WO2006027099A2 - Hochspezifisch mit dna interagierende enzym-konjugate mit programmierbarer spezifität - Google Patents

Hochspezifisch mit dna interagierende enzym-konjugate mit programmierbarer spezifität Download PDF

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Alfred M. Pingoud
Albert Jeltsch
Kristin Eisenschmidt
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Justus Liebig Universitaet Giessen
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    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide

Definitions

  • the present invention relates to the fields of biology, biochemistry, chemistry, pharmacy and human and veterinary medicine.
  • the present invention describes the principle and the use of highly specific with DNA interacting enzyme conjugates with programmable specificity.
  • These enzyme conjugates according to the invention consist of enzymes which are covalently linked to oligonucleotide derivatives via linkers.
  • DE 198 42 527 A1 describes a method for the formation of triple helix-forming oligomers also for those nucleic acid regions in which neither a homopurine nor a homopyrimidine sequence is present, which increases the flexibility of the addressable recognition sites.
  • the same procedure also applies to the. Training of double helices applies.
  • PNAs can in principle recognize each DNA sequence specifically, but in combination with nucleases lead to DNA cleavages whose position can vary greatly, since nucleases usually have several target sites [Kl Izvolsky, VV Demidov, PE Nielsen and MD Kamenetskii ( 2000): Sequence-specific protection of duplex DNA against restriction and methylation enzymes by pseudocompatible PNAs. Biochemistry 39; 10,908 to 10,913].
  • the specific recognition of DNA with oligodeoxynucleotides or PNAs is used in the sense of an antigen technology.
  • TFO triple helix-forming oligonucleotide
  • sequence-specific recognition of DNA with TFOs was used for targeted mutagenesis and to stimulate homologous recombination [MP Knauert and PM Glazer (2001): Triplex forming oligonucleotides: sequence-specific tools for gene targeting.
  • the present invention is distinguished from the prior art in that it provides conjugates of enzymes and so-called specificity anchors, which are chemically linked to one another via a linker.
  • Specificity anchors are oligodeoxynucleotides or peptide nucleic acids which form double or triple helices with the recognition site of the DNA to be addressed.
  • the recognition site on the target DNA of the conjugate is characterized by the recognition given specificities of the specificity anchor and the enzyme, whereby the conjugate interacts highly specifically with the target DNA.
  • the enzymatically catalyzed reaction is selected from the group cleavage or methylation and homologous recombination and induction of DNA repair or targeted inhibition of gene expression by specific
  • the reaction taking place on the recognition sequence of the target DNA, which is catalyzed by the enzyme conjugate proceeds at least ten times faster than any other reaction proceeding in the presence of the enzyme conjugate at a reaction other than the recognition sequence of the target DNA.
  • the enzyme has on its surface a reactive functional group for the binding of a linker, that the at least one specificity anchor is an oligonucleotide compound which has a complementary base pairing with a triplex formation site (TFS) of the target DNA forms a triple helix and has a reactive functional group at the 5'-end or at the 3'-end,
  • TFS triplex formation site
  • the specificity anchor has a sequence homology of at least 85% to the triplex binding site
  • the at least one linker is a molecular compound containing at least one chain of at least two carbon atoms, wherein the chain is derivatized in two places with the same or different reactive functional groups, - one of the two reactive functional groups of at least one Lin ⁇ kers forms a covalent chemical bond with the reactive functional group of the enzyme and the reactive functional group of the specificity anchor, and
  • - Enzyme and specificity anchors are bound to the target DNA with a distance of at least two base pairs.
  • enzymes are biocatalytically active proteins that are substrate- and reaction-specific, ie. Each enzyme catalyzes a very specific course of reaction, and this only with certain substrates, namely those which, according to the key-lock principle, fit exactly into the binding site of the enzyme in question.
  • the term "specifically interacting with DNA” in the present invention means enzymes and enzyme conjugates which interact substrate and reaction-specifically only with those DNA regions whose base sequence matches the recognition site of the enzyme according to the key-and-lock principle.
  • the person skilled in the art is aware of the fact that there are numerous DNA molecules which have the recognition sequence for a particular enzyme several times.
  • enzyme-conjugates which are highly specifically interacting with DNA are those enzyme conjugates whose binding and subsequent substrate- and reaction-specific interaction with the target DNA depend on two factors: on the one hand, as in the case of the above-described specific interaction from the recognition sequence for the enzyme, on the other hand from a Triplex Forming Site (TFS) on the target DNA, which TFS must be adjacent to the recognition sequence for the enzyme.
  • TFS Triplex Forming Site
  • Oligonucleotide and linker content of the enzyme conjugate determine at which point of the target DNA and at which distance to the enzyme portion of the enzyme conjugate the triplex formation occurs between TFS of the target DNA and triplex-forming oligonucleotide portion of the enzyme conjugate.
  • the enzyme is chemically coupled via a linker to a reagent capable of specifically recognizing DNA.
  • This reagent is hereinafter referred to as "specificity anchor”.
  • Such specificity anchors are, for example, oligodeoxynucleotides or peptide nucleic aeids (PNA), which can recognize double-stranded DNA specifically through the formation of a double (duplex invasion or double duplex invasion) and / or triple helix. DNA recognition via double or triple helices takes place according to rules of the base pairing, so that it is predictable which sequence the specificity anchor to be used must have in order to recognize a specific target sequence.
  • the specificity anchor must have a sequence homology of at least 85% to the TFS of the target DNA. With a length of the specificity anchor of 12 base pairs, a sequence homology of 85% corresponds to a mismatch.
  • Homology here means a complementary identity of the intramolecular nucleotide base pairing of TFO and TFS, so that 100% sequence homology mean that each nucleotide base of the TFO, according to the rules of the base pairing, faces a respective complementary nucleotide base on the TFS.
  • linker is meant a molecular compound containing at least one hydrocarbon chain of at least two carbon atoms, which chain is derivatized at two sites with the same or different reactive functional groups, with linkers having two different reactive functional groups being preferred. These reactive functional groups form covalent chemical bonds in known chemical reactions, with one of the functional groups first binding to the specificity anchor and the other binding to the enzyme.
  • linker first, the covalent linkage between linker and enzyme and then that between linker and specificity anchor are formed. These chemical reactions include, but are not limited to, the formation of ether, thioether, ester, thioester or amide linkages.
  • the linker preferably consists of the covalent linkage of a 5'-link or 3'-link with a crosslinker.
  • the 5'-link or 3'-link represents a molecular compound which contains 1. a hydrocarbon chain of at least two carbon atoms, 2. bound to the 5'-end or 3'-end of the specificity anchor and the 3 contains at one point a reactive functional group.
  • nucleic acid derivatives such as oligodeoxyribonucleotides (ODN) or PNA, which are chemically linked to such a 5'-link or 3'-link, are commercially available.
  • the reactive functional group is, for example, a primary amino group.
  • the crosslinker is a molecular compound of at least one hydrocarbon chain, which contains at least one hydrocarbon chain at least two carbon atoms and contains reactive functional groups at two sites.
  • the reactive functional groups are, for example, ester, carboxylic acid, imide and / or amino groups, preferably succinimide ester and maleimido groups.
  • crosslinker forms part of the enzyme conjugates according to the invention, one of its reactive functional groups is associated with the enzyme and the other with the reactive functional group of the chemically bound to the specificity anchor 5 'link or 3' link covalently linked.
  • "programmable specificity” is understood to mean that the enzyme conjugates according to the invention are provided with a complementary DNA address in such a way that their interaction with DNA can be precisely adjusted and highly specific according to rules known to the person skilled in the art the enzyme conjugates according to the invention - enzymes, specificity anchors, 5'-link, 3'-link and crosslinker - are described in detail below.
  • Type II restriction endonucleases such as but not limited to AcH, Alu ⁇ , Bfa ⁇ , BsaJ ⁇ , Bsl ⁇ , BsoR, BssK ⁇ , BstU ⁇ , Cac8 ⁇ , Cha ⁇ , Csp6 ⁇ , CwJI,
  • hominganucleases such as, but not limited to, I-Crel, I-Ppol, F-Scel, F-Scell, F-SwI, F-Tevl, F-Tet / II.
  • ⁇ -Tev ⁇ , ⁇ -Tev ⁇ W ⁇ -UarAP, ⁇ -UarHGPA1P, ⁇ -UarHGPA13P, Pl-Pspl Pl-SPetelP, Pl-Scel, PI-TfUl, PI-TYuII, P-Thy ⁇ , PI -77 / I, PI-77 / II.
  • DNA repair enzymes such as, but not limited to, MutH and Vsr, DNA methyltransferases such as, but not limited to, M.Sssl, M.Hhal, EcoDam, mammalian DNA methyltransferases or catalytically active active fragments thereof including, for example, the human methyltransferases DNMT1, DNMT3a and DNMT3b,
  • the binding of the enzyme to the linker takes place by forming a covalent chemical bond between a reactive functional group of the linker and the reactive functional group of the enzyme accessible on the surface.
  • This surface-accessible reactive functional group of the enzyme is, for example, a singular cysteine in the case of a restriction endonuclease or one which can be expressed by means of a site-specific mutation. Tagetes, a methyltransferase cysteine.
  • enzymes can be used without surface-accessible cysteine, in which case oligonucleotide derivatives having a 5'-SH link or 3'-SH l_ink are preferably used.
  • the specificity anchors are oligonucleotides and oligonucleotide analogs - collectively referred to as "oligonucleotide compounds" - consisting of 10 to 20 nucleotides to ensure specific addressing and pairing that is sufficiently stable to be among the Reaction conditions in the cell or in vitro to ensure binding of the conjugate to the target sequence having a sequence homology of at least 85% to the TFS of the target DNA, for example to - oligodeoxyribonucleotides (ODN) and their derivatives, including, for example, oligonucleotides whose phosphate backbone partially phosphodiester and partially or exclusively modified phosphorothioate groups, methylphosphonate, H-phosphonate or other phosphate-analogous groups auf ⁇ has or replaced by other compounds, such as the methyl (methylimino) - or Methylencarboxamid group, and ODN 1 whose ribose unit at the 2 ' C or 4'
  • Sugar such as the ⁇ -anomer of deoxyribose, Peptide nucleic acids (PNA), - threose nucleic acid analogs (TNA), for example
  • Aminoalkyl group having 1 to 20 carbon atoms, more preferably 2 to
  • oligonucleotides and oligonucleotide analogs with a 5'-SH link or 3'-SH link are used.
  • crosslinkers covalently bound to the reactive functional group of the 5-link or 3 'linker of the specificity anchor and the superficially accessible reactive functional group of the enzyme compounds having two reactive functional groups, one of which is suitable specifically linked to the reactive functional group of the 5'-link or 3'-link of the TFO and the other to the superficially accessible reactive functional group of the enzyme, for example a succinimide ester and a maleimide function,
  • crosslin Ker are known in the art and can, without departing from the scope of the Pa ⁇ tentages, are used.
  • the two reactive functional groups of the crosslinker are preferably arranged at a distance of 1 to 20 CH 2 groups and very particularly preferably at a distance of 6 to 12 CH 2 groups.
  • the unit formed by linkage of crosslinker and 5'-link or 3'-l_ink, which is referred to as linker, on the target DNA of the enzyme conjugate has a distance of at least 2 base pairs, preferably 2 to 20 bp, between the recognition sequence for the Enzyme and the address for the TFO on the target DNA.
  • N- ( ⁇ -Maleidobutyryloxy-) succinimidester used on one
  • oligodeoxyribonucleotides or PNAs are highly specific. While oligodeoxyribonucleotides have a DNA recognition sequence of 10 to 20 Base pairs, PNAs can specifically recognize each sequence.
  • the present invention utilizes this specificity to increase the specificity of DNA recognition of a DNA interacting enzyme by maintaining and expanding the inherent specificity of the DNA interacting enzyme. This ensures that a chemically defined modification is carried out on the DNA.
  • the DNA is cleaved further by a TFO restriction endonuclease conjugate according to the invention at the cleavage position defined for the restriction enzyme.
  • a TFO-methyltransferase conjugate according to the invention further transfers methyl groups only to the target base within the recognition sequence of the methyltransferase. In both cases, however, not all of the target sequences of this enzyme are cleaved or methylated by the conjugates according to the invention on the target DNA, but only those which have the recognition sequence for the TFO adjacent thereto.
  • the highly specific DNA-interacting enzyme conjugates of programmable specificity according to the invention are suitable for numerous applications in which different genes and DNA sequences, irrespective of whether they originate from Prokarya, Eukarya or Archaea, have to be addressed in a targeted manner and / or specific manipulation of DNA is required.
  • Targeted addressing here is to be understood as meaning the exclusive addressing of such recognition sequences of an enzyme which are adjacent to a TFS. In this case, no enzymatic reaction takes place at such recognition sites of the enzyme which are not adjacent to TFS.
  • a specific manipulation of DNA means that the manipulation is site specific with respect to sequence and Cleavage or modification site and a defined chemical reaction is kataly ⁇ Siert.
  • programmable restriction endonuclease conjugates can be used for the manipulation of large DNA molecules in vitro since they are programmable for the targeted cleavage of each required site of the target DNA.
  • large are meant DNA molecules consisting of at least 10,000 base pairs, which are therefore suitable, for example, for cloning and characterizing small and large DNA fragments
  • the enzyme conjugates according to the invention are suitable for this purpose In vitro Mapping of Genomic DNA It will be apparent to those skilled in the art that it is not absolutely necessary - and for all other in vitro uses - that the recognition sequence for an enzyme conjugate of the invention be present only once on the target DNA
  • such enzyme conjugates according to the invention are suitable in which the specificity anchor has a sequence homology of at least 85% to the TFS of the target DNA and in which the DNA sequence taking place on the recognition sequence of the target DNA Conjugate catalyzed reaction runs at least ten times faster than any other in the presence of E nzym- conjugate to other than the recognition sequence of the
  • such enzyme conjugates of the invention are used for in vitro uses in which the sequence homology between TFO and TFS is 90% to 100% and the reaction catalyzed by the enzyme conjugate is at least 100 times faster than any other in the presence of the enzyme Enzyme conjugate on other than the recognition sequence of the target DNA ab Anlagen ⁇ de reaction.
  • enzyme conjugates in which the specificity anchor has a sequence homology of 100% to the TFS of the target DNA and the reaction taking place on the recognition sequence of the target DNA, which is catalyzed by the enzyme conjugate, proceeds at least a thousand times faster than any other reaction taking place in the presence of the enzyme conjugate on other than the recognition sequence of the target DNA reaction.
  • This very particularly preferred embodiment of the enzyme conjugates according to the invention is also suitable for uses in vivo if exactly one recognition sequence for this enzyme conjugate exists on the target DNA and this recognition sequence is present on the target DNA just once.
  • the low yield with which DNA introduced into cells is integrated into the gene by recombination is a central problem of gene therapy.
  • the introduction of a specific Doppelstrang ⁇ fraction increases the yield of recombination more than 1000-fold.
  • the programmable restriction endonuclease conjugates according to the invention cut the DNA specifically at the target site, thereby stimulating homologous recombination and thus increasing the efficiency of the exchange of target DNA sequences with the aim of DNA repair by exogenous DNA (gene targeting ). This also ensures that the exogenous DNA is integrated at a predetermined location in the genome.
  • Programmable restriction endonuclease conjugates are thus suitable for gene therapy and experimental genetics for the production of organisms, for example animal or plant organisms.
  • the highly specific DNA-interacting enzymes of the invention stimulate DNA repair in cells by a targeted double-strand break.
  • Targeted DNA methylation using the highly specific DNA-interacting enzymes according to the invention is suitable for in vitro manipulation of DNA by, for example, methylating DNA specifically at an adenine residue of a GATC sequence and selectively cleaving the modified sequence by the restriction enzyme DpnI , Since DNA methylation induces stable repression of gene expression, programmable DNA methyltransferases according to the invention are suitable for repression of gene expression. Targeted repression of genes has a number of biomedical applications that have in common that, for example, the expression of a disease gene is inhibited.
  • the possible desired inhibition reactions are, for example, the repression of the expression of oncogenes in tumor therapy or the repression of expression of viral proteins in the control of viral infections.
  • amyloid storage diseases for example Parkinson's, Alzheimer's
  • the expression of the precursor protein is inhibited and thus the progression of the disease is stopped.
  • An advantage of the programmable DNA methyltransferase conjugates according to the invention is that a once altered methylation pattern of the DNA remains stable and is obtained from the cellular methylation system. Therefore, no permanent presence of the programmed DNA methyltransferase of the invention is required and the genomic DNA sequence of the target cell remains unchanged.
  • the enzyme conjugates according to the invention are furthermore suitable as auxiliaries for biomedical research, for example for the experimental reduction of the expression of a gene, for the production of transgenic organisms or for the manipulation of DNA, in particular for the manipulation of large DNA molecules.
  • kits which provide means for coupling crosslinkers to enzymes and specificity anchors provided with a 5'-link or 3'-link, so that those with a 5'-link or 3'-linkage Link provided specificity anchor first with the provided crosslinkers and then reacted with the enzymes provided to erfindungs ⁇ according to enzyme conjugates.
  • the manufacturer of the kit according to the invention is aware of his general knowledge of how to use the individual components of the kit, e.g. Enzymes, crosslinkers, specificity anchors and buffers, produces, formulates and stores.
  • the highly specific DNA-interacting enzyme conjugates of programmable specificity according to the present invention can be used as medicaments for patients for the therapy, diagnosis and prophylaxis of diseases in which a disorder of gene expression occurs, whereby disorder means both pathogenic hyper- and hypo-expression.
  • diseases are, for example, viral diseases (eg AIDS, herpes simplex), tumor diseases (eg chronic myeloid leukemia), amyloid storage diseases (Creutzfeld-Jakob disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease).
  • muscoviscidosis cystic fibrosis
  • phenylketonuria phenylketonuria
  • albinism adreno- genital syndrome
  • the term "patient” refers equally to humans and vertebrates.
  • the drugs can be used in human and veterinary medicine.
  • Pharmaceutically acceptable compositions of compounds according to the claims whose salts, esters, or amides can, if they do not cause excessive toxicity, irritation or allergic reactions on the patient after zuver ⁇ casual medical assessment.
  • the therapeutically effective compounds of the present invention may be administered to the patient as part of a pharmaceutically acceptable composition either orally, rectally, parenterally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intracistemally, intravaginally, intraperitoneally, intravascularly, intrathecally, intravesically, topically, locally (Powder , Ointment or drops) or in spray form (aerosol).
  • Intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or intrathecal administration can be carried out continuously by means of a pump or metering unit.
  • Dosage forms for the topical administration of the compounds according to the invention include ointments, powders, suppositories, sprays and inhalants.
  • the active component is mixed under sterile conditions with a physiologically acceptable carrier and possible stabilizing and / or preserving additives, buffers, diluents and propellants as needed. embodiments
  • the single-stranded variant scPvull of the restriction enzyme Pvull is used, since in this variant a single cysteine can be introduced for the coupling with the TFO.
  • a His 6 -tag followed by four glycine residues and a cysteine residue is introduced: [2-157] -GSGG- [2-157J-H 6 G 4 C.
  • This cysteine residue-containing variant of ScPvUlI-H 6 G 4 C is prepared by PCR-based site-directed mutagenesis using pRIZ 'scPvull as a template.
  • PCR-based site-directed mutagenesis is known to the person skilled in the art and described in RD Kirsch, E JoIy: An imporved PCR mutagenesis strategy for two-site mutagenesis or sequence swapping between related genes. Nuclear Acids Res 1998, 26, 1848-1850.
  • the use of pRIZ'scPvull as template is known to those skilled in the art, for example from A Simoncsits, ML Tjornhammar, T Rasko, A Kiss, S Pongor: Covalent joining of the subunits of a homodimeric type II restriction endonuclease: single-chain Pvull endonuclease, J Mol Biol 2001, 309, 89-97.
  • the His 6 -tagged scPvull variant is prepared according to those skilled in the art from W Wende, W Grindl, F Christ, A Pingoud, V Pingoud: Binding, bending and cleavage of DNA substrates by the homing endonuclease Pl-Scel, Nucleic Acids Res 1996, 24, 4123-4132 and purified in 0.03 M K-phosphate pH 7.2, 0.5 M NaCl, 0.2 M imidazole, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% Lubrol ( w / v) stored at 4 ° C. until further use.
  • Triplex-forming oligonucleotides contain a 5'-C6 spacer or a 5'-C6 spacer with a terminal amino group (Eurogentec, Cologne, Germany): 5'-NH 2 - [CH 2] 6/12-MPMPMPMPMPPPPPPT-3 ' where M is 5-methyl-2'-deoxycytidine and P is 5- [1-propynyl] -2'-deoxyuridine.
  • TFO Gel electrophoretic mobility shift assays are performed with the TFO and a complementary double-stranded oligonucleotide.
  • 5 ⁇ l of 10 mM Tris-phosphate pH 7.2, 25% (w / v) sucrose are added.
  • the complex formation is determined by gel electrophoresis over 15% polyacrylamide gels in 10 mM Tris-phosphate, pH 7.2. After electrophoresis, the gels are dried and the radioactive bands are visualized using an instant imager (Canberrra Pa ckard).
  • the assay to study the protection of restriction enzymes from cleavage is performed on a 150 bp DNA substrate having a Fokl site and an adjacent triple helix formation site (TFS) overlapping the Fokl cleavage site downstream.
  • 1 ⁇ M substrate is dissolved in 10 mM Tris. Phosphate pH 7.2 with 10 .mu.M TFO or - in the case of the control - a technicallypei ⁇ fischen Hexadecadeoxyribonukleotid for 4 h at 37 0 C in 70 .mu.l total volume incubated.
  • 40 ⁇ l of Fokl in cleavage buffer are added to a final volume of 100 ⁇ l.
  • the desalted activated TFO is dissolved in 80 ⁇ l of PBS buffer.
  • the scPvull-H 6 G 4 C is previously dialyzed against PBS buffer for 4 h to remove DTT.
  • the yield of the crosslinking reaction is determined by means of 15% SDS-PAGE.
  • Non-covalently linked to the TFO ScPvUlI-HeG 4 C is separated by anion exchange chromatography of cross-linked scPvull-H 6 G 4 Cc 6 / ci 2 -TFO ge, where DE52 in 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 3 mM EDTA and a linear Gra ⁇ serves to be used from 100 mM to 400 mM NaCl.
  • the protein content of each fraction is determined by 15% SDS-PAGE.
  • scPvull-H 6 G 4 C elutes with the first flow, ie before the gradient elution is started, whereas the scPvull-H 6 G4C-c 6 / ci 2 TFO elutes during the gradient elution at a NaCl concentration of 350 mM to 390 mM eluted.
  • the purified scPvull-H 6 G 4 Cc 6 / ci 2 -TFO is dialysed against PBS buffer containing 25% PEG 10000 and then stored at 4 ° C. until further use.
  • Radiolabeled 239 bp substrates are used for DNA cleavage experiments.
  • the pAT153 plasmid is used, which contains a Pvull instead of a BamHI site, using the following primers: 5'-GGCCTCTTGCGGGAGATCTTCCATTCCG AC-3 1 and 5'- ⁇ GTACTO ⁇ CGACAGTCGGCGCACATCAGACAGCTGACAGGACGGGT & 3 '(The Pvull interface is CAGCTG).
  • the unaddressed 478 bp substrate does not contain a TFS site and is prepared by PCR with the same plasmid using [ ⁇ - 32 P] dATP and 5'-ATAGGCGC-CAGCAACCGCACCTGTG-3 'and ⁇ '-AATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTC-S' as primers become.
  • This non-addressed substrate has the same sequence as the addressed cleavage substrates (see below) with the exception of its larger number of base pairs and the TFS. All substrates are purified by PCR columns (Qiagen, Hilden, Germany). The purity is determined by native PAGE. The concentration is determined on the assumption that 1 OD 260 nm corresponds to 50 ng / ⁇ l.
  • the cleavage of a 478 bp substrate without TFS is compared with that of a 239 bp substrate with a TFS at a distance of 9 bp to the Pvull interface. It uses scPvull- C i 2 -TFO.
  • the Rein ⁇ incubation of scPvull-ci 2 -TFO with the respective DNA substrates is at 23 0 C for 10-15 h in the appropriate buffer for the triple helix 10 mM Tris-phosphate pH 7.2, 1 mM spermine, 3 mM EGTA in the absence of Mg 2+ to prevent the binding of Pvull sites without adjacent TFS and DNA cleavage, both of which require the presence of Mg 2+ .
  • cleavage is started by addition of Pvull cleavage buffer, consisting of 10 mM Tris-HCl pH 7.2, with MgCl 2 in various concentrations. The final concentrations are 1, 25 mM, 2.5 mM and 5 mM MgCl 2 .
  • MgCI 2 Concentration As the MgCI 2 concentration decreases, the rate of cleavage of the unaddressed 478 bp substrate decreases, reaching zero at a concentration of 1.25 mM MgCl 2 , whereas the rate of cleavage of the targeted 239 bp substrate remains unchanged (FIGS. 5a and 5b).
  • the same amount of product formed and scPvull- C i 2 -TFO are present in the reaction mixture as long as the amount of scPvull-ci 2 -TFO used does not exceed the amount of substrate addressed , If more than stoichiometric quantities of the enzyme are added in comparison with the DNA, cleavage of the non-addressed substrate additionally occurs, the last-mentioned cleavage proceeding at a substantially very low rate.
  • TFS triple helix forming site
  • two scPvull-TFO conjugates are prepared as described above, differing only in the length of the linker: scPvull-c ⁇ -TFO and scPvull- C12 -TFO.
  • scPvull-c ⁇ -TFO and scPvull- C12 -TFO.
  • the cleavage is terminated after 5, 10, 20, 30, 60 or 110 min by adding EDTA to a final concentration of 50 mM.
  • the reaction products are determined by electrophoresis over 12% PAGE gel. Subsequently, the gels are dried and the radioactive bands are determined by autoradiography using an instant imager system (Canberra Packard, Rüsselsheim, Germany).
  • the target-directed cleavage of 45 nM scPvull-H 6 G 4 Cc 6 / ci 2 -TFO is performed in the assay experiment by simultaneous incubation with in each case 45 nM of the addressed and the non-addressed substrate in 10 mM Tris-phosphate pH 7.2, 1 mM spermine, 3 mM EGTA at 23 0 C for 12 to 18 h.
  • EGTA is added to the preincubation buffer to complex Ca 2+ ions which, even at low concentrations, stimulate the specific binding of the non-addressed substrate to the Pvull site.
  • the cleavage reaction is started at 37 0 C by cleavage of the buffer 10 mM Tris-HCl pH 7.2 are added to identical volumes containing different concentrations of MgCl 2, wherein the terminally concentration of MgCl 2 1, 25 mM, 2.5 mM or 5 mM.
  • the cleavage reaction is stopped and the cleavage products are determined as described above.
  • the cleavage rates of the non-addressed substrates are very low in all reactions performed with 1.25 mM MgCl 2 and about 1.400 times lower than those of the addressed substrates.
  • Table 1 For the addressed substrates up to 1,400-fold higher cleavage rates result, see Table 1.
  • scPvull-ci 2 -TFO also shows that the 13 bp DNA between Pvull interface and TFS is a good substrate.
  • the cleavage rates determined for scPvu- II- C12- TFO are higher than those for scPvull- C12- TFO , in which the distance between Pvull interface and TFS is shorter than 7 bp, decreases with decreasing distance, whereby this effect is stronger with scPvull-c ⁇ -TFO than with scPvull-ci 2 -TFO.
  • Table 1 shows the rate constants of cleavage for six different addressed 239 bp substrates, which differ in the distance between Pvull cleavage site and triple helix binding site (TFS).
  • the specified error range is based on three independent measurements.
  • the cleavage preference represents the ratio of the rate constants of the addressed 239 bp substrate and the unaddressed 478 bp substrate.
  • a 5556 bp plasmid with 5 Pvull sites is used which has a Pvull site spaced 9 bp to a TFS. If the supercoiled plasmid is cleaved without pre-incubation with Pvull or scPvull-ci 2 -TFO, five cleavage fragments result.
  • Preincubation and cleavage of the supercoiled and HindIII-ionized plasmid are carried out as described for the PCR products.
  • scPvull-ci 2 -TFO and spirally-distilled or HindIII-linearized plasmid in a used essentially stoichiometric ratio.
  • the cleavage products are determined by electrophoresis over a 0.8% agarose gel.
  • the gel is then stained with SYBR Gold and analyzed using suitable software (Biometra, Göttingen, Germany). Analysis of the lengths of the cleavage products of the spirally-spun and linearized plasmids shows that only the addressed cleavage site is cleaved.
  • retroviral genome Genome of the target cell prior to the targeted methylation
  • Specificity anchors 2 and enzyme 4 are chemically linked to one another via a linker 3.
  • Linker 3 sets the distance between specificity anchor 2 and enzyme 4.
  • the recognition site 7 of the conjugate of specificity anchor and enzyme is defined by the recognition sequence of the specificity anchor 5 or of the enzyme 6.
  • the programmable restriction enzyme 11 is introduced into the cell together with a plasmid vector 10.
  • the vector 10 contains the altered target gene 12, which is flanked by regions that are homologous to the genomic region (upstream homology region 13, downstream homology region 14).
  • the genomic DNA is cleaved by the programmable restriction enzyme 11.
  • the gene copy on the plasmid vector 10 contains no recognition sequence for the programmable restriction enzyme 10.
  • a programmable DNA methyltransferase is introduced into a target cell 16, e.g. integrated a retroviral genome 17 into its genome 18.
  • the target sequence 19 is methylated.
  • the preparation of a programmed restriction enzyme is shown schematically.
  • the single-stranded variant of Pvull is linked to a triple helix-forming oligonucleotide (TFO) via a (CH 2 ) 6 or (CH 2 ) i 2 linker using a chemical crosslinker.
  • TFO triple helix-forming oligonucleotide
  • the end product scPvull-c ⁇ / ci 2 -TFO has a two-part recognition site: the Pvull recognition site and the triplicate pelhelix binding site (TFS). Cleavage of the double strand occurs in the Pvull site, but only if it is adjacent to the TFS.
  • FIGS. 5a and b represent the addressed (239 bp substrate) and the nonaddressed DNA cleavage (478 bp substrate) by scPvull c 6 / ci 2 TFO at two different levels Mg 2+ concentrations are used.
  • a 239 bp substrate which has a TFS at a distance of 9 bp to the Pvull interface and a 478 bp substrate which has no TFS are used.
  • 45 nM of each substrate are incubated with 40 nM scPvull-c6 / ci2-TFO in the presence of spermine for the purpose of triple helix formation.
  • the kinetic data of the cleavage are determined. While the non-addressed Sub ⁇ strat ( ⁇ ) at a MgCfe concentration of 5 mM essentially the same
  • the addressed substrate is rapidly cleaved like the addressed substrate ( ⁇ ), cleavage at a MgCl 2 concentration of 1.25 mM is essentially undetectable.
  • the addressed substrate is rapidly cleaved both at 5 mM and at 1.25 mM MgCb.
  • Fig. 6 shows the addressed cleavage of a 5556 bp plasmid by scPvull-c 6 / ci2-TFO.
  • the plasmid has five Pvull interfaces (designated P in Fig. 6); one of them has a TFS at a distance of 9 bp and is marked with * fc.
  • P in Fig. 6 the Pvull interfaces
  • 50 nm of the plasmid are preincubated with 45 nM scPvull-c 6 / ci 2 -TFO in the presence of spermine.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt das Prinzip, die Herstellung und die Ver­wendung von hochspezifisch mit DNA interagierenden Enzym-Konjugaten mit programmierbarer Spezifität. Diese erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate beste­hen aus Enzymen, die über Linker kovalent mit Oligonukleotidderivaten verknüpft sind. Der Enzymanteil der erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate bindet an seine Erkennungssequenz auf der Ziel-DNA, während der Oligonukleotidanteil über eine komplementäre Basenpaarung mit einer Triplex-Bildungsstelle (TFS) der Ziel-DNA eine Tripelhelix ausbildet. Die Enzym-Konjugate lassen sich durch geeignete Kombination von Enzym, Linker und Oligonukleotid maßschneidern und besitzen eine Erkennungsstelle auf der Ziel-DNA. Die erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate eignen sich zur gezielten Manipulation großer DNA-Moleküle sowie zum Mapping genomischer DNA in vitro. In vitro und in vivo können sie zur Einführung eines gezielten Doppelstrangbruches verwendet werden, um die homologe Rekombination und / oder die DNA-Reparatur zu stimu­lieren und/oder zur Repression der Genexpression.

Description

Hochspezifisch mit DNA interagierende Enzym-Konjugate mit programmier¬ barer Spezifität
Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete Biologie, Biochemie, Chemie, Phar¬ mazie sowie Human- und Veterinärmedizin.
Verschiedene Familien von Enzymen werden in vitro und in vivo zur Manipulation von DNA eingesetzt. Zu diesen Enzymfamilien gehören beispielsweise Restrikti- onsendonukleasen, Exonukleasen, DNAsel, DNA-Reparaturenzyme und DNA- Methyltransferasen. Die spezifischeren dieser Enzyme (Restriktionsendonuklea- sen und DNA-Methyltransferasen) erkennen allerdings typischerweise relativ kur¬ ze DNA-Sequenzen von 4 bis 8 Basenpaaren, welche beispielsweise im mensch¬ lichen Genom 102-106 mal vorkommen. Somit ist eine gezielte, exklusive Adressie- rung einzelner bestimmter Gene durch diese Enzyme nicht möglich. Für zukünfti¬ ge Applikationen in der Biotechnologie und molekularen Medizin werden jedoch solche gezielten Adressierungen benötigt. Derartige Anwendungen erfordern da¬ her eine Methode, die es gestattet, die Spezifität von Enzymen, die mit DNA inter- agieren, gezielt zu erweitern. Um unterschiedliche Gene und DNA-Sequenzen zu adressieren, sollten diese Enzyme hochspezifisch und programmierbar sein, d.h. ihre Erkennungssequenz muss gezielt veränderbar sein.
Die vorliegende Erfindung beschreibt das Prinzip und die Verwendung von hoch¬ spezifisch mit DNA interagierenden Enzym-Konjugaten mit programmierbarer Spezifität. Diese erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate bestehen aus Enzymen, die über Linker kovalent mit Oligonukleotidderivaten verknüpft sind. Stand der Technik
Der Stand der Technik kennt die hochspezifische Ausbildung von Tripelhelices mit Oligodesoxynukleotiden oder Peptidnukleinsäuren (peptide nucleic acids, PNAs). Triplex bildende Oligodesoxynukleotide benötigen eine DNA-Erkennungssequenz von 10-20 Basenpaaren. Anfangs wurde die Tripelhelix-Strategie nur bei DNA an¬ gewandt, bei der ein Strang ausschließlich Purine enthielt [AJ. Cheng und M.W. van Dyke (1994): Oligodeoxyribonucleotide length and sequence effects on inter- molecular purine-purine-pyrimidine triple helix formation. Nucleic Acids Research 22; 4742-4747]. Die DE 198 42 527 A1 beschreibt dagegen ein Verfahren zur Bil¬ dung Tripelhelix-bildender Oligomere auch für solche Nukleinsäure-Bereiche, in denen weder eine Homopurin- noch eine Homopyrimidin-Sequenz vorliegt, was die Flexibilität der adressierbaren Erkennungsstellen erhöht. In der genannten Pa¬ tentschrift wird darauf hingewiesen, dass die gleiche Vorgehensweise auch für die. Ausbildung von Doppelhelices gilt. Weder die genannte Homopurin-Strategie noch DE 198 42 527 A1 gestatten es allerdings, Nukleasen oder andere Enzyme spezi¬ fisch an bestimmte DNA-Regionen zu lenken.
Dagegen können PNAs im Prinzip jede DNA-Sequenz spezifisch erkennen, führen aber in Kombination mit Nukleasen zu DNA-Spaltungen, deren Position stark vari¬ ieren kann, da Nukleasen i.d.R. mehrere Zielstellen besitzen [K.l. Izvolsky, V.V. Demidov, P.E. Nielsen und M. D. Kamenetskii (2000): Sequence-specific protecti- on of duplex DNA against restriction and methylation enzymes by pseudocomple- mentary PNAs. Biochemistry 39; 10908-10913]. Die spezifische Erkennung von DNA mit Oligodesoxynukleotiden oder PNAs wird im Sinne einer Antigen-Technologie eingesetzt. Hierbei wird durch die Gabe eines TFOs (Tripelhelix-forming oligonucleotide = Tripelhelix-bildendes Oligonukleotid) die Ausbildung einer Tripelhelix im Gen- oder Promotorbereich eines Zielgens in- duziert, wodurch die Transkriptionsinitiation oder -elongation inhibiert wird [L. Good und P.E. Nielsen (1998): Antisense inhibition of gene expression in bacteria by PNA targeted to mRNA. Nature Biotechnology 16; 355-358]. Außerdem wurde die sequenzspezifische Erkennung von DNA mit TFOs für gezielte Mutagenese eingesetzt und um homologe Rekombinationen zu stimulieren [M. P. Knauert und P.M. Glazer (2001): Triplex forming oligonucleotides: sequence-specific tools für gene targeting. Human Molecular Genetics 10; 2243-2251]. Allerdings lassen sich bei allen diesen Vorgehensweisen die Ereignisse, die nach Ausbildung der Tripel¬ helix ablaufen (Inaktivierung der Genexpression, homologe Rekombination, Muta¬ genese) nicht vorherbestimmen und sind schwer zu beeinflussen. Eine Erweiterung der DNA-Erkennungsspezifität kann durch Fusion mit anderen DNA-bindenden Proteinen erzielt werden. Die DE 197 56 975 A1 beschreibt ein Protein, welches das zelluläre Protein p27 inhibiert und damit die durch p27 be¬ wirkte Hemmung der Zeilproliferation aufhebt, sowie Nukleinsäurekonstrukte aus Aktivierungs-, Binde- und Transkriptionssequenzen, die für das Inhibitorprotein von p27 codieren und für die Gentherapie von Erkrankungen verwendet werden sollen. Nachteil dieser Konstrukte ist, dass für die meisten potenziellen Zielse¬ quenzen keine geeignete DNA-Bindungsdomäne als Fusionspartner zur Verfü¬ gung steht, welche die Sequenz mit hinreichender Affinität und Spezifität bindet. Der Stand der Technik kennt Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus Nuk- leinsäuren und/oder Proteinen und weiteren Informations- und Funktionseinheiten wie Antikörpern, Enzymen und anderen Biomolekülen. So beschreibt die DE 197 45 668 A1 ein Verfahren zur Kopplung von Oligonukleotiden und Biomolekülen für Bioanalytik, Sensorik und Diagnostik. Die DE 44 21 079 C1 beschreibt chimäre Peptid-Nukleinsäure-Fragmente, die die zielgerichtete Einbringung in Zellorganel- len und Zellen ermöglichen soll. Beide Verfahren gestatten jedoch keine zielge¬ richtete Adressierung bestimmter Sequenzen in vitro und in vivo. Eine Alternative zur hochspezifischen Spaltung von DNA sind selten schneidende Restriktionsendonukleasen, die 8 und mehr Basen erkennen. Sog. Homing- endonukleasen wurden von Chevalier und Stoddard beschrieben [B. S. Chevalier und B. L. Stoddard (2001 ): Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility, Nucleic Acids Research 29; 3757-3774]. Sie erkennen wesentlich längere DNA-Sequenzen. Es gibt allerdings nur wenige dieser Endonukleasen, und im Falle von Homingendonukleasen sind die Erken¬ nungssequenzen oft nicht genau definiert. Hochspezifische DNA- Methyltransferasen sind nicht bekannt. Ein weiteres Problem ist, dass die Regio¬ nen der DNA, die adressiert werden sollen, normalerweise keine Erkennungsse¬ quenz für eines dieser Enzyme enthalten.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich gegenüber dem Stand der Technik da- durch aus, dass sie Konjugate aus Enzymen und sog. Spezifitätsankern bereit¬ stellt, die über einen Linker chemisch miteinander verknüpft sind. Spezifitätsanker sind dabei Oligodeoxynukleotide oder Peptidnukleinsäuren, die mit der Erken¬ nungsstelle der zu adressierenden DNA Doppel- oder Tripelhelices bilden. Die Erkennungsstelle auf der Ziel-DNA des Konjugates ist durch die Erkennungsse- quenzen des Spezifitätsankers und des Enzyms gegeben, wodurch das Konjugat hochspezifisch mit der Ziel-DNA wechselwirkt.
Aufgabe Aufgabe der Erfindung ist es, hochspezifisch mit DNA wechselwirkende Enzym- Konjugate mit programmierbarer Spezifität und ein Verfahren zu ihrer Herstellung bereitzustellen, wobei unter hochspezifisch mit DNA wechselwirkenden Enzym- Konjugaten verstanden wird, dass
- innerhalb der Ziel-DNA genau eine Erkennungssequenz des Enzym- Konjugates existiert,
- es sich bei der Wechselwirkung der Enzym-Konjugate mit der Erkennungsse¬ quenz auf der Ziel-DNA um eine enzymatisch katalysierte Reaktion handelt,
- die enzymatisch katalysierte Reaktion ausgewählt ist aus der Gruppe Spal¬ tung oder Methylierung und homologe Rekombination und Induktion einer DNA-Reparatur oder gezielte Hemmung der Genexpression durch spezifische
Methylierung der Ziel-DNA, und
- die an der Erkennungsequenz der Ziel-DNA stattfindende, durch das Enzym- Konjugat katalysierte Reaktion mindestens zehnmal schneller abläuft als jede andere in Gegenwart des Enzym-Konjugats an anderen als der Erkennungs- sequenz der Ziel-DNA ablaufende Reaktion.
Die Aufgabe der Bereitstellung hochspezifisch mit DNA wechselwirkender Enzym- Konjugate mit programmierbarer Spezifität wird erfindungsgemäß gelöst durch die Merkmale des Anspruchs 1 , d.h. durch Enzym-Konjugate, bei denen ein Enzym über je einen Linker kovalent an mindestens einen sog. Spezifitätsanker gebunden ist, wobei
- das Enzym auf seiner Oberfläche eine reaktive funktionelle Gruppe zur bin- dung eines Linkers aufweist, - es sich bei dem mindestens einen Spezifitätsanker um eine Oligonukleotidver- bindung handelt, die über eine komplementäre Basenpaarung mit einer Triplex-Bildungsstelle (TFS) der Ziel-DNA eine Tripelhelix ausbildet, und die am 5'-Ende oder am 3'-Ende eine reaktive funktionelle Gruppe aufweist,
- der Spezifitätsanker eine Sequenzhomologie von mindestens 85 % zur Triplex-Bindungsstelle aufweist,
- der mindestens eine Linker eine molekulare Verbindung darstellt, die mindes¬ tens eine Kette aus mindestens zwei Kohlenstoffatomen enthält, wobei die Kette an zwei Stellen mit gleichen oder verschiedenen reaktiven funktionellen Gruppen derivatisiert ist, - je eine der beiden reaktiven funktionellen Gruppen des mindestens einen Lin¬ kers eine kovalente chemische Bindung mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms und der reaktiven funktionellen Gruppe des Spezifitätsankers ausbildet, und
- Enzym und Spezifitätsanker mit einen Abstand von mindestens zwei Basen- paaren an die Ziel-DNA gebunden werden.
Die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Enzym- Konjugate bereitszustellen, wird erfindungsgemäß gelöst durch Anspruch 13, in¬ dem nacheinander folgende Schritte durchgeführt werden: - Umsetzung des Linkers mit dem Spezifitätsanker, wobei eine reaktive funktionelle Gruppe des Linkers mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Spezifitätsankers eine kovalente chemische Bindung eingeht,
- Umsetzung mit dem Enzym, wobei die zweite reaktive funktionelle Grup- pe des Linkers mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms eine kovalente chemische Bindung eingeht,
- Reinigung des Endproduktes.
Dem Fachmann ist bekannt, dass es sich bei Enzymen um biokatalytisch wirkende Proteine handelt, die substrat- und reaktionsspezifisch wirken, d.h. jedes Enzym katalysiert einen ganz bestimmten Reaktionsablauf, und dies auch nur bei be¬ stimmten Substraten, nämlich solchen, die nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip genau in die Bindungsstelle des betreffenden Enzyms passen. Als „spezifisch mit DNA interagierend" werden in der vorliegenden Erfindung Enzyme und Enzym- Konjugate verstanden, die substrat- und reaktionsspezifisch nur mit solchen DNA- Bereichen wechselwirken, deren Basensequenz nach dem Schlüssel-Schloss- Prinzip zur Erkennungsstelle des Enzyms passt. Diese Basensequenz bezeichnet der Fachmann als Erkennungssequenz (der Ziel-DNA). Dem Fachmann ist be¬ kannt, dass es zahlreiche DNA-Moleküle gibt, die die Erkennungssequenz für ein bestimmtes Enzym mehrfach aufweisen.
Als „hochspezifisch mit DNA interagierend" werden dagegen in der vorliegenden Erfindung solche Enzym-Konjugate bezeichnet, deren Bindung und nachfolgende substrat- und reaktionsspezifische Wechselwirkung mit der Ziel-DNA von zwei Faktoren abhängt: zum Einen - wie im Falle der oben beschriebenen spezifischen Interaktion - von der Erkennungssequenz für das Enzym, zum Anderen von einer Triplex-Bildungsstelle (TFS) auf der Ziel-DNA, wobei diese TFS benachbart zur Erkennungssequenz für das Enzym liegen muss. Dabei legen Oligonukleotid- und Linkeranteil des Enzym-Konjugates fest, an welcher Stelle der Ziel-DNA und in welchem Abstand zum Enzymanteil des Enzym-Konjugates die Triplexbildung zwi- sehen TFS der Ziel-DNA und Triplex-bildendem Olignukleotidanteil des Enzym- Konjugates erfolgt. Die Spezifität eines derartigen erfindungsgemäßen Enzym- Konjugates kann daher „programmiert" werden, d.h. selbst im Falle von Ziel-DNA, die mehr als eine Erkennungssequenz für ein gewähltes Enzym aufweist, wird durch Kopplung mit einem bestimmten Triplex-bildenden Oligonukleotid und einem Linker (= „Programmierung") erreicht, dass auf der Ziel-DNA genau eine Erken¬ nungssequenz für das Konjugat aus Enzym und TFO existiert. Sollte diese Erken¬ nungssequenz für das Konjugat aus Enzym und TFO mehr als einmal in einer ge¬ nomischen Ziel-DNA auftreten, wird die Anzahl derjenigen Stellen der Ziel-DNA, an die das Konjugat bindet, dennoch gegenüber der Anzahl der Bindungsstellen des unkonjugierten Enzyms minimiert durch das Erfordernis einer der Erken¬ nungssequenz des Enzyms benachbarten TFS (s.o.).
Zur Herstellung von Enzym-Konjugaten mit programmierbarer Spezifität wird das Enzym chemisch über einen Linker an ein Reagenz gekoppelt, das in der Lage ist, DNA spezifisch zu erkennen. Dieses Reagenz wird nachfolgend als „Spezifitäts- anker" bezeichnet.
Solche Spezifitätsanker sind z.B. Oligodesoxynukleotide oder Peptidnukleinsäuren (peptide nucleic aeids, PNA), welche doppelsträngige DNA spezifisch über die Ausbildung einer Doppel- (duplex invasion oder double duplex invasion) und/oder Tripelhelix erkennen können. Die DNA-Erkennung über Doppel- bzw. Tripelhelices erfolgt nach Regeln der Basenpaarung, so dass vorhersagbar ist, welche Sequenz der zu verwendende Spezifitätsanker aufweisen muss, um eine bestimmte Zielse¬ quenz zu erkennen. Der Spezifitätsanker muss eine Sequenzhomologie von min¬ destens 85 % zur TFS der Ziel-DNA aufweisen. Bei einer Länge des Spezifitäts ankers von 12 Basenpaaren entspricht eine Sequenzhomologie von 85 % einer Fehlpaarung. Homologie meint dabei eine komplementäre Identität der intramole¬ kularen Nukleotidbasenpaarung von TFO und TFS, so dass 100 % Sequenzhomo¬ logie bedeuten, dass jeder Nukleotidbase des TFO nach den Regeln der Basen¬ paarung eine jeweils komplementäre Nukleotidbase auf der TFS gegenübersteht. Unter Linker wird eine molekulare Verbindung verstanden, die mindestens eine Kohlenwasserstoffkette aus mindestens zwei C-Atomen enthält, wobei die Kette an zwei Stellen mit gleichen oder verschiedenen reaktiven funktionellen Gruppen derivatisiert ist, wobei Linker mit zwei verschiedenen reaktiven funktionellen Grup¬ pen bevorzugt sind. Diese reaktiven funktionellen Gruppen bilden in bekannten chemischen Reaktionen kovalente chemische Bindungen aus, wobei zuerst eine der funktionellen Gruppen an den Spezifitätsanker und die andere an das Enzym bindet. Alternativ wird zuerst die kovalente Bindung zwischen Linker und Enzym und danach diejenige zwischen Linker und Spezifitätsanker gebildet. Bei diesen chemischen Reaktionen handelt es sich beispielsweise, aber nicht erschöpfend, um die Bildung von Ether-, Thioether-, Ester-, Thioester- oder Amidbindungen. Bevorzugt besteht der Linker aus der kovalenten Verknüpfung eines 5'-Link oder 3'-Link mit einem Crosslinker. Dabei stellt der 5'-Link oder 3'-Link eine molekulare Verbindung dar, die 1. eine Kohlenwasserstoffkette aus mindestens zwei C- Atomen enthält, 2. an das 5'-Ende oder 3'-Ende des Spezifitätsankers gebunden ist und die 3. an einer Stelle eine reaktive funktionelle Gruppe enthält. Dem Fach- mann ist bekannt, dass Nukleinsäurederivate wie Oligodesoxyribonukleotide (ODN) oder PNA, die chemisch mit einem solchen 5'-Link oder 3'-Link verbunden sind, kommerziell erhältlich sind. Bei der reaktiven funktionellen Gruppe handelt es sich z.B. um eine primäre Aminogruppe. Der Crosslinker stellt eine molekulare Verbindung aus mindestens einer Kohlen¬ wasserstoffkette dar, wobei diese mindestens eine Kohlenwasserstoffkette min¬ destens zwei C-Atome enthält und an zwei Stellen reaktive funktionelle Gruppen enthält. Bei den reaktiven funktionellen Gruppen handelt es sich beispielsweise um Ester-, Carbonsäure-, Imid- und/oder Aminogruppen, bevorzugt um Succinimi- dester- und Maleimidogruppen. Stellt der Crosslinker einen Teil der erfindungsge¬ mäßen Enzym-Konjugate dar, so ist eine seiner reaktiven funktionellen Gruppen mit dem Enzym und die andere mit der reaktiven funktionellen Gruppe des che¬ misch an den Spezifitätsanker gebundenen 5'-Link oder 3'-Link jeweils kovalent verbunden. Unter „programmierbarer Spezifität" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass die erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate dergestalt mit einer komplementären DNA-Adresse versehen werden, dass ihre Wechselwirkung mit DNA nach dem Fachmann bekannten Regeln genau einstellbar und hochspezi¬ fisch ist. Die einzelnen Komponenten der erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate - Enzyme, Spezifitätsanker, 5'-Link, 3'-Link und Crosslinker - sind nachfolgend im Detail be¬ schrieben.
Bei den Enzymen, welche erfindungsgemäß über je einen Linker kovalent an min- destens einen sog. Spezifitätsanker gebunden sind, handelt es sich um Typ Il-Restriktionsendonukleasen, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend AcH, Alu\, Bfa\, BsaJ\, Bsl\, BsoR, BssK\, BstU\, Cac8\, Cha\, Csp6\, CwJI,
Ddβ\, Dpn\, DpnW, Fmu\, Fnu4H\, Haelll, Hha\, Hinü, HinPI, HpaU, MaeU, Maβ\\\, Mbo\, Mnl\, Mse\, Msp\, Mwo\, MaIII, MaIV, Rsal, Sau3A\, Sau96\,
ScrR, Tai\, Taq\, Tsp4C\, TspsO9\,
AcIWl, Alw26\, AM, AsuHPl, AvaW, Bbv\, Bcc\, ßcefl, Bin\, Bsb\, BscGl,
Bsel\,BseN\, BsmA\, BsmF\, BspLUIHW, Bsή, BsrS\, Bst7l\, BstF5\, BstNl, Cje\,
CjeP\, EcoRW, Faul, Fin\, Fok\, Hga\, Hph\, MboU, NcH, Ple\, SfaN\, Sim\, Tau\, T/71, Tsel, Tsp45\, TspR\, VpallA\,
Acc\, Afl\\\, Apo\, /Aval, ßanl, ßanll, Bmgl, Bsa\, BsaH\, BsaW\, BsiEl,
BsiHKAΪ, BsoBl, Bsp1286\, BsrF\, BstY\, Dsa\, Eae\, EcoO109\, Gc(ZII, Hael,
Haell, Hin4\, HincW, Mme\, MsIl, MspAW, Nsp\, Scf\, Sty\, Tat\, TtNIIW, Aat\,
Accll3\, Acc65\, AclN\, AfIW, Alw44\, Apa\, Apaü, Ase\, Asp718\, /WrII, Sa/l, ßamHI, Bbu\, Bbs\, BcH, Bf ή, BgIW, Bln\, BpH, Bpm\, Bsa\, BsaM\, BseR\,
ßsmßl, ßsml, Bsp120\, Bspl407\, Bsp19\, Bsphft, BspLUIH, BspM\, BspT\,
BsrG\, BstllO7\, Bst98\, Dra\, EamllO4\, Eaή, Ecll36\\, Eco147\, Eco255\, E-
co57\, EcoN\, EcoR\, EcoRV, EcoT22\, HindlW, Hpa\, Kpn\, Mfe\, Msc\, Λ/col,
Λ/ctel, Miel, NsH, Psü, PvuW, Sac\, Sca\, Spe\, Sph\, Ssp\, Sst\, Stu\, Xba\,
AatW, Bbe\, BsH, BsiW\, BsmB\, BspD\, BsrB\, BssHW, Bst2B\, Cla\, Eag\, EcH,
Eco47W\, Ehel, Esp3\, Fsp\, Kas\, Mlu\, Naή, Nru\, PfH 1081, PmH, Psp1406\,
Pvu\, SacW, Snaßl, Xho\,
Asc\, Bae\, Fse\, Noü, Päd, Pme\, PpuM\, Rsή\, SanD\, Sap\, SexA\, SfH, Sgfl, SgrA\, Srft, Sse8387\, Swa\
Asp\, BgH, Bsg\, Dralll, DsaV, EcIXi, Ksp632\, Mae\, Mam\, Mcή, Mun\, Rle\, Ssp4800\, andere spezifisch DNA spaltende Nukleasen, insbesondere Homingendo- nukleasen, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend, I-Crel, I-Ppol, F-Scel, F-Scell, F-SwI, F-Tevl, F-Tet/Il, \-Ama\, \-Ani\, I-Ceul, \-CeuA\\P, \-Chu\, I-Cmoel, I-Cpal, I-Cpall, I-Crel, \-Crepsb\P, 1-CrepsbllP, 1-CrepsblllP, \-Crepsb\\/P, \-Csm\, \-Cvu\, \-CvuA\P, I-Dcf/I, \-Ddi\\, \-Diή, \-Dmo\, \-Hmu\,
\-Hmu\\, \-HspN\P, l-L/al, \-Mso\, l-Λ/aal, l-Λ/anl, l-Λ/c/IP, 1-Λ/α/rlP, \-Nit\, l-Λ/yal, \-Nsp236\P, \-Pak\, \-Pbo\P, \-Pcu\P, \-PcuA\, 1-PcuVI, \-PgήP, \-Pob\P, \-Poή, 1-PorllP, 1-PpblP, I-Ppol, 1-SPBetelP, I-Scal, I-Scel, I-Scell, I-Scelll, 1-ScelV, 1-SceV, 1-SceVI, 1-SceVII, 1-SexlP, 1-SnelP, 1-SpomCP, 1-SpomlP, l-SpomllP, l-SqrulP, \-Ssp6803\, \-SthPhiJP, \-SthPhiST3P, \-SthPhiS3bP, l-TcfelP, \-Tev\,
\-Tev\\, \-Tev\W, \-UarAP, \-UarHGPA1P, \-UarHGPA13P, Pl-Pspl Pl-SPßetelP, Pl-Scel, PI-TfUl, PI-TYuII, P\-Thy\, PI-77/I, PI-77/II.
DNA-Reparaturenzyme, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend, MutH und Vsr, - DNA-Methyltransferasen, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend, M.Sssl, M.Hhal, EcoDam, DNA-Methyltransferasen aus Säugern oder katalytisch akti¬ ve aktive Fragmente davon, darunter beispielsweise die humanen Methyltrans- ferasen DNMT1 , DNMT3a und DNMT3b,
Die Bindung des Enzyms an den Linker erfolgt durch Ausbildung einer kovalenten chemischen Bindung zwischen einer reaktiven funktionellen Gruppe des Linkers und der auf der Oberfläche zugänglichen reaktiven funktionellen Gruppe des En¬ zyms. Bei dieser auf der Oberfläche zugänglichen reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms handelt es sich beispielsweise um ein singuläres Cystein im Falle einer Restriktionsendonuklease oder um einen mit Hilfe einer ortsspezifischen Mu- tagenese in eine Methyltransferase eingeführtes Cystein. Alternativ sind bei¬ spielsweise Enzyme ohne oberflächlich zugängliches Cystein einsetzbar, wobei in diesem Falle bevorzugt Oligonukleotidderivate eingesetzt werden, die einen 5'- SH-Link oder 3'-SH-l_ink aufweisen. Dem Fachmann ist bekannt, wie er weitere oberflächlich zugängliche funktionelle Gruppen in Enzyme einführen kann. Er kann diese Methoden, ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu verlassen, ver¬ wenden, um die im Rahmen der vorliegenden Erfindung einzusetzenden Enzyme gegebenenfalls dergestalt zu modifizieren, dass sie mit einem Linker umsetzbar sind.
Bei den Spezifitätsankern handelt es sich um Oligonukleotide und Oligonukleotid- analoga - zusammengefasst als „Oligonukleotidverbindungen" bezeichnet -, die aus 10 bis 20 Nukleotiden bestehen, um eine spezifische Adressierung zu ge¬ währleisten und eine Paarung einzugehen, die hinreichend stabil ist, um unter den Reaktionsbedingungen in der Zelle oder in vitro eine Bindung des Konjugats an die Zielsequenz sicherzustellen, die eine Sequenzhomologie von mindestens 85 % zur TFS der Ziel-DNA aufweisen, beispielsweise um - Oligodesoxyribonukleotide (ODN) und ihre Derivate, darunter beispielsweise Oligonukleotide, deren Phosphatgerüst teilweise Phosphodiester- und teilwei- se oder ausschließlich modifizierte Phosphorothioatgruppen aufweist, Me- thylphosphonat-, H-Phosphonat- oder andere phosphatanaloge Gruppen auf¬ weist oder durch andere Verbindungen ersetzt ist, wie beispielsweise die Me- thylen(methylimino)- oder Methylencarboxamid-Gruppe, sowie ODN1 deren Ri- boseeinheit am 2'-C- oder 4'-C-Atom modifiziert ist oder durch einen anderen
Zucker ersetzt ist, wie beispielsweise das α-Anomer der Desoxyribose, Peptidnukleinsäuren (PNA), - Threose-Nukleinsäureanaloga (TNA), beispielsweise
α-Threofuranosyl-(3'->2')-Oligonukleotide, die mit DNA eine Tripelhelix bilden
oder spezifisch mit einem Strang der DNA eine Paarung eingehen können
Dem Fachmann ist bekannt, dass zahlreiche der genannten Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga, mit einem 5'-Link oder 3'-Link versehen, kommerziell er¬ hältlich sind, während er nicht kommerziell erhältliche, beispielsweise mit einem
3'- oder 5'-Link versehene TNAs, PNAs und Oligonukleotidderivate mit ß-
anomerer Ribose mit Hilfe seines Fachwissens selbst herstellen kann. Bevorzugt werden Olignukleotide und Oligonukleotidanaloga mit einem 5'-Aminolink verwen¬
det, wobei es sich bei dem 5'-Aminolink beispielsweise um eine ω-
Aminoalkylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen handelt, besonders bevorzugt mit 2 bis
12 C-Atomen, verwendet, darunter ω-Aminohexyl- und ω-Amino-n-
dodecylgruppen. Alternativ werden Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga mit einem 5'-SH-Link oder 3'-SH-Link verwendet.
Als Crosslinker, die kovalent an die reaktive funktionelle Gruppe des 5-Link oder 3'-Link des Spezifitätsankers und die oberflächlich zugängliche reaktive funktionel- Ie Gruppe des Enzyms gebunden werden, sind Verbindungen geeignet, die über zwei reaktive funktionelle Gruppen verfügen, von denen eine spezifisch mit der reaktiven funktionellen Gruppe des 5'-Link oder 3'-Link des TFO und die andere mit der oberflächlich zugänglichen reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms verbunden wird, beispielsweise eine Succinimidester- und eine Maleimidfunktion,
wie es in N-(γ-Maleimidobutyryloxy-)succinimidester der Fall ist. Weitere Crosslin- ker sind dem Fachmann bekannt und können, ohne den Schutzbereich der Pa¬ tentansprüche zu verlassen, verwendet werden. Die beiden reaktiven funktionellen Gruppen des Crosslinkers sind bevorzugt in einem Abstand von 1 bis 20 CH2- Gruppen und ganz besonders bevorzugt in einem Abstand von 6 bis 12 CH2- Gruppen angeordnet.
Erfindungsgemäß deckt die durch Verknüpfung von Crosslinker und 5'-Link oder 3'-l_ink gebildete, als Linker bezeichnete Einheit, auf der Ziel-DNA des Enzym- Konjugates einen Abstand von mindestens 2 Basenpaaren, bevorzugt 2 bis 20 bp, zwischen Erkennungssequenz für das Enzym und der Adresse für das TFO auf der Ziel-DNA ab.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Enzyme mit programmierbarer Spezifität erfolgt durch eine kovalente Kopplung von Spezifitätsanker und Enzym mit Hilfe bifunktioneller Crosslinker. Es werden kommerziell erhältliche Crosslinker wie bei-
spielsweise N-(γ-Maleidobutyryloxy-)succinimidester eingesetzt, die auf der einen
Seite des Spezifitätsankers mit der reaktiven funktionellen Gruppe des 5'-Link o- der 3'-Link reagieren und auf der anderen Seite mit der oberflächlich zugängli¬ chen, d.h. zum Lösungsmittel hin exponierten, reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms, bei der es sich beispielsweise um ein Cystein oder eine nicht natürliche Aminosäure handelt. Das mit dem TFO verknüpfte Enzym muss von dem freien Enzym abgetrennt werden, was durch chromatographische Verfahren geschieht, beispielsweise durch lonenaustauschchromatographie.
Tripelhelixbildung mit Oligodesoxyribonukleotiden oder PNAs ist hochspezifisch. Während Oligodesoxyribonukleotide eine DNA-Erkennungssequenz von 10 bis 20 Basenpaaren benötigen, können PNAs jede Sequenz spezifisch erkennen. Die vorliegende Erfindung nutzt diese Spezifität, um die Spezifität der DNA-Erkennung eines mit DNA interagierenden Enzyms zu erhöhen, indem die inhärente Spezifität des mit DNA interagierenden Enzyms beibehalten und erweitert wird. Damit wird sichergestellt, dass an der DNA eine chemisch definierte Modifikation vorgenom¬ men wird. So wird die DNA z.B. von einem erfindungsgemäßen TFO- Restriktionsendonuklease-Konjugat weiterhin an der für das Restriktionsenzym definierten Spaltposition gespalten. Ein erfindungsgemäßes TFO- Methyltransferase-Konjugat überträgt Methylgruppen weiterhin nur auf die Zielba- se innerhalb der Erkennungssequenz der Methyltransferase. In beiden Fällen werden durch die erfindungsgemäßen Konjugate aber nicht alle Zielsequenzen dieses Enzyms auf der Ziel-DNA-gespalten bzw. methyliert, sondern nur diejeni¬ gen, welche benachbart auch die Erkennungssequenz für das TFO aufweisen.
Die erfindungsgemäßen hochspezifisch mit DNA wechselwirkenden Enzym- Konjugate mit programmierbarer Spezifität sind für zahlreiche Anwendungen ge¬ eignet, bei denen unterschiedliche Gene und DNA-Sequenzen, unabhängig da¬ von, ob sie aus Prokarya, Eukarya oder Archaea stammen, gezielt adressiert wer¬ den müssen und/oder eine spezifische Manipulation von DNA erforderlich ist. Un- ter gezielter Adressierung ist hierbei die exklusive Adressierung von solchen Er¬ kennungssequenzen eines Enzyms zu verstehen, die einer TFS benachbart sind. Dabei findet keine enzymatische Reaktion an solchen Erkennungsstellen des En¬ zyms statt, welche keiner TFS benachbart sind. Eine spezifische Manipulation von DNA bedeutet, dass die Manipulation ortsspezifisch bezogen auf Sequenz und Spalt- oder Modifikationsstelle ist und eine definierte chemische Reaktion kataly¬ siert wird.
So können programmierbare Restriktionsendonuklease-Konjugate zur Manipulati¬ on großer DNA-Moleküle in vitro eingesetzt werden, da sie für die gezielte Spal- tung jeder geforderten Stelle der Ziel-DNA programmierbar sind. Unter „groß" werden dabei DNA-Moleküle verstanden, die aus mindestens 10.000 Basenpaa¬ ren bestehen. Diese programmierbaren Restriktionsenzym-Konjugate sind daher beispielsweise zur Klonierung und Charakterisierung von kleinen und großen DNA-Fragmenten geeignet. Die erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate eignen sich für das in vitro-Mapping genomischer DNA. Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass es hierbei - und bei allen anderen in vitro-Verwendungen - nicht zwingend erforderlich ist, dass die Erkennungssequenz für ein erfindungsgemäßes Enzym-Konjugat auf der Ziel- DNA nur ein einziges Mal vorkommt. Zur Verwendung in vitro sind solche erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate geeig¬ net, bei denen der Spezifitätsanker eine Sequenzhomologie von mindestens 85 % zur TFS der Ziel-DNA aufweist und bei denen die an der Erkennungsequenz der Ziel-DNA stattfindende, durch das Enzym-Konjugat katalysierte Reaktion mindes¬ tens zehnmal schneller abläuft als jede andere in Gegenwart des Enzym- Konjugats an anderen als der Erkennungssequenz der Ziel-DNA ablaufende Re¬ aktion. Bevorzugt werden solche erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate für in vitro-Verwendungen eingesetzt, bei denen die Sequenzhomologie zwischen TFO und TFS 90 % bis 100 % beträgt und die durch das Enzym-Konjugat katalysierte Reaktion mindestens 100 mal schneller abläuft als jede andere in Gegenwart des Enzym-Konjugats an anderen als der Erkennungssequenz der Ziel-DNA ablaufen¬ de Reaktion.
Ganz besonders bevorzugt sind Enzym-Konjugate, bei denen der Spezifitätsanker eine Sequenzhomologie von 100 % zur TFS der Ziel-DNA aufweist und die an der Erkennungsequenz der Ziel-DNA stattfindende, durch das Enzym-Konjugat kata¬ lysierte Reaktion mindestens tausend Mal schneller abläuft als jede andere in Ge¬ genwart des Enzym-Konjugats an anderen als der Erkennungssequenz der Ziel- DNA ablaufende Reaktion. Diese ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate eignet sich außerdem für Verwendun- gen in vivo, sofern auf der Ziel-DNA genau eine Erkennungssequenz für dieses Enzym-Konjugat existiert und diese Erkennungssequenz genau einmal auf der Ziel-DNA vorliegt.
Nach dem derzeitigen Stand der Technik ist die geringe Ausbeute, mit der in ZeI- len eingebrachte DNA durch Rekombination in das Gen integriert wird, ein zentra¬ les Problem der Gentherapie. Das Einbringen eines spezifischen Doppelstrang¬ bruchs erhöht die Ausbeute der Rekombination mehr als 1000-fach. Die erfin¬ dungsgemäßen programmierbaren Restriktionsendonuklease-Konjugate schnei¬ den die DNA dagegen gezielt an der Zielstelle, stimulieren dadurch die homologe Rekombination und steigern damit die Effizienz des Austausche von Ziel-DNA- Sequenzen mit dem Ziel der DNA-Reparatur durch exogene DNA (gene targeting). Hierbei ist auch sichergestellt, dass die exogene DNA an einem vorbestimmten Ort in das Genom integriert wird. Programmierbare Restriktionsendonuklease- Konjugate eignen sich somit für die Gentherapie und die experimentelle Genetik zur Erzeugung von Organismen, beispielsweise tierischen oder pflanzlichen Orga- nismen, mit Veränderungen in der DNA-Sequenz. Des Weiteren stimulieren die erfindungsgemäßen hochspezifisch mit DNA wechselwirkenden Enzyme die DNA- Reparatur in Zellen durch einen gezielten Doppelstrangbruch. Eine gezielte DNA-Methylierung mit Hilfe der erfindungsgemäßen hochspezifisch mit DNA wechselwirkenden Enzyme ist für die in vitro-Manipulation von DNA ge¬ eignet, indem beispielsweise DNA gezielt an einem Adeninrest einer GATC- Sequenz methyliert und die modifizierte Sequenz durch das Restriktionsenzym Dpnl gezielt gespalten wird. Da DNA-Methylierung eine stabile Repression der Genexpression induziert, eig- nen sich erfindungsgemäße programmierbare DNA-Methyltransferasen zur Re¬ pression der Genexpression. Eine gezielte Repression von Genen hat eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen, denen gemein ist, dass z.B. die Expression eines Krankheitsgens inhibiert wird. Bei den in Frage kommenden gewünschten Inhibierungsreaktionen handelt es sich beispielsweise um die Repression der Ex- pression von Onkogenen in der Tumortherapie oder die Repression der Expressi¬ on viraler Proteine bei der Bekämpfung von viralen Infektionen. Bei amyloiden Speichererkrankungen (z.B. Parkinson, Alzheimer) wird die Expression des Vor¬ läuferproteins inhibiert und damit die Progression der Krankheit gestoppt. Ein Vor¬ teil der erfindungsgemäßen programmierbaren DNA-Methyltransferase- Konjugaten ist, dass ein einmal verändertes Methylierungsmuster der DNA stabil bleibt und vom zellulären Methylierungssystem erhalten wird. Daher ist keine dau¬ erhafte Anwesenheit der erfindungsgemäßen programmierten DNA- Methyltransferase erforderlich, und die genomische DNA-Sequenz der Zielzelle bleibt unverändert. Die erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate sind des weiteren als Hilfsmittel für die biomedizinische Forschung geeignet, beispielsweise für die experimentelle Reduk¬ tion der Expression eines Gens, für die Herstellung transgener Organismen oder zur Manipulation von DNA, besonders für die Manipulation großer DNA-Moleküle.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung von Kits verwendet wer¬ den, die Mittel zur Kopplung von Crosslinkeren an Enzyme und mit einem 5'-Link oder 3'-Link versehene Spezifitätsanker bereitstellen, so dass die mit einem 5'- Link oder 3'-Link versehenen Spezifitätsanker zunächst mit den bereit gestellten Crosslinkem und anschließend mit den bereit gestellten Enzymen zu erfindungs¬ gemäßen Enzymkonjugaten umgesetzt werden. Dem Hersteller des erfindungs¬ gemäßen Kits ist aus seinem allgemeinen Wissen bekannt, wie er die einzelnen Komponenten des Kits, z.B. Enzyme, Crosslinker, Spezifitätsanker und Puffer, herstellt, formuliert und lagert.
Die erfindungsgemäßen hochspezifisch mit DNA interagierenden Enzym- Konjugate mit programmierbarer Spezifität können als Arzneimittel für Patienten zur Therapie, Diagnostik und Prophylaxe von Erkrankungen verwendet werden, bei denen eine Störung der Genexpression auftritt, wobei unter Störung sowohl pathogene Hyper- als auch Hypoexpression verstanden wird. Bei diesen Erkran¬ kungen handelt es sich beispielsweise um Viruserkrankungen (z.B. AIDS, Herpes simplex), Tumorerkrankungen (z.B. chronische myeloische Leukämie), amyloide Speichererkrankungen (Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson). Des Weiteren zählen hierzu monogen hereditäre Erkrankungen, dar- unter Muskoviszidose (Cystische Fibrose), Phenylketonurie, Albinismus, Adreno- genitales Syndrom, Mukopolysaccharidosen, Galaktosämie, hereditäre Taubstummheit, Xeroderma pigmentosum, Sichelzellanämie, Brachydaktylie, A- chondroplasie, Apert-Syndrom, Neurofibromatose, Marfan-Syndrom, Osteogene¬ sis imperfecta Typ I1 Chorea Huntington, Myotone Dystrophie, Rot-Grün- Farbsinnstörungen, Hämophilie A und B, Muskeldystrophie Typ Duchenne / Typ Becker, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Glykogenspeicherkrankhei- ten (z.B. Pompe).
Der Begriff Patient bezieht sich dabei gleichermaßen auf Menschen und Wirbeltie¬ re. Damit können die Arzneimittel in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden. Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen von Verbindungen gemäß den Ansprüchen deren Salze, Ester, oder Amide können, sofern sie nach zuver¬ lässiger medizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen. Die therapeutisch wirksamen Ver¬ bindungen der vorliegenden Erfindung können dem Patienten als Teil einer phar- mazeutisch akzeptablen Komposition entweder oral, rektal, parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intracistemal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, intrathekal, intravesikal, topisch, lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Spray¬ form (Aerosol) verabreicht werden. Die intravenöse, subkutane, intraperitoneale oder intrathekale Gabe kann dabei kontinuierlich mittels einer Pumpe oder Dosier- einheit erfolgen. Dosierungsformen für die örtliche Administration der erfindungs¬ gemäßen Verbindungen schließen Salben, Puder, Zäpfchen, Sprays und Inhalati¬ onsmittel ein. Die aktive Komponente wird dabei unter sterilen Bedingungen mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen stabilisierenden und/oder konservierenden Zusätzen, Puffern, Verdünnungs- und Treibmitteln je nach Bedarf vermischt. Ausführungsbeispiele
1. Proteine und Oligonukleotide Als Bindungspartner zur Herstellung eines adressierten Restriktionsenzyms wird die einzelsträngige Variante scPvull des Restriktionsenzyms Pvull verwendet, da in dieser Variante ein einzelnes Cystein für die Kopplung mit dem TFO einführbar ist. Am C-Terminus von scPvull wird ein His6-tag, gefolgt von vier Glycinresten und einem Cysteinrest eingeführt: [2-157]-GSGG-[2-157J-H6G4C. Diese einen Cysteinrest enthaltende Variante des ScPvUlI-H6G4C wird durch eine PCR-basierte ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von pRIZ'-scPvull als Templat hergestellt. Die PCR-basierte ortsspezifische Mutagenese. ist dem Fachmann bekannt und in RD Kirsch, E JoIy: An imporved PCR-mutagenesis stra- tegy for two-site mutagenesis or sequence swapping between related genes. Nuc- leic Acids Res 1998, 26, 1848-1850 beschrieben. Die Verwendung von pRIZ'- scPvull als Templat ist dem Fachmann beispielsweise aus A Simoncsits, ML Tjornhammar, T Rasko, A Kiss, S Pongor: Covalent joining of the subunits of a homodimeric type Il restriction endonuclease: single-chain Pvull endonuclease, J Mol Biol 2001 , 309, 89-97 bekannt. Die His6-tagged scPvull-Variante wird nach der dem Fachmann aus W Wende, W Grindl, F Christ, A Pingoud, V Pingoud: Binding, bending and cleavage of DNA Substrates by the homing endonuclease Pl-Scel, Nucleic Acids Res 1996, 24, 4123-4132 bekannten Methode exprimiert und aufgereinigt und in 0,03 M K-Phosphat pH 7,2, 0,5 M NaCI, 0,2 M Imidazol, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,01 % Lubrol (w/v) bei 4 0C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Triplex bildende Oligonukleotide (TFO) enthalten einen 5'-C6-Spacer oder einen 5'-C6-Spacer mit einer terminalen Aminogruppe (Eurogentec, Köln, Deutschland): 5'-NH2-[CH2]6/12-MPMPMPMPMPPPPPPT-3', wobei M für 5-Methyl-2'- desoxycytidin und P für 5-[1-Propinyl]-2'-desoxyuridin steht.
2. Gelelektrophoretischer Mobilitätsshift-Assay
Gelelektrophoretische Mobilitätsshift-Assays werden mit den TFO und einem kom¬ plementären doppelsträngigen Oligonukleotid durchgeführt. Hierzu werden 50 bis 500 nM TFO mit 500 nM 32P-markiertem doppelsträngigem 5'- d(GAGAGAGAGAAAAAAA) -3' in 10 mM Tris-Phosphat, pH 7,2, 1 mM Spermin bei 37 0C für 1 h in einem Volumen von 15 μl inkubiert. Anschließend werden 5 μl 10 mM Tris-Phosphat pH 7,2, 25 % (w/v) Sucrose zugegeben. Die Komplexbil¬ dung wird mittels Gelelektrophorese über 15%-ige Polyacrylamidgele in 10 mM Tris-Phosphat, pH 7,2, bestimmt. Nach der Elektrophorese werden die Gele ge- trocknet und die radioaktiven Banden mit einem Instant Imager (Canberrra Pa¬ ckard) sichtbar gemacht. Die quantitative Auswertung der gelelektrophoretischen Mobilitätsshift-Assays ergibt für die Bindung zwischen TFO und ds DNA eine Bin¬ dungskonstante KaSs=6,4*10'7M"1.
3. Assay zur Untersuchung des Schutzes von Restriktionsenzymen vor Spaltung
Der Assay zur Untersuchung des Schutzes von Restriktionsenzymen vor Spaltung wird mit einem 150 bp DNA-Substrat durchgeführt, das eine Fokl-Stelle und eine daneben liegende, die Spaltungsstelle von Fokl überlappende Tripelhelix- Bildungsstelle (TFS) stromabwärts aufweist. 1 μM Substrat wird in 10 mM Tris- Phosphat pH 7,2 mit 10 μM TFO oder - im Falle der Kontrolle - einem nicht spezi¬ fischen Hexadecadeoxyribonukleotid für 4 h bei 37 0C in 70 μl Gesamtvolumen inkubiert. Anschließend werden 40 U Fokl in Spaltungspuffer bis zu einem Endvo¬ lumen von 100 μl zugegeben. Nach 30, 60, 90, 120, 300, 600, 1200,1800, 2700 und 3600 Sekunden werden 10 μl-Aliquote entnommen und die Reaktion durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 50 mM beendet. Nach Zu¬ gabe von 5 μl Ladepuffer (10 % w/v) Ficoll, 10 % (w/v) Glycerin, 0,2 % (w/v) Bromphenolblau, 0,2 % Xylencyanol) wird der Spaltungsschutz durch Elektropho¬ rese über 12 %-ige Polyacrylamidgele in 80 mM Tris-Phosphat pH 8,2, 2 mM ED- TA bestimmt. Die Banden werden durch Färben des Gels mit Ethidiumbromid (0,1 μg/ml) und Bestrahlen mit UV-Licht sichtbar gemacht.
4. Crosslinking-Reaktion
Zur Aktivierung des Oligonukleotids werden 500 μM TFO mit 40 mM des bifunktio-
nalen Crosslinkers N-(γ-Maleidobutyryloxy)-succinimidester (GMBS) (Pierce Che¬
mical, Rockford / Illinois, USA) in 140 mM NaCI, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1 ,4 mM K2HPO4, pH 7,2 (PBS-Puffer) für eine Stunde bei 23 0C inkubiert. Nicht umgesetzter Crosslinker wird mittels Anionenaustauschchromatographie in zwei Schritten entfernt, wobei im ersten Schritt eine NAP®5- und im zweiten Schritt eine NAP®-10-Säule (Amersham, Braunschweig, Deutschland) verwendet wird. Das entsalzte aktivierte TFO wird in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Reines, ent¬ salztes aktiviertes TFO wird in einer Ausbeute von >70 %, bezogen auf das als Edukt eingesetzte nicht aktivierte TFO, erhalten. Das entsalzte aktivierte TFO wird in 80 μl PBS-Puffer gelöst. Für die Crosslinking-Reaktion zwischen Oligonukleotid und Protein werden 80 μM aktiviertes TFO für 1 h bei 23 0C mit 20 μM scPvull- H6G4C inkubiert. Das scPvull-H6G4C wird zuvor für 4 h gegen PBS-Puffer dialy- siert, um DTT zu entfernen. Die Ausbeute der Crosslinking-Reaktion wird mittels 15%-iger SDS-PAGE bestimmt.
5. Protein-TFO-Aufreinigung
Nicht kovalent mit dem TFO verknüpfte ScPvUlI-HeG4C wird durch Anionen- austauschchromatographie von quervernetztem scPvull-H6G4C-c6/ci2-TFO ge¬ trennt, wobei DE52 in 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 3 mM EDTA und ein linearer Gra¬ dient von 100 mM bis 400 mM NaCI verwendet werden. Der Proteingehalt jeder Fraktion wird mittels 15 %-iger SDS-PAGE bestimmt. scPvull-H6G4C eluiert mit dem ersten Durchfluss, d.h. bevor mit der Gradientenelution begonnen wird, wo¬ hingegen scPvull-H6G4C-c6/ci2-TFO während der Gradientenelution bei einer NaCI-Konzentration von 350 mM bis 390 mM eluiert. Das aufgereinigte scPvull- H6G4C-c6/ci2-TFO wird gegen PBS-Puffer dialysiert, welcher 25 % PEG 10000 enthält, und anschließend bis zur weiteren Verwendung bei 4 0C gelagert.
6. Substrate für DNA-Spaltungsversuche
Für die DNA-Spaltungsversuche werden radioaktiv markierte 239 bp-Substrate,
die eine Pvull-Schnittstelle enthalten, mittels PCR unter Verwendung von [α-32P]
dATP hergestellt. Als Templat für die Herstellung des 239 bp-PCR-Produktes wird das pAT153-Plasmid verwendet, welches eine Pvull- an Stelle einer BamHI- Schnittstelle enthält, wobei die folgenden Primer eingesetzt werden: 5'- GGCCTCTTGCGGGAGATCTTCCATTCCG AC-31 und 5'-∞GTACTO^CGACAGTCGGCGCACATCAGACAGCTGACAGGACGGGT&3' (Die Pvull-Schnittstelle ist CAGCTG). Das nicht adressierte 478 bp-Substrat enthält keine TFS-Stelle und wird mittels PCR mit demselben Plasmid hergestellt, wobei [σ-32P]dATP und 5'- ATAGGCGC- CAGCAACCGCACCTGTG-3' und δ'-AATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTC-S' als Primer verwendet werden. Dieses nicht adressierte Substrat besitzt dieselbe Sequenz wie die adressierten Spal¬ tungssubstrate (siehe unten) mit Ausnahme seiner größeren Anzahl von Basen¬ paaren und der TFS. Alle Substrate werden über PCR-Säulen aufgereinigt (Qia- gen, Hilden, Deutschland). Die Reinheit wird mittels nativer PAGE bestimmt. Die Konzentration wird unter der Voraussetzung bestimmt, dass 1 OD260nm 50 ng/μl entspricht.
7. Kompetionsversuch: Spaltung von Substraten mit und ohne TFS
In diesem Kompetitionsversuch wird die Spaltung eines 478 bp-Substrates ohne TFS mit derjenigen eines 239 bp-Substrates mit einer TFS im Abstand von 9 bp zur Pvull-Schnittstelle verglichen. Es wird scPvull-Ci2-TFO verwendet. Die Präin¬ kubation des scPvull-ci2-TFO mit den jeweiligen DNA-Substraten wird bei 23 0C für 10-15 h in dem für die Tripelhelixbildung geeigneten Puffer 10 mM Tris- Phosphat pH 7,2, 1 mM Spermin, 3 mM EGTA in Abwesenheit von Mg2+ durchge¬ führt, um die Bindung der Pvull-Schnittstellen ohne benachbarte TFS sowie DNA- Spaltung zu verhindern, welche beide die Anwesenheit von Mg2+ erfordern. Bei dieser Präinkubation werden im Wesentlichen äquimolare Konzentrationen von scPvull-ci2-TFO und adressiertem DNA-Substrat eingesetzt, um eine im Wesentli¬ chen stöchiometrische Bindung der TFS zu erreichen und freies Enzym im Reakti¬ onsgemisch zu vermeiden. Die Spaltung wird durch Zugabe von Pvull- Spaltungspuffer, bestehend aus 10 mM Tris-HCI pH 7,2, mit MgCI2 in verschiede¬ nen Konzentrationen gestartet. Dabei betragen die Endkonzentrationen 1 ,25 mM, 2,5 mM und 5 mM MgCI2. Die Präferenz für das adressierte Substrat ist abhängig von der MgCI2-Konzentration: Mit abnehmender MgCI2-Konzentration nimmt die Geschwindigkeit der Spaltung des nicht adressierten 478 bp-Substrates ab und erreicht bei einer Konzentration von 1 ,25 mM MgCI2 den Wert Null, wohingegen die Geschwindigkeit der Spaltung des adressierten 239 bp-Substrates unverändert bleibt (Fig. 5 a und 5b). Bei einer MgC^-Konzentration von 1 ,25 mM liegen in der Reaktionsmischung die gleichen Mengen an gebildetem Produkt und scPvull-Ci2- TFO vor, so lange die Menge des eingesetzten scPvull-ci2-TFO die Menge des adressierten Substrates nicht übersteigt. Werden mehr als stöchiometrische Men¬ gen des Enzyms im Vergleich zur DNA zugegeben, so tritt zusätzlich Spaltung des nicht adressierten Substrates ein, wobei die letztgenannte Spaltung mit einer im Wesentlichen sehr geringen Geschwindigkeit verläuft.
8. Einfluss des Abstandes zwischen TFS und Pvull-Schnittstelle und der Länge des Linkers auf die Spaltung In verschiedenen Abständen zur Puvll-Schnittstelle wird durch ortsspezifische Mu- tagenese eine angrenzende Tripelhelix-Bildungsstelle (TFS, triple helix forming Site) eingeführt, und zwar 3, 5, 7, 9, 11 bzw. 13 bp stromabwärts der TFS, so dass alle adressierten 239mer-Substrate angrenzend an die Pvull-Schnittstelle (fett) dieselbe Sequenz mit Ausnahme der TFS (unterstrichen) besitzen: 3 bp 5'- CGGTACTCGACGTTTTTTTCTCTCTCTCAGACAGCTG ...-3"
5 bp 5'- CGGTACTCGA I I I I I I I CTCTCTCTCGCAGACAGCTG...-3'
7 bp 51- CGGTACTCTTTTTTTCTCTCTCTCCAGCAGACAGCTG...-31
9 bp 5'- CGGTAC I I I I I I I CTCTCTCTCCACAGCAGACAGCTG ...-3'
11 bp 5'- CGG I I I I I I I I CTCTCTCTCCGCACAGCAGAC AGCTG...-3' 13 bp 5'- CGTTTTTTTCTCTCTCTCGGCGCACAGCAGACAGCTG...-3'
Außerdem werden zwei scPvull-TFO-Konjugate wie oben beschrieben hergestellt, die sich nur in der Länge des Linkers unterscheiden: scPvull-cβ-TFO und scPvull- C12-TFO. Um die DNA-Spaltung zu bestimmen, werden 45 nM jedes Substrats mit 5 nM SCPvUlI-H6G4C-Ce-TFO bzw. scPvull-Ci2-TFO bei 37 0C in 10 mM Tris- Phosphat pH 7,2, 10 mM MgCI2, und 1 mM Spermin gespalten. Die Spaltung wird nach 5, 10, 20, 30, 60 bzw. 110 min durch Zugabe von EDTA bis zu einer End- konzentration von 50 mM beendet. Die Reaktionsprodukte werden durch Elektrophorese über 12 %-ige PAGE-GeIe bestimmt. Anschließend werden die Gele getrocknet und die radioaktiven Banden mittels Autoradiographie unter Ver¬ wendung eines Instant Imager-Systems (Canberra Packard, Rüsselsheim, Deutschland) bestimmt. Die Ziel gerichtete Spaltung von 45 nM scPvull-H6G4C-c6/ci2-TFO wird im Kompe- titionsversuch durch gleichzeitiges Inkubieren mit je 45 nM des adressierten und des nicht adressierten Substrates in 10 mM Tris-Phosphat pH 7,2, 1 mM Spermin, 3 mM EGTA bei 23 0C für 12 bis 18 h untersucht. EGTA wird dem Präinkubati¬ onspuffer zugesetzt, um Ca2+-lonen zu komplexieren, die selbst bei niedrigen Konzentrationen die spezifische Bindung des nicht adressierten Substrates an die Pvull-Stelle stimulieren. Die Spaltungsreaktion wird bei 37 0C gestartet, indem identische Volumina des Spaltungspuffers 10 mM Tris-HCI pH 7,2 zugegeben werden, die verschiedene Konzentrationen an MgCI2 enthalten, wobei die End¬ konzentration an MgCI2 1 ,25 mM, 2,5 mM bzw. 5 mM beträgt. Die Spaltungsreak- tion wird gestoppt, und die Spaltungsprodukte werden wie oben beschrieben be¬ stimmt.
Die Spaltungsgeschwindigkeiten der nicht adressierten Substrate sind in allen Re¬ aktionen, die mit 1 ,25 mM MgCI2 durchgeführt werden, sehr gering und etwa 1.400-fach niedriger als die der adressierten Substrate. Die Geschwindigkeitskon- stanten für die Spaltung des nicht adressierten Substrates durch scPvull-c6-TF0 bzw. scPvul 1-C12-TFO betragen kniCht adressierte 2) = 0,002 min'1 bzw. kniCht adressiert«*) = 0,001 min"1. Für die adressierten Substrate ergeben sich bis zu 1.400-fach höhere Spaltungsgeschwindigkeiten, siehe Tab. 1. Am schnellsten findet die Spaltung dabei statt, wenn der Abstand zwischen Pvull-Schnittstelle und TFS 9 bp bis 11 bp beträgt. Bei Verwendung von scPvull-ci2-TFO stellt auch die DNA mit 13 bp Ab¬ stand zwischen Pvull-Schnittstelle und TFS ein gutes Substrat dar. Die für scPvu- II-C12-TFO ermittelten Spaltungsgeschwindigkeiten sind höher als die für scPvull- C12-TFO. Die Spaltungsgeschwindigkeit von Substraten, bei denen der Abstand zwischen Pvull-Schnittstelle und TFS kürzer als 7 bp ist, nimmt mit geringer wer¬ dendem Abstand ab, wobei dieser Effekt bei scPvull-cβ-TFO stärker ist als bei scPvull-ci2-TFO.
Spaltungsgeschwindigkeiten der adressierten Substrate sowie die für die Reaktion in Gegenwart von 1 ,25 mM MgCb bestimmten Präferenzen sind in Tab. 1 darge- stellt:
Tabelle 1 : Geschwindigkeitskonstanten für die Spaltung des 239 bp-Substrates durch SCPVUII-C6/C12-TFO
Figure imgf000031_0001
Tab.1 zeigt die Geschwindigkeitskonstanten der Spaltung für sechs verschiedene adressierte 239 bp-Substrate, die sich im Abstand zwischen Pvull-Spaltungsstelle und Tripelhelixbindungsstelle (TFS) unterscheiden. Der angegebene Fehlerbe¬ reich basiert auf drei unabhängigen Messungen. Die Spaltungspräferenz stellt das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten des adressierten 239-bp-Substrates und des nicht adressierten 478 bp-Substrates dar. Aufgeführt sind die Daten für die SCPVUII-CΘ-TFO- und scPvull-ci2-TFO-Varianten, die sich in der Länge der Spacer unterscheiden (6 oder 12 Methylengruppen zwischen Protein und Oligo- nukleotid).
9. Adressierte Spaltung von Plasmiden mit mehreren Schnittstellen
Für die Ziel gerichtete Spaltung eines Plasmidsubstrates durch ScPvUlI-H6G4C- C6/C12-TFO wird ein 5556 bp-Plasmid mit 5 Pvull-Stellen verwendet, das eine Pvull- Schnittstelle im Abstand von 9 bp zu einer TFS aufweist. Wird das überspiralisierte Plasmids ohne Präinkubation mit Pvull oder scPvull-ci2-TFO gespalten, so resul- tieren fünf Spaltungsfragmente.
Präinkubation und Spaltung des überspiralisierten und Hindlll-Iinearisierten Plas¬ mids werden wie für die PCR-Produkte beschrieben durchgeführt. Dabei werden scPvull-ci2-TFO und überspiralisiertes bzw. Hindlll-Iinearisiertes Plasmid in einem im Wesentlichen stöchiometrischen Verhältnis eingesetzt. Die Spaltungsprodukte werden mittels Elektrophorese über ein 0,8 %-iges Agarosegel bestimmt. Das Gel wird anschließend mit SYBR Gold gefärbt und mit Hilfe einer geeigneten Software analysiert (Biometra, Göttingen, Deutschland). Die Analyse der Längen der Spal- tungsprodukte des überspiralisierten und des linearisierten Plasmids zeigen, dass nur die adressierte Schnittstelle geschnitten wird. Die quantitative Analyse der In¬ tensitäten der verschiedenen DNA-Banden ergibt Geschwindigkeitskonstanten für die Spaltung der adressierten Schnittstelle des überspiralisierten und des lineari¬ sierten Plasmids von kübersPiraiisiert = 1,4 min'1 sowie k|inear = 3,9 min"1. Eine Spaltung im Bereich der Pvull-Schnittstellen ohne benachbarte TFS wird nicht beobachtet, da eine etwa 1000-fach höhere Spaltungspräferenz für die adressierte Pvull- Schnittstelle vorliegt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt.
Bezugszeichenliste
1. DNA
2. Spezifitätsanker (TFO) 3. Linker
4. Enzym
5. Erkennungssequenz des Spezifitätsankers
6. Erkennungssequenz des Enzyms
7. Erkennungsstelle des Konjugats aus Spezifitätsanker und Enzym 8. Zellmembran
9. Zellkernmembran
10. Plasmidvektor
11. programmierbares Restriktionsenzym
12. verändertes Zielgen 13. Upstream-Homologieregion
14. Downstream-Homologieregion
15. neue Genprodukte
16. Zielzelle mit retroviralem Genprodukt
17. retrovirales Genom 18. Genom der Zielzelle vor der adressierten Methylierung
19. Zielsequenz für die DNA-Methylierung
20. methylierte Zielregion
21. Chromatin-Kondensation
22. Tochterzellen ohne retrovirales Genprodukt Abbildungslegenden
Fig. 1
Dargestellt ist das Prinzip der Herstellung von hoch spezifischen mit DNA 1 inter- agierenden Enzymen mit programmierbarer Spezifität. Spezifitätsanker 2 und En¬ zym 4 sind über einen Linker 3 chemisch miteinander verbunden. Der Linker 3 legt den Abstand zwischen Spezifitätsanker 2 und Enzym 4 fest. Die Erkennungsstelle 7 des Konjugats aus Spezifitätsanker und Enzym ist durch die Erkennungsse¬ quenz des Spezifitätsankers 5 bzw. des Enzyms 6 festgelegt.
Fig. 2
Prinzip des Genaustauschs mit Hilfe einer programmierbaren Restriktionsendo- nuklease 11.
A) Das programmierbare Restriktionsenzym 11 wird zusammen mit einem Plasmidvektor 10 in die Zelle eingebracht. Der Vektor 10 enthält das verän¬ derte Zielgen 12, das flankiert ist von Bereichen, die zur genomischen Re¬ gion homolog sind (Upstream-Homologieregion 13, Downstream- Homologieregion 14).
B) Die genomische DNA wird vom programmierbaren Restriktionsenzym 11 gespalten. Die Genkopie auf dem Plasmidvektor 10 enthält keine Erken¬ nungssequenz für das programmierbare Restriktionsenzym 10.
C) Dadurch wird die homologe Rekombination stimuliert, und es kommt zum Austausch des internen DNA-Abschnitts gegen den externen (gene targe- ting). D) Es kommt zu einer stabilen Veränderung des Genoms; alle Nachkommen weisen die neuen Genprodukte 15 auf.
Fig. 3 Prinzip der gezielten Inhibition der Gentranskription durch DNA-Methylierung
E) Eine programmierbare DNA-Methyltransferase wird in eine Zielzelle 16 ein¬ gebracht, die z.B. ein retrovirales Genom 17 in ihr Genom 18 integriert hat. Die Zielsequenz 19 wird methyliert.
F) Die Methylierung breitet sich im Bereich der Zielregion 20 aus, und die Ex- pressionsaktivität der entsprechenden DNA-Region sinkt.
G) Es kommt zur Chromatin-Kondensation 21 , Histon-Deacetylierung und Histon-Methylierung. Die Expression der DNA wird dauerhaft abgeschaltet.
H) Dieser Zustand ist stabil und wird an Tochterzellen 22 vererbt. Damit ist das integrierte Retrovirus still gelegt. Dem Fachmann ist ohne Weiteres ersichtlich, dass nach demselben Prinzip auch andere Gene gezielt inaktivierbar sind, deren Expression eine pathogene Wirkung hat, z.B. Onkogene oder Gene, deren Proteinprodukte zur Ausbildung von Aggre¬ gaten in Zellen führen.
Fig. 4
Die Herstellung eines programmierten Restriktionsenzyms ist schematisch darge¬ stellt. Die einzelsträngige Variante von Pvull wird über einen (CH2)6- oder (CH2)i2- Linker unter Verwendung eines chemischen Crosslinkers mit einem Tripelhelix bildenden Oligonukleotid (TFO) verknüpft. Das Endprodukt scPvull-cδ/ci2-TFO weist eine zweiteilige Erkennungsstelle auf: die Pvull-Erkennungstelle und die Tri- pelhelixbindungsstelle (TFS). Die Spaltung des Doppelstranges findet in der Pvull- Stelle statt, jedoch nur, wenn diese der TFS benachbart ist.
Fig. 5a und b: Die Fig. 5a und b stellen die adressierte (239 bp-Substrat) und die nicht adressier¬ te DNA-Spaltung (478 bp-Substrat) durch scPvull-c6/ci2-TFO bei zwei verschiede¬ nen Mg2+-Konzentrationen dar. Eingesetzt werden ein 239 bp-Substrat, das eine TFS in einem Abstand von 9 bp zur Pvull-Schnittstelle aufweist, sowie ein 478 bp- Substrat, welches keine TFS besitzt. 45 nM jedes Substrates werden zum Zwecke der Tripelhelix-Bildung mit 40 nM scPvull-c6/ci2-TFO in Gegenwart von Spermin inkubiert. Nach Zugabe von 1 ,25 mM (Fig. 5a) oder 5 mM (Fig. 5b) MgCI2 werden die kinetischen Daten der Spaltung bestimmt. Während das nicht adressierte Sub¬ strat (♦) bei einer MgCfe-Konzentration von 5 mM im Wesentlichen ebenso
schnell gespalten wird wie das adressierte Substrat (■), ist eine Spaltung bei ei- ner MgCI2-Konzentration von 1 ,25 mM im Wesentlichen nicht feststellbar. Im Ge¬ gensatz dazu wird das adressierte Substrat sowohl bei 5 mM als auch bei 1 ,25 mM MgCb schnell gespalten.
Fig. 6
Fig. 6 zeigt die adressierte Spaltung eines 5556 bp-Plasmids durch scPvull-c6/ci2- TFO. Das Plasmid besitzt fünf Pvull-Schnittstellen (in Fig. 6 mit P bezeichnet); eine davon weist eine TFS im Abstand von 9 bp auf und ist mit *fc gekennzeich- net. Zum Zwecke der Tripelhelixbildung werden 50 nm des Plasmids mit 45 nM scPvull-c6/ci2-TFO in Gegenwart von Spermin präinkubiert. Aliquote des Reakti¬ onsgemisches werden 0, 1 , 10, 30, 60, 120 und 300 Minuten nach Zugabe von MgCI2 entnommen und die Reaktionsprodukte mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Oberer bzw. unterer Teil der Abbildung zeigen die Ergebnisse der ad- ressierten Spaltung der überspiralisierten bzw. linearisierten Form des Plasmids. Durch die substöchiometrische Zugabe von scPvull-cβ/ci2-TFO ist die Spaltung nicht vollständig. Bahn 1 im oberen Gel zeigt das Ergebnis des Kontrollspaltungs- experiments, bei dem das überspiralisierte Plasmid ohne Präinkubation für 5 min mit scPvull-c6/ci2-TFO in Spaltungspuffer inkubiert wird. In diesem Fall wird das Plasmid an allen fünf Pvull-Spaltungsstellen gespalten.

Claims

Ansprüche
1. Mit Ziel-DNA interagierendes Enzym-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Enzym-Konjugat um eine Verbindung handelt, bei der ein En¬ zym über je einen Linker kovalent an mindestens einen Spezifitätsanker ge- bunden ist, wobei
- das Enzym auf seiner Oberfläche eine reaktive funktionelle Gruppe zur Bindung eines Linkers aufweist,
- es sich bei dem mindestens einen Spezifitätsanker um eine Oligonukleo- tidverbindung handelt, die über eine komplementäre Basenpaarung mit einer Triplex-Bildungsstelle (TFS) der Ziel-DNA eine Tripeihelix ausbildet, und die am 5'-Ende oder am 3'-Ende eine reaktive funktionelle Gruppe aufweist,
- der Spezifitätsanker eine Sequenzhomologie von mindestens 85 % zur Triplex-Bindungsstelle der Ziel-DNA aufweist, - der mindestens eine Linker eine molekulare Verbindung darstellt, die mindestens eine Kette aus mindestens zwei Kohlenstoffatomen enthält, wobei die Kette an zwei Stellen mit gleichen oder verschiedenen reakti¬ ven funktionellen Gruppen derivatisiert ist,
- je eine der beiden funktionellen Gruppen des mindestens einen Linkers eine kovalente chemische Bindung mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms und der reaktiven funktionellen Gruppe des Spezifitätsankers ausbildet, und
- Enzym und Spezifitätsanker mit einem Abstand von mindestens zwei Ba¬ senpaaren an die Ziel-DNA gebunden werden.
2. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das En¬ zym ausgewählt ist aus der Gruppe Typ Il-Restriktionsendonuklease, Homin- gendonuklease, DNA-Reparaturenzym, DNA-Methyltransferase.
3. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das En¬ zym eine Typ Il-Restriktionsendonuklease ist.
4. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das En¬ zym eine Methyltransferase ist.
5. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeich¬ net, dass der Spezifitätsanker ausgewählt ist aus der Gruppe Oligonukleotid, Oligonukleotidanalogon, PNA, Threose-NukleinsäureanalogON.
6. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Spezifitätsanker um ein Oligonukleotidanalogon ausgewählt aus den Gruppen
- Oligonukleotide mit modifiziertem Phosphatgerüst: mixed backbone- Oligonukleotide, Methylphosphonat-, Methyl-(methylenimino)-, Methylcar- boxamid-modifizierte Oligonukleotide,
- Oligonukleotide mit modifizierter Riboseeinheit: am 2'- oder 4'-C-Atom
modifizierte Ribose, α-Anomere, 3'-Desoxyribose
handelt.
7. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich¬ net, dass der Spezifitätsanker aus 10 bis 20 Nukleotiden besteht.
8. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Spezi- fitätsanker aus 10 bis 20 Nukleotiden besteht und eine Sequenzhomologie zur
Triplex-bildenden Stelle der Ziel-DNA von 100 % aufweist.
9. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeich¬ net, dass der Linker eine kovalente chemische Verknüpfung aus einem Cross- linker und einem 3'-l_ink oder 5'-Link ist, wobei
- der Crosslinker eine molekulare Verbindung aus mindestens einer Koh¬ lenwasserstoffkette darstellt, wobei diese mindestens eine Kohlenwasser¬ stoffkette mindestens zwei C-Atome enthält und an zwei Stellen reaktive funktionelle Gruppen enthält, - der 5'-Link oder 3'-Link eine molekulare Verbindung darstellt, die eine
Kohlenwasserstoffkette aus mindestens zwei C-Atomen enthält, an das 5'-Ende oder 3'-Ende des Spezifitätsankers gebunden ist und an einer Stelle eine reaktive funKtionelle Gruppe enthält und
- eine reaktive funktionelle Gruppe des Crosslinkers mit der funktionellen reaktiven Gruppe des 3'-Links oder δ'-Links chemisch kovalent verbunden ist.
10. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeich¬ net, dass der der Spezifitätsanker mit einem 5'-Aminolink chemisch kovalent verbunden ist und der δ'-Aminolink 6 bis 12 Methylengruppen enthält.
11. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeich¬ net, dass der Crosslinker eine Succinimidester- und Maleimid-Funktion enthält.
12. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeich¬ net, dass Enzym und Spezifitätsanker in einem Abstand von 2 bis 20 Basen¬ paaren an die Ziel-DNA gebunden werden, bevorzugt in einem Abstand von 9 bis 13 Basenpaaren.
13. Verfahren zur Herstellung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprü¬ che 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass nacheinander folgende Schritte durchgeführt werden: a) Umsetzung des Linkers mit dem Spezifitätsanker, wobei eine reaktive funktionelle Gruppe des Linkers mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Spezifitätsankers eine kovalente chemische Bindung eingeht, b) Umsetzung des Linkers mit dem Spezifitätsanker, wobei eine reaktive funktionelle Gruppe des Linkers mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Spezifitätsankers eine kovalente chemische Bindung eingeht, c) Reinigung des Enzym-Konjugates.
14. Verfahren zur Herstellung von Enzym-Konjugaten gemäß Anspruch 13, da¬ durch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Methyltransferase ist und vor der Durchführung von Schritt b) in Anspruch 9 über PCR-basierte ortsspezifische Mutagenese ein oberflächlich zugänglicher Cysteinrest am Enzym eingeführt wird.
15. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur in vitro-Klonierung und/oder Charakterisierung von DNA-Fragmenten, die aus mindestens 10.000 Basenpaaren bestehen.
16. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur DNA-Methylierung in vitro.
17. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zum in vitro-Mapping von genomischer DNA.
18. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 deren Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Reagenz zur spezifi¬ schen Repression der Expression eines Gens in vivo.
19. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels.
20. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 und 19 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie, Diagnose und Prophylaxe von Erkrankungen, die durch die Expression pathogener Gene verursacht wer¬ den.
21. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 3, 5 bis 12 sowie 19 und 20 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Herbeiführung eines gezielten DNA-Doppelstrangbruches in vivo.
22. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß Anspruch 19 sowie deren phar¬ mazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels, welches die homologe Rekombination und/oder die DNA- Reparatur in vivo stimuliert.
23. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 4 bis 12 sowie 19 und 20 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels zur spezifischen Methylie- rung von DNA in vivo.
24. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß Anspruch 20 sowie deren phar¬ mazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels zur spezifischen Repression von pathogenen Genen in vivo.
25. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, 19 und 20 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie, Diagnose und Prophylaxe von Erkrankungen, bei denen Onkogenprodukte, virale Proteine oder Vorläu¬ ferproteine amyloider Speichererkrankungen produziert werden.
26. Pharmazeutisch akzeptable Komposition enthaltend Verbindungen gemäß ei¬ nem der Ansprüche 1 bis 12 als aktive Komponente und einen physiologisch akzeptablen Trägerstoff.
27. Pharmazeutisch akzeptable Komposition gemäß Anspruch 26, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass sie oral, rektal, parenteral, intravenös, intramuskulär, sub¬ kutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, intrathekal, intravesikal, topisch, lokal oder als Aerosol verabreicht wird.
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