JPH06506603A - 一本鎖環状オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一本鎖環状オリゴヌクレオチド 本出願は、１９９１年３月２７日に出頭された米国特許出頭第６７５８４３号の 一部継続出願である。さらに、本出頭の主題は、１９８９年９月５日に米国特許 商標庁に受領されたＤｉｓｃｌｏｓｕｒｅ　Ｄｏｃｕｍｅｎｔ　ｎｕｍｂｅｒ２ ３４７９４に含まれた主題に間する。

本発明は、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌ ｔｈにより与えられたグランドナンバーＧＭ−４６６２５の米国政府の支持によ りなされた。米国政府は２発明に一定の＄１ｆｆ４１を有する。

技術分野 本発明は、目標とするＤＮＡ又はＲＮＡに結合でき、それによりＤＮＡ複製。

ＲＮＡ転写、蛋白翻訳及び核酸の鋳型を含む他のプロセスをｍ節できる一重鎖環 状オリゴヌクレオチドを提供する。その上、環状オリゴヌクレオチドは、目標と する核酸を検出又は単離するプローブとして使用するためにラベルされつる。環 状オリゴヌクレオチドは　又二重らせんの前もった変性なしに二重らせん核酸の 一つの鎖をａ俟できる。その上、環状オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアー ゼに対して抵抗性があり、そして線状のオリゴヌクレオチドより高い選択性及び 親和性で目標に結合する。

背景技術 オリゴヌクレオチドは、ターゲットとオリゴヌクレオチドとの塩基間に水素結合 を形成することにより目標とする核酸に結合する。普通のＢ　ＤＮＡは、それぞ れ２個及び３叫の水素結合を有する従来のアデニン−チミン（Ａ−Ｔｌ及びグア ニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）ワトソン及びクリック塩基対を有する。従来のハイブ リッド化技術は、ワトソンークリック水素結合を経て目標とする核酸に結合する 配列特異性ＤＮＡ又はＲＮＡプローブの能力に基づり、シかし、ワトソンークリ ック塩基対に含まれない塩基の成る原子が他のヌクレオチドへの水素結合を形れ によりＴ−ＴＡ塩基トリアットを形成する。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ　（１９５９゜ Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ　１２：８２２）は、始めてＴ−Ａ Ｔ及びＣ−（１；Ｃ）リアラドに存在する交互の水素結合を記載した。さらに最 近、グアニンが中心のチミンと水素結合できるＧ−ＴＡ塩基トリアットが観察さ れた（Ｇｒｉｆｆｉｎら、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：９６７−９７１ ＞。

もしオリゴヌクレオチドが、ワトソンークリック及び交互の水素結合の両者によ りターゲットに結合できるならば、種々の生体内及び生体外の有用性を有するで あろう極めて安定なコンプレックスが形成されるだろう、しかし、現在まで、ワ トソンークリック及び交互の水素結合の両者により安定な目標結合を達成する必 要な構造上の特徴を有するオリゴヌクレオチドの開示はない。

オリゴヌクレオチドは、生体内で非ワトソンークリック水素結合により結合する ことが観察されている０例えば、Ｃｏｏｎｅｙら、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ２ ４１：４５６は、非ワトソンークリック水素結合を経て二本鎖核酸に結合した２ ７塩基−木調核酸を記載している。しかし、このタイプの二本鎖コンプレックス は、オリゴヌクレオチドがより安定でない交互の水素結合によってのみ即ち全て のワトンンークリック結合なしに、そのターゲットに結合するので、非常に安定 でない。

オリゴヌクレオチドは１種々の用途に使用されてきた０例えば、オリゴヌクレオ チドは、フィルター又は膜上に不動化され又は組織に存在する目標とする核酸の ためのプローブとして使用できる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、　（１９８９，Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、１ −３巻、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）は、ハイ ブリッド化技術の詳細なレビューを提供する。

さらに、細胞の核酸の生１勿学的機能の調節剤としてオリゴヌクレオチドを開発 することに最近大きな関心が持たｎてきている。この関心は、蛋白発現をコント ロールする成る細胞により使用される天然の相補性即ちアンチセンスＲＮＡに間 する観察から生じている。しかし、生物学的プロセスの生体内調節に間するオリ ゴヌクレオチドの開発は、低い結合安定性及び線状のオリゴヌクレオチドのヌク レアーゼ感受性を含む二重の長い間の問題により妨げられてきた。

例えば、とトＣ−ｍｙｃ遺伝子の転写は、ｃ−ｍｙｃプロモーターに結合するよ うにデザインされた２７塩基線状オリゴヌクレオチドにより無細胞生体外アッセ イ系中で阻害されている。阻害は、生理学的温度より低い）２度が使用され、そ して多くの細胞の酵素が除かれ又は不活性化されてしまった注意深くコントロー ルされた生体外アッセイ系を使用することによってのみ観察された。これらの条 件は、線状のオリゴヌクレオチドが低い親和性で結合しそしてＤＮＡの線状の部 分を分解する酵素に非常に作用されやすいので、必要である（Ｃｏｏｎｅｙら） 。

単純ヘルペスウィルスの複製に必須の前ｍＲＮＡ転写物のスプライシングは、又 受容体スプライス連結点に相補的な線状のオリゴヌクレオチドにより阻害された 。

この場合、メチルホスホ−ネート結合は、そのヌクレアーゼ抵抗性を増大させる ために線状のオリゴヌクレオチドで使用された。培養培地へのこの（ヒ学的修飾 オリゴヌクレオチドの添加は、恐らく高濃度における毒性の問題のために未感染 細胞の成長及び蛋白合成の低下を生じさせた（Ｓｍｉｔｈら、１９８６、ｐｒｏ ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：２７８７−２７９１）。

他の例では、線状のオリゴヌクレオチドは、培養された細胞中のヒト免疫不全ウ ィルスの複製を阻害するのに使用された。レトロウィルスゲノムの末端の繰返し の内或は近傍の部位に相補的なそして成るスプライス連Ｎ声に相補的な部位内の 部位に相補的なの線状のオリゴヌクレオチドは、ウィルス複製をブロックするの に最も有効であった。しかし、これらの実験は、恐らく低い結合安定性及びヌク レアーゼに対するこれらの線状のオリゴヌクレオチドの傷つきやすさのため。

効果が得られる前に多量の線状のオリゴヌクレオチドを必要とした（Ｇｏｏｄｃ ｈｉ１＋１ら、＋９８８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８ ５：５５０７−５５１　り。

それ故、生マ勿学的なプロセスのＴＪＩｔａ剤として有用なオリゴヌクレオチド は、好ましくは成る性質を有する。先ず、オリゴヌクレオチ１ｚは、その相補的 な目標とする核酸に所望の調節効果を有するのに十分なほど強く結合しなければ ならない。

第二に　オリゴヌクレオチド及びそのターゲットが配列特異性であることが一般 に望ましい、第三に、オリゴヌクレオチドは、細胞内でその所望の調節作用を達 成することが可能なようにそれに対して生体内の条件下で十分な半減期を有しな ければならない、従って、オリゴヌクレオチドは、核酸を分解する酵素例えばヌ クレアーゼに抵抗しなければならない、筒口に、オリゴヌクレオチドは、−木調 及び二本鎖のターゲットに結合できなければならない。

線状のオリゴヌクレオチドは、配列特異性の要件を満足することができるが、線 状のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに感受性があり、さらに一般に生物学 的な半減期を増大する化学的修飾を必要とする。これらの修飾は、オリゴヌクレ オチドを作るコストを増加させそして毒性の問題を提供する。さらに、Ｉｌ状の オリゴヌクレオチドは、結合して細胞の核酸に存在するものに似た二本鎖のコン プレックスを形成する。その結果、細胞の酵素は、ターゲットとの二本鎖コンプ レックスに結合した線状のオリゴヌクレオチドを容易に操作しそして解離できる 。

線状のオリゴヌクレオチドの低い結合力及びヌクレアーゼ感受性は、従って高い 濃度のオリゴヌクレオチドの投与を必要とし、そのためこの投与を毒性にし又は 高価にする。その上、線状のオリゴヌクレオチドは、交互の水素結合を経て二本 鎖のターゲットに結合できるが（例えばＨｏｏｇｓ　ｔ　ｅ　ｅｎ結合）、ｉｌ ｌ状のオリゴヌクレオチドは、一つの鎖をｉ換し、それによりさらに安定なワト ソンークリック結合パターンを形成するように二本鎖のターゲットを容易に解離 できない。

さらに、増大した結合力は、調節オリゴヌクレオチドの有効性を増大させる。

そのため、高い結合親和性を有するオリゴヌクレオチドは、少ない投与量で使用 できる。少ない投与量は、コストを低下させそして毒性を減少させる。

従って１本発明は、オリゴヌクレオチド並びにオリゴヌクレオチドに存在するド メインの環状性のためにヌクレアーゼ抵抗性でありそしてそれらの目標とする核 酸と強い親和性及び高い選択性で結合する一重鎖の環状のオリゴヌクレオチドを 提供する。さらに１本発明の環状のオリゴヌクレオチドは、そのターゲットの前 もった変性なしに二本鎖のターゲットに解離しそして結合できる。

ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖の環状物の成るタイプは、知られている１例えば、成 る天然のウィルス及びバクテリオファージのゲノムの構造は、−重鎖の環状の核 酸である。ＤＮＡの一本鎖の環状物は、Ｅｒ１ｅら（１９８７，Ｂｉｏ（ｌｌｅ ｍｉｓｔｒｙ　２６：７１５０−７１５９及び１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　２８°２６８−２７３１により研究されている。しかしながら、これらの 環状の分子の何れも目標とする核酸と結合するようには、デザインされていない 。

そのため、本発明は１本発明の環状のオリゴヌクレオチドが、高い特異性、低い 毒性又は焼毒そして線状のオリゴヌクレオチドより高いヌクレアーゼ抵抗性を示 し、一方従来の線状のオリゴヌクレオチドよりさらに強く一本鎖又は二本鎖の目 標とする核酸に結合するため、従来の技術に比べて実質的な改良を特徴とするイ ノベーションを示す。

発明の概要 本発明は、少なくとも１個の平行結合（Ｐ）　ドメイン及び少なくともｌｌの逆 平行結合（ＡＰ）ｌ’メインを有しさらに環状のオリゴヌクレオチドを形成する ための各結合ドメイン間にループドメインを有する一本鎖環状オリゴヌクレオチ ドを提供する。各Ｐ及び灯心するＡＰドメインは、ターゲットに平行なやり方で 結合するＰドメイン及びターゲットに逆平行なやり方で結合するＡＰドメインを 有する限定された核酸ターゲットの一つの鎖に検出可能に結合するのに十分な相 補性を有する。十分な相補性とは、安定な即ち検出可能な結合を達成するために 環状のオリゴヌクレオチドのＰ及び／又はＡＰドメインと目標とする核酸との間 に。

十分な数の１基対が存在することを意味する。

本発明の他の態様は、目標とする核酸についてプローブを提供するリポータ−分 子により、又は細胞ｎＲ性の薬剤伝達を提洪する医薬又は他の製薬剤により。

又は目標とする核酸を開裂又はさもなければ修飾できる削により、又はその上オ リゴヌクレオチドの細胞への取込み又はターゲットの結合を行うことのできる剤 により、誘導体化された一本鎖環状オリゴヌクレオチドを提供する。

本発明の他の態様は、オリゴヌクレオチドに相補的な核酸の単離のための固体支 持体に結合した一本鎖環状オリゴヌクレオチドを提供する。

本発明の他の態様は１本発明の環状オリゴヌクレオチドの任意の一つを提供する 少な（とも１個の第一のコンテナーを含む目標とする核酸の検出又は診断のため のコンパートメント化キットを提供する。

本発明のさらに他の！１！様は、目標とする核酸を検出する方法を提供し、それ は、オリゴヌクレオチドーターゲットコンブレクッスを形成するのに十分な時間 及び条件下で目標とする核酸を含むサンプルと一本鎖環状オリゴヌクレオチドと を接触させ、そしてコンプレックスを検出することを含む、この検出方法は、蛍 光エネルギー転移により行われる。

本発明の他のＬＩ！様は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白の生合成を調節する方法を提 供する。この方法は５ｇＩ型に含まれた目標とする配列へオリゴヌクレオチドの 結合を行うのに十分な条件下にＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白に間する核酸鋳型と本発 明の環状オリゴヌクレオチドの少な（とも一つとを接触させ、次にターゲットへ オリゴヌクレオチドを結合させ、鋳型への接近をブロックし、それによりＤＮＡ 、ＲＮＡ又は蛋白の生合成を調節することを含む。

本発明の追加のＵＳは、生合成調節量の少なくとも１種の本発明の環状オリゴヌ クレオチド及び製薬上許容可能な担体を含む核酸又は蛋白の生合成を調節するた めの製薬組成物を提供する。

本発明の他の態様は、一本＃ＡＩＪＩ状オリゴヌクレオチドを製造する方法を提 供し、それは、線状の前環状物（ｐｒｅｃｉｒｃｌｅ）を末端結合オリゴヌクレ オチドに結合し、前環状物の２個の末端を結合させ、そして環状のオリゴヌクレ オチド生成物を採取することを含む。

本発明の他の態様は、ターゲットを変性しそして環状オリゴヌクレオチドを結合 するのに有効な時間及び条件の下水発明の環状オリゴヌクレオチドの任意の１個 とターゲットとを接触させることによる、二本Ｍ核酸ターゲットにおける鎖の置 換方法を提供する。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、ワトソンークリック（逆平行ドメイン）ＡＴ及びＧＣ塩基対の結合パ ターンを描く９図ＩＢは、Ｐ、ターゲット及びＡＰヌクレオチドの間に形成でき るＴ−ＡＴ、Ｃ＋ＧＣ及びＧ−ＴＡ塩塩基トリアトド描く。

図２は、一本鎖環状オリゴヌクレオチドの合成のための環状化反応を概略的に示 す、線状の前環状物オリゴヌクレオチドは、ターゲットと同じ配列を有するオリ ゴヌクレオチド即ち末端結合オリゴヌクレオチドに結合して前環状物コンプレッ クスを形成する。連結反応後、環状化されたオリゴヌクレオチドは、末端結合オ リゴヌクレオチドから分離される。

図３は、実施例に記載された環状オリゴヌクレオチドへの線状の前駆体即ち前環 状物（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：６及びＳＥＱ　ＩＤＮ０ ニアを有する１−３）、’；’−ゲット　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８及び５ＥＱ ＩＤ　ＮＯ：９を有する４、５）、環状オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：５−７及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４を有する６、７．８）及び線状オリゴ ヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１０−１３及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ ５を有する９−１２及び１４）の配列を描く。

図４は、連結反応前の末端結合オリゴヌクレオチドとコンプレックス化された線 状の前環状物の構造を描（。

図５は、Ｔｍにより測定された環状オリゴヌクレオチド：ターゲットコンブレッ クス形成に対するｐＨの作用を描く、黒丸は、６゛４コンプレツクスに間する異 なるｐＨ価の安定性を表し、一方黒い四角は、７：５コンプレツクスの安定性を 描く、環状オリゴヌクレオチド６及び７及びターゲット４及び５の配列は１図３ に表される。

図６Ａは、２個のターゲット即ち簡単な（ｄＡ）＋２ターゲツト（四角）及び３ ６核酸オリゴヌクレオチドターゲント　（丸）への結合間の比較とともに、コン プレックス形成に対するループのサイズの効果を描く１図６Ｂは、コンプレック ス形成に対するターゲット及び結合ドメインの長さの効果を描く。

図７は、Ｐ及びＡＰ結合ドメインがターゲットでずれているターゲットと環状オ リゴヌクレオチドとの間に形成されたコンプレックスを描く。

図８は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８を有する線状のオリゴヌクレオチド　（、り線 ）又はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５を有する環状オリゴヌクレオチド（実線）の何れ かによる、蛍光的にラベルされた二本鎖ターゲット（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＩ ＋の１本の鎖の置換を描＜、鎖の置換は、時間（Ｘ軸）の間数としてのフルオロ セイン蛍光強度（Ｙ軸）の増大により測定された。

図９は、二重の濃度で二重らせんターゲット（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）につい ての観察された擬−次速度定数Ｋ。６．のプロットを描く、速度定数の不確定さ は、±１０％より低い、描かれた曲線は、最も良く適合するものとして生ずる直 角双曲線である。データの二重逆数のプロット即ち［環状オリゴヌクレオチド１ −１対（Ｋ）Ｉは、線状であり、８．９５ＸｌＯ−６秒・Ｍ−１のスロｂｓ −ブ及び３９．８秒のｙ−切片である。

発明の詳細な説明 本発明は、−重鎖環状オリゴヌクレオチド即ち環状物に間し５それは、対応する 線状のオリゴヌクレオチドより高い親和性及び選択度で核酸ターゲットに結合で きる。その上１本発明の環状物は５二本鎖核酸の２本の鎖を開きそしてそれに結 合するので、−重鎖及び二本鎖の両方の核酸は、本発明の環状オリゴヌクレオチ ドによる結合のターゲットになりつる。

さらに、これらの環状物の一本鎖又は二本鎖の何れかのターゲットへの強い選択 的な結合は、生物学的プロセス例えばＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、ＲＮＡスプライ シング及びプロセッシング、蛋白翻訳などを調節する方法を含む種々の用途を提 洪する。同様に、二本鎖核酸を解離しそして目標とする核酸へ選択的に安定に結 合するこれらの環状物の能力は、それらを診断用プローブとして、又は例えば染 色体或は池のＤＮＡ或はＲＮＡ分子の特定の部位に局在化するマーカーとして埋 恵的なものにする。さらに１本発明の環状物は、相補的核酸の単離又は細胞中へ の医薬又は他の分子の配列特異的な伝達に有用である。

特に、本発明の一本鎖環状オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の平行結合（ ＰＪ　ドメイン及び少なくともＩＮの逆平行結合（ＡＰ）　ドメインを有しさら に各結合ドメイン間にループドメインを有し、環状オリゴヌクレオチドが形成さ れる、さらに、各Ｐ及びＡＰドメインは、平行なやり方でターゲットに結合する Ｐドメイン及び逆平行なやり方でターゲットに結合するＡＰドメインにより限定 された核酸ターゲットの１本の鎖に結合する十分な相補性を示す。

以下に示された概略的な説明は５ターゲツト（以下にＴとして示される）に結合 したときと同様、互いにＰ及びＡＰオリゴヌクレオチドドメインの一つのセット の環状の配置を示す。

一−−−−−−−−−＝＝＝＝＞ ５′　−−−＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＞−−−−−３’Ｐ ＜＝＝＝＝＝＝　＝＝＝＝＝＝＝ 矢印は、各鎖の５゛から３°の配向を示し、各ドメインの５′末端は尾にあり、 ３゛末端は矢じりにある。それ故、ここで使用されるとき、平行のやり方の核酸 の結合は、５゛から３°　の配向は、コンプレックスの容積又は核酸について同 じであることを意味する。これは、ターゲットとＰドメインとの間に存在する結 合のタイプである。ここで使用されるとき、逆平行のやり方の核酸の結合は、コ ンプレックス中の２本の鎖又はヌクレオチドの５゛から３′の配向が、反対の方 向にある。即ち鎖が二重らせんＤＮＡの代表的なワトソンークリック塩基対配置 に見出されるように整列していることを意味する。

１個より多いＰ又はＡＰ結合ドメインが存在するとき、これら結合ドメインは、 その長さが多数のターゲットへの結合を行うのに十分であるループドメインによ り他のＰ及びＡＰドメインから分離される。さらに、環状物が多数のＡＰ及びＰ ドメインを有するとき、対応するターゲットは、１本の核酸の鎖である必要はな い、その上、成るターゲットに結合した環状オリゴヌクレオチドのループドメイ ンは、環状オリゴヌクレオチドが第一のターゲットから離脱するとき、第二のタ ーゲットに結合するためのＡＰ又はＰドメインである。

本発明によれば、Ｐ及びＡＰドメインのヌクレオチド配列は、以下に示される１ 基対の規則により、核酸ターゲットの限定された配列から決定できる。ターゲッ トは、一本積又は二本鎖の何れかであり、そしてその周知の機能的及び構造的な 特徴により選択される１例えば、成る好ましいターゲットは、コーディング領域 、複製の原点、逆転写酵素結合部位、転写ｖ４ｎ要素、ＲＮＡスプライシング連 結点、又はリポソーム結合部位などである。ターゲットは、又ＤＮＡ又はＲＮＡ 鋳型の検出又は単離のためのその能力により選択できる。好ましいターゲットは ２プリン即ちアデニン及びグアニンに富む。

目標とするＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレオチド配列は、十分に又は部分的に知られ ている。目標とするヌクレオチド配列が完全に知られているとき、Ｐ及びＡＰド メインの配列は、例えば光吸収又は蛍光の変化により、周知の方法により検出さ れるような結合を達成する必要な度の相補性によりデザインされる。成る例では 、目標とする配列は、コンセンサス配列により表されるか５又は部分的にのみ知 られている６例えば、コンセンサス配列により表さられるターゲットの全クラス に結合する環状のオリゴヌクレオチド（環状物）は、目標とするコンセンサス配 列からＰ及びＡＰドメインをデザインすることにより提供できる。この場合では 、ターゲットの成るものは、コンセンサス配列に正確にマツチしそして他のもの は、二重のミスマツチした塩基を有するが、結合を防ぐほど多いミスマツチでは ない、同様に、もし目標とする配列の一部が知られているならば、当業者は、環 状物のそれに相当する配列を有する線状のオリゴヌクレオチドより高い親和性を 有するそのターゲットに結合する環状物をデザインするように、以下に示される 塩基対の規則を参照できる。

従って、本発明は５又Ｐ及びＡＰドメイン中の十分な数であるが必ずしも全てで はないヌクレオチド位置が１本発明の塩基対の規則に従ってターゲットの配列か ら決定される核酸ターゲットに十分に相補的に結合するＰ及びＡＰドメインを有 する環状物に間する。決定された（即ち周知の）位ｌの数は、結合又は溶融時の 光吸収の変化を含む標準のやり方により検出されるような、それらのターゲット へのオリゴヌクレオチドの結合に十分な相補性を提供する必要がある位置の数で ある。

本発明の塩基対の規則は、Ｐドメインを、Ｐドメイン及び目標とするヌクレオチ ドが同じ５゛から３°の配向を有する塩基対を形成することによりターゲットへ 結合するようにする。特に、これらの規則は、その杉酸ターゲ・ントへの環状オ リゴヌクレオチドの結合を達成するのに必要な程度を満足させる、即ち相補性の 程度は、結合が検出できる限り１００％である必要はない、従って、Ｐドメイン の配列を決定するための一般的な規Ｈすは、以下の通りである。

ターゲット中の位置に間する塩基がグアニン又はグアニンアナログであるとき。

Ｐは相当する位置にシトシン又は好適なそのアナログを有する。

ターゲット中の位置に間する塩基がアデニン又はアデニンアナログであるとき。

Ｐは相当する泣ｌにチミン又はウラシル又はその好適なアナログを有する。

ターゲット中の位置に間する塩基がチミン又はチミンアナログであるとき、Ｐは 相当する位置にシトシン又はグアニン又はその好適なアナログを有する。

ターゲット中の位ｌに間する塩基がシトシン又はシトシンアナログであるとき、 Ｐは相当する位置にシトシン、チミン又はウラシル又はその好適なアナログを有 する。そして ターゲット中の位置に間する塩基がウラシル又はウラシルアナログであるとき。

Ｐは相当する位置にシトシン、グアニン、チミン又はウラシル又はその好適なア ナログを有する。

本発明の塩基対の規−ＩＪは、ＡＰドメインを、ＡＰドメイン及び目標とするヌ クレオチドが反対の方向に配向される塩基対を形成することによりターゲット中 こ結合するようにする。特に、これらの規則は、その核酸ターゲットへの環状オ リゴヌクレオチドの検出可能な結合を達成するのに必要な程度に満足される、即 ち相補性の程度は１００％より少ない、従って、塩基対の規則は、環状第１ノゴ ヌクレオチドとそのターゲットとの間の結合が検出されるのに十分な相補性を達 成することが必要な限りのみ、固執される。

従って、ＡＰドメインの配列を決定する一般的な規則は、以下の通りである。

ターゲット中の位ｌに間する塩基がグアニン又はグアニンアナログであるとき。

ＡＰは相当する位置にシトシン又はウラシル又はその好適なアナログを有する。

ターゲット中の位置に間する塩基がアデニン又はアデニンアナログであるとき。

ＡＰは相当する位置にチミン又はウラシル又はその好適なアナログを有する。

ターゲット中の位置に間する塩基がチミン又はチミンアナログであるとき、ＡＰ は相当する位置にアデニン又はその好適なアナログを有する。そしてターゲット 中の位置に間する塩基がシトシン又はシトシンアナログであるとき。

ＡＰは相当する位ｌにグアニン又はその好適なアナログを有する。

ターゲット中の位置に間する塩基がウラシル又はウラシルアナログであるとき、 ＡＰは相当する位置にアデニン又はグアニン又はその好適なアナログを有する。

好ましい態様では、Ｐ、ＡＰ及びループドメインは、互いに相補的ではない。

表１は、どのヌクレオチドが限定された目標とするヌクレオチドと逆平行の塩基 対又は平行の塩基対を形成できるかを要約している。

ａ　又は好適なアナログ 二つの相補的な一本鎮核酸は、蹟が代表的なワトソンークリ・ツクのやり方で即 ち逆平行ＧＣ及びＡＴ塩基対を経て互いに結合即ちハイブリッドするとき、安定 な二重らせん（ｄｕｐｌｅｘ）を形成する０本発明にとり、安定な二重らせん形 成及び安定な三重らせん形成は、Ｐ及びＡＰドメインが、環状オリゴヌクレオチ ドと目標とする分子との間の安定な結合を達成するために目標とする配列に対し 十分な相補性を示すとき、達成される。安定な結合は、オリゴヌクレオチドが必 要な条件下でターゲットに検出可能に結合したままであるとき、生ずる。

核酸間の相補性は、１本の核酸の鎖の塩基が第二の核酸の鎖の塩基と水素結合又 は塩基対できる度合である。そのため、相補性は、ときには、２本の鏡開又は２ 本の鎖の特定の領域或はドメイン内に塩基対を形成するヌクレオチドの％即ち割 合により、好都合に記載できる０本発明では、十分な相補性とは、検出可能な結 合を達成するために、十分な数の塩基対が、目標とする核酸と環状オリゴヌクレ オチドのＰ及び／又はＡＰドメインとの間に存在することを意味する。その上、 Ｐドメイン及びターゲットの間並びにＡＰドメイン及びターゲットの間の相補性 の度合は、同じである必要はない、形成される塩基対の％により表示又は測定さ れるとき、相補性の度合は、約３０−４０％の相補性から十分な即ち１００％の 相補性に及ぶ、一般に、Ｐ又はＡＰドメインとターゲットとの間の相補性の合計 の度合は、好ましくは少なくとも約５０％である。しかし、Ｐドメインは、とき には、ＡＰドメインがターゲットと有するのよりターゲットと低い相補性を有し 、例えばＰドメインはターゲットと約３０％の相補性を有するが、ＡＰドメイン は実質的により多い相補性例えば５０−１００％の相補性を有することができる 。

さらに、環状オリゴヌクレオチドとそれらのそれぞれのターゲットとの間に検出 可能な結合をもたらす相補性の度合は、その結合が生ずる条件に依存する。核酸 の鏡開の結合即ちハイブリッド化が、二つの配列間のミスマツチの度合の外にフ ァクターに依存することは、周知である。これらのファクターは、領域のＧＣ含 量、温度、イオン力、ホルムアミドの存在及び存在する対イオンのタイプを含む 、これらの条件が結合に有する効果は、当業者に周知である。さらに１条件は。

使用の環境によりしばしば決められる９例えば、環状オリゴヌクレオチドが生体 内の使用のために作られるとき、ホルムアルデヒドは存在せず、そしてイオン力 、対イオンのタイプ及び温度は、生理学的条件に対応する。結合条件は、生体外 で操作されて本発明のオリゴヌクレオチドの有用性を最適にする。所望の条件下 使用される適切なオリゴヌクレオチドを当業者がデザインする確立した結合条件 に含まれる定量的及び定性的な事項の徹底的な処置は、Ｂｅ１ｔｚら、１９８３ 、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１００：２６６−２８５によりそしてＳａ ｍｂｒｏｏｋらにより縄供される。

従って１本発明に間し、当業者は、その目標とする配列に検出可能に結合するの に十分な相補性を示す環状オリゴヌクレオチドのＰ及びＡＰドメインについてヌ クレオチド配列を容易にデザインできる、ここで使用されるとき、「結合」又は 「安定な結合」とは、十分な量のオリゴヌクレオチドがそのターゲットに結合即 ちハイブリッドしてその結合が検出できることを意味する。結合は、ターゲット ：環状オリゴヌクレオチドコンプレックスの物理的又は機能的の何れかの性質に より検出できる。

ターゲットとオリゴヌクレオチドとの間の結合は、物理的又は機能的の両方の結 合アッセイを含む当業者に周知の任意の方法により検出できる。結合は、結合が 生合成プロセス例えばＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、蛋白翻訳などに対してｉｉ！察 可能な効果を有するかどうかを決めることにより機能的に検出できる。

ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的な鎖の結合を検出する物理的方法は、当業者に周知で あり、そしてＤＮアーゼＩ又は化学的フットプリント法、ゲルシフト及びアフイ ニテイ開裂アッセイ及び光吸収検出法のような方法を含む０例えば、簡単且つ信 頼できるために広く使用されている方法は、温度が次第に上昇するにつれ、２２ ０−３００ａｍにおけるオリゴヌクレオチド及び目標とする核酸を含む溶液の光 吸収の変化の観察を含む、もしオリゴヌクレオチドがそのターゲットに結合して いるならば、オリゴヌクレオチド及びターゲットが解離するか又は溶融するにつ れ特徴的な温度で吸収における急激な増大が存在する。

オリゴヌクレオチドとその目標とする核酸との間の結合は、オリゴヌクレオチド の５０％がそのターゲットから溶融する温度をしばしば特徴とする。この温度は 、溶融温度（Ｔ　）である、より高いＴ　は、より低いＴｍとのコンプレツクｍ 　ｍ スに比べてより強い又はさらに安定なコンプレックスを意味する。二重らせんの 安定性は、Ａ：Ｔ塩基対が２個の水素結合を有するのに対しＧ：Ｃ塩基対が３個 の水素結合を有するので、Ｇ：Ｃ含量の増加とともに増大する０本発明の環状オ リゴヌクレオチドは、追加の水素結合をもたらし、そのためさらに安定である。

それは、２ｆｌの結合ドメインが単一の目標とする核酸即ちＰドメイン及びＡＰ ドメインに結合するのに利用できるからである。それ故、その目標とする核酸に 結合する環状オリゴヌクレオチドにより形成される三重らせんは、線状のオリゴ ヌクレオチド及びターゲットにより形成される二重らせんより高いＴｍで溶融し なければならない。

環状オリゴヌクレオチドは、結合ドメインのヌクレオチド及びターゲットの間に 形成される水素結合を経て核酸ターゲットに結合する。ＡＰドメインは、ワトソ ンークリック水素結合を形成することにより結合できる（図１）、Ｐドメインは 、非ワトソンークリック水素結合を形成することにより目標とするヌクレオチド に結合できる（例えば図１及び表１１．ＤＮＡ又はＲＮＡの異なる鎖からの２個 のヌクレオチドがここで規定された塩基対の規則により水素結合されるとき１基 対又は二重らせんが形成される。ＡＰからのヌクレオチド及びＰからのヌクレオ チドが両者とも同じ目標とするヌクレオチドに結合するとき、塩基トリアットが 形成される。

核酸の相補的な目樟鎖との平行なドメイン塩基対は　ワトソンークリック塩基対 より熱力学的により好ましくないが、平行及び逆平行の両方の対のモードが単一 の分子に存在するとき２非常に安定なコンプレックスが形成できる。それ故。

環状オリゴマーの二つの相対するドメインは、中心のターゲットとコンプレック スを形成して三重らせん構造を与え　又は環状物の２個のループ状の末端により 結合された三重らせんコンプレックスを与える１例えば、この配置は、２個のチ ミンが目標とするアデニンに結合するとき、４個までの水素結合の形成を許し、 そして２個のシトシンが目標とするグアニンに結合するとき、５個までの水素結 合を許す。

さらに、Ｐ及びＡＰドメインの結合特性のために、本発明の環状オリゴヌクレオ チドは、対応する線状のオリゴヌクレオチドより特別なターゲットに対して高い 選択度を有する。少なくとも二つのファクターが、この高い選択度に寄与してい る。第一に、本発明の環状オリゴヌクレオチドは、同じ中心の目標鎖に２団結合 する。そのため、二つのドメインがターゲットを選択するのに含まれる０Ｍ二に 、Ｃ＋Ｇ−Ｃトリアット中のシトシンのプロトン化は、このトリアットが形成し そして追加のプロトンがトリアンドに正の電荷を与えるときのみ、好ましい。

この正の電荷は、３個のホスホジエステルの骨格の連結から生ずる負の電荷の反 発を低下させる。

線状のオリゴヌクレオチドとは異なり１本発明の環状のオリゴヌクレオチドは。

二本鎖のターゲットの変性が熱力学的に好ましくない条件下で二本鎖のターゲッ トの１本の鎖を置換できる。線状オリゴヌクレオチドは、二重らせんの鎖をｆｆ ｉ換するこの能力を有しない０例えば、相補性線状オリゴヌクレオチドの存在下 の二本鎖ターゲットの半減期は、約５８分であり、即ちその長さでは、線状オリ ゴヌクレオチドは二重らせんターゲットの１本の鎖を置換するのに殆ど有用性を 有しない、しかし、二本鎖ターゲットは１本発明の環状オリゴヌクレオチドの存 在下では麿か３０秒の半減期を有する。それ故１本発明の環状オリゴヌクレオチ ドは。

−重鎖のターゲットに結合するのみならず、二本鎖のターゲットに結合する有用 性を有する。従って、−重鎖及び二本鎖の両方の核酸が本発明の環状オリゴヌク レオチドのターゲットとして利用できるので、これらの環状オリゴヌクレオチド は、線状オリゴヌクレオチドより大きな有用性を有することができる０例えば、 本発明の環状オリゴヌクレオチドは、対応する線状のオリゴヌクレオチドより生 体内の生物学的プロセスのより良い調節剤でありそして生体外でより良い診断プ ローブである。

核酸の鋳型が、中心の二本鎖ターゲット：環状物コンプレックスを越えて延在す るとき、Ｐ又はＡＰドメインは、二本鎖コンプレックスの何れの測で二重らせん として結合できる。そのため、ターゲット：環状オリゴヌクレオチドコンプレッ クスは、一部二本鎖であって一部三重鎖であるが、二本鎖の部分は、結合したＡ ＰヌクレオチドなしのＰ：ターゲット二重らせんであるか、又は結合したＰヌク レオチドなしのＡＰ：ターゲット二重らせんである。この結合の配置は、スタソ ガー結合配置である。

各Ｐドメイン、ＡＰドメイン及びターゲットは、独立して、約２−約２００個の ヌクレオチドを有し、好ましい長さは、約４−約１００個のヌクレオチドである 。最も好ましい長さは、６−３６個のヌクレオチドである。

Ｐ及びＡＰドメインは、独立して約２−約２００個のヌクレオチドを有するルー プドメインにより分離されている。好ましいループの長さは、約３−約８個のヌ クレオチドであり、特に好ましい長さは約５個のヌクレオチドである。

本発明によれば、ループドメインは、ヌクレオチド塩基からなる必要はない。

非ヌクレオチドループは１本発明の環状オリゴヌクレオチドを生成するのに安く することができる。さらに顕著なことは、非ヌクレオチドループを有する環状オ リゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対してより抵抗性があり、そのため線状オ リゴヌクレオチドより長い生物学的半減期を有する。その上、電荷のない又は正 の電荷を有するループは２ループとターゲットとの間の負の電荷の反発を排除す ることにより結合を促進するのに使用できる。さらに、電荷のない又は疎水性の 非ヌクレトチドを有する環状のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドループを有 する環状のオリゴヌクレオチドより細胞膜に浸透することができる。

ここで考えられるように、非ヌクレオチドループドメインは、オリゴヌクレオチ ド合成を阻害しない必要な立体性又はたわみ性がある限り、アルキル幀、ポリエ チレングリコール又はオリゴエチレン鎖又は他の鎖からなる。これらの鎖の長さ は、約２−約２０００個のヌクレオチドに等しく、好ましい長さは、約３−約８ 個のヌクレオチドに等しい、これらの鎖の最も好ましい長さは、約５個のヌクレ オチドに等しい。

非ヌクレオチドループドメインに関して好ましい鎖は、ポリエチレングリコール 又はオリゴエチレングリコール鎖である。特に、５個のヌクレオチド鎖と同じ長 さを有するオリゴエチレングリコール鎖例えばペンタエチレングリコール、ヘキ サエチレングリコール又はヘプタエチレングリコールが好ましい。

環状オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド中に塩基であるグアニン（Ｇ）、アデ ニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）又はウラシル（Ｕ）を有するか、又 は平行又は逆平行のやり方で水素結合しつる任意のヌクレオチドアナログを有す る一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。ヌクレオチドアナログは、シュードシチジン 、インシェードシチジン、３−アミノフェニル−イミダソール、２′−〇−メチ ルーアデノシン、７−ジアザアデノシン、７−ジアザグアノシン、４−アセチル シチジン、５−（カルボキシ−ヒドロキシメチル）−ウリジン、２’　−０−メ チルシチジン、５−カルボキシメチルアミンメチル−２−チオリジン、５−カル ボキシメチルアミノ−メチルウリジン、ジヒドロウリジン、２゛−Ｏ−メチルウ リジン、２°−〇−メチルーシュートウリジン、ベータ、Ｄ−ガラクトシルチオ シン、２゛−〇−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−インペンテニルアデノシ ン、■−メチルアデノシン、ｌ−メチル−シュードウリジン、ｌ−メチルグアノ シン２　】−メチルイノシン、２．２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノ シン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、５− メチルウリジン、Ｎ６−メチル−アデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチ ルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β− り一マンノシルケオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキ シウリジン、２−メチル−チオ−Ｎ６−インペンテニルアデノシン、Ｎ−（９− ベーターＤ−リボフラノシルー２−メチルチオプリン−６−イル）−力ルパモイ ル）スレオニン、Ｎ−（９−ベーター〇−リボフラノシルプリン−６−イル）− Ｎ−メチルカルバモイル）スレオニンを含む、可能ならば、リボース又はデオキ シリボースの何れかが、これらのアナログとともに使用できる。ａ−γツマー的 立体配座中のヌクレオチド塩基は、又本発明の環状オリゴヌクレオチドに使用で きる。

好ましいヌクレオチドアナログは、未修飾Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＵヌクレオチド、 塩基の５位に低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルアミン、フェニル又 は低級アルキル置換フェニル基を有するピリミジンアナログ及び塩基の７又は８ 位に同様な基を有するプリンアナログである。特に好ましいヌクレオチドアナロ グは、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、ジアミノプリン、及びリポー ス又はデオキシリボースの代りに２゛−Ｏ−メチルリポース部分を有するヌクレ オチドである。ここで使用されるとき、低級アルキル、低級アルコキシ及び低級 アルキルアミンは、１−６個の炭素原子を有し、直鎖でも分岐鎖でもよい、これ らの基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル２第 三級ブチル、アミル、ヘキシルなどを含む、好ましいアルキル基は、メチルであ る。

環状オリゴヌクレオチドは、まず線状のオリゴヌクレオチドとして作られ次に環 状化される１ｗＡ状オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチ ドを作ることが知られている多数の方法の任意のものにより製造できる５例えば 。

これらの方法は、酵素的合成及び化学的合成を含む。

ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成の酵素的方法は。Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載され たようなＫｌ　ｅｎｏｗ、Ｔ７．Ｔａｑ又はＥ、ｃｏｌ　１ＤＮＡポリメラーゼ をしばしば使用する。ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成の酵素的方法は、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋらに記載されたようなＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼをしば しば使用する。逆転写酵素も又ＲＮＡからＤＮＡを合成するのに使用できる（Ｓ ａｍｂｒｏｏｋら）、オリゴヌクレオチドを酵素的に製造することは、化学的に 合成されるか、又はｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローン化ゲノムＤＮＡ、クロー ン化ｃＤＮＡ又は他の組換えＤＮＡとして得られる鋳型核酸を要する。ＤＮＡ合 成の成る酵素的方法は、化学的に合成できる追加のブライマーオリゴヌクレオチ ドを必要とする。最後に、線状オリゴヌクレオチドは１例えば’３Ｂｉｋｉら、 １９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７により記述されたようなＰＣＲ技術 により製造できる。

線状オリゴヌクレオチドの化学的合成は、当業者に周知であり、そして液相又は 固相技術により達成できる。その上、限定された配列の線状オリゴヌクレオチド は、市販されているか、又は一般に自動化された合成法による、ホスホルアミダ イト、ホスファイトトリエステル、Ｈ−ホスホネート及びホスホトリエステル法 を含むユニの異なる合成法の１壬意のものにより製造できる０選択された合成法 は、所望のオリゴヌクレオチドの長さに依存し、そしてこの選択は、当業者の技 術の範囲内にある０例えば、ホスホロアミダイト及びホスファイトトリエステル 法は、１．７５個以上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを生成するが 、Ｈ−ホスホネート法は、１００個より少ないヌクレオチドのオリゴヌクレオチ ドに間して良く働く、もし修飾された塩基がオリゴヌクレオチドに挿入されるな らば、そして特にもし修飾されたホスホジエステル結合が使用されるならば１合 成法は１周知のやり方により必要に応じ変化される。このつに間し、Ｕｈ　１ｍ ａｎｎら（１９９０、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　９０：５４３−５８ ４）は、修飾された塩基及び修飾されたホスホジエステル結合を有するオリゴヌ クレオチドを製造する文献及び概括のやり方を提供している。

合成の線状オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により。

又はゲルクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを含む多数のクロ マトグラフィー法の１千意のものにより、精製できる。ヌクレオチド配列を確認 するために、オリゴヌクレオチドは、Ｍａｘａｍ及びＧｉ　Ｉｂｅｒｔ配列法、 Ｓａｎｇｅｔ配列法１毛管電気泳動配列法、移動スポット配列法を含む周知のや り方の任意のものにより、又は）（ｙｂｏｎｄ紙へ結合したオリゴヌクレオチド の選択的化学分解を使用することにより、ＤＮＡ配列法にかけられる。短いオリ ゴヌクレオチドの配列は、又血清脱着質量分光法により又は高速原子衝撃法によ り分析できるｆＭｃＮｅａｌら、＋９８２．Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１ ０４：９７６、Ｖｉａｒｉら、　＋９８７．Ｂｉｏｍｅｄ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍ ａｓｓＳｏｅｃｔｒｏｍ、１４：８３．Ｇｒｏｔｊａｈｎら、１９８２、Ｎｕｃ 、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、ＩＯ：４６７１１．配列法は、又ＲＮＡオリゴヌクレオチ ドについて利用できる。

本発明は１ｗＡ状前駆物（即ち前環状物）から環状オリゴヌクレオチドを製造す るユニの方法を提供し２それは、前環状物が合成されそして末端結合オリゴヌク レオチドに結合し、さらに前環状物の二つの末端が結合する方法を含む、オリゴ ヌクレオチドの二つの末端が結合する任意の方法は１本発明に包含され、それは 、例えば周知のカップリング剤例えばＢｒＣＮ、Ｎ−シアノイミダソール　Ｚｎ Ｃｌ２、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及び 他のカルボジイミド及びカルボニルジイミダソールを使用する化学的方法を含む 。

さらに、前環状物の末端は、５°ホスフエート及び３°　ヒドロキシ、又は５° ヒドロキシ及び３°ホスフエートを縮合することにより結合できる。

本発明によれば、＊単な１段階化学的方法が提供され、前環状物から環状オリゴ ヌクレオチド又は環状物を構築する。目標とする核酸即ち末端結合オリゴヌクレ オチドと同じ配列を有するオリゴヌクレオチドが構築される。ＤＮＡ又はＲＮＡ 線状線状状環状物化学的又は酵素的に合成され、そして再び化学的又は酵素的の 何れかの手段によりその５゛又は３゛末端を燐酸化する。前環状物及び末端結合 オリゴヌクレオチドは、混合されそしてアニーリングされ、それにより前環状物 の５゛及び３°末端が、図２に描かれるように、隣接するコンプレックスを形成 する。前環状物の末端が、ループ内ではなく結合ドメイン内そして好ましくは平 行ドメインよりむしろ逆平行結合ドメイン内に入ることが好ましい、さらに、前 環状物が５゛−ホスフェートよりむしろ３゛−ホスフェートを有することが好ま しい、コンプレックスの形成後、末端は、約ｐＨ７，０で二価の金属イオン及び ＢｒＣＮを含む緩衛された水溶液中で縮合反応を行う、好ましい態様では、緩衡 剤は、ｐＨ７，０でイミダソール−Ｃ１であり、二価の金属例えばＮｉ、Ｚｎ、 Ｍｎ、又はＣＯである。Ｎｉが最も好ましい二価の金属である。ｉｉ合は、４− ３７°Ｃのインキユベーションの約６−４８時間後に生ずる。他の二価の金属例 えばＣｕ、Ｐｂ、Ｃａ及びＭｇも又使用できる。

ＲＮＡ環状化の一つの方法は、自己スプライシングを促進するために、好ましく はループドメインで適切なヌクレオチド配列をＲＮＡオリゴヌクレオチド中に挿 入する。それは、環状の生成物が適切な条件下で形成されるからである（Ｓｕｇ ｉｍｏｔｏら、１９８８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：６３８４−６３９ ２）。

酵素による環状物の閉止は、これらの酵素に適切な条件下でＤＮＡリガーゼ又は ＲＮＡリガーゼを使用して可能である。

環状のオリゴヌクレオチドは、変性ゲル電気泳動又は融解、次にゲル電気泳動、 サイズ選択性クロマトグラフィー或は他の適切なりロマトグラフィー又は電気泳 動法により、鋳型から分離できる。採取された環状オリゴヌクレオチドは１本発 明の方法に使用されるのに、必要に応じ標準の技術によりさらに精製できる。

本発明は、又細胞への取り込みを促進するために、化学的基による本発明のオリ ゴヌクレオチドの誘導体化又は化学的修飾を包含する１例えば、オリゴヌクレオ チドへのコレステロール部分の共有結合は、細胞への取込みを５−１０倍改良し 、さらに約ｌＯ倍ＤＮＡ結合を改良する（Ｂｏｕｔｏｒｉｎら、１９８９、ＦＥ ＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２５４°１２９−１３２１．細胞受容体に間する他のリ ガンドは、又例えばインスリン、トランスフェリンなどを含む細胞の取込みを改 良する有用性を有する。同様に、ポリーＬ−リジンによるオリゴヌクレオチドの 誘導体化は２細胞によるオリゴヌクレオチドの取込みを助ける（Ｓｃｈｅｌｌ、 １９７４、Ｂｉｏｃｂｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　３４０：３２３及びＬ ａｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８４　：　６４８１　、成る蛋白担体は、又オリゴヌクレオチドの細胞の取込み を促進し、例えば血清アルブミン、核への輸送のための信号を有する核蛋白、及 び細胞膜浸透が可能なウィルス或は細菌の蛋白を含む、それ故、蛋白担体は、本 発明の環状オリゴヌクレオチドと一緒又は結合したとき、有用である。従って１ 本発明は、ＮＪ胞の取込みを促進することのできる基による本発明の環状オリゴ ヌクレオチドの誘導ｔ＊Ｉヒを含み、それは、炭化水素及び非極性基、コレステ ロール、ポリーＬ−リジン及び蛋白、並びに他のアリール又はステロイド基及び 同様な有利な効果を有するポリカチオン例えばフェニル又はナフチル基、キノリ ン、アンスラセン又はフェナンスラセン基、脂肪酸、脂肪族アルコール及び七ス キテルペン、ジテルペン及びステロイドを含む。

本発明は、さらに、ターゲットと一緒又はその付近の目標とする核酸又は他の核 酸の鎖を開裂又は修飾できる剤による本発明のオリゴヌクレオチドの誘導体化を 含む１例えば、ウィルス性ＤＮＡ又はＲＮＡは、結合してウィルス性ＤＮＡ又は ＲＮＡを切断又は不活性にする剤に結合する目標核酸に相補的な環状のオリゴヌ クレオチドを投与することにより、細胞の核酸を害することなく破壊に向けられ る。開裂又は修飾活性を有するものとして本発明により包含される核酸破壊剤は ５例えばＲＮＡ及びＤＮＡヌクレアーゼ、ＲＮＡを開裂できるリボザイム、アジ ドプロフラビン、アクリジン、ＥＤＴＡ／Ｆｅ、クロロエチルアミン、アジドフ ェナシル及びフェナンスロリン／Ｃｕを含む、Ｌｌｈｌｍａｎｎら（１９９０゜ Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　９０：５４３−５８４）は、本発明の環状 オリゴヌクレオチドについて使用されるように適合されたオリゴヌクレオチドを 誘導体化する方法及びこれらの剤の使用に間する情報をさらに提供している。

細胞の取込み又はターゲットとの結合を促進する基による本発明の環状オリゴヌ クレオチドの誘導体化、並びに核酸破壊剤又は薬剤による誘導体化は、当業者に 周知の方法の（子息のものにより行うことができる。さらに、所望の基は、オリ ゴヌクレオチドの合成前にヌクレオチドに加えられる０例えば、これらの基は。

Ｔ又はＣの５位に結合でき、そしてこれらの修飾したＴ及びＣヌクレオチドは、 本発明の環状オリゴヌクレオチドの合成に使用できる。さらに、選択されたヌク レオチドの誘導体化は、環状オリゴヌクレオチドの選択されたドメイン中への基 の挿入を行う０例えば、成る場合では、基が結合と干渉しないループ中へ、又は 目標核酸の開裂又は修飾を促進するためにＡＰ又はＰドメイン中へ成る基を挿入 することが好ましい。

本発明によれば、環状オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格における修飾 も又含まれる。これらの修飾は、細胞によるオリゴヌクレオチドの取込みを助け るか、又はこれらヌクレオチドの生物学的半減期を延長できる０例えば、環状オ リゴヌクレオチドは、もしヌクレオチド内ホスフェートの負の電荷が排除される ならば、さらに容易に細胞膜に浸透できる。これは、負に電荷されたホスフェー ト酸素を、メチル基、アミンにより置換することにより、又は負に電荷されたホ スフェート酸素へのアルキル基の付加によりホスホジエステル結合をホスホトリ エステル結合に変１ヒさせることにより行われる。別に、正常のホスホジエステ ル結合の一部であるホスフェート原子の１ｌｉ１以上が置換される０例えば、Ｎ Ｈ〜Ｐ、ＣＨ２−Ｐ又はＳ−Ｐ結合が形成できる、従って５本発明は、メチルホ スホネート、ホスホロチオエート。ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル 及び燐−ホウ素結合の使用を含む（Ｓ　ｏ　ｏ　ｄら、１９９０．Ｊ、Ａｍ、Ｃ ｈｅｍ、Ｓｏｃ、　］　１２：９０００）、ホスホジエステル基は、シロキサン 、カーボオ、−ト、アセトアミデート又はチオエーテル基により＃Ｌ換できる。

これらの修飾は。

又ヌクレアーゼに対する本発明のオリゴヌクレオチドの抵抗性を増大できる。修 飾ホスホジエステルによりオリゴヌクレオチドの合成法は、Ｕｈｌｍａｎｎらに より説明されている。

非ヌクレオチドループによる環状オリゴヌクレオチドは、周知のやり方により製 造できる０例えば、Ｉ）ｕｒａｏｄら（１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、　１８：６３５３−６３５９）は、ＤＮＡへ非ヌクレオチド鎖を結合さ せる合成法を提供している。これらのやり方は、一般に５次に本発明の環状オリ ゴヌクレオチドを製造するのに使用される線状のオリゴヌクレオチド前駆物の自 動化合成を行うように適合できる。一般に、標準のＤＮＡ合成においてヌクレオ チドと反応性の基、例えばホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ジメトキシ トリチル、モノメトキシトリチルなどは２非ヌクレオチド鎖の末端に置かれ、そ してＰ及びＡＰドメインの末端に相当するヌクレオチドは、それに結合できる。

さらに、異なるヌクレオチド環が１本発明のオリゴヌクレオチド中に挿入できる １例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＤＮＡ ：　ＤＮＡハイブリッドより安定なため、使用できる。追加の結合安定性は、又 本発明の環状オリゴヌクレオチドにおいて２°−０−メチルリポースを使用する ことにより提供できる。ホスホロアミダイト化学は、記述されているように、Ｒ ＮＡオリゴヌクレオチドを合成するのに使用できる（Ｒｅｅｓｅ、Ｃ，Ｂ、Ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　＆　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｓｐ ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ、＋９８９：ｖｏｌ、３．ｐ、１６ ４、及びＲａｏら、ｌ９８７、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、２８：４８ ９７）。

ＲＮＡ　２°−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド及びＤＮＡオリゴヌクレオチ ドの合成は、漢かに異なる。ＲＮＡ２’　−０−メチルオリゴリボヌクレオチド は、アミダイト、Ｈ−ホスホネート又はホスホトリエステル法の少しの修飾によ り製造できる　（Ｓｈｉｂａｈａｒａら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、１５：４４０３：５ｈｉｂａｈａｒａら、１９８７．Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７　°２３９：Ａｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌ ｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１５：６１３１）。

本発明の他の懸様において、環状オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸ターゲット の解離を促進できる。そのため、二本鎖核酸ターゲットは１本発明の環状オリゴ ヌクレオチドの結合前に変性条件にかけられなければならない、従って、環状オ リゴヌクレオチドは、種々の条件下特に生理学的条件下で、−重鎖及び二本鎖の 両方の核酸ターゲットに結合できる０本発明の環状オリゴヌクレオチドは、対応 する線状オリゴヌクレオチドより数次の大きさで早く二重らせん核酸鎖置換を促 進する。

本発明は、そのため、二本鎖核酸ターゲットの１本の鎖を、二本鎖核酸ターゲッ トの前もった変性の必要なしに、本発明の環状オリゴヌクレオチドの一つにより ｉ摸する手段を提供する。従って１本発明は、ターゲットと本発明の環状オリゴ ヌクレオチドの一つとを、該ターゲットを変性するのに有効な時間及び条件下で 接触させ、そして環状オリゴヌクレオチドをターゲットに結合させることにより 、二本鎖核酸ターゲットにおける鎖置換をする方法を提供する０本発明の環状オ リゴヌクレオチドへのターゲットは５例えば加熱又はアルカリ性ｐＨへの暴露に より変性をうけない、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れかの二本Ｉ！Ｉ核酸である。

ここで使用されるとき、鎖置換に間する核酸は、生物に存在するか、又は不純又 は純粋の核酸標本１組織切片、原核細胞又は真核細胞の塗抹標本、染色体の塊な どを含むサンプルに存在する。さらに１本発明の環状オリゴヌクレオチドによる 鎖置換のための核酸ターゲットは、ウィルス、細菌、かび又は噌乳動物の核酸を 含む。

本発明によれば、鎖置換によりターゲットを変性しそれにより結合をおこなわせ るのに有効な条件は、適当な環状オリゴヌクレオチド対目標である核酸の比を有 することを含む、さらに、ここで使用されるとき、環状オリゴヌクレオチド対タ ーゲットの好適な比は、約１−約１００であり、そして好ましくは約１−約５０ である。

さらに、ここで使用されるとき１本発明のオリゴヌクレオチドによるＦ！４置換 により二本！ｌ！Ｉ核酸を変性するのに有効な時間は、約１分から約１６時間で ある。

環状オリゴヌクレオチドは、先ずＰドメインで結合することにより二重らせんタ ーゲットと結合できる。このＰドメイン結合は、ＡＰドメインヌクレオチドを連 結して目標ヌクレオチドへのワトソンークリツケ結合について競合する。このＰ ドメインの前結合そしてワトソンークリック結合へのＡＰドメインのヌクレオチ ドの競合は、環状オリゴヌクレオチドによる１！１ｆｆｉ換のＩｌ！察された加 速の基礎を形成する。

要するに１本発明の環状オリゴヌクレオチドは、二重らせん幀置換を行わせる三 つの重要な特徴を有する。第一に、環状オリゴヌクレオチドは、高い局所の濃度 を生ずる前結合の能力を有する。＠二に、環状オリゴヌクレオチドは、第二（Ａ Ｐ）の結合ドメインを含み　それは、二重らせんの相補性鎖への結合へ競合する 。

最後に、環状オリゴヌクレオチドは、二重らせんの置換された鎖より高い親和性 で結合し、それにより反応を競合へ動かす。

本発明は、一本積及び二本鎖の両方のターゲットとのそれらの選択的な且つ安定 な結合性により可能になった本発明の環状オリゴヌクレオチドについて種々の有 用性を含む、成る有用性は、相補的な核酸の親和単離に関する固体支持体に結合 した限定された配列の環状オリゴヌクレオチドの使用、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐ ＣＲ）中の配列特異性停止信号をもたらすための本発明のオリゴヌクレオチドの 使用、細胞特異性薬剤伝達を行うための環状オリゴヌクレオチドへの薬剤、薬剤 アナログ又は池の治療剤の共有付加、相補的目標核酸を局在化し、定量化しそし て同定するための検出可能なレポーター分子により環状オリゴヌクレオチドのラ ベル化、！ｔびに環状オリゴヌクレオチドを細胞又はウィルス性核酸鋳型に結合 しその鋳型により導かれる生合成を調節することを含むが、それらに限定されな い。

本発明の環状オリゴヌクレオチドは、固体支持体例えばシリカ、セルロース。

ナイロン並びにビーズ、フィルター及びカラムクロマトグラフィー樹脂を製造Ｓ るのに使用される他の天然或は合成の物質に付着できる。これらのタイプの固体 支持体への核酸の付着のやり方は１周知であり、全ての周知の付着のやり方は、 本発明に含まれる。固体支持体にずす着した環状オリゴヌクレオチドは５次に相 補的核酸を単離するのに使用できる。相補的核酸の単離は、オリゴヌクレオチド ：固体支持体をクロマトグラフィ一手段のカラムに配合することにより行うこと ができる。他の単離の方法は、例えば濃過手段の利用により、カラム中にオリゴ ヌクレオチド：固体支持体を配合することな（行うことができる。環状オリゴヌ クレオチド：固体支持体は１例えばＰ及びＡＰドメインポリ（ｄＴ）又はポリ（ Ｕｌ配列により環状オリゴヌクレオチドを製造することにより、全細胞又はウィ ルス性ＲＮＡからポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを単離するのに使用できる。環状オリゴ ヌクレオチドは、それらがヌクレアーゼ抵抗性であり目標核酸に強く結合するの で。

理想的にこのタイプの応用に適している。

他の有用性は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術の分野における本発明のオリ ゴヌクレオチドが利用できることである。ＰＣＲ技術は、プライマー結合部位と して用いられる２個の周知の核酸配列の間の核酸鋳型にエンコードされた二本ｔ ＩＩ４ＤＮＡフラグメントを合成する方法を提供する。成る場合には、二本鎖フ ラグメントの成るものを製造する前又はした後に、一本＄１ｆｉＤＮＡフラグメ ントを生成するのが望ましい、これは、例えば、本発明の環状オリゴヌクレオチ ドをプライマー結合部位の一つに又はプライマー結合部位の間に存在する部位に 結合することにより行うことができる。

本発明は、又特定の細胞のタイプに薬剤を指向するために本発明の環状オリゴヌ クレオチドを使用することを含む、この指向は、特別の細胞のタイプの選択的破 壊又は増大を行うことができ１例えば、腫瘍の細胞の成長の抑止が達成できる。

異なる細胞のタイプは、異なる遺伝子を発現し、特別なｍＲＮＡの濃度は、他の 細胞のタイプよりも一つの細胞のタイプで高くすることができ、このｍＲＮＡは 。

薬剤又は薬剤アナログに結合した環状オリゴヌクレオチドによる、細胞のタイプ に特異的な薬剤伝達のための目１１１ｍＲＮＡである。高濃度の目標ｍＲＮＡを 有する細胞は、目標ｍＲＮＡに相補的なしかも共有結合で結合した薬剤を有する 環状オリゴヌクレオチドを細胞に投与することによる、薬剤伝達のために指向さ れる。

本発明は、又目標核酸を検出するプローブとして使用されるために本発明の環状 オリゴヌクレオチドをラベルすることを含む、ラベルされた環状オリゴヌクレオ チドプローブは　組織、染色体又（よ核酸の混合物中の目標核酸を局在化、定量 化又は検出するための診断及び分析のハイブリッドイヒ法に有用性を有する。本 発明の環状オリゴヌクレオチドプローブは、環状オリゴヌクレオチドが二本鎖核 酸の１本の鎖を置換できるため　さらに本発明のオリゴヌクレオチドが結合安定 性を増すばかりかターゲット　オリゴヌクレオチドの相互作用のためのより大き な配列選択度（又は特異性）を付与する２個の結合ドメインを有するため、線状 の核酸プローブより実質的な改良を示す。

環状オリゴヌクレオチドのラベリングは１本発明の環状オリゴヌクレオチド中に ｒレポーター分子Ｊに結合したヌクレオチドを挿入することにより行うことがで きる。ここで規定される「レポーター分子」は、その化学的性質により、環状オ リゴヌクレオチドの検出を行う同定可能な信号を提供する分子又は原子である。

検出は、定量的又は定性的の何れでもできる０本発明は、ラジオニュクリド　酵 素、ビオチン、ブソラレン、蛍光団、キレート化重金属及びルシフェリンを含む 。

任、ｔの普通に使用されるレポーター分子の使用を含む、最も普通に使用される レポーター分子は、環状オリゴヌクレオチドの合成に使用されるヌクレオチドに 結合した酵素、蛍光団又は放射能ニュクリドの何れがである１ｇ通に使用される 酵素は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコース オキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼなどを含む、特定の酵素ととに使用され る基質は、検出可能に着色した生成物は、基質に作用する酵素により形成される 。

例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼコンジ ュゲートと使用されるのに適し、わさびペルオキシダーゼには、１．２−フェニ レンジアミン、５−アミノサルチル酸又はトルイジンが普通に使用される。生成 したプローブは、例えば、サーザン分析、ノーザン分析、組織切片或は染色体の 塊（Ｓ　ｑ　ｕ　ａ　ｓ　ｈ）へのその場のハイブリッド化及び他の分析及び診 断法において、特定のＤＮＡ又はＲＮＡの検出に有用性を有する。このハイブリ ッド化プローブを使用する方法は５周知であり、そしてこの方法の成る例は、Ｓ ａｍｂｒ。

ｏｋらにより提供される。

本発明の環状オリゴヌクレオチドは、目標核酸へのプローブのハイブリッＦ：１ ヒに基づく任意の周知の検出又は診断法に間違して使用できる。さらに、本発明 の環状オリゴヌクレオチド１よ、例えばサンプル中に存在する目標核酸と本発明 のオリゴヌクレオチドの一つのためのラベルしたトレーサーターゲントとの間の 競合的ハイブリッド化により、目標核酸を定量する任意のハイブリッド化に使用 できる。さらに、環状オリゴヌクレオチドプローブを製造するのに必要なしかも ハイブリッド化法にこのプローブを利用するのに必要な！ｉｃ！５は、キットで 市販されている。

キットは、利用の容易さのためにコンパートメント化され、そして環状オリゴヌ クレオチドのための前環状物を製造するための試薬を提供する少な（とも１個の 第一のコンテナー、レポーター分子により前環状物をラベルするための試薬を提 供する少なくとも１個の第二のコンテナー、ｎ環状物を環状化するための試薬を 提供する少なくとも１個の第三のコンテナー並びにラベルされた環状オリゴヌク レオチドを単離するための試薬を提供する少なくとも１個の筒口のコンテナーを 含むことができる。

さらに、本発明は、鋳型核酸の単離のためのキットを提供する。このキットは。

鋳型内に含まれたターゲットに相補的な環状オリゴヌクレオチドを提供する少な （とも１個の第一のコンテナーを有する０例えば、鋳型核酸は、細胞性及び／又 はウィルス性のポリ（Ａ）　＋ｍＲＮＡであり、そしてターゲットは、ポリ　（ Ａ）千尾部である。従って、ポリ（Ａ）　＋ｍＲＮＡの単離に有用性を有する本 発明の環状オリゴヌクレオチドは、ポリ（ｄＴｌ又はポリ（Ｕ）のＰ及びＡＰド メイン配列を有する。

その上、本発明は、疾患の診断が特定の周知の目標核酸の検出に依存するとき有 用なキットを提供する。これらの核酸ターゲットは２例えば、ウィルス性核酸、 エキストラ又はミッシング染色体又は遺伝子、突然変異細胞遺伝子又は染色体。

異常発現ＲＮＡなとでありうる。キットは、コンパートメント化されて、レボ− クー分子に結合した環状オリゴヌクレオチドを提供する少なくとも１個の第一の コンテナー及びレポーター分子の検出のための試薬を提供する少な（とも１個の 第二のコンテナーを含む。

本発明のひとつの態様は、鋳型に含まれる目標配列への１種以上のオリゴヌクレ オチドの結合を行わすのに十分な量及び条件下で、そのＤＮＡ、そのＲＮＡ又は その蛋白のための核酸鋳型を、少なくとも１種の本発明の環状オリゴヌクレオチ ドと接触させることにより　ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白の生合成を調節する方法を 擾供する。１種以上のオリゴヌクレオチドとターゲットとの間の結合は、鋳型へ の接近を阻止し、それにより核酸又は蛋白の生合成を調節する。鋳型への接近を 阻止することは、生合成プロセスに含まれる蛋白及び核酸を、鋳型への結合する こと、鋳型に沿って移動すること又は鋳型内にエンコードされた信号を！！識す ることを妨げる。別に　鋳型がＲＮＡであるとき、調節は、鋳型の選択的分解を 許すことにより達成できる０例えば、本発明の環状オリゴヌクレオチドにより結 合されたＲＮＡ鋳型は、ＲＮアーゼＨによる分解に曝され易く１選択されたＲＮ Ａ鋳型のＲＮアーゼ■（分解は　それにより生合成プロセスの鋳型の使用をｖ４ ！５する。

ここで使用されるとき５枠酸又は蛋白の生合成は、細胞性及びウィルス性のプロ セス例えばＤＮＡ複製、ＤＮＡ逆転写、ＲＮＡ転写、ＲＮＡスプライシング、Ｒ ＮＡポリアデニル化　ＲＮＡ輸送及び蛋白翻訳を含み、それらは、ＤＮＡ、ＲＮ Ａ又は蛋白の生成を導き、そして生合成プロセスの成る段階での核酸鋳型を含む 。

ここで使用されるとき、生合成の調節は、生合成の阻害、停止、増大、促進又は 遅延を含む、　ＵＩ４ｉＩＢは　直接又は間接であり、即ちＤＮＡ、ＲＮＡ又は 蛋白の生合成は　そのＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白のための鋳型に環状オリゴヌクレ オチドを結合することにより直接的に調節できるか、又は生合成は、第一のＤＮ Ａ、ＲＮＡ又は蛋白の生合成をｙＪ節するのに役割を果たす蛋白をエンコードす る第二の鋳型へのオリゴヌクレオチドの結合により、間接的に調節できる。

核酸鋳型は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり、そして一本積又は二本鎖である１本発明 の環状オリゴヌクレオチドは、鋳型に存在するターゲットの１本の鎖のみに結合 するが、二本鎖の鋳型は、生合成プロセス中に開き２それにより結合に利用でき るようになる。さらに、本発明の環状オリゴヌクレオチドのＰドメインは、二本 鎖のターゲットに結合でき、そしてＡＰドメインヌクレオチドを目標ヌクレオチ ドへのワトソンークリック結合に競合する位置にｌく。

ＤＮＡ鋳型からのＤＮＡ複製は、それらがＤＮＡを開きそしてＤＮＡ鋳型に沿っ てＤ　Ｎ　Ａ合成を開始する複製の元に結合する蛋白により仲介される１本発明 によりＤＮＡ複製を阻害するために、複製の元で１種以上のターゲットに結合す る環状オリゴヌクレオチドが選択される。この結合は、ＤＮＡ複製に含まれる蛋 白に接近する鋳型をブロックする。そのため、ＤＮＡ複製の開始及び進行が阻害 される。ＤＮＡ複製を阻害する別の方法として、ＤＮＡ複製を仲介する蛋白の発 現は１例えば転写又は翻訳のレベルで阻害できる。

ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ複製は、又核酸プライマーにより結合されるＲＮＡの領 域に結合する逆転写酵素により仲介される。ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ複製を阻害 するために、逆転写酵素又はプライマー結合は、プライマー結合部位へ環状オリ ゴヌクレオチドを結合させ　それによりその部位への接近をブロックすることに よりブロックできる。さらに、ＤＮＡ複製の阻害は、ＲＮＡ鋳型に存在する部位 へ環状オリゴヌクレオチドを結合することにより生ずる。それは、この結合が、 その部位そして下流部位即ちターゲット又は結合部位の３゛測の部位への接近を ブロックするからである。

ＲＮＡ転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型の特定の開始 配列又はプロモーターを認識し結合する。ＲＮＡポリメラーゼの結合は、ＤＮＡ 鋳型を開く、転写に役割を果たしそしてＤＮＡ鋳型に位置する追加の転写調節要 素も又存在する。これらの転写ｍｎ要素は、エンハンサ−配列、上流活性化配列 、レプレッサー結合部位などを含む、全てのこのプロモーター及び転写調節要素 は、単独で又は組合わさって、本発明の環状オリゴヌクレオチドのターゲットで ある。これらの部位に結合するオリゴヌクレオチドは、鋳型へ接近し、それによ りＲＮＡ特にｍＲＮＡ及びｔＲＮＡの生成を調節例えば増大又は減少させること がらＲＮＡポリメラーゼ及び転写ファクターをブロックできる。さらに、本発明 のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型のコーティングｖＡ域又は３°−未翻訳領 域に指向して、転写の早すぎた停止を生じさせる。当業者は、これらの調節要素 の周知の配列から、コーディング領域配列から及びコンセンサス配列から、上記 の目標配列に対するオリゴヌクレオチドを容易にデザインできる。

ＲＮＡ転写は　例えば、環状オリゴヌクレオチドを負の転写調節要素に結合する ことにより　又は転写を抑制できる蛋白の生合成を阻害することにより、増大で きる。負の転写調節要素は、レプレッサ一部位又はオペレータ一部位を含みレプ レッサー蛋白が結合し転写をブロックする。レプレッサー又はオペレータ一部位 に結合するオリゴヌクレオチドは、それらの結合部位へのレプレッサー蛋白の接 近をブロックしそれにより転写を増大させる。

真核細胞に作られた一次ＲＮ　Ａ転写物即ち前ｍＲＮＡは、蛋白翻訳のための細 胞質中に輸送される前に多数の成執プロセスにかけられる。核では、イントロン か、スプライシング反応で前ｍＲＮＡから取り出される。ｍＲＮ、Ａの５°末端 は。

修飾されて５゛キヤツプ構造を形成し、それによりｍＲＮＡを安定化する１種々 の１基が又変（ヒする。３°末端のｍＲＮＡのポリアデニル化は、核からの輸出 と関連していると眉われる０本発明の環状オリゴヌクレオチドは、これらのプロ セスの全てをブロックするのに使用できる。

前ｍＲＮＡ鋳型は、前ｍ　ＲＮ　Ａの連結及びイントロン分岐つ配列をスプライ シングするために結合するリボ核蛋白により核でスプライシングされる。５゛及 び３°スプライス連結及びイントロン分岐点のコンセンサス配列は、知られてい る。

例えば　スプライス連結へ結合するリポ核蛋白の阻害又はイントロン分岐点に対 するイントロンの５′末端の共有結合の阻害は、スプライシングをブロックでき る。前ｍＲＮＡ鋳型の成熟化は、そのため、これらの部位への接近を妨げること により、叩ち５°スプライス連結、イントロン分岐点又は３゛スプライス連結へ の本発明の環状オリゴヌクレオチドを結合することにより２ブロツクできる。特 定の前ｍＲＮＡ鋳型のスプライシングは、１個以上の特定の前ｍＲＮＡスプライ ス連結又はイントロン分岐つに相補的な配列を有する環状オリゴヌクレオチドを 使用することにより、阻害できる。池の態様では、前ｍＲＮＡ鋳型の関連するス プライシングのコレクションは、−緒になってスプライス連結及びイントロン分 岐点の配列の所望の群に相補的な種々の配列を有する環状オリゴヌクレオチドの 混合物を使用することにより、阻害できる。

ポリアデニルｆとは、特定のポリアデニル化部位における特定のＲＮＡエンドヌ クレアーゼによる前ｍＲＮＡの認識及び開裂１次に前ｍＲＮＡの３′末端へのポ リ　（Ａｌ　Ｍ部の付加を含む、従って、任意のこれらの段階は、本発明のオリ ゴヌクレオチドを適切な部位に結合させることにより阻害できる。

真核細胞の細胞質への核からのＲＮＡ輸送は、ポリ（Ａ）尾部を必要としている ように見える。従って、環状オリゴヌクレオチドは１本発明に従ってデザインさ れてポリ（Ａ１尾部に結合し、それによりポリ（Ａ１Ｍ部への接近をブロックし モしてＲＮＡ輸送を阻害する。このオリゴヌクレオチドについて、Ｐ及びＡｐド メインの両者は、約１０−約５０個のチミン残基そして好ましくは約２０個の残 基よりなる。このオリゴヌクレオチドにとり特に好ましいＰ及びＡＰドメインの 長さは、約６−約１２個のチミン残基である。

蛋白生合成は、ｍＲＮＡ鋳型へのリポソームの結合、次にｍＲＮＡの翻訳「読み 」を経るアミノ酸の開始及び伸長により始まる。蛋白生合成即ち翻訳は、そのた め鋳型ｍＲＮＡのターゲットへ結合する本発明の環状オリゴヌクレオチドを使用 する、鋳型への接近をブロックすることにより、ブロック又は阻害できる１本発 明により含まれるこれらターゲットは、リポソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅ 　１　ｇａ　ｒｎｏ配列）、５°ｍＲＮＡキャップ部位、開始コドン、及び蛋白 コーディング配列中の部位を含む、又ヌクレオチド配列ホモロジーのドメインを 同じくする蛋白の群が存在する。従って、この群に間する蛋白生合成の阻害は、 本発明の環状オリゴヌクレオチドを相同蛋白ドメイン（コーティング配列を経て ）に指向することにより達成できる。

前記のやり方の任意のものによる生合成の調節は、多くの応用について有用性を 有する１例えば、遺伝子的障害は、突然変異又は過剰生成蛋白の生成を阻害する ことにより、又は過少発現蛋白の増加した生成により補正でき、細胞の増殖をｖ ４ｎするファクターをエンコードする遺伝子の発現は、阻害されて癌の拡大をコ ントロールし、そしてウィルスをエンコードした機能は、阻害されてウィルスの 感染と闘う。

本発明の環状オリゴヌクレオチドにより処置できる遺伝的障害の成るタイプは。

アルツハイマー病、成るタイプの神経痛、１！状赤血球貧血などを含む、多くの タイプのウィルス感染は１本発明の環状オリゴヌクレオチドを利用することによ り処置でき、インフルエンザ、ライノウイル人ＨｒＶ、単純ヘルペス、バビロー マウイルス、サイトメガウィルス、ニブシュタイン−八−ウイル人アデノウィル ス、水泡性口内炎ウィルス、ロタウィルス及びＲＳウィルスなどを含む１本発明 によれば、動物及び植物のウィルス感染は、又本発明のオリゴヌクレオチドを投 与することにより処置される。

Ｃ−ｍｙｃ遺伝子は、細胞の増殖に役割を有する遺伝子の一つの例である。Ｃ− ｍｙｃ発現の阻害は、ｃ−ｍｙｃ転写開始部位の目標１１５ｂｐ上流に相補的な 線状オリゴヌクレオチドを使用して生体外で証明されている（Ｃｏｏｎｅｙら、 １９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６　４５９）、以下に示される５ＥＱ ＩＤ　ＮＯ：Ｉ及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の環状オリゴヌクレオチドは、それ ぞれ−１３１から−１２０及び−７５から−６２のヌクレオチドでｃ−ｍｙｃプ ロモーターに相補的であり、そして本発明によりＣ−ｍｙｃ発現を阻害するよう にされる。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のこれらの描写 に使用されるとき、Ｎは任意のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログである。

挺例」旦Ｊジュ ユ旦」見上化ｌ ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）は、獲得免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き 起こすレトロウィルスである０本発明の環状オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶに感 染されたヒトの正常の細胞の？！製に有害に影響することなく、ウィルスの複製 をブロックする手段を提供する。レトロウィルスのゲノムは、単一の長い転写物 として転写され、その一部は、スプライスされてウィルスのエンベロープ蛋白を エンコードするＲＮＡを生ずる。ＨＩＶ感染の阻害は、ＨＩＶゲノム内の多数の 領域に結合するようにオリゴヌクレオチドをデザインすることにより達成でき　 それは、ゲノムを複製する機能のためのコーディング領域（即ちｐｏ＋又は逆転 写酵素の機能）又は遺伝子発現をコントロールする機能（Ｐｉｑえは、ｔａｔ、 ｒｅｖ又は他の機能）を含む、しかし、ｉＩｌ状オリゴヌクレオチドよる従来の 研究は、スプライス部位、ポリ　（Ａ）付加信号、キャップ又は開始コドン部位 、及びリボ　・ソームアセンブリに関連する部位が、真核細胞蛋白発現を阻害す るのに特に有効であることを示唆している。さらに、レトロウィルスのゲノムの 末端構造は、又これらの構造が転写及び複製の速度を仲介するコンｌ−ロール領 域をエンコードするばかりか、これらの構造が縁り返され、オリゴヌクレオチド をそれぞれの繰返しへ結合しそれへの接近をブロックするため、レトロウィルス を阻害するための優れたターゲットである。

従って、本発明は、Ｎが任意のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログでありそ してＹがピリミジン又はピリミジンアナログであるＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３及び ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に示される２個の環状オリゴヌクレオチドを提供する。

ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：３は、ＨＩＶ−１スプライス連結（ヌクレオチド６０３９ −５２）に相補的であり、一方ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４は、ｔａｔ遺伝子の一部 （ヌクレオチド５９７４−８８）に相補的である。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の環 状の形は、以下に描かれ、ヌクレオチドナンバーｌは、Ｐドメイン中の第一のヌ クレオチドであり即ち上線の第一のＴは、　ｔ１基ｌに相当する。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の環状の形は、以下に描かれ、ヌクレオチドアナログ＼ −１は、Ｐドメインの笥−のヌクレオチドである。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の環状のオリゴヌクレオチ ドは、生体外及び生体内の両方でＨＩＶ感染を阻害できる。ＨＩＶ感染に対する 環状オリゴヌクレオチドの有効性に間する生体外のスクリーニングは、当業者を してオリゴヌクレオチド：ターゲットの結合の安定性を判断させそして生体内の 有効性及び結合安定性を評価させる。生体外の阻害を観察するために、環状オリ ゴヌクレオチドは、ＨＩＶに感染された適切な細胞系の培養培地に加えられる。

細胞は、ｌ状オリゴヌクレオチドにより予め処理されるか、又は環状オリゴヌク レオチドは、感染時又はＨＩＶの感染後に加えられる。感染前又は後の添加は。

本発明のオリゴヌクレオチドがそれぞれＨＩＶ感染を予防するか又は単に阻害す るかの何れかの評価を行う。

ＨＩＶ感染又は複製の阻害の度合は、ユニのアッセイ系の任意のものにより判断 され、未処置細胞に対する感染後に生存するオリゴヌクレオチド処置細胞の割合 の評価、処置及び未処置ＨＩＶ感染細胞に形成されたシンシチウムの数の評価及 び処置及び未処置細胞で生成したウィルス抗原の量の測定を含む。

環状オリゴヌクレオチドの有効性の生体内の研究は、適当な動物宿主例えばトラ ンスジェニックマウス又はチンパンジーで行われる。ＨＩＶ抗原のレベルはモニ ターされて　ＨＩＶ複製に対する環状オリゴヌクレオチドの効果を評価しそれに より疾磨の状況の流れをたどる。一方、ＡＩＤＳ又はＡＲＣによるヒトボランテ ィアは、オリゴヌクレオチドが細胞毒性を有するとは思えないので１本発明の環 状オリゴヌクレオチドを投与される。これらのボランティアの疾患の状況は、次 に評価されて、ＡＩＤＳ感染の治療及び予防における本発明のオリゴヌクレオチ ドの効果を決定する。

本発明の他の！Ｑ！様は、製薬上許容できる担体とともに本発明の環状オリゴヌ クレオチドを含む製薬組成物を提供する。特に１本発明のオリゴヌクレオチドは 。

１日当り体重１ｋｇ当り約０．ｌｕｇ−約１００ｍｇ、好ましくは１日当り体重 １ｋｇ当り約０．　１μｇ−約１０ｍｇの治療上有効量で提供されて、本発明の 方法により核酸に結合する。投与量は、当業者により容易に決められ、そして本 発明の製薬組成物に処方される。

ユニで使用されるとき　［製薬上許容できる担体」とは、任意のそして全ての溶 媒５分散媒体　コーティング、抗菌及び抗かび剤、等張性及び吸収遅延性剤など である。製薬活性物質に対するこれらの媒体及び剤の使用は、当業者に周知であ る。任意の従来の媒体又は削が活性成分と不融和性であることを除いて　治療組 成物中のその使用は、含まれる。ｆＩ助的な活性成分も組成物に配合できる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＩｑえは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下又 は皮膚経由のルートにより５局所的に又は非経口的に投与され、又は好適に保護 されたときには１本発明のオリゴヌクレオチドは、経口で投与される８本発明の オリゴヌクレオチドは、局所投与用のクリーム、溶液又は懸濁液中に配合できる 。

経口投与では、オリゴヌクレオチドは、ゼラチンカプセル中の囲みによりｔｕｆ ｆできる。オリゴヌクレオチドは、非経口投与のために、リポソーム又はポリエ チレングリコールにより修飾されたリポソーム中に配合される。リポソーム中へ の追加の物質　例えば特定の目標細胞に見出される＋１１１１蛋白に対して反応 性の抗体の配合は、オリゴヌクレオチドを特定の細胞のタイプに指向するのを助 ける。

リポソーム担体中の局所投与及び非経口投与が好ましい。

実施例 以下の実施例は、本発明をさらに説明する。

実Ｉ＊例　１ 末端結合オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチドの環状化本発明によ れば、簡単な１段階化学法が開発されて、線状前駆＃＆Ｊ（前環状物）から環状 物を構築する。実際のターゲットと同じ配列を有したＤＮＡオリゴヌクレオチド が構築され、これは、末端結合オリゴヌクレオチドである。前環状オリゴヌクレ オチドが１次に構築され、そして５′末端又は３′末端で化学的に燐酸化された ０図２に示されるように、前環状物及び末端結合オリゴヌクレオチドは、混合さ れ、そして末端が隣接しているコンプレックスを形成させた。臭化シアノゲン、 イミダソールＩＩＩｊ物及び二価金属を加えた。６−４８時間のインキュベージ タン後、混合物を透析し、凍結乾燥し、そして生成物を変性２０％ポリアクリル アミドゲル電気泳動により分離した。ＵＶシャドウィングは、前環状物より僅か に遅く移行する一つの新しい生成物とともに、前環状物及び末端結合オリゴヌク レオチドと一緒に移行する大きなバンドを示した。加えられた末端結合オリゴヌ クレオチドなしに又は前環状物の５°又は３°ホスフエート基の不存在下で生成 物は何も観察されなかった。主なバンドを収りだし、ゲルがら溶離し、透析して 塩を取り除き、そして２６０ｎｍでの吸収により定量した。末端結合オリゴヌク レオチド４及び５（それぞれＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：８及ヒＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ； ９）を用いる前環状物】及び２（それぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５及びＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：６）との反応では　環状物６及び７が、それぞれ４０％及び５８％ の収率で得られた。これらの分子及び他のオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列 は１図３に示される。

生成ｆＪ５６及び７の環状の構造は、線状の前環状物が完全に破壊又は脱燐酸化 される反応条件下で３゛エキソヌクレアーゼ消化及び５°脱燐酸化に対する抵抗 性により確認された。従って、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３′エキソヌクレアー ゼ活性は、線状前場状物１及び２を開裂したが、環状物６及び７を開裂しなかっ た。

線状の前環状物は、又３２Ｐにより５°末端をラベルされ次に環状化された１反 応後、環状生成物は、コラジアルカリ性ホスファターゼに対して不活性であるが 、前環状物は、完全にラベルした３２Ｐを離脱した。前環状物に対する環状物の 僅かに遅いゲル移動性は、環状化の発生と一致した。

最適の環状化条件 多くのパラメーターが最適化されて、環状生成物の収率を増大し、それは、オリ ゴスクレオチド及び前環状物の濃度、温度１反応時間、金属、金属濃度、ＢｒＣ Ｎ濃度及びｐＨを含む、改良された環状化色性は、２本の一重鎖オリゴヌクレオ チドが結合した従来の条件に比べて、環状物の少な（とも２＠の高い収率をもた らしたｆＬｕｅｂｋｅら、１９８９．Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、ｌ　１１　 ：８７３３及びＫａｎａｙ　ａら、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５ ニア４２３）、これらのｉｊｊ＆された条件は、以下の通りであった。

５０μＭ　前環状物 ５５μＭ　末端結合オリゴヌクレオチド１００ｍＭ　Ｎ　ｉ　Ｃ＋　２ ２００ｍＭ　イミダソールＭＣＩ　（ｐＨ７，０）１２５ｍＭ　ＢｒＣＮ ２５℃、３６時間。

しかしながら、環状物の閉環は、又以下の条件下で有効であった。

３−２００μＭ　前環状物 ３−２００μＭ　末端結合オリゴヌクレオチド１０１０−５０Ｑ　ＮｔＣ１２ ５０−５００ｍＭ　イミダソールＨＣｌ２０−２００ｍＭ　ＢｒＣＮ ４−３７℃、６−４８時間。

ｍ（７）金ｍ　（Ｚ　ｎ　２”、Ｍｆ１２＋、Ｃｏ　２＋、　ｃｕ２＋、Ｐ、２ ＋、Ｃａ２＋。

２＋　、２−１− Ｍｇ　）もＮ１　の代りに使用される。さらに１反応は、ｐＨに敏感である。

ＡＰ及びＰドメインの閉環 ＡＰドメインの環状物の閉環は、Ｐドメインの閉環より優れていた。同じ末端結 合オリゴヌクレオチド　（即ち５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）の回りの前環状物 ２及Ｕ３　（それｆｔＬｓＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア） （７）Ｉｌｌ状化の比較は、環状ｔ＃Ｉ７　ｌ５ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６’Ｆｔ有 する）がＡＰＩ”）４ン（ａち前環状物２を使用して）で閉じられたとき５８％ の収率であったが、Ｐドメイン（即ち前環状物３を使用して）で閉じられたとき 、３５％の収率に過ぎなかった。

縮合試薬 ２種の試薬即ちＢｒＣＮ／イミダソール／　Ｎ　Ｉ　ＣＩ　２及び１−エチル− ３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が、ＤＮＡ及び ＲＮＡの化学的連結に普通使用されている（Ｋａｎａｙａら、＋９８６、Ｂ　ｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５ニア４２３及びＡｓｈｌ　ｅｙら、１９９１．Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０：２９２７）、それ故、これらの試薬は、ｄＡ、２ 　（ＳＥＱＩ　Ｄ　Ｎｏ　：　８）末端結合オリゴヌクレオチドを使用して環状 オリゴヌクレオチド６（図３及びＳＥＱ　［）　ＮＯ：５１に前環状物を連結す る有効性につぃて直接比較した６ Ｂ　ｒ　ＣＮ／イミダソール／　Ｎ　ｉ　Ｃｌ　２は、確立された最適の条件下 で使用されたが、但し連結の有効性は、４°Ｃ及び２５°Ｃの両者で観察された 。ＥＤＣは、４日間のインキュベーションで、４゛Ｃ又は２５°Ｃで、２０ｍＭ のＭ　ｇ　Ｃ＋　２．５０ｍＭのＭＥＳ　（ｐＨ６，０）とともに２００ｍＭで 使用された。

４°Ｃで、ＢｒＣＮは、より有効であり、９５％の環状生成物を生じたが、ＥＤ Ｃは、僅かに５５％の生成物を生ずるに過ぎなかった。しがし、２５°Ｃでは、 ＥＤＣ及びＣｒＣＮはともに９５％の生成物を生じた。それ故、ＢｒＣＮは、低 い温度でより有効であるが、ＥＤＣ又はＢｒＣＮの何れも２５°Ｃで等しい成功 率で使用できる。しかし、ＢｒＣＮは、ＢｒＣＮとの連結が２４時間以下を要す るがＥＤＣとの連結が約４日を要するので、ＥＤＣより追加の利点を有する。

５′又は３°　−ホスフェートの使用 具なる連結条件下で、３′−ホスフェートを５’　−ＯＨと結合することは、５ ′−ホスフェートを３’−ＯＨと結合することより連結された生成物を生じた（ Ａｓｈｌｅｙら）。

そのため、５゛−ホスフェート前環状物による又は３°−ホスフェート前環状物 による環状オリゴヌクレオチド６　（図３）の変換％は、比較された。

環状１ヒ反応は、ｄＡ１２末鳩結合オリゴヌクレオチド及び確立された最適の条 件を使用して行われたが、但し４μモルの前環状物及び末端結合オリゴヌクレオ チドが使用された。生成物は、変性ゲル電気泳動による分離後ＵＶ光の下で肉眼 で観察された。

環状生成物への変換は、５゛−ホスフェートが存在するとき６０％（±５％）で あり、３°−ホスフェートが存在するとき９５％であった０反応時間の増大又は 試薬濃度の増加が使用されるとき　収率の増大は５観察されなかった。

従って、５°−ホスフェートよりむしろ３゛−ホスフェートの使用が、環状化を 改良する。

実施例　２ 環状オリゴヌクレオチドは、線状オリゴヌクレオチドより高い親和性で目標核酸 と結合する それらのターゲットへの環状物６及び７（それぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５及び ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）の結合親和性は、環状コンプレックス及び線状コンプ レックスのに！１点の比較により測定された。溶液は、＋００ｍ？ｖ！＋７）Ｎ ａＣ１，１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，Ｏ ｌ中で１：ｌの比のオリゴヌクレオチド及びターゲット（それぞれ３μＭ）を含 んだ、２６０ｎｍで測定された混合曲線は、ｌ；１コンプレツクスが形成された ことを確認した。コンプレックスの自由エネルギー（−ΔＧ°３□）は、二状懸 曲線適合法を使用して溶融データから誘導された（Ｐ　ｅ　ｔ　ｅ　ｒ　ｓ　ｈ 　ｆ　ｍら、■９８３、Ｂｆ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２：２５６）。

結果は、環状オリゴヌクレオチドが、それらのターゲットに、線状前場状物又は ワトソンークリック相補的な目標のサイズのオリゴヌクレオチドがするのよりさ らに強く結合したことを示した（表ＩＩ）、例えば、ターゲット４　（ＳＥＱＩ Ｄ　ＮＯ：８）は、３７．１’ＣのＴｍを有するそのターゲットのサイズのワト ソンークリック補体との二重らせんを形成したが、前環状物１：ターゲツト４コ ンプレツクス（即ち、ＳＥＱ　ＬＤ　ＮＯ：８に結合したＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： ５）は、４４．７°ＣのＴ　を有した。前環状物１と同じ配列を有する環状物６ は。

５７．５°ＣのＴｍでターゲット４に結合し、その結合の自由エネルギーは、対 応するワトソンークリック二重らせんより８．６ｋｃａ１１モル好ましかった。

３７°Ｃにおけるｔｆ応する会合定数は、６ＸｌＯ”Ｍ　’であり、それは、ワ トソンークリック二重らせんについてより６次より大きい、同様な効果は、ター ゲット５（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ°９）への環状物７　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６ ）の結合について観察され、このコンプレックスは、６２３°ＣのＴｍを有した が、対応するワトソンークリック二重らせんは、４３．８°Ｃで融解した。これ らのデータは、環状オリゴヌクレオチドの結合が、ターゲットへの線状オリゴス クレオチドの結合より強いことを示す。

目標配列が、より長い配列に埋め込まれるときの結合の特徴を知るために　３６ 個のヌクレオチドオリゴヌクレオチドを合成し、中間に１２塩基目標配列（ター ゲット４に等しい）を有する。溶融の試験は、このより長いオリゴヌクレオチド に、環状物の結合ドメインと同じサイズを有するターゲットにそれが結合するよ り強く結合し、ターゲット４との環状物６のＴ　は５９．８°Ｃであるが　埋め 込まれたターゲットを含む３６塩基オリゴヌクレオチドでは、Ｔ　は６３４°Ｃ であったことを示した。従って、埋め込まれたターゲットを有する環状物の結合 の強さは、結合ドメインのサイズのターゲットを有するそれより高かった。

ＲＮＡターゲットへの環状ｆ勿６の結合親和性は、オリゴリボヌクレオチドｒＡ べて５８．３’Ｃであった。データは、環状物が、ＤＮＡターゲットへよりもＲ ＮＡターゲットへ同じか又はそれ以上に強（結合することを示す。

実施例　３ 環状オリゴヌクレオチドは　線状オリゴヌクレオチドよりターゲットにさらに選 択的に結合する 環状オリゴヌクレオチドの配列選択度を測定するために、一つの変化しつる塩を 有する一連のターゲットオリゴヌクレオチドを構築した。これらのターゲットと コンプレックスを作る環状物の結合エネルギーを測定した６選択度は、補正配列 とミスマツチした配列との間の自由エネルギーの差により定義された。環状構造 により得られる選択度は１次にアナロガスな線状オリゴヌクレオチドの選択度と 直接比較した。

ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、β−シアンエチルボスポルアミダイト法を用いて 機械で合成した。環状オリゴヌクレオチド８は、ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯニア５’　 −ｐＴＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＣを有する線状前環 状物から製造され、そして実施例１に記載されたように、最終表ＩＩ オリゴヌクレオチド°　コンプレックス　Ｔ　５°Ｃ−ΔＧ°３□ターゲット　 （ｋｃａ１１モル） の結合を閉じるために、ＢｒＣＮ／イミダソールを使用して配列５’　−ＡＡＧ ＡＡＡＡＧＡＡＡＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１　を有する末端結合オリゴヌク レオチ１：の回りのアセンブリにより環１ヒされた。環状構造は、３゛　−エキ ソヌクレアアーゼ及び５゛−ホスファターゼに対土るその低抗性により確認され た。

環状物８の配列選択度は　単独のミスマツチした塩基を含んだターゲットとそれ をハイブリッド化し、熱変性により得られたコンプレックスの強さくΔＧ°３７ ）を測定することにより測定された。８Ｆ！のターゲットが合成され、それらは 、単独の中心に位置する変化可能な塩基を除いて、環状物８及び線状オリゴヌク レオチド９に相補的であった（Ｘ又はＹ＝Ａ、Ｇ、Ｃ，Ｔｌ　、４ｆｌのターゲ ットは。

環状物中の２個の相対するＴとマツチし、Ｔ−Ｘ−Ｔｌ−リアソドを生ずる変化 可能な１基Ｘを有する。残りの４！１のターゲットでは、変化可能な塩基Ｙは、 環状物中の２個の相対するＣとマツチし　Ｃ−Ｙ−Ｃトリアットを生ずる。この 環状物コンプレックスと比較するため、線状オリゴヌクレオチド９が使用され、 初めの４種の実験では中心のＴ−Ｘペアとの二重らせん又は残りの４種ではＣ− Ｙベアとの二重らせんを生ずる。

＝　実鼠−瓦り一 ５°−ＡＡＧＡＸＡＡＧＡＡ、ＡＧ ＡＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡ ５’　−ＡＡＧＡＡＡＡＹＡＡＡＧ １６種のコンプレックスの熱変性は、それぞれ３μＭでのターゲット及び環状又 は線状オリゴヌクレオチドの濃度で、１０ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１２，１００ｍＭの Ｎａｃｌ及び１０ｍＭのトリスＨＣＩ　（１）Ｈ７，０）の存在下で実施された 。実験は、２回繰り返され。結果を平均した。オリゴスクレオチド；ターゲット コンプレックスの融解は、２６０ｎｍでモニターされた。生じた温度対吸収曲線 は、結合オリゴヌクレオチドから遊離のオリゴヌクレオチドへの単一の転移を示 した。

会合の自由エネルギーは、二状憇曲線適合法にデータを適合させることにより得 られた１Ｍ果は、ファントホップ法による会合エネルギーを測定することにより 二つのケースでチェックされ、良好な一致が、二つの方法の間に見られた１選択 度は、マツチしたオリゴマーとミスマツチしたオリゴマーとの間のコンプレック ス化の自由エネルギー（ΔＧ）の差として定義される。

表Ｉｎは、ミスマツチ実験の結果を示す、実験１−４は、ＤＮＡ二重らせんのＴ −Ｘターゲットミスマツチの効果を示す、予想されたように、真のマツチ（Ｘ＝ Ａｌは、最も好ましいコンプレックス（−ΔＧ　’　３７＝　１０．３　ｋ　ｃ 　ａ　ｌ　１モル）をあたえ、ミスマツチ（ＸΔＧ、　Ｃ，Ｔ）は、結合エネル ギーで３．２−４゜４ｋｃａ１１モルの損失を生じ１発表されたミスマツチの研 究と良（一致する。

実験５−８は、比較により、環状物コンプレックス結合強さに対するＴ−Ｘ−Ｔ ミスマツチの効果を示す６もう一度、真のマツチ（Ｘ　＝　Ａ）は、最も好まし い３本積のコンプレックス（−ΔＧ’　３７＝１６．４ｋｃａ１１をあたえる。

しかし。

ターゲットミスマツチ（Ｘ＝Ｇ、Ｔ、Ｃ）は、線状オリゴヌクレオチドに対する よりも環状オリゴヌクレオチドに対して結合エネルギー（６，２−７，６ｋｃａ １１モル）のかなり大きな損失を生ずる。

同様に、実験９−１２は、二本鎖二重らせんに対するＣ−Ｙミスマツチの効果を あたえる。マツチした塩基（Ｙ＝Ｇ）は、−１０，３ｋｃａ１１モルの二重らせ ん会合の自由エネルギーをあたえる。ミスマツチ（Ｙ＝Ａ、　Ｔ、　Ｃ）は、結 合エネルギーの５．２−５．８ｋｃａ１１モルの損失を生じ、発表されたデータ とかなり一致する。対照的に、Ｃ−Ｙ−Ｃミスマツチの効果は、二本鎖コンプレ ックス（実験１３−１６）で大きく、マツチ（Ｙ＝Ｇ）は、−１６，４ｋｃａ１ １モルの結合エネルギーを与え、そしてミスマツチ（Ｙ＝Ａ、Ｔ、Ｃ）は、７． 　１−７．５ｋｃａ１１モル安定ではない。

従って、検討された全てのケースで、環状リガンドは、標準の線状オリゴマーが するのよりその補正されたマツチした配列についてさらに大きな選択度を示す。

選択度の有利さは、Ｃ−Ｙ−Ｃシリーズで１．３−２．２ｋｃａ１１モルからＴ −Ｘ−Ｔシリーズで３．０−３．４ｋｃａ１１モルに及ぶ、これらは５それらが 単一の塩基の変化から生じ、Ｔ−Ｘ−Ｔシリーズの場合、環状オリゴヌクレオチ ドは、線状オリゴヌクレオチドの約２＠選択的であることを考慮すると、全く顕 著な相違である。この選択度の相違は、３７°Ｃで結合定数で１−２次の大きさ に相当する。

この高い選択度を説明できる二つのファクターが存在する。先ず、環状オリゴヌ クレオチドの二つのドメインが、中心の目ｅｌｔｌを結合するので、環状オリゴ ヌクレオチドは、実際、マツチングを補正するために２回配列をチェックする。

第二に、Ｃ＋Ｇ−Ｃ１−リアラド内のシトシンのプロトン化は、又増大する選択 度におけるファクターである。このプロトン化は、グアニンが正の電荷をともに する塩基トリアット形成が存在するときのみ、好ましいようであり、事実は、塩 基トリアット内のシトシンのｐＫａが、遊離のデオキシシトシンのそれより２− ３単位高いことを示唆している。この正の電荷のけ加は、コンプレックス中のホ スホネートの高い密度から生ずる負の電荷の反発を少なりシ、それにより結合安 定性を増大する。

′そのため、環状オリゴヌクレオチドは、ここに記載したように、ワトソンーク リック二重らせんのみにより達成できるのより高い結合親和性及び高い選択度の 両者を有する。

実施例　４ コンプレックス形成に影響するファクターｌ）溶液の効果、環状物：ターゲット コンプレックスに対するＮａＣ１，Ｍｇ２＋、スペルミン及びｐＨの効果を調べ た。結合ドメインにおけるシトシンとの環状物は、ｐＨに鋭敏であり　低いｐＨ 価で大きな安定性を示した。しかし、これら及び他の環状物：ターゲットコンプ レックスは、７．０−７．４の生理学的ｐＨで全く安定である（図５）、コンプ レックスは、二重らせんに匹敵する塩濃度感受性を示すが、しかし、少量のＭｇ ２＋又はスペルミンは、コンプレックスの安定性を顕著に増加する０例えば、塩 の憲添加のｐＨ７，０のＩｍＭのＭｇ＋十の濃度で、５８゛ＣのＴ　を有する安 定な７：５の環状物：ターゲットコンブレックスが形成された。添加される塩を 含まない２０μｍの溶液が使用されたとき。

５６°ＣのＴ　を有する７：５コンプレツクスが安定に形成された。Ｍｇ＋“及 びスペルミンの両者が少なくともこれらの濃度で晴乳動物に存在し、そして環状 物：ターゲットコンプレックスは、生理学的条件下で安定であろう。

２）ループサイズ、環状物のループドメインに間する最適な数のヌクレオチドは 、異なるループサイズを有する環状物とターゲットとの間のコンプレックス形成 を観察することにより決定された。前環状物に似た前環状線状オリゴヌクレオチ ドは、Ｃ及びＡが交互の残基の任意の配列を使用して２．３．４．５，６及び１ ０塩基ループにより合成した。これらの前環状物のそれぞれは、Ａ１２鋳型（即 ちターゲット４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８））に結合するようにデザインされた 。

４．５，６及び１０塩基ループを有する環状１勿に間するＴ　は、５ヌクレオチ ドループサイズが、鋳型Ａ１□への環状物の結合、又はＡ１２！＠合部位を含む 長い３６マ一配列への環状物の結合の何れかについて最適であったことを示した （図６Ａ参照）。

３）結合ドメインの長さ、環状物、クーゲットコンプレックス融点に対する環状 オリゴヌクレオチド結合ドメインの長さの効果は、同じ長さを有する二重らせん の溶融と比較した。１々のサイズの結合ドメインを有する環状物が構築され。

４．８、Ｉ２及び１８ヌクレオチドにｎが等しいように一本ｆｆ１ｄＡｎとコン プレックス化された１図６Ｂは、かなり高いＴ　が、結合ドメインと同じ長さを 有するワトソンークリックニ重らせんに比べて環状物、ターゲットコンプレック スについて観察されたことを示す（帆　ＬＭのＮａＣ１，ｐＨ７）、例えば、１ ２塩基の環状コンプレックスは、２４塩基の二重らせんと大体同じ温度で溶融し た。

４ｊＪｉ基環状コンプレツクスは３４°Ｃで溶融したが、対応するワトソンーク リソク二重らせんＴ請よ０°Ｃより低かった。

４）メチル化、大勢の塩基ｍ５Ｃを形成するシトシンのＣ−５位量でのメチル化 が、未メチル化配列に間して、それが生ずる二重らせんＤＮＡのＴｍを上昇させ ることが、成る期間知られていた（Ｚｍｕｄｚｋａら、１９６９．Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　８：３０４９１．このメチル基の付加が環状物：ターゲットコン プレックスを安定化するかどうかを調べるために、環状１ｆｆ７（ＳＥＱ　ｒＤ ＮＯ：６を有する）の２種のアナログが合成された。一つの環状物では、結合ド メイン中の６個のＣがメチル化され、未メチル化されたループが残った（Ｍｅ６ １゜第二の環状物では、全ての１２ｆｌｉのＣがメチル化された（Ｍｅ　＋　２ １．ターゲット５とのこれらのメチル化された環状物のコンプレックスの融点を 測定した９Ｍｅ６コンブレソクスは、７１．１’ＣのＴｍを有しく未メチル化環 状物に間する６１８°Ｃに比べて）、そしてＭｅ＋□環状物は７２．４°ＣのＴ ｍを有した。従って、Ｃの代りに天然の塩基ｍ５Ｃの使用は、安定性を実質的に 増大させ、そして一つのケースでは、未メチル化環状物より１０．６°Ｃ高く溶 融しそして対応する未メチル化ワトンンークリソクニ重らせんより２８．６’Ｃ 高く溶融する１２塩基コンプレツクスを生じた。

実施例　５ 非ヌクレオチドループドメインによるヌクレオチドループドメインの置換環状オ リゴヌクレオチドのループドメインは、異なる長さのポリエチレン又はオリゴエ チレングリコール鎖により置換し、環状オリゴヌクレオチド結合及びヌクレアー ゼ抵抗性に対するこれら合成ループの効果を！１１１−価した。

方法 テトラ、ペンタ又はヘキサ−エチレングリコール鎖ループドメインを有する環状 オリゴヌクレオチドを合成した。それぞれのケースにおいて、エチレングリコー ル鎖は、Ｄｕｒａｎｄらの方法（１９９０，Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、＋８：６３５３−６３５９）を使用して、自動化ＤＮＡ合成法で合成的に製 造された。簡単には、ホスホロアミダイトをエチレングリコール鎖の一端のヒド ロキシ基に置き、そしてジメトキシトリチル（ＤＭＴ）部分を他の端末エチレン グリコールヒドロキシ基に置いた。この誘導体化エチレングリコール鎖を次に自 動化ＤＮＡ合成の適切な段階で成長する線状オリゴヌクレオチドに加えた。環状 化段階は、実施例Ｉに記載したやり方により行われた。テトラエチレンループド メインを有する線状オリゴヌクレオチド前環状物は、能率的には環状化されなか った。この結果は２テトラエチレンループドメインが、ターゲットへの最適な結 合には余りに短いこと示す。

二つのタイプの線状オリゴヌクレオチドが、環状オリゴヌクレオチドのためのタ ーゲット結合ドメインとして使用された。ターゲットＩは、非ターゲットヌクレ オチドを有しない１２塩基オリゴヌクレオチドであり、ターゲットＩＩは、その 中に１２塩基ターゲツトを有する３６塩基オリゴヌクレオチドであった。利用さ れたターゲット配列は、５°−ＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧ−３’　（Ｓ　ＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：９）及び５’　−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３°　（ＳＥＱ　Ｔ Ｄ　ＮＯ：８）であり、後者はポリ（ｄＡ１１２ターゲット配列と命名される。

ポリエチレンループを有する環状オリゴヌクレオチドの融点（ＴＩＴｌ）は、１ ０ｍＭのＭｇＣ１２及び１００ｍＭのＮａＣｌ中のｐＨ７，０（１０ｍＭ）リス ＨＣ１）で観察された。それぞれの線状ターゲット及びそれぞれの環状オリゴヌ クレオチドは、３μＭ濃度で存在した。

結果 Ｐ及びＡＰドメインに間しＣＡＣＡＣヌクレオチドループ配列及びポリ（ｄＡ） １２配列を有する環状オリゴヌクレオチドのＴ　は、ポリ　（ｄＡ）１□タ一ゲ ツト配列に結合したとき、５７８°Ｃであった。同じＰ及びＡＰドメイン配列を 有するがヘキサエチレングリコールループドメインを有する環状オリゴヌクレオ チドのＴｍは、同じターゲットに結合したとき、５１．４°Ｃであった。

ペンタエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヘキサエチレングリコール（ＨＥ（１ ；）ループドメインを有する環状オリゴヌクレオチドについてｗＬ察されたＴｆ ｉｆｆｉの比較は５表１ｖに示される。

表ＩＶ −一　−１−二赴七−土 工□ ｐＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣｐ ＰＥＧ　ＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧ　ＰＥＧ　５１．５　４７．５ｐＴＴＣＴＴ ＴＴＣＴＴＴＣｐ ｐＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣｐ ＨＥＧ　ＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧ　ＨＥＧ　５８．０　５１．１ｐＴＴＣＴＴ ＴＴＣＴＴＴＣｐ ｐＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｐ ＨＥＧ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＨＥＧ　５１．４　４６．５ｐＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴｐ ＨＥＣループを有する環状オリゴヌクレオチドについて観察されたＴ　価は、Ｐ ＥＧループを有する環状オリゴヌクレオチドのそれより約４．５°Ｃ高い、その ため、ヘキサエチレングリコールループドメインを有する環状オリゴヌクレオチ ドは、テトラ又はペンタ−エチレングリコールループを有する環状オリゴヌクレ オチドより大きな安定性で結合する。

ヌクレアーゼ抵抗性 環状オリゴヌクレオチドは、未結合のとき及び目標オリゴヌクレオチドに結合し たときのヌクレアーゼ抵抗性についてテストされた。全ての環状オリゴヌクレオ チドは、結合していても又は結合していな（でも、完全にエキソヌクレアーゼに 抵抗する。エンドヌクレアーゼの感受性は、製造者の示唆に従ってＳｌヌクレア ーゼを使用して評（２）された。

Ｓ１ヌクレアーゼに対する結合及び未結合環状オリゴヌクレオチドの抵抗性の比 較は、表Ｖに示される。

表Ｖ １　争　１　０　。

ｐ　ＴＴＣＴＴＴＴ　ＣＴＴＴＣｐ ｐＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣｐ ＨＥＧ　ＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧ　ＨＥＧ　＞２４時間ｐＴＴＣＴＴＴＴＣＴ ＴＴＣｐ ＡＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡ ＡＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡ ＣＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧ　Ｃ４０分ＡＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡ これらのデータは、未結合環状オリゴヌクレオチドが５１ヌクレアーゼに弱いこ とを示す、しかし、ターゲットに結合されたとき、ポリエチレンループドメイン を有する環状オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチドループドメインを有する環状 オリゴヌクレオチドより少な（とも３ｆｌｌＳ１ヌクレアーゼに対して遥かに抵 抗性がある。

環状及び線状のオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗性は、又これらのオリゴ ヌクレオチドが種々の時間ヒト血清にインキュベートされたとき、比較された。

環状オリゴヌクレオチド７及びこの環状物への前駆ｔｂ、　ｍ状オリゴヌクレオ チド２は、３７゛Ｃで血清中に５０ｕＭの濃度でインキュベートされた。一部を 種々の時占で取りだし、開裂生成物をゲル電気泳動により分離した。ヌクレアー ゼ抵抗性は１分解生成物がゲル上に明らかであるかどうかを観察することにより 評価された。

ヒト血清中にインキュベートされたとき、線状オリゴヌクレオチド２の半減期は 、２０分であった。対照的に、環状オリゴヌクレオチド７は、４８時間のインキ ュベーション中測定できるヌクレアーゼ分解を行わなかった。同様に、環状オリ ゴヌクレオチドの半減期は、ヒト血清中で４８時間より長く、即ち同じ配列を有 する線状オリゴヌクレオチドより１４０倍以上長い。

実施例　６ 環状オリゴヌクレオチドはＲＮＡに選択的に結合できるこの実施例に記載された 実験は、線状オリゴヌクレオチドとは異なり。環状オリゴヌクレオチドは、ＤＮ ＡクーゲットよりむしろＲＮＡターゲットに選択的に結合できる。

２種のデオキシオリゴヌクレオチドがターゲットとして製造され、即ちｒＴＪＩ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ＩＩ）ターゲット及びｒｄＵＪ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ ：１２）ターゲットである。

Ｔターゲット：５’　−ＡＡＧＡＡ工ＡＧＡＡＡＧ−３’ｄＵ＋−ゲット：　５ ’　−ＡＡＧＡＡ豆ＡＧＡＡＡＧ−３゜ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４を有する環状 オリゴヌクレオチドも又製造された。

比較のため、Ｔ及びａＵターゲットへ相補的な線状オリゴヌクレオチドも合成さ れた（即ち線状オリゴヌクレオチド、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ３）５’　−ＣＴ ＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴ−３’　。

ターゲットのそれぞれに結合する環状オリゴヌクレオチド対線状オリゴヌクレオ チドについて観察されるｔｈ点（Ｔ　）は１表Ｖｌに提供される。

線状オリゴヌクレオチドは、実験的誤差の限界より有意に多い量で、ｄＵツタ− ットへよりもＴターゲットへ強（結合する。Ｔｍ価のこの差は、１．７ｋｃａ１ １モルの結合の自由エネルギーの差に相当する。

しかし、線状オリゴヌクレオチドとは対照的に、環状オリゴヌクレオチドは、Ｕ ターゲットにさらに強ぐ結合する。そのため、環状オリゴヌクレオチドは、対応 するＤＮＡクーゲットよりＲＮＡに選択性を示すことができる。

その上、ＲＮＡターゲットに対する環状オリゴヌクレオチドの結合強さの増大は 、３７°ＣでＲＮＡターゲットが対応するＤＮＡターゲットより約３°　ｌ好ま しいことを示す０．８ｋｃａ１１モルの自由エネルギーの差に相当する。

実施例　７ 環状オリゴヌクレオチドによる鎖の置換環状オリゴヌクレオチド６　（図３）は 、Ｉｌ状ｄＴ１□オリゴヌクレオチド（実施例２）よりも９ｋｃａ　１１モル大 きい安定性でｄＡ１□ターゲットに結合した。

安定性のこの増大は、環状オリゴヌクレオチド：ターゲットコンプレックスが。

線状オリゴヌクレオチド：ターゲットより熱力学的に優れていることを立証する 。

さらに、環状オリゴヌクレオチドは、二重らせんＤＮＡターゲット配列の解離を 実際に促進（又は触媒ｆヒ）して、二重らせんの１本の鎖とコンプレックスを形 成できる。

環状オリゴヌクレオチドが、二重らせんＤＮＡを容易に解離しそして二重らせん ＤＮＡターゲットの１本の鎖を置換するかどうかをテストするには、鎖の置換の カイネティクスは、相補的線状又は環状オリゴヌクレオチドの存在下の二重らせ んＤＮＡターゲットについてｌ［察された。

１本の鎖にフルオレセイン基を有しそして他の鎖にテトラメチルローダミン基を 有するＤＮＡ二重らせんターゲットは、発表されたやり方を用いて製造された（ Ｃａｒｄｕｌｌｏら、＋９８８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ　８５：８７９０：Ｃｏｏｐｅｒら、１９９０．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２ ９：９２６１１．ｍ重らせんターゲット（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）（７）構 造は、以下の通りであった。

５゛　−フルオレセイン−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ３°−ローダミン−ＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ。

このラベルした二重らせんターゲットのＴｒｒｌは、正常であり、それ故蛍光置 換物は、会合力イネティクスに対して顕著な効果を有しなかった。さらに、フル オレセイン−ｄＡ　ｙ４の発光最大は、５２３ｎｍであったが、ローダミン−ｄ Ｔ。

２鎖の発光最大は、５９０ｎｍであり、２本の鎖の会合力イネテイクスを別々に モニターすることを可能にした。

鎖の置換反応は、１ｃｍ蛍光セル中で１０°Ｃで行われた６反応条件は、１００ ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＭｇＣｌ２及びｌｏｍＭのトリス）（Ｃ１，ｐＨ７ ゜０であり１反応容積は、３ｍｌであった。ラベルした二重らせんは、少なくと も１時間ｌＯ°Ｃで平衡させ１次に４０倍過剰の線状又は環状オリゴヌクレオチ ド（最終の濃度０．Ｏ１μＭ）を加えた。５ｍｍのスリットの巾を有する５ｐｅ ｘ　ＦＩｕｒｏｌｏ　Ｆ　ＩＩＩＡ′ｔＬ光装置を使用した。４５０ｎｍの励起 波長及び５２３ｎｍのモニターされた発光波長を使用した。結果は、励起波長及 びモニターされた発光波長の両者とは無間係であった０反応は、少なくとも５半 減期続いた。

フルオレセイン−ｄＴ１２へのローダミン−ｄＴ＋２の添加は、フルオレセイン の蛍光の低下及びローダミン蛍光の増大を生じた。これらの効果は、蛍光部分間 のエネルギー転移による（Ｃａｒｄｕｌｌｏら）。

２本の蛍光をラベルされた鎖の会合速度定数は、疑−次条件下に腋を混合し。

そしてフルオレセイン発光の低下速度をモニターすることにより決定された。ｌ ＯｏＣで　ｕ察された会合定数は、３．２ＸＩＯ６Ｍ　’秒−１であり、それに ＤＮＡオリゴヌクレオチドに間する会合の発表された速度と良（一致する（Ｎｅ ｌｓｏｎら、＋９８２．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１：５２８９：Ｔｕｒｎ ｅｒら、＋９９０　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ（ｓｕｂｖｏｌｕｍｅ　 Ｃ）、Ｗ、Ｓａｎｇｅｒ、Ｅｄ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ　ａｇ、Ｂｅｒｌ 　ｉｎ：２０１−２２７１　。

単一の線状の鎖（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）又はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５を有す る環状オリゴヌクレオチド（即ち環状オリゴヌクレオチド６）が二重らせんＤＮ Ａ中の鎖と交換した速度を比較するために、過剰の未ラベル化線状又は環状オリ ゴヌクレオチドを、蛍光的にラベルした二重らせんＤＮＡターゲットと混合した 。フルオレセイン発光の増大は１次に二重らせんターゲット鎖解離の目安として 二重らせんターゲットのＴｒｎのかなり下の温度でｉ＋を察された。

図８は、ＩＯ’Ｃにおける４０ＩＩＩ過剰の未ラベルｄＡ、□（点線）又は環状 オリゴヌクレオチド６　（実線）による二重らせんターゲットの解離に間する代 表的なカイネテエクアッセイを示す、示されたように、環状オリゴヌクレオチド による二重らせんターゲットの解離は、線状オリゴヌクレオチドによる解離より もかなり早い、線状オリゴヌクレオチドによる解離に間する一次速度定数は、２ ．０×１０−４秒−１であるが、環状オリゴヌクレオチドによる解離に間する一 次速度定数は、２．０ＸＩＯ−２秒−１であり、殆ど二次のオーダーの大きさで 早い。

この差は、線状オリゴヌクレオチド対環状オリゴヌクレオチドの存在下のターゲ ット二重らせんの半減期が計算されるとき、さらに明らかになる。１０°Ｃで、 二重らせんは、線状オリゴヌクレオチドの存在下で５８分の解離の半減期を有す るが、環状オリゴヌクレオチドの存在下では３０秒に過ぎない。

線状オリゴヌクレオチドと二重らせんとの間の反応の速度とは興なり、環状オリ ゴヌクレオチドと二重らせんとの間の反応の速度は、低い濃度で加えた環状オリ ゴヌクレオチドの濃度に依存し、そして高い濃度でＭｉｃｈａｅｌｆ　ｓ−Ｍｅ ｎｔｏｎ型飽和の挙動を示す（図９）。

１０°Ｃでラベルした二重らせんの解離速度は、二重らせん会合速度定数及びΔ ”１０酒から誘導できる。この速度定数、８．５ＸＩＯ”秒−１は、二重らせん コンプレックスに関する予想された熱力学的ハラメーターから誘導されるがｆＢ ｒｅｓｌａｕｅｒら、１９８６．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８３：３７４６１．この速度は、線状オリゴヌクレオチドによる鎖の置 換に間する速度定数より有意に遅い、Ｉｌ状オリゴヌクレオチドの付加による二 重らせん解離の増大は、他のケースで明白である（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら、１ ９６５、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１２：４１０）未援助二重らせん解離のそれに 対する環状オリゴヌクレオチド触媒化反応に間する速度の比較は、約１０７＠の 速度増加を明らかにしている１５１ｇ１ｅｒら、＋９６２．Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ ｌのＫ　を生ずる。Ｋ　は、ｄＡ、２又はｄ　Ｔ　Ｉ　２の一本鎖の何れかと二 重らｍ　ｃａｔ ぜんとの反応について得られた観察された速度定数より１００倍大きい。

観察された飽和の挙動（図９）は、コンプレックスが環状物と二本鎖ターゲット との間に形成することを示唆している。上記のＫｍ価を使用しモしてＫ。ａｔあ る。この価は、Ｐｊｌｃｈら（１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、１８：５７４３）の熱力学的パラメーターから誘導されるような、Ｔ−Ａ−Ｔ 塩基トリアソドよりなる１２１基三重へリックス中のＰドメインに間する約−９ ｋｃａ　ｌ　・モル−Ｉのｉ定された価に似ている。

配列リスト （１）一般的情報 （ｉ）出願人：Ｋｏｏｌ、Ｅｒ１ｃ　Ｔ。

（ｉ　ｉ）発明の名称ニ一本鎖環状オリゴヌクレオチド（ｉｉｉ）配列の数：１ ５ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛先：５ｃｕｌｌｙ、ＳｃｏｔｔｌＭｕｒｐｈｙ　＆　Ｐｒｅ（Ｂ）スト リート：４００　Ｇａｒｄｅｎ　Ｃ１ｔｙ　Ｐｌａｚａ（Ｃ）市：Ｇａｒｄｅｎ 　Ｃ１ｔｙ （Ｄ）州：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ （Ｅ）国：ＵＳＡ ＣＦ）ＺＩＰ　：１１５３０ （Ｖ）コンピュータ読みだしフオーム：（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステ ム：　ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｒ ｅ１ｅａｓｅ　＃１．０１Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５ （ｖｉ）最近の出願データ： （Ａ）出頭番号：米国 （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人／代理者情報： （Ａ）名前：ＭｃＮｕｌ　ｔｙ、Ｗ＋　１１　ｉａｍ　Ｅ。

（Ｂ）登録番号：　２２６０６ ＦＣ＋参照参照／ソケット番号８０８５Ｚ（ｉｘ）通信情報。

＋Ａ）電話：　ｆ５１６）７４２−４３４３（Ｂ）ファックス゛　（５１６）７ ４２−４３６６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　Ｉに間する情報。

ｍ配列の特徴： （Ａ）長さ：３４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の要素ニ一本積 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ：ｃＴｃｃｃｃｃｃｃｃ　ＴＣＮ ＮＮＮＮＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＴＣＮＮＮＮ３４ （２）ＳＥＱ　Ｉ［ＮＯ：２＋、ｍ間する惰Ｎ：（ｉｌ配列の特？！ｉ： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）　ｉｌｌの要素、一本積 （Ｄ）トポロジー、環状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　［）　ＮＯ１２：ＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴ　ＴＴＴ ＣＮＮＮＮＮＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＮＮＮＮＮ３８ （２１ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に間する情報：ｆｉｌ配列の特徴： （Ａ）長さ、３８塩基対 （Ｂ）タイプ核酸 （Ｃ）蹟の要素ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー゛環状 （ｘ　ｔ　）　配列ｆ）記述：ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：３：丁ＴＴＣＹＴＣＧＴＴ 　ＣＧＴＣＮＮＮＮＮＣＴＡＣＴＴＡＣ丁ＧＣＴＴＴＮＮＮＮＮ３８ （２）ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ：４に間する情報゛（ｉ）配列の特徴。

（Ａｌ長さ：４ｏＩ！基対 ＣＢ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の要素゛一本本 積Ｄ）トポロジー：環状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：ＴＣＣＴＴＣＴＴＣＹ　ＣＣＴ ＣＴＮＮＮＮＮ　ＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＮＮＮＮＮ　４゜ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５に間する情報：（ｉ）配列の特？Ｉｉ： （Ａ）長さ：３４塩基対 ＣＢ）タイプ：核酸 （ＣｈＩ！ｌの要素ニ一本積 （Ｄ）トポロジー゛両者 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：ＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡ　ＣＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＴ３４ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６に間する情報：（＋）配列の特ｍ： （Ａ）長さ：３４塩基対 （Ｂｌタイプ：核酸 （Ｃ１ａｌｌの要素ニ一本積 （Ｄ）トポロジー二両者 ｆｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：ＴＣＴＴＴＣＣＡＣＡ　ＣＣＴ ＴＴＣＴＴＴＴ　ＣＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＴ３４ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアに間する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ゛３４塩基灯 （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）鎖の要素ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー°両者 （ｘｉｌ配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア：ＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡ　ＣＴＴ ＣＴＴＴＴＣＴ　ＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴ３４ ｆ２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８に関する情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：　１２塩基対 （Ｂ）タイプ°核酸 （Ｃ）Ｆ１４の要素、一本積 （Ｄ）トポロジー　ｍ状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８゜ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡ、 ２ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：９に関する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２塩基対 （Ｂｌタイプ、核酸 （Ｃ１鎖の要素　一本積 （Ｄ）トポロジー°線状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：ＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡ　ＡＧ、 ２ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１０に関する情報；（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　１２塩基対 ＣＢ１タイプ：核酸 ｆＣｌ　！１１の要素ニ一本積 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：］Ｏ：ＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴ。

（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１］に間する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２塩基対 （Ｂｌタイプ：核酸 （Ｃ）鎖の要素ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１：ＡＡＧＡＡＴＡＧＡＡ　ＡＧ １２ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１２に間する情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　１２塩基対 ＣＢ１タイプ：核酸 （Ｃ１鎖の要素ニ一本積 （Ｄ）トポロジー：ｌｓ状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：ＡＡＧＡＡＵＡＧＡＡ　ＡＧ 、２ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３に間する情報：（ｉ）配列の特８！： （Ａ）長さ：　１２塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の要素、一本積 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：１３：ＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴ、 ２ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１４に間する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３４塩基対 ＣＢ１タイプ：核酸 （ＣＡＭの要素ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：両者 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４：ＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴ　ＴＣ ＣＡＣＡＣＣＴＴ　ＴＣＴＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣ３４ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：］５に間する情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）Ｍの要素：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡ 、２ ＦＩＧ、　ＩＡ ＡＴ　ＧＣ ＦＩＧ、ＩＢ Ｆ；η　貴 図３　（続き） ９　５’−ＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１０）図５ Ｔｍに対するｐＨの効果 ｐＨ Ｔｍ、’Ｃ Ｔｍ、。Ｃ 図７ ５′ 図８ 図９ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年９月２２日

Claims (64)

【特許請求の範囲】
1. １．環状のオリゴヌクレオチドを形成するための各結合ドメイン間にループドメ インを有する少なくとも１個の平行結合（Ｐ）ドメイン及び少なくとも１個の逆 平行結合（ＡＰ）ドメインを含み、各Ｐ及び対応するＡＰドメインは、限定され た核酸ターゲットの一つの鎖に検出可能に結合するのに十分な椙補性を有し、Ｐ ドメインはターゲットに平行なやり方で結合しＡＰドメインはターゲットに逆平 行なやり方で結合する一本鎖環状オリゴヌクレオチド。
2. ２．該ターゲットは、それから該Ｐドメイン及び前記の対応するＡＰドメイン中 の十分な数の位置に関するヌクレオチド配列が該ターゲットの配列から決められ る周知のヌクレオチド配列を含み、該Ｐドメインに関し、該ターゲット中の位置 に関する塩基がグアニン又はグアニンアナログであるとき、Ｐは相当する位置に シトシン又は好適なそのアナログを有し、該ターゲット中の位置に関する塩基が アデニン又はアデニンアナロケであるとき、Ｐは相当する位置にチミン又はウラ シル又はその好適なアナログを有し、該ターゲット中の位置に関する塩基がチミ ン又はチミンアナログであるとき、Ｐは相当する位置にシトシン又はグアニン又 はその好適なアナログを有し、該ターゲット中の位置に関する塩基がシトシン又 はシトシンアナログであるとき、Ｐは相当する位置にシトシン、チミン又はウラ シル又はその好適なアナログを有し、そして 該ターゲット中の位置に関する塩基がウラシル又はウラシルアナログであるとき 、Ｐは相当する位置にシトシン、グアニン、チミン又はウラシル又はその好適な アナログを有し、 さらに該ＡＰドメインに関し、 該ターゲット中の位置に関する塩基がグアニン又はグアニンアナログであるとき 、ＡＰは相当する位置にシトシン又はウラシル又はその好適なアナログを有し、 該ターゲット中の位置に関する塩基がアデニン又はアデニンアナロケであるとき 、ＡＰは相当する位置にチミン又はウラシル又はその好適なアナログを有し、該 ターゲット中の位置に関する塩基がチミン又はチミンアナログであるとき、ＡＰ は相当する位置にアデニン又はその好適なアナログを有し、そして該ターゲット 中の位置に関する塩基がシトシン又はシトシンアナログであるとき、ＡＰは相当 する位置にグアニン又はその好適なアナログを有し、該ターゲット中の位置に関 する塩基がウラシル又はウラシルアナログであるとき、ＡＰは相当する位置にア デニン又はグアニン又はその好適なアナログを有し、前記の十分な数の位置は、 該ターゲットに検出可能に結合する該オリゴヌクレオチドに十分な相補性をもた らす数の位置である請求項１のオリゴヌクレオチド。
3. ３．該Ｐドメインは、該ターゲットの周知のヌクレオチド配列から決められるヌ クレオチド配列を含み、 該ターゲット中の位置に関する塩基がグアニン又はグアニンアナログであるとき 、Ｐは相当する位置にシトシン又は好適なそのアナログを有し、該ターゲット中 の位置に関する塩基がアデニン又はアデニンアナログであるとき、Ｐは相当する 位置にチミン又はウラシル又はその好適なアナログを有し、該ターゲット中の位 置に関する塩基がチミン又はチミンアナログであるとき、Ｐは相当する位置にシ トシン又はグアニン又はその好適なアナログを有し、該ターゲット中の位置に関 する塩基がシトシン又はシトシンアナログであるとき、Ｐは相当する位置にシト シン、チミン又はウラシル又はその好適なアナログを有し、そして 該ターゲット中の位置に関する塩基がウラシル又はウラシルアナログであるとき 、Ｐは相当する位置にシトシン、グアニン、チミン又はウラシル又はその好適な アナログを有し、 そしてさらに該ＡＰドメインは、以下の該ターゲットの該配列から決められるヌ クレオチド配列を含み、 該ターゲット中の位置に関する塩基がグアニン又はグアニンアナログであるとき 、ＡＰは相当する位置にシトシン又はウラシル又はその好適なアナログを有し、 該ターゲット中の位置に関する塩基がアデニン又はアデニンアナログであるとき 、ＡＰは相当する位置にチミン又はウラシル又はその好適なアナログを有し、該 ターゲット中の位置に関する塩基がチミン又はチミンアナログであるとき，ＡＰ は相当する位置にアデニン又はその好適なアナログを有し、そして該ターゲット 中の位置に関する塩基がシトシン又はシトシンアナログであるとき、ＡＰは相当 する位置にグアニン又はその好適なアナログを有し、該ターゲット中の位置に関 する塩基がウラシル又はウラシルアナログであるとき、ＡＰは相当する位置にア ラニン又はグアニン又はその好適なアナログを有する請求項１のオリゴヌクレオ チド。
4. ４．該ターゲット、該Ｐドメイン及び該ＡＰドメインは、独立して約２−約２０ ０個のヌクレオチドを含む請求項１−３の何れか一つの項のオリゴヌクレオチド 。
5. ５．該ターゲット、該Ｐドメイン及び該ＡＰドメインは、独立して約６−約３６ 個のヌクレオチドを含む請求項４のオリゴヌクレオチド。
6. ６．それぞれのループドメインは、独立して約２−約２０００個のヌクレオチド を含む請求項１−３の何れか一つの項のオリゴヌクレオチド。
7. ７．それぞれのループドメインは、独立して約３−約８個のヌクレオチドを含む 請求項６のオリゴヌクレオチド。
8. ８．該ターゲットは、一本鎖又は二本鎖である請求項１−３の何れか一つの項の オリゴヌクレオチド。
9. ９．該ターゲットは、ＲＮＡ又はＤＮＡである請求項１−３の何れか一つの項の オリゴヌクレオチド。
10. １０．該ターゲットは、核酸鋳型中に含まれるドメインである請求項１−３の何 れか一つの項のオリゴヌクレオチド。
11. １１．該Ｐドメイン及び該ＡＰドメインは、スタッガー結合配置で該ターゲット に結合する請求項１−３の何れか一つの項のオリゴヌクレオチド。
12. １２．十分な相補性は、１００％より少ない相補性である請求項１−３の何れか 一つの項のオリゴヌクレオチド。
13. １３．十分な相補的は、約３０−約４０％の相補性である請求項１２のオリゴヌ クレオチド。
14. １４．該オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡである請求項１−３の何れか 一つの項のオリゴヌクレオチド。
15. １５．シトシンの好適なアナログは、５−メチルシトシンである請求項２又は３ のオリゴヌクレオチド。
16. １６．ウラシルの好適なアナログは、５−メチルウラシルである請求項２又は３ のオリゴヌクレオチド。
17. １７．アデニンの好適なアナログは、ジアミノプリンである請求項２又は３のオ リゴヌクレオチド。
18. １８．ヌクレオチドは、リボース又はデオキシリボースの代りに２′−Ｏ−メチ ルリボースを有する請求項１−３の何れか一つの項のオリゴヌクレオチド。
19. １９．該オリゴヌクレオチドは細胞内に取り込まれる請求項１−３の何れか一つ の項のオリゴヌクレオチド。
20. ２０．該オリゴヌクレオチドは、細胞受容体、コレステロール基、アリール基、 ステロイド基又はポリカチオンに関するリガンドをさらに含む請求項１９のオリ ゴヌクレオチド。
21. ２１．該オリゴヌクレオチドは、薬剤又は薬剤アナログをさらに含む請求項１− ３の何れか一つの項のオリゴヌクレオチド。
22. ２２．該ループドメインは、非ヌクレオチドループドメインを含む請求項１−３ の何れか一つの項のオリゴヌクレオチド。
23. ２３．該非ヌクレオチドループドメインは、エチレングリコールである請求項２ ２のオリゴヌクレオチド。
24. ２４．該ポリエチレングリコールは、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレ ングリコール又はヘプタエチレングリコールである請求項２３のオリゴヌクレオ チド。
25. ２５．該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１種のメチルホスホネート、ホスホ ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル，シロキサン、カー ボネート、アセトアミデート又はチオエーテル基及び燐−ホウ素結合をさらに含 む請求項１−３の何れか一つの項のオリゴヌクレオチド。
26. ２６．該オリゴヌクレオチドは、レポーター分子をさらに含む請求項１−３の何 れか一つの項のオリゴヌクレオチド。
27. ２７．請求項１−３の何れか一つの項の環状オリゴヌクレオチドを提供する少な くとも１個の第一のコンテナーを含む、ターゲット核酸の検出又は診断のための コンバートメント化キット。
28. ２８．請求項１−３の何れか一つの項の環状オリゴヌクレオチドを提供する少な くとも１個の第一のコンテナーを含む、鋳型核酸の単離のためのコンバートメン ト化キットにおいて、該オリゴヌクレオチドが該鋳型内に含まれるターゲットに 相補的であるコンパートメント化キット。
29. ２９．該鋳型がポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡである請求項２８のキット。
30. ３０．鋳型に含まれた目標とする配列へオリゴヌクレオチドの結合を行うのに十 分な条件下にＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白に関する核酸鋳型と請求項１−３の何れか 一つの項の環状オリゴヌクレオチドの少なくとも一つとを接触させ、次に該ター ゲットへ該オリゴヌクレオチドを結合させ、該鋳型への接近をブロックするか又 はその分解を行い、それによりＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白の生合成を調節すること を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白の生合成を調節する方法。
31. ３１．該鋳型は二本鎖核酸ターゲットを含み、該条件は、鎖置換により該ターゲ ットを変性しそれにより結合を行わせるのに有効である請求項３０の方法。
32. ３２．該生合成は、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ逆転写、ＲＮＡ転写、ＲＮＡスプライシ ング、ＲＮＡポリアデニル化、ＲＮＡ輸送及び蛋白翻訳の少なくとも一つを含む 請求項３０の方法。
33. ３３．該ＤＮＡ複製に関する該鋳型は、ＲＮＡ鋳型又はＤＮＡ鋳型である請求項 ３２の方法。
34. ３４．該ＤＮＡ複製を調節するための該オリゴヌクレオチドの該ターゲットは、 複製の初め又はプライマー結合部位である請求項３３の方法。
35. ３５．該ＤＮＡ逆転写を調節するための該オリゴヌクレオチドの該ターゲットは 、プライマー結合部位、レトロウイルスゲノム中の部位又はｍＲＮＡ中の部位で ある請求項３２の方法。
36. ３６．該ＲＮＡ転写を調節するための該オリゴヌクレオチドの該ターゲットは、 プロモーター、レプレッサー結合部位．オペレーター、エンハンサー、転写調節 要素又はｍＲＮＡエンコーディング領域中の部位である請求項３２の方法。
37. ３７．該ＲＮＡスプライシングを調節するための該オリゴヌクレオチドの該ター ゲットは、５′スプライス連結、イントロン分岐点又は３′スプライス連結の少 なくとも一つである請求項３２の方法。
38. ３８．該ＲＮＡポリアデニル化を調節するための該オリゴヌクレオチドの該ター ゲットは、ポリアデニル化部位である請求項３２の方法。
39. ３９．該ＲＮＡ輸送を調節するための該オリゴヌクレオチドの該ターゲットは、 ポリ（Ａ）尾部である請求項３２の方法。
40. ４０．該蛋白翻訳のための該鋳型は、ｍＲＮＡ鋳型である請求項３２の方法。
41. ４１．該鋳型の該ターゲットは，リボソーム結合部位、５′ｍＲＮＡキャップ又 は蛋白コーディング領域中の部位である請求項４０の方法。
42. ４２．該鋳型は、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型である請求項３０の方法。
43. ４３．該オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３又はＳＥＱＩＤＮＯ：４の ヌクレオチド配列を有する請求項４２の方法。
44. ４４．ターゲットを変性しそして環状オリゴヌクレオチドを結合するのに有効な 時間及び条件の下、請求項１−３の何れか一つの項の環状オリゴヌクレオチドの 任意の１個とターゲットとを接触させることによる、二本鎖核酸ターゲットにお ける鎖の置換方法。
45. ４５．該ターゲットを変性するのに有効な該条件は、約１−約１００の比で該環 状オリゴヌクレオチド及び該ターゲットを存在させることを含む請求項４４の方 法。
46. ４６．該ターゲットを変性するのに有効な該時間は、約１分−約１６時間に及ぶ 請求項４５の方法。
47. ４７．該二本鎖核酸ターゲットは、ウイルス、細菌、かび又は哺乳動物の核酸を 含む請求項４４の方法。
48. ４８．該二本鎖核酸ターゲットは、複製の元、プロモーター、レプレッサー結合 部位、オペレーター、エンハンサー、転写調節要素又はｍＲＮＡエンコーディン グ領域中の部位である請求項４７の方法。
49. ４９．該二本鎖核酸ターゲットは、純粋又は不純の核酸サンプル、組織切片、細 胞塗抹又は染色体の塊中に存在する請求項４４の方法。
50. ５０．該オリゴヌクレオチドは、レボーター分子に共有結合的に結合する請求項 ４９の方法。
51. ５１．生合成調節量の請求項１−３の何れか一つの項のオリゴヌクレオチドの少 なくとも１種及び製薬上許容できる担体を含む、核酸又は蛋白の生合成を調節す るための製薬組成物。
52. ５２．末端結合オリゴヌクレオチドに線状前環状物を結合し、該前環状物の二つ の末端を結合し、そして該一本鎖環状オリゴヌクレオチドを採取することを含む 請求項１−３の何れか一つの項の一本鎖環状オリゴヌクレオチドを製造する方法 。
53. ５３．該線状前環状物は３′−ホスフェートを有する請求項５２の方法。
54. ５４．前記の二つの末端は、該一本鎖環状オリゴヌクレオチドのＡＰヌクレオチ ドに相当する２種のヌクレオチドを含む請求項５３の方法。
55. ５５．該結合は、ＢｒＣＮ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル） カルボジイミド又はＮ−シアノイミダソールＺｎＣ１２により行われる請求項５ ４の方法。
56. ５６．請求項１−３の何れか一つの項のヌクレオチドとターゲットとの間に形成 されるコンプレックス。
57. ５７．ａ）請求項１−３の何れか一つの項のオリゴヌクレオチドに共有結合で結 合した薬剤を動物に投与し、 ｂ）該オリゴヌクレオチドを該細胞タイプに存在するターゲットｍＲＮＡに結合 し、 ｃ）それにより該薬剤を前記の特定の細胞タイプに伝達することよりなる特定の 細胞タイプ薬剤伝達の方法。
58. ５８．オリゴヌクレオチドーターゲットコンブレックスを形成するのに十分な時 間及び条件下で該核酸を含むためにテストされるサンプルを請求項１−３の何れ か一つの項の環状オリゴヌクレオチドと接触させ、そして該コンプレックスを検 出する ことを含むターゲット核酸を検出する方法。
59. ５９．該核酸は二本鎖核酸ターゲットを含み、そして該条件は、鎖置換により該 ターゲットを変性しそれにより該オリゴヌクレオチドーターゲットコンブレック スを形成する該オリゴヌクレオチドの結合を行うのに有効である請求項５８の方 法。
60. ６０．該サンプルは、純粋又は不純の核酸サンプル、組織切片、細胞塗抹又は染 色体の塊中に存在する請求項５８の方法。
61. ６１．該ターゲットを変性するのに有効な該条件は、約１−約１００の比で該環 状オリゴヌクレオチド及び該ターゲットを存在させることを含む請求項５８の方 法。
62. ６２．該ターゲットを変性するのに有効な該時間は、約１分−約１６時間に及ぶ 請求項５８の方法。
63. ６３．該コンプレックスは、蛍光エネルギー転移アッセイにより検出される請求 項５８の方法。
64. ６４．十分な相補性は、少なくとも約５０％である請求項１２のオリゴヌクレオ チド。