WO2006042838A1 - Anordnung zur integrierten und automatisierten dna- oder protein-analyse in einer einmal verwendbaren cartridge, herstellungsverfahren für eine solche cartridge und betriebsverfahren der dna- oder protein-analyse unter verwendung einer solchen cartridge - Google Patents

Anordnung zur integrierten und automatisierten dna- oder protein-analyse in einer einmal verwendbaren cartridge, herstellungsverfahren für eine solche cartridge und betriebsverfahren der dna- oder protein-analyse unter verwendung einer solchen cartridge Download PDF

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Definitions

  • a PCR polymerase chain reaction
  • amplification selective DNA amplification
  • the object of the invention is the realization of a low-cost, easy-to-handle, complete DNA or protein analysis process in a miniaturized cartridge.
  • the following improvements compared to the laboratory method should be realized: - A complete integration of all substances (possibly except
  • the cartridge used is small and inexpensive to produce.
  • the invention is based, in particular, on WO 02/072262 A1 and the further prior art mentioned therein.
  • an analysis device with dry-stored in fluid channels, stable at room temperature reagents is described, which are brought into solution by supplying water shortly before their intended use.
  • the invention is furthermore based on the unpublished DE 10 2004 021780 A1 and the unpublished DE 10 2004 021822 A1.
  • the inventive system of the geometric structures ren in microchannels or microcavities for receiving dry reagents to provide suitable conditions for DNA analysis of a hand and the other hand, protein analysis ⁇ .
  • the following features and measures are essential:
  • the reagents and auxiliaries are already introduced into depressions of the cartridge channels 4 as dry substances in the production of the cartridge.
  • the depressions can advantageously be filled with variable amounts of dry reagent. Through the combination of different dry reagent quantities and well spacing patterns, the desired concentration profiles of the final reagent solutions can be adjusted.
  • the magnetic beads are dispensed as a suspension in the lysis channel. Evaporation of the solvent is observed to cause the beads to enter the
  • the lysis reagents and the magnetic beads may be contained together in a single dry matrix.
  • the card also contains the reagents for an ELISA assay. Two reagents are described in detail for the ELISA assay required, that the first agent Re ⁇ a label enzyme, and as the second reagent is an enzyme substrate.
  • a detection module for the electrical detection of the hybridization processes is arranged in the cartridge.
  • the detection module advantageously consists of an el-metal / plastic composite or a semiconductor-processed Silicon chip with precious metal electrodes.
  • electrochemical, magnetic or piezoelectric measuring methods are suitable for electrical detection.
  • an input port for a whole blood sample before ⁇ handen is in particular an input port for a whole blood sample before ⁇ handen.
  • means are for supplying water vorhan ⁇ to, for example, inflow ports for connection to an ex ternal ⁇ water supply or an integrated water reservoir.
  • dry buffer substances have a defined ionic strength after the supply of water.
  • means for mixing a whole blood sample with water or a buffer solution are advantageously present.
  • means for flowing through the lysis / bead / reagent coated microchannel or microcavity with blood or blood / water or blood / buffer mixtures are present.
  • a magnetic field spe ⁇ for the invention in the cartridge in use essential for DNA analysis carried out PCR are still With ⁇ tel for generating for fixing the DNA / magnetic bead complex in the PCR cavity there.
  • the PCR cavity must be able to be suitably closed and means for thermocyclization must be present.
  • FIG. 2 shows the plan view of a cell disruption channel
  • FIG. 3 shows the cross section through the cell disruption channel
  • FIG. 5 FIG.
  • FIG. 5 the top view of the PCR chamber in FIG. 1, FIGS. 6 and 7 the cross section through the PCR chamber according to FIG. 5,
  • FIG. 8 and FIGS. 11 to 23 show the plan view of the cartridge according to FIG. 1 in various process states during an automated evaluation.
  • a cartridge 100 for an ELISA ( "enzyme-linked immunosorbent assay") - test with an elevation of the existing therein microchannel or Darge cavities system ⁇ is, the clarity, the associated function ⁇ designations are also referred to ,
  • the cartridge 100 consists in detail of a plastic body 101 with there introduced fluidic structures, the one of
  • the cartridge 100 has an input port 102 for a whole blood sample.
  • means for supplying water are present.
  • microchannels or microcavities 101-131 are filled in the Nor mally ⁇ with dry buffer substances which ensure a de ⁇ finêt ionic strength to the water supply.
  • dry buffer substances which ensure a de ⁇ finiert ionic strength to the water supply.
  • For the blood analysis are means for mixing whole blood samples and water or the buffer solution and / or means for flowing through a microsphere coated with a lysis bead reagent or the microcavity with blood or with blood-water or blood-buffer mixture available.
  • In the channel system are wide areas 106, 107, 108, 109 is provided as re ⁇ servoirs for receiving waste ( "waste").
  • reference numerals 101 again identify the cartridge base body.
  • the body includes a spe ⁇ essential for cell disruption ( "lysis") a shaped in a special way flow passage 111 with edges formed by the sides ⁇ step-shaped recesses 112 is used to receive me of dry reagents.
  • the recesses 112 in this case have a plurality of steps with step heights of 10 to 500 .mu.m and ha ⁇ ben an extension of approximately 1 mm and a depth of about microns 100th
  • reagents of this kind which in particular also contain magnetic beads for binding the released DNA, are distributed uniformly between the steps 112 via the flow channel 111.
  • Magnetic beads have DNA- and protein-binding properties, provided that they have been pretreated accordingly. They may interfere with DNA-binding properties. optionally also be coated with antibodies.
  • FIGS. 8 to 10 show the structure and the structure of the ELISA reagent channels 131 and 131 'from FIG. 1.
  • well-shaped depressions 132 to 132 6' are present which are suitable for receiving pre-dosed and pre-ported quantities Reagents for the ELISA process according to FIG. 9 are suitable.
  • This is described in detail in WO 02/072262 A1, which has already been cited at the outset as state of the art, to which reference is likewise expressly made in the present context (“Incorporation by Reference").
  • the circular cylindrical recesses 132-132 6 'with dry reagents 133-133 6' filled dar ⁇ provided.
  • a first reagent realizes a labeling enzyme and a second reagent an enzyme substrate, as is known to be required in the hybridization of the sample optionally prepared by a PCR with specific capture probes.
  • area 130 of the detection may be in a module of a precious metal / plastic composite are different sensors for Erfas ⁇ solution of biochemical reactions.
  • semiconductor-processed chips ie in particular silicon-based sensors, the signals electrically detected and processed immediately.
  • electrochemical, magnetic and / or piezoelectric measuring methods with related sensors are also possible.
  • the cartridge 100 according to FIG. 1 is shown in plan view, with the area of the cartridge 100 active during the analysis process being marked.
  • the cartridge 100 is transformed into an analyzer, which is not shown in detail in the figures and not Jacobs ⁇ tand the present patent application, is inserted.
  • the enzyme-substrate solution flows via the Detektionsmo ⁇ module 130 for enzymatic-electrochemical detection of hybridization in the waste area 109 (Waste 4).
  • the cartridge described in detail with channels and cavities with reference to FIG. 1 is made of a polymer material, such as polycarbonate, for example by injection molding.
  • the card base body 101 is produced with structures that are open at the top, and the reagents are spotted into the initially open channels or cavities and then dried.
  • the detection module is incorporated in a suitable manner in the cartridge, insbesonde ⁇ re glued.
  • the channels and the cavities are provided , for example, with an elastic film as the top cover and are therefore closed for the intended use.
  • the detection chamber is first flushed with an antibody solution carrying an enzyme label (ELISA reagent 1). Then, the rinsing of the detection chamber with enzyme substrate (ELISA reagent 2). The electrochemical measurements are carried out in a manner known per se at predeterminable, different temperatures and changeable flow rates of the enzyme-substrate solution.

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Abstract

Zur automatisierten DNA- oder Protein-Analyse wird eine Cartridge (Karte) mit einem System von Mikrokanälen und/oder Mikrokavitäten verwendet, wobei die Mikrokanäle bzw. die Mikrokavitäten geometrische Strukturen zur Aufnahme von Trockenreagenzien aufweisen. Zwecks industrieller Herstellung wird die Cartridge aus einem flachen Kartenkörper hergestellt, beispielsweise durch Spritzgusstechnik, in die offenen Kanäle die Reagenzien gespottet und getrocknet und anschliessend werden die Kanäle durch eine Folie verschlossen. Es kann somit eine fertig konfektionierte Cartridge mit einer Messprobe versehen werden und durch Einbringen in ein Auslesegerät der vollautomatisierte Messablauf gestartet werden.

Description

Beschreibung
Anordnung zur integrierten und automatisierten DNA- oder Pro¬ tein-Analyse in einer einmal verwendbaren Cartridge, Herstel- lungsverfahren für eine solche Cartridge und Betriebsverfah¬ ren der DNA- oder Protein-Analyse unter Verwendung einer sol¬ chen Cartridge
Die Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung zur integrier- ten und automatisierten DNA- oder Protein-Analyse in einer einmal verwendbaren Cartridge. Als Cartridge wird dabei eine flache Karte im Scheckkartenformat bezeichnet. Daneben be¬ zieht sich die Erfindung auf die Herstellung einer solchen Cartridge. Schließlich bezieht sich die Erfindung auch auf ein Betriebsverfahren für eine DNA- oder Protein-Analyse un¬ ter Verwendung einer solchen Cartridge.
Zur Nukleinsäureanalytik, beispielsweise zur Analytik von weißen Blutzellen aus Vollblut, zwecks Beantwortung von hu- mangenomischen Fragestellungen müssen zunächst in einer ers¬ ten Station als Probenvorbereitungsschritt die Zellen auf¬ gebrochen und anschließend die dabei freigesetzte DNA iso¬ liert werden. In einer zweiten Station erfolgt eine PCR (Po¬ lymerase Chain Reaction = Polymerase-Ketten-Reaktion) zur se- lektiven DNA-Vervielfältigung (Amplifikation) , um die Kon¬ zentration der nachzuweisenden DNA soweit zu erhöhen, dass diese in einer dritten Station nachgewiesen werden kann.
Im Labor werden letztere Teilprozesse separat nach bekanntem Stand der Technik durchgeführt. Die vorstehend erläuterten drei Stationen beinhalten jeweils mehrere Arbeitsschritte und werden voneinander unabhängig mit unterschiedlichen Geräten durchgeführt. Die einzelnen Arbeitsschritte erfolgen weitge¬ hend manuell.
Die Realisierung dieser Schritte ist vom Vorhandensein von Laborgeräten - wie einer Zellaufschluss-Apparatur, einem PCR- Gerät (sog. Thermocycler) , evtl. einem PCR-Gerät, das für quantitative PCR geeignet ist, einer Elektrophorese-Appara¬ tur, einer Hybridisierungsstation, einem optischen Reader, sog. Eppendorf-Tubes, mehreren Pipettier-Geräten sowie einem Kühlbehälter für Reagenzien - abhängig und muss von geschul- tem Personal unter Einhaltung von Sicherheitsvorschriften be¬ züglich Infektionsgefahr, Abfallentsorgung od. dgl. durchge¬ führt werden. Insbesondere müssen mehrere volumetrische, d.h. genaue, Dosierungen (Pipettieren) von Reagenzlösungen durch¬ geführt werden. Solche Arbeitsschritte sind zeitaufwendig und kostenintensiv.
Vom Stand der Technik sind Einrichtungen zur biochemischen Analyse bekannt, die entsprechend der WO 02/073153 Al Verwen¬ dung von insbesondere siliziumbasierten Messmodulen machen, welche in eine Chipkarte integriert werden können. Dabei wer¬ den entsprechend der WO 02/072262 Al bereits die zur Analyse verwendeten Reagenzien in trockengelagerter Form in das Ana¬ lysemodul integriert .
Davon ausgehend ist Aufgabe der Erfindung die Realisierung eines preisgünstigen, einfach handhabbaren, kompletten DNA- oder Protein-Analyse-Vorganges in einer miniaturisierten Cartridge. Insbesondere sollen folgende Verbesserungen im Vergleich zur Labormethode realisiert werden: - Eine vollständige Integration aller Stoffe (evtl. außer
Wasser) in einer geschlossenen einmal verwendbaren Cartrid¬ ge;
- eine Bevorratung der Reagenzien in einer bei Raumtemperatur lagerstabilen Form; - eine automatische Durchführung aller Prozesse in der Cart¬ ridge;
- keine manuellen Arbeitsschritte, außer Injektion der zu analysierenden Probe, z.B. Blut;
- Kein direkter Kontakt mit gesundheitsgefährdenden Stoffen (Blut und Reagenzien-Abfall verbleiben in der Cartridge) ;
- Cartridge-Geometrie erlaubt eine effiziente und schnelle Thermozyklisierung;
- alle Detektionsvorgänge sollen elektrisch ablaufen und ein¬ fach auszulesen sein;
- die verwendete Cartridge ist klein und kostengünstig herzu- stellen.
Die Aufgabe ist erfindungsgemäß durch eine Anordnung mit ei¬ ner Cartridge gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Die Herstellung einer solchen Cartridge ist Gegenstand des Patentanspruches 34. Betriebsverfahren mit solchen Cartridges sind Gegenstand der nebengeordneten Patentansprüche 38 und 42. Dabei ist An¬ spruch 38 auf die DNA-Analyse und Anspruch 42 auf die Prote¬ in-Analyse gerichtet. Weiterbildungen der Anordnung, des Her¬ stellungsverfahrens und der Betriebsweise bei der Analyse sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben.
Die Erfindung geht insbesondere von der WO 02/072262 Al und dem dort genannten weiteren Stand der Technik aus. Dort wird eine Analyseeinrichtung mit in Fluidkanälen trockengelager- ten, bei Raumtemperatur stabilen Reagenzien beschrieben, die durch Zuführen von Wasser kurz vor ihrer bestimmungsgemäßen Verwendung in Lösung gebracht werden. Die Erfindung geht wei¬ terhin von der nicht vorveröffentlichten DE 10 2004 021780 Al und der nicht vorveröffentlichten DE 10 2004 021822 Al aus. Daneben ist es auch bekannt, speziell elektrisch auslesbare Detektionsmodule zu verwenden.
Demgegenüber ist Gegenstand der Erfindung eine solche einmal verwendbare Cartridge mit einem System aus Mikrokanälen und/oder Mikrokavitäten für einen vorgegebenen Prozessablauf nach der Probenaufnahme, wobei die Cartridge Strukturen zur Aufnahme der Trockenreagenzien aufweist und diesen Strukturen Mittel zur Durchführung sowohl des Zellaufschlusses einer¬ seits und der PCR andererseits, aber auch der elektrochemi- sehen Detektion zugeordnet sind. Insbesondere haben dabei die Kanäle unterschiedliche, problemangepasste Strukturen. Spe¬ ziell der Aufschlusskanal hat vorteilhafterweise gestufte Querschnitte zur optimalen Benetzung mit dem Trockenreagenz, während die PCR-Kammer und die Elisa-Reagenzkanäle töpfchen- förmige Vertiefungen aufweisen.
Es kann somit erreicht werden, dass in einem Verfahrensab- lauf die Zuführung und Aufbereitung der Probe, die DNA-
Amplifikation und die eigentliche Detektion der DNA möglich ist .
Durch das erfindungsgemäße System der geometrischen Struktu- ren in den Mikrokanälen bzw. Mikrokavitäten zur Aufnahme von Trockenreagenzien ergeben sich geeignete Randbedingungen für die DNA-Analyse einerseits und die Protein-Analyse anderer¬ seits. Folgende Merkmale und Maßnahmen sind wesentlich:
- Die im Mikrokanal bzw. in der Mikrokavität eingebrachten Reagenzien sind trockenbare Substanzen mit vernachläs¬ sigbarem Dampfdruck. Durch die bei Raumtemperatur stabi¬ len Substanzen bleiben deren Eigenschaften für Zellauf- schluss und/oder PCR und/oder Detektion erhalten. Dabei können Gemische aus den Substanzen mit Hilfsstoffen Dünnfilme bilden und können die Gemische mit dünnen Pa¬ raffinschichten wasserdicht abgedeckt sein.
Bei der Erfindung werden die Reagenzien und Hilfsstoffe be¬ reits bei der Herstellung der Cartridge als Trockensubstanzen in Vertiefungen der Cartridgekanäle4 eingebracht. Daraus er¬ geben sich folgende Vorteile:
- einfache und präzise Applikation der Reagenzien bei der Herstellung der Cartridge
- Schutz der Reagenzien beim Befüllen der Reagenzkanäle, d.h. die Reagenzien werden durch einen sog. Wasserflow nicht weggespült, sondern bleiben beim Füllen des gesam¬ ten Kanals erhalten. Erst nach dem Befüllen des Kanals lösen sich die Reagenz-Spots über Diffusionsvorgänge auf und es entsteht eine homogene Reagenzlösung.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform sind die Vertie¬ fungen in vordefinierten Abständen entlang des Reagenzkanals lokalisiert. Dabei können die Abstände äquidistant sein oder besonders vorteilhaft in variablen Abstandsmustern angeordnet sein.
Die Vertiefungen können vorteilhafterweise mit variablen Tro- ckenreagenzmengen befüllt sein. Durch die Kombination von verschiedenen Trockenreagenzmengen und Abstandsmustern der Vertiefungen können die gewünschten Konzentrationsprofile der fertigen Reagenzlösungen eingestellt werden.
Für bestimmte Funktionen wie z.B. ZellaufSchluss in Gegenwart von Magnet-Beads und Lyse-Reagenzien ist eine gleichmäßige Verteilung der unlöslichen Komponenten, d.h. der Beads, im Trockenreagenz erforderlich. Dazu werden die Magnet-Beads als Suspension in den Lyse-Kanal dispensiert. Beim Verdampfen des Lösungsmittels wird beobachtet, dass sich die Beads in die
Randbereiche des Lyse-Kanals zurückziehen und eine gleichmä¬ ßige Verteilung dadurch nicht gegeben ist. Durch stufenartige Strukturierung des Lyse-Kanal-Querschnittes verteilen sich die Magnet-Beads über die Stufen und eine gleichmäßige Ver- teilung wird erreicht.
Damit mit der erfindungsgemäßen Cartridge gleichermaßen ein ZellaufSchluss, eine PCR und ein so genannter DNA-/Protein- ELISA-Test durchgeführt werden kann, ist es vorteilhaft, dass in den Mikrokanälen bzw. Mikrokavitäten Substrate mit DNA- bindenden Eigenschaften, insbesondere die DNA-bindenden Mag¬ net-Beads, vorhanden sind. Dabei können die Lyse-Reagenzien und die Magnet-Beads zusammen in einer einzigen Trockenmatrix enthalten sein. Weiterhin sind in der Karte auch die Reagen- zien für einen ELISA-Assay vorhanden. Im Einzelnen werden für das ELISA-Assay zwei Reagenzien benötigt, d.h. als erstes Re¬ agenz ein Label-Enzym und als zweites Reagenz ein Enzym-Substrat.
Insbesondere ist in der Cartridge ein Detektionsmodul zur e- lektrischen Detektion der Hybridisierungsvorgänge angeordnet. Das Detektionsmodul besteht vorteilhafterweise aus einem E- delmetall/Plastik-Verbund oder einem halbleiterprozessierten Siliziumchip mit Edelmetallelektroden. Für eine elektrische Detektion geeignet sind dabei insbesondere elektrochemische, magnetische oder piezoelektrische Messverfahren.
Zur Anwendung der Erfindung der erfindungsgemäßen Cartridge ist insbesondere ein Eingabeport für eine Vollblutprobe vor¬ handen. Weiterhin sind Mittel zur Zufuhr von Wasser vorhan¬ den, beispielsweise Zufluss-Ports zum Anschluss an eine ex¬ terne Wasserzufuhr oder ein integriertes Wasserreservoir. In den Mikrokanälen bzw. Mikrokavitäten haben trockene Puffer¬ substanzen definierte Ionenstärke nach der Wasserzufuhr.
Bei Anwendung der Erfindung zur Analytik von weißen Blutzel¬ len aus Vollblut sind vorteilhafterweise Mittel zum Mischen einer Vollblutprobe mit Wasser bzw. einer Pufferlösung vor¬ handen. Dabei sind Mittel zum Durchströmen des mit Lyse- /Bead/Reagenz beschichteten Mikrokanals bzw. Mikrokavität mit Blut bzw. Blut/Wasser- oder Blut/Puffer-Gemische vorhanden.
Für die in der erfindungsgemäßen Cartridge bei Anwendung spe¬ ziell zur DNA-Analyse durchzuführende PCR sind weiterhin Mit¬ tel zum Generieren eines Magnetfeldes zum Fixieren des DNA- /Magnetbead-Komplexes in einer PCR-Kavität vorhanden. Für diesen Zweck muss die PCR-Kavität geeignet verschlossen wer- den können und müssen Mittel zur Thermozyklisierung vorhanden sein.
Schließlich ist es bei der erfindungsgemäßen Cartridge we¬ sentlich, dass Mittel zum Lagern von verbrauchtem Probenmate- rial und verbrauchten Reagenzien vorhanden sind, die Abfall- Reservoirs bilden. Dabei müssen die Mittel zur keimdichten, zell- bzw. partikelfreien Entlüftung von mindestens einem Ab¬ fallreservoir geeignet sein. Zum Auslesen der Cartridge in einem Auslesegerät, das nicht Gegenstand der Erfindung ist, müssen schließlich Mittel zur Fixierung der Cartridge vorhan¬ den sein.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbei¬ spielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentan¬ sprüchen. Es zeigen in jeweils schematischer Darstellung
Figur 1 eine Cartridge mit einer Übersicht über einzelne
Mikrokanal-/ Kavitäten-Systeme mit den zugehörigen Funktionsbezeichnungen,
Figur 2 die Draufsicht auf einen Zeilaufschlusskanal, Figur 3 den Querschnitt durch den Zeilaufschlusskanal ge- maß Figur 5,
Figur 4 zwei Alternativen des Durchflusskanalquerschnittes in vergrößerter Darstellung,
Figur 5 die Draufsicht auf die PCR-Kammer in Figur 1, Figuren 6 und 7 den Querschnitt durch die PCR-Kammer gemäß Figur 5,
Figur 8 die Draufsicht auf einen ELISA-Reagenzkanal in Fi¬ gur 1, Figuren 9, 10 den Querschnitt des ELISA-Reagenzkanals gemäß
Figur 8 sowie die Figuren 11 bis 23 die Draufsicht auf die Cartridge gemäß Fi¬ gur 1 in verschiedenen Verfahrenszuständen während einer automatisierten Auswertung.
In den Figuren haben gleiche bzw. gleichwirkende Elemente gleiche Bezugszeichen. Insbesondere die Figuren 1 bis 10 ei¬ nerseits und die Figuren 11 bis 23 andererseits werden ge¬ meinsam beschrieben.
In Figur 1 ist eine Cartridge 100 für einen ELISA("Enzyme Linked Immuno Sorbent ASSAY")- Test mit einem Aufriss des darin vorhandene Mikrokanal- bzw. Kavitäten-System darge¬ stellt, wobei der Übersicht halber die zugehörigen Funktions¬ bezeichnungen zusätzlich bezeichnet sind. Die Cartridge 100 besteht im Einzelnen aus einem Kunststoff-Grundkörper 101 mit dort eingebrachten Fluidik-Strukturen, die von einer
Kunstofffolie abgedeckt sind. Die Strukturen werden anhand der Figuren 2 bis 10 weiter unten beschrieben. Aus der Draufsicht gemäß Figur 1 ist ein Probenport 102 mit daran anschließender Dosierstrecke 105, über den definiert flüssige Proben zur insbesondere Nukleinsäureanalytik, bei¬ spielsweise zur Analytik von weißen Blutzellen aus Vollblut, zwecks Beantwortung von humangenomischen Fragestellungen ein¬ gebracht werden können, ersichtlich. Es schließt sich ein Ka¬ nalbereich 110 für den ZellaufSchluss der Probe und weiterhin speziell für eine der DNA-Analyse ein Bereich 120 für eine PCR(Polymerase Chain Reaction = Polymerase-Ketten-Reaktion) zur selektiven DNA-Vervielfältigung (Amplifikation) an, um die Konzentration der nachzuweisenden DNA soweit zu erhöhen, dass diese in einer dritten Station nachgewiesen werden kann. Die eigentliche PCR-Kammer ist durch Ventile 122, 122' ver¬ schließbar. Die Detektion der so aufbereiteten Probe, insbe- sondere gemäß dem ELISA-Verfahren, erfolgt dann im Bereich 130.
Aus Figur 1 sind weiterhin Wasserports 103 bis 103''' er¬ sichtlich. Darüber ist bei der Aufbereitung einer Probe Was- ser als Transport- und Lösungsmittel in die Cartrridge 100 einbringbar. Weiterhin sind Entlüftungsports 104 bis 104''' vorhanden.
Wie erwähnt hat die Cartridge 100 insbesondere einen Eingabe- Port 102 für eine Vollblutprobe. Dazu sind Mittel zur Zufuhr von Wasser vorhanden. Es kann ein Zuflussport zum Anschluss an eine externe Wasserzufuhr vorhanden sein oder der Zufluss¬ port kann an ein integriertes Wasser-Reservoir angeschlossen werden.
Die Mikrokanäle bzw. Mikrokavitäten 101 bis 131 sind im Nor¬ malfall mit trockenen Puffersubstanzen gefüllt, die eine de¬ finierte Ionenstärke nach Wasserzufuhr gewährleisten. Für die Blutanalyse sind Mittel zum Mischen von Vollblutproben und Wasser bzw. der Pufferlösung und/oder Mittel zum Durchströmen eines mit einem Lyse-Bead-Reagenz beschichteten Mikrokanals bzw. der Mikrokavität mit Blut oder mit Blut-Wasser- bzw. Blut-Puffer-Gemisch vorhanden. Im Kanalsystem sind weite Bereiche 106, 107, 108, 109 als Re¬ servoirs für die Aufnahme von Abfall ("Waste") vorgesehen. Daneben ist ein Bereich mit Kanälen 131 bzw. 131' für die Aufnahme unterschiedlicher ELISA-Reagenzien vorhanden.
In den Figuren 2 bis 4 kennzeichnen jeweils Bezugszeichen 101 wieder den Cartridge-Grundkörper. Der Körper beinhaltet spe¬ ziell für einen ZellaufSchluss ("Lyse") einen in besonderer Weise ausgeformten Durchflusskanal 111 mit durch die Seiten¬ kanten gebildeten stufenförmigen Vertiefungen 112 zur Aufnah¬ me von Trockenreagenzien. Die Vertiefungen 112 weisen dabei mehrere Stufen mit Stufenhöhen von 10 bis 500 μm auf und ha¬ ben eine Ausdehnung von ca. 1 mm und eine Tiefe von etwa 100 μm.
Speziell in der Darstellung gemäß der Figur 4a ergibt sich die alternative Möglichkeit, bei einem Durchflusskanal ohne Zusatzvertiefungen die Aufnahme der Lyse-Reagenzien nur im Bereich 113 der Kanten des Durchflusskanals 111 vorzusehen. In Figur 4b sind dagegen derartige Reagenzien, die insbeson¬ dere auch Magnet-Beads zur Bindung der freigesetzen DNA ent¬ halten, gleichmäßig zwischen den Stufen 112 über den Durch¬ flusskanal 111 verteilt. Magnet-Beads haben DNA- und Protein- bindende Eigenschaften, sofern sie entsprechend vorbehandelt sind. Sie können mit DNA-bindenden Eigenschaften u. gegebenenfalls auch mit Antikörpern beschichtet sein. Zum Einbringen von Trockensubstanzen als Matrix mit Lyse-Reagenz und Magnet-Beads wird insbesondere auf die ältere DE 10 2004 021780 Al und die ältere DE 10 2004 021822 der Anmelderin verwiesen.
In den Figuren 5 bis 7 ergibt sich die Struktur einer PCR- Kammer 120 im Cartridge-Grundkörper 101 mit Strömungskanal 111. Die Ventilanordnung zum Abschluss der PCR-Kammer bei be¬ stimmungsgemäßer Anwendung ist hier nicht dargestellt. We¬ sentlich ist, dass in der PCR-Kammer 120 rundzylindrische Vertiefungen 124, 124' zur Aufnahme spezifischer Reagenzien 127, 127', die bei der Durchführung der PCR benötigt werden, vorhanden sind. Speziell in Figur 7 ist dazu dargestellt, dass ein trocken lagerbares, bei Raumtemperatur stabiles PCR- Reagenz 127, 127' zunächst von einer Paraffinschicht 128, 128' abgedeckt ist.
Die sachgerechte Durchführung der PCR mit ventilgesteuerter Thermozyklisierung innerhalb einer Cartridge wird im Einzel¬ nen in den parallelen Anmeldungen DE 10 2004 050576.4 und DE 10 2004 050510.1 Anmelderin mit gleicher Anmeldepriorität be¬ schrieben, auf die im vorliegenden Zusammenhang ausdrücklich verwiesen wird ("Incorporation by Reference") . Insbesondere wird darin die Verwendung von Magnet-Beads zur DNA-Bindung und die Konzentration der Magnet-Beads mit der DNA in der PCR-Kammer 120 durch steuerbare Magnetfelder beschrieben, worauf hier nicht mehr im Einzelnen eingegangen wird.
Aus den Figuren 8 bis 10 ergibt sich der Aufbau und die Struktur der ELISA-Reagenz-Kanäle 131 und 131' aus Figur 1. Es sind jeweils näpfchenförmige Vertiefungen 132 bis 1326' vorhanden, die zur Aufnahme von vordosierten und vorportio¬ nierten Mengen an Reagenzien für den ELISA-Prozess entspre¬ chend Figur 9 geeignet sind. Dies ist im Einzelnen in der eingangs bereits als Stand der Technik genannten WO 02/072262 Al beschrieben, auf die im vorliegenden Zusammenhang eben¬ falls ausdrücklich verwiesen wird ("Incorporation by Referen¬ ce") . In Figur 10 sind die kreiszylindrischen Vertiefungen 132 bis 1326' mit Trockenreagenzien 133 bis 1336' befüllt dar¬ gestellt. Dabei realisiert ein erstes Reagenz ein Markie- rungsenzym und ein zweites Reagenz ein Enzymsubstrat, wie es bekanntermaßen bei der Hybridisierung der gegebenenfalls durch eine PCR aufbereiteten Probe mit spezifischen Fänger¬ sonden benötigt wird. Im nur schematisch angedeuteten Bereich 130 der Detektion können sich in einem Modul aus einem Edel- metall-/Plastik-Verbund unterschiedliche Sensoren zur Erfas¬ sung biochemischer Reaktionen befinden. Speziell bei elektro¬ chemischen Messungen mit halbleiterprozessierten Chips, d.h. insbesondere siliziumbasierten Sensoren, können die Signale elektrisch erfasst und unmittelbar weiterverarbeitet werden. Neben elektrochemischen sind auch magnetische und/oder piezo¬ elektrische Messmethoden mit diesbezüglichen Sensoren mög¬ lich.
In den Figuren 11 bis 23 ist jeweils die Cartridge 100 gemäß Figur 1 in der Draufsicht dargestellt, wobei der jeweils beim Analysevorgang aktive Bereich der Cartridge 100 markiert ist: Dazu wird die Cartridge 100 in ein Analysegerät, das in den Figuren nicht im Einzelnen dargestellt ist und nicht Gegens¬ tand vorliegender Patentanmeldung ist, eingeschoben.
Die Auswertung wird nachfolgend anhand elf konkreter Verfah¬ rens-Teilschritte a) bis m) verdeutlicht, nachdem die Cart- ridge in ein Auswertegerät mit Mitteln zur Aufnahme der Cart¬ ridge eingeschoben und das Auswertegerät bei darin fixierter Cartridge aktiviert ist. Unter Bezugnahme auf Figurl ergeben sich im Einzelnen folgende Teilschritte:
a) Es wird ca. 10 μl Blut als Messprobe eingefüllt. Über die Dosierkapillare 105 wird 1 μl automatisch dosiert. b) Das überschüssige Blut wird in den Leerraum 106 (Waste 1) gewaschen. c) Anschließend werden 1 μl Blutprobe mit Wasser verdünnt und in den Zeilaufschlusskanal 110 transferiert. Dort finden der ZellaufSchluss (Lyse) der Blutzellen sowie das Binden der freigesetzten DNA an die Magnet-Beads statt. d) Anschließend werden die Magnet-Beads in die PCR-Kammer transferiert und dort gesammelt. Es findet ein Wasch¬ vorgang statt, wobei die Waschlösung im Leerraum 107
(Waste 2) gesammelt wird. e) Nunmehr ist der Waschvorgang abgeschlossen. f) Anschließend werden die PCR-Kammerventile 122, 122' ge- schlössen und die PCR durchgeführt. g) Während der PCR wird gleichermaßen der ELISA-Reagenz- kanal 131, der das Enzymsubstrat enthält, mit Wasser gefüllt. h) Gleichermaßen wird während der PCR der ELISA-Reagenz kanal 131', der das Label-Enzym enthält, mit Wasser ge¬ füllt. i) Nach der PCR werden die PCR-Kammerventile 122, 122' ge- öffnet und das PCR-Produkt wird über das Detektionsmo- dul 130 (in den Waste 3, Kanal 108) geleitet, wo die Hybridisierung mit den spezifischen Fängersonden er¬ folgt. j) Der Enzym-Substrat-Kanal wird in den Abfallkanal 108 (Waste 3) entlüftet. k) Der Label-Enzym-Kanal wird in den Abfallkanal 108
(Waste 3) entlüftet. 1) Die Label-Enzym-Lösung fließt über das Detektionsmodul
130 zum Labein in den Abfallbereich 109 (Waste 4) . m) Die Enzym-Substrat-Lösung fließt über das Detektionsmo¬ dul 130 zur enzymatisch-elektrochemischen Detektion der Hybridisierung in den Abfallbereich 109 (Waste 4) .
Damit ist das Analyseverfahren abgeschlossen. Insbesondere bei einer elektrochemischen Detektion können die anfallenden Signale elektrisch ausgelesen und prozessorgestützt gemäß vorgegebenem Programm ausgewertet werden.
Die anhand der Figur 1 im Einzelnen mit Kanälen und Kavitäten beschriebene Cartridge wird aus einem Polymermaterial, wie z.B. Polycarbonat, beispielsweise in Spritzgusstechnik, her¬ gestellt. Dabei wird zunächst der Karten-Grundkörper 101 mit nach oben offenen Strukturen hergestellt und es werden die Reagenzien in die zunächst offenen Kanäle bzw. Kavitäten ge- spottet und anschließend getrocknet. Das Detektionsmodul wird in geeigneter Weise in die Cartridge eingebracht, insbesonde¬ re eingeklebt. Zum Abschluss werden die Kanäle und die Kavi¬ täten z.B. mit einer elastischen Folie als obere Abdeckung versehen und ist damit für den bestimmungsgemäßen Gebrauch abgeschlossen.
Es ist auch möglich, dass auf den offenen Kartengrundkörper 101 vor dem abdeckseitigen Abschluss und Fertigstellung der Cartridge bestimme Sondereinrichtungen, beispielsweise als Dichtungsmaterialien und/oder Entlüftungsmaterialien, aufge¬ bracht werden.
Das konkrete Messverfahren wurde anhand der Figuren 11 bis 23 für einen spezifischen Fall der DNA-Analyse einer Probe aus Vollblut erläutert. Allgemein ist vorgesehen, die beschriebe¬ ne Cartridge für die DNA-Analyse einerseits und/oder die Pro¬ teinanalyse andererseits einzusetzen, wobei - wie vorstehend bereits erwähnt - ein entsprechendes Auslesegerät und zugehö¬ rige Auswertealgorithmen zu Hilfe genommen werden. Damit er¬ geben sich definierte Betriebsverfahren, welche die anhand der Beispiele beschriebene Cartridge erst praxistauglich zum dezentralen Einsatz im Rahmen einer medizinischen "Point of Care"-Anwendung machen.
Abschließend wird speziell für die DNA-Analyse nochmals das integrierte Betriebsverfahren der oben im Einzelnen beschrie¬ benen Cartridge als Kombination bzw. in der Abfolge der einzelnen Teilschritte zusammengefasst :
- Aufgeben der Probe in Cartridge
- Einschieben der Cartridge in Auslesegerät
- Starten des vollautomatischen Assays - Proben-Dosierung über Dosierstrecke
- Waschen der Dosierstrecke
- Verdünnen der Probe und Einbringen in Lyse-Kanal
- Verweilen im Lyse-Kanal
- Sammeln des DNA-Bead-Komplexes durch Beadsammler in der PCR-Kammer
- Waschen des DNA-Bead-Komplexes mit Wasser
- Verschließen der PCR-Kammer
- Durchführung der PCR
- Während der PCR: Füllen der beiden ELISA-Reagenzkanäle mit Wasser
- Öffnen der PCR-Kammer
- Transport des PCR-Produkts in Detektionskammer
- Hybridisierung in der Detektionskammer - Entlüften der beiden ELISA-Reagenzkanäle
- Füllen und Spülen der Detektionskammer mit ELISA Rea¬ genz 1
- Füllen und Spülen der Detektionskammer mit ELISA- Reagenz 2
- Durchführung der elektrochemischen Messungen.
Bei den elektrochemischen Messungen erfolgt zunächst das Durchspülen der Detektionskammer mit einer ein Enzymlabel tragenden Antikörperlösung (ELISA-Reagenz 1) . Dann erfolgt das Durchspülen der Detektionskammer mit Enzymsubstrat (ELISA-Reagenz 2) . Die elektrochemischen Messungen werden in an sich bekannter Weise bei vorgebbaren, unterschiedlichen Temperaturen und änderbarer Fließgeschwindigkeiten der Enzym- substrat-Lösung durchgeführt.
Für die Protein-Analyse werden entsprechende Vorgehensweisen angewandt, wobei in diesem Fall die PCR nicht zum Tragen kommt .

Claims

Patentansprüche
1. Anordnung zur integrierten und automatisierten DNA- oder Protein-Analyse einer Messprobe in einer mit Trockenreagen- zien befüllten einmal verwendbaren Cartridge (Karte) , mit folgenden Merkmalen zur automatischen Durchführung aller für die Prozessanalytik aus einzelnen Teilprozessen in der Cart¬ ridge notwendigen Maßnahmen:
- in der Cartridge (100) ist ein System von Mikrokanälen und/oder Mikrokavitäten (101 bis 131) für eine mikrofluidi- sche Prozesstechnik vorhanden,
- die Mikrokanäle bzw. die Mikrokavitäten (101 bis 131) wei¬ sen vorgegebene geometrische Strukturen auf, um Reagenzien aufzunehmen, wobei - die Reagenzien an bestimmten Stellen in den Mikrokanälen bzw. die Mikrokavitäten (101 bis 131) der Cartridge (100) in einer lagerstabilen Form bevorratet sind,
- es sind Mittel vorhanden, um die trockengelagerten Reagen¬ zien für den jeweiligen Teilprozess in geeigneter Form, insbesondere als flüssiges Reagenz, bereit zu stellen.
2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Strukturen zur Aufnahme der trockenen, lagerstabilen Rea¬ genzien die Reagenzien Vertiefungen (112, 132) aufweisen.
3. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefungen mindestens eine Stufe mit Stufenhöhen von 10 bis 500 μm aufweisen.
4. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefungen eine Ausdehnung von ca. 1 mm und eine Tiefe von etwa 100 μm haben.
5. Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefungen Zylindrisch sind, wobei die Ausdehnung den Durchmesser darstellt.
6. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in den Mikrokanälen bzw. in den Mik- rokavitäten (101 bis 131) eingebrachte Reagenzien folgende Eigenschaften aufweisen: - Es sind trockenbare Substanzen mit vernachlässigbarem
Dampfdruck, die bei Raumtemperatur stabil sind, so dass die Eigenschaften für einen ZellaufSchluss bzw. eine PCR bzw. zur Detektion biochemischer Größen erhalten bleiben.
7. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Gemische aus der jeweiligen Substanz mit Hilfsstoffen dünne Filme bilden, die an den Wandungen haften.
8. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass in Teile der Mikrokanäle bzw. Mikrokavitäten (101 bis 131) ein¬ gebrachten Substanzen bzw. Gemische mit dünnen Paraffin¬ schichten wasserdicht abgedeckt sind.
9. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Teile der Mikrokanäle bzw. Mikro¬ kavitäten (101 bis 131) eingebrachten Substanzen DNA- oder Protein-bindende Eigenschaften aufweisen.
10. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass die in Teile der Mikrokanäle bzw. Mikrokavitäten (101 bis 131) eingebrachten Substanzen Magnet- Beads mit spezifischen Bindungseigenschaften sind.
11. Anordnung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnet-Beads mit Antikörpern beschichtet sind.
12. Anordnung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnet-Beads mit DNA-bindende Substanzen beschichtet sind.
13. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei gleichermaßen Lyse-Reagenzien und Magnet-Beads vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse-Reagenzien und die Magnet-Beads in einer einzigen Trockenmatrix enthalten sind.
14. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass ein so genannter DNA-ELISA-Assay oder Protein-ELISA-Assay (130, 131) durchführbar ist, wobei als Reagenzien für das ELISA-Assay (130, 131) ein Label-Enzym (Reagenz 1) und ein Enzymsubstrat (Reagenz 2) vorhanden sind.
15. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass ein Detektionsmodul (130) zur elektrischen Detektion der Hybridisierungsvorgänge vorhanden ist.
16. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsmodul (130) aus einem Edelmetall/Plastik- Verbund besteht.
17. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsmodul aus einem halbleiterprozessierten Silizi¬ umchip mit Edelmetallelektroden besteht.
18. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel für die elektrische Detektion elektrochemische, magnetische und/oder piezoelektrische Messmethoden eingesetzt werden.
19. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass die Cartridge (100) einen Eingabe- Port (102) für eine Vollblutprobe hat.
20. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da- durch gekennzeichnet, dass Mittel (103 bis 103' ' ' ) zur Zu fuhr von Wasser, insbes. ein Zuflussport, vorhanden ist.
21. Anordnung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zuflussport zum Anschluss an eine externe Wasserzufuhr vorhanden ist.
22. Anordnung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Zuflussport an ein integriertes Wasser-Reservoir ange¬ schlossen ist.
23. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass die Mikrokanäle bzw. Mikrokavitä- ten (101 bis 131) mit trockenen Puffersubstanzen definierter Ionenstärke nach Wasserzufuhr gefüllt sind.
24. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass Mittel zum Mischen von Vollblut¬ proben und Wasser bzw. der Pufferlösung vorhanden sind.
25. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass Mittel zum Durchströmen des mit Lyse-Bead-Reagenz beschichteten Mikrokanals bzw. der Mikroka- vität mit Blut oder mit Blut-Wasser- bzw. Blut-Puffer-Gemisch vorhanden sind.
26. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass Mittel zum Generieren eines Mag¬ netfeldes zwecks Fixierung des DNA-/Magnet-Bead- oder Prote- in-Magnet-Bead Komplexes vorhanden sind.
27. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass Mittel zum Generieren eines Mag¬ netfeldes zwecks Fixierung des DNA/Magnet-Bead-Komplexes in einer PCR-Kavität vorhanden sind.
28. Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Verschließen der PCR-Kavität vorhanden sind .
29. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass Mittel zur Thermozyklisierung der Probe vorhanden sind.
30. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass in der Cartridge (Karte) Mittel zum Lagern von verbrauchtem Probenmaterial und/oder ver- brauchten Reagenzien vorhanden sind.
31. Anordnung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Lagern von verbrauchtem Probenmaterial und/ oder verbrauchten Reagenzien Abfallreservoirs bilden.
32. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass Mittel zum keimdichten, partikel- bzw. zellfreien Entlüften der Abfall-Reservoirs vorhanden sind.
33. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass Mittel zur Fixierung der Cartridge in einem Auslesegerät vorhanden sind.
34. Verfahren zur Herstellung einer bei der Anordnung gemäß Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 33 verwendeten Cartridge, mit folgenden Verfahrensschritten:
- Ein Cartridge-Grundkörper mit Kanälen und/oder Kavitäten wird aus Polymer gefertigt, - in die offenen Kanäle werden Reagenzien gespottet und dort getrocknet,
- die Kanäle und/oder Kavitäten werden durch eine Folie ver¬ schlossen.
35. Herstellungsverfahren nach Anspruch 34, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass der Karten-Grundkörper durch Spritzgusstech- nik hergestellt wird.
36. Herstellungsverfahren nach Anspruch 34, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass Sondermaterialien, wie beispielsweise Dich- tungsmembranen, Entlüftungsmembranen od. dgl. , auf den Kar¬ tenkörper aufgebracht werden.
37. Herstellungsverfahren nach Anspruch 34, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass vor dem Abdichten des Kartenkörpers ein Detek- tionsmodul mit Messmitteln eingebracht, insbesondere einge¬ klebt, wird.
38. Betriebsverfahren für eine DNA-Analyse in einer Anordnung gemäß Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 33, mit fol- genden Maßnahmen:
- Aufgeben der Probe in die Cartridge,
- Einschieben der Cartridge in das Auslesegerät,
- Starten des vollautomatischen Assays.
39. Betriebsverfahren nach Anspruch 38, mit folgenden Schrit¬ ten beim Betrieb des vollautomatischen Assays:
- Über eine Dosierstrecke erfolgt eine Probendosierung,
- die Dosierstrecke wird gewaschen,
- die Messprobe wird verdünnt und in den Lysekanal einge- bracht,
- durch Verweilen im Lysekanal erfolgt ein ZellaufSchluss,
- der gebildete DNA-Bead-Komplex wird durch einen Flüssig¬ keitsstrom in die PCR-Kammer gebracht und durch einen Bead- Sammler in die PCR-Kammer gehalten - es erfolgt ein Waschen des DNA-Bead-Komplexes mit Wasser,
- die PCR-Kammer wird verschlossen,
- die PCR wird durchgeführt,
- nach Beendigung der PCR wird das PCR-Produkt in die Detek- tionskammer transportiert - in der Detektionskammer finden Hybridisierungsvorgänge mit spezifischen Fängersonden statt,
- es erfolgt das Durchspülen der Detektionskammer mit Markie¬ rungsenzym - es erfolgt das Durchspülen der Detektionskammer mit Enzym¬ substrat
- es erfolgt die Durchführung der elektrochemischen Messungen
- die elektrochemischen Messungen werden bei verschiedenen Temperaturen und verschiedenen Fließgeschwindigkeiten der
Enzymsubstrat-Lösung durchgeführt .
40. Betriebsverfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeich¬ net, dass während der PCR die ELISA-Reagenzkanäle mit Wasser gefüllt werden.
41. Betriebsverfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeich¬ net, dass nach der Hybridisierung die beiden ELISA-Kanäle entlüftet werden, dass anschließend die Detektionskammer zu- nächst mit dem ersten ELISA-Reagenz gasblasenfrei gespült und anschließend mit dem zweiten ELISA-Reagenz gasblasenfrei ge¬ spült wird, und dass anschließend die elektrochemische Mes¬ sung durchgeführt wird.
42. Betriebsverfahren für eine Protein-Analyse in einer An¬ ordnung gemäß Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 33, mit folgenden Maßnahmen:
- Aufgeben der Probe in die Cartridge,
- Einschieben der Cartridge in das Auslesegerät, - Starten des vollautomatischen Assays.
43. Betriebsverfahren nach Anspruch 42, mit folgenden Schrit¬ ten beim Betrieb des vollautomatischen Assays:
- Über eine Dosierstrecke erfolgt eine Probendosierung, - die Dosierstrecke wird gewaschen,
- die Messprobe wird verdünnt und durch einen Flüssigkeits¬ strom in die Detektionskammer transportiert
- in der Detektionskammer finden Bindungsvorgänge zwischen den Proteinen der Messprobe und spezifischen Fängerantikör- pern bzw. Fängerproteinen statt, es erfolgt das Durchspülen der Detektionskammer mit ei ner ein Enzymlabel tragenden Antikörperlösung (ELISA-Re- agenz 1) ,
- es erfolgt das Durchspülen der Detektionskammer mit En¬ zymsubstrat (ELISA-Reagenz 2) - es erfolgt die Durchführung der elektrochemischen Messun¬ gen.
44. Betriebsverfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeich¬ net, dass nach der Hybridisierung die beiden ELISA-Kanäle entlüftet werden, dass anschließend die Detektionskammer zu¬ nächst mit dem ersten ELISA-Reagenz gasblasenfrei gespült und anschließend mit dem zweiten ELISA-Reagenz gasblasenfrei ge¬ spült wird, und dass anschließend die elektrochemische Mes¬ sung durchgeführt wird.
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