WO2006048465A2 - Animaux modèles comprenant au moins une mutation ou un ki et un ko conditionnel - Google Patents

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    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a combination of DNA sequences for developing model animals comprising on the one hand a modification of its genome to introduce either a new gene to be expressed (KI or Knock In) or a mutation in a gene target and on the other hand a constitutive or conditional KO (Knock Out) in a target gene.
  • a modification of its genome to introduce either a new gene to be expressed (KI or Knock In) or a mutation in a gene target and on the other hand a constitutive or conditional KO (Knock Out) in a target gene.
  • DNA sequences according to the invention makes it possible to carry out on the same animal model several operations that formerly required the development and use of several distinct models. It allows for example, to study with the same model the phenotype obtained by the introduction of a mutation in the endogenous gene sequence or to have a transgenic model for example expressing the human gene in place of the endogenous gene then, after excision of the whole, perform a knockout in the insertion gene, making it possible to study the phenotype for the KO model, this KO possibly being specific or ubiquitous tissue.
  • the combination of DNA sequences according to the invention comprises a first sequence (Sl) and a second sequence (S2) intended to be inserted into the genomic DNA of a eukaryotic cell of a host organism.
  • DNA sequence is meant according to the invention a DNA molecule consisting of a sequence of deoxyribonucleic acids covalently bound.
  • the first and second sequences S1 and S2 are supported either on two vectors, or on the same vector, or again in the genome of at least one eukaryotic cell of a host organism.
  • eukaryotic cell is meant more particularly according to the invention all cells of animal origin, preferably with the exception of humans, in particular mammalian cells, preferably rodent mammals, more preferably rat or mouse.
  • the first and second sequences are integrated into the genomic DNA of a eukaryotic cell within the same target gene, the first sequence Sl being preferentially intended to be integrated downstream of the promoter of the target gene.
  • the second sequence S2 is intended to be integrated downstream of the integration site of the first sequence Sl, preferably downstream of exons important for the function or the functionality of the target gene.
  • the first sequence Sl of the combination according to the invention comprises, in the
  • the second sequence S2 of the combination according to the invention comprises, in the 5'-3 'direction, the following elements:
  • nucleic acid sequence of a gene coding for a functional selection marker in the eukaryotic cell in the genome from which it will be integrated
  • a second SR2 recognition site for the R2 recombinase and, if appropriate, a second SRI recognition site for the R1 recombinase.
  • the heterologous nucleic acid of the first sequence Sl is a nucleic acid coding for an exon of the target gene, comprising at least one mutation.
  • the sequence Sl is advantageously integrated into the genome of the target cell so that the mutated exon of the sequence S1 replaces the non-mutated exon of the target gene.
  • Target genes include genes associated with nuclear receptors, membrane receptors, transcription factors, and the like.
  • the insertion of the combination of sequences in the genome of the host organism can lead, after excision, to a deletion affecting one or more genes, for example when the insertion locus carries several genes or parts of genes, or when a large fragment of genomic DNA is left between the two sequences S1 and S2 according to the invention.
  • the heterologous nucleic acid of the sequence Sl is a nucleic acid comprising in the 5'-3 'direction, the following elements:
  • nucleic acid sequence coding for a sequence of interest
  • the SRI site located 3 'of the sequence S2 is not present.
  • the nucleic acid sequence coding for a sequence of interest in the sequence S1 comprises, functionally linked, functional elements necessary for stopping the transcription and preferably of the functional elements necessary for the transcription.
  • initiation of transcription Among the elements necessary for the initiation of transcription are those described in particular in Baker et al ((1972) J Mol Biol, 69: 89-102.) And in Georgiev GP ((1972) Curr Top Dev Biol., 7, 1-60).
  • sequence of interest of the sequence Sl according to the invention is preferably chosen from the following sequences:
  • the nucleic acid sequence encoding a polypeptide is a cDNA, more preferably a cDNA encoding a polypeptide of human origin.
  • a cDNA encoding a polypeptide of human origin.
  • the antisense or interfering RNA makes it possible to inhibit the translation of target mRNAs, preferentially chosen from the following genes: GPCR, nuclear receptors, membrane receptors, cytokines, ion channels, etc.
  • the SRI and SR2 recombinase recognition sites are chosen, independently of one another, from the modified Lox P, Lox P and FRT sites. The preferred combinations are shown in the table below.
  • the recombinases R1 or R2 are chosen, independently of one another, from the following recombinases: Cre or FLP.
  • the present invention also relates to a method of transforming eukaryotic cells to integrate into its genome the combination of vectors according to the invention.
  • the methods for integrating sequences into the genome of eukaryotic cells are well known to those skilled in the art, in particular described in Smithies et al. ((1985) Nature 317, 230-4) and Wong et al. ((1986) Somat CeIl Mol Genet 12, 63-72).
  • the cells are animal cells transformed by the methods as described in Vasquez et al ((2001) PNAS 98, 8403-8410) and Yanez et al ((1999), somatic cell and molecular genetics 25, 27- 31).
  • the present invention also relates to the eukaryotic cells in the genome of which is integrated the combination of vectors according to the invention, more preferably the animal cells as defined above, in particular mouse or rat.
  • These cells according to the invention may be cells obtained by integration of the combination of sequences by the method according to the invention. They may also comprise cells obtained by taking from animals obtained from said cells obtained by the process according to the invention.
  • the invention also relates to animal embryos obtained from the cells according to the invention, as well as the animals obtained from these embryos and the offspring of said animals having retained the vector according to the invention.
  • the animals according to the invention are defined above with the exception of humans, preferably mammals, more preferably rodent mammals, even more preferably rats or mice.
  • the model animals thus obtained can be employed as described below.
  • the first application concerns the development of a model carrying a mutation in an exon carrying a functional domain (Sl). This model makes it possible to study the phenotype created by this mutation.
  • a second step it is possible to compare it with the phenotype obtained by a complete inactivation of the gene function (KO) by crossing this animal with an animal expressing a recombinase (Cre or FIp according to the SR sites used) ubiquitously.
  • This phenotype comparison can be further refined by inactivating the gene in a specific tissue manner by using animals expressing the recombinase in a specific tissue or by delivering the recombinase ectopically (virus, ).
  • the second application concerns the development of a model in which the human gene has been substituted for the mouse gene (Sl).
  • This humanized model provides a tool for in vivo study of molecules and drugs that is more relevant than the starting animal. The larger the gap between human protein and mouse protein, the more relevant this model is.
  • a model KO for this human form by crossing this humanized animal with an animal expressing a recombinase (Cre or FIp following SR sites used) ubiquitously.
  • This new model is particularly suitable for studying the toxicity and non-specific effects of the molecules tested.
  • This study can be further refined by inactivating the gene in a specific tissue manner using animals expressing the recombinase specifically tissue or delivering the recombinase ectopically (virus, ).
  • the strategy employed makes it possible to generate a KO mouse model free from Prp ⁇ 1 gene expression by generating a model that has both a Kin mutation point that mimics the A216P mutation in humans and a conditional deletion of the domain. NOP.
  • the injection of the ES 2 target cells into the blastocysts will make it possible to generate the Kin mutation point of the model.
  • Mating of the Kin cell line with a Cre-expressing mouse in a tissue-specific manner will allow the generation of KO model mice of the NOP specific tissue domain.
  • the chosen strategy includes the following steps:
  • EXAMPLE 2 Mouse KO Free of Expression of the C3Ra Gene
  • the strategy employed makes it possible to generate a KO mouse model that is free from expression of the C3R ⁇ murine gene by generating a model that has both a Kin of the human form and a conditional deletion of the human gene.
  • the mofel development strategy is shown in Figure 1.
  • the blue triangles represent the LoxP sites
  • the red double triangles represent the FRT sites
  • the white box represents the Neo resistance cassette.
  • the action of the FHp recombinase makes it possible to obtain a clean humanized model.

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Abstract

La présente invention concerne une combinaison de séquences d'ADN permettant de développer des animaux modèles comprenant d'une part une modification de son génome afin d'introduire soit un nouveau gène pour être exprimé (KI ou Knock In) soit une mutation dans un gène cible et d'autre part un KO (Knock Out), constitutif ou conditionnel, dans un gène cible.

Description

Animaux modèles comprenant au moins une mutation ou un KI et un KO conditionnel
La présente invention concerne une combinaison de séquences d'ADN permettant de développer des animaux modèles comprenant d'une part une modification de son génome afin d'introduire soit un nouveau gène pour être exprimé (KI ou Knock In) soit une mutation dans un gène cible et d'autre part un KO (Knock Out), constitutif ou conditionnel, dans un gène cible.
La combinaison de séquences ADN selon l'invention permet de réaliser sur le même modèle animal plusieurs opérations nécessitant autrefois le développement et l'usage de plusieurs modèles distincts. Il permet par exemple, d'étudier avec le même modèle le phénotype obtenu par l'introduction d'une mutation dans la séquence du gène endogène ou de disposer d'un modèle transgénique par exemple exprimant le gène humain en lieu et place du gène endogène, puis après excision de l'ensemble effectuer un KO dans le gène d'insertion, permettant d'étudier le phénotype pour le modèle KO, ce KO pouvant être tissu spécifique ou ubiquitaire.
Différentes stratégies à base de recombinases et de vecteurs permettant d'insérer puis de supprimer des éléments de gènes dans les génomes de différents organismes sont décrits dans l'état de la technique, notamment dans EP 1 462 525, US 2003/165497, US 2004/241851, WO 02/40685, WO 2004/056964, WO 2004/044151, WO 2005/007877, Kasin & al (Nucleic Acid Research. 2004, vol 32, n° 7, pp E66.1-E66.8), Coumoul & al (Nucleic Acid Research 2004, vol 32, n° 10, pp E85.1-E85.7), Conrad & al. (Biotechnologies, vol 34, n° 6, juin 2003, 1136-1140), Kϋhn & al. (Methods in Molecular Biology 2003, vol 209, 159- 185), Soukharev & al. (Nucleic Acid Research 1999, vol 27, n° 18, ppE21.1-E21.8), McMinn & al. (Mammalian Génome 2004, vol 15, n° 9, 677-685), Casanova & al (Genesis 2002, vol 32, n° 2, 15/8-160) et Ren & al (Genesis 2002, vol 32, n° 2, 105-108). Cependant, aucun de ces documents ne vient apporter de solution au problème technique associé à la présente invention, ni décrire la solution de la présente invention.
La combinaison de séquences d'ADN selon l'invention comprend une première séquence (Sl) et une deuxième séquence (S2) destinées à être insérés dans l'ADN génomique d'une cellule eucaryote d'un organisme hôte.
Par séquence d'ADN on entend selon l'invention une molécule d'ADN constituée par une séquence d'acides désoxyribonucléiques liés de manière covalente. Pour la combinaison selon l'invention, les première et deuxième séquences Sl et S2 sont supportées soit sur deux vecteurs, soit sur un même vecteur, soit encore dans le génome d'au moins une cellule eucaryote d'un organisme hôte.
Par cellule eucaryote, on entend plus particulièrement selon l'invention toutes cellules d'origine animale, préférentiellement à l'exception de l'homme, en particulier les cellules de mammifères, préférentiellement de mammifères rongeurs, plus préférentiellement de rat ou de souris.
De manière préférentielle, la première et deuxième séquences sont intégrées dans l'ADN génomique d'une cellule eucaryote au sein d'un même gène cible, la première séquence Sl étant préférentiellement destinée à être intégré en aval du promoteur du gène cible.
De manière préférentielle la deuxième séquence S2 est destinée à être intégrée en aval du site d'intégration de la première séquence Sl de préférence en aval d'exons important pour la fonction ou la fonctionnalité du gène cible. La première séquence Sl de la combinaison selon l'invention comprend, dans le sens
5 '-3', les éléments suivants :
- un premier site SRI de reconnaissance d'une première recombinase Rl, et
- un acide nucléique hétérologue.
La deuxième séquence S2 de la combinaison selon l'invention comprend, dans le sens 5 '-3', les éléments suivants :
- un premier site SR2 de reconnaissance d'une recombinase R2,
- une séquence d'acide nucléique d'un gène codant pour un marqueur de sélection fonctionnel dans la cellule eucaryote dans le génome de laquelle il sera intégré,
- un second site SR2 de reconnaissance de la recombinase R2, et - le cas échéant, un second site SRI de reconnaissance de la recombinase Rl .
Selon un premier mode particulier de réalisation de l'invention, l'acide nucléique hétérologue de la première séquence Sl est un acide nucléique codant pour un exon du gène cible, comprenant au moins une mutation. La séquence Sl est avantageusement intégrée dans le génome de la cellule cible de manière que l'exon muté de la séquence Sl vienne remplacer l'exon non muté du gène cible.
Parmi les gènes cibles, on peut citer les gènes associés aux récepteurs nucléaires, aux récepteurs membranaires, aux facteurs de transcription, etc. L'insertion de la combinaison de séquences dans le génome de l'organisme hôte peut conduire, après excision, à une délétion affectant un ou plusieurs gènes, par exemple lorsque le locus d'insertion porte plusieurs gènes ou parties de gènes, ou encore lorsque l'on laisse un grand fragment d'ADN génomique entre les deux séquences Sl et S2 selon l'invention. Selon un deuxième mode particulier de réalisation de l'invention, l'acide nucléique hétérologue de la séquence Sl est un acide nucléique comprenant dans le sens 5'-3', les éléments suivants :
- une séquence d'acide nucléique codant pour une séquence d'intérêt, et
- un deuxième site SRI de reconnaissance de la troisième recombinase Rl, le site SRI localisé en 3' de la séquence S2 n'est pas présent..
De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique codant pour une séquence d'intérêt dans la séquence Sl comprend, liés de manière fonctionnelle, des éléments fonctionnels nécessaires à l'arrêt de la transcription et de manière préférentielle des éléments fonctionnels nécessaires à l'initiation de la transcription. Parmi les éléments nécessaires à l'initiation de la transcription, on peut citer ceux décrits notamment dans Baker et al ((1972) J Mol Biol.; 69:89-102.) et dans Georgiev GP.((1972) Curr Top Dev Biol. 7, 1-60).
Parmi les éléments nécessaires à l'arrêt de la transcription, on peut citer ceux décrits notamment dans Proudfoot et al (CeIl. (1991) 64,:671-4) et dans Beaudoing et al. (Génome Res. (2001) 11, 520-526).
La séquence d'intérêt de la séquence Sl selon l'invention est de préférence choisie parmi les séquences suivantes :
- une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide, en particulier une protéine d'intérêt, ou - une séquence d'acide nucléique codant pour un RNA, en particulier un RNA antisens ou un RNAi, miRNA, shRNA ou siRNA.
De manière avantageuse, la séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide est un ADNc, plus préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine. On citera notamment ceux décrits dans Li, et al. ((1997). J CeIl Biol 139, 129-44), Schneider- Maunoury et al. ((1993). CeIl 75, 1199-214) et Tajbakhsh et al. ((1996) Nature 384, 266-70).
De manière avantageuse, le RNA antisens ou interfèrent permet d'inhiber la traduction d'ARNm cibles, préférentiellement choisis parmi les gènes suivants : GPCR, récepteurs nucléaires, récepteurs membranaires, cytokines, canaux ionique, etc. De manière avantageuse, les sites de reconnaissance de recombinases SRI et SR2 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les sites Lox P, Lox P modifiés et FRT. Les combinaisons préférées sont représentées sur le tableau ci-dessous.
Figure imgf000005_0001
En fonction des sites de reconnaissance choisis, les recombinases Rl ou R2 sont choisies, indépendamment l'une de l'autre, parmi les recombinases suivantes : Cre ou FLP.
Les sites de reconnaissance Lox P, Lox P modifié, FRT et les recombinases Cre et FLP correspondantes sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrits dans Kilby, et al. ((1993). Trends Genêt 9, 413-21), Sauer, et Henderson ((1988). Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5166-70), Gu et al. ((1994). Science 265, 103-6), Cohen-Tannoudjiet Babinet ((1998). Mol Hum Reprod 4, 929-38), Shibata, et al. ((1997). Science 278, 120-3), Schlake et Bode ((1994). Biochemistry 33, 12746-51).
La présente invention concerne également un procédé de transformation de cellules eucaryotes pour intégrer dans son génome la combinaison de vecteurs selon l'invention. Les méthodes d'intégration de séquences dans le génome de cellules eucaryotes sont bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans Smithies et al. ((1985). Nature 317, 230-4) et Wong et al. ((1986). Somat CeIl Mol Genêt 12, 63-72).
De manière préférentielle, les cellules sont des cellules animales transformées par les méthodes telles que décrites dans Vasquez et al ((2001) PNAS 98, 8403-8410) et Yanez et al ((1999), somatic cell and molecular genetics 25, 27-31 ).
La présente invention concerne aussi les cellules eucaryotes dans le génome desquelles est intégré la combinaison de vecteurs selon l'invention, plus préférentiellement les cellules animales telles que définies précédemment, en particulier souris ou rat.
Ces cellules selon l'invention peuvent être des cellules obtenues par intégration de la combinaison de séquences par le procédé selon l'invention. Elles peuvent également comprendre des cellules obtenues par prélèvement sur des animaux obtenus à partir desdites cellules obtenues par le procédé selon l'invention. L'invention concerne également des embryons d'animaux obtenus à partir des cellules selon l'invention, ainsi que les animaux obtenus à partir de ces embryons et la descendance desdits animaux ayant conservé le vecteur selon l'invention. Les animaux selon l'invention sont définis précédemment à l'exception de l'homme, préférentiellement des mammifères, plus préférentiellement des mammifères rongeurs, encore plus préférentiellement des rats ou des souris.
Les animaux modèles ainsi obtenus peuvent être employés de la manière décrite ci- dessous.
Les méthodes de préparation d'animaux modèles sont bien connues de l'homme du métier, et notamment décrites pour le mouton (Wilmut et al. Nature 385, 810-813, 1997 ; WO
97 07669), la souris (Wakayama et al. Nature 394, 3,69-3,1 A, 1998 ; WO 99 37143), les bovins
(Wells et al. Biol. Reprod. 60, 996-1005, 1999), la chèvre (Baguisi et al. Nature Biotechnol.
17, 456-461, 1999 ; WO 00 25578), le porc (Polejaeva et al. Nature 407, 86-90, 2000), le lapin (Chesne et al. Nature Biotechnol. 20, 366-369, 2002) et le rat (Zhou & al., Science, 25 septembre 2003 ; PCT/FR04/001275). Les méthodes de transfert nucléaire sont notamment décrites par Campbell & al. (Nuclear transfer in practice, School of Biosciences, University ofNottingham, Leicestershire, United Kingdom).
La première application concerne le développement d'un modèle porteur d'une mutation dans un exon porteur d'un domaine fonctionnel (Sl). Ce modèle permet d'étudier le phénotype créé par cette mutation.
Dans un second temps, il est possible de le comparer au phénotype obtenu par une inactivation complète de la fonction du gène (KO) en croisant cet animal avec un animal exprimant une recombinase (Cre ou FIp selon les sites SR utilisés) de façon ubiquitaire. Cette comparaison de phénotype peut être par la suite raffinée en inactivant le gène de façon tissue spécifique en utilisant des animaux exprimant la recombinase de façon tissue spécifique ou en délivrant la recombinase de façon ectopique (virus, ...).
La seconde application concerne le développement d'un modèle dans lequel a été substitué le gène humain au gène de souris (Sl). Ce modèle humanisé fournit un outil d'étude in vivo de molécules et de drogues qui est plus relevant que l'animal de départ. Plus l'écart entre la protéine Humaine et la protéine de souris est importante et plus ce modèle est pertinent.
Dans un second temps, il est possible de disposer d'un modèle KO pour cette forme humaine en croisant cet animal humanisé avec un animal exprimant une recombinase (Cre ou FIp suivant les sites SR utilisés) de façon ubiquitaire. Ce nouveau modèle est particulièrement adapté pour étudier la toxicité et les effets non spécifiques des molécules testées. Cette étude peut être par la suite raffinée en inactivant le gène de façon tissue spécifique en utilisant des animaux exprimant la recombinase de façon tissue spécifique ou en délivrant la recombinase de façon ectopique (virus, ...).
Exemple 1 : Souris KO exempte d'expression du gène Prpβl
La stratégie employée permet de générer un modèle de souris KO exempt d'expression du gène Prpβl par la génération d'un modèle qui a à la fois un point de mutation Kin qui mime la mutation A216P chez l'homme et une délétion conditionnelle du domaine NOP.
Ce modèle sera obtenu en introduisant un point de mutation dans l'exon 7 en introduisant deux sites LoxP aux deux extrémités de l'exon 7. La stratégie de développement du modèle est exposée sur la figure 2. Sur cette figure, les triangles rouges représentent les sites LoxP, les doubles triangles jaunes représentent les sites FRT, la boîte pourpre représente la cassette de résistance Neo, la boîte orange représente la cassette de sélection négative DTA, les boîtes noires représentent les exons et l'astérisque au dessus de l'exon 7 schématise la mutation qui y est introduit.
L'injection des cellules cibles ES 2 dans les blastocystes va permettre de générer le point de mutation Kin du modèle. L'accouplement de la lignée cellulaire Kin avec une souris exprimant Cre de manière tissus-spécifique va permettre la génération de souris modèles KO du domaine NOP tissus spécifique.
La stratégie choisie comprend les étapes suivantes :
- Clonage et séquençage de la région ciblée du gène murin 129Sv Prpβl
- Construction d'un vecteur de ciblage permettant à la fois de générer un point de mutation et un KO conditionnel du domaine NOP
- Electroporation du vecteur de ciblage dans les cellules ES et sélection des événements de recombinaison homologue
- Excision in vitro via FHp de la cassette de sélection
- Injection des cellules ES dans les blastocystes - Génération de souris chimères et génotypage pour la caractérisation des mutants hétérozygotes.
Exemple 2 : Souris KO exempte d'expression du gène C3Ra La stratégie employée permet de générer un modèle de souris KO exempt d'expression du gène murin C3Ra par la génération d'un modèle qui a à la fois un Kin de la forme Humaine et une délétion conditionnelle du gène humain.
La stratégie de développement du mofèle est exposée sur la figure 1. Sur cette figure, les triangles bleus représentent les sites LoxP, les doubles triangles rouges représentent les sites FRT, la boîte blanche représente la cassette de résistance Neo.
L'action de la recombinase FHp permet d'obtenir un modèle humanisé propre.
L'action de la recombinase Cre tissue spécifique ou ubiquitaire permet d'obtenir un KO tissue spécifique ou ubiquitaire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Combinaison de séquences d'ADN comprenant une première séquence Sl et une deuxième séquence S2 destinées à être insérés dans un gène cible d'une cellule eucaryote, caractérisée en ce que : la première séquence Sl comprend, dans le sens 5'-3', les éléments suivants :
- un premier site SRI de reconnaissance d'une première recombinase Rl, et
- un acide nucléique hétérologue, et la deuxième séquence S2 comprend, dans le sens 5'-3', les éléments suivants :
- un premier site SR2 de reconnaissance d'une recombinase R2,
- une séquence d'acide nucléique d'un gène codant pour un marqueur de sélection fonctionnel dans la cellule eucaryote dans le génome de laquelle il sera intégré
- un second site SR2 de reconnaissance de la recombinase R2, et - le cas échéant, un second site SRI de reconnaissance de la recombinase Rl.
2. Combinaison selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'acide nucléique hétérologue de la séquence Sl est un acide nucléique codant pour un exon du gène cible, comprenant au moins une mutation, destiné à être dans le génome de la cellule cible de manière que l'exon muté de la séquence Sl vienne remplacer l'exon non muté du gène cible.
3. Combinaison selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dans la séquence Sl est une séquence d'acide nucléique comprenant, liés de manière fonctionnelle, des éléments fonctionnels nécessaires à l'initiation de la transcription et/ou des éléments fonctionnels nécessaires à l'arrêt de la transcription.
4. Combinaison selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique hétérologue de la séquence Sl comprend une séquence d'intérêt choisie parmi les séquences suivantes : - une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide, en particulier une protéine d'intérêt, ou
- une séquence d'acide nucléique codant pour un RNA, en particulier un RNA antisens ou un RNAi, miRNA, shRNA ou siRNA.
5. Combinaison selon la revendication 4, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide est un ADNc, plus préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine.
6. Combinaison selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les sites de reconnaissance de recombinases SRI et SR2 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les sites Lox P, Lox P modifiés et FRT.
7. Cellules eucaryotes dans le génome desquelles est intégré la combinaison de séquences selon l'une des revendications 1 à 6.
8. Cellules selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les cellules de mammifères, à l'exception de l'homme, préférentiellement de mammifères rongeurs, de préférence rat ou souris.
9. Embryons d'animaux, à l'exception de l'homme, obtenus à partir des cellules selon l'une des revendications 7 ou 8.
10. Animaux obtenus à partir des embryons selon la revendication 9, comprenant des cellules selon l'une des revendications 7 ou 8, à l'exception de l'homme.
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