WO2006069413A2 - Verfahren zur isolierung von zellen und viren - Google Patents

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WO2006069413A2
WO2006069413A2 PCT/AT2005/000525 AT2005000525W WO2006069413A2 WO 2006069413 A2 WO2006069413 A2 WO 2006069413A2 AT 2005000525 W AT2005000525 W AT 2005000525W WO 2006069413 A2 WO2006069413 A2 WO 2006069413A2
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating cells and viruses.
  • the isolation of cells and viruses of various kinds is carried out in practice in a variety of different methods, the majority of these methods to a separation due to the physical or biological properties of the cells to be isolated, cell fragments (eg microorganisms, microorganism fragments ) or viruses (eg centrifugation, accumulation of microorganisms and viruses in enrichment media or cell cultures).
  • cell fragments eg microorganisms, microorganism fragments
  • viruses eg centrifugation, accumulation of microorganisms and viruses in enrichment media or cell cultures.
  • magnetic, especially superparamagnetic, particles which can be used to isolate cells and viruses of any kind from biological samples has led to a simplification of the isolation methods, since the magnetic properties can be used for cells bound to these particles to isolate a liquid or suspension.
  • the particles used in this case are functionalized with specific binding partners which are able to bind structures located on the surface of cells, as a result of which the magnetic particles have a high specificity with respect to the cells to be isolated.
  • binding partners may be, for example, antibodies or lectins capable of binding surface epitopes or carbohydrate structures.
  • US 4,910,148 discloses the use of magnetizable particles to isolate cells from a biological sample.
  • a sample container is brought into contact with a biological fluid with suspended, magnetizable, functionalized particles and incubated for a defined time.
  • a magnetic field is built up on the container by means of a magnetic device and the supernatant of the biological fluid is removed.
  • the magnetizable particles located on the wall of the container can be further processed.
  • the particles disclosed in this patent comprise a magnetizable material and therefore themselves have no magnetic properties.
  • US 6 020 210 describes the isolation of biological cell organelles and other biological materials from a biological sample.
  • a sample containing superparamagnetic particles, on which the material to be isolated is located is passed over a magnetizable columnar matrix on which the superparamagnetic particles are immobilized after the formation of a magnetic field. After removing the remaining sample-bound liquid from the column, the particles can be eluted from the column matrix after removal of the magnetic field.
  • the article by Khare et al. (Clin. Microbiol., 42 (2004): 1075-1081) relates to a method for the rapid and sensitive detection of Mycobacterium paratuberculosis in milk and feces.
  • magnetic particles are added to a sample containing Mycobacterium paratuberculosis, which are due to a corresponding surface functionalization in a position to bind Mycobacterium paratuberculosis. This binding can be accomplished, for example, by the provision of polyclonal anti-Mycobacterium paratuberculosis antibodies.
  • the magnetic particles disclosed are not ferromagnetic but supermagnetic particles, i.
  • the particles used in this document can have magnetic properties only in a magnetic field.
  • the genomic DNA of the adhering to the magnetic particles mycobacteria is isolated. Following this, the genomic DNA is subjected to a PCR to identify the mycobacteria. Whole cells are not obtained according to this document.
  • WO 2004/053154 A1 relates to a method for the amplification of nucleic acids of a target cell or of a virus which have been isolated from a sample with the aid of magnetic microparticles.
  • the use of magnetic, magnetizable, paramagnetic, ferromagnetic, ferrimagnetic, metal oxide, etc. particles is described, without any particular form being emphasized as having particular effectiveness in the method used.
  • no reference is made to the problem of sample consistency with regard to the analysis result.
  • no cells or viruses can be obtained in living or propagatable form, since they are destroyed to recover the DNA.
  • WO 2004/003231 A2 relates to magnetic particles which are capable of binding a substance, these particles consisting of a magnetic and a matrix material and the matrix material having on the surface functional groups which in the liquid phase the Promote disaggregation.
  • the magnetic material may consist of a ferromagnetic or ferromagnetic material.
  • the magnetic particles are used to insulate e.g. DNA or RNA, but also proteins, cells and microorganisms used. The problem of microorganisms present in difficult-to-access sample material is not discussed in this document.
  • US 5,283,079 relates to a process for producing fluorescent magnetic polymer particles which are suitable for binding molecules such as antibodies or nucleic acids. It is mentioned that the metallic oxide used to produce the particles may have inter alia ferromagnetic properties, but in this case the Purification / separation by centrifugation (instead of magnetic separation) as mandatory, which is why the use of superparamagnetic particles is preferred.
  • cells for example eukaryotic cells, such as fungi, in particular yeasts, animal and plant cells, and prokaryotic cells, such as bacteria or other microorganisms, isolated from complex samples and optionally determined or characterized.
  • the present invention relates to a method for isolating at least one cell, in particular a eukaryotic and prokaryotic cell, or a virus from a complex, suspended biological sample comprising the steps:
  • the cell (s) or virus (s) bound to the ferromagnetic particles are (are) permeated
  • cell is understood inter alia microorganisms, eukaryotic and prokaryotic cells, in particular plant and animal cells, bacteria, fungi and the like, whereby cell fragments, such as cell walls, cell wall components (peptidoglycan, S-layers, Lipopolysaccharide, etc.), cell membranes, cell membrane constituents (transmeran protein, etc.) are preferably to be isolated with the method according to the invention are preferably complete (whole, viable and replicable) cells.
  • the method of the invention are preferably pathogenic, especially human and animal pathogenic, Microorganisms, isolated.
  • Viruses include all known viruses for which it is possible to provide binding partners (for example antibodies), the viruses preferably having epitopes or other binding partners accessible on the surface thereof. in particular eukaryotic and prokaryotic cells, the outstanding advantages over the prior art.
  • samples which are present in suspension, according to the invention, those samples are understood from which cells are difficult to separate and isolate.
  • Such samples contain, in addition to the aqueous phase, at least one second phase which may be liquid or solid and which has at least 50% worse rheological properties than human blood (eg flowing in a flow test 50% slower than human blood).
  • ferromagnetic particles have proven to be far superior to the superparamagnetic (and of course paramagnetic or ferrimagnetic) particles, especially when removed from the suspension by magnetic separation.
  • Particularly preferred complex biological suspension samples are foodstuffs (with a non-aqueous suspension content of preferably 5-25%, especially 8-20%, eg milk with -15% (predominantly fat) or food grade).
  • troll samples with about 10% non-aqueous suspension content
  • feces with preferably 2-20%, in particular 5-10%, non-aqueous suspension content
  • water filtrates eg from sewage treatment plants, water supply systems (eg from hospitals) etc.
  • Environmental analysis with a solids content of up to 2.5% (preferably 1-2.5% solids), bottom slurries (preferably 5-20%, especially 8-15% solids), tissue samples (preferably pre-digested samples) with eg 5 -20%, in particular 8-15%, of non-aqueous suspension content and other samples in which the cells to be isolated by paramagnetic particles due to the non-aqueous suspension fraction compared to ferromagnetic particles only to 50%, especially only 30% or even only to 10%, isolate.
  • cells are isolated by the method according to the invention, which occur in complex biological suspensions or tissues.
  • the "ferromagnetic" property of a particle is characterized by the fact that the elementary magnetic moments of the particles have a parallel order. Ferromagnetic order at room temperature show the metals iron, nickel and cobalt and various alloys thereof. It does not matter whether the metals are crystalline or amorphous. The magnetic order is broken at high temperatures, the ferromagnets then become paramagnetic. The temperature at which the ferromagnetic order disappears is referred to as Curie temperature T c . At low temperatures, ferromagnetic ordering is also observed for substances that are paramagnetic or superparamagnetic at room temperature, such as the lanthanides gadolinium and dysprosium.
  • Ferromagnetic properties of a substance or particle which depend on particle size, material and temperature, can be determined, for example, by the inclusion of hysteresis curves (see, for example, abstract book “Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers", May 20-22, 2400 Lyon , France). This makes it possible in the desired temperature range (eg between 4 and 90 0 C) to determine the particle size and the material of the particles to be used in a simple manner, so that they actually have ferromagnetic properties.
  • desired temperature range eg between 4 and 90 0 C
  • the temperature, size of the particles and nature of the particles are always set so that the particles have ferromagnetic properties in the context of bonding to the magnet.
  • This setting is readily apparent to one of ordinary skill in the art based on his or her expertise and disclosure of the individual method approach described herein.
  • the sample provided by the method according to the invention can either be used directly in the method or subjected to a corresponding sample preparation.
  • This sample preparation depends on the sample used. For example, a food sample may first be homogenized or suspended. In any case, it is crucial for the sample preparation that the treatment steps have no influence on the later binding behavior of the material to be isolated with optionally functionalized particles.
  • the ferromagnetic particles are particularly well suited for the isolation of cells or viruses from complex biological suspensions. Ferromagnetic particles themselves act magnetically and thus have a high affinity for other magnetically acting materials. Especially in view of the fact that, for example, in US 6,020,210 it is pointed out that ferromagnetic particles with a permanent magnetization are not suitable for the isolation of cells from biological samples, since suspensions with ferromagnetic particles to aggregation, shows the surprising effect of ferromagnetic particles in cell isolation.
  • the ferromagnetic particles may consist entirely or, in a preferred embodiment, only partially of at least one ferromagnetic material, provided that the ferromagnetic properties of the entire particle are retained.
  • the cell-particle complexes can be isolated with a magnet from suspensions in a very short time, whereas with superparamagnetic particles, isolation takes a long time.
  • cell isolation with superparamagnetic particles can not occur in a short time, with many of these particles sticking to the sample matrix itself.
  • the resulting suspension for at least 1 minute, at least 5 minutes, at least 10 minutes, is incubated while maintaining the suspension, with the preferred incubation temperature a maximum of 80 0 C, preferably a maximum of 6O 0 C, more preferably a maximum of 40 0 C, in particular at most 30 0 C, is.
  • the preferred incubation temperature a maximum of 80 0 C, preferably a maximum of 6O 0 C, more preferably a maximum of 40 0 C, in particular at most 30 0 C, is.
  • Higher incubation temperatures may be used, for example, for samples which are viscous at room temperature (eg cheese samples), but it has to be taken into account that the higher temperature does not adversely affect or even prevent the binding of the cells to the particles. Nevertheless, room temperature (16 ° to 26 ° C) is preferred as the incubation temperature.
  • the incubation time depends above all on the concentration of the cells or viruses to be isolated in the sample and on the bond strength between these and the optionally functionalized particles. Therefore, the incubation time may vary depending on the samples and particle properties.
  • the particles are separated from the sample particle suspension and optionally subjected to further processing.
  • the separation of the particles is preferably carried out due to the magnetic properties of these particles, since conventional methods, such as filtration, decantation or centrifugation, although in principle are suitable for more complex biological suspensions as samples, however, a significantly worse overall performance of the process - magnetic separation - have.
  • the cell / viral particle suspensions can be directly subjected to nucleic acid amplification without the presence of ferromagnetic particles affecting this reaction in any way.
  • the complex biological suspension sample is a food sample, fecal sample, biological source, environmental sample, or industrial intermediate or final product.
  • the method according to the invention is suitable for all types of samples, it shows an unprecedented performance especially in the case of very viscous and inhomogeneous samples.
  • the method of the invention can be used to isolate cells or viruses from faeces samples or from cheese melts or cheese suspensions, milk and the like.
  • Industrial processes such as the production of food, may require regular monitoring of the intermediate and final products for possible contamination.
  • Complex biological suspensions according to the present invention have a non-aqueous suspension content comprising liquid (lipid (fat), multiphase extracts, etc.) and / or solid (biological, organic or inorganic) components.
  • This proportion is usually in the context of the present invention from 1 to 30%, in particular from 3 to 20%, and causes an impairment of the flow or mixing behavior of the suspension, which thus becomes more difficult to analyze than uncomplicated biological suspensions, such as human blood.
  • the inventive method can also be used to isolate cells and viruses from a sample, for example, to reduce the cell count or the virus titer in the sample.
  • "isolating" does not just define an analytical or preparative process step.
  • the particles comprise a ferromagnetic material selected from the group consisting of iron, especially magnetite and maghemite, iron alloys, nickel, nickel alloys, cobalt, cobalt alloys, and combinations thereof.
  • a ferromagnetic material selected from the group consisting of iron, especially magnetite and maghemite, iron alloys, nickel, nickel alloys, cobalt, cobalt alloys, and combinations thereof.
  • the magnetophoretic mobility increases for a given particle diameter.
  • appropriate particle diameters have to be chosen, because even Co- or CoFe nanocrystals have excellent magnetic moments, but are superparamagnetic because of their small size.
  • the ferromagnetic particles are coated with silicon or silicon compounds, gold, glass, polysaccharides, in particular dextran, plastic, proteins, nucleic acids or combinations thereof. Further materials for the coating or coating process can be found in the abstract book “Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers” (May 20-22,2004 Lyon, France).
  • a coating which specifically promotes disaggregation, as in WO 2004/003231 A, is superfluous according to the invention and may be disadvantageous in some embodiments, so that the particles according to the invention preferably have no such properties.
  • Ferromagnetic materials can be directly derivatized or functionalized or preferably provided with a corresponding surface, the for example, silicon or silicon compounds, plastic, gold, glass or polysaccharides, such as dextran.
  • the ferromagnetic material may form the core of the particles or be embedded in a matrix consisting of the above-mentioned coating materials, wherein in such an embodiment, a plurality of ferromagnetic "cores" can be introduced into a particle
  • functional groups on the surface of the ferromagnetic Bonding particles efficiently binds carboxy-, amine-, tosyl-, epoxy-, hydroxy- and hydrazide groups, streptavidin and His-tag, as already done for paramagnetic and supperparamagnetic particles, but such specific functionalizations, especially With specific binding receptors for certain cells, according to the invention often are not necessary, they are preferably not provided according to the invention.
  • the particles have a diameter of 50 nm to 20 .mu.m, preferably from 200 nm to 5 .mu.m, in particular from 400 nm to 2.5 microns.
  • a particle size is chosen which depends on the magnetic material used, so that the magnetophoretic mobility is as high as possible, but the magnetic moment is still small enough, the aggregates formed by moving the suspension, e.g. by pipetting, rotating the Rotamix or in the ultrasonic bath at least partially dissolve.
  • the density of the ferromagnetic particles is preferably not higher than 5 g / cm 3 (eg, 0.5-5 g / cm 3 ).
  • a particularly preferred range of density is from 1.5 to 4 g / cm 3 , in particular from 1.75 to 2.75 g / cm 3 .
  • the ferromagnetic properties are optimally balanced against the greatest possible similarity of the densities of the cells to be isolated.
  • diameter is the greatest distance between the points of intersection of a body with a straight line passing through the body center (body center).
  • the ferromagnetic particles may be functionalized, in particular with at least one cell- or virus-specific binding partner, but this embodiment is just be the Serial testing not preferred.
  • the binding partners provided on the particles have a specificity with respect to the cells or viruses to be isolated. In any case, it must be ensured that the binding partner specifically recognizes those parts that are actually accessible in the sample.
  • ligands or epitopes for example carbohydrate structures, antigens located on the cell surface are suitable for this purpose.
  • the at least one binding partner may be e.g. an antibody or antibody fragment, protein A, protein G, a lectin, a peptide, a nucleic acid or a combination thereof.
  • Such cells include microorganisms such as e.g. Magnetospirillum magneticum or Aquaspirillum magnetotacticum.
  • the separation can be effected by means of a magnetic device.
  • the separation of the particles from the sample-particle suspension can, as mentioned, be achieved by methods such as centrifugation
  • the application of a magnetic field by means of a magnetic device is for the isolation of cells or viruses from complex biological Suspensions clearly preferred.
  • a magnetic field is applied to the container at the desired time, whereby the ferromagnetic particles are immobilized on the wall of the vessel. Subsequently, the supernatant can be easily removed.
  • the magnetic device is designed as a magnet, in particular as an electric or permanent magnet.
  • an electromagnet for separating off the particles has the particular advantage that the strength of the magnetic field can be influenced by the application of a current flow. This makes it possible to attach the electromagnet permanently to a device (eg container, hose) and to control the magnetic field as needed. In contrast, the magnetic field is completely independent of the presence of a current flow, which, however, leads to the variation of the magnetic field. field strength of the magnet itself must be removed.
  • electromagnets for machines with high sample throughput permanent magnets, can be used for individual samples.
  • the method according to the invention can also be used to first isolate cells or viruses from a sample in order subsequently to detect them in a detection step and, if appropriate, to determine their concentration in the sample.
  • the sample is first brought into contact with functionalized ferromagnetic particles. This makes it possible that the thus insulating cells or viruses can be immobilized on these particles.
  • the particles are separated from the sample particle suspension, wherein a separation can be carried out by methods such as centrifugation or filtration or by the application of a magnetic field.
  • the particles on which the cells or viruses or fragments thereof are located are mixed with corresponding specific primers.
  • the presence of cells or viruses in the sample is optionally qualitatively and / or quantitatively determined by the detection of at least one amplification product.
  • One (or more) fragment specific for a cell or virus produced by the nucleic acid amplification technique may be prepared by known methods, such as e.g. Southern blot, gel electrophoresis (with silver or Coomassie staining), photometry.
  • the cell- or virus-specific primers to be used in this method can be derived, for example, from already known nucleic acid data.
  • the cells bound to the particles will be at least partially lysed.
  • the nucleic acids present in these cells are made accessible to the primers.
  • the lysis of the cells is carried out by methods known in the art, in particular by a heat shock (eg 95 0 C) or by chemical or biochemical reagents, such as lysozyme.
  • a heat shock eg 95 0 C
  • chemical or biochemical reagents such as lysozyme.
  • the particles can be treated after separation with appropriate solutions (solutions comprising guanidine thiocyanate, for example).
  • the nucleic acid amplification is a chain reaction technique (PCR technique), which is selected from the group consisting of real-time PCR, in particular, TaqMan PCR (labeled with SYBR Green primer / probes), nested PCR ( "nested PCR ⁇ ), inverse PCR, Multiplex PCR, asymmetric PCR, reverse transcriptase PCR and combinations thereof.
  • PCR technique is selected from the group consisting of real-time PCR, in particular, TaqMan PCR (labeled with SYBR Green primer / probes), nested PCR ( "nested PCR ⁇ ), inverse PCR, Multiplex PCR, asymmetric PCR, reverse transcriptase PCR and combinations thereof.
  • nucleic acid amplification techniques known to the person skilled in the art can be used according to the invention.
  • real-time PCR techniques e.g., TaqMan PCR
  • a statement can already be made in the course of the PCR as to whether and in which concentration a specific fragment which is detected by the attachment of a fluorescent probe is present in the sample.
  • pathogenic cells in particular pathogenic microorganisms, such as e.g. Mycobacteria, and viruses are determined in a sample.
  • the central aspect of the present invention relates to the use of at least partially ferromagnetic particles, which are optionally functionalized, for the isolation of cells or viruses for further cultivation or propagation.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of ferromagnetic particles, optionally functionalized, for the combined isolation and detection of cells or viruses.
  • Another aspect of the present invention relates to a kit for the combined isolation and determination of cells or viruses in a sample comprising
  • a kit according to the invention may comprise both functionalized and functionalizable ferromagnetic particles.
  • the user of this kit can apply any binding partners to the particles.
  • the particles to be functionalized have epoxy groups on the surface which can react directly with amino groups of an antibody so as to bind it to the particle.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for the isolation and detection of Mycobacterium paratuberculosis, in particular from feces samples, by the use of a method according to the present invention.
  • functionalized ferromagnetic particles capable of binding with M. paratuberculosis are brought into contact with a sample and isolated.
  • the isolated cell-particle complex is then spiked with specific primers directly or after lysing the cells on the particles (e.g., P.H. Vary, Journal of Clinical Microbiology (1990) 933-937).
  • primers are used: forward primer: MP139U24 5'-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-3 '; reverse primer: MP221L22 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAAC-3 ', MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-S'; Probe for real-time PCR: MP204L17: 5'-CGTCATTGTCCAGATCA-S ', 5'-TCATTGTCCAGATCA-3'.
  • the mycobacteria e.g., Mycobacterium tuberculosis
  • they may preferably be introduced into the appropriate medium immediately with the particles for cultivation, and preferably cultured with the particles.
  • extremely pure cultures of mycobacteria are provided, which is particularly important in view of the long culturing times of these microorganisms (up to 18 months) and the lack of a selective nutrient medium.
  • FIG. 1 shows an agarose gel on which 10 ⁇ l PCR amplicon of PCRs were reacted with the particles resulting from point 4 (example) (only stored 040813-2, activated 040813-1 and coated 040811-1).
  • Figure 2 shows an agarose gel: lO ⁇ l of the amplicon are on Analyzed gel, with a specific band seen in both approaches: lane 1 is isolation as in point 4, lane 3 as described in point 5; for lane 2 and lane 4, the particles were washed as in items 4 and 5, but the starting milk was diluted 1:10 with cell lysis buffer.
  • FIG. 3 shows an amplification plot of a real-time PCR with SybrGreen (point 11, example).
  • TPBS 8g NaCl (Sigma, # S9625), 1, 15g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O (Merck, # 106580), 0.2g KCl (Merck, # 104936), 0.2g KH 2 PO 4 (Merck, # 104873), 100 ⁇ l Tween20 (Merck, # 822184) were made up to 11 in water.
  • Denaturation buffer 56 mM NaOH in water.
  • Hybridization Buffer O, 1N NaH 2 PO 4 .H 2 O in water.
  • Cell lysis buffer 8g NaCl, 1.15 g Na2HPO4x2H2O, 0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4, lOO ⁇ l Tween20, 0,508g MgCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0,788g TrisHCl, 0,605g Tris base, 5 ml Triton X-IOO, 54 , 75 sucrose are made up to 500 ml with dH 2 O.
  • SIMAG-MP / Carboxyl (Chemicell, Berlin), aqueous dispersion of magnetic silicate, core is magnetite, matrix is non-porous silicate, size l ⁇ m, surface area ⁇ 25m 2 / g, -1.5 x 10 8 particles / g, density ⁇ 2.25 g / cm 3 , magnetization is ferromagnetic, carboxyl is functional group with 12 atoms spacer, degree of carboxylation is 350 ⁇ mol COOH / g, storage buffer is ddH 2 O.
  • ferromagnetic particles (ChemiCell, SIMAG-MP / TCL) suspension are deposited on the magnet (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, # M010104), resuspended in ImI MES, the supernatant removed from the magnet and incubated with 25mg carbodiimide (Sigma, # E7750 ) in 1 ml of MES buffer for 15 minutes on rotamix (RMl at 15 rpm). The particles are washed with 1 ml of MOPS buffer and rotated with 900 ⁇ l of MOPS buffer for 2 hours at RMI.
  • StabilZyme AP Sudmodics, SAOl-100
  • the particles are washed 2x with ImI TPBS and Ix with ImI StabilZyme.
  • the particles are taken up in 20 ml of StabilZyme (final concentration of 10 mg of particles / mL) and stored in the refrigerator.
  • ferromagnetic particles (ChemiCell, SIMAG-MP / TCL) suspension are deposited on the magnet (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, # M010104), resuspended in ImI MES, the supernatant removed from the magnet and incubated with 25mg carbodiimide (Sigma, # E7750 ) in 1 ml of MES buffer for 15 minutes on Rotamix (RMl at 15r ⁇ m) activated. The particles are washed with ImI MOPS buffer and spiked for 2 hours at RMI with 900 ⁇ l of antibody in MOPS buffer (QED Bioscience, 18101-18104).
  • StabilZyme AP Sudmodics, SAOl-100
  • the particles are washed 2x with ImI TPBS and Ix with ImI StabilZyme.
  • the particles are taken up in 20 ml of StabilZyme (final concentration of 10 mg of particles / mL) and stored in the refrigerator.
  • ImI of a suspension of M. paratuberculosis in raw milk is mixed with 10 ⁇ l of a particle suspension and incubated for 30 minutes with occasional shaking. Thereafter, the particles are deposited on the magnet and washed 4 times with CT wash solution by respective deposition on the magnet.
  • the particle-bacteria complex is now available for further analysis.
  • the particles resulting from point 4 (only stored 040813-2, activated 040813-1 and coated 040811-1) are mixed with 50 ⁇ l PCR amplification mix (Andiatec, Stuttgart) and It. Manufacturer's information amplified. 10 ⁇ l of the amplicon is analyzed on the gel showing a specific band in all three batches ( Figure 1).
  • the particles resulting from point 4 or point 5 were mixed with 50 ⁇ l of PCR amplification mix (Andiatec, Stuttgart) and amplified according to the manufacturer's instructions. 10 ⁇ l of the amplicon is analyzed on the gel, with a specific band seen in both batches. Lane 1 is insulation as in point 4, lane 3 as described in point 5. For lane 2 and lane 4, the particles were washed as in items 4 and 5, however, the starting milk was diluted 1:10 with cell lysis buffer ( Figure 2).
  • the forward primer was taken directly from the literature (PH Vary, Journal of Clinical Microbiology (1990) 933-937). This primer is designated MP139U24 (5'-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-3 '). However, because the primer pair described in this document did not have sufficient specificity (due to Clustal X (1.81) Multiple Sequence Alignment analyzes), the reverse primer was placed elsewhere. This has the advantage that the amplification product was very short (104bp), at 95 0 C for a second are denatured and thus had normal as PCR Real-time very quickly and was efficient. In addition, a two-step PCR can be carried out because the primers had a high melting temperature.
  • the sample was designed to exploit the cooperative effect of hybridized DNA if all base pairs match. This accumulation of differences in the sequences of the capture probe plus the sequence-specific primer provides for very good PCR specificity.
  • 5 ⁇ l of the amplicons were incubated either with 10 ⁇ l of denaturation buffer for 10 min and applied to the plate with 95 ⁇ l of hybridization buffer.
  • 5 ⁇ l amplicon with 95 ⁇ l TPBS are applied to the microplate.
  • Incubate with shaking for 15 min at room temperature wash 4x with TPBS, incubate 100 ⁇ l of anti-fluorescein-AP (Roche) 1: 10,000 in StableZyme at room temperature with shaking, wash 4x with TPBS, incubate 100 ⁇ l LumiPhos Plus (Lumigen) for 15 min at room temperature and on the luminometer (Mediators PhL) with 1 sec integration time.
  • Cycle 3 repeats 1 - 25 0 C A ⁇ 10 "9 dilution
  • sperm DNA was added to the sample.
  • the melting curve showed a melting temperature of 79 0 C for the product of the internal control and 86 ° C for the product of M. paratuberculosis PCR.
  • ferromagnetic particles were used for the isolation of cells and, surprisingly, it was found that such particles are very well suited for cell isolation. This is of great importance because only ferromagnetic particles can be deposited in an acceptable time from difficult sample material, such as raw milk, feces or high solids samples, with a magnet from the sample suspension to the vessel wall.
  • ferromagnetic particles which can nonspecifically bind bacteria, as well as ferromagnetic particles, which are functionalized with an antibody. Furthermore, it could be shown that the particle-cell complex can be used directly in the PCR. In order to remove substances which could adversely affect the PCR or distort the results, an inhibitor removal buffer was used and it was shown that in this case the DNA remains bound to the particles and the DNA-particle complex is used in the PCR can be.
  • Real-time PCR is very important for quantification today, and it has been shown that ferromagnetic particles can be used in such applications.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von mindestens einer Zelle, insbesondere von einer eukaryotischen und prokaryotischen Zelle, oder eines Virus aus einer komplexen, in Suspension vorliegenden biologischen Probe umfassend die Schritte: Bereitstellen der Probe, enthaltend die Zelle oder das Virus; Inkontaktbringen der Probe in Suspension mit ferromagnetischen Partikeln, wobei die Zelle oder das Virus an die Partikel gebunden wird; und magnetisches Abtrennen der Partikel aus der Proben-Partikel-Suspension.

Description

Verfahren zur Isolierung von Zellen und Viren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Zellen und Viren.
Die Isolierung von Zellen und Viren unterschiedlichster Art (z.B. Erythrozyten, Mikroorganismen) erfolgt in der Praxis in einer Vielzahl von verschiedenen Methoden, wobei der Großteil dieser Methoden auf eine Trennung aufgrund der physikalischen oder biologischen Eigenschaften der zu isolierenden Zellen, Zellfragmenten (z.B. Mikroorganismen, Mikroorganismenfragmenten) oder Viren abzielt (z.B. Zentrifugation, Anreicherung von Mikroorganismen und Viren in Anreicherungsmedien bzw. Zellkulturen) . Die Entwicklung von magnetischen, insbesondere von superpa- ramagnetischen Partikeln, die zur Isolierung von Zellen und Viren jeglicher Art aus biologischen Proben herangezogen werden können, führte zu einer Vereinfachung der Isolierungsmethoden, da die magnetischen Eigenschaften dazu verwendet werden können, an diesen Partikeln gebundene Zellen aus einer Flüssigkeit bzw. Suspension zu isolieren. Die dabei verwendeten Partikel werden mit spezifischen Bindungspartnern, die an der Oberfläche von Zellen befindliche Strukturen zu binden vermögen, funktio- nalisiert, wodurch die magnetischen Partikel eine hohe Spezifi- zität gegenüber den zu isolierenden Zellen aufweisen. Derartige Bindungspartner können beispielsweise Antikörper oder Lektine sein, die Oberflächenepitope bzw. Kohlenhydratstrukturen binden können. Durch die Entwicklung von superparamagnetischen Partikeln, die eine hohe magnetische Suszeptibilität aufweisen und rasch die magnetischen Eigenschaften verlieren, sobald ein angelegtes Magnetfeld entfernt wird, konnte schließlich der Sprung zur wirtschaftlichen Nutzung derartiger Methoden erfolgen, da derartige Partikel bei Anlegen eines Feldes selbst magnetische Eigenschaften erlangen, wodurch ein stärkere magnetische Wirkung zwischen den einzelnen Partikeln und dem Magneten erfolgen kann.
In der US 4 910 148 wird die Verwendung von magnetisierbaren Partikeln zur Isolierung von Zellen aus einer biologischen Probe offenbart. Dabei wird zunächst ein Probenbehälter mit einer biologischen Flüssigkeit mit suspendierten, magnetisierbaren, funktionalisierten Partikeln in Kontakt gebracht und für eine definierte Zeit inkubiert. Um nach der Inkubation die an den magnetisierbaren Partikeln gebundenen Zellen zu isolieren, wird ein Magnetfeld an den Behälter mittels einer magnetischen Vorrichtung aufgebaut und der Überstand der biologischen Flüssigkeit entfernt. Anschließend können die an der Wand des Behältnisses befindlichen magnetisierbaren Partikel weiterverarbeitet werden. Die in dieser Patentschrift offenbarten Partikel umfassen ein magnetisierbares Material und weisen daher selbst keine magnetischen Eigenschaften auf.
In der US 6 020 210 wird die Isolierung von biologischen Zellorganellen und anderen biologischen Materialien aus einer biologischen Probe beschrieben. Dabei wird eine Probe, enthaltend superparamagnetische Partikel, an denen sich das zu isolierende Material befindet, über eine magnetisierbare Säulenmatrix geführt, an der nach dem Aufbau eines Magnetfeldes die su- perparamagnetischen Partikel immobilisiert werden. Nachdem die restliche nicht an den Partikeln gebundene Probenflüssigkeit aus der Säule entfernt wurde, können die Partikel von der Säulenrαa- trix nach der Entfernung des Magnetfeldes eluiert werden.
Der Artikel von Khare et al. (Clin.Microbiol. , 42 (2004) : 1075-1081) betrifft ein Verfahren zur schnellen und sensitiven Detektion von Mycobacterium paratuberculosis in Milch und Fäces. Dabei werden zu einer Probe enthaltend Mycobacterium paratuberculosis magnetische Partikel hinzugefügt, die aufgrund einer entsprechenden Oberflächenfunktionalisierung in der Lage sind, Mycobacterium paratuberculosis zu binden. Diese Bindung kann beispielsweise durch das Vorsehen von polyklonalen anti-Mycobacterium paratuberculosis Antikörpern erfolgen. Die in Khare et al. geoffenbarten magnetischen Partikel sind allerdings keine ferromagnetischen, sondern supermagnetische Partikel, d.h. dass die in diesem Dokument verwendeten Partikel nur in einem magnetischen Feld selbst magnetische Eigenschaften aufweisen können. Um weitere Untersuchungen durchzuführen, wird die genomische DNA der an den magnetischen Partikeln anhaftenden Mykobakterien isoliert. Im Anschluss daran wird zur Identifizierung der Mykobac- terien die genomische DNA einer PCR ausgesetzt. Ganze Zellen werden gemäß diesem Dokument nicht erhalten.
Im Artikel von Grant et al. (Environ.Microbiol.64 (1998) : 3153-3158) wird ein Verfahren zur Isolierung von Mycobacterium paratuberculosis in Milch mit Hilfe von immunomagnetischen Partikeln geoffenbart. In diesem Dokument werden DNA Partikel, die nicht ferromagnetisch sind (Dynabeads®) , mit Antikörpern, gerichtet gegen Mycobacterium paratuberculosis, funktio- nalisiert, die anschließend zur Bindung von Mykobakterien aus einer Probe an die Partikel verwendet werden können. Auch in der Arbeit von Djonne et al. (Vet.Microbiol.92 (2003) : 135-143) werden bei der Detektion von Mycobacterium paratuberculosis mit Hilfe von immunomagnetischer PCR keine ferromagnetischen Partikel eingesetzt.
Die WO 2004/053154 Al betrifft ein Verfahren zur Amplifi- zierung von Nukleinsäuren einer Zielzelle bzw. eines Virus, welche mit Hilfe von magnetischen Mikropartikeln aus einer Probe isoliert wurden. Dabei wird ganz allgemein die Verwendung von magnetischen, magnetisierbaren, paramagnetischen, ferromagne- tischen, ferrimagnetischen, metalloxidischen, etc. Partikeln beschrieben, ohne dass dabei eine bestimmte Form als von besonderer Wirksamkeit bei der angewendeten Methode hervorgehoben wird. Weiters wird nicht auf die Problematik der Probenkonsistenz im Hinblick auf das Analyseergebnis Bezug genommen. Schließlich können mit dem dort beschriebenen Verfahren auch keine Zellen oder Viren in lebender bzw. propagierbarer Form gewonnen werden, da diese zur Gewinnung der DNA zerstört werden.
Die WO 2004/003231 A2 betrifft magnetische Partikel, welche in der Lage sind, eine Substanz zu binden, wobei diese Partikel aus einem magnetischen und einem Matrix-Material bestehen und das Matrix-Material an der Oberfläche funktionelle Gruppen aufweist, die in flüssiger Phase die Disaggregation fördern. Das magnetische Material kann dabei aus einem ferri- bzw. ferromagnetischen Material bestehen. Auch hier werden die magnetischen Partikel zur Isolierung von z.B. DNA oder RNA, aber auch Proteinen, Zellen und Mikroorganismen verwendet. Auf die Problematik von Mikroorganismen, die in schwierig zugänglichem Probenmaterial vorhanden sind, wird auch in diesem Dokument nicht eingegangen.
Die US 5,283,079 betrifft ein Verfahren zur Herstellung fluoreszierender magnetischer Polymerpartikel, die sich dazu eignen, Moleküle wie z.B. Antikörper oder Nukleinsäuren zu binden. Es wird erwähnt, dass das zur Herstellung der Partikel verwendete metallische Oxid unter anderem ferromagnetische Eigenschaften aufweisen kann, jedoch ist in diesem Fall die Reinigung/Abtrennung mittels Zentrifugation (anstelle von magnetischer Abtrennung) als zwingend dargestellt, weshalb die Verwendung von superparamagnetischen Partikeln bevorzugt wird.
In der US 2004/0023222 Al sind Partikel mit einer signifikant von der Norm abweichenden Teilchendichte (7-9 g/cm3) und -große (0,5-2 μm) zur Selektion bzw. Isolierung von Zellen, wie zum Beispiel Bakterien oder Viren, aber auch von Nukleinsäuren, Proteinen, Hormonen und dergleichen, offenbart. Die dabei verwendeten Partikel können zwar auch ferromagnetisch sein, die Durchmischung/Abtrennung der Teilchen erfolgt jedoch ausschließlich durch Selektion mittels Schwerkraft („gravity selection") , welche eben durch die signifikant erhöhte Dichte der Teilchen gewährleistet werden soll. Auf die Problematik des Isolierens von Zellen aus schwer zugänglichem, komplexem biologischen Probenmaterial wird nicht eingegangen.
Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dessen Hilfe Zellen, beispielsweise eukaryotische Zellen, wie Pilze, insbesondere Hefen, tierische und pflanzliche Zellen, und prokaryotische Zellen, wie Bakterien oder sonstige Mikroorganismen, aus komplexen Proben isoliert und gegebenenfalls bestimmt bzw. charakterisiert werden können.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von mindestens einer Zelle, insbesondere von einer eukaryotischen und prokaryotischen Zelle, oder eines Virus aus einer komplexen, in Suspension vorliegenden biologischen Probe umfassend die Schritte:
- Bereitstellen der Probe, enthaltend die Zelle oder das Virus
- Inkontaktbringen der Probe in Suspension mit ferromagne- tischen Partikeln, wobei die Zelle oder das Virus an die Partikel gebunden wird, und
- magnetisches Abtrennen der Partikel aus der Proben- Partikel-Suspension.
Vorzugsweise wird (werden) die auf den ferromagne- tischen Partikeln gebundene (n) Zelle (n) oder Virus (-en) durch
- Inkontaktbringen der Partikel mit Zell- oder Virus-spezifischen Primern, - Unterwerfen der Partikel einer Nukleinsäureamplifikations- technik und
- qualitativen und/oder quantitativen Detektieren mindestens eines Nukleinsäureamplifikationsprodukts die Anwesenheit von Zellen oder Viren in der Probe bestimmt.
Unter dem Begriff „Zelle" gemäß der vorliegenden Erfindung werden u.a. Mikroorganismen, eukaryotische und prokaryo- tische Zellen, insbesondere pflanzliche und tierische Zellen, Bakterien, Pilze und dergleichen verstanden, wobei auch Zellfragmente, wie beispielsweise Zellwände, Zellwandbestandteile (Peptidoglykan, S-Schichten, Lipopolysaccharid usw.), Zellmembrane, Zellraembranbestandteile (Transmerabranproteine usw.) mit umfasst sein sollen. Vorrangig werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vollständige (ganze, lebens- und vermehrungsfähige) Zellen isoliert. Vorzugsweise werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren pathogene, insbesondere human- und tierpathogene, Mikroorganismen, isoliert.
„Viren" umfassen alle bekannten Viren, für die es möglich ist, Bindungspartner (z.B. Antikörper) zur Verfügung zu stellen, wobei die Viren vorzugsweise an deren Oberfläche zugängliche Epitope oder sonstige Bindungspartner aufweisen. Das erfindungsgemäße Verfahren weist aber vor allem im Hinblick auf Zellen, insbesondere eukaryotische und prokaryotische Zellen, die herausragenden Vorteile gegenüber dem Stand der Technik auf.
Unter komplexen biologischen Proben, die in Suspension vorliegen, werden erfindungsgemäß solche Proben verstanden, aus denen Zellen nur schwer abgetrennt und isoliert werden können. Derartige Proben enthalten neben der wässerigen Phase zumindest eine zweite Phase, die flüssig oder fest sein kann und um zumindest 50% schlechtere rheologische Eigenschaften hat als menschliches Blut (z.B. in einem Fließtest um 50% langsamer fließt als menschliches Blut) . Bei derartigen Proben haben sich ferromagnetische Partikel überraschenderweise den superpa- ramagnetischen (und natürlich auch paramagnetischen oder ferrimagnetischen) Partikeln als weit überlegen erwiesen, besonders bei Entfernung aus der Suspension durch magnetisches Abtrennen. Besonders bevorzugte komplexe biologische Suspensionsproben sind Nahrungsmittel (mit einem nicht-wässerigen Suspensionsanteil von vorzugsweise 5-25%, insbesondere 8- 20%; z.B. Milch mit -15% (vorwiegend Fett) oder Lebensmittelkon- trollproben mit ca. 10% nicht-wässerigem Suspensionsanteil), Fä- ces (mit vorzugsweise 2-20%, insbesondere 5-10%, nicht-wässerigem Suspensionsanteil), Wasserfiltrate (z.B. aus Kläranlagen, Wasserleitungssystemen (z.B. aus Krankenhäusern) etc.), Umweltanalytik) mit einem Feststoffanteil von bis zu 2,5% (bevorzugt 1-2,5% Feststoffe), Bodenaufschlämmungen (mit vorzugsweise 5- 20%, insbesondere 8-15% Feststoffen) , Gewebeproben (vorzugsweise vorverdaute Proben) mit z.B. 5-20%, insbesondere 8-15%, nichtwässerigem Suspensionsanteil und anderen Proben, bei denen sich die zu isolierenden Zellen durch paramagnetische Partikel aufgrund des nicht-wässerigen Suspensionsanteils im Vergleich zu ferromagnetischen Partikeln nur zu 50%, insbesondere nur zu 30% oder gar nur zu 10%, isolieren lassen.
Vorzugsweise werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Zellen isoliert, die in komplexen biologischen Suspensionen bzw. Geweben vorkommen.
Die "ferromagnetische" Eigenschaft eines Partikels ist dadurch charakterisiert, dass die elementaren magnetischen Momente der Partikel eine parallele Ordnung aufweisen. Ferromagnetische Ordnung bei Raumtemperatur zeigen die Metalle Eisen, Nickel und Kobalt sowie diverse Legierungen davon. Hierbei ist es unerheblich, ob die Metalle kristallin oder amorph vorliegen. Die magnetische Ordnung wird bei hohen Temperaturen aufgebrochen, die Ferromagneten werden dann paramagnetisch. Die Temperatur, ab der die ferromagnetische Ordnung verschwindet, wird als Curie- Temperatur Tc bezeichnet. Bei tiefen Temperaturen beobachtet man ferromagnetische Ordnung auch bei Stoffen, die bei Raumtemperatur paramagnetisch oder superparamagnetisch sind, wie z.B. bei den Lanthanoiden Gadolinium und Dysprosium. Ferromagnetische Eigenschaften einer Substanz bzw. eines Partikels, die von Partikelgröße, Material und Temperatur abhängen, können beispielsweise durch die Aufnahme von Hysteresekurven bestimmt werden (siehe beispielsweise Abstract-Book "Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers", May 20-22,2004 Lyon, France) . Dadurch wird es ermöglicht im gewünschten Temperaturbereich (z.B. zwischen 4 und 900C) die Partikelgröße und das Material der zu verwendenden Partikel in einfacher Weise zu bestimmen, so dass diese auch tatsächlich ferromagnetische Eigenschaften aufweisen. Erfindungswesentlich ist dabei immer, dass bei der Durchführung des Verfahrens die Partikel fer- romagnetisch sind, dass also z.B. Temperatur, Größe der Teilchen und Natur der Teilchen (beispielsweise die exakte Zusammensetzung der Partikel) immer so eingestellt werden, dass die Partikel im Rahmen der Bindung an den Magneten ferromagne- tische Eigenschaften aufweisen. Diese Einstellung ist für den Fachmann ohne Weiteres auf Basis seines Fachwissens und der hier beschriebenen Offenbarung für den individuellen Verfahrensansatz möglich.
In Molday RS und MacKenzie D (J Immunol Methods (1982), 52:353-367) wird die Markierung und Isolierung von Zellen mit ferromagnetischen Eisen-Dextran-Partikeln, deren Kern eine Größe von 15 nm aufweist, beschrieben. In Molday RS und Molday LL (FEBS Lett (1984), 170:232-238) werden rote Blutkörperchen mittels Dextran-SPIO ("superparamagnetic iron oxide") -Partikel markiert und durch Anlegen eines Hochgradientenfeldes getrennt. Derartige Dextran-SPIO Partikel wurden nach der Methode von Molday (1982) von Dodd et al. (Biophys J (1999), 76:103-109) gereinigt und als superparamagnetisch beschrieben. Die in Molday (1982) beschriebenen Partikel mit einer Kerngöße von 15 nm können bei einer Temperatur >273 K nicht ferromagnetisch sein.
Die Probe, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt wird, kann entweder direkt im Verfahren eingesetzt werden oder einer entsprechenden Probenvorbereitung unterzogen werden. Diese Probenvorbereitung hängt dabei jeweils von der verwendeten Probe ab. So kann beispielsweise eine Nahrungsmittelprobe zunächst homogenisiert oder suspendiert werden. Entscheidend bei der Probenvorbereitung ist jedenfalls, dass die Aufbereitungsschritte keinen Einfluss auf das spätere Bindungsverhalten des zu isolierenden Materials mit gegebenenfalls funktionalisierten Partikeln haben.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich besonders ferromagnetische Partikel zur Isolierung von Zellen oder Viren aus komplexen biologischen Suspensionen besonders gut eignen. Ferromagnetische Partikel wirken selbst magnetisch und weisen dadurch eine hohe Affinität gegenüber anderen magnetisch wirkenden Materialien auf. Vor allem in Anbetracht der Tatsache, dass beispielsweise in der US 6 020 210 darauf hingewiesen wird, dass sich ferromagnetische Partikel mit einer dauerhaften Magnetisierung nicht zur Isolierung von Zellen aus biologischen Proben eignen, da Suspensionen mit ferromagnetischen Partikeln zur Aggregation tendieren, zeigt die überraschende Wirkung fer- romagnetischer Partikel bei Zellisolierungen auf. Die fer- romagnetischen Partikel können erfindungsgemäß zur Gänze oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, nur teilweise aus mindestens einem ferromagnetischen Material bestehen, vorausgesetzt, dass die ferromagnetischen Eigenschaften des gesamten Partikels erhalten bleiben. Deshalb können die Zeil-Partikel-Komplexe mit einem Magneten aus Suspensionen in kürzester Zeit isoliert werden, wohingegen mit superparamagnetischen Partikeln eine Isolierung sich langwierig gestaltet. Bei viskosen Proben (z.B. Käseschmelzen) beispielsweise kann eine Zeil-Isolierung mit superparamagnetischen Partikeln in kurzer Zeit nicht erfolgen, wobei viele dieser Partikel in der Probenmatrix selbst haften bleiben würden.
Nach dem Inkontaktbringen der Probe mit den ferromagnetischen Partikeln wird die daraus resultierende Suspension für mindestens 1 Minute, mindestens 5 Minuten, mindestens 10 Minuten, unter Beibehaltung der Suspension inkubiert, wobei die bevorzugte Inkubationstemperatur maximal 800C, vorzugsweise maximal 6O0C, noch mehr bevorzugt maximal 400C, insbesondere maximal 300C, beträgt. Höhere Inkubationstemperaturen können beispielsweise für bei Raumtemperatur zähflüssige Proben verwendet werden (z.B. Käseproben), wobei aber berücksichtigt werden muss, dass die höhere Temperatur die Bindung der Zellen an die Partikel nicht negativ beeinflusst oder sogar verhindert. Dennoch wird Raumtemperatur (16° bis 26°C) als Inkubationstemperatur bevorzugt. Die Inkubationszeit hängt vor allem von der Konzentration der zu isolierenden Zellen oder Viren in der Probe und von der Bindungsstärke zwischen diesen und den gegebenenfalls funktionalisierten Partikeln ab. Daher kann die Inkubationszeit je nach Proben und Partikeleigenschaften variieren. Nach Ablauf der Inkubation werden die Partikel aus der Probenpartikelsuspension abgetrennt und gegebenenfalls einer weiteren Bearbeitung unterzogen. Die Abtrennung der Partikel wird dabei vorzugsweise aufgrund der magnetischen Eigenschaften dieser Partikel vollzogen, da herkömmliche Methoden, z.B. Filtration, Dekantation oder Zentrifugation zwar prinzipiell geeignet sind, sich bei komplexeren biologischen Suspensionen als Proben jedoch eine deutlich schlechtere Gesamt-Performance des Verfahrens - im Vergleich zur magnetischen Abtrennung - aufweisen. Dies war auch in Anbetracht der technischen Lehren in WO 2004/053154 A, WO 2004/003231 A, US 5,283,079 A und US 2004/0023222 A überraschend, in welchen allerdings die Problematik des Isolierens von Zellen oder Viren an komplexen biologischen Suspensionen als Proben gar nicht angesprochen worden ist. Insbesondere zeigte sich, dass der Lösungsansatz der US 2004/0023222 A (Partikel höherer Dichte zu verwenden) ungeeignet für derartige komplexe Supsensionen ist, da eine Abtrennung mittels gravity selection sich als nicht effektiv herausgestellt hat.
Nach der Isolierung der Zellen bzw. der Viren können diese direkt am Partikel oder nach der Abtrennung von diesem mittels einer Nukleinsäureamplifikation analysiert werden. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Zell-/Viren-Partikel- Suspensionen direkt einer Nukleinsäureamplifikation unterworfen werden können, ohne dass die Anwesenheit von ferromagnetischen Partikeln diese Reaktion in irgendeiner Weise beeinträchtigt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die komplexe biologische Suspensionsprobe eine Nahrungsmittelprobe, Fä- cesprobe, Probe biologischen Ursprungs, Umweltprobe oder industrielles Zwischen- oder Endprodukt.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren zwar für jegliche Art von Proben eignet, jedoch vor allem bei sehr zähflüssigen und inhomogenen Proben eine bislang unerreichte Performance zeigt. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Isolieren von Zellen oder Viren aus Fäcesproben oder aus Käseschmelzen bzw. Käsesuspensionen, Milch und dergleichen verwendet werden. Industrielle Prozesse, wie z.B. die Produktion von Lebensmitteln, erfordern unter Umständen eine regelmäßige Kontrolle der Zwischen- und Endprodukte auf mögliche Kontaminationen. Komplexe biologische Suspensionen gemäß der vorliegenden Erfindung weisen einen nicht-wässerigen Suspensionsanteil auf, der flüssig (Lipi- de (Fett), mehrphasige Extrakte, etc.) und/oder feste (biol- gische, organische oder anorganische) Bestandteile umfasst. Dieser Anteil beträgt üblicherweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung von 1 bis 30%, insbesondere von 3 bis 20%, und verursacht eine Beeinträchtigung des Fließ- bzw. Mischverhaltens der Suspension, welche damit schwerer analysierbar wird als unkomplizierte biologische Suspensionen, wie z.B. menschliches Blut. Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch dazu verwendet werden, Zellen und Viren aus einer Probe zu isolieren, um beispielsweise die Zellzahl bzw. den Virustiter in der Probe zu reduzieren. Somit wird erfindungsgemäß unter "isolieren" nicht nur ein analytischer bzw. präparativer Verfahrensschritt definiert.
Vorzugsweise umfassen die Partikel ein ferromagnetisches Material, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Eisen, insbesondere Magnetit und Maghemit, Eisenlegierungen, Nickel, Nickellegierungen, Kobalt, Kobaltlegierungen und Kombinationen davon. Je nach Zusammensetzung des Materials (von z.B. Fe75Co2S über Fe, zu Fe3O4 erhöht sich die magnetophoretische Mobilität bei gegebenem Partikeldurchmesser. Um den ferromagnetischen Zustand bei angesprochenen Temperaturen zu erhalten, müssen entsprechende Partikeldurchmesser gewählt werden, weil selbst Co- oder CoFe-Nanokristalle hervorragende magnetische Momente aufweisen, jedoch wegen ihrer Kleinheit superparamagnetisch sind. Eine umfassende Darstellung der Herstellung, Eigenschaften und Anwendungen findet sich im Abstract-Book "Scientific and Clini- cal Applications of Magnetic Carriers" (May 20-22,2004 Lyon, France) , insbesondere die Abhängigkeit der ferromagnetischen Temperatur von der Partikelgröße, die Mobilität, abhängig von Größe und Material, und der hydrodynamische Durchmesser.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die ferromagnetischen Partikel mit Silizium oder Siliziumverbindungen, Gold, Glas, Polysacchariden, insbesondere Dextran, Kunststoff, Proteinen, Nukleinsäuren oder Kombinationen davon beschichtet. Weitere Materialien für die Beschiσhtung bzw. Be- schichtungsverfahren können im Abstract-Book "Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers" (May 20-22,2004 Lyon, France) gefunden werden. Eine Beschichtung, die gezielt die Disaggregation fördert, wie in der WO 2004/003231 A, ist erfindungsgemäß überflüssig und kann in manchen Ausführungsformen nachteilig sein, so dass die erfindungsgemäßen Partikel vorzugsweise keine derartigen Eigenschaften aufweisen.
Eine mögliche Funktionalisierung der ferromagnetischen Partikel setzt voraus, dass die Oberfläche dieser Partikel de- rivatisiert werden kann. Ferromagnetische Materialien können direkt derivatisiert bzw. funktionalisiert werden oder aber vorzugsweise mit einer entsprechenden Oberfläche versehen, die beispielsweise aus Silizium oder Siliziumverbindungen, Kunststoff, Gold, Glas oder Polysacchariden, wie Dextran, besteht. Dabei kann das ferromagnetische Material den Kern der Partikel bilden oder in eine Matrix bestehend aus den oben angeführten Beschichtungsmaterialien eingebettet werden, wobei bei einer derartigen Ausführungsform auch mehrere ferromagnetische „Kerne" in ein Partikel eingebracht werden können. Um schließlich funktionelle Gruppen an die Oberfläche der ferromagnetischen Partikel effizient zu binden, werden daran Carboxy-, Amin-, Tosyl-, Epoxy-, Hydroxy- und Hydrazidgruppen, Streptavidin und His-tag gebunden, wie diese bereits bei paramagnetischen und su- perparamagnetischen Partikeln erfolgt. Da aber derartige spezifische Funktionalisierungen, insbesondere mit spezifischen Bindungsrezeptoren für bestimmte Zellen, erfindungsgemäß oft gar nicht erforderlich sind, werden diese erfindungsgemäß vorzugsweise gar nicht vorgesehen.
Vorzugsweise weisen die Partikel einen Durchmesser von 50 nm bis 20 μm, vorzugsweise von 200 nm bis 5 μm, insbesondere von 400 nm bis 2,5 μm auf. Vorzugsweise wird eine Partikelgröße gewählt, welche vom verwendeten magnetischen Material abhängt, so dass die magnetophoretische Mobilität möglichst hoch ist, aber das magnetische Moment noch klein genug ist, die gebildeten Aggregate durch Bewegen der Suspension, z.B. durch Pipettieren, Drehen am Rotamix oder im Ultraschallbad zumindest teilweise aufzulösen.
Eine wichtige bevorzugte Eigenschaft ist, dass die Dichte der ferromagnetischen Partikel vorzugsweise nicht höher als 5 g/cm3 beträgt (z.B. 0,5-5 g/cm3) . Aus praktischen Gründen liegt dabei ein besonders bevorzugter Bereich der Dichte von 1,5 bis 4 g/cm3, insbesondere bei 1,75 bis 2,75 g/cm3. Dabei sind die ferromagnetischen Eigenschaften optimal gegen die möglichst große Ähnlichkeit der Dichten der zu isolierenden Zellen abgewogen.
In diesem Zusammenhang wird unter „Durchmesser" die größte Entfernung zwischen den Schnittpunkten eines Körpers mit einer Geraden, die durch den Körpermittelpunkt (Körperzentrum) verläuft.
Die ferromagnetischen Partikel können funktionalisiert sein, insbesondere mit mindestens einem Zell- oder Viren-spezifischen Bindungspartner, jedoch ist diese Ausführungsform gerade be der Serientestung nicht bevorzugt.
Die auf den Partikeln vorgesehenen Bindungspartner weisen eine Spezifizität gegenüber den zu isolierenden Zellen bzw. Viren auf. Dabei ist jedenfalls darauf zu achten, dass der Bindungspartner spezifisch jene Teile erkennt, die auch tatsächlich in der Probe zugänglich sind. Hierzu eignen sich beispielsweise an der Zelloberfläche befindliche Liganden bzw. Epi- tope (z.B. Kohlehydratstrukturen, Antigene) .
Dabei kann der mindestens eine Bindungspartner z.B. ein Antikörper oder Antikörperfragment, Protein A, Protein G, ein Lektin, ein Peptid, eine Nukleinsäure oder eine Kombination davon sein.
Dennoch ist es aber durchaus möglich Zellen, die selbst magnetische Eigenschaften aufweisen, aus einer Probe direkt mit ferromagnetischen Beads zu isolieren, ohne dass diese funktio- nalisiert werden müssen. Zu derartigen Zellen zählen Mikroorganismen wie z.B. Magnetospirillum magneticum oder Aquaspiril- lum magnetotacticum.
Gemäß der besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Abtrennung mittels einer magnetischen Vorrichtung erfolgen.
Die Abtrennung der Partikel aus der Proben-Partikel- Suspension kann zwar, wie erwähnt, durch Methoden, wie Zentri- fugation, erreicht werden, das Anbringen eines magnetischen Feldes mit Hilfe einer magnetischen Vorrichtung ist jedoch für die Isolierung von Zellen oder Viren aus komplexen biologischen Suspensionen klar bevorzugt. Dabei wird zu dem gewünschten Zeitpunkt ein Magnetfeld an den Behälter angelegt, wodurch die ferromagnetischen Partikel an der Wand des Gefäßes immobilisiert werden. Anschließend kann der Überstand in einfacher Weise entfernt werden.
Vorzugsweise ist die magnetische Vorrichtung als Magnet, insbesondere als Elektro- oder Permanentmagnet, ausgebildet.
Die Verwendung eines Elektomagneten zur Abtrennung der Partikel weist vor allem den Vorteil auf, dass die Stärke des Magnetfeldes durch das Anlegen eines Stromflusses beeinflusst werden kann. Dadurch wird es ermöglicht, den Elektromagneten dauerhaft an eine Vorrichtung (z.B. Behältnis, Schlauch) anzubringen und das Magnetfeld je nach Bedarf zu steuern. Im Gegensatz dazu ist das Magnetfeld gänzlich unabhängig vom Vorhandensein eines Stromflusses, wodurch aber zur Variation der Magnet- feld-Stärke der Magnet selbst entfernt werden muss. Für Einzelproben können beispielsweise Elektromagneten, für Automaten mit hohem Probendurchsatz Permanentmagneten, Anwendung finden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch dazu verwendet werden, Zellen oder Viren zunächst aus einer Probe zu isolieren, um diese dann anschließend in einem Detektionsschritt zu detek- tieren und gegebenenfalls deren Konzentration in der Probe zu bestimmen. Auch hierbei wird zunächst die Probe mit funktio- nalisierten ferromagnetischen Partikeln in Kontakt gebracht. Dadurch wird es ermöglicht, dass die so isolierenden Zellen oder Viren an diese Partikel immobilisiert werden können. Im An- schluss an diesen Bindungsschritt werden die Partikel aus der Probepartikelsuspension abgetrennt, wobei eine Abtrennung durch Methoden wie Zentrifugation oder Filtration erfolgen kann oder aber durch das Anlegen eines magnetischen Feldes. Um schließlich die vorhandenen Zellen bzw. Viren qualitativ und quantitativ zu bestimmen, werden die Partikel, an denen sich die Zellen oder Viren bzw. Fragmente davon befinden, mit entsprechenden spezifischen Primern versetzt. Nach dem Durchführen einer Nukleinsäu- reamplifikation wird gegebenenfalls qualitativ und/oder quantitativ die Anwesenheit von Zellen oder Viren in der Probe durch die Detektion mindestens eines Amplifikationsprodukts bestimmt. Ein (oder mehrere) durch die Nukleinsäureamplifikationstechnik erzeugtes, für eine Zelle bzw. einen Virus spezifisches, Fragment kann durch bekannte Verfahren, wie z.B. Southern-Blot, Gel- Elektrophorese (mit Silber- oder Coomassie-Färbung) , Photometrie, bestimmt werden.
Die in diesem Verfahren zu verwendenden von Zell- oder Viren-spezifischen Primer können beispielsweise aus bereits bekannten Nukleinsäuredaten abgeleitet werden.
Vorzugsweise werden zwischen der Abtrennung der Partikel und dem Inkontaktbringen der Partikel mit Zell- oder Viren-spezifischen Primern die an den Partikeln gebundenen Zellen zumindest teilweise lysiert werden.
Durch das Lysieren der an den Partikeln gebundenen Zellen wird die in diesen Zellen vorhandene Nukleinsäuren (u.a. DNA, RNA, mRNA) den Primern zugänglich gemacht. Die Lyse der Zellen erfolgt dabei durch im Stand der Technik bekannte Methoden, insbesondere durch einen Hitzeschock (z.B. 950C) oder durch chemische bzw. biochemische Reagenzien, wie z.B. Lysozym. Um mögli- che Inhibitoren oder Enyzme, insbesondere Proteasen und Restriktionsenzyme, die die Nukleinsäureamplifikation stören könnten, zu entfernen, können die Partikel nach deren Abtrennung mit entsprechenden Lösungen (z.B. Guanidinthiocyanat umfassende Lösungen) behandelt werden.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäureamplifikationstechnik eine Kettenreaktionstechnik (PCR-Technik) , wobei diese ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Echtzeit PCR, insbesondere TaqMan PCR (mit Sybr Green markierte Primer/Sonden) , verschachtelte PCR („nested PCRΛΛ) , inverser PCR, Multiplex PCR, asymmetrische PCR, reverse Transkriptase PCR und Kombinationen davon, ist.
Im Prinzip können alle dem Fachmann bekannten Nukleinsäu- reamplifikationstechniken erfindungsgemäß verwendet werden. Sollte jedoch auch eine quantitative Aussage über Zellen bzw. Viren in den Proben getroffen werden, eignen sich besonders gut Echtzeit-PCR-Techniken (z.B. TaqMan-PCR) . Bei derartigen Techniken, kann bereits im Zuge der PCR eine Aussage getroffen werden, ob und in welcher Konzentration ein spezifisches Fragment, welches durch die Anlagerung einer fluoreszierenden Sonde detektiert wird, in der Probe vorhanden ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können vorzugsweise pathogene Zellen, insbesondere pathogene Mikroorganismen, wie z.B. Mykobakterien, und Viren in einer Probe bestimmt werden.
Der zentrale Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft aber die Verwendung von zumindest teilweise ferromagnetischen Partikeln, die gegebenenfalls funktionalisiert sind, zur Isolierung von Zellen oder Viren zur weiteren Kultivierung oder Propagation.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von ferromagnetischen Partikeln, die gegebenenfalls funktionalisiert sind, zur kombinierten Isolierung und Bestimmung von Zellen oder Viren.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur kombinierten Isolierung und Bestimmung von Zellen oder Viren in einer Probe umfassend
- funktionalisierte oder funktionalisierbare ferromagnetische Partikel und
- Zell- oder Viren-spezifische Primer.
Ein erfindungsgemäßer Kit kann sowohl funktionalisierte als auch funktionalisierbare ferromagnetische Partikel umfassen. Durch das Bereitstellen von funktionalisierbaren ferromagne- tischen Partikeln, kann der Benutzer dieses Kits beliebige Bindungspartner auf die Partikel aufbringen. Beispielsweise weisen die zu funktionalisierenden Partikel Epoxy-Gruppen an der Oberfläche auf, die direkt mit Aminogruppen eines Antikörpers reagieren können, um diesen dadurch an den Partikel zu binden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Detektion von Mycobacterium paratu- berculosis, insbesondere aus Fäces-Proben, durch die Verwendung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
Dabei werden zunächst gegebenenfalls funktionalisierte fer- romagnetische Partikel, die mit M. paratuberculosis zu binden vermögen, mit einer Probe in Kontakt gebracht und isoliert. Der isolierte Zell-Partikel-Komplex wird anschließend direkt oder nach dem Lysieren der Zellen an den Partikeln mit spezifischen Primern versetzt (z.B. P.H. Vary, Journal of Clinical Microbio- logy (1990) 933-937) . Vorzugsweise werden dabei folgenden Primer eingesetzt: forward Primer: MP139U24 5'-CCGCTAATTGAGAGATGC- GATTGG-3'; reverse Primer: MP 221L22 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAAC- 3', MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-S'; Sonde für real time PCR: MP204L17: 5'-CGTCATTGTCCAGATCA-S', 5'-TCATTGTCCAGATCA- 3' .
Wenn die Isolierung der Zellen, insbesondere der Mykobakterien (z.B. Mycobacterium tuberculosis) , zur Bereitstellung zur Kultivierung dieser Zellen verwendet wird, können diese vorzugsweise gleich mit den Partikeln zur Kultivierung in ein geeignetes Medium eingebracht werden und vorzugsweise mit den Partikeln kultiviert werden. Dadurch werden äußerst reine Kulturen von My- cobakterien bereitgestellt, was insbesondere in Anbetracht der langen KultivierungsZeiten dieser Mikroorganismen (bis zu 18 Monaten) und dem Fehlen eines selektiven Nährmediums besonders wichtig ist.
Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Figuren und das folgende Beispiel exemplarisch beschrieben, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Figur 1 zeigt ein Agarose-Gel, auf dem lOμl PCR-Amplikon von PCR' s mit den aus Punkt 4 (Beispiel) resultierenden Partikeln (nur gelagert 040813-2, aktiviert 040813-1 und beschichtet 040811-1) durchgeführt wurden.
Figur 2 zeigt ein Agarose-Gel: lOμl des Amplikons werden am Gel analysiert, wobei eine spezifische Bande in beiden Ansätzen zu sehen ist: Spur 1 ist Isolierung wie unter Punkt 4, Spur 3 wie in Punkt 5 beschrieben; für Spur 2 und Spur 4 wurden die Partikel wie in Punkt 4 und 5 gewaschen, allerdings war die Aus- gangsmilch 1:10 mit Cell-Lyse-Puffer verdünnt.
Figur 3 zeigt ein Amplifikations-Plot einer Echtzeit-PCR mit SybrGreen (Punkt 11, Beispiel) .
Beispiel: Isolierung, Nachweis und Quantifizierung von Mycobacterium paratuberculosis
1. Allgemeine Reagenzien
TPBS: 8g NaCl (Sigma, #S9625) , 1, 15g Na2HPO4x2H2O (Merck, #106580), 0,2g KCl (Merck, #104936), 0,2g KH2PO4 (Merck, #104873), lOOμl Tween20 (Merck, #822184) wurden in Wasser auf 11 aufgefüllt.
MES-Puffer: 9,76g MES (Sigma, #M3023) mit ION NaOH auf pH=5,5 stellen und auf 11 auffüllen.
MOPS-Puffer: 5,23g MOPS (Sigma, #M1254) mit ION NaOH auf pH=7,5 stellen und auf 11 auffüllen.
Denaturierungspuffer: 56OmM NaOH in Wasser.
Hybridisierungspuffer: O,1N NaH2PO4 x H2O in Wasser.
CT-Waschpuffer: 20Mm Tris, 15OmM NaCl in Wasser pH=7,4.
Inhibitor-Removal-Puffer: 2,5M Guanidinthiocyanat, 1OmM Tris, ImM EDTA in Wasser, pH=7,0 mit Ethanol auf 70% Ethanol.
Cell-Lysis-Puffer: 8g NaCl , 1,15g Na2HPO4x2H2O , 0,2g KCl , 0,2g KH2PO4 , lOOμl Tween20, 0,508g MgCl2x6H2O, 0,788g TrisHCl, 0,605g TrisBase, 5ml Triton X-IOO, 54,75 Saccharose werden mit dH2O auf 500ml aufgefüllt.
2. Ferromagnetische Partikel
SIMAG-MP/Carboxyl (Chemicell,Berlin) , wässerige Dispersion von magnetischem Silikat, Kern ist Magnetit, Matrix ist nicht poröses Silikat, Größe lμm, Oberfläche ~25m2/g, -1,5 x 108 Partikel/g, Dichte ~2,25g/cm3, Magnetisierung ist ferromagne- tisch, Carboxyl ist funktionelle Gruppe mit 12 Atomen Spacer, Carboxylierungsgrad ist 350μmol COOH/g, Lagerpuffer ist ddH2O.
2.1. Partikel-Lagerung
0,8 ml Ferromagnetische Partikel (ChemiCell, SIMAG-MP/TCL) Suspension werden am Magneten (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, #M010104) abgeschieden, mit 4ml StabilZyme AP (Surmodics, SAOl- 100) gewaschen, in 20 ml StabilZyme aufgenommen (Endkonzentration von 10mg Partikel/mL) und im Kühlschrank gelagert. 2.2. Partikel-Aktivierung
0,8 ml Ferromagnetische Partikel (ChemiCell, SIMAG-MP/TCL) Suspension werden am Magneten (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, #M010104) abgeschieden, in ImI MES resuspendiert, am Magneten der Überstand abgenommen und mit 25mg Carbodiimid (Sigma, #E7750) in 1ml MES-Puffer 15 Minuten am Rotamix (RMl bei 15rpm) aktiviert. Die Partikel werden mit 1ml MOPS-Puffer gewaschen und mit 900μl MOPS-Puffer 2 Stunden am RMl gedreht. Danach werden 4ml StabilZyme AP (Surmodics, SAOl-100) zugesetzt und über Nacht am RMl gedreht. Durch Abscheiden der Partikel am Magneten, Resuspendieren und erneutes Abscheiden werden die Partikel 2x mit ImI TPBS und Ix mit ImI StabilZyme gewaschen. Zuletzt werden die Partikel in 20 ml StabilZyme aufgenommen (Endkonzentration von 10mg Partikel/mL) und im Kühlschrank gelagert.
2.3. Antikörperbeschichtung
0,8 ml Ferromagnetische Partikel (ChemiCell, SIMAG-MP/TCL) Suspension werden am Magneten (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, #M010104) abgeschieden, in ImI MES resuspendiert, am Magneten der Überstand abgenommen und mit 25mg Carbodiimid (Sigma, #E7750) in 1ml MES-Puffer 15 Minuten am Rotamix (RMl bei 15rρm) aktiviert. Die Partikel werden mit ImI MOPS-Puffer gewaschen und mit 900μl Antikörper in MOPS-Puffer (QED Bioscience, 18101- 18104) 2 Stunden am RMl gedreht. Danach werden 4ml StabilZyme AP (Surmodics, SAOl-100) zugesetzt und über Nacht am RMl gedreht. Durch Abscheiden der Partikel am Magneten, Resuspendieren und erneutes Abscheiden werden die Partikel 2x mit ImI TPBS und Ix mit ImI StabilZyme gewaschen. Zuletzt werden die Partikel in 20 ml StabilZyme aufgenommen (Endkonzentration von 10mg Partikel/mL) und im Kühlschrank gelagert.
3. Herstellung der Microplatten für Hybridisierunqsassay Streptavidin von Roche wird in Carbonat-Beschichtungspuffer auf eine Konzentration von 2μg/ml verdünnt und die Näpfchen von Weißen MaxiSorp Microplatten (Nunc, Art-N°437-591) über Nacht bei 40C mit lOOμl beschichtet. Die Microplatten werden 4x mit TPBS gewaschen und lOOμl der Probe Bio-TCATTGTCCAGATCA in TPBS (30pmol/mL) über Nacht bei 40C gebunden. Nach 4x Waschen mit TPBS werden die Platten getrocknet und eingeschweißt.
4. Isolierung von M. paratuberculosis aus Milch
ImI einer Suspension von M. paratuberculosis in Rohmilch (Andiatec, Stuttgart) wird mit lOμl einer Partikel-Suspension versetzt und 30 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Danach werden die Partikel am Magneten abgeschieden und 4 Mal mit CT-Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Partikel-Bakterien-Komplex steht nun für weitere Analysen zur Verfügung.
5. Isolierung von M. paratuberculosis DNA aus Milch mittels Inhibitor-Removal-Puffer
ImI einer Suspension von M. paratuberculosis in Rohmilch (Andiatec, Stuttgart) wird mit lOμl der Partikel-Suspension versetzt und 30 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Danach werden die Partikel am Magneten abgeschieden und 2 Mal mit Inhibitor-Removal-Puffer, 1 Mal mit CT-Waschlösung/70% EtOH und 1 Mal mit CT-Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Partikel-DNA-Komplex steht nun für weitere Analysen zur Verfügung.
6. Herstellung von M. paratuberculosis DNA aus Milch ImI einer Suspension von M. paratuberculosis in Rohmilch
(Andiatec, Stuttgart) wird mit lOμl der Partikel-Suspension versetzt und 30 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Danach werden die Partikel am Magneten abgeschieden und 4 Mal mit CT-Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Partikel-Bakterien-Komplex wird in 50μl dest. Wasser resuspendiert, 10 min. bei 95°C erhitzt, danach die Partikel am Magneten abgeschieden und der der Überstand in ein frisches Röhrchen übertragen.
7. Herstellung von hochreiner M. paratuberculosis DNA ImI einer Suspension von M. paratuberculosis in Rohmilch
(Andiatec, Stuttgart) wird mit lOμl der Partikel-Suspension versetzt und 30 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Danach werden die Partikel am Magneten abgeschieden und 2 Mal mit Inhibitor-Removal-Puffer, 1 Mal mit CT-Waschlösung/70% EtOH und 1 Mal mit CT-Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Partikel-DNA-Komplex wird in 50μl dest. Wasser resuspendiert, 10 min. bei 95°C erhitzt, danach die Partikel am Magneten abgeschieden und der überstand in ein frisches Röhrchen übertragen.
8. PCR mit Partikel
Die aus Punkt 4 resultierenden Partikel (nur gelagert 040813-2, aktiviert 040813-1 und beschichtet 040811-1) werden mit 50μl PCR Amplifizierungsmix (Andiatec, Stuttgart) versetzt und It. Angaben des Herstellers amplifiziert. lOμl des Amplikons werden am Gel analysiert, wobei eine spezifische Bande in allen drei Ansätzen zu sehen war (Figur 1) .
9. PCR mit Bakterien-Partikel-Komplex und Bakterien-DNA-Komplex
Die aus Punkt 4 bzw. Punkt 5 resultierenden Partikel wurden mit 50μl PCR Amplifizierungsmix (Andiatec, Stuttgart) versetzt und It. Angaben des Herstellers amplifiziert. lOμl des Amplikons werden am Gel analysiert, wobei eine spezifische Bande in beiden Ansätzen zu sehen ist. Spur 1 ist Isolierung wie unter Punkt 4, Spur 3 wie in Punkt 5 beschrieben. Für Spur 2 und Spur 4 wurden die Partikel wie in Punkt 4 und 5 gewaschen allerdings war die Ausgangsmilch 1:10 mit Cell-Lyse-Puffer verdünnt (Figur 2).
10. Asymmetrische PCR mit DNA
Der Forward Primer wurde aus der Literatur direkt übernommen (P.H. Vary, Journal of Clinical Microbiology (1990)933-937) . Dieser Primer wird als MP139U24 (5'-CCGCTAATT- GAGAGATGCGATTGG-3' ) bezeichnet. Da jedoch das in diesem Dokument beschriebene Primer-Paar eine nicht ausreichende Spezifität aufwies (aufgrund von Clustal X (1.81) Multiple Sequence Align- ment-Analysen) , wurde der Reverse Primer an eine andere Stelle gesetzt. Dies hat den Vorteil, dass das Amplifizierungsprodukt sehr kurz wurde (104bp) , bei 950C nur eine Sekunde denaturiert werden musste und damit die normale wie Real-time PCR sehr schnell und effizient wurde. Zudem kann eine Zwei- stufen-PCR durchgeführt werden, weil die Primer eine hohe Schmelztemperatur aufwiesen.
Im Anschluss an den Reverse Primer wurde die Probe konzipiert, um den kooperativen Effekt an hybridisierter DNA zu nutzen, falls alle Basenpaare entsprechen. Diese Kumulierung der Unterschiede in den Sequenzen der Capture Probe plus dem sequenzspezifischen Primer sorgt für sehr gute Spezifität der PCR.
Es wurde festgestellt, dass die Reverse Primer MP 221L22 (5I-GTGCCACAACCACCTCCGTAAC-3• ) und MP219L24 (5'-GTGCCACAACCACCT- CCGTAACCG-3 ' ) gemeinsam mit dem oben angeführten Forward Primer und den Sonden MP204L17 (5'-CGTCATTGTCCAGATCA) und 5 ' -TCATTGTC- CAGATCA die besten Ergebnisse zeigten. lμl einer Verdünnungsreihe der aus Punkt 6 isolierten DNA- Lösung wurde mit 4pmol/20μl mit dem Fluorescein gelabeltem Primer MP139U24: 5'-F-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-S' und 2pmol/20μl it dem Primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-S' in Ix SybrGreen Supermix von BioRad am Biometra TGradient Zyklusr in Gesamtvolumen von 20μl asymmetrisch amplifiziert.
PCR-Parameter:
Figure imgf000021_0001
5μl der Amplikons wurden entweder 10 min mit lOμl Denatu- rierungspuffer inkubiert und mit 95μl Hybridisierungspuffer auf die Platte aufgetragen. Alternativ werden 5μl Amplikon mit 95μl TPBS auf die Microplatte aufgetragen. 15min bei Raumtemperatur mit Schütteln inkubieren, 4x mit TPBS waschen, lOOμl anti-Fluo- rescein-AP (Roche) 1:10.000 in StabilZyme bei Raumtemperatur mit Schütteln inkubieren, 4x mit TPBS waschen, lOOμl LumiPhos Plus (Lumigen) 15min bei Raumtemperatur inkubieren und am Luminometer (Mediators PhL) mit 1 sek Integrationszeit messen.
Figure imgf000021_0002
11. Echtzeit-PCR mit SvbrGreen 'und DNA Lösung lμl von Verdünnungen der aus Punkt 6 isolierten DNA-Lösung wurde mit 4pmol/20μl mit dem Primer MP139U24: 5 ' -CCGCTAATT- GAGAGATGCGATTGG-3' und 4pmol/20μl mit dem Primer MP219L24: 5' -GTGCCACAÄCCACCTCCGTAACCG-3 ' in Ix SybrGreen Supermix von BioRad am iZyklusr in 20μl Gesamtvolumen amplifiziert.
PCR-Parameter (Ergebnisse in Figur 3) : Zyklus 1 Wiederholungen 1 3 min 950C A3 Negativ-Kontrolle
Zyklus 2 Wiederholungen 50 1 sek 95 0C A4 Negativ-Kontrolle
30 sek 67 0C A5 10"10 Verdünnung
Zyklus 3 Wiederholungen 1 - 25 0C Aβ 10"9 Verdünnung
12. Echtzeit-PCR mit Svbr Green mit und ohne Partikel lμl der 10~7 Verdünnung aus Punkt 6 isolierten DNA-Lösung wurde mit 4pmol/20μl mit dem Primer MP139U24: 5'-CCGCTAATT- GAGAGATGCGATTGG-3' und 4pmol/20μl mit dem Primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3' in Ix SybrGreen Supermix und lOOμg ferromagnetischen Partikel am iZyklusr mit 20μl Gesamtvolumen amplifiziert. Die Partikel wurden vorher mit Milch inkubiert und wie unter Punkt 4 und 5 angegeben gewaschen.
PCR-Parameter:
Figure imgf000022_0001
Ergebnisse (Schwellenwertzyklus - „threshold cycle")
Ohne Partikel Zusatz Mit Partikel Zusatz
Punkt 4 26,4 26,7
Punkt 5 25,7 26,1
13. Echtzeit-PCR mit SvbrGreen und DNA Lösung lμl eine Verdünnungsreihe der aus Punkt 6 isolierten DNA-Lösung wurde mit 4pmol/20μl MP139U24: δ'-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG- 3' und 4pmol/20μl mit dem Primer MP219L24:
5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-S' in Ix SybrGreen Supermix von Bio- Rad am iZyklusr mit 20μl Gesamtvolumen amplifiziert und real- time analysiert.
Um die Robustheit zu demonstrieren, wurde zudem zur Probe Hering Sperma DNA zugesetzt.
PCR-Parameter:
Figure imgf000023_0001
Ergebnisse (Schwellenwertzyklus threshold cycle") :
Ohne DNA Zusatz Mit 200ng Hering Sperma DNA
lo-io Verdünnung 34,4 40, 8
10-9 Verdünnung 31,9 35, 8
10"8 Verdünnung 28,5 32, 2 io-7 Verdünnung 25,5 29, 2
Die Schmelzkurve ergab eine Schmelztemperatur von 790C für das Produkt der Internen Kontrolle und 86°C für das Produkt der M. paratuberculosis PCR.
14. Vergleich der Geschwindigkeit des Fanqens ferromaqne- tischer Partikel mit superparamagnetischen Partikeln
20μg von Alkalischer Phosphatase beschichteten Partikeln (Streptavidin-Partikel mit Überschuss biotin-AP inkubiert und gewaschen mit TPBS) wurden in 1 ml TPBS in 1,5ml Eppendorf Cups suspendiert und mit 2 Sekunden Inkubationszeit mit dem Aureon Separation Pen (M020101, Aureon, Wien) aus der Suspension gewonnen und danach in ImI TPBS resuspendiert. lOμl der Ausgangssuspension sowie der isolierten Beads wurden in einer weißen Microplatte nach 15 Minuten Inkubationszeit mit lOOμl LumiPhos Plus (Lumigen, USA) am mediators PhL mit 1 Sekunde Integrationszeit gemessen.
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000024_0001
15. Diskussion
Entgegen der Vorbehalte aus der Literatur wurden ferromagne- tische Partikel für die Isolierung von Zellen verwendet und überraschender Weise wurde festgestellt, dass derartige Partikel sehr wohl für die Zellisolierung geeignet sind. Dies ist deshalb von großer Bedeutung, weil nur ferromagnetische Partikel in akzeptabler Zeit aus schwierigem Probenmaterial, wie Rohmilch, Kot oder Proben mit hohem Feststoffanteil, mit einem Magneten aus der Probensuspension an die Gefäßwand abgeschieden werden können.
Im Beispiel wurden ferromagnetische Partikel verwendet, die unspezifisch Bakterien binden können, sowie ferromagnetische Partikel, die mit einem Antikörper funktionalisiert sind. Ferner konnte gezeigt werden, dass der Partikel-Zellkomplex direkt in der PCR verwendet werden kann. Um Substanzen, die die PCR negativ beeinflussen bzw. die Ergebnisse verfälschen könnten, zu entfernen, wurde ein Inhibitor-Entfernungs Puffer verwendet und gezeigt, dass die DNA in diesem Fall an den Partikeln gebunden bleibt und der DNA-Partikel-Komplex in der PCR verwendet werden kann.
Um die Auswertung der PCR zu vereinfachen, wurde gezeigt, dass das Produkt einer asymmetrischen PCR ohne Denaturierung hybridisiert werden kann.
Die Echtzeit-PCR ist heute für Quantifizierungen sehr wichtig, wobei gezeigt werden konnte, dass ferromagnetische Partikel in derartigen Anwendungen eingesetzt werden können.
Ferner konnte somit eine hochsensitive und hochspezifische PCR zum Nachweis von M. paratuberculosis DNA entwickelt und gezeigt werden, dass auch nach 80 Durchläufen keine Primerdimere auftreten. Die Spezifität wurde weiters mit denselben Primern in einer Touch-Down-PCR erhöht.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Isolierung von mindestens einer Zelle, insbesondere von einer eukaryotischen und prokaryotischen Zelle, oder eines Virus aus einer komplexen, in Suspension vorliegenden biologischen Probe umfassend die Schritte:
- Bereitstellen der Probe, enthaltend die Zelle oder das Virus
Inkontaktbringen der Probe in Suspension mit ferromagne- tischen Partikeln, wobei die Zelle oder das Virus an die Partikel gebunden wird, und
- magnetisches Abtrennen der Partikel aus der Proben- Partikel-Suspension.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die auf den ferromagnetischen Partikeln gebundene(n) Zelle(n) oder Virus (-en) durch
Inkontaktbringen der Partikel mit Zell- oder Virus-spezifischen Primern,
- Unterwerfen der Partikel einer Nukleinsäureamplifikations- technik und
- qualitativen und/oder quantitativen Detektieren mindestens eines Nukleinsäureamplifikationsprodukts die Anwesenheit von Zellen oder Viren in der Probe bestimmt wird (werden) .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Nahrungsmittelprobe, Fäcesprobe, Probe biologischen Ursprungs, Umweltprobe oder industrielles Zwischenoder Endprodukt ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel ein ferromagnetisches Material, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Eisen, insbesondere Magnetit und Maghemit, Eisenlegierungen, Nickel, Nickellegierungen, Kobalt, Kobaltlegierungen und Kombinationen davon, umfassen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die ferromagnetische Partikel mit Silizium oder Siliziumverbindungen, Gold, Glas, Polysacchariden, insbesondere Dextran, Kunststoff oder Kombinationen davon beschichtet sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel einen Durchmesser von 50nm bis 20μm, vorzugsweise von 200nm bis 5μm, insbesondere von 400nm bis 2,5μm, aufweisen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die ferromagnetischen Partikel funktionalisiert sind.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die ferromagnetischen Partikel mit mindestens einem Zell- oder Virus-spezifischen Bindungspartner funktionalisiert sind.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindungspartner ein Antikörper oder Antikörperfragment, Protein A, Protein G, ein Lektin, ein Peptid, eine Nukleinsäure oder eine Kombinationen davon ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung mittels einer magnetischen Vorrichtung erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetische Vorrichtung als Magnet, insbesondere als Elektro- oder Permanentmagnet, ausgebildet ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Abtrennung der Partikel und dem In- kontaktbringen der Partikel mit Zell- oder Virus-spezifischen Primern die an den Partikeln gebundenen Zellen oder Viren zumindest teilweise lysiert werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäureamplifikationtechnik eine Polyme- rasekettenreaktionstechnik (PCR-Technik) ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR-Technik) , ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Echtzeit PCR, insbesondere TaqMan PCR, verschachtelte PCR („nested PCR") , inverser PCR, Multiplex PCR, asymmetrische PCR, reverse Transkriptase PCR und Kombinationen davon, ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mykobakterien, Listerien, Salmonellen, Campylobacter, und Kombinationen davon, sind.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Enteroviren, CMV, Hepatitis, HIV und Kombinationen davon, sind.
17. Verwendung von zumindest teilweise ferromagnetischen, gegebenenfalls funktionalisierten, Partikeln zur Isolierung von Zellen oder Viren.
18. Verwendung von zumindest teilweise ferromagnetischen, gegebenenfalls funktionalisierten, Partikeln zur kombinierten Isolierung und Bestimmung von Zellen oder Viren.
19. Kit zur kombinierten Isolierung und Bestimmung von Zellen oder Viren in einer Probe umfassend
- ferromagnetische, gegebenenfalls funktionalisierte oder funktionalisierbare, Partikel und
- Zell- oder Virus-spezifische Primer.
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