WO2006084552A1 - Verfahren zur bestimmung von keimen - Google Patents

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WO2006084552A1
WO2006084552A1 PCT/EP2006/000473 EP2006000473W WO2006084552A1 WO 2006084552 A1 WO2006084552 A1 WO 2006084552A1 EP 2006000473 W EP2006000473 W EP 2006000473W WO 2006084552 A1 WO2006084552 A1 WO 2006084552A1
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germs
sample
fluorescence
fluorescent
detection
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PCT/EP2006/000473
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English (en)
French (fr)
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Michael Frank
Friedhelm Siepmann
Andreas THÜNCHEN
Stefan Stumpe
Helmut Herrmann
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Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
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Priority to EP06704549A priority patent/EP1846569B1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantitative and / or qualitative determination of germs and the application of such a method, in particular 'in the context of production and / or quality control. Furthermore, the present invention relates to a device for the quantitative and / or qualitative determination of germs, in particular for carrying out the aforementioned method, and the use of this device, in particular for the preferably automated production and / or quality control.
  • Germs - these are understood according to the invention as bacteria, yeasts and fungi - in products of any kind on the one hand lead to spoilage, which has a direct influence on the quality, mode of action and performance.
  • infections and / or diseases can be caused if the bacterial load or germs are too high. Therefore, the immediate detection of a germ load is essential, for. B. before a final product enters the market.
  • the control of the hygienic status of consumer goods such as food, cosmetics, adhesives, detergents and cleaners, but also z.
  • coolants which are used in particular in the industrial sector, is regulated by law.
  • different limits for the microbiological load are defined.
  • the detection methods are very diverse and depend in their complexity, the expenditure on equipment and the necessary analysis time usually on the germ levels to be detected, in particular the specification of the maximum germ count, and the matrix in which the germs can occur.
  • bacteria Gram-positive and Gram-negative
  • yeasts and fungi are called.
  • Quantitative microbiological analysis techniques have been used for quality assurance for a long time.
  • the basis of these methods is to propagate individual germs that occur in the material to be examined so that they are visible as smears or colonies with the naked eye.
  • this cultivation methods are used, which propagate these bacteria either on solid nutrient media or in liquid nutrient solutions or media.
  • conventional culture methods for the detection of bacteria and fungi take up to several days.
  • the most "classical" method of detecting germs is the so-called plate culture method.
  • the sample to be analyzed is applied to a Petri dish coated with nutrient medium (eg agar-agar) and cultured for a certain time under defined conditions.
  • nutrient medium eg agar-agar
  • colonies grow on the nutrient medium, which can be detected and counted with the naked eye.
  • a suitable nutrient medium is offered for the germs to be detected or the environmental conditions -.
  • B. of oxygen content, temperature, light, etc. - promote growth.
  • germs can be detected up to a limit of one colony forming unit (CFU) per milliliter (ml).
  • the culture methods are generally carried out in such a way that nutrient media (typically culture dishes with nutrient media based on agar agar) are inoculated with the sample and adapted to the respective germs, generally elevated temperatures for up to one week be cultivated (eg in an incubator). From the growth and shape of the resulting cultures, one skilled in the art can then deduce the type and extent of microbial load on the sample.
  • nutrient media typically culture dishes with nutrient media based on agar agar
  • This technology has the significant disadvantage that only an indeterminate fraction of the germs contained in the sample can be cultivated and the information is available only after one week.
  • Device-technically more complex analysis methods are based, for example, on the measurement of the conductivity in a germ-containing solution. This involves tracking the change in conductance caused by germination and metabolism-generated components of the solution.
  • the impedance method for determining the alternating current resistance has the disadvantage that significant conductance changes can only be detected for bacterial counts of from 10 3 to 10 4 germs per ml. Although it is possible to analyze even lower "start germ counts", but first a certain germ count must be exceeded for a measuring effect. Over the time to reach this threshold can be calculated back to the original concentration accordingly. At very low levels of germination, it usually takes 24 to 48 hours to obtain a valid result.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the germ-containing solution to be analyzed is pumped through a very thin capillary.
  • the diameter of this capillary is in places in the lower micrometer range, so that here germs and cells can be considered isolated.
  • the germs labeled with a dye are excited to fluoresce at these bottlenecks with high-energy, ideally monochromatic light (eg with a laser).
  • the intensity of the emitted fluorescence light is usually measured with a photomultiplier tube (PMT) and subjected to pulse height analysis (see S.
  • PMT photomultiplier tube
  • the basic idea of the DEFT method is to stain germs with fluorescent dyes, to cause fluorescence in these seeds and to measure the emitted fluorescent light.
  • the DEFT method has the distinct advantage that the germ-containing sample is filtered before or after staining.
  • the detection limit described in the literature can be reduced to one CFU per ml.
  • both living and dead germs can be stained using the DEFT method.
  • the detection of dead germs plays a very important role in the assessment of the hygiene status of production facilities (eg biofilm formation).
  • the analysis procedure, ie the filtration and the staining can be carried out within about 30 minutes.
  • the basic requirement for the DEFT method is the filterability of the product to be investigated.
  • the detection of the fluorescence radiation emitted by the germs can take place in various ways: The most widespread method is the use of a fluorescence microscope. The membrane filter with the stained germs is scanned field of view for field of view. The number of stained germs is detected by the microscope with the naked eye and added. On the one hand, this approach requires a high degree of microscopic and microbiological experience, since a clear differentiation between actual germs and unavoidably occurring foreign particles of similar size and fluorescence is often very difficult for the layman. In addition, this method places high demands on the user's ability to concentrate because the seeds appear on the non-ideal planar membrane filters at different depth levels and overlapping fields of view without double counting must be clearly recognized.
  • EP 0 713 087 A1 describes a structure and a method in which stained germs are located on a solid carrier material. This is scanned line by line with a laser, wherein the detection of the emitted fluorescence takes place at at least one wavelength. Compared to classical microscopy, this method allows a much faster analysis, which also runs completely automated. Based on the described evaluation algorithm, this method - although it is not an imaging process in the true sense - is able to count particles, to determine their size and to detect absolute bacterial counts of less than 100, taking into account the spectral characteristics of the individual particles.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • WO 2002/064818 A1 relates to an extremely simple procedure for the detection of microorganisms: In two different structural embodiments, germs are analyzed. On the one hand, one with a vital and Totbstoffbstoffgemisch dropped sample onto a transparent glass slide and the fluorescence after an increase by a factor of 220 recorded with a CCD camera. In the second embodiment, in analogy to flow cytometry, the sample is pumped through a capillary, irradiated with light, and the fluorescence signal generated is detected with a photodiode or photomultiplier.
  • LEDs light emitting diode
  • Xe lamp for irradiating the sample.
  • LEDs have the advantage over conventional "light sources of high stability in the radiated light output.
  • the - still existing - disadvantages regarding the intensity of LEDs are compensated almost annually by new developments.
  • the US 6 122 396 A brings together some of the aforementioned apparatus and software solutions to a structure.
  • the combination of fluorescence microscope, LED illumination and video camera is coupled with a specific image evaluation algorithm.
  • This algorithm stores a reference ("training") dataset that clearly distinguishes between microorganisms and foreign particles. Parameters that characterize this reference data set are morphology and "brilliance" of fluorescence radiation in a particular wavelength range.
  • fluorescence hfetime imaging microscopy FLIM
  • FLIM fluorescence hfetime imaging microscopy
  • MMCF method membrane filter microcolony fluorescence method
  • MMCF method see, for example, J. Baumgart, Microbiological Examination of Foods, Behr's Verlag 1993, 3rd edition, pages 98 ff.
  • the disadvantage here is that a time-consuming pre-enrichment of the germs must precede, the membrane filter for the subsequent Epifluoreszenzmikroskopie must be pretreated (moistening with special media, dimensioning and drying) and the number of germs by Counting the fluorescently labeled colonies must be done under an epifluorescence microscope or a UV lamp.
  • DE 102 59 302 A1 which belongs to the same patent family
  • WO 2004/055203 A1 belonging to the same patent family describes a method for the quantitative and / or qualitative determination of germs in a sample, which comprises a method step (a) of the sample preparation with a marking at least part of the germs present in the sample by means of at least one fluorescence marker and a step (b) of the quantitative and / or qualitative detection and / or evaluation, wherein the detection and / or evaluation carried out in method step (b) is carried out by fluorescence reflection photometry.
  • the present invention is therefore based on the object, a method of the type mentioned, which is suitable for the quantitative or qualitative determination of germs and in particular avoids the disadvantages described above at least partially, and to provide a corresponding device for performing such a method.
  • the present invention thus relates, according to a first aspect, to a method for the quantitative and / or qualitative determination of germs in a sample by means of fluorescence labeling and subsequent detection and / or evaluation, wherein the detection and / or evaluation by detection and / or measurement of fluorescence emission takes place, wherein the fluorescence-labeled germs for a defined period of time continuously exposed to an excitation radiation of a defined wavelength or a defined wavelength range and the time-dependent course of the fluorescence emission radiation generated as a result of the excitation is detected, so that a discrimination between going back to the fluorescence-labeled nuclei measuring signals on the one hand and any Störsignaien on the other hand is possible.
  • subject of the present invention - according to a first aspect of the present invention - a method for quantitative and / or qualitative determination of germs in a sample
  • the Method comprises a method step (a) of the sample preparation and a method step (b) of the detection and / or evaluation, wherein in method step (a) a marking of at least part of the germs present in the sample takes place by means of at least one fluorescent mark and in method step (b) a quantitative and / or qualitative detection and / or evaluation takes place, wherein the detection and / or evaluation carried out in method step (b) takes place by detecting and / or measuring the fluorescence emission, wherein in method step (b) the sample prepared in method step (a) exposed to the fluorescence-labeled nuclei for a defined period of time continuously excitation radiation of a defined wavelength or a defined wavelength range and the time-dependent course of fluorescence emission radiation generated as a result of the excitation is detected, so that a discrimination between the fluorescently labeled nucle
  • An essential idea of the present invention is therefore to be seen in that the time-dependent course of the fluorescence emission radiation is detected with continuous illumination or irradiation by the excitation light source and in this way a discrimination between traceable to the fluorescence-labeled nuclei measuring signals on the one hand and any interfering signals on the other. Because, as the Applicant has surprisingly found, the returning to the fluorescence-labeled germs measuring signals show a different time-dependent course of the fluorescence emission than the interference signals, so that an assignment of the detected or measured fluorescence emissions in this way is possible, ie a discrimination between measuring signals on the one hand and on the other hand possible interference signals.
  • fluorescently labeled nuclei generally bleach faster than fluorescent foreign particles, so that this effect can be used for the assignment of fluorescence emission signals.
  • an efficient differentiation between measuring signals originating from the fluorescently labeled germs on the one hand and any interfering signals on the other hand is possible, even if the number of nuclei in the sample is extremely low and consequently the number of measuring signals due to the fluorescence-marked germs is considerably less than the number of measuring signals Interference signals (eg by a factor of 1,000 or more).
  • the method according to the invention enables a relatively simple, low-cost detection or evaluation, because the fluorescently labeled microorganisms require substantially no further processing for this purpose.
  • a time- and labor-consuming process step of (pre-) enrichment of germs, ie the detection or evaluation according to the invention directly provides the "authentic" or present in the sample germ count.
  • time-dependent course of the fluorescence emission radiation refers in particular to the time-dependent progression of the intensity of the detected or observed fluorescence emission. This is not a luminescence phenomenon, since it is there that the intensity of the fluorescence is traced only after switching off the excitation light source.
  • interference signals refers to all detected or measured fluorescence emission signals which do not originate from the fluorescence-labeled germs. Such interference signals can be generated, for example, by foreign substances with intrinsic fluorescence, in particular plastic particles, in the sample, but also by non-specific binding of the fluorescent marker to foreign particles or else by contamination due to free, eg. B. not washed out fluorescent markers.
  • the inventive method basically allows both the qualitative and the quantitative determination of germs in a sample, ie both the determination of the species or species of germs as well as their number or their concentration.
  • the method according to the invention is carried out in such a way that the time-dependent course of the fluorescence emission radiation generated as a result of the excitation is detected in such a way that the kinetics of the degradation or bleaching of the fluorescence marker or of the fluorescence-marked nuclei (ie fluorescence markers with binding to the germs in the detection of dead germs or fluorescent markers that are converted by the metabolism of living germs) is detected.
  • the surprising finding or fact that the fluorescently labeled germs have a different degradation or bleaching behavior of the fluorescence marker than foreign particles, in particular generally bleach faster than foreign particles, is used in the context of the method according to the invention.
  • detecting the kinetics of the degradation and / or bleaching of the fluorescent marker can be - in alignment with the interfering signals - an assignment of the detected or detected fluorescence emission signals to be determined germs on the one hand and the interference realized on the other hand, so that a targeted discrimination or Differentiation is made possible, which allows a reliable quantitative and / or qualitative determination of fluorescently labeled germs - even at extremely low concentrations.
  • the detection of the kinetics of the degradation and / or fading of the fluorescence emission signals or of the fluorescence marker and the germs labeled herewith generally takes place via the detection of the time-dependent course of the intensities of the fluorescence emission signals.
  • the phrase "marking at least part of the germs present in the sample” means, in particular, the following: Depending on whether only specific germs or germ species present in the sample or all germs present in the sample are to be determined, the former is marked only a specific portion of the germs present in the sample (generally with germ-specific fluorescent labels), while in the latter case all of the germs present in the sample are labeled (generally with germ-specific fluorescent labels or a mixture of different germ-specific fluorescent labels).
  • the number of germs present in the sample can then be determined on the basis of the measured values determined, if appropriate by means of suitable calibration (in the case of fluorescence labeling of all the germs present in the sample, the total number of all germs present in the sample and, in the case the fluorescent label of only specific germs, their total number).
  • suitable calibration in the case of fluorescence labeling of all the germs present in the sample, the total number of all germs present in the sample and, in the case the fluorescent label of only specific germs, their total number.
  • the reproducibility and / or reliability of the method according to the invention can be further increased by detecting the fluorescence radiation at at least two temporally successive intervals at mutually different but respectively defined wavelengths or wavelength ranges of the prepared sample with the fluorescence-marked nuclei.
  • a further increase in the performance of the method according to the invention can be achieved by additionally discriminating between measurement signals originating from the fluorescence-labeled nuclei on the one hand and any interfering signals on the other hand via the analysis of the fluorescence characteristic.
  • the ratio of the fluorescence intensities is detected at different but defined wavelengths or wavelength ranges, so that a reliable discrimination between on the determined germs going back measurement signals on the one hand and any interference signals on the other hand.
  • the wavelength or the wavelength range of the application radiation should be matched to the fluorescence characteristic of the fluorescence marker or the fluorescence-labeled nuclei, in particular their absorption maxima with respect to the fluorescence emission.
  • the performance of the method according to the invention can also be further increased by discriminating over the size and / or shape of the emitting particles in addition to the discrimination by detecting the time-dependent course of the fluorescent emission radiation, which can be done, for example, in the context of automated image acquisition methods .
  • On the acquisition of the size and / or shape of the emitting particles results - together with the assessment of the time-dependent course - another criterion for reliable assignment to interfering or foreign particles on the one hand and to be determined germs on the other. Since the detected germs are generally smaller than 6 microns, all major signals can be neglected.
  • the form is also visible; in general, the ratio of the major axes in germs under the use of a 10x or 20x microscope objective according to the invention is approximately 1: 1, ie. H. the germs appear - with the exception of the hyphae form of a mushroom - as round structures. Particles which, on the other hand, have a different principal axis ratio are thus ignored.
  • the discriminating between the fluorescence-labeled germs originating measuring signals on the one hand and any interfering signals on the other hand three stages, ie using all three aforementioned discrimination methods, namely both on the detection of the time-dependent course of the fluorescence emission radiation and on the size and / or shape of the emitting particles and finally on the analysis of the fluorescence characteristic.
  • the germs to be determined are generally applied or fixed on a support. At least for the duration of the measurement, the germs to be determined are in this way in an immobilized form insofar as they are fixed on the carrier and can not change their position, so that a reliable signal assignment is possible.
  • sample preparation is carried out in general, as described in the back to the applicant itself documents DE 102 59 302 A1 and WO 2004/055203 A1, the entire contents of which is hereby incorporated by reference.
  • the fluorescence-marked seeds are applied to a preferably porous carrier (for example a membrane filter, for example a polycarbonate membrane filter or a silicon microsieve), the carrier preferably being porous.
  • a preferably porous carrier for example a membrane filter, for example a polycarbonate membrane filter or a silicon microsieve
  • the carrier in particular membrane filter or silicon microsieve, should generally be designed such that it retains the germs or is impermeable to the germs.
  • the size of the pores of the carrier should be chosen so that the pore size is smaller than the size of the germs present in the sample.
  • Membrane filters can be used according to the invention as porous support materials, for example membrane filters based on polycarbonate, PTFE, polyesters, cellulose and cellulose derivatives, such as cellulose acetate, regenerated cellulose, nitrocellulose or cellulose mixed ester.
  • suitable membrane filters are marketed for example by Macherey-Nagel (eg. B, the "PORAFIL ®" series).
  • a silicon microsieve As a porous support, a silicon microsieve can be used, which has a particularly smooth and even surface, which is why it can detect microorganisms located on it even better; Furthermore, the cleaning of such screens is relatively easy to do, and such screens are reusable, in addition, the silicon microsieve have a good biocompatibility and a rigid structure, which brings considerable advantages in their handling.
  • the use of a porous support, in particular membrane filter or silicon microsieve offers the advantage that the detection or evaluation can take place directly on the porous support, in particular without further sample treatment, preparation, transfer or the like (ie in particular without advance).
  • the fluorescent marker used in the method according to the invention is selected such that it is membrane-permeable with respect to the carrier used in the sample preparation carried out in method step (a), in particular membrane filter or silicon microsieve.
  • This has the advantage that in the detection or evaluation caused by excess fluorescence marker noise or no background noise occurs and consequently a favorable signal / background ratio or signal / noise ratio is achieved.
  • the fluorescence labeling of the germs present in the sample in process step (a) of the process according to the invention is carried out in a manner known per se.
  • the germs to be labeled may be contacted with a solution or dispersion of the fluorescent labels present in excess relative to the germs present, the contact time being sufficient to ensure complete fluorescence labeling of all the germs present in this process step (depending on the selection of the fluorescence marker, eg all germs present in the sample or all germs of only one or several germ species).
  • the excess fluorescence markers can then be removed or separated from the fluorescence-labeled nuclei.
  • a porous support in particular membrane filter or silicon microsieve, which is membrane-permeable in relation to the fluorescence markers but impermeable with respect to the nuclei
  • this can be done, for example, by applying (for example by applying overpressure or underpressure).
  • process step (a) of the sample preparation may also include inactivation and / or removal of any germ-inhibiting and / or germicidal substances or ingredients present in the sample (eg, preservatives, surfactants, etc.). This prevents that the later measurement results are falsified by the fact that a portion of the germs are killed or inactivated during the sample preparation or measurement by the germ-inhibiting or germicidal substances or components and thus a falsely too low bacterial count is determined.
  • germ-inhibiting and / or germicidal substances or ingredients present in the sample eg, preservatives, surfactants, etc.
  • step (a) carried out the sample preparation carried out according to the method of the invention is advantageously before the fluorescence labeling, preferably immediately after sampling or immediately at the beginning of in step (a) carried out the sample preparation carried out according to the method of the invention; In this way, it is ensured that the germ-inhibiting or germ-killing substances, constituents, ingredients and the like have essentially not yet caused any change in the number of germs present in the original sample. Equally, though less preferably, it is possible to carry out the inactivation or removal of any germ-inhibiting or germ-killing substances or constituents present in the sample after the fluorescence labeling. It is also possible that Fluorescence labeling and the inactivation or removal of the germ-inhibiting or germicidal substances or components to perform simultaneously.
  • the method step of inactivating or removing optionally germ-inhibiting or germ-killing substances or constituents present in the sample, depending on the type of sample, takes place in a manner known per se.
  • the article by Stumpe et al. "Chemoluminescence-based direct evidence of microorganisms - A report from the food and cosmetics industry” on pages 317 to 323 of the conference volume "HY-PRO 2001, Hygienic Production Technology / Hygienic Production Technology", 2nd International Congress and Exhibition, Wiesbaden 15.- 17.5.2001 and the literature cited in this article; the entire content of this article, including the contents of the literature cited therein, is hereby incorporated by reference.
  • TLH tween-lecithin histidine
  • aqueous inactivation or conditioning solutions which are suitable according to the invention may also contain buffer substances (for example phosphate buffer such as hydrogen phosphate and / or dihydrogenphosphate), further salts (cf. for example, sodium chloride and / or sodium thiosulfate) and tryptone (peptone from casein).
  • buffer substances for example phosphate buffer such as hydrogen phosphate and / or dihydrogenphosphate
  • further salts cf. for example, sodium chloride and / or sodium thiosulfate
  • tryptone peptone from casein
  • An inactivation or conditioning solution which is particularly suitable according to the invention has the following composition:
  • TLH water usable according to the invention has in particular the following composition:
  • Polysorbate 80 (Tween 80) 30.0 g
  • the phosphate buffer solution usable according to the invention has in particular the following composition:
  • fluorescent marker s
  • the fluorescence markers known from the prior art can be used here, provided they are suitable for use in the context of the method according to the invention.
  • fluorescent marker is understood very broadly in the context of the present invention and means in particular any fluorescent marker which is designed such that it interacts with the germs, for example on the germs, in particular on their cell wall (shell) and / or nucleic acid , binds and / or absorbed by the germs, in particular metabolized and / or enzymatically converted.
  • the fluorescence marker used according to the invention may be, for example, a germ-specific fluorescence marker or a mixture of germ-specific fluorescent labels. This allows a relatively inexpensive fluorescence labeling of all germs present in the sample and thus a relatively fast determination of the total number of bacteria in the sample. In particular, in the event that only specific germs are to be detected qualitatively and quantitatively, a germ-specific fluorescence marker or a mixture of different germ-specific fluorescence markers can be used as fluorescence marker.
  • a mixture of germ-specific and germ-specific fluorescent markers can be used as the fluorescent marker.
  • a fluorescence marker which interacts with living germs can be used as the fluorescent marker.
  • a fluorescence marker which interacts with "dead” germs can also be used as the fluorescent marker.
  • fluorescence markers for example, the fluorescence markers customarily used for nucleotide labeling in epifluorescence microscopy or in the DEFT (direct epifluorescence filter technique) or in the MMCF (membrane filter-microcolony fluorescence method).
  • a fluorescent marker a fluorescent dye or a precursor of such a fluorescent dye from which by interaction with the germs, in particular by metabolization and / or enzymatic reaction, the fluorescent dye is generated, are used.
  • fluorescence markers which can be used according to the invention as fluorescence markers include, without limitation, e.g. 3,6-bis [dimethylamino] acridine (acridine orange), 4 ', 6-diamido-2-phenylindole (DAPI), 3,8-diamino-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridinium bromide (ethidium bromide), 3,8-diamino-5- [3- (diethyl-methylammonio) -propyl] -6-phenyl-phenanthridinium diiodide (propidium iodide),
  • Rhodamines such as rhodamine B and sulforhodamine B as well as fluorescein isothiocyanate.
  • fluorescent labels may also be used, for example, as nucleic acid probes (eg germ-specific nucleic acid probes) which in turn are fluorescently labeled, in particular with a fluorescent group or a fluorescent molecule.
  • the fluorescent moiety or molecule can be covalently or otherwise attached to the nucleic acid probe.
  • the nucleic acid probe used according to the invention as a fluorescence marker can be, for example, a fluorescently labeled oligo- or polynucleotide or a fluorescently labeled DNA or RNA probe. In general, for stability reasons, DNA probes are preferred according to the invention.
  • nucleic acid probes which can be used according to the invention as fluorescence markers are, for example, the probes mentioned in WO 01/85340 A2, WO 01/07649 A2 and WO 97/14816 A1, the entire disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • nucleic acid probes commonly used for labeling DNA or RNA labeling
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • fluorescence marker it is also possible to use a particularly germ-specific antibody, which in turn is fluorescence-labeled, in particular with a fluorescent group or a fluorescent molecule, wherein the fluorescent group or molecule may be covalently or otherwise bound to the antibody.
  • the amount or concentration of fluorescence markers used will be adapted by the person skilled in the art to the particular circumstances of the individual case. This is readily familiar to him.
  • the germs present in the sample should be chosen for a good germ coloration and, at the same time, a weak "background coloration", a suitable mixing ratio of "live dye” dyestuff; to select this on a case-by-case basis is within the skill of the art.
  • the detection limit in the method according to the invention with respect to the germs to be determined is ⁇ 100 colony forming units (CFU) per milliliter of sample volume, preferably ⁇ 10 colony forming units (CFU) per milliliter of sample volume. Therefore, the process according to the invention does not require any pre-enrichment.
  • the low detection limit is critical to meeting certain policies or regulations.
  • a time-consuming and cost-intensive absence testing of certain problem germs, ie pathogenic germs must be carried out.
  • counts in the range of about 10 CFU per milliliter sample volume or even less to about 10 8 CFU per milliliter sample volume can be determined.
  • the sample should be diluted in advance accordingly, ie in a suitable manner.
  • the method according to the invention is suitable in principle for the determination of any germs, in particular pathogenic germs of all kinds (eg. Microorganisms of all kinds, in particular unicellular microorganisms, such as bacteria and fungi, z. Yeasts or molds).
  • pathogenic germs of all kinds eg. Microorganisms of all kinds, in particular unicellular microorganisms, such as bacteria and fungi, z. Yeasts or molds.
  • the inventive method is suitable in principle for the quantitative and / or qualitative determination of germs in any products (i.e., media, matrices, solutions, etc.), preferably filterable, especially liquid and / or flowable products.
  • any products i.e., media, matrices, solutions, etc.
  • filterable especially liquid and / or flowable products.
  • these must be converted in the sample preparation in a form accessible to the method according to the invention; This is done by methods known per se, for example by conversion into a solution or dispersion, comminution, extraction, etc.
  • inventive method for quantitative and / or qualitative determination of germs in food, surfactant-containing products such as detergents and cleaners, surface treatment agents, dispersion products, cosmetics, hygiene products and personal care products, Pharmazeutikä, adhesives, coolants, paints and lacquer -) coagulations and raw materials and raw materials for the aforementioned products.
  • surfactant-containing products such as detergents and cleaners, surface treatment agents, dispersion products, cosmetics, hygiene products and personal care products, Pharmazeutikä, adhesives, coolants, paints and lacquer -) coagulations and raw materials and raw materials for the aforementioned products.
  • the method according to the invention is therefore suitable for all kinds of possible raw materials, intermediate and end products from the different areas, such as e.g. Foodstuffs, branded goods, cosmetics, adhesives, coolants (eg oily coolant emulsions); Process fluids of plants, etc., with the restriction that the germs to be detected should be separated via a separation process, such as filtration or sedimentation. It is also irrelevant whether the products are in solid or liquid form.
  • a separation process such as filtration or sedimentation.
  • the inventive method is particularly suitable for automated implementation (eg in the context of production and / or quality control).
  • test preparation can be carried out as described in DE 102 59 302 A1 and WO 2004/055203. This can be done, for example, as follows:
  • the sample with the quantitatively and / or qualitatively to be determined germs is placed in a suitable sample vessel whose bottom with a generally porous support, for.
  • a membrane filter or a silicon microsieve is provided and should be closed sterile.
  • the porous support lies with its outer edge on the sample vessel, so that the outer, concentric edge is not occupied by germs. If a sample is to be tested which contains germicidal or germicidal substances or components (eg preservatives or surfactants), inactivation and / or removal of these substances or components is first carried out by mixing the sample with a suitable inactivation and / or removal agent or conditioning solution for a time sufficient to allow inactivation and / or removal of these substances or components.
  • germicidal or germicidal substances or components eg preservatives or surfactants
  • the inactivation and / or conditioning solution is removed via the membrane filter.
  • excess or remaining inactivation and / or conditioning solution is removed via the membrane filter, usually by applying an overpressure or underpressure, so that the wash water is removed in a simple manner.
  • a mark at least one Part of the germs present in the sample by means of at least one fluorescent marker on.
  • the seeds may be contacted with a solution or dispersion of the fluorescent label for a time sufficient to mark the seeds. Subsequently, the excess solution or dispersion of the fluorescent marker is removed by re-applying an overpressure or underpressure over the porous support.
  • the sample may be subjected to a single or multiple wash with water, buffer solutions or other liquids.
  • the porous support can then finally be separated from the sample vessel so that a porous support, in particular membrane filter or silicon microsieve, coated with fluorescence-marked nuclei results.
  • a porous support in particular membrane filter or silicon microsieve, coated with fluorescence-marked nuclei results.
  • This can be fed directly, ie in general without further treatment of the sample or treatment of the sample or the filter, the measurement or detection.
  • the carrier coated with fluorescence-labeled germs is then irradiated with light of suitable wavelength and, as it were, scanned or scanned. The determined measured value correlates with the germ count on the membrane filter or in the sample.
  • the measurement setup on which the present invention is based includes some "deviations" from a conventional fluorescence microscope and goes a step further in some places.
  • the detector may comprise, for example, the following components: A sample holder table which can be moved in all three spatial directions.
  • the stepwise positioning is z. B. at about 2 microns.
  • the control of the table for example, computer-aided, wherein the parameters for Abrastem a carrier or membrane filter or Siliziummikrosiebs are stored in a corresponding measurement program. These parameters describe an automatic focus adjustment, the grid width in the x and y direction, the depth profile in the z direction and the area of the sample to be examined.
  • the sample holder table itself can z. B. be shaped so that in a preferred manner Standard slides with the dimensions 26 mm wide and 76 mm long (ISO standard 8037 / I) can be firmly fixed.
  • the sample is z. B. irradiated with an LED (light emitting diode).
  • LED light emitting diode
  • the use of an LED has the advantage that the sample to be examined exposed to only a small thermal load and thus longer lasting.
  • the excitation wavelength of the LED depends in particular on the absorption maximum of the fluorescent dye used.
  • the light from the LED is directed to the sample via a dichroic beam splitter.
  • the fluorescence radiation emitted by the germs can be spectrally filtered on their way through a microscope objective to a CCD camera. As a result, the fluorescence radiation can be detected as a function of wavelength; one gets a sort of "spectral fingerprint" of the germs.
  • Autofocus is used to define a specific image plane. From this, a movement of the specimen to be examined in the z-direction (ie, vertical to the surface of the preparation) is carried out in defined process steps. In this way images are taken in different depth levels. A subsequent projection of the image planes finally provides a deep-sharp overall picture.
  • multiple visual fields eg, in the preferred size 1.5mm x 1.0mm
  • multiple optical filters provide a relatively large amount of data.
  • a series of image sequences can be recorded.
  • the images generated in this way are evaluated with regard to their actual germ content, taking into account various evaluation parameters.
  • the size and shape of a detected particle plays an important role. Since the detectable nuclei are generally smaller than 6 microns, all larger particles can be neglected. In this context, the form is also visible; for at the preferred magnification mentioned here, the ratio of the major axes of the germs is, to a first approximation, 1: 1, ie the germs appear (with the exception of the hyphae form of a fungus) as round structures. Particles that have a different major axis ratio are therefore also disregarded.
  • Another parameter is the analysis of the fluorescence characteristic.
  • the ratio of the fluorescence intensities at different wavelengths / wavelength ranges is crucial for discriminating between germs and other particles. These wavelength differences are additionally displayed as false colors in the aforementioned deep-focus image.
  • a dichroic beam splitter with an "edge" at 500 nm is used. This ensures that the excitation light is reflected almost completely on the filter, while the light emitted by the colored living germs fluorescent light from 520 nm wavelength is almost completely transmitted.
  • a long-pass filter with an "edge" at 520 nm is arranged in order to further attenuate the intense excitation light of the LED. All other filters are integrated into a filter wheel, leaving one position ("position 1") of the filter wheel without filter; this serves to measure the total fluorescence emitted by the sample. On two further positions (“positions 2 and 3”) bandpass filters are used, which filter out the green fluorescent light with different widths. Three more filters on the remaining positions of the filter wheel (“positions 4 to 6”) are long pass filters with "absorption edges" shifted further and further into the red area.
  • the fluorescence intensity determined at a given irradiation time is evaluated. This is not a measurement of Fluorescence lifetime, which under single excitation, the duration of the "afterglow” is detected. Rather, in the present invention, a field of view is exposed for a certain period of time, a photograph of the field is taken, re-exposed, and so forth. This "bleaching" produced by the LED is crucial for differentiation of germs and others, for the determination the germ count of negligible particles ("sturgeon particles"). Since germs absorb only a finite amount of fluorescent dye, this is bleached after a certain time by the irradiation of the LED; the germs only glow weakly or not at all anymore. On the other hand, particles which were not stained by the fluorescent dye and cause fluorescence on account of intrinsic properties (eg plastic particles) remain almost unaffected in their intensity by the irradiation time.
  • intrinsic properties eg plastic particles
  • the system used according to the invention is able to find the focus of a viewing field completely automatically. For the most accurate mapping possible of the germs and other particles present on the membrane filters, an autofocus adjustment takes place again after each method step or in each field of view.
  • An advantage of the method according to the invention is the fact that it can be carried out automatically. Complete automation of the entire process makes the process easier, faster and more reproducible. This brings advantages in terms of cost, labor costs and sensitivity. The high reproducibility in carrying out the investigations is also of great advantage.
  • Another advantage of the method according to the invention is the use of standardized or conventional components:
  • the overall system required for carrying out the method according to the invention is integrated in such a way that a multiplicity of standardized or conventional components (vessels, media, filters, etc.) are used can and thus reduces the user effort and safety of the process is increased.
  • Another advantage of the method according to the invention consists in the simple detection and evaluation:
  • the inventive method can be carried out for example in a suitable sample vessel, so that the labeled germs on a suitable support, for. As a filter membrane, are prepared.
  • Yet another advantage of the method according to the invention is the speed of carrying out the method according to the invention:
  • the method according to the invention allows a determination of the germ count already after a time between a few minutes, depending on the type of germs and their number. By contrast, conventional culture methods take up to several days.
  • the high sensitivity of the method according to the invention is also of particular advantage:
  • the method according to the invention allows the determination of germs even in high dilution. Accelerated culture methods are not sufficiently sensitive for a detection limit of 10 cfu per milliliter of sample volume.
  • the present invention also relates to a device as described in claim 35 for the quantitative and / or qualitative determination of germs in a sample by means of fluorescence labeling or by means of a fluorescent marker, wherein the device is designed such that the Time-dependent course of the fluorescence emission to discriminate between on the fluorescence-labeled nuclei originating measurement signals on the one hand and any interference signals on the other hand can be detected.
  • the subject of the present invention is an apparatus for the quantitative and / or qualitative determination of germs in a sample according to a method with sample preparation and subsequent detection and / or evaluation, wherein by means of the device in the course of sample preparation, a marking of at least part of the present in the sample germs by means of at least one fluorescent marker is feasible and the detection and / or evaluation using the fluorescent marker by detection and / or measuring the fluorescence emission is feasible, in particular for carrying out the method according to the invention described above, wherein the device
  • porous carrier for applying and / or fixing the germs, in particular membrane filter or Siliziummikrosieb, wherein the carrier is designed such that it retains the germs to be detected and / or in is impermeable to the germs to be detected, and
  • a detection system which is designed to carry out a fluorescence emission measurement and to which the sample receptacle with the support and / or the support removed from the sample receptacle can be positioned for purposes of detection and / or evaluation
  • the detection system is a preferably computer-controlled control and / or Evaluation device as part of the detection system and / or for controlling the detection system and comprises a radiation source, by means of which the fluorescently labeled nuclei can be exposed for a defined period of excitation radiation of a defined wavelength or a defined wavelength range
  • the detection system in particular the control and / or evaluation, means for detecting the time-dependent course of the fluorescence emission radiation generated as a result of the excitation, so that a discrimination between the fluorescently labeled germs the return of the measuring signals on the one hand and any interference signals on the other hand can be detected
  • the present invention - according to a further, third aspect of the present application - relates to the inventive use of the device according to the invention as described above, as it is the subject of the use claims (claims 41 to 43).

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe, welches einen Verfahrenschritt (a) der Probenaufbereitung mit einer Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkes und einen Verfahrensschritt (b) der ) eine quantitativen und/oder qualitativen Detektion und/oder Auswertung durch Erfassung und/oder Messung der Fluoreszenzemission umfaßt, wobei in Verfahrensschritt (b) die in Verfahrensschritt (a) aufbereitete Probe mit den fluoreszenzmarkierten Keimen für eine definierte Zeitdauer einer Anregungsstrahlung einer definierten Wellenlänge oder eines definierten Wellenlängenbereichs ausgesetzt und der zeitabhängige Verlauf der infolge der An- regung erzeugten Fluoreszenzemissionsstrahlung erfaßt wird, so daß eine Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits ermöglicht wird und auf diese Weise eine quantitative und/oder qualitative Bestimmung der fluoreszenzmarkierten Keime in der Probe erfolgt. Gleichermaßen beschrieben ist eine entsprechende Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Keimen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen und die Anwendung eines solchen Verfahrens, insbesondere 'im Rahmen der Produktions- und/oder Qualitätskontrolle. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen, insbesondere zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens, sowie die Verwendung dieser Vorrichtung, insbesondere für die vorzugsweise automatisierte Produktions- und/oder Qualitätskontrolle.
Keime - hierunter werden erfindungsgemäß Bakterien, Hefen und Pilze verstanden - in Produkten jeglicher Art können einerseits zum Verderb führen, was einen direkten Einfluß auf die Qualität, Wirkungsweise und Leistung hat. Andererseits können bei zu hohen Keimbelastungen bzw. durch pathogene Keime Infektionen und/oder Krankheiten hervorgerufen werden. Daher ist die unmittelbare Erkennung einer Keimbelastung unerläßlich, z. B. bevor ein Endprodukt in den Markt gelangt.
Für eine Vielzahl von Substanzen, Rohstoffen und Produkten aus den unterschiedlichen Bereichen Industrie, Handwerk, Haushalt, Gesundheit, Gastronomie etc. muß die mikrobiologische Sicherheit gewährleistet sein. Dabei ist zu beachten, daß die Art und Anzahl unterschiedlicher Keime, wie z. B. Bakterien und Pilze, in engen Grenzen kontrolliert werden muß.
Die Kontrolle des hygienischen Status von Konsumgütern, wie Lebensmitteln, Kosmetika, Klebstoffen, Wasch- und Reinigungsmitteln, aber auch z. B. von Kühlschmierstoffen, die insbesondere im industriellen Bereich eingesetzt werden, ist vom Gesetzgeber geregelt. Je nach Art der Güter sind unterschiedliche Grenzwerte für die mikrobiologische Belastung definiert. Gleiches gilt für Oberflächen in Krankenhäusern (z. B. in Operationssälen), aber in zunehmendem Maße auch für Klimaanlagen, Wärmetauscher etc. Die Nachweismethoden sind sehr vielfältig und hängen in ihrer Komplexität, dem apparativen Aufwand und der notwendigen Analysezeit meist von den nachzuweisenden Keimgehalten, insbesondere der Spezifikation der maximalen Keimzahl, und der Matrix, in der die Keime auftreten können, ab. Als Keime werden in der vorliegenden Anmeldung insbesondere Bakterien (Gram-positiv und Gram-negativ), Hefen und Pilze bezeichnet.
Quantitative mikrobiologische Analysetechniken werden zur Qualitätssicherung schon seit langer Zeit eingesetzt. Grundlage dieser Methoden ist es, einzelne Keime, die in dem zu untersuchenden Material vorkommen, so zu vermehren, daß sie als Ausstriche oder Kolonien mit bloßem Auge sichtbar werden. Standardmäßig werden hierfür Kultivierungsmethoden eingesetzt, die diese Keime entweder auf festen Nährböden oder in flüssigen Nährlösungen bzw. -medien vermehren. Die Durchführung herkömmlicher Kultivierungsverfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen dauert je nach Methode und Keimart bis zu mehreren Tagen.
Das mitunter "klassischste" Verfahren zum Nachweis von Keimen besteht in der sogenannten Platten-Kultur-Methode. Dabei wird die zu analysierende Probe auf eine mit Nährmedium (z. B. Agar-Agar) beschichtete Petrischale aufgebracht und für eine bestimmte Zeit unter definierten Bedingungen kultiviert. Im Laufe von einem oder mehreren Tagen wachsen im Falle einer keimbelasteten Probe Kolonien auf dem Nährmedium an, die mit dem bloßen Auge detektiert und ausgezählt werden können. Auf diese relativ einfache, aber langsame Art gelingt der Keimnachweis, vorausgesetzt, daß für die nachzuweisenden Keime ein geeignetes Nährmedium angeboten wird bzw. die Umgebungsbedingungen - beeinflußt z. B. von Sauerstoffgehalt, Temperatur, Licht etc. - das Wachstum fördern. Somit können Keime bis zu einer Grenze von einer koloniebildenden Einheit (KBE) pro Milliliter (ml) nachgewiesen werden. Die relativ unkomplizierte Handhabbarkeit der Platten-Kultur-Methode, die darüber hinaus kein explizites mikrobiologisches Fachwissen erfordert, macht dieses Verfahren auch heute noch bei einer Reihe von Anwendungen zu einer Methode der Wahl. Nach dem Stand der Technik geht man bei den Kultivierungsverfahren im allgemeinen derart vor, daß Nährmedien (typischerweise Kulturschalen mit Nährmedien auf Basis von Agar-Agar) mit der Probe beimpft werden und bei den jeweiligen Keimen angepaßten, im allgemeinen erhöhten Temperaturen für bis zu einer Woche kultiviert werden (z. B. in einem Brutschrank). Aus dem Wachstum und der Form der entstandenen Kulturen kann ein Fachmann dann die Art und das Ausmaß der mikrobiellen Belastung der Probe ableiten.
Diese Technologie hat den entscheidenden Nachteil, daß sich nur ein unbestimmter Bruchteil der in der Probe enthaltenen Keime kultivieren läßt und die Information erst nach einer Woche zur Verfügung steht.
Um die zuvor beschriebenen Probleme zu lösen, wurden in der Vergangenheit bereits eine Reihe von Verfahren entwickelt, um den mikrobiellen Nachweis zu beschleunigen bzw. die Empfindlichkeit zu erhöhen. Dazu zählen mikroskopische Verfahren, bei denen Keime selektiv oder unselektiv angefärbt und entsprechend nachgewiesen werden, aber auch Verfahren, die auf Immunoassays basieren, und direkte molekularbiologische Verfahren, welche die Erbsubstanz der Keime amplifizieren und anschließend gelelektrophoretisch nachweisen.
Seit einiger Zeit wird versucht, durch neue, sogenannte "Schnellnachweismethoden" die Nachweiszeit von einigen Tagen auf wenige Stunden oder noch darunter zu reduzieren. "Schnellnachweismethoden" werden partiell schon eingesetzt (Impedanz, Biolumineszenz etc.), aber es besteht die Nachfrage nach direkteren und schnelleren Methoden. Denn auch die bisher etablierten "Schnellnachweisverfahren" beruhen auf einer zeitabhängigen Anreicherung von biologischem Material, so daß immer noch 24 bis 48 Stunden für eine Analyse benötigt werden.
Gerätetechnisch aufwendigere Analyseverfahren beruhen beispielsweise auf der Messung der Leitfähigkeit in einer keimhaltigen Lösung. Hierbei verfolgt man die Änderung des Leitwerts, die durch das Keimwachstum und den aus dem Metabolismus generierten Bestandteilen der Lösung hervorgerufen wird. Dieses Impendanz-Verfahren zur Bestimmung des Wθchselstromwiderstands hat jedoch den Nachteil, daß sich signifikante Leitwertänderungen erst bei Keimzahlen ab 103 bis 104 Keime pro ml feststellen lassen. Zwar ist es möglich, auch niedrigere "Start-Keimzahlen" zu analysieren, doch zunächst muß für einen Meßeffekt eine gewisse Keimzahl überschritten werden. Über die Zeit zum Erreichen dieses Schwellwertes kann entsprechend auf die ursprüngliche Konzentration zurückgerechnet werden. Bei sehr niedrigen Keimgehalten muß in der Regel 24 bis 48 Stunden gewartet werden, um ein valides Resultat zu erhalten.
In einem ähnlichen Keimzahlbereich arbeitet das sogenannte ATP-Verfahren (ATP = Adenosintrip_hosphat), bei dem die im Rahmen einer biochemischen Abbaureaktion durch das ATP der Keime emittierte Biolumineszenz gemessen wird.
Alle drei vorgenannten Verfahren, nämlich Platten-Kultur-, Impendanz- und ATP- Verfahren, können lediglich lebende, vitale Keime nachweisen. Sie alle beruhen darauf, daß sich Keime vermehren und einen funktionierenden Stoffwechsel haben.
Technisch noch anspruchsvollere - und damit auch von der Anschaffung her deutlich teurere - Geräte stellen Durchflußcytometer dar. Bei diesen Apparaten wird die zu analysierende, keimhaltige Lösung durch eine sehr dünne Kapillare gepumpt. Der Durchmesser dieser Kapillare liegt stellenweise im unteren Mikrometerbereich, so daß hier Keime und Zellen vereinzelt betrachtet werden können. Die mit einem Farbstoff markierten Keime werden an diesen Engpässen mit energiereichem, idealerweise monochromatischem Licht (z. B. mit einem Laser) zur Fluoreszenz angeregt. Die Intensität des abgestrahlten Fluoreszenzlichts wird meist mit einem Photomultiplier (PMT) gemessen und einer Pulshöhenanalyse unterzogen (vgl. S. Rapposch et al., "Influence of Fluorescence of Bacteria Stained with Acridine Orange on the Enumeration of Microorganisms in Raw Milk", J. Dairy Sei., 83 (2000), Seiten 2753 bis 2758). Bei geeigneter Auswahl der Farbstoffe ist mit Hilfe der Durchflußcytometer sowohl eine Bestimmung lebender/aktiver als auch toter Keime möglich. Die Verwendbarkeit dieser Durchflußsysteme ist bei höherviskosen und zur Schaumbildung neigenden Proben meist nicht gegeben: Einerseits verstopft die Kapillare leicht, und andererseits ist durch die hervorgerufenen Blasen keine einwandfreie Detektion mit Hilfe des Lasers und des PMT möglich.
Fluoreszenzoptische Verfahren haben in der jüngeren Vergangenheit die herkömmlichen "Schnellnachweismethoden" und Kultivierungsverfahren mehr und mehr abgelöst. Eine Methode, welche die Grundlage der hier beschriebenen Erfindung darstellt, ist die sogenannte Direkte Epifluoreszenz-Filter-Technik, DEFT genannt. Mit der Direkten Epifluoreszenz-Filter-J_echnik (DEFT) steht eine Direktmethode zur Verfügung, welche auch einen quantitativen "lebend/tot"- Keimnachweis in weniger als einer Stunde erlaubt. Dieses unspezifische, fluoreszenzoptische Verfahren ist als qualitatives Verfahren seit über 25 Jahren in der universitären Grundlagenforschung bekannt (siehe z. B. Pettipher et al., Appl. Environ. Microbiol. 44(4): 809-13, 1982) und hat sich seit Anfang der 1990er Jahre zunehmend in industriellen Anwendungen (z. B. Brauereien, Molkereien, Lebensmittelindustrie etc.) als quantitative Untersuchungsmethode etabliert (Hermida et al., J. AOAC Int. 83(6): 1345-1348, 2000 und Nitzsche et al., Brauwelt, Nr. 5, 177-178, 2000). Es existiert außerdem eine Euro-Vorschrift für die Untersuchung bestrahlter Lebensmittel mit einem DEFT- Screeningverfahren (EN 13783: 2001 "Nachweis der Bestrahlung von Lebensmitteln mit Epifluoreszenz- Filtertechnik/aerober mesophiler Keimzahl (DEFT/APC) - Screeningverfahren").
Alternative, selektiv wirkende Fluoreszenzfarbstoffe werden als Laborkits für Vitalnachweise von diversen Herstellern angeboten (z. B. von den Firmen Molecular Probes und EasyProof Laborbedarf GmbH). Einige Anbieter (z. B. die Firma Chemunex) verkaufen Gerätesysteme; die beispielsweise von der Firma Chemunex angebotenen Systeme beruhen entweder auf dem Prinzip der Durchflußcytometrie (L. Philippe, SÖFW-Journal 126, 28-31 , 2000), die zur Untersuchung niedriger Keimgehalte einer Anreicherungsphase von 24 Stunden bedarf, oder auf einem mikroskopischen Filtrationsverfahren, welches aber keine "lebend/tot"-Differenzierung erlaubt (Wallner et al., PDA J. Pharm. Sei. Technol. 53(2): 70-74, 1999). Die Grundidee der DEFT-Methode besteht darin, Keime mit Fluoreszenzfarbstoffen anzufärben, eine Fluoreszenz bei diesen Keimen hervorzurufen und das abgestrahlte Fluoreszenzlicht zu messen. Im Vergleich zum ATP- und Impendanz-Verfahren hat die DEFT-Methode den entscheidenden Vorteil, daß die keimhaltige Probe vor oder nach der Anfärbung filtriert wird. Durch diesen Anreicherungsschritt kann die auch in der Literatur beschriebene Nachweisgrenze auf eine KBE pro ml gesenkt werden. Hinzu kommt, daß mit Hilfe der DEFT-Methode sowohl lebende als auch tote Keime angefärbt werden können. Gerade der Nachweis von Totkeimen spielt bei der Beurteilung des Hygienestatus von Produktionsanlagen (z. B. Biofilmbildung) eine sehr wichtige Rolle. Außerdem kann das Analyseprocedere, d. h. die Filtration und die Anfärbung, innerhalb von ca. 30 Minuten durchgeführt werden. Grundvoraussetzung für die DEFT-Methode ist die Filtrierbarkeit des zu untersuchenden Produkts.
Die Detektion der von den Keimen emittierten Fluoreszenzstrahlung kann auf verschiedene Arten erfolgen: Das am weitesten verbreitete Verfahren ist der Einsatz eines Fluoreszenzmikroskops. Der Membranfilter mit den angefärbten Keimen wird Gesichtsfeld für Gesichtsfeld abgerastert. Dabei wird die Zahl angefärbter Keime vom Mikroskopierenden mit dem bloßen Auge erfaßt und addiert. Diese Vorgehensweise erfordert einerseits ein hohes Maß an mikroskopischer und mikrobiologischer Erfahrung, da eine klare Differenzierung zwischen tatsächlichen Keimen und unvermeidbar auftretenden Fremdpartikeln ähnlicher Größe und Fluoreszenz für den Laien oft sehr schwierig ist. Darüber hinaus stellt dieses Verfahren hohe Anforderungen an die Konzentrationsfähigkeit des Anwenders, weil die Keime auf den nicht ideal planaren Membranfiltern in verschiedenen Tiefenebenen erscheinen und überlappende Gesichtsfelder ohne Doppelzählung klar erkannt werden müssen.
Dem Ziel, dieses Auswerteprocedere zu automatisieren und somit Fehler durch den Bediener weitestgehend auszuschließen, kam man in der Vergangenheit dadurch näher, daß folgende Bestandteile eines Fluoreszenzmikroskops verändert wurden: Der manuell verstellbare Probenhaltertisch wurde durch eine ansteuerbare x,y,z-Einheit ersetzt, die eine Probe automatisiert und genau definiert positionieren kann. Statt des Okulars, das dem Mikroskopierenden zum Betrachten des Objekts dient, werden diverse Kamerasysteme eingesetzt. Diese ermöglichen einerseits eine visuelle Inspektion auf einem Bildschirm, und andererseits liegen digitalisierte Daten vor, die im Nachhinein, z. B. mit Hilfe von Bilderkennungsalgorithmen, analysiert werden können. Weitere Änderungen ergaben sich auch auf Seiten der Lichtquellen zur Fluoreszenzanregung: Neben Weißlichtquellen werden zunehmend leistungsstarke Laser verwendet; diese haben den Vorteil einer sehr definierten Wellenlänge des Anregungslichts, wodurch auf optische Filter nahezu verzichtet werden kann.
Ein simpleres Verfahren, das zwar auf der DEFT-Methode beruht, aber ohne Mikroskop auskommt, ist in der EP 0 713 087 A1 beschrieben. Die EP 0 713 087 A1 beschreibt einen Aufbau und ein Verfahren, bei dem sich angefärbte Keime auf einem festen Trägermaterial befinden. Dieses wird mit einem Laser zeilenförmig abgerastert, wobei die Detektion der emittierten Fluoreszenz bei mindestens einer Wellenlänge erfolgt. Im Vergleich zur klassischen Mikroskopie ermöglicht dieses Verfahren eine deutlich schnellere Analyse, die zudem vollständig automatisiert abläuft. Anhand des beschriebenen Auswertealgorithmus ist diese Methode - obwohl es sich um kein bildgebendes Verfahren im eigentlichen Sinn handelt - in der Lage, Partikel zu zählen, deren Größe zu bestimmen und unter Hinzuziehung der spektralen Charakteristik der einzelnen Teilchen absolute Keimzahlen von weniger als 100 zu detektieren.
Eine Veröffentlichung der Applied Spectral Imaging, Inc. beschreibt ein Verfahren zur Analyse von FISH-Proben (FISH = Fluorescence in situ hybridisation), das man als eine Art "ortsaufgelöste Spektroskopie" bezeichnen kann (vgl. D. G. Soenksen et al. "Multicolor FISH using a novel spectral bio-imaging System", Proceedings of SPIE (International Society for Optical Engineering), 2678 (1996), Seiten 303 bis 309). Mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops wird eine farbstoffmarkierte Probe abgerastert und das Bild nach einer Kombination aus Fourier-Transform-(FT)-Spektroskopie mit einer CCD-Kamera pixelweise ausgewertet. So erhält man für jedes Pixel des digitalen Bildes ein komplettes Spektrum vom ultravioletten Bereich bis in den nahen Infrarot-Bereich. Im Gegensatz zu Methoden, bei denen mit unterschiedlichen Filtern gearbeitet wird (siehe z. B. auch I. Ravkin et al." Automated microscopy System for detection and genetic characterization of fetal nucleated red blood cells on slides", Proceedings of SPIE (International Society for Optical Engineering), 3260 (1998), Seiten 180 bis 191) steht so eine viel größere Anzahl von Wellenlängen zur Differenzierung zwischen Keimen und Autofluoreszenz/Fremdpartikeln zur Verfügung. Darüber hinaus ermöglicht die FT-Spektroskopie eine zügige Betrachtung der Proben. Nachteilig wirkt sich jedoch die riesige Menge an Daten und deren komplexe Analyse aus.
Das bei I. Ravkin et al., loc. cit, beschriebene Verfahren zur Untersuchung von Zellen ist nur für die Akquisition der Bilder automatisiert; die nachfolgende Auswertung des Bildmaterials erfolgt durch den Bediener. Zur besseren Unterscheidung des von den Teilchen abgestrahlten Fluoreszenzlichts wird ein Filterrad eingesetzt. Dieses Filterrad kann in Abhängigkeit von den zur Anfärbung gewählten Fluoreszenzfarbstoffen konfiguriert werden. Außerdem erläutert diese Referenz ein mögliches Verfahren zur Einstellung eines Autofokus.
Dem für eine erfolgreiche Automatisierung in der Analyse keimhaltiger Proben auf festen Trägern, wie Membranfiltern, wichtigen Aspekt der Autofokuseinstellung widmen sich auch J. Pernthaler et al. "Automated Enumeration of Groups of Marine Picoplankton after Fluorescence In Situ Hybridisation", Appl. Environ. Microbiol., 69 (2003), Seiten 2631 bis 2637. Zum Auffinden des Fokus schlagen die Autoren eine "doppelte Autofokus-Strategie" vor. In einem ersten Schritt wird zunächst der grobe Fokus mit "normal" einfallendem Licht zwischen zwei voneinander unabhängigen Filterstücken eingestellt. Die Autofokussierung verschiedener Gesichtsfelder desselben Filters geschieht allein unter Fluoreszenzbedingungen.
Die WO 2002/064818 A1 bezieht sich auf ein extrem einfaches Vorgehen zum Nachweis von Mikroorganismen: In zwei verschiedenen baulichen Ausführungsformen werden Keime analysiert. Einerseits wird eine mit einem Vital- und Totfarbstoffgemisch versetzte Probe auf einen lichtdurchlässigen Glasträger aufgetropft und die Fluoreszenz nach einer Vergrößerung um den Faktor 220 mit einer CCD-Kamera aufgenommen. In der zweiten Ausführungsform wird die Probe in Analogie zur Durchflußcytometrie durch eine Kapillare gepumpt, mit Licht bestrahlt und das erzeugte Fluoreszenzsignal mit einer Photodiode oder einem Photomultiplier erfaßt. Ungeachtet der wenig differenzierten Betrachtung zu den in den oben zitierten Referenzen genannten Problemen automatischer Analysen, schlagen die Autoren in dieser Anmeldung als Ersatz für eine Xe-Lampe zur Bestrahlung der Probe auch LEDs (light emitting diode) vor. LEDs haben gegenüber "klassischen" Lichtquellen den Vorteil einer hohen Stabilität in der abgestrahlten Lichtleistung. Femer werden die - immer noch - vorhandenen Nachteile bezüglich der Intensität von LEDs fast jährlich durch Neuentwicklungen kompensiert.
Gerade bei FISH-Proben ergibt sich oftmals die Notwendigkeit zum Einsatz vieler verschiedener Fluoreszenzmarker. Sollen unterschiedliche DNA-Bestandteile eindeutig differenziert werden, ist der Verwendung mehrerer Farbstoffe unerläßlich. Da in diesen Fällen einzelne Filterräder oder Filterwürfel ungeeignet sind, werden zwei oder mehrere Filterwürfel so konfiguriert, daß mindestens ein Filter in beiden gleich ist. Das nun in der WO 98/17992 A2 erläuterte mathematische Verfahren ermöglicht unter Berücksichtigung zweier gleicher Filter in zwei verschiedenen Würfeln eine Angleichung der erhaltenen Datensätze vor allem hinsichtlich der Intensität des abgestrahlten Fluoreszenzlichts. Somit wird die Vergleichbarkeit von Aufnahmen mit unterschiedlichen Filterwürfeln gewährleistet.
A. Pernthaler et al. "Comparison of Fluorescently Labeled Oligonucleotide and Polynucleotide Probes for the Detection of Pelagic Marine Bacteria and Archaea", Appl. Environ. Microbiol., 68 (2992), Seiten 661 bis 667, weisen auf ein wichtiges Phänomen hin, das bei der korrekten Bestimmung der Keimzahl eine Rolle spielt, nämlich das Ausbleichen des Farbstoffs. Bei der in dieser Referenz beschriebenen Untersuchung an Plankton-Proben, die mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern versetzt und ausgezählt wurden, hat sich gezeigt, daß vermeintliche Mindergehalte durch ein schnelleres Ausbleichen eines Farbstoffs im Vergleich zu anderen Fluoreszenzsonden erklärt werden können.
Die US 6 122 396 A führt einige der zuvor genannten apparativen und softwaretechnischen Lösungen zu einem Aufbau zusammen. Die Kombination aus Fluoreszenzmikroskop, LED-Beleuchtung und Videokamera wird mit einem spezifischen Bildauswertealgorithmus gekoppelt. In diesem Algorithmus ist ein Referenz-("Trainings-")Datensatz hinterlegt, anhand dessen eine eindeutige Unterscheidung zwischen Mikroorganismen und Fremdpartikeln erfolgt. Parameter, die diesen Referenzdatensatz charakterisieren, sind Morphologie und "Brillanz" der Fluoreszenzstrahlung in einem bestimmten Wellenlängenbereich.
Bei der Untersuchung lebender Zellen unter Verwendung von Farbstoffen rückte in der Vergangenheit die FLIM-Methode (fluorescence Hfetime imaging microscopy) in den Mittelpunkt des Interesses. Statt mit ganzen Zellen können ähnliche Experimente auch mit FISH-Proben durchgeführt werden. H. J. Tanke et al. "Use of Platinum Coproporphyrin and Delayed Luminescence Imaging to Extend the Number of Targets FISH Karyotyping", Cytometry 33 (1998), Seiten 453 bis 459, beschreiben eine Methode, bei der durch Messung der Fluoreszenzlebensdauem - also eigentlich eine Lumineszenzmessung - von unterschiedlichen Farbstoffen letztlich auf die Anwesenheit bestimmter DNA- Fragmente zurückgeschlossen werden kann. Je nach Hybridisierung ergeben sich so für DNA-Fragmente charakteristische Intensitäts- und Lebensdauerwerte.
Die sogenannte Membranfilter-Mikrokolonie-Fluoreszenz-Methode (MMCF- Methode, siehe z. B. J. Baumgart, Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln, Behr's Verlag 1993, 3. Auflage, Seiten 98 ff.) sieht die Vorbereitung der Probe bzw. der in der Probe vorhandenen Keime auf einem Membranfilter vor. Nachteilig ist dabei, daß eine zeitaufwendige Voranreicherung der Keime vorangehen muß, der Membranfilter für die anschließende Epifluoreszenzmikroskopie vorbehandelt werden muß (Befeuchtung mit speziellen Medien, Dimensionierung und Trocknung) und die Zahl der Keime durch Auszählung der fluoreszenzmarkierten Kolonien unter einem Epifluoreszenzmikroskop oder einer UV-Lampe erfolgen muß.
Einige der zuvor beschriebenen Technologien liefern zwar innerhalb weniger Stunden ein Ergebnis, sie sind aber im allgemeinen sehr aufwendig hinsichtlich der erforderlichen Nachweisgeräte und der nötigen Kenntnisse des Benutzers. Aus diesem Grund haben sich diese Verfahren bisher nicht in ausreichendem Maße im Routineeinsatz etabliert. Weiterhin weisen die einzelnen Methoden Einschränkungen im Hinblick auf Spezifität und Sensitivität auf. Des weiteren besitzen einige der zuvor beschriebenen Methoden eine zu hohe Keimnachweisgrenze, so daß auf eine vorangehende Kultivierung oftmals nicht verzichtet werden kann.
Bei den herkömmlichen Kultivierungsmethoden und bei "Schnellnachweismethoden" mit entsprechenden Anreicherungsschritten sind außerdem durch die Arbeitsweise grundsätzliche Nachteile vorhanden: Die Auswahl der Nährmedien spielt eine entscheidende Rolle, welche Mikroorganismen vermehrt werden können. Selektive Nährmedien bieten hier Vorteile. Aber auch diese können nur die Mikroorganismen vermehren, die physiologisch dazu in der Lage sind. Laut neuesten Erkenntnissen sind jedoch nur 5 % der Mikroorganismen kultivierbar. Daher entstehen mit den konventionellen Methoden oft unzutreffende, negative Ergebnisse, obwohl eine tatsächliche Verkeimung der Probe vorliegt. Darüber hinaus ist die Aussagekraft der Analytik durch die zur Verfügung stehende Zeit begrenzt. Nach Abschluß der Anreicherungszeit müssen alle Keime sich soweit vermehrt haben, daß sie sichtbar geworden sind. Bei verzögertem Anwachsen durch ungünstige Probenahme- oder Anzuchtbedingungen kann es somit zu irrtümlich negativen Ergebnissen kommen. Deshalb erfordert die Durchführung der herkömmlichen Kultivierungsverfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen oft mehrere Tage, so daß die mikrobiologischen Ergebnisse aber oftmals zu spät kommen, um noch einen regulativen Eingriff in den Produktionsprozeß zu ermöglichen. Mit Nachweisverfahren mittels Kultivierung der Keime lassen sich nur vitale, vermehrungsfähige Keime nachweisen. Oftmals hat aber die bestehende Produktkonservierung Kontaminanten abgetötet. Die im Produkt vorliegenden "toten" Keime lassen sich auf diese Weise jedoch nicht nachweisen, so daß mögliche Hygieneprobleme bei der Produktion oder bei der Abfüllung nicht bemerkt werden bzw. erst dann, wenn Störfälle eintreten, d. h. nach Versagen der Konservierung.
Der Nachweis sehr geringer Keimgehalte, insbesondere unterhalb von 100 KBE pro ml, erfordert entweder eine Wartezeit im Bereich von mehreren Stunden (Impendanz- oder Biolumineszenzverfahren) oder Tagen (Platten-Kultur-Methode) oder aber mikroskopische Verfahren, die langwierig, teuer und ermüdend (vor allen für das menschliche Auge) sind sowie eingewiesenes Fachpersonal erfordern.
Automatisierte Keimnachweise für sehr kleine Keimzahlen wurden technisch schon teilweise realisiert, haben jedoch Nachteile. Bei Durchflußcytometer muß zur Analyse einer größeren Probenmenge (mehrere Milliliter) lange gewartet werden, da die Kapillaren, durch die die Keime fließen, entsprechend dimensioniert sind. Außerdem führt die Verwendung dieser Kapillaren bei höherviskosen Medien zum Verstopfen, und tensidhaltige Produkte erschweren durch Schaum- bzw. Blasenbildung die Analyse.
Beim automatisierten Nachweis von Keimen auf festen Trägern (z. B. Membranfilter) besteht das Hauptproblem einerseits in einer Fokussierung der Objektebene und andererseits in der eindeutigen Unterscheidung zwischen "tatsächlichen" Keimen und unvermeidbar auftretenden Störpartikeln mit Eigenfluoreszenz.
Die auf die Anmelderin selbst zurückgehende DE 102 59 302 A1 bzw. die zu derselben Patentfamilie gehörende WO 2004/055203 A1 beschreibt ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe, welches einen Verfahrensschritt (a) der Probenaufbereitung mit einer Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers und einen Verfahrensschritt (b) der quantitativen und/oder qualitativen Detektion und/oder Auswertung umfaßt, wobei die in Verfahrensschritt (b) durchgeführte Detektion und/oder Auswertung fluoreszenzreflexionsphotometrisch erfolgt. Da die fluoreszenzmarkierten Keime nur relativ kurze Zeit einer Bestrahlung ausgesetzt sind, weil die Meßwerte fluoreszenzreflexionsphotometrisch relativ schnell erfaßt werden, wird zwar ein Ausbleichen ("bleaching effect") des Fluoreszenzmarkers und somit eine Verfälschung des Meßergebnisses weitestgehend vermieden; jedoch ermöglicht dieses Verfahren nicht immer eine ausreichend zuverlässige Bestimmung bei extrem geringen Keimkonzentrationen, da Fremd- bzw. Störsignale nicht immer ausreichend von den durch die fluoreszenzmarkierten Keimen generierten Meßsignalen diskriminiert bzw. unterschieden werden können.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art, welches sich zur quantitativen bzw. qualitativen Bestimmung von Keimen eignet und insbesondere die zuvor geschilderten Nachteile zumindest teilweise vermeidet, und eine entsprechende Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit - gemäß einem ersten Aspekt - ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe mittels Fluoreszenzmarkierung und nachfolgender Detektion und/ oder Auswertung, wobei die Detektion und/oder Auswertung durch Erfassung und/oder Messung der Fluoreszenzemission erfolgt, wobei die fluoreszenzmarkierten Keime für eine definierte Zeitdauer kontinuierlich einer Anregungsstrahlung einer definierten Wellenlänge oder eines definierten Wellenlängenbereichs ausgesetzt und der zeitabhängige Verlauf der infolge der Anregung erzeugten Fluoreszenzemissionsstrahlung erfaßt wird, so daß eine Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignaien andererseits ermöglicht wird.
Genauer gesagt ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung - ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe, wobei das Verfahren einen Verfahrenschritt (a) der Probenaufbereitung und einen Verfahrensschritt (b) der Detektion und/oder Auswertung umfaßt, wobei in Verfahrensschritt (a) eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkes erfolgt und in Verfahrensschritt (b) eine quantitative und/oder qualitative Detektion und/oder Auswertung erfolgt, wobei die in Verfahrensschritt (b) durchgeführte Detektion und/oder Auswertung durch Erfassung und/oder Messung der Fluoreszenzemission erfolgt, wobei in Verfahrensschritt (b) die in Verfahrensschritt (a) aufbereitete Probe mit den fluoreszenzmarkierten Keimen für eine definierte Zeitdauer kontinuierlich einer Anregungsstrahlung einer definierten Wellenlänge oder eines definierten Wellenlängenbereichs ausgesetzt und der zeitabhängige Verlauf der infolge der Anregung erzeugten Fluoreszenzemissionsstrahlung erfaßt wird, so daß eine Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits ermöglicht wird und auf diese Weise eine quantitative und/oder qualitative Bestimmung der fluoreszenzmarkierten Keime in der Probe erfolgt.
Ein wesentlicher Gedanke der vorliegenden Erfindung ist somit darin zu sehen, daß der zeitabhängige Verlauf der Fluoreszenzemissionsstrahlung bei kontinuierlicher Beleuchtung bzw. Bestrahlung durch die Anregungslichtquelle erfaßt wird und auf diese Weise eine Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits ermöglicht wird. Denn, wie die Anmelderin überraschenderweise herausgefunden hat, zeigen die auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignale einen anderen zeitabhängigen Verlauf der Fluoreszenzemission als die Störsignale, so daß eine Zuordnung der erfaßten bzw. gemessenen Fluoreszenzemissionen auf diese Weise möglich ist, d. h. eine Diskriminierung zwischen Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits ermöglicht wird. Wie die Anmelderin überraschenderweise herausgefunden hat, bleichen fluoreszenzmarkierte Keime im allgemeinen schneller aus als fluoreszierende Fremdpartikel, so daß dieser Effekt für die Zuordnung der Fluoreszenzemissionssignale genutzt werden kann. Auf diese Weise gelingt eine effiziente Differenzierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits, und zwar auch dann, wenn die Keimanzahl in der Probe äußerst gering ist und folglich die Anzahl der auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignale wesentlich geringer ist als die Anzahl der Störsignale (z. B. um den Faktor 1.000 oder mehr). Auf diese Weise ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine relativ einfache, wenig aufwendige Detektion bzw. Auswertung, weil die fluoreszenzmarkierten Keime hierzu im wesentlichen keiner weiteren Aufbereitung bedürften. Insbesondere entfällt ein zeit- und arbeitsaufwendiger Verfahrensschritt der (Vor-)Anreicherung von Keimen, d. h. die erfindungsgemäße Detektion bzw. Auswertung liefert direkt die "authentische" bzw. in der Probe vorhandene Keimzahl.
Unter dem Begriff "zeitabhängiger Verlauf der Fluoreszenzemissionsstrahlung", wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird insbesondere der zeitabhängige Verlauf der Intensität der detektierten bzw. beobachteten Fluoreszenzemission bezeichnet. Hierbei handelt es sich um kein Lumineszenphänomen, da dort erst nach dem Abschalten der Anregungslichtquelle die Intensität der Fluoreszenz verfolgt wird.
Der Begriff "Störsignale" bezeichnet alle detektierten bzw. gemessenen Fluoreszenzemissionssignale, welche nicht auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehen. Solche Störsignale können beispielsweise durch Fremdstoffe mit intrinsischer Fluoreszenz, insbesondere Kunststoffpartikel, in der Probe erzeugt werden, aber auch durch unspezifische Bindungen des Fluoreszenzmarkers an Fremdpartikel oder aber auch durch Verunreinigungen aufgrund von freien, z. B. nicht ausgewaschenen Fluoreszenzmarkern.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht grundsätzlich sowohl die qualitative wie auch die quantitative Bestimmung von Keimen in einer Probe, d. h. sowohl die Bestimmung der Art bzw. Spezies von Keimen überhaupt als auch deren Anzahl bzw. deren Konzentration. Insbesondere wird das erfindungsgemäße Verfahren derart durchgeführt, daß der zeitabhängige Verlauf der infolge der Anregung erzeugten Fluoreszenzemissionsstrahlung dahingehend erfaßt wird, daß die Kinetik des Abbaus bzw. Ausbleichens des Fluoreszenzmarkers bzw. der fluoreszenzmarkierten Keime (d. h. Fluoreszenzmarker mit Bindung an die Keime beim Nachweis von toten Keimen bzw. Fluoreszenzmarker, die durch den Metabolismus lebender Keime umgewandelt werden) erfaßt wird. Wie zuvor geschildert, nutzt man im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens die überraschende Erkenntnis bzw. Tatsache, daß die fluoreszenzmarkierten Keime ein anderes Abbau- bzw. Ausbleichverhalten des Fluoreszenzmarkers aufweisen als Fremd partikel, insbesondere im allgemeinen schneller ausbleichen als Fremdpartikel. Über die Erfassung der Kinetik des Abbaus und/oder des Ausbleichens des Fluoreszenzmarkers läßt sich - in Abgleichung mit den Störsignalen - eine Zuordnung der detektierten bzw. erfaßten Fluoreszenzemissionssignale zu den zu bestimmenden Keimen einerseits und den Störsignalen andererseits realisieren, so daß eine gezielte Diskriminierung bzw. Differenzierung ermöglicht wird, die eine zuverlässige quantitative und/oder qualitative Bestimmung der fluoreszenzmarkierten Keime - auch bei extrem geringen Konzentrationen - ermöglicht.
Die Erfassung der Kinetik des Abbaus und/oder Ausbleichens de?" Fluoreszenzemissionssignale bzw. des Fluoreszenzmarkers und der hiermit markierten Keime erfolgt im allgemeinen über die Erfassung des zeitabhängigen Verlaufs der Intensitäten der Fluoreszenzemissionssignale.
Auf Basis der durch Fluoreszenzemission ermittelten Meßwerte kann dann die in der Probe vorhandene Zahl an Keimen bestimmt werden, gegebenenfalls mittels7 geeigneter Kalibrierung. v„^-
Die Formulierung "Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime" meint insbesondere folgendes: Je nachdem, ob nur spezielle in der Probe vorhandene Keime bzw. Keimarten oder aber sämtliche in der Probe vorhandenen Keime bestimmt werden sollen, markiert man im ersteren Fall gezielt nur ein speziellen Teil der in der Probe vorhandenen Keime (im allgemeinen mit keimspezifischen Fluoreszenzmarkern), während man im letzteren Fall sämtliche in der Probe vorhandenen Keime markiert (im allgemeinen mit keimunspezifischen Fluoreszenzmarkern oder aber einer Mischung verschieden keimspezifischer Fluoreszenzmarker).
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich dann aufgrund der ermittelten Meßwerte, gegebenenfalls mittels geeigneter Kalibrierung, die in der Probe vorhandene Zahl an Keimen bestimmen (und zwar im Fall der Fluoreszenzmarkierung sämtlicher in der Probe vorhandenen Keime die Gesamtzahl aller in der Probe vorhandenen Keime und im Fall der Fluoreszenzmarkierung nur spezieller Keime deren Gesamtzahl). Wie im folgenden noch erläutert, ermöglicht der Einsatz keimspezifischer Fluoreszenzmarker darüber hinaus auch eine qualitative Aussage in bezug auf das Vorhandensein spezieller Keime in der Probe.
Die Reproduzierbarkeit bzw. Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich noch weiter dadurch erhöhen, daß in mindestens zwei zeitlich aufeinanderfolgenden Intervallen die Fluoreszenzstrahlung bei jeweils voneinander unterschiedlichen, aber jeweils definierten Wellenlängen oder Wellenlängenbereichen von der aufbereiteten Probe mit den fluoreszenzmarkierten Keimen detektiert wird.
Eine weitere Steigerung der Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich dadurch erreichen, daß zusätzlich eine Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignale einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits über die Analyse der Fluoreszenzcharakteristik erfolgt. Dabei wird insbesondere das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen, aber definierten Wellenlängen oder Wellenlängenbereichen erfaßt, so daß eine zuverlässige Diskriminierung zwischen auf die zu bestimmenden Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits ermöglicht wird. Die Wellenlänge bzw. der Wellenlängenbereich der Anwendungsstrahlung sollte auf die Fluoreszenzcharakteristik des Fluoreszenzmarkers bzw. der fluoreszenzmarkierten Keime abgestimmt sein, insbesondere auf deren Absorptionsmaxima in bezug auf die Fluoreszenzemission.
Die Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch dadurch noch weiter erhöht werden, daß - zusätzlich zu der Diskriminierung über die Erfassung des zeitabhängigen Verlaufs der Fluoreszenzemissionsstrahlung - eine Diskriminierung über die Größe und/oder Form der emittierenden Partikel erfolgt, was beispielsweise im Rahmen automatisierter Bilderfassungsverfahren erfolgen kann. Über die Erfassung der Größe und/oder Form der emittierenden Partikel ergibt sich - zusammen mit der Beurteilung des zeitabhängigen Verlaufs - ein weiteres Kriterium für eine zuverlässige Zuordnung zu Stör- bzw. Fremdpartikeln einerseits und zu den zu bestimmenden Keimen andererseits. Da die nachzuweisenden Keime im allgemeinen kleiner als 6 μm sind, können alle größeren Signale vernachlässigt werden. In diesem Zusammenhang ist auch die Form zu sehen; denn im allgemeinen ist das Verhältnis der Hauptachsen bei Keimen unter der erfindungsgemäßen Verwendung eines 10fach- oder 20fach- Mikroskopobjektivs näherungsweise 1 : 1 , d. h. die Keime erscheinen - mit Ausnahme der Hyphenform eines Pilzes - als runde Gebilde. Partikel, die dagegen ein anderes Hauptachsenverhältnis aufweisen, werden somit außer acht gelassen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits dreistufig, d. h. unter Anwendung aller drei zuvor genannten Diskriminierungsmethoden, nämlich sowohl über die Erfassung des zeitabhängigen Verlaufs der Fluoreszenzemissionsstrahlung als auch über die Größe und/oder Form der emittierenden Partikel sowie schließlich über die Analyse der Fluoreszenzcharakteristik. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. die Detektion und/oder Auswertung werden die zu bestimmenden Keime im allgemeinen auf einem Träger aufgebracht bzw. fixiert. Zumindest für die Dauer der Messung liegen die zu bestimmenden Keime auf diese Weise in sozusagen immobilisierter Form insofern vor, als sie auf dem Träger befindlich fixiert sind und ihre Position nicht ändern können, so daß eine zuverlässige Signalzuordnung möglich ist.
Die Probenaufbereitung erfolgt im allgemeinen, wie dies in den auf die Anmelderin selbst zurückgehenden Druckschriften DE 102 59 302 A1 und WO 2004/055203 A1 beschrieben ist, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Im allgemeinen werden die fluoreszenzmarkierten Keime bei der im Verfahrensschritt (a) durchgeführten Probenaufbereitung auf einem vorzugsweise porösen Träger (z. B. einen Membranfilter, wie beispielsweise einem Polycarbonatmembranfilter, oder einem Siliciummikrosieb) aufgebracht, wobei der Träger vorzugsweise porös ausgebildet ist. Der Träger, insbesondere Membranfilter oder Siliciummikrosieb, sollte im allgemeinen derart ausgebildet sein, daß er die Keime zurückhält bzw. in bezug auf die Keime undurchlässig ist. Zu diesem Zweck sollte die Größe der Poren des Trägers so gewählt sein, daß die Porengröße kleiner als die Größe der in der Probe vorhandenen Keime ist. Als poröse Trägermaterialien können erfindungsgemäß beispielsweise Membranfilter verwendet werden, beispielsweise Membranfilter auf Basis von Polycarbonat, PTFE, Polyestem, Cellulose und Cellulosederivaten, wie Celluloseacetat, regenerierter Cellulose, Nitrocellulose oder Cellulosemischester. Erfindungsgemäß geeignete Membranfilter werden beispielsweise von der Firma Macherey-Nagel vertrieben (z. B die "PORAFIL®"-Serie). Als poröser Träger kann auch ein Siliciummikrosieb verwendet werden, welches eine besonders glatte und ebenmäßige Oberfläche aufweist, weshalb sich darauf befindliche Keime noch besser detektieren lassen; ferner ist die Reinigung solcher Siebe relativ einfach zu bewerkstelligen, und solche Siebe sind mehrfach verwendbar, darüber hinaus besitzen die Siliciummikrosiebe eine gute Biokompatibilität und eine starre Struktur, die erhebliche Vorteile bei ihrer Handhabung bewirkt. Der Einsatz eines porösen Trägers, insbesondere Membranfilters oder Siliciummikrosiebs, bietet den Vorteil, daß die Detektion bzw. Auswertung insbesondere ohne weitere Probenbehandlung, -aufbereitung, -Übertragung oder dergleichen (d. h. insbesondere ohne Voranreichung) unmittelbar auf dem porösen Träger erfolgen kann.
Vorteilhafterweise wird der in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Fluoreszenzmarker derart ausgewählt wird, daß er membrangängig in bezug auf den bei der in Verfahrensschritt (a) durchgeführten Probenaufbereitung verwendeten Träger, insbesondere Membranfilter oder Siliciummikrosieb, ist. Dies hat den Vorteil, daß bei der Detektion bzw. Auswertung keine durch überschüssige Fluoreszenzmarker verursachten Störsignale bzw. kein Hintergrundrauschen auftritt und folglich ein günstiges Signal/Hintergrund- Verhältnis bzw. Signal/Rausch-Verhältnis erzielt wird.
Die Durchführung der Fluoreszenzmarkierung der in der Probe vorhandenen Keime in Verfahrensschritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in an sich bekannter Weise durchgeführt. Dies ist dem Fachmann ohne weiteres geläufig. Beispielsweise können zu diesem Zweck die zu markierenden Keime mit einer Lösung oder Dispersion der im Überschuß in bezug auf die vorhandenen Keime vorliegenden Fluoreszenzmarker in Kontakt gebracht werden, wobei die Kontaktzeit ausreichend sein muß, um eine vollständige Fluoreszenzmarkierung aller Keime zu gewährleisten, die bei diesem Verfahrensschritt markiert werden sollen (je nach Auswahl des Fluoreszenzmarkers z. B. sämtliche in der Probe vorhandenen Keime oder aber sämtliche Keime nur einer oder mehrerer Keimarten). Nach der eigentlichen Fluoreszenzmarkierung können dann die überschüssigen Fluoreszenzmarker entfernt bzw. von den fluoreszenzmarkierten Keimen abgetrennt werden. Dies kann im Fall der Verwendung eines porösen Trägers, insbesondere Membranfilters oder Siliciummikrosiebs, der membrangängig in bezug auf die Fluoreszenzmarker, aber undurchlässig in bezug auf die Keime ist, beispielsweise dadurch geschehen, daß man (z. B. durch Anlegen von Überdruck oder Unterdruck) die Lösung bzw. Dispersion der überschüssigen Fluoreszenzmarker über den porösen Träger abführt und gegebenenfalls das Ganze mit Wasser, Pufferlösungen oder anderen Flüssigkeiten nachspült, so daß auf dem Träger schließlich nur noch die fluoreszenzmarkierten Keime (gegebenenfalls zusammen mit den Keimen, die gezielt unmarkiert geblieben sind) verbleiben. Dies ermöglicht dann eine sich ohne weiteres in Verfahrensschritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens anschließende Detektion bzw. Auswertung.
Gegebenenfalls kann der Verfahrensschritt (a) der Probenaufbereitung auch eine Inaktivierung und/oder Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden und/oder keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen (z. B. Konservierungsstoffe, Tenside etc.) umfassen. Dies verhindert, daß die späteren Meßergebnisse dadurch verfälscht werden, daß ein Teil der Keime während der Probenaufbereitung oder Messung durch die keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen abgetötet bzw. inaktiviert werden und somit eine fälschlich zu geringe Keimzahl bestimmt wird. Auf diese Weise wird eine Bestimmung der Keimzahl auch in Proben mit keimhemmenden und/oder keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen (z. B. Konservierungsstoffe, Tenside etc.) ermöglicht, so daß das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise auch bei Tensid- und Dispersionsprodukten angewendet werden kann.
Der je nach Art der Probe nur gegebenenfalls durchgeführte Verfahrensschritt der Inaktivierung bzw. Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen wird vorteilhafterweise vor der Fluoreszenzmarkierung, vorzugsweise unmittelbar nach der Probenahme bzw. unmittelbar zu Beginn der in Verfahrensschritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführten Probenaufbereitung ausgeführt; auf diese Weise ist sichergestellt, daß die keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen, Bestandteile, Inhaltsstoffe und dergleichen im wesentlichen noch keine Änderung der in der ursprünglichen Probe vorhandenen Keimzahl bewirkt haben können. Gleichermaßen, wenn auch weniger bevorzugt, ist es möglich, die Inaktivierung bzw. Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen nach der Fluoreszenzmarkierung durchzuführen. Ebenfalls ist es möglich, die Fluoreszenzmarkierung und die Inaktivierung bzw. Entfernung der keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen gleichzeitig durchzuführen.
Der je nach Art der Probe nur gegebenenfalls durchgeführte Verfahrensschritt der Inaktivierung bzw. Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen erfolgt in an sich bekannter Weise. Beispielsweise kann auf den Beitrag von Stumpe et al. "Chemolumineszenz-basierte Direktnachweise von Mikroorganismen - Ein Erfahrungsbericht aus der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie" auf den Seiten 317 bis 323 des Tagungsbandes "HY-PRO 2001 , Hygienische Produktionstechnologie/Hygienic Production Technology", 2. Internationaler Fachkongreß und Ausstellung, Wiesbaden 15.-17.5.2001 und die in diesem Beitrag angegebene Literatur verwiesen werden; der gesamte Inhalt dieses Beitrags einschließlich des Inhalts der dort genannten Literatur wird hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen. Im allgemeinen kann dies dadurch erfolgen, daß die zu analysierende Probe mit einer geeigneten Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung in Kontakt gebracht wird. Solche Inaktivierungs- bzw. Konditionierlösungen sind dem Fachmann an sich bekannt (z. B. wäßrige THL- Konditionierlösung, TLH = Tween-Lecithin-Histidin). Erfindungsgemäß geeignete wäßrige Inaktivierungs- bzw. Konditionierlösungen können beispielsweise neben TLH (z. B. Polysorbat 80 = Tween 80, Soyalecithin und L-Histidin) auch noch Puffersubstanzen (z. B. Phosphatpuffer, wie Hydrogenphosphat und/oder Dihydrogenphosphat), weitere Salze (z. B. Natriumchlorid und/oder Natriumthiosulfat) und Trypton (Pepton aus Casein) enthalten.
Eine erfindungsgemäß besonders geeignete Inaktivierungs- bzw. Konditionierlösung hat die folgende Zusammensetzung:
- Trypton 1 ,0 g
- Natriumchlorid 8,5 g
- Natriumthiosulfatpentahydrat 5,0 g
- 0,05 M Phosphatpufferlösung 10 ml
- TLH-Wasser ad 1000 ml. Das erfindungsgemäß einsetzbare TLH-Wasser hat insbesondere folgende Zusammensetzung:
- Polysorbat 80 (Tween 80) 30,0 g
- Soyalecithin 3,0 g
- L-Histidin 1 ,0 g
- Vollentsalztes Wasser ad 1000 ml.
Die erfindungsgemäß einsetzbare Phosphatpufferlösung hat insbesondere folgende Zusammensetzung:
- Kaiiumdihydrogenphosphat 6,8045 g
- Dikaliumhydrogenphosphat 8,709 g
- Vollentsalztes Wasser ad 1000 ml.
Die Auswahl an Fluoreszenzmarker(n) ist nicht kritisch. Hier können, je nach Anwendung und Art der Keime, die aus dem Stand der Technik an sich bekannten Fluoreszenzmarker verwendet werden, sofern sie sich zur Verwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen.
Der Begriff "Fluoreszenzmarker" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung sehr breit verstanden und meint insbesondere jeden Fluoreszenzmarker, der derart ausgebildet ist, daß er mit den Keimen in Wechselwirkung tritt, beispielsweise an die Keime, insbesondere an deren Zellwand (Hülle) und/oder Nukleinsäure, anbindet und/oder von den Keimen aufgenommen, insbesondere metabolisiert und/oder enzymatisch umgesetzt wird.
Bei dem erfindungsgemäß eingesetzten Fluoreszenzmarker kann es sich beispielsweise um einen keimunspezifischen Fluoreszenzmarker oder ein Gemisch keimunspezifischer Fluoreszenzmarker handeln. Dies ermöglicht eine relativ kostengünstige Fluoreszenzmarkierung aller in der Probe vorhandenen Keime und somit eine relativ schnelle Bestimmung der Gesamtkeimzahl in der Probe. Insbesondere für den Fall, daß selektiv nur spezielle Keime qualitativ und quantitativ erfaßt werden sollen, kann als Fluoreszenzmarker ein keimspezifischer Fluoreszenzmarker oder ein Gemisch verschieden keimspezifischer Fluoreszenzmarker eingesetzt werden.
Gleichermaßen kann als Fluoreszenzmarker ein Gemisch keimunspezifischer und keimspezifischer Fluoreszenzmarker eingesetzt werden.
Beispielsweise kann als Fluoreszenzmarker auch ein mit lebenden Keimen in Wechselwirkung tretender Fluoreszenzmarker eingesetzt werden. Gleichermaßen kann als Fluoreszenzmarker auch ein mit "toten" Keimen in Wechselwirkung tretender Fluoreszenzmarker eingesetzt werden.
Ebenfalls ist es möglich, als Fluoreszenzmarker ein Gemisch von mit lebenden Keimen in Wechselwirkung tretenden Fluoreszenzmarkern und mit "toten" Keimen in Wechselwirkung tretenden Fluoreszenzmarkern einzusetzen. Auf diese Weise kann eine lebend/tot-Differenzierung der in der Probe vorhandenen Keime erreicht werden. Solche Gemische sind aus dem Stand der Technik an sich bekannt (siehe beispielsweise Stumpe et al„, loc. cit., und das dort genannten System der Firma EasyProof Laborbedarf GmbH, Voerde).
Das zuvor genannte Markersystem der Firma EasyProof Laborbedarf GmbH wurde ursprünglich für die Brauereiindustrie eingeführt (Eggers et al., Brauindustrie 6, 34-35, 2001). Dabei wird eine nichtfluoreszierende Vorstufe (d. h. ein Vorläufer oder Precursor) eines Fluoreszenzmarkers in eine intakte mikrobielle Zelle aufgenommen und durch enzymatische Aktivität (Esterase) innerhalb der Zelle (im Cytoplasma) in eine fluoreszierende Verbindung umgewandelt (Grünfärbung = Lebendnachweis); damit dieser Vorgang ablaufen kann, muß eine intakte Zellmembran mit Membranpotential vorhanden sein. Der Nachweis "toter" Zellen erfolgt über die Einlagerung eines spezifischen Fluoreszenzfarbstoffes in die DNA der Zelle. Dieser Einbau kann wiederum nur bei Zellen erfolgen, die eine defekte Zellmembran aufweisen (Rotfärbung = Totnachweis). Da beide Reaktionen auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen, sind die Ergebnisse voneinander unabhängig. Diese Markierungstechnik schädigt die Zellen nicht, so daß bei der Auswertung der aktuelle mikrobiologische Status der Probe bestimmt werden kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich als Fluoreszenzmarker beispielsweise auch die in der Epifluoreszenzmikroskopie oder in der DEFT (Direkte Epifluoreszenz-Filter-Technik) oder in der MMCF (Membranfilter-Mjkro- kolonie-Fluoreszenz-Methode) üblicherweise zur Keimmarkierung verwendeten Fluoreszenzmarker einsetzen.
Beispielsweise kann als Fluoreszenzmarker ein Fluoreszenzfarbstoff oder aber eine Vorstufe eines solchen Fluoreszenzfarbstoffs, aus dem durch Wechselwirkung mit den Keimen, insbesondere durch Metabolisierung und/oder enzymatische Umsetzung, der Fluoreszenzfarbstoff generiert wird, eingesetzt werden.
Beispiele für derartige Vorstufen von Fluoreszenzfarbstoffen sind z. B. in der WO 86/05206 A1 und in der EP 0 443 700 A2 beschrieben, deren gesamter jeweiliger Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist (z. B. nichtfluoreszierendes Diacetylfluorescein, das enzymatisch zu Fluorescein umgesetzt werden kann)
Beispiele für erfindungsgemäß als Fluoreszenzmarker verwendbare Fluoreszenzfarbstoffe sind, ohne Beschränkung, z. B. 3,6-Bis[dimethylamino]acridin (Acridin- orange), 4',6-Diamido-2-phenylindol (DAPI), 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenyl- phenanthridiniumbromid (Ethidiumbromid), 3,8-Diamino-5-[3-(diethyl- methylammonio)propyl]-6-phenyl-phenanthridiniumdiiodid (Propidiumiodid),
Rhodamine wie Rhodamin B und Sulforhodamin B sowie Fluoresceiniso- thiocyanat. Für weitere Beispiele kann auch auf die EP 0 940 472 A1 oder aber auf Molecular Probes" Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5. Ausgabe, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon (P. R. Haugland, Editor, 1992) verwiesen werden, deren gesamter jeweiliger Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Des weiteren kann auch auf die einschlägigen Chemikalienkataloge verwiesen werden (z. B. Katalog Biochemikalien und Reagenzien für die Life Science Forschung der Firma Sigma- Aldrich, "Fluorescent Labeling Reagents", Ausgabe 2002/2003).
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich als Fluoreszenzmarker beispielsweise auch Nukleinsäuresonden (z. B. keimspezifische Nukleinsäuresonden) einsetzen, die ihrerseits fluoreszenzmarkiert sind, insbesondere mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem fluoreszierenden Molekül. Die fluoreszierende Gruppe oder das fluoreszierende Molekül können beispielsweise kovalent oder anderweitig an die Nukleinsäuresonde gebunden sein. Bei der erfindungsgemäß als Fluoreszenzmarker eingesetzten Nukleinsäuresonde kann es sich beispielsweise um ein fluoreszenzmarkiertes Oligo- oder Polynukleotid oder eine fluoreszenzmarkierte DNA- oder RNA-Sonde handeln. Im allgemeinen werden aus Stabilitätsgründen DNA-Sonden erfindungsgemäß bevorzugt.
Beispiele für erfindungsgemäß als Fluoreszenzmarker einsetzbare Nukleinsäuresonden sind beispielsweise die in der WO 01/85340 A2, WO 01/07649 A2 und WO 97/14816 A1 genannten Sonden, deren gesamter jeweiliger Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
So können beispielsweise als Nukleinsäuresonden die in der Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung (FISH) üblicherweise zur Markierung (DNA- oder RNA-Markierung) verwendeten Nukleinsäuresonden eingesetzt werden. Für weitere diesbezügliche Einzelheiten kann auf RÖMPP Lexikon Biotechnologie und Gentechnik, 2. Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Seiten 285/286, Stichwort: "FISH" und die dort angegebene Literatur sowie auf die WO 01/07649 A2 verwiesen werden, deren gesamter jeweiliger Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Gleichermaßen kann als Fluoreszenzmarker auch ein insbesondere keimspezifischer Antikörper eingesetzt werden, der seinerseits fluoreszenzmarkiert ist, insbesondere mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem fluoreszierenden Molekül, wobei die fluoreszierende Gruppe oder das fluoreszierende Molekül kovalent oder anderweitig an den Antikörper gebunden sein kann.
Die Menge bzw. Konzentration an eingesetzten Fluoreszenzmarkem wird der Fachmann den jeweiligen Gegebenheiten des Einzelfalls anpassen. Dies ist ihm ohne weiteres geläufig. Beispielsweise sollte bei einer lebend/tot-Differenzierung der in der Probe vorhandenen Keime für eine gute Keimanfärbung bei gleichzeitig schwacher "Hintergrundfärbung" ein geeignetes Mischungsverhältnis von "LebendfarbstoffV'Υotfarbstoff" gewählt werden; dies im Einzelfall auszuwählen, liegt im Rahmen des fachmännischen Könnens.
Im allgemeinen liegt die Nachweisegrenze bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in bezug auf die zu bestimmenden Keime bei < 100 Koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter Probevolumen, vorzugsweise bei ≤ 10 Koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter Probevolumen. Daher kommt das erfindungsgemäße Verfahren ohne jegliche Voranreicherung aus. Die niedrige Nachweisgrenze ist beispielsweise zur Erfüllung bestimmter Richtlinien oder Vorschriften von entscheidender Bedeutung. So muß beispielsweise laut CTFA-Richtlinie für kosmetische Rohstoffe bei deutlich höher liegender Keimzahlgrenze (z. B. 102 bis 103 KBE/ml) eine zeitaufwendige und kostenintensive Abwesenheitsprüfung von bestimmten Problemkeimen, d. h. pathogenen Keimen, durchgeführt werden.
Im allgemeinen lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Keimzahlen im Bereich von etwa 10 KBE pro Milliliter Probevolumen oder sogar weniger bis etwa 108 KBE pro Milliliter Probevolumen bestimmen. Dabei sollte zu Zwecken quantitativer Auswertungen ab einer bestimmten Keimzahl (im allgemeinen ab ca. 102 KBE pro Milliliter Probevolumen) die Probe vorab entsprechend, d. h. in geeigneter Weise, verdünnt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich prinzipiell für die Bestimmung beliebiger Keime, insbesondere pathogener Keime aller Art (z. B. Mikroorganismen aller Art, insbesondere einzellige Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, z. B. Hefen oder Schimmelpilze).
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich prinzipiell zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in beliebigen Produkten (d. h. Medien, Matrices, Lösungen etc.), vorzugsweise filtrierbaren, insbesondere flüssigen und/oder fließfähigen Produkten. Bei festen oder als solchen nicht filtrierbaren Produkten müssen diese bei der Probenaufbereitung in eine dem erfindungsgemäßen Verfahren zugängliche Form überführt werden; dies geschieht mit an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Überführen in eine Lösung oder Dispersion, Zerkleinerung, Extraktion etc.
Beispielsweise eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in Lebensmitteln, tensidhaltigen Produkten wie Wasch- und Reinigungsmitteln, Mitteln zur Oberflächenbehandlung, Dispersionsprodukten, Kosmetika, Hygieneprodukten und Produkten der Körperpflege, Pharmazeutikä, Klebstoffen, Kühlschmierstoffen, Lacken und (Lack-)Koagulationen sowie Rohstoffen und Ausgangsstoffen für die vorgenannten Produkte.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich damit für alle Arten möglicher Rohstoffe, Zwischen- und Endprodukte aus den unterschiedlichen Bereichen, wie z.B. Lebensmittel, Markenartikel, Kosmetika, Klebstoffe, Kühlschmierstoffe (z. B. ölige Kühlschmierstoffemulsionen); Prozeßflüssigkeiten von Anlagen etc., mit der Einschränkung, daß die nachzuweisenden Keime sich über ein Trennverfahren, wie Filtration oder Sedimentation, abtrennen lassen sollten. Dabei ist es auch nicht von Bedeutung, ob die Produkte in fester oder flüssiger Form vorliegen.
Aufgrund der relativ einfachen Durchführbarkeit und der besonderen Kombination von Verfahrensschritten eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere für die automatisierte Durchführung (z. B. im Rahmen von Produktions- und/oder Qualitätskontrolle). Neben der Produktions- und/oder Qualitätskontrolle (z. B. bei der Abfüllung von Tensid-Flüssigprodukten, Dispersionen, konservierten Produkten etc.) eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise auch zur Untersuchung von Störfällen bzw. Kontaminationen zur Bestimmung des Keimstatus oder auch zur Bewertung von Maßnahmen zur Produktsanierung oder aber auch zur Optimierung bzw. Überprüfung von Anlagenreinigungen (z. B. in Anlagen zur Herstellung konservierter Produkte), beispielsweise im Rahmen von CIP-Verfahren (CIP = Cleaning in Place) und SIP-Verfahren (SIP = Sterilisation in Place).
Das erfindungsgemäße Verfahren wird üblicherweise wie folgt durchgeführt:
Die Probeaufbereitung kann, wie in der DE 102 59 302 A1 und der WO 2004/055203 beschrieben, durchgeführt werden. Dies kann beispielsweise wie folgt geschehen:
Die Probe mit den quantitativ und/oder qualitativ zu bestimmenden Keimen wird in ein geeignetes Probengefäß eingebracht, dessen Boden mit einem im allgemeinen porösen Träger, z. B. einem Membranfilter oder einem Siliciummikrosieb, versehen ist und das keimfrei verschließbar sein sollte. Der poröse Träger liegt mit seinem äußeren Rand auf dem Probengefäß auf, so daß der äußere, konzentrische Rand nicht mit Keimen belegt wird. Falls eine Probe untersucht werden soll, die keimhemmende bzw. keimtötende Substanzen oder Bestandteile (z. B. Konservierungsstoffe oder Tenside) aufweist, wird zunächst eine Inaktivierung und/oder Entfernung dieser Substanzen bzw. Bestandteile durchgeführt, indem die Probe mit einer geeigneten Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung in Kontakt gebracht wird, und zwar für eine Zeitdauer die ausreicht, um die Inaktivierung und/oder Entfernung dieser Substanzen bzw. Bestandteile zu ermöglichen. Mittels Über- oder Unterdruck wird die Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung über den Membranfilter entfernt. Anschließend wird gegebenenfalls durch einfaches oder mehrfaches Waschen mit Wasser überschüssige bzw. verbleibende Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung über den Membranfilter entfernt, und zwar üblicherweise durch Anlegen eines Über- oder Unterdrucks, so daß auch das Waschwasser auf einfache Art entfernt wird. Hieran schließt sich eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers an. Zu diesem Zweck können die Keime beispielsweise mit einer Lösung oder Dispersion des Fluoreszenzmarkers in Kontakt gebracht werden für eine Zeit, die ausreicht, um die Keime zu markieren. Anschließend wird die überschüssige Lösung oder Dispersion des Fluoreszenzmarkers durch erneutes Anlegen eines Über- oder Unterdrucks über den porösen Träger entfernt. Schließlich kann gegebenenfalls zur Entfernung überschüssigen Fluoreszenzmarkers die Probe einer einfachen oder mehrfachen Wäsche mit Wasser, Pufferlösungen oder anderen Flüssigkeiten unterzogen werden. Nach Abziehen des Wassers über den porösen Träger durch Anlegen von Über- oder Unterdruck kann der poröse Träger dann schließlich vom Probengefäß abgetrennt werden, so daß ein mit fluoreszenzmarkierten Keimen belegter poröser Träger, insbesondere Membranfilter oder Siliciummikrosieb, resultiert. Dieser kann unmittelbar, d. h. im allgemeinen ohne weitere Aufbereitung der Probe oder Behandlung der Probe bzw. des Filters, der Messung bzw. Detektion zugeführt werden. Im Rahmen der Messung wird der mit fluoreszenzmarkierten Keimen belegte Träger dann mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt und hierbei sozusagen abgerastert bzw. abgescannt. Der ermittelte Meßwert korreliert mit der Keimzahl auf dem Membranfilter bzw. in der Probe.
Der der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Meßaufbau beinhaltet einige "Abweichungen" von einem üblichen Fluoreszenzmikroskop und geht an manchen Stellen einen Schritt weiter.
Der Detektor kann beispielsweise die folgenden Komponenten umfassen: Einen Probenhaltertisch, der in alle drei Raumrichtungen verfahrbar ist. Die Schrittweise seiner Positionierung liegt z. B. bei etwa 2 μm. Die Steuerung des Tisches erfolgt beispielsweise rechnergestützt, wobei in einem entsprechenden Meßprogramm die Parameter zum Abrastem eines Trägers bzw. Membranfilters oder Siliciummikrosiebs hinterlegt sind. Diese Parameter beschreiben eine automatische Schärfeeinstellung, die Rasterbreite in x- und y-Richtung, das Tiefenprofil in z-Richtung sowie die Fläche der zu untersuchenden Probe. Der Probenhaltertisch selbst kann z. B. derart geformt sein, daß in bevorzugter Weise Standardobjektträger mit den Maßen 26 mm Breite und 76 mm Länge (ISO Norm 8037/I) fest fixiert werden können.
Die Probe wird z. B. mit einer LED (light emitting diode) bestrahlt. Die Verwendung einer LED hat den Vorteil, daß das zu untersuchende Präparat einer nur geringen thermischen Belastung ausgesetzt und somit länger haltbar ist. Die Anregungswellenlänge der LED richtet sich insbesondere nach dem Absorptionsmaximum des verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs. Das Licht der LED wird über einen dichroitischen Strahlenteiler auf die Probe gelenkt. Die von den Keimen emittierte Fluoreszenzstrahlung kann auf ihrem Weg durch ein Mikroskopobjektiv zu einer CCD-Kamera spektral gefiltert werden. Dadurch kann die Fluoreszenzstrahlung wellenlängenabhängig detektiert werden; man erhält gewissermaßen einen "spektralen Fingerabdruck" der Keime.
it Hilfe einer Autofokusfunktion kann eine automatische Schärfeeinstellung in verschiedenen, bestimmten Ebenen erfolgen. Die so erhaltenen Bildausschnitte haben beispielsweise unter bevorzugter Benutzung eines Mikroskopobjektivs mit 10facher Vergrößerung eine Größe von ca. 1 ,5 mm x 1 ,0 mm. Der Autofokus dient zur Festlegung einer bestimmten Bildebene. Von dieser aus wird in definierten Verfahrensschritten eine Bewegung des zu untersuchenden Präparates in z- Richtung (also vertikal zur Fläche des Präparates) durchgeführt. Auf diese Weise werden Bilder in verschiedenen Tiefenebenen aufgenommen. Eine anschließende Projektion der Bildebenen liefert schließlich ein tiefenscharfes Gesamtbild.
Bei der Gesamtanalyse eines Trägers bzw. Membranfilters oder Siliciummikrosiebs liefern so mehrere Gesichtsfelder (z. B. in der bevorzugten Größe 1 ,5 mm x 1 ,0 mm) in verschiedenen Tiefen unter Verwendung unterschiedlicher optischer Filter eine relativ große Menge an Daten. Ferner können in einem bestimmten Gesichtsfeld bei bestehender Tiefe und optischem Filter bei einer längeren Belichtungszeit eine Reihe von Bildsequenzen aufgenommen werden.
Die so erzeugten Bilder werden unter Berücksichtigung verschiedener Auswerteparameter auf ihren tatsächlichen Keimgehalt hin beurteilt. Zum einen spielt die Größe und die Form eines detektierten Partikels eine wichtige Rolle. Da die nachzuweisenden Keime im allgemeinen kleiner als 6 μm sind, können alle größeren Teilchen vernachlässigt werden. In diesem Zusammenhang ist auch die Form zu sehen; denn bei der hier genannten, bevorzugten Vergrößerung ist das Verhältnis der Hauptachsen der Keime in erster Näherung 1 : 1 , d. h. die Keime erscheinen (mit Ausnahme der Hyphenform eines Pilzes) als runde Gebilde. Partikel, die ein anderes Hauptachsenverhältnis aufweisen, werden somit ebenfalls außer acht gelassen.
Als weiterer Parameter kommt die Analyse der Fluoreszenzcharakteristik hinzu. Hierbei ist nicht nur die Intensität der Strahlung bei einer bestimmten Wellenlänge oder einem Wellenlängenbereich von Interesse. Vielmehr ist das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen Wellenlängen/Wellenlängenbereichen zur Diskriminierung zwischen Keimen und anderen Partikeln entscheidend. Diese Wellenlängenunterschiede werden in dem zuvor genannten tiefenscharfen Bild als Falschfarben zusätzlich dargestellt. Zur Abtrennung des Anregungslichtes wird ein dichroitischer Strahlenteiler mit einer "Kante" bei 500 nm eingesetzt. Dadurch wird erreicht, daß das Anregungslicht an dem Filter fast vollständig reflektiert wird, während das von den angefärbten lebenden Keimen emittierte Fluoreszenzlicht ab 520 nm Wellenlänge fast komplett durchgelassen wird. Im Fluoreszenzstrahlengang ist ein Langpaßfilter mit einer "Kante" bei 520 nm angeordnet, um das intensive Anregungslicht der LED noch weiter abzuschwächen. Alle weiteren Filter sind in ein Filterrad integriert, wobei eine Position ("Position 1") des Filterrads ohne Filter bleibt; dieses dient zur Messung des insgesamt von der Probe abgestrahlten Fluoreszenzlichts. Auf zwei weiteren Positionen ("Positionen 2 und 3") sind Bandpaßfilter eingesetzt, die mit unterschiedlichen Breiten das grüne Fluoreszenzlicht herausfiltern. Drei weitere Filter an den verbleibenden Positionen des Filterrads ("Positionen 4 bis 6") sind Langpaßfilter mit immer weiter in den roten Bereich verschobenen "Absorptionskanten".
Letztens wird die bei einer bestimmten Bestrahlungszeit ermittelte Fluoreszenzintensität ausgewertet. Es handelt sich hierbei um keine Messung der Fluoreszenzlebensdauer, bei der unter einmaliger Anregung die Zeitdauer des "Nachleuchtens" detektiert wird. Bei der vorliegenden Erfindung wird vielmehr ein Gesichtsfeld für eine bestimmte Zeit belichtet, eine Aufnahme des Feldes durchgeführt, erneut belichtet usw. Dieses, mit der LED erzeugte Ausbleichen ("Bleaching") dient in entscheidender Weise zur Differenzierung von Keimen und anderen, für die Bestimmung der Keimzahl unerheblicher Teilchen ("Störpartikeln"). Da Keime nur eine endliche Menge an Fluoreszenzfarbstoff aufnehmen, ist dieser nach einer bestimmten Zeit durch die Einstrahlung der LED gebleicht; die Keime leuchten nur noch schwach oder überhaupt nicht mehr. Partikel hingegen, die nicht vom Fluoreszenzfarbstoff angefärbt wurden und aufgrund intrinsischer Eigenschaften eine Fluoreszenz hervorrufen (z. B. Kunststoffpartikel), bleiben in ihrer Intensität von der Bestrahlungszeit nahezu unbeeinflußt.
Das erfindungsgemäß eingesetzte System ist in der Lage, vollständig automatisiert den Fokus eines betrachtenden Gesichtsfelds zu finden. Zur möglichst genauen Abbildung der auf den Membranfiltern vorhandenen Keime und anderen Partikeln erfolgt eine Autofokuseinstellung nach jedem Verfahrensschritt bzw. in jedem Gesichtsfeld erneut.
Bei längerer Belichtungszeit besteht ein fundamentaler Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbten Keimen und Störpartikeln, d. h. Teilchen, die eine Eigenfluoreszenz aufweisen. Im Fall der Keime wird der Farbstoff durch das energiereiche Licht allmählich ausgebleicht. Bei aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften fluoreszierenden Teilchen (Eigenfluoreszenz) ruft dagegen eine längere Belichtung keine oder nur eine sehr schwache Änderung der Intensität hervor. Dieses Kriterium ist sehr entscheidend, wenn gleich große und in ihrer spektralen Charakteristik ähnliche Teilchen voneinander unterschieden werden sollen. Es ist in diesem Zusammenhang zu beachten, daß dieses beschriebene Ausbleichverfahren zur Differenzierung nicht mit den Fluoreszenzlebensdaueruntersuchungen (vgl. z. B. H. J. Tanke et al., loc. cit.) gleichgesetzt werden kann. Die Kombination der Charakteristiken Form/Größe und spektrale Eigenschaften sowie Ausbleichverhalten von Teilchen - sowohl Keime als auch "Störpartikel" - führt zu einer extrem hohen Sicherheit bei der Differenzierung bzw. Diskriminierung. Somit ist eine nachfolgende mikroskopische Inspektion durch den Bediener nicht mehr erforderlich. Auf diese Art und Weise ist es möglich, automatische Analysen im Bereich < 10 KBE / ml reproduzierbar und verläßlich durchzuführen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind eine Vielzahl von Vorteile verbunden, von denen die wesentlichen, jedoch nicht beschränkend, im folgenden aufgeführt sind:
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß es automatisiert durchgeführt werden kann. Durch die vollständige Automatisierung des gesamten Ablaufs läßt sich das Verfahren einfacher, schneller und reproduzierbarer durchführen. Dies bringt Vorteile hinsichtlich Kosten, Personalaufwand und Empfindlichkeit mit sich. Die hohe Reproduzierbarkeit bei der Durchführung des Untersuchungen ist ebenfalls von großem Vorteil.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung standardisierter bzw. herkömmlicher Komponenten: Das für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderliche Gesamtsystem ist in der Weise integriert, daß eine Vielzahl standardisierter bzw. herkömmlicher Komponenten (Gefäße, Medien, Filter etc.) verwendet werden kann und damit der Bedieneraufwand reduziert und die Sicherheit des Verfahrens erhöht wird.
Ein anderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der einfachen Detektion und Auswertung: Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise in einem geeigneten Probengefäß durchgeführt werden, so daß die markierten Keime auf einem geeigneten Träger, z. B. einer Filtermembran, präpariert werden. Wiederum ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Geschwindigkeit der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens: Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine Bestimmung der Keimzahl bereits nach einer Zeit zwischen wenigen Minuten, abhängig von der Art der Keime und ihrer Anzahl. Konventionelle Kulturmethoden benötigen dagegen bis zu mehreren Tage.
Auch die hohe Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist von besonderem Vorteil: Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Bestimmung von Keimen auch in großer Verdünnung. Beschleunigte Kulturverfahren sind nicht ausreichend empfindlich für eine Nachweisgrenze von 10 KBE pro Milliliter Probevolumen.
Schließlich muß ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Bedienerfreundlichkeit gesehen werden: Der gesamte Prozeß der Bestimmung der Keimbelastung einer Probe besteht bei automatisierter Durchführung lediglich aus dem Einfüllen der Probe und dem Starten des Ablaufs. Im Anschluß erhält der Benutzer den numerischen Wert für die Keimbelastung. Der Aufwand für Probenaufbereitung und Messung ist minimal. Das System läßt sich damit auch in idealer Weise in Prozeßsysteme zur Qualitätsüberwachung, -Sicherung und -dokumentation einbinden.
Gemäß einem weiteren, zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung auch eine wie in Anspruch 35 beschriebene Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe mittels Fluoreszenzmarkierung bzw. mittels eines Fluoreszenzmarkers, wobei die Vorrichtung derart ausgebildet ist, daß der zeitabhängige Verlauf der Fluoreszenzemission zur Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits erfaßbar ist.
Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe nach einem Verfahren mit Probenaufbereitung und anschließender Detektion und/oder Auswertung, wobei mittels der Vorrichtung im Zuge der Probenaufbereitung eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers durchführbar ist und die Detektion und/oder Auswertung unter Nutzung des Fluoreszenzmarkers durch Erfassung und/oder Messung der Fluoreszenzemission durchführbar ist, insbesondere zur Durchführung des zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Vorrichtung
- einen Probenaufnahmebehälter,
- einen an einem Auslaß des Probenaufnahmebehälters, insbesondere an dessen Boden, angeordneten, vorzugsweise porösen Träger zur Aufbringung und/oder Fixierung der Keime, insbesondere Membranfilter oder Siliciummikrosieb, wobei der Träger derart ausgebildet ist, daß er die zu detektierenden Keime zurückhält und/oder in bezug auf die zu detektierenden Keime undurchlässig ist, und
- ein Detektionssystem, das zur Ausführung einer Fluoreszenzemissionsmessung ausgestaltet ist und an dem der Probenaufnahmebehälter mit dem Träger und/oder der aus dem Probenaufnahmebehälter entnommene Träger zu Zwecken der Detektion und/oder Auswertung positionierbar ist, wobei das Detektionssystem eine vorzugsweise computergesteuerte Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung als Teil des Detektionssystems und/oder zur Steuerung des Detektionssystems aufweist und eine Strahlungsquelle umfaßt, mittels derer die fluoreszenzmarkierten Keime für eine definierte Zeitdauer einer Anregungsstrahlung einer definierten Wellenlänge oder eines definierten Wellenlängenbereichs ausgesetzt werden können, wobei das Detektionssystem, insbesondere die Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung, Mittel zur Erfassung des zeitabhängigen Verlaufs der infolge der Anregung erzeugten Fluoreszenzemissionsstrahlung aufweist, so daß eine Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits erfaßbar ist,
aufweist.
Weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Gegenstand der Vorrichtungsunteransprüche (Patentansprüche 37 bis 40). Die in bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren gemachten Ausführungen gelten für die erfindungsgemäße Vorrichtung entsprechend.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem weiteren, dritten Aspekt der vorliegenden Anmeldung - die erfindungsgemäße Verwendung der erfindungsgemäßen, wie zuvor beschriebenen Vorrichtung, wie sie Gegenstand der Verwendungsansprüche (Patentansprüche 41 bis 43) ist.
Weitere Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen sowie Vorteile der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe, wobei das Verfahren einen Verfahrenschritt (a) der Probenaufbereitung und einen Verfahrensschritt (b) der Detektion und/oder Auswertung umfaßt, wobei in Verfahrensschritt (a) eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkes erfolgt und in Verfahrensschritt (b) eine quantitative und/oder qualitative Detektion und/oder Auswertung erfolgt, wobei die in Verfahrensschritt (b) durchgeführte Detektion und/oder Auswertung durch Erfassung und/oder Messung der Fluoreszenzemission erfolgt,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t ,
daß in Verfahrensschritt (b) die in Verfahrensschritt (a) aufbereitete Probe mit den fluoreszenzmarkierten Keimen für eine definierte Zeitdauer einer Anregungsstrahlung einer definierten Wellenlänge oder eines definierten Wellenlängenbereichs ausgesetzt und der zeitabhängige Verlauf der infolge der Anregung erzeugten Fluoreszenzemissionsstrahlung erfaßt wird, so daß eine Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits ermöglicht wird und auf diese Weise eine quantitative und/oder qualitative Bestimmung der fluoreszenzmarkierten Keime in der Probe erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Kinetik des Abbaus und/oder Ausbleichens des Fluoreszenzmarkers erfaßt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der Kinetik über die Erfassung des zeitabhängigen Verlaufs der Intensität der Fluoreszenzemissionssignale erfolgt.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß auf Basis der durch Fluoreszenzemission ermittelten Meßwerte die in der Probe vorhandene Zahl an Keimen bestimmt werden kann, insbesondere mittels geeigneter Kalibrierung.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in zwei oder mehreren, zeitlich aufeinanderfolgenden Zeitintervallen mit Anregungsstrahlungen von jeweils voneinander unterschiedlichen, aber jeweils definierten Wellenlängen oder Wellenlängenbereichen auf die aufbereitete Probe mit den fluoreszenzmarkierten Keimen eingestrahlt wird und/oder daß in mindestens zwei zeitlich aufeinanderfolgenden (Zeit-)lntervallen die Fluoreszenzstrahlung bei jeweils voneinander unterschiedlichen, aber jeweils definierten Wellenlängen oder Wellenlängenbereichen von der aufbereiteten Probe mit den fluoreszenzmarkierten Keimen detektiert wird.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlänge oder der Wellenlängenbereich der Anregungsstrahlung auf die Fluoreszenzcharakteristik des Fluoreszenzmarkers und/oder der fluoreszenzmarkierten Keime abgestimmt ist, insbesondere auf deren Absorptionsmaxima in bezug auf die Fluoreszenzemission.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich eine Diskriminierung über die Größe und/oder Form der emittierenden Partikel erfolgt.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich eine Diskriminierung über die Analyse der Fluoreszenzcharakteristik erfolgt, insbesondere wobei das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen, aber definierten Wellenlängen oder Wellenlängenbereichen erfaßt wird.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Keime auf einem Träger aufgebracht und/oder fixiert sind.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger porös ausgebildet ist, insbesondere wobei die Poren des Trägers derart gewählt sind, daß die Porengröße kleiner als die in der Probe vorhandenen Keime ist, und/oder daß der Träger derart ausgebildet ist, daß er die Keime zurückhält und/oder in bezug auf die Keime undurchlässig ist.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszenzmarkierten Keime bei der in Verfahrensschritt (a) durchgeführten Probenaufbereitung auf einem insbesondere porösen Membranfilter, vorzugsweise einem Polycarbonatmembranfilter, oder einem Siliciummikrosieb aufgebracht werden, wobei das Membranfilter oder das Siliciummikrosieb so ausgebildet ist, daß es die Keime zurückhält und/oder in bezug auf die Keime undurchlässig ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Poren des Membranfilters oder des Siliciummikrosiebs so gewählt ist, daß die Porengröße kleiner als die in der Probe vorhandenen Keime ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion und/oder Auswertung, insbesondere ohne weitere Probenbehandlung oder -aufbereitung oder -Übertragung, unmittelbar auf dem Träger, insbesondere Membranfilter oder Siliciummikrosieb, erfolgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker derart ausgewählt wird, daß er porengängig, insbesondere membrangängig oder mikrosiebgängig, in bezug auf den bei der in Verfahrensschritt (a) durchgeführten Probenaufbereitung verwendeten Träger, insbesondere Membranfilter oder Siliciummikrosieb, ist.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt (a) der Probenaufbereitung auch eine Inaktivierung und/oder Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden und/oder keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen, insbesondere Konservierungsstoffen oder Tensiden, umfaßt, insbesondere wobei die Inaktivierung und/oder Entfernung der gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden und/oder keimtötenden Substanzen oder Bestandteile dadurch erfolgen kann, daß die Probe mit einer geeigneten Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung in Kontakt gebracht wird.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker derart ausgewählt wird, daß er mit den Keimen in Wechselwirkung tritt, insbesondere an die Keime, insbesondere an deren Zellwand (Hülle) und/oder Nukleinsäure, anbindet und/oder von den Keimen aufgenommen, insbesondere metabolisiert und/oder enzymatisch umgesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein keimunspezifischer Fluoreszenzmarker oder ein Gemisch keimunspezifischer Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein keimspezifischer Fluoreszenzmarker oder ein Gemisch verschieden keimspezifischer Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein Gemisch keimunspezifischer und keimspezifischer Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein mit lebenden Keimen in Wechselwirkung tretender Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein mit toten Keimen in Wechselwirkung tretender Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein Gemisch von mit lebenden Keimen in Wechselwirkung tretenden Fluoreszenzmarkem und mit toten Keimen in Wechselwirkung tretenden Fluoreszenzmarkem eingesetzt wird, so daß eine lebend/tot-Differenzierung der in der Probe vorhandenen Keime erfolgt.
23. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein in der Epifluoreszenzmikroskopie oder in der DEFT (Direkte Epifluoreszenz-Filter- Technik) oder in der MMCF (Membranfilter-Mikrokolonie-Fluoreszenz- Methode) üblicherweise zur Keimmarkierung verwendeter Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein Fluoreszenzfarbstoff oder aber eine Vorstufe eines solchen Fluoreszenzfarbstoffs, aus dem durch Wechselwirkung mit den Keimen, insbesondere durch Metabolisierung und/ oder enzymatische Umsetzung, der Fluoreszenzfarbstoff generiert wird, eingesetzt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe von 3,6-Bis[dimethylami- no]acridin (Acridinorange), 4',6-Diamido-2-phenylindol (DAPI), 3,8-Diamino- 5-ethyl-6-phenyl-phenanthridiniumbromid (Ethidiumbromid), 3,8-Diamino-5- [3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenyl-phenanthridiniumdiiodid (Propidiumiodid), Rhodaminen wie Rhodamin B und Sulforhodamin B sowie Fluoresceinisothiocyanat.
26. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker eine insbesondere keimspezifische Nukleinsäuresonde eingesetzt wird, die ihrerseits fluoreszenzmarkiert ist, insbesondere mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem fluoreszierenden Molekül, insbesondere wobei die fluoreszierende Gruppe oder das fluoreszierende Molekül kovalent oder anderweitig an die Nukleinsäuresonde gebunden sein kann und/oder insbesondere wobei die Nukleinsäuresonde ein fluoreszenzmarkiertes Oligo- oder Polynukleotid umfaßt und/oder insbesondere wobei die Nukleinsäuresonde eine fluoreszenzmarkierte DNA- oder RNA-Sonde ist.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß als Nukleinsäuresonde eine in der FJuoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) üblicherweise zur Markierung verwendete Nukleinsäuresonde eingesetzt wird.
28. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein insbesondere keimspezifischer Antikörper eingesetzt wird, der seinerseits fluoreszenzmarkiert ist, insbesondere mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem fluoreszierenden Molekül, insbesondere wobei die fluoreszierende Gruppe oder das fluoreszierende Molekül kovalent oder anderweitig an den Antikörper gebunden sein kann.
29. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisegrenze in bezug auf die Keime ≤ 100 Koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter Probevolumen, vorzugsweise < 10 Koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter Probevolumen, ist.
30. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zu bestimmenden Keimen um pathogene Keime aller Art handelt, insbesondere Mikroorganismen aller Art, insbesondere einzellige Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze (z. B. Hefen oder Schimmelpilze).
31. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in Lebensmitteln, tensidhaltigen Produkten wie Wasch- und Reinigungsmitteln, Mitteln zur Oberflächenbehandlung, Dispersionsprodukten, Kosmetika, Hygieneprodukten und Produkten der Körperpflege, Pharmazeutika, Klebstoffen, Kühlschmierstoffen, Lacken und (Lack-)Koagulationen sowie Rohstoffen und Ausgangsstoffen für die vorgenannten Produkte.
32. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in filtrierbaren, insbesondere flüssigen und/oder fließfähigen Produkten.
33. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren automatisiert durchgeführt wird.
34. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren im Rahmen der Produktions- und/oder Qualitätskontrolle durchgeführt wird.
35. Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe mittels eines Fluoreszenzmarkers, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorangehenden Verfahrensansprüche,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Vorrichtung derart ausgebildet ist, daß der zeitabhängige Verlauf der Fluoreszenzemission zur Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits erfaßbar ist.
36. Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe nach einem Verfahren mit Probenaufbereitung und anschließender Detektion und/oder Auswertung, insbesondere nach Anspruch 35, wobei mittels der Vorrichtung im Zuge der Probenaufbereitung eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers durchführbar ist und die Detektion und/oder Auswertung unter Nutzung des Fluoreszenzmarkers durch Erfassung und/oder Messung der Fluoreszenzemission durchführbar ist, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorangehenden Verfahrenansprüche, wobei die Vorrichtung aufweist:
- einen Probenaufnahmebehälter,
- einen an einem Auslaß des Probenaufnahmebehälters, insbesondere an dessen Boden, angeordneten, vorzugsweise porösen Träger zur Aufbringung und/oder Fixierung der Keime, insbesondere Membranfilter oder Siliciummikrosieb, wobei der Träger derart ausgebildet ist, daß er die zu detektierenden Keime zurückhält und/oder in bezug auf die zu detektierenden Keime undurchlässig ist, und
- ein Detektionssystem, das zur Ausführung einer Fluoreszenzemissionsmessung ausgestaltet ist und an dem der Probenaufnahmebehälter mit dem Träger und/oder der aus dem Probenaufnahmebehälter entnommene Träger zu Zwecken der Detektion und/oder Auswertung positionierbar ist, wobei das Detektionssystem eine vorzugsweise computergesteuerte Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung als Teil des Detektionssystems und/oder zur Steuerung des Detektionssystems aufweist und eine Strahlungsquelle umfaßt, mittels derer die fluoreszenzmarkierten Keime für eine definierte Zeitdauer einer Anregungsstrahlung einer definierten Wellenlänge oder eines definierten Wellenlängenbereichs ausgesetzt werden können, wobei das Detektionssystem, insbesondere die Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung, Mittel zur Erfassung des zeitabhängigen Verlaufs der infolge der Anregung erzeugten
Fluoreszenzemissionsstrahlung aufweist, so daß eine Diskriminierung zwischen auf die fluoreszenzmarkierten Keime zurückgehenden Meßsignalen einerseits und etwaigen Störsignalen andererseits erfaßbar ist.
37. Vorrichtung nach Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Poren aufweisender Träger, insbesondere ein Membranfilter, vorzugsweise ein Polycarbonatmembranfilter, oder ein Siliciummikrosieb, ist.
38. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Poren des Trägers kleiner ist als die Größe der in der Probe vorhandenen und/oder zu erwartenden, zu bestimmenden Keime.
39. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dem Probenaufnahmebehälter (1 ) eine Abtropfeinrichtung, eine Absaugeinrichtung und/oder eine Abdrückeinrichtung zum Abtropfen, Absaugen und/oder Abdrücken eines oberhalb oder stromaufwärts des Trägers anstehenden Probenfluids und/oder Aufnahmefluids für den Fluoreszenzmarker und/oder Spülfluids aufweist.
40. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung außerdem eine Thermostatisierungseinrichtung zur Thermostatisierung des Probenaufnahmebehälters aufweist.
41. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 35 bis 40 zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in Lebensmitteln, tensidhaltigen Produkten wie Wasch- und Reinigungsmitteln, Mitteln zur Oberflächenbehandlung, Dispersionsprodukten, Kosmetika, Hygieneprodukten und Produkten der Körperpflege, Pharmazeutika, Klebstoffen, Kühlschmierstoffen, Lacken und Lackkoagulationen sowie Rohstoffen und Ausgangsstoffen für die vorgenannten Produkte.
42. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 35 bis 40 zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in filtrierbaren, insbesondere flüssigen und/oder fließfähigen Produkten, insbesondere Medien, Lösungen, Flüssigkeiten, Matrices und dergleichen.
43. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 35 bis 40 zur vorzugsweise automatisierten Produktions- und/oder Qualitätskontrolle.
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