WO2006100330A2 - Antibióticos polienos, composiciones que los contengan, procedimiento y microorganismos para su obtención y sus aplicaciones - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to new knotted and methylated polyenes, the process for obtaining them, characterization of biological activities and applications, for example, therapeutic, agricultural and agri-food.
  • the invention also relates to: (a) methylated derivatives of other polyenes obtained in the same manner in their respective producing organisms; (b) recombinant microorganisms producing amidated polyenes as well as (c) with vectors useful for obtaining said microorganisms and (d) a procedure for obtaining aminated polyenes using acellular extracts or protein fractions obtained from producers of aminated polyenes macrolides.
  • antifungal drugs Despite the need for antifungal drugs, the number of these pharmaceutical products on the market to treat systemic infections is dangerously low. Most of them, such as azoles and polyenes, which include amphotericin B, have the structural integrity of fungal membranes as a target, although, in recent years, antifungal drugs (echinocandins) have been developed that they target specific components of the cellular wall.
  • Polyenes are a group of very interesting polytonic macrolides due to their antifungal activity. These compounds contain a macrolactone ring with numerous conjugated double bonds, forming chromophores with a characteristic spectrum in the ultraviolet / visible area; These characteristics are responsible for their physical and chemical properties (high light absorption, photolability and poor water solubility). Despite the importance of some examples such as amphotericin B as antifungal drugs, its precise mechanism of action is not yet well understood; however, the antifungal activity seems to be due to interactions between polyene molecules and sterol-containing membranes. This interaction provides an ion channel and the membranes become permeable causing the destruction of electrochemical gradients and the consequent cell death.
  • the inventors of the invention have found that by genetic manipulation of Streptomyces diastaticus var. 108, a strain producing the polymic macrolide antibiotics rimocidine (lia) and CE-108 (Hb) (Pérez-Z ⁇ fiiga et al, (2004), J. Antibiot.
  • the inventors of the invention have found that by genetic manipulation of Streptomyces diastaticus var. 108, a strain producing the polymic macrolide antibiotics rimocidine (lia) and CE-108 (Hb) (Pérez-Z ⁇ fiiga et al, (2004), J. Antibiot.
  • the biosynthetic mechanism for the formation of these aforementioned rimocidine B (I-la) and CE-108B (I-Ib) polyenes is elucidated, as well as the obtention of two new rimocidine C (Illa polyenes) ) and CE-108C (HIb) (methylated polyenes, Example 2) by genetic manipulation of the cluster involved in the biosynthesis of the two macrolide antibiotics polymos rimocidine (lia) and CE-108 (Hb) (Seco et al., 2004, Chem Biol. 11: 357-366).
  • the new methylated polyenes, as well as the amidated ones, have clearly improved pharmacological properties compared to native tetraenes.
  • module 7 of the polyketide synthetase ( PKS) methylmalonamil-CoA is incorporated as an elongation unit, which is responsible for the presence of a methyl group in the macrocyclic ring which, subsequently, by a site-specific post-PKS modification would be oxidized to give rise to the free carboxyl group present in rimocidine (lia) and CE-108 (Hb).
  • cytochrome P450 monooxygenase is involved in this oxidation, and is encoded in the biosynthetic clusters of polyenes described so far (Aparicio et al., 2003, Appl Microbiol Biotechnol 61: 179-188).
  • RimG be the cytochrome P450 monooxygenase involved in the oxidation of the methyl group to originate the carboxyl group (Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366).
  • the invention relates to two amidated polyenes identified later in this description as rimocidine B (I-la) and CE-108B (I-lb) and two methylated polyenes identified later as rimocidine C (Illa) and CE-108C (HIb ); their obtaining and applications constitute additional aspects of this invention.
  • Such compounds have biocidal activity, which, in particular, is more selective against organisms that have ergosterol-containing cell membranes, either fungi or parasites.
  • Biocidal compositions for example, pharmaceutical compositions and / or antifungal compositions for agricultural or agri-food use containing said aminated or methylated polyenes, constitute a further aspect of this invention.
  • the use of said polyenes, whether aminated or methylated, in pharmaceutical compositions for sanitary purposes for human or animal use and / or antifungal compositions for agricultural or agri-food use constitutes another aspect of this invention.
  • the invention relates to the applications of polyene AB-400 (IVb), the corresponding pimaricin amide (IVa) (Ca ⁇ edo LM et al., 2000, J. Antibiot. (Tokyo) 53: 623-626) , based on the test results of this compound, isolated from Streptomyces sp. RGU5.3 and revealed in this invention.
  • IVb polyene AB-400
  • IVa pimaricin amide
  • the invention relates to the use of vectors derived from SCP2 * that contain at least the erythromycin resistance (ermE) gene, such as pSM784 or pSM743B, identified below.
  • ermE erythromycin resistance
  • the invention relates, in another aspect, to a process for the production of said amidated polyenes which comprises culturing a recombinant microorganism producing said compounds under conditions that allow the production of said polyenes, whether aminated or methylated, and, if desired. , isolate and purify said compounds.
  • recombinant microorganisms include Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces d ⁇ astaticus var. 108 / 743B and Streptomyces diastaticus var.
  • the invention relates to the elucidation of the mechanism for the formation of the amide group of the aminated polyenes for which, an interruption or deletion of the rimG gene in order to block the formation of the carboxyl group was crucial.
  • the formation of the carboxyl group is blocked, if the formation of the amide group takes place during the assembly of the polytonic chain, by transforming the disrupting strain with a plasmid inducing the biosynthesis of the amidated tetraenes, these should be detected in the fermentation broth . If not, it would be concluded that the formation of the amide group takes place by means of an amidotransferase activity on the free carboxyl group, once it has been formed.
  • Inactivating gene disruption was chosen as an alternative to mutagenize the rimG gene. However, under these first conditions, and unexpectedly the disruption in the rimG gene performed as indicated above, generates a recombinant incapable of producing polyenes. This was interpreted to mean that the promoter used for the disruption was unable to prevent polar effects probably on the rimA gene located after the insertion point.
  • the invention also relates to a methylated polyene of formula (III), hereinafter composed of the invention, useful as an antifungal and antiparasitic, and as particular objects said polyene describes the following methylated polyenes identified later in this description. as rimocidine C (Illa) and CE-108C (HIb).
  • the invention relates, in another aspect, to a process for the production of said methylated polyenes of formula III which comprises culturing the disrupting microorganism producing said compounds under conditions that allow the production of said methylated polyenes, and, if desired, isolating and purify said compounds.
  • the invention also relates to the use of gene disruption involved in the same chemical modification proposed for RimG (some of which have already been described) in other biosynthetic clusters of polyenes in order to produce the corresponding methylated derivatives .
  • rimocidine C (Illa) and CE-108C (IHb) is based on a greater selective toxicity towards membranes containing ergosterol, either fungi or parasites, than towards human cell membranes, which significantly reduces their toxicity.
  • Biocidal compositions for example, pharmaceutical compositions and / or antifungal compositions for sanitary, agricultural or agri-food use containing said methylated polyenes, constitute a further aspect of this invention.
  • Another additional object of the invention is the use of a biocidal composition containing the compound of the invention for the treatment of infectious diseases in the human and animal, agricultural and food sanitary field.
  • a biocidal composition containing the compound of the invention for the treatment of infectious diseases in the human and animal, agricultural and food sanitary field.
  • amidotransferase activity present in the acellular extracts of the genetic recombinants of S. diastaticus var. 108 has a relaxed specificity towards the substrate being able to modify not only the native substrates rimocidine (lia) and CE-108 (Hb) in their corresponding amides rimocidine B (I-la) and CE-108B (I-lb), but which is also able to recognize heterologous substrates such as pimaricin (IVa). This did not occur for the amidotransferase activity of Streptomyces sp. RGU5.3, being only able to recognize pimaricin (IVa) as a substrate under the conditions tested.
  • the invention provides an enzymatic process, hereafter enzymatic process of the invention, to convert carboxylated polyenes into the corresponding amidates, using acellular extracts of the producers or components selected either directly or immobilized in suitable supports following the technology of the field of immobilized systems from a substrate and under conditions of certain cultivation.
  • the invention relates to acellular extracts of producers of amidated polyenes, carriers of an amidotransferase activity, capable of converting "in vitro" carboxylated polyenes into their corresponding amides necessary for the implementation of the enzymatic process of the invention.
  • the invention relates to the acellular extracts of microorganisms S. diastaticus var. 108 / 743B, S. diastaticus var.
  • Figure 1 shows a schematic representation of the physical maps of the recombinant plasmids pSM743B (rimA gene introduced in pIJ922) [ Figure IA] and pSM784 (ermE gene introduced in pIJ941) [ Figure IB].
  • xysAp xysA promoter
  • rimA Type I PKS involved in the biosynthetic pathway of CE-108 and rimocidine
  • Ti methylenomycin resistance gene terminator
  • ermE, tsr and hyg genes for resistance to erythromycin, thiostrepton and hygromycin, respectively
  • riml * ⁇ riml truncated on your N-terminal Figure IC shows the chromatographic profile (HPLC) of the fermentation broth of the genetically modified strain Streptomyces diastaticus var. 108 / 743B.
  • the numbers 1-4 represent 1: CE-108B (Mb); 2: CE-108 (Hb); 3: rimocidine B (Ila); and 4: rimocidine (lia).
  • Figure 2 shows the antifungal activity of the four tetraenes produced by S. diastaticus var. 108 / 743B.
  • the numbers that appear on each of the antibiograms refer to the applied amounts of each of the polyenes expressed in nanomoles.
  • the target organisms were: P. chrysogenum, C. krusei, A. niger, C. albicans and C. neoformans (see Table 1, Exemplol).
  • Figure 3 shows the biological activities of the pimaricin (IVa) and AB-400 (IVb) polyenes isolated from Streptomyces sp. RGU5.3.
  • HPLC analyzes chromatograms of fermentation broths from Sti-eptomyces sp. RGU5.3 grown in medium with acetate ( Figure 3 A) or glucose ( Figure 3B) as carbon source respectively.
  • Figure 3C illustrates the antifungal activity of pimaricin (IVa) and AB-400 (IVb) against P. chrysogenum; the samples of applied polyenes were (1): commercial pimaricin (Calbiochem 5279962), (2): total extract of the fermentation broth of S. sp.
  • FIG. 3D shows the hemolytic activity for pimaricin (Calbiochem 527962, 98.8% purity) and AB-400 (purified by HPLC as indicated in the Experimental Procedures); the values of each polyene are expressed in nanomoles (left column) and the corresponding hemolytic activities are provided as a percentage of total hemolysis (see text for experimental procedures).
  • Figure 4 shows, in panel A, a scheme of the transcription of the genes in this particular region of the chromosome deduced by endonuclease Sl protection tests carried out with different DNA fragments (Seco et al, 2004, Chem. Biol 11: 357-366).
  • the transcripts are represented by dashed arrows corresponding to the polycistron of the rimE, rimF, rimG, rimH and ritnA genes.
  • Deducted transcripts are represented by dashed arrows.
  • the DNA fragments used for inactivating insertions of the rimG and rimE genes are indicated with a gray line; the numbers in brackets correspond to the DNA sequence deposited under the accession number AY442225.
  • Panel B of this figure shows the chromatogram corresponding to the fermentation broth of S. diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B, where a and b correspond to CE-108C (HIb) and rimocidine C (Illa) respectively.
  • Figure 5 shows, on the left panel, the chromatogram of the fermentation broth of the S. diastaticus var. 108 :: PMl-702B / 743B.
  • To the right of the chromatogram is the chemical structure deduced from the compounds detected in the chromatography. The chemical structure was deduced based on the analysis of mass spectrometry.
  • Figure 6 shows the HPLC analyzes of the in vitro amidotransferase activity assays carried out with acellular extracts of S. diastaticus var.
  • the chromatograms of the left and right columns show the reaction at incubation times of 0 and 60 minutes, respectively.
  • the peaks are: a. CE-108B; b. CE-108; C. rimocidine B; d. rimocidine; and. pimaricin; F. AB-400
  • the present invention describes a new polyethylene macrolide compound characterized by the formula (I):
  • R 1 is C 1 -C 3 alkyl
  • R2 is a functional group chosen from CH 3 - or CONH 2 - (methyl or primary amide), its isomers, salts, prodrugs or solvates.
  • the compounds of the present invention represented by the formula (I) described above may include isomers, depending on the presence of multiple bonds (eg, Z, E), including optical isomers or enantiomers, depending on the presence of chiral centers.
  • the individual isomers, enantiomers or diastereoisomers and mixtures thereof fall within the scope of the present invention.
  • the individual enantiomers or diastereoisomers, as well as mixtures thereof, can be separated by conventional techniques.
  • salt includes both pharmaceutically acceptable salts, that is, salts of the compound of formula (I) that can be used in the manufacture of a medicament, as pharmaceutically unacceptable salts since these may be useful. in the preparation of pharmaceutically acceptable salts.
  • the nature of the pharmaceutically acceptable salt is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • pharmaceutically acceptable salts of the compounds of formula (I) are acid addition salts, which can be obtained from acids, organic or inorganic, by conventional methods well known to those skilled in the art by reacting the acid appropriate with the compound of formula (I) in the appropriate stoichiometric amount.
  • prodrugs of the compounds of formula (I) are also be used to obtain said salts of Acid addition.
  • prodrug includes any compound derived from a compound of formula (I), for example, esters, including carboxylic acid esters, amino acid esters, phosphate esters, metal salt sulphonate esters, etc., carbamates, amides, etc., which, when administered to an individual, is capable of providing, directly or indirectly, said compound of formula (I) in said individual.
  • said derivative is a compound that increases the bioavailability of the compound of formula (I) when administered to an individual or that enhances the release of the compound of formula (I) in a biological compartment.
  • the nature of said derivative is not critical as long as it can be administered to an individual and provides the compound of formula (I) in a biological compartment of an individual.
  • the preparation of said prodrug can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art.
  • solvate includes both pharmaceutically acceptable solvates, that is, solvates of the compound of formula (I) that can be used in the manufacture of a medicament, as pharmaceutically acceptable solvates, which may be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable solvates or salts.
  • pharmaceutically acceptable solvate is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • the solvate is a hydrate. Solvates can be obtained by conventional solvation methods well known to those skilled in the art.
  • the compounds of formula (I), their isomers, salts, prodrugs or solvates will preferably be found in a pharmaceutically acceptable or substantially pure form, that is, having a pharmaceutically acceptable level of purity excluding normal pharmaceutical additives such as diluents and carriers, and not including material considered toxic at normal dosage levels.
  • the purity levels for the active ingredient are preferably greater than 50%, more preferably greater than 70%, more preferably greater than 90%. In a preferred embodiment, they are greater than 95% of the compound of formula (I), or of its salts, solvates or prodrugs.
  • the compounds of the invention also include compounds that differ only in the presence of one or more isotopically enriched atoms.
  • compounds having said structure, except for the replacement of a hydrogen with a deuterium or tritium, or the replacement of a carbon with a carbon enriched in 13 C or 14 C or a nitrogen enriched in 15 N are within of the scope of this invention.
  • the invention relates to a compound of formula (1-1), amidated derivative of the polyene of the invention of formula (I):
  • R is NH 2 ;
  • R 1 is C 1 -C 3 alkyl, or an isomer, salt, prodrug or solvate thereof.
  • said compound of formula (I-1) is selected from the group consisting of the compounds identified in this description as "rimocidine B", of formula (I-la), and "CE-108B", of formula ( Mb):
  • the invention also relates to a compound of formula (III), methylated derivative of the polyene of the invention of formula (I):
  • R is C 1 -C 3 alkyl , or an isomer, salt, prodrug or solvate thereof.
  • said compound of formula (III) is selected from the group consisting of the compounds identified in this description as "rimocidine C", of formula (Illa), and "CE-108C”, of formula (HIb).
  • rimocidine C Illa
  • CE-108C HIb
  • the chemical structure of these compounds has been characterized by various techniques as well as their biological activity (for example, mass spectrometry, NMR, antibiograms, hemolytic activity, etc.).
  • the antifungal activity unlike the amidated polyenes, does not increase with respect to the parental compounds rimocidine and CE-108; however, the toxicity measured in hemolytic terms is more reduced than that of the compounds rimocidine and CE-108, which also implies an increase in the selective toxicity towards fungal membranes compared to native polyenes (Example 2).
  • the compounds of formula (I), and among them the compounds of formula (Il) and (III) have, in general, biocidal activity, and, in particular, biocidal activity against organisms that possess an ergosterol-containing cell membrane, by what are potentially useful as biocides.
  • a "biocide” is a chemical that stops growth or kills different types of living things.
  • organisms that possess an ergosterol-containing cell membrane includes any organism provided with an ergosterol-containing cell membrane, for example, fungi, parasites, etc.
  • fungi include Trypanosoma, Leishmania, etc. parasites, as well as fungi such as Fusarium oxysporium, Botrytis cinerea (phytopathogens), Candida albicans, Candida cruzei, Aspergillus niger, Criptococcus neoformans (human pathogens), among others .
  • said compounds of formula (I), and among them the compounds of formula (I-1) and (III), and in particular, the compounds rimocidine B (I-la), CE-108B (I-Ib) , rimocidine C (Illa) and CE-108C (HIb) are potentially useful as biocides against such organisms that possess an ergosterol-containing cell membrane.
  • said compounds are more useful as antiparasitic agents or as antifungal agents than the corresponding non-amidated polyenes.
  • antifungal includes both fungicides and fungistatics.
  • the invention relates to a biocidal composition
  • a biocidal composition comprising a compound of formula (I), and among them compounds of formula (1-1) and (III), together with an inert carrier.
  • said compound of formula (I) is selected from the group of formula (I-1), and preferably by rimocidine B (I-la), CE-108B (I-Ib) and mixtures thereof;
  • said compound of formula (III) is selected from the group of formula (III), and preferably by rimocidine C (Illa), CE-108C (IHb) and mixtures thereof.
  • Said biocidal composition is particularly useful against organisms that possess ergosterol-containing cell membranes.
  • said biocidal composition is an antifungal composition
  • a compound of formula (I) such as a compound selected from the compounds rimocidine B (Ila), CE-108B (I-Ib), rimocidine C (Illa ), CE-108C (HIb) and mixtures thereof, together with, optionally, one or more vehicles inert
  • inert means that said vehicle does not have a significant biocidal activity.
  • said biocidal composition may contain, in addition, other biocides, natural, recombinant or synthetic, which, if necessary, enhance the biocidal action of said compound of formula (I), for example, of the rimocidine compounds B (Ila) ) and / or CE-108B (Mb), rimocidine C (Illa), CE-108C (IHb) and their mixtures or that increase their spectrum of action.
  • biocides natural, recombinant or synthetic
  • the invention provides a pharmaceutical composition comprising a compound of formula (I), and among them a compound of formula (I-1) or (III) or mixtures thereof, together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • said compound of formula (I) is selected from the compounds rimocidine B (I-la), CE-108B (I-lb) and mixtures thereof, as well as the compounds of formula (III) are selected from rimocidine C (Illa), CE-108C (HIb) compounds and mixtures thereof.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical administration forms and includes adjuvants, solids or liquids, solvents , surfactants, etc.
  • said pharmaceutical composition may also contain one or more therapeutic agents that, if necessary, enhance the therapeutic action of said compounds of formula (I), for example, of the compounds rimocidine B, CE -108B, rimocidine C, CE -108C or increase their spectrum of action.
  • Said pharmaceutical composition can be used to prevent and / or treat infections caused by pathogenic organisms of humans or animals that possess ergosterol-containing cell membranes, for example, parasites and pathogenic fungi of humans or animals.
  • said pharmaceutical composition is an antiparasitic composition and can be used in the prevention and / or treatment of infections caused by parasites whose cell membranes contain ergosterol, for example, Trypanosoma, Leishmania, etc.
  • said antiparasitic composition may also contain one or more antiparasitic agents that, if necessary, enhance the therapeutic action of compounds of formulas (I), for example, of the compounds rimocidine B, CE-108B, rimocidine C, CE -108C or increase their spectrum of action.
  • said pharmaceutical composition is an antifungal composition and can be used in the prevention and / or treatment of fungal infections (whose cell membranes contain ergosterol).
  • said antifungal composition may also contain one or more antifungal agents that, if necessary, potentiate the antifungal action of compounds of formulas (I), for example, rimocidine B, CE -108B, rimocidine C, CE-108C, or that increase their spectrum of action.
  • antifungal agents include polyenes, such as amphotericin B, nystatin, AB-400, allylamines (e.g., terbinafine, naphthifine, etc.), amorolfia, tolnaphthalate, etc .; azoles, such as clotrimazole, miconazole, ketoconazole, fluconazole, itraconazole, etc .; benzof ⁇ ranos, for example, griseofulvin, etc .; pyrimidines, for example, fluocytosine, etc.
  • polyenes such as amphotericin B, nystatin, AB-400, allylamines (e.g., terbinafine, naphthifine, etc.), amorolfia, tolnaphthalate, etc .
  • azoles such as clotrimazole, miconazole, ketoconazole, fluconazole, itraconazole, etc
  • the pharmaceutical composition provided by this invention contains between 0.01% and 99.99% by weight of a compound of formula (I), such as a compound selected from the compounds rimocidine B (I-la) , CE-108B (I-lb), rimocidine C (Illa), CE-108C (HIb) and mixtures thereof, and may be presented in any appropriate pharmaceutical form of administration depending on the route of administration chosen, for example, oral, parenteral or topical.
  • a compound of formula (I) such as a compound selected from the compounds rimocidine B (I-la) , CE-108B (I-lb), rimocidine C (Illa), CE-108C (HIb) and mixtures thereof, and may be presented in any appropriate pharmaceutical form of administration depending on the route of administration chosen, for example, oral, parenteral or topical.
  • the invention also relates to the use of a compound of formula (I) and / or (III) in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of infection caused by pathogenic organisms of humans or animals whose cell membranes contain ergosterol, for example, human parasites or animals or human or animal pathogenic fungi.
  • said compound of formula (I) and / or (III) is selected from rimocidine B (Ila), CE-108B (T-Ib), rimocidine C (Illa), CE-108C (HIb) and their mixtures.
  • the invention also provides a method for preventing and / or treating infections caused by pathogenic organisms of humans or animals whose cell membranes contain ergosterol, for example, parasites of humans or animals or pathogenic fungi of humans or animals, which comprises the step of administering to an animal or a human being, in need of treatment, a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition provided by this invention.
  • the invention provides an antifungal composition useful for controlling infection caused by phytopathogenic fungi (such as Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solana, Rhizoctonia meloni, Ustilago mayan, among others) whose cell membranes contain ergosterol, which comprises a compound of formula (I) and / or (III), such as a compound selected from the compounds rimocidine B (I-la), CE-108B (Mb), rimocidine C (Illa), CE-108C (HIb) and mixtures thereof , together with, optionally, one or more agriculturally acceptable inert vehicles.
  • phytopathogenic fungi such as Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solana, Rhizoctonia meloni, Ustilago mayan, among others
  • ergosterol which comprises a compound of formula (I) and / or (III), such as a compound selected from the compounds
  • control includes the inhibition, reduction or paralysis of spore germination and / or fungal mycelium growth that may result in the removal of such fungi or in the reduction of damage caused for these.
  • agriculturally acceptable inert vehicle refers to those substances, or combination of substances, known in the agricultural sector, used to vehicle compounds of interest, and includes adjuvants, solids or liquids, diluents, solvents, surfactants , etc.
  • said antifungal composition further comprises of said compound of formula (I) and / or (III), for example, a compound selected from rimocidine B (I-la), CE-108B (I-lb), rimocidine C (Illa), CE-108C (HIb ) and mixtures thereof, one or more compounds with antifungal activity, for example, one or more compounds that alter the fungal cell membrane, or one or more compounds that inhibit ergosterol synthesis, such as the compounds mentioned above, or one or more compounds with enzymatic activities required for the modification or degradation of cell walls, for example, one or more lithic enzymes capable of modifying or degrading fungal cell walls, such as enzymes with cellulolytic, mannanolytic, chitinolytic or proteolytic activity (eg, cellulases, ⁇ - (l, 3) -glucanases, ⁇ - (l, 6) -glucanases, ⁇ - (l, 3) -glucanases,
  • the antifungal composition useful for controlling phytopathogenic fungi contains between 0.01% and 100% by weight of said compound of formula (I) and / or (III), for example, of said compounds rimocidine B (I-la), CE-108B (I-lb), rimocidine C (Illa), CE-108C (IHb).
  • Said composition may be prepared by conventional methods and may be presented in liquid or solid form, for example, in the form of a granulate. Additionally, said composition may contain additives, for example, preservatives and stabilizers that prolong the preservation and stability thereof.
  • Said antifungal composition can be used, for example, to control infections caused by phytopathogenic fungi in plants and / or fruits. Therefore, the invention provides a method for controlling infection caused by a phytopathogenic fungus in a plant, in particular, a phytopathogenic fungus whose cellular membrane contains ergosterol, which comprises applying to said plant, or to the surrounding environment, said composition for control said phytopathogenic fungus.
  • said method comprises the application of said composition, in a suitable amount, on the aerial parts of the plant in order to prevent and / or treat a fungal infection caused by a phytopathogenic fungus.
  • the invention also provides a method for controlling infection caused by phytopathogenic fungi in a fruit, in particular, a phytopathogenic fungus whose cell membrane contains ergosterol, which comprises applying said fruit to said fruit.
  • composition to control phytopathogenic fungi.
  • the application of said composition, in an effective amount, on the fruit is carried out prior to its collection (pre-harvest) while in another alternative embodiment the application of the composition is carried out on the fruit already collected (post-harvest).
  • the invention provides an antifungal composition useful for the control of fungi that can eventually be developed on food preparations, for example, on the surface of food preparations, such as dairy derivatives, for example, cheeses, etc., comprising a compound of formula (I) such as a compound selected from the compounds rimocidine B (Ila), CE-108B (I-lb), rimocidine C (Illa), CE-108C (IHb) and mixtures thereof, together with, optionally, one or more inert vehicles acceptable from the agri-food point of view, such as liposomal suspensions, in water, etc., among others.
  • a compound of formula (I) such as a compound selected from the compounds rimocidine B (Ila), CE-108B (I-lb), rimocidine C (Illa), CE-108C (IHb) and mixtures thereof, together with, optionally, one or more inert vehicles acceptable from the agri-food point of view, such as liposomal
  • control includes the inhibition, reduction or paralysis of spore germination and / or fungal mycelium growth that may result in a marked decrease in the damage caused by them; in this way the food spoil caused by the growth of fungi can be prevented or treated.
  • inert agri-food vehicle refers to those substances, or combination of substances, known in the agri-food sector, used to vehicle compounds of interest, and includes adjuvants, solids or liquids, diluents, solvents, surfactants , etc.
  • said antifungal composition comprises, in addition to said compound of formula (I) for example, a compound selected from rimocidine B (I-la), CE-108B (I-lb), rimocidine C (Illa), CE -108C (HIb) and mixtures thereof, one or more compounds with antifungal activity, for example, one or more compounds that alter the fungal cell membrane, or one or more compounds that inhibit ergosterol synthesis, such as the compounds mentioned previously, or one or more compounds with enzymatic activities required for the modification or degradation of cell walls, for example, one or more lytic enzymes capable of modify or degrade fungal cell walls, such as enzymes with cellulolytic, mannanolytic, chitinolytic or proteolytic activity (eg, cellulases, ⁇ - (1, 3) -glucanases, ⁇ - (l, 6) -glucanases, ⁇ - (l, 3) -glucanases, mannanas, endo-
  • the compound of formula (I) will be present in said antifungal composition in an effective antifungal amount, that is, in an appropriate amount to control the infection caused by fungi susceptible to developing on food preparations.
  • said antifungal composition useful for controlling fungi capable of developing on food preparations provided by this invention contains between 0.01% and 100% in weight of said compound of formula (I), for example, of said compounds rimocidine B (I-la), CE -108B (I-lb), rimocidine C (Illa), CE-108C (HIb).
  • Such composition can be prepared by conventional methods and it can be presented in liquid or solid form, for example, in the form of a granulate. Additionally, said composition may contain additives, for example, preservatives and stabilizers that prolong the preservation and stability thereof.
  • Said antifungal composition can be used to control infections caused by fungi that can develop in food preparations, for example, on the surface of food preparations. Therefore, the invention also provides a method of controlling infection caused by a fungus capable of developing in a food preparation, in particular, a fungus capable of developing in a food preparation whose cell membrane contains ergosterol, which comprises applying to said food preparation. , or to the surrounding environment, said antifungal composition to control said fungus capable of developing in a food preparation.
  • said method comprises the application of said composition, in a suitable amount, on the surface of the food preparation in order to prevent and / or treat the food spoil due to physical growth.
  • Said antifungal composition is applied externally on the surface of the food preparation.
  • Plasmid pSM743B (Table 1, Example 1) ( Figure IA) is derived from plasmid pIJ922 and comprises the rimA gene and the erythromycin resistance (ermE) gene. Plasmid pSM784 (Table 1, Example 1) ( Figure IB) is derived from plasmid pIJ941 and contains the erythromycin resistance gene (ermE).
  • Such plasmids pIJ922 and ⁇ IJ941 are vectors derived from the SCP2 * replicon, a low copy plasmid from Str-eptomyces coelicolor.
  • the invention relates to a process for the production of a compound of formula (I-1), which comprises culturing a microorganism selected from Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108 / 743B, Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-500 / 743B and combinations thereof, under conditions that allow the production of compounds of formula (I), and, if desired, isolate and purify said compounds.
  • the compounds of formula (I) are selected from rimocidine B (I-la), CE-108B (I-lb) and mixtures thereof.
  • the formation of the amide group in polyenes is due to an "adornment" activity due to an amidotransferase.
  • an amidotransferase activity ATP / Mg dependent and capable of using glutamine as a donor of amide groups see Example 2, section B.
  • amidotransferase activity present in the acellular extracts of the genetic recombinants of S. diastaticus var. 108 has a relaxed specificity towards the substrate being able to modify not only the native substrates rimocidine (lia) and CE-108 (Hb) in their corresponding amides rimocidine B (I-la) and CE-108B (I-Ib), but which is also able to recognize heterologous substrates such as pimaricin (IVa). This did not occur for the amidotransferase activity of Streptomyces sp. RGU5.3, being only able to recognize pimaricin (IVa) as a substrate under the conditions tested.
  • the free carboxyl group is fairly conserved in most typical polyenes, such as amphotericin B, nystatin, pimaricin (IVa), candicidine, etc.
  • the substitution of these carboxylic groups with amide groups would probably also result in knotted polyenes with improved pharmacological properties, such as higher water solubility, higher antifungal activity, and lower hemolytic activity. In short, the compounds would have greater selective toxicity against fungi.
  • the invention provides an enzymatic process, hereinafter enzymatic method of the invention, to obtain a polyene amidated from polyenes with free carboxylic groups in the macrolactone ring using acellular extracts of strains producing polyenes knotted by the following steps: a) fine-tuning a mixture with a substrate consisting of a polyene with free carboxylic groups or mixtures of several of them, purified or not, and a protein extract from a strain or strains producing amidated polyenes, and b ) reaction of the mixture of a) under conditions: of dependence on ATP / Mg and capable of using glutamine as a donor of amide groups, and c) purification of the aminated polyenes.
  • a particular object of the invention is the enzymatic process of The invention in which the aminated polyene to be obtained is CE-108B (I-lb), rimocidine B (I-Ia) or mixtures thereof, the substrate polyene of a) is CE-108 (Hb), rimocidine (lia) or their mixtures, purified or not, and in which the extract of a) is obtained from the following strains: S. diastaticus var. 108/784 and S. diastaticus var. 108 / 743B.
  • Another particular object of the invention is the enzymatic process of the invention in which the aminated polyene to be obtained is AB-400 (IVb), the substrate polyene of a) is pimaricin (IVa), purified or not, and in which the extract of a) is obtained from the following strains: S. diastaticus var. 108/784 and & diastaticus var. 108 / 743B.
  • Another particular object of the invention is the enzymatic process of the invention in which the aminated polyene to be obtained is AB-400 (IVb), the substrate polyene of a) is pimaricin (IVa), purified or not, and in which the extract of a) is obtained from the strain Streptomyces sp. RGU5.3.
  • the invention relates to acellular extracts from producers of amidated polyenes, carriers of an amidotransferase activity, capable of converting or in vitro "carboxylated polyenes into their corresponding amides necessary for the implementation of the enzymatic process of the invention.
  • Acellular extracts are those extracts from the homogenization of cells by various mechanical procedures (usually applicable in the field of protein manipulation) and subsequent fractionation either by filtration or differential centrifugation, to have clarified containing most of the cellular components either in suspension or in solution.
  • the invention relates to the acellular extracts of microorganisms S. diastaticus var. 108 / 743B, S. diastaticus var. 108/784 (DSM 17187) - both producers of the aminated polyenes CE-108B (I-lb) and rimocidine B (I-la) - carriers of an amidotransferase activity capable of converting rimocidine (lia) and CE-108 (Hb ) in addition to other heterologous substrates in their corresponding amides; and the acellular extract of the microorganism Streptomyces sp. RGU5.3 (producer of the aminated polyene AB-400 (IVb)), capable of converting at least pimaricin (IVa) into its corresponding amide AB-400 (IVb) under the conditions tested.
  • DSM 17187 both producers of the aminated polyenes CE-108B (I-lb) and rimocidine B (
  • the enzymatic process of the present invention can be performed using conventional methods of immobilized enzyme systems (acellular extract of the invention) on solid supports by flowing the components of the reaction with the corresponding mobile phases, following the technology of the field of immobilized systems known by an average technician in the sector.
  • immobilized enzyme systems acellular extract of the invention
  • CE-108C CE-108C (HIb) are present in the fermentation broth of the microorganism identified in this description as Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B, obtained by disruption of the rimG gene by homologous recombination with the recombinant phage PMl -768 (see Table 1, Example 2) and by transfer of plasmid pSM743B by conjugation from the Streptomyces diastaticus var. 108 / 743B as shown in Table 1, Example 1.
  • Both the fragment to generate the disruption of the rimG gene, and the fragment containing the complete rimA gene to avoid polar effects can easily be obtained by people with some ability in the field, by conventional techniques of amplification of deoxyribonucleic acid (DNA).
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • the strain deposited in Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSMS), Braunschweig, Germany (accession number DSM 17187) can be used.
  • the corresponding vectors can be introduced by conventional techniques (transformation, transfection, conjugation, etc.) into strain DSM 17187 indicated above.
  • the recombinant phage PMl -768 was obtained from the phage
  • Said compounds rimocidin C (Illa) and CE-108C (HIb) can be obtained directly from the fermentation broth of the microorganism Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B and easily purified by relatively simple conventional procedures, for example, by using hydrophobic or reverse phase interaction columns.
  • the invention relates to a process for the production of a compound of formula (III), which comprises the following steps: culture of the microorganism Streptomyces diastaticus var. 1O8 :: PM1-768 / 743B under conditions that allow the production of compounds of formula (III), obtaining the fermentation broth and, if desired, the isolation and purification of said compounds of formula (III).
  • the process is carried out to obtain the compounds of formula (III) that are selected from rimocidine C (Illa), CE-108C QEb) and mixtures thereof.
  • the culture medium of said recombinant microorganism comprises, in general, one or more carbon sources, one or more nitrogen sources, one or more inorganic salts assimilable by the microorganism, and, if necessary, one or more organic nutrients, such as vitamins and amino acids, dissolved in an aqueous medium.
  • Said means, as well as the appropriate conditions are known to those skilled in the art.
  • Illustrative, non-limiting examples of the means and conditions for growing said recombinant microorganism are mentioned in Example 2 of the invention (section "Experimental procedures").
  • the fermentation broth of said recombinant microorganisms Streptomyces diastaticus and ⁇ X.
  • SUS functional equivalents comprises a compound selected from a compound of formula (III), for example, rimocidine C (Illa), CE-108C (HIb) and mixtures thereof, and can be used as such or It may well be subsequently treated to separate the compound of interest, which can be isolated by conventional methods.
  • the cell culture is centrifuged to separate the supernatant and the cell extract and the supernatant is used to isolate and, if desired, purify, the polyene, amidated or non-amidated, of interest.
  • the study of the physical-chemical characteristics of said compounds allows a technician to design a procedure for purification from the supernatant.
  • the invention relates to a microorganism selected from Streptomyces diastaticus var. 108 / 743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784 and Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-500 / 743B 5 and provides a culture of a microorganism selected from Streptomyces diastaticus var.
  • the invention relates to the use of a microorganism selected from Streptomyces diastaticus var. 108 / 743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-500 / 743B and combinations thereof, or of said culture of microorganisms selected from Streptomyces diastaticus var. 108 / 743B, Streptomyces diastaticus var. 108 / 743B, Streptomyces diastaticus var.
  • the compound of formula (I-1) is selected from rimocidine B (I-Ia), CE-108B (I-Ib) and mixtures thereof.
  • the tests carried out by the inventors showed that the fermentation broth of said recombinant microorganisms Streptomyces diastaticus var. 108 / 743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784 and Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-500 / 743B also contains, in addition to the knotted polyamines rimocidine B (I-la) and / or CE-108B (I-lb), the non-knotted polyenes rimocidine (lia) and / or CE-108 ( Hb), which contain a free carboxyl group.
  • the invention relates to a process for the production of a compound selected from a compound of formula (I), rimocidine (lia), CE-108 (Hb) and mixtures thereof, which comprises culturing a microorganism. selected from Streptomyces diastaticus var. 108 / 743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-500 / 743B and combinations thereof, under conditions that allow the production of a compound selected from a compound of formula (I), rimocidine (lia), CE-108 (Hb) and mixtures thereof, and, if desired, isolate and purify said compound.
  • the compound of formula (I) is selected from rimocidine B (Ila), CE-108B (I-lb) and mixtures thereof.
  • the compound of formula (I) is selected from rimocidine B (Ila), CE-108B (I-Ib) and mixtures thereof.
  • the culture medium of said recombinant microorganisms comprises, in general, one or more carbon sources, one or more nitrogen sources, one or more inorganic salts assimilable by the microorganism, and, if necessary, one or more organic nutrients, such as vitamins and amino acids, dissolved in an aqueous medium.
  • Said means, as well as the appropriate conditions are known to those skilled in the art.
  • Illustrative, non-limiting examples of the means and conditions for growing said recombinant microorganisms are mentioned in the Example (section "Experimental procedures").
  • the fermentation broth of said recombinant microorganisms selected from Streptomyces diastaticus var.
  • 108 / 743B Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-500 / 743B and combinations thereof, comprises a compound selected from a compound of formula (I), for example, rimocidine B (I-la), CE-108B (I-Ib), rimocidine (lia ), CE-108 (Hb) and mixtures thereof, and can be used as such or it can be subsequently treated to separate the compound or compounds of interest, which can be isolated by conventional methods.
  • a compound of formula (I) for example, rimocidine B (I-la), CE-108B (I-Ib), rimocidine (lia ), CE-108 (Hb) and mixtures thereof, and can be used as such or it can be subsequently treated to separate the compound or compounds of interest, which can be isolated by conventional methods.
  • the cell culture is centrifuged to separate the supernatant and the cell extract and the supernatant is used to isolate and, if desired, purify, the polyene, amidated or non-amidated, of interest.
  • the study of the physicochemical characteristics of said compounds allows to design a procedure for purification from the supernatant.
  • the microorganism Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B, or any other functional equivalent are part of the present invention. Therefore, in another aspect, the invention relates to the microorganism Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B or functional equivalents useful for carrying out the procedure for obtaining the compounds of formula (III) and providing a culture of these microorganisms.
  • a particular embodiment of the invention is the Streptomyces diastaticus var.
  • the term "functional equivalent” refers to an element - be it a microorganism, vector, genetic construct, or fragment of a gene, method of disruption of a gene, of genetic transformation of a cell or microorganism, as the case may be - that can be developed by an average technician in the field with the different existing alternatives and that has identical or homologous characteristics to the original element referred to.
  • “functional equivalent / s” means those recombinant microorganisms that can be obtained either by chromosomal deletion of the rimG gene, rather than inactivating insertion or with any other technique; said deletion can be easily made by using conventional vectors either non-replicative plasmids or being replicative with thermosensitive origin of replication. These deletions or insertions can be made by a technician with some experience in the field.
  • the invention relates to the use of the microorganisms Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B or its functional equivalents for obtaining a compound of formula (III).
  • the compound of formula (III) is selected from rimocidine C (Illa), CE-108C (IHb) and mixtures thereof.
  • the fermentation broth thus obtained with the process of the invention can be used directly for the preparation of certain biocidal solutions, without the need to purify the compounds of the present invention.
  • the fermentation broth of the microorganisms Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B or its functional equivalents indicated above, which comprises a compound of formula (III) may be potentially useful as a biocide and constitutes an additional aspect of this invention.
  • Plasmid pSM784 derived from vector pIJ941 on which the erythromycin resistance gene has been cloned, when introduced into S. diastaticus var. 108, gives place to a strain (S. diastaticus var. 108/784) producing the new rimocidine B (I-la) and CE-108B (I-lb) amidated polyenes, in addition to rimocidine (lia) and CE-108 (Hb) .
  • plasmid pSM743B derived from an SCP2 * vector plus the ermE and carrier gene, in addition to a fragment of the rim cluster (comprising the rim ⁇ gene) expressed under a promoter, endogenous or exogenous, such as the xysA promoter
  • the invention relates to a vector, hereinafter vector of the invention, selected from: a) a vector derived from the vector SCP2 *, or a fragment thereof, which comprises the origin of replication of SCP2 * and the erythromycin resistance gene (ermE); b) a vector comprising (i) the origin of replication of the vector SCP2 *, (ii) the ermE gene, and (iii) a fragment of the vector SCP2 *; c) a vector comprising (i) an origin of replication, (ii) the ermE gene, and (iii) a fragment of the vector SCP2 *, wherein said origin of replication is different from the origin of replication of the vector SCP2 *; d) a vector that has no origin of replication and comprises the ermE gene and a fragment of the vector SCP2 *; e) a vector derived from the vector SCP2 * comprising (i) an origin of replication, (ii) the ermE gene
  • Virtually any vector derived from the vector SCP2 * can be used, for example, pIJ922, pIJ941, etc.
  • the ermE gene is a known gene (Uchiyama et al.,
  • the term "SCP2 * vector fragment” refers to a nucleic acid comprising one or more SCP2 * fragments sufficient to induce the formation of knotted polyenes. Tests carried out by the inventors have shown that a nucleic acid comprising one or more fragments of the SCP2 * vector, together with the ermE gene, is necessary and sufficient for the aminated polyenes to be generated in recombinant microorganisms.
  • the vector of the invention is a replicative vector derived from SCP2 *, which contains the origin of SCP2 * replication, and is also a carrier of the ermE gene, for example, pSM784.
  • Said plasmid may be introduced by conventional methods (eg, transformation, electroporation, conjugation, etc.) into microorganisms producing polyane macrolides containing a free carboxyl group (eg, amphotericin B, nystatin, rimocidine, pimaricin, candicidine, etc.), in order to produce the corresponding aminated polyenes.
  • microorganisms include S. noursei, S. albidus, S. rimosus, S. nodosus, S. natalensis, S. chattanoogensis, S.griseus, etc.
  • the vector of the invention is a replicative vector comprising the origin of replication of the vector SCP2 *, the ermE gene and a fragment of the vector SCP2 *.
  • the vector of the invention is a replicative vector comprising an origin of replication different from the origin of replication of SCP2 *, the ermE gene and a fragment of the vector SCP2 *.
  • the vector of the invention is an integrative or non-replicative vector that has no origin of replication and comprises the ermE gene and a fragment of the vector SCP2 *.
  • the vector of the invention is a replicative vector. comprising 'a replication origin equal to or different from the replication origin of SCP2 * vector, the gene ermE and the entire biosynthetic cluster of a polyene or a fragment of said cluster.
  • the vector of the invention is a replicative vector comprising an origin of replication equal to or different from the origin of replication of the vector SCP2 *, the ermE gene, a fragment of the vector SCP2 * and the entire biosynthetic cluster of a polyene or a fragment of said cluster.
  • the vector of the invention is an integrative or non-replicative vector that has no origin of replication and comprises the ermE gene and the entire biosynthetic cluster of a polyene or a fragment of said cluster.
  • the vector of the invention is an integrative or non-replicative vector that lacks origin of replication and comprises the ermE gene, a fragment of the vector SCP2 * and the entire biosynthetic cluster of a polyene or a fragment of said cluster .
  • vectors of the invention comprising the entire biosynthetic cluster of a polyene or a fragment thereof are used to transform polyene producing microorganisms with free carboxyl groups, the production of knotted polyenes and / or an increase in the total production of both amidated polyenes such as non-amidated polyenes, whereby said vectors can be used to increase the total production of polyenes with free carboxylic groups and / or aminated polyenes in polyene producing organisms.
  • any biosynthetic cluster of a polyene or fragment thereof can be present in the vector of the invention; however, in a particular embodiment said vector comprises the entire rim cluster, rimocidine biosynthetic, or a fragment thereof (Seco E.M., et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366). Although any fragment of the rim cluster can be used, in a specific embodiment, said fragment of the rim cluster comprises the rimA gene of the rim cluster.
  • Said biosynthetic cluster of a polyene or fragment thereof may, optionally, be under the control of a promoter (ie, operatively linked to said promoter so as to direct the expression of the gene it controls).
  • Said promoter can be endogenous or exogenous.
  • said exogenous promoter is a functional promoter in Streptomyces sp., such as the xysA (xysAp) promoter of the Streptomyces halstedü JM8 xylanase gene (Ruiz-Arribas A., et al., 1997, Appl. Environ.
  • Plasmid pSM743B is an illustrative example of this type of vectors of the invention.
  • the vectors of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor, NY, 1989).
  • the vectors of the invention can be used to generate amidated or non-amidated polyenes in polyene producing microorganisms containing a free carboxyl group.
  • combinations of vectors containing, on the one hand, (i) a vector comprising a biosynthetic cluster of a polyene, such as the rim cluster, or a fragment thereof, and, on the other hand, (ii) a derived vector of SCP2 * comprising the ermE gene, or a vector comprising an origin of replication different from that of SCP2 *, the ermE gene and a fragment of the vector SCP2 *, can be introduced into microorganisms producing polyane macrolides having carboxyl groups, to generate aminated or non-amidated polyenes in said microorganisms.
  • the invention relates to the use of a vector of the invention to be introduced, by conventional methods, into microorganisms producing polyethylene macrolides containing free carboxyl groups (eg, amphotericin B, nystatin, rimocidine, pimaricin , candicidine, etc.), in order to produce the corresponding amidated polyenes from the corresponding recombinant microorganisms generated.
  • a vector of the invention to be introduced, by conventional methods, into microorganisms producing polyethylene macrolides containing free carboxyl groups (eg, amphotericin B, nystatin, rimocidine, pimaricin , candicidine, etc.), in order to produce the corresponding amidated polyenes from the corresponding recombinant microorganisms generated.
  • free carboxyl groups eg, amphotericin B, nystatin, rimocidine, pimaricin , candicidine, etc.
  • Microorganisms likely to be used as hosts of the vectors of the invention include polyene-producing microorganisms that have a free carboxyl group such as Streptomyces nodosus, a natural producer of amphotericin B; Streptomyces rimosus, producer of rimocidine; Streptomyces griseus, producer of candicidine; Streptomyces natalensis, producer of pimaricin; Streptomyces noursei, nystatin producer, etc.
  • polyene-producing microorganisms that have a free carboxyl group such as Streptomyces nodosus, a natural producer of amphotericin B; Streptomyces rimosus, producer of rimocidine; Streptomyces griseus, producer of candicidine; Streptomyces natalensis, producer of pimaricin; Streptomyces noursei, nystatin producer, etc.
  • the invention in another aspect, relates to a process for obtaining recombinant microorganisms producing polyethylene macrolides containing an amide group comprising introducing a vector of the invention into microorganisms producing polyethylene macrolides containing free carboxyl groups.
  • said recombinant microorganisms producing macrolides polyenes containing an amide group can be obtained by introducing into polysaccharide producing microorganisms polyenes containing free carboxyl groups combinations of vectors containing, on the one hand, (i) a vector comprising a biosynthetic cluster of a polyene, such as the rim cluster, or a fragment thereof, and, on the other hand, (ii) a vector derived from SCP2 * comprising the ermE gene, or a vector comprising an origin of replication different from that of SCP2 *, the ermE gene and a fragment of the SCP2 * vector, can be introduced into microorganisms producing polyane macrolides that have carboxyl groups, to generate knotted or non-knotted polyenes in said microorganisms.
  • microorganisms of the invention or combinations of vectors into said microorganisms can be carried out by conventional techniques known to those skilled in the art, eg, transformation, electroporation, conjugation, etc.
  • Illustrative, non-limiting examples of microorganisms producing polyane macrolides containing free carboxyl groups include various species of Streptomyces, for example, S. noursei, S. rimosus, S. nodosus, S. natalensis, S. griseus, etc.
  • Recombinant microorganisms obtained as previously indicated, hereinafter recombinant microorganisms of the invention, form part of the present invention and constitute an additional aspect of this invention.
  • the invention in another aspect, relates to a process for producing a polyene macrolide comprising culturing a recombinant microorganism of the invention under conditions that allow the production of said polyene macrolide, and, if desired, isolating and purifying said compound.
  • said polyene macrolide is selected from a polyene macrolide containing a free carboxyl group, a polyene macrolide containing an amide group and mixtures thereof.
  • polyene macrolides containing an amide group are compound AB-400 (IVb) and compounds of formula (1-1), for example, rimocidine compounds B (I-la), CE-108B (I-lb ) and their mixtures.
  • formula (I) for example, compounds selected from pimaricin (IVa), AB-400 (IVb), rimocidine (lia), rimocidine B (I-la), CE-108 (Hb), CE-108B (I-lb) and mixtures thereof.
  • Said recombinant microorganisms will be grown in any medium suitable for the fermentation of said microorganisms and will contain, in general, one or more carbon sources, one or more nitrogen sources, one or more inorganic salts assimilable by the microorganism, and, if necessary, one or more organic nutrients, such as vitamins and amino acids, dissolved in an aqueous medium, and the appropriate conditions (aeration / agitation, temperature and fermentation time, stages, etc.) for the growth of microorganisms and the production of polyane macrolides.
  • the polyene macrolides obtained are secreted to the culture medium from where they can be recovered by conventional procedures, for example, by the use of chromatographic methods, optionally after removal of the cell extract.
  • the polyene / s amidated / s of interest can be separated based on their physical-chemical characteristics, which allows to design a procedure for purification from the culture medium after the fermentation process.
  • the invention also relates to the use of recombinant phage PM1-768B, derived from actinophage PMl (Malpartida and Hopwood (1986) Mol. Gen. Genet. 205: 66-73) on which a fragment of DNA internal to the rimG gene has been cloned together with the ermEp promoter; the promoter in front of the fragment internal to the gene avoids possible polar effects on the genes located next to the insertion point.
  • a DNA fragment containing another functional promoter activity for Streptomyces can be used, cloned in front of any fragment internal to the rimG gene or obtained by amplification of the chromosomal DNA of the producer of rimocidine (lia) and CE-108 (Hb); the resulting construct can be cloned interchangeably in the PMl vector or in another non-replicative vector in Streptomyces (or being replicative subject to culture conditions where the vector does not replicate, such as thermosensitive replication plasmids), according to the methodology used in the field to which any operator with experience in the field has access.
  • 108 / PM 1-768) (or other functionally equivalent that could be generated by the procedures indicated above) should be a producer of intermediates of the biosynthetic pathway of rimocidine (lia) and CE-108 (Hb), since the insertion inactivating, it would only affect the ability of the recombinant to complete the oxidation of the methyl side group introduced by module 7 of the polyketide synthetase rimocidine (lia) and CE-108 (Hb) (Seco et al 2004, Chem Biol., Cited supra). However, under these first conditions, and unexpectedly the disruption in the rimG gene generated generated a recombinant unable to produce polyenes.
  • the disrupter must be supplemented with plasmid pSM743B or another functionally equivalent vector, capable of complementing a disruption of the rimA gene on the chromosome.
  • the genetic recombinant thus obtained would contain an additional copy of the rimA gene in plasmid pSM743B (or another functionally equivalent vector) in addition to the chromosome located following the disruption of the rimG gene.
  • Plasmid pSM743B (or another functionally equivalent vector, as indicated above) can be transferred by any technique usually available for Streptomyces manipulation (transformation of protoplasts, infection, conjugation, etc.). Once the constructs were confirmed, HPLC analyzes of the fermentation broth of the resulting strain (Streptomyces diastaticus var.
  • rimocidine C Illa
  • CE -108C IHb
  • CE-108 Ub
  • the rimG gene mutation can be performed by deletion of an internal fragment to the rimG gene, following conventional techniques for use for manipulation from Streptomyces.
  • the present invention relates to a method of obtaining the strain of the invention producing methylated polyenes S. diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B or its equivalents in which the resulting strain is exclusively affected in the expression of the rimG gene and because it comprises the following steps: a) Obtaining a mutant in the rimG gene of the S. diastaticus var. 108 or its functional equivalents by disruption or deletion of said gene, unable to produce polyenes, and b) its subsequent transformation with a vector, preferably a plasmid, capable of complementing the disruption of the rimA gene on the chromosome in said mutant.
  • a vector preferably a plasmid
  • the invention relates to a method of obtaining the microorganism of the invention in which the mutant of step a) is obtained by using the recombinant phage PMl-768 or any other inactivating system that is functionally equivalent to generate disruption or deletion of the rimG gene of the S. diastaticus var. 108 and in which step b) is performed with plasmid pSM743B (or functionally equivalent vector as indicated above) to complement the possible polar effect of the rimA gene on the recombinant chromosome.
  • the invention relates, in another aspect, to the disruption of the rimG gene on the chromosome of Sfreptomyces diastaticus var. 108 by any conventional method and using any appropriate vector.
  • Such interruption may be carried out using a strong promoter to avoid a polar effect such as the ermEp promoter (Kieser et al. (2000) Practical Streptomyces
  • the invention relates in another aspect to the disruption in other polyene producers of the gene coding for the cytochrome P450 monooxygenase involved in this same oxidation (formation of the carboxyl group from the methyl group of the corresponding polyenes) in order to obtain derivatives methylated thereof. It is described that a cytochrome P450 monooxygenase is involved in this oxidation, and is encoded in the biosynthetic clusters of polyenes described so far (Aparicio et al., 2003, Appl Microbiol Biotechnol 61: 179-188). Some genes involved in this oxidation have already been described, including the genespimG (Aparicio et al, 2000, Chem. Biol.
  • the invention relates to a method for obtaining microorganisms producing methylated polyethylene macrolides which comprises interrupting the gene coding for the cytochrome P450 monooxygenase involved in the formation of the free carboxyl group - gene homologous to the described gene.
  • HmG in other strains - in microorganisms producing polyene macrolides containing free carboxyl groups, using for this purpose any conventional method (transformation, conjugation, electroporation, infection, etc.).
  • the invention relates to the use of any vector to carry out a disruption of the gene coding for the cytochrome P450 monooxygenase involved in the formation of the free carboxyl group in microorganisms producing polyane macrolides containing free carboxyl groups, belonging among others, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: amphotericin B, nystatin, rimocidine, pimaricin and candicidine in order to produce the corresponding methylated polyenes.
  • Streptomyces nodosus natural producer of amphotericin B
  • Streptomyces rimosus producer of rimocidine
  • Streptomyces griseus producer of candicidine
  • Streptomyces natalensis producer of pimaricin
  • Streptomyces noursei nystatin producer.
  • the invention relates to the adequate expression of genes that could have been affected by a polar effect when disruption of the corresponding gene is carried out, using any vector as a vehicle (replicative plasmids, integrative plasmids, actinophages, etc.) and being introduced by any of the conventional methods (transformation, conjugation, electroporation, infection, etc.).
  • vectors for example, S. noursei, S. rimosus, S. nodosus, S. natalensis and S. griseus.
  • the invention in another aspect, relates to a process for producing a methylated polyene macrolide comprising culturing a genetically engineered microorganism of the invention under conditions that allow the production of said methylated polyene, and, if desired, isolating and purifying said compound which It is by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: methylated amphotericin B, methylated nystatin, methylated pimaricin and methylated candicidine.
  • Another additional object of the present invention is any of these new methylated polyenes, methylated amphoteric B, methylated nystatin, methylated pimaricin and methylated candicidine, which can be used for the preparation of biocidal and pharmacological compositions as in the case of rimocidin C and CE-180C.
  • Said genetically engineered microorganisms will be grown in any medium suitable for the fermentation of said microorganisms and will contain, in general, one or more carbon sources, one or more nitrogen sources, one or more inorganic salts assimilable by the microorganism, and, if it is necessary, one or more organic nutrients, such as vitamins and amino acids, dissolved in an aqueous medium, and appropriate conditions (aeration / agitation, temperature and fermentation time, stages, etc.) will be applied for the growth of microorganisms and production of polyene macrolides.
  • the polyene macrolides obtained are secreted to the culture medium from where they can be recovered by conventional procedures, for example, by the use of chromatographic methods, optionally after removal of the cell extract.
  • the methylated polyene / s of interest can be separated based on their physical-chemical characteristics, which allows to design a procedure for purification from the culture medium after the fermentation process.
  • Compound AB -400 (IVb), the amide corresponding to pimaricin (I Va), is a known natural product from Streptomyces costae (Ca ⁇ edo LM et al, 2000, J. Antibiot. (Tokyo) 53: 623-626) .
  • amidated polyenes are significantly more soluble in water than non-amidated homologs. This characteristic together with the pharmacological properties described above make this compound susceptible to being used clinically, for topical or systemic treatment of mycosis or parasitosis; and, in the agri-food industry.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the compound AB-400 (IVb) together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • said pharmaceutical composition may also contain one or more therapeutic agents that, if necessary, enhance the therapeutic action of said compound AB -400 (IVb), or increase its spectrum of action.
  • Said pharmaceutical composition can be used to prevent and / or treat infections caused by pathogenic organisms of humans or animals that possess ergosterol-containing cell membranes, for example, parasites and pathogenic fungi of humans or animals.
  • said pharmaceutical composition is an antiparasitic composition and can be used in the prevention and / or treatment of infections caused by parasites whose cell membranes contain ergosterol, for example, Trypanosoma, Leishmania, etc.
  • said antiparasitic composition may also contain one or more antiparasitic agents that, eventually, enhance the therapeutic action of said compound AB-400 (IVb) or increase its spectrum of action.
  • said pharmaceutical composition is an antifungal composition and can be used in the prevention and / or treatment of fungal infections (whose cell membranes contain ergosterol).
  • said antifungal composition may also contain one or more antifungal agents that, if necessary, potentiate the antifungal action of said compound AB -400 (IVb), or increase its spectrum of action.
  • antifungal agents include polyenes, such as amphotericin B, nystatin, AB-400 (IVb), allylamines (eg 5 terbinafma, naphthifine, etc.), amorolfia, tolnaphthalate, etc .; azoles, such as clotrimazole, miconazole, ketoconazole, fluconazole, itxaconazole, etc .; benzofurans, for example, griseo ⁇ ilvina, etc .; pyrimidines, for example, fluocytosine, etc .;
  • Compound AB-400 (IVb) will be present in said pharmaceutical composition in a therapeutically effective amount, that is, in an amount appropriate to exert its therapeutic effect.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention contains between 0.01% and 99.99% by weight of compound AB -400 (IVb), and can be presented in any pharmaceutical form of appropriate administration depending on the route of chosen administration, for example, oral, parenteral or topical.
  • a review of the different pharmaceutical forms for drug administration and their preparation methods can be found, for example, in the Tratado de Farmacia Galenica, C. Fauli i Trillo, I Edition, 1993, Luzan 5, SA de Ediations.
  • the invention also relates to the use of AB -400 (IVb) in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of infection caused by pathogenic organisms of humans or animals whose cell membranes contain ergosterol, by for example, parasites of humans or animals or pathogenic fungi of humans or animals.
  • the invention also provides a method for preventing and / or treating infections caused by pathogenic organisms of humans or animals whose cell membranes contain ergosterol, for example, parasites of humans or animals or pathogenic fungi of humans or animals, which comprises the step of administering to an animal or a human being, in need of treatment, a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition provided by this invention comprising the compound AB-400 (IVb).
  • Streptomyces diastaticus var. 108 and its derivatives by genetic modification were routinely grown in liquid and solid medium SYM2 (Atlas R.M.,
  • Streptomyces lividans TK21 was used as a general cloning host and grown in a solid R5 medium and YEME liquid medium as described in field manuals (Kieser T. et al, 2000, Practical Streptomyces Genetics, Norwich).
  • E. coli strains were grown on Luria-Bertani agar (LB) or in LB broths as described in the specialized literature (Maniatis T. et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY).
  • This invention with plasmid pSM743B; Producer of CE-108, rimocidine, CE-108B and rimocidine B
  • This invention plasmid pSM784; Producer of CE-108, rimocidine,
  • This invention replicates pHisl Vector in E, coli transporting the promoter
  • This invention pSM784 1.8 kb SspI-EcoRV fragment of pGAe-1 (gene of this invention ermE resistance) cloned into the EcoRV site of pIJ941 (see Figure 1) Ap, ampicillin; Km, Kanamycin; ermE, tsr and hyg: genes for resistance to erythromycin, thioestreptone and hygromycin B
  • Tests for the production of tetraenes The production of tetraenes was analyzed by extracting all of an aliquot from the culture with methanol as previously described (Seco E.M. et al., 2004, cited supra). The extracts were filtered and subjected to HPLC analysis with a Waters 600S Controller, equipped with Waters 996 PDA; The quantitative determination and chromatographic conditions were the same as those previously described (Pérez-Z ⁇ fiiga F.J., et al., 2004, cited above).
  • HPLC-MS assays Mass spectra were determined on an HPLC 1100MSD equipment connected to an Agilent Technology Detector quadrupole detector, using electrospray as a source and a positive ionization mode. The chromatographic conditions were the same as previously described (Pérez-Z ⁇ iga FJ., Et al., 2004, cited supra).
  • Streptomyces diastaticus var. 108/784, or possibly modified microorganisms with constructs capable of producing the amidated polyenes (as indicated above) were grown or cultivated either in SYM2 medium, solid or liquid (Pérez-Z ⁇ iga FJ, et al., 2004, cited supra ). After six days, the complete solid medium where the microorganisms were grown, was fragmented by shear by passing it through a 50 mL syringe; The solid medium thus fragmented was extracted with four volumes of methanol, previously acidified with 25 mM formic acid. The cultures from liquid medium were lyophilized before performing similar extractions with methanol.
  • the aqueous suspension was stirred for 1 hour and centrifuged at 5,000 g for 20 minutes to remove the solid particles in suspension.
  • the transparent supernatant was concentrated by broken-evaporation at 10-20 X 10 6 units per microliter ( ⁇ L) measured at a wavelength of 304 nanometers (nm).
  • the sample was subsequently stored in 80% methanol / water until it was used. Two hundred milliliters of the liquid cell culture or a plate (24 x 24 cm) whose culture was previously extracted with 5 volumes of methanol, resulted in a production of up to 40 mg of the amidated tetraenes mixture. Samples extracted in methanol were taken to 20% methanol with water and filtered to remove precipitated material.
  • the filtrate was slowly applied to an Omnifit column (250 x 25 mm, Supelco Cat No. 56010) previously filled with an ion exchange resin, such as SP-Sepharose, Phast Flow (Pharmacia) that was previously equilibrated with the same solution.
  • an ion exchange resin such as SP-Sepharose, Phast Flow (Pharmacia) that was previously equilibrated with the same solution.
  • rimocidine and compound CE-108 eluted with the front not attached to the column filler, as well as pigments from the culture; the corresponding rimocidine B (Ila) and CE-108B (I-Ib) amidated polyenes were completely retained.
  • the column, containing the compounds of interest retained in the solid phase was washed thoroughly with the same solution to remove those compounds that do not interact with the SP Sepharosa filler.
  • rimocidine B (I-la) and CE-108B (I-lb) aminated polyenes retained by column interaction, are eluted with 300 mM ammonium acetate pH 5 in 20% methanol collecting fractions at regular time intervals. From the eluted fractions, those containing mixtures of the amides of interest were selected; they got together and underwent a physical desalination process, using Sep-Pak (Waters) cartridges. Finally the desalinated fractions were dissolved in 20% methanol.
  • the chromatographic parameters and the mobile phases controlled with an automatic gradient controller (Waters Automated Gradient Controller), were: 12 minutes with 100% B (20 mM ammonium acetate pH 5, 20% ethanol), 43 minutes of a binary gradient up to 50% of A (methanol) and 50% of B (curve 6 specified in Waters chromatographic controllers); 35 minutes of a binary gradient up to 100% of A (curve 8, of the same controllers mentioned above), and a constant flow of 5 mL / min.
  • the fractions were collected at regular intervals (5 mL per fraction) and those carrying purified isolated compounds were pooled and subjected to an additional desalination stage, as described above and, finally, lyophilized twice.
  • AB-400 (Ca ⁇ edo LM et al., 2000, J. Antibiot. (Tokyo) 53: 623-626) was also purified, from the liquid cultures of Sfreptomyces sp. RGU5.3, as described above.
  • the HmA gene (Seco EM et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366), encoded within a polycistronic mRNA, was cloned under the control of the xysA (xys Ap) promoter of the Streptomyces halstedii xylanase gene JM8 (Ruiz-Arribas A., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 2983-2988).
  • the xys Ap promoter was rescued from pHisl as a 547 base pair BgRl / Smal fragment which also carries the terminator of the methyleneomycin resistance gene (Tl: Adham SA et al., 2001, Arch. Microbiol. 177: 91-97) located in position prior to the xys Ap promoter.
  • the DNA fragment containing the rimA gene and the 3 'end of the HmI gene was merged with xys Ap in the appropriate orientation that allowed to express the HmA under the promoter xys Ap (recombinant rimA).
  • the pNAe-1 ermE gene (Table 1) was rescued by digestion with the flanking enzymes and the resulting DNA fragment was cloned, in intermediate stages, following the "rimA recombinant" gene to generate, in the final construction, a DNA fragment containing (see Figure IA), from left to right: the rimA gene under the control of the xysAp promoter, the truncated riml gene fragment and finally the complete ermE gene.
  • the resulting DNA fragment was cloned, via blunt ends, according to the usual technique in Molecular Biology, at the unique EcoKV restriction site, located within the thioestreptone resistance gene, of the Streptomyces pIJ922 vector.
  • the resulting plasmid (pSM743B, Figure IA) confers resistance to erythromycin but not thioestreptone by having the corresponding thioestreptone resistance gene interrupted by insertion of the DNA fragment described above.
  • 108 mutant with the previously unbroken rimA gene is capable of producing the native polienic macrolides (rimocidine and CE-108), as well as the new amidated macrolides ( rimocidine B and CE-108B).
  • the plasmid pSM743B introduced into the silves ⁇ re strain also induced the production of the four tetraenes (amidated and carboxylated) but with an increase in the io ⁇ al production of polyenes probably due to the expression of biosin ⁇ icos genes of the clus ⁇ er Hm.
  • plasmid pSM784 was considered.
  • the errriE gene was cloned, following the usual technology in Molecular Biology and, in successive eiapas, in suitable vectors of Escherichia coli to obtain the complete ermE gene capable of being rescued as a fragment of blunt-end DNA.
  • the DNA fragment containing the ermE gene in a DNA fragment with blunt ends was cloned into the unique EcoRV restriction site of vector pIJ941.
  • the resulting vector confers resistance to erythromycin and hygromycin B although it is sensitive to thioestreptone by interrupting the resistance gene to it by inactivating insertion of the ermE gene fragment (see Figure IB).
  • the resulting recombinant microorganism is capable of producing, in addition to the macrolides rimocidine (lia) and CE-108 (Hb), the new amidated polyenes CE-108B (I-lb) and rimocidine B (I-la).
  • the genetic modified Streptomyces diastaticus var. 108 containing the vector pSM743B or the vector pSM784 produce both the original polyenes (rimocidine and CE-108) as well as the new aminated polyenes (CE-108B and rimocidine B), with a chromatographic profile, analyzed in HPLC, similar, as indicated in Figure 1 C. Although qualitatively both genetic recombinants produce the same polyenes, their production is significantly higher in those recombinants that contain the rimA gene and the erythromycin gene (plasmid pSM743B).
  • Two interchangeable protons appeared at ⁇ 7.30 and 6.83 as wide singles.
  • the rimocidine B (Ila) powder was dissolved in DMSO.
  • the mass spectrum (+) - ESI MS set the molecular weight of rimocidine B (Ila) as 766, which corresponds, by high resolution, to the molecular formula C 39 H 6 2N 2 O 13 (found 767.43254, calculated 767.43301 for [M + N] + ).
  • the 1 H-NMR spectrum was similar to that of CE-108B (I-lb) and showed two interchangeable H / D protons at ⁇ 7.30 and 6.83, two doublet doublets and one multiplet in the ⁇ 6 range , 40-5.80.
  • the antifungal activity of the new amidated tetraenes [rimocidin B (Ila) and CE-108B (I-lb)] was tested against several fungi: Penicillium chrysogenum, Candida albicans, Aspergillus niger, Candida h'usei and Cryptococcus neoformans. Increasing amounts of the different tetraenes, dissolved in methanol, were applied on paper discs (9 mm in diameter); after application, the discs were dried and placed on the bioassay plates in which the corresponding control fungi had previously been extended.
  • the hemolytic activity of the new compounds was evaluated (see the section on Experimental Procedures) against rimocidine and EC-108; Amphotericin B and nystatin A were also included. As shown in Table 2, the hemolytic activity of the amidated tetraenes [rimocidine B (Ila) and CE-108B (1-Ib)] was not significantly different from that of the corresponding tetraenes from which they came, while their antifungal activity was clearly higher.
  • Streptomyces diastaticus var, 108 a producer of two natural tetraenes (rimocidine and CE-108), acquires the ability to produce, in a natural way and as main compounds, the corresponding amides (rimocidine B and CE-108B) if properly modified by genetic manipulation.
  • the conversion of the free carboxylic group into an amide group entails a clear improvement in some of its pharmacological properties (substantial increase in antifungal activity but not in hemolytic activities), thus providing a significant advantage, as antifungal agents, against native tetraenes.
  • amides would be the result of an amidotransferase activity subsequent to the assembly of the polytonic chain of aglycone (activity of "adornment” or post-modification) PKS), which under the experimental conditions described in this invention could be activated, or (b) a malonamil-CoA transferase activity would incorporate, by means of the condensation module 7 of the corresponding PKS (Dry EM et al, 2004, Chem. Biol.
  • the product of the ermE gene (a methylase) can act on another intermediate gene, encoded within the DNA of the plasmids derived from SCP2 * (pIJ922 or pIJ941) whose final result would be the activation of a chromosomal gene responsible for the amidation of natural polyenes of Streptomyces diastaticus var. 108 (rhinocidine and CE-108).
  • the present invention provides a system for generating new polyenes amidated by biotransformation by a genetically modified strain. This process, applied satisfactorily to the biosynthetic route of commercial polyenes, would undoubtedly be a simple process for the production of improved pharmaceutical compounds. Given the complexity of the polynolic structures referred to in this invention, the biotransformation proposed in this invention to generate amidated polynolic compounds constitutes an undoubtedly more efficient process than those described so far by organic synthesis to generate some semisynthetic structures.
  • Bacterial strains, cloning vectors and growth conditions Bacterial strains, cloning vectors and growth conditions
  • Bacterial strains and plasmids are described in Table 1. Sti'eptomyces diastaticus var. 108 and its derivatives were grown in medium
  • Streptomyces lividans TK21 was used for phage propagation and as a host strain, and was grown in a solid R5 medium and YEME liquid medium as described in field manuals (Kieser T., et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics , Norwich).
  • E. coli strain JM101 was grown in Luria-Bertani medium (LB) or in LB broth as described in the specialized literature (Maniatis T. et al., 1982, Molecular Cloning Protocol
  • Penicillium chrysogenum ATCC 10003 was used to test antifungal activity and was grown in MPDA medium (composition: 2% malt extract, 2% glucose, 0.1% Bactopeptone).
  • Table 1 Bacterial strains and vectors used in the invention
  • S. diastaticus var. Derivatives of S. diastaticus var. 108 wild This 108 :: PMl-768 with the rimG gene interrupted by insertion invention of phage PMl -768
  • S. diastaticus var. Derived from S. diastaticus var. 108 wild d 108 / PM1-500 with the rim A gene interrupted by phage integration PMl -500
  • invention pHJL401 Vector for cloning contains the replicon e SCP2 * and pUC19; It contains the thiostrepton resistance gene.
  • Bi Shencional E. coli / Streptomyces ⁇ EL-1 EcoRI-HMIII DNA fragment of pIJ4090 This corresponds to the ermEp promoter (ref. Invention b) cloned into the EcoRI-HmdlII site of the pHJL401 vector
  • PMl Actinophage derived from ⁇ C31 (att " ), hyg, tsr f pSM743B Recombinant vector, derived from pIJ922, It is containing the rimA gene under the control of the xylanase promoter invention Xy s A.
  • pCNB5006 Vector derived from pIJ2925 containing the d ermEp.
  • pSM721 promoter Internal 0.7-kb (Sacl ⁇ ) DNA fragment This is the rimG gene cloned into the Hincll site of invention pIJ2925 pSM768 0.7 kb fragment of AND Hindl ⁇ l-Xbal This of the vector pSM721 cloned into the Bam ⁇ l-invention site
  • E. coli JMlOl strain was grown and transformed using previously described protocols (Maniatis et. Al., 1982, Molecular Cloning, CoId Spring Harbor, N. Y). Streptomyces strains were manipulated as previously described (Kieser T. et al., 2000, cited supra). Intraspecific conjugation was carried out as previously described in Example 1. DNA manipulations were carried out as previously described by Maniatis et al, 1982 (cited supra). Trials for the production of tetraenes
  • Mass spectra were determined on an 1100MSD HPLC device connected to an Agilent Technology quadrupole detector, using electrospray as a source and a positive ionization mode.
  • the chromatographic conditions were the same as those previously described (Pérez-Z ⁇ iga F.J., et al., 2004, cited supra). NMR analysis
  • Streptomyces diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B was cultured in solid SYM2 medium (Pérez-Z ⁇ iga FJ, et al, 2004, cited supra) supplemented with thiostreptone (50 ⁇ g / ml) and erythromycin (25 ⁇ g / ml) for the correct selection of the phage insertion PMl -768 on the chromosome and the presence of plasmid pSM743B, respectively. After 6 days, the complete solid medium where the microorganisms were grown, was fragmented and processed as previously described in Example 1.
  • CE-108C (HIb) and rimocidine C (Illa) were purified by HPLC using a semi-preparative column (Supelcosil PLC-8, 250 x 21.2 mm); the gradient applied was similar to that described previously for analytical fractionation (cited above) and controlled by an automatic gradient controller (Waters Automated Gradient).
  • the fractions carrying the pure polyenes were combined, subjected to a desalination stage using Sep-Pak (Waters) cartridges and, finally, they were lyophilized twice. This method can be used to purify any methylated polyene from the culture of the corresponding genetically modified microorganism.
  • Hemolytic activity assays The assays were carried out on human blood enriched in erythrocytes as previously described in Example 1. Preparation of acellular extracts and "in yrtro" amidation assays
  • the cells were collected by centrifugation as described above and resuspended in a 50 mM Tris-CIH buffer, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 5% glycerol, 50 mM ClNa, 0.5 mM PMSF and 1 mM beta-mercaptoethanol (PTSD buffer).
  • Resuspended cells underwent ultrasound disruption; The homogenate was clarified by centrifugation twice at 8,000 g for 15 minutes and 4 0 C. Polyenes contaminating the acellular homogenate were partially removed by passing the supernatant through a Sep-Pak Cl 8 cartridge (Waters).
  • amidotransferase assays were performed in 200 microliters containing 100 microliters of the solution described above, 4 x 10 6 Units of optical density measured at 340 nm of the solutions containing the different polyenes, 2.5 mM glutamine, 25 mM ClNa, 10 mM Cl 2 Mg, 4 mM ATP and 125 mM TES buffer at pH 7.2.
  • rimG could be crucial: disruption of the rimG gene would give rise to a mutant capable of producing the corresponding amides by being a carrier of a plasmid involved in inducing the formation of tetraenes knotted if the mechanism were the (a) or incapable of it in the possibility (b).
  • a mutant was generated by disruption in the rimG gene using actinophage PMl as a vector (Malpartida et. Al., 1986, cited supd).
  • actinophage PMl actinophage PMl as a vector
  • a 0.6 kbp Sac ⁇ l fragment internal to rimG (coordinates 8267-8849 of the sequence deposited in GeneBank AY442225) was cloned following the fragment containing the promoter of the ermE v gene and the set in phage PMl.
  • the recombinant actinophagus PM1-768B was used to infect spores of S. diastaticus var. 108 giving rise to S. diastaticus var.
  • plasmid pSM743B capable of complementing rimA disruption and inducing the formation of knotted polyenes (cited supra), was transferred by intraspecific conjugation from the wild strain S. diastaticus and ⁇ X. 108 / 743B to the lysogen S. diastaticus var. 108 :: PMl-768, where S. diastaticus var. 108 :: PMl-768 / 743B the resulting recombinant. Once the genotypes are confirmed corresponding, the fermentation broths were analyzed for the production of polyenes.
  • the compound rimocidine C (Illa) was obtained as a yellow powder, which manifested the existence of ions / "ez / fo-molecular am / z 738 ([M + H]) and 760 [(MH-Na + ]) , which corresponds to the molecular formula C ⁇ H 63 NO 12 by high resolution (found 738.442217, calculated 738.442300 for [M + H]).
  • this compound corresponds to the loss of two oxygen atoms and the addition of two protons in rimocidine C (Illa), which can formally be interpreted as a substitution of the group carboxyl in C-14 carbon by a methyl residue.
  • the 1 H-NMR spectrum was very similar to that of rimocidine (lia) and showed three signals in the range of sp 2 , a doublet doublet (dd) at ⁇ 6.30, a multiplet at ⁇ 6.05- 6.18, and a second dd at ⁇ 5.90 (Table 2).
  • the sugar protons appeared in the range of ⁇ 3.25-4.62.
  • the aliphatic region of the 1 H-NMR spectrum also exhibited similarities with that of rimocidine (lia), especially with respect to five complex multiplet patterns in the range of ⁇ 1.30-2.50.
  • rimocidine (lia) Four methyl groups instead of three as in rimocidine (lia) appeared as two triplets and two doublets at ⁇ 0.90, 0.95, and 1.26, 1.00, respectively.
  • the 13 C-NMR magnetic resonance spectrum indicated 39 carbon signals as in rimocidine (lia), as required by the molecular formula. This and the similarities of the proton spectra allowed us to conclude that rimocidine (lia) and rimocidine C (Illa) have the same carbon skeleton including mycosamine sugar, the only difference being the presence of only two carbonyl groups instead of three as in rimocidine (lia). The signals at ⁇ 211.6 and 174.5 were attributed to a ketone group and a carbonyl lactone, respectively.
  • the mass spectrum (+) - ESI NS determined the molecular weight of CE-108C (HIb) as miz 709, which corresponds to the molecular formula C 37 H 59 NO 12 by high resolution (found 710.410905, calculated 710.411000 for [ M + H] + ).
  • the 13 C-NMR magnetic resonance spectrum confirmed the presence of 37 carbon signals as in CE-108 (Hb), as required by the molecular formula.
  • Comparison with the 13 C-NMR magnetic resonance spectrum of CE-108B (I-lb) revealed the presence of only two carbonyl signals at ⁇ 211.3 and 174.3 again attributed to a ketone group and a carbonyl lactone.
  • the antifungal activity of the new non-carboxylated tetraenes rimocidine C (Illa) and CE-108C (HIb) was measured against Penicillium chrysogenum, Candida albicans, Aspergillus niger, Candida h'usei and Criptococcus neoformans compared to that of native rimocidine tetraenes ( lia) and CE-108 (Hb).
  • rimE gene is transcribed in a polyistron of approximately 9 Kb that also houses the rimF, rimG, HmH and rimA genes (Seco EM et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366) ( Figure 4A) , it was necessary to prevent a polar effect on genes located downstream in the chromosome.
  • the strong ermEp * promoter was cloned in front of the 0.8 kbp fragment I left internal to the rimE gene (coordinates 5629-6484 of the sequence deposited in GeneBank AY442225) in the correct orientation to allow transcription of the rest of the RNA delivery courier.
  • the resulting construct was cloned into the PM1 phage in several steps described in Table 1.
  • the resulting recombinant phage (PM1 -702B) was used to infect spores of Streptomyces diastaticus var. 108, allowing the isolation of S. diastaticus var. 108 :: PMl-702B.
  • the correct integration into the chromosome was confirmed by the Southern blotting technique.
  • the analysis of the HPLC fermentation broths and mass spectrometry analysis determined the presence of four major compounds (see Figure 5) that correspond to the CE-108 and rimocidine aglycones, as well as the rimocidine C aglycones ( Illa) and CE-108C (HIb).
  • plasmid pSM743B was introduced by conjugation to this lysogen, capable of inducing S. diastaticus var. 108 the formation of the rimocidine B (I-la) and CE-108B (I-lb) amides, no formation of knotted aglycones was observed.
  • the data is interpreted as that the substrate of the possible amidotransferase activity would actually be rimocidine (lia) and CE-108 (Hb) but not its aglycone.
  • 108/784 cited in Example 1 was grown in SYM2 liquid medium for 3 days, as indicated in Experimental Procedures for obtaining acellular extracts. Initially, different parameters were tested: substrates, enzymatic co-factors, donors of the amide group, optimal reaction pH. The products of the reactions were analyzed by HPLC and the titration was optimized using for the enzymatic tests the sediment of several fractionations with ammonium sulfate, carried out according to the conditions of standardized use in the biochemical works of the field. Finally, the most optimal conditions for the assessment of amidotransferase activity are indicated in the Experimental Procedures section.
  • acellular extracts of S. diastaticus var. 108/784 were also tested against heterologous substrates such as amphotericin B and pimaricin (IVa) although the results were only satisfactory using pimaricin (IVa) as a substrate.
  • acellular extracts of S. diastaticus var.108 / 784 were able to convert pimaricin (IVa) to its corresponding amide AB-400 (IVb).
  • the strain contains the complete route to produce rimocidine (lia) and CE-108 (Hb), being also able to produce the corresponding rhymoidin B (I-la) and CE-108B (I-lb) amidates.

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Abstract

Los nuevos polienos responden a la fórmula (I) en donde: R1 es alquilo, C1-C3; R2 es un grupo funcional elegido entre CH3- ó CONH2- (metilo ó amida primaria). Tienen actividad biocida frente a organismos que poseen membranas celulares que contienen ergosterol, por ejemplo, hongos o parásitos. Estos compuestos pueden ser obtenidos mediante un procedimiento que comprende cultivar un microorganismo productor bajo condiciones que permitan su producción. Se describe, además, un mecanismo para a obtención 'in vitro' de polienos amidados que consiste en incubar polienos carboxilados con extractos acelulares (ó fracciones proteicas) de los productores de aquellos en presencia de ATP/Mg++ y un compuesto donador de grupos amida (preferentemente glutamina).

Description

TÍTULO
ANTIBIÓTICOS POLIENOS, COMPOSICIONES QUE LOS CONTENGAN,
PROCEDIMIENTO Y MICROORGANISMOS PARA SU OBTENCIÓN Y SUS
APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con nuevos polienos anudados y metilados, el procedimiento para su obtención, caracterización de actividades biológicas y aplicaciones, por ejemplo, terapéuticas, agrícolas y agroalimentarias. La invención también se relaciona con: (a) derivados metilados de otros polienos obtenidos de la misma manera en sus respectivos organismos productores; (b) microorganismos recombinantes productores de polienos amidados así como (c) con vectores útiles para obtener dichos microorganismos y (d) un procedimiento para obtener polienos amidados utilizando extractos acelulares o fracciones proteicas obtenidas de productores de macrólidos polienos amidados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las infecciones fúngicas representaban en el pasado un lugar poco relevante dentro del panorama de las enfermedades infecciosas. Sin embargo, ese panorama ha cambiado radicalmente en los últimos veinte años. El aumento de los pacientes inmunodeprimidos, los transplantes de médula y de órganos sólidos, el mayor número de pacientes cancerosos, los tratamientos quimioterápicos, la utilización de agentes inmunosupresores así como de agentes antimicrobianos de amplio espectro y de otros fármacos que alteran los mecanismos naturales de defensa, y la epidemia del SIDA, han sido responsables de este cambio. La infección nosocomial por especies fúngicas tiene cada vez mayor relevancia y son también más numerosas las especies fúngicas que se asocian a micosis profundas.
A pesar de la necesidad de disponer de fármacos antifúngicos, el número de estos productos farmacéuticos en el mercado para tratar infecciones sistémicas es peligrosamente bajo. La mayoría de ellos, tales como los azoles y los polienos, entre los que se encuentra la anfotericina B, tienen como diana la integridad estructural de las membranas fúngicas, si bien, en los últimos años, se han desarrollado fármacos antifúngicos (equinocandinas) que tienen como diana componentes específicos de la pared celular.
Los polienos son un grupo de macrólidos policetónicos muy interesantes debido a su actividad antifúngica. Estos compuestos contienen un anillo de macrolactona con numerosos dobles enlaces conjugados, formando cromóforos con un espectro característico en la zona del ultravioleta/visible; estas características son las responsables de sus propiedades físicas y químicas (gran absorción de luz, fotolabilidad y escasa solubilidad en agua). A pesar de la importancia de algunos ejemplos tales como la anfotericina B como fármacos antifúngicos, su mecanismo de acción preciso no se entiende bien todavía; no obstante, la actividad antifúngica parece deberse a interacciones entre las moléculas de polieno y las membranas que contienen esterol. Esta interacción proporciona un canal de iones y las membranas se hacen permeables causando la destrucción de gradientes electroquímicos y la consecuente muerte celular. Estos compuestos muestran una afinidad significativamente mayor a las membranas que contienen ergosterol (el principal esterol presente en las membranas de hongos y parásitos como Tiypanosoma y Leishmania) que a las membranas que contienen colesterol (células de mamíferos). Sin embargo, la interacción entre los polienos y las membranas que contienen colesterol no es insignificante y causa efectos secundarios, lo que unido a la baja solubilidad, hace que el compuesto no sea totalmente satisfactorio para tratar infecciones sistémicas fúngicas. A pesar de estas propiedades indeseables y los efectos secundarios tóxicos de la anfotericina B, este antiguo fármaco ha sido empleado durante más de 40 años y sigue siendo el agente antifúngico preferido para tratar la mayoría de las infecciones sistémicas; de hecho, se admite que no hay mejores alternativas disponibles para luchar contra las enfermedades fúngicas emergentes. Algunos de los efectos indeseables pueden minimizarse mediante la liberación del fármaco en una formulación liposomal; ésto reduce la toxicidad de la anfotericina B y ha permitido su aplicación sistémica como antifúngico (micosis) y como antiparasitario (e.g., frente a leishmaniasis y trypanosomiasis, entre otros parásitos), organismos cuyas membranas celulares contienen ergosterol (Berman et al, 1992, Antimicrob. Agents Chemother 36: 1978-1980; Herwaldt, (1999), The Lancet. 354: 1191-1199; Yardley et al, 1999, Am. J. Trop. Med. Hyg. 61: 163-197).
Por esta razón, el descubrimiento de nuevos fármacos antifúngicos o la mejora de las propiedades farmacológicas de los ya existentes constituye un reto apasionante. Con este objetivo, y empleando aproximaciones racionales de modelos moleculares, se han generado y ensayado varios derivados semi-sintéticos de anfotericina B como fármacos antifúngicos eficaces. Para efectuar las modificaciones estructurales se han considerado, entre otros, dos blancos principales: el grupo carboxílico de la cadena lateral y el grupo amino del azúcar. Aunque algunos de estos derivados semi-sintéticos todavía mostraban la misma toxicidad, otros presentaban características farmacológicas mejoradas comparadas con la molécula de anfotericina B: mayor actividad antifúngica, mayor solubilidad en agua, mayor especificidad por membranas que contienen ergosterol y menor actividad hemolítica, lo que sugería una mayor especificidad por las membranas que contienen ergosterol. Aunque la mayor actividad antifúngica le confiere alguna ventaja a estos compuestos, sorprendentemente estas modificaciones estructurales no están comúnmente representadas dentro de los polienos naturales aislados procedentes de microorganismos. De hecho, todos los polienos descritos hasta la fecha como fármacos mejorados son derivados semi-sintéticos, generados por síntesis orgánica en lugar de por biotranformaciones . Aunque se dispone de diversos agentes antifúngicos no poliénicos, el uso de estos fármacos favorece la selección y desarrollo de cepas resistentes a ellos que pueden comprometer en un futuro la eficacia de esos compuestos para el tratamiento antifúngico. Existe, por tanto, un interés generalizado en la búsqueda de nuevos fármacos antifúngicos y en la mejora de las propiedades farmacológicas de los ya existentes.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la invención han encontrado que mediante la manipulación genética de Streptomyces diastaticus var. 108, una cepa productora de los antibióticos macrólidos poliénicos rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) (Pérez-Zúfiiga et al, (2004), J. Antibiot. (Tokio) 57: 197-204) se obtienen además de los dos polienos nativos, nuevos macrólidos poliénicos en el caldo de fermentación de la cepa recombinante que, una vez caracterizados químicamente, resultaron ser las amidas de los ácidos carboxílicos, rimocidina B (I-la) y CE-108B (I-lb) de los polienos de los que proceden, rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb), respectivamente, y metilos de fómula (III), rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb) todos ellos comprendidos en la fómula (I). La actividad biológica y algunos ensayos de toxicidad in vitro mostr aron que las modificaciones químicas presentes en los nuevos compuestos confieren propiedades biológicas mejoradas comparadas con las que presentan los productos de los que proceden (ver Ejemplo 1 y Ejemplo 2).
Más concretamente, los inventores de la invención han encontrado que mediante la manipulación genética de Streptomyces diastaticus var. 108, una cepa productora de los antibióticos macrólidos poliénicos rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) (Pérez -Zúfiiga et al, (2004), J. Antibiot. (Tokio) 57: 197-204), y preferentemente por transformación con vectores derivados de SCP2* que portan el gen de resistencia a eritromicina (ermE) (Uchiyama et al, (1985), Gene 38: 103-110) se obtienen además de los dos polienos nativos, dos nuevos macrólidos poliénicos en el caldo de fermentación de la cepa recombinante que, una vez caracterizados químicamente, resultaron ser las amidas de los ácidos carboxílicos, rimocidina B (I- la) y CE-108B (I- Ib) de los polienos de los que proceden, rimocidina (lia) y CE-108 (Hb), respectivamente. La actividad biológica y algunos ensayos de toxicidad in vitro mostraron que la modificación química presente en los nuevos compuestos (amida en lugar de ácido carboxílico) confiere propiedades biológicas mejoradas comparadas con las que presentan los productos de los que proceden (Tabla 2, Ej emplo 1 ) .
En esta invención, además, se elucida el mecanismo biosintético para la formación de estos polienos amidados rimocidina B (I- la) y CE-108B (I- Ib) mencionados, así como se describe la obtención de dos nuevos polienos rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb) (polienos metilados, Ejemplo 2) mediante manipulación genética del cluster implicado en la biosíntesis de los dos antibióticos macrólidos polienos rimocidina (lia) y CE-108 (Hb) (Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366). Los nuevos polienos metilados, al igual que los amidados, presentan propiedades farmacológicas claramente mejoradas respecto a los tetraenos nativos.
En base al modelo propuesto para la biosíntesis de los tetraenos nativos rimocidina (lia) y CE-108 (Hb) (Seco et al, 2004, Chem. Biol. 11: 357-366), en el módulo 7 de la poliquétido sintetasa (PKS) se incorpora metilmalonamil-CoA como unidad de elongación, que es responsable de la presencia de un grupo metilo en el anillo macrocíclico que, posteriormente, mediante una modificación post-PKS específica de sitio se oxidaría para dar lugar al grupo carboxilo libre presente en rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb). Está descrito que una citocromo P450 monooxigenasa esté implicada en esta oxidación, y se encuentra codificada en los clusters biosintéticos de polienos descritos hasta el momento (Aparicio et al., 2003, Appl Microbiol Biotechnol 61: 179-188). En el caso de la biosíntesis de rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb), debido a la similitud de su secuencia y a que sólo se precisa de una única citocromo P450 monooxigenasa en el modelo biosintético, se propuso que RimG fuera la citocromo P450 monooxigenasa implicada en la oxidación del grupo metilo para originar el grupo carboxilo (Seco et al. , 2004, Chem. Biol. 11: 357-366). Para la formación del grupo amida presente en los polienos amidados rimocidina
B (I- la) y CE-108B (I- Ib), en un principio, se propusieron como teoría dos mecanismos posibles: (a) incorporación de unidades malonamil-CoA durante el ensamblaje de la cadena policetónica en lugar de unidades metilmalonil-CoA propuestas para la formación de rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) ó (b) actividad amidotransferasa actuando una vez que el grupo metilo lateral del anillo de macrolactona es oxidado a grupo carboxilo.
La invención se relaciona con dos polienos amidados identificados más adelante en esta descripción como rimocidina B (I-la) y CE-108B (I-lb) y dos polienos metilados identificados más adelante como rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb); su obtención y aplicaciones constituyen aspectos adicionales de esta invención. Dichos compuestos tienen actividad biocida, que, en particular, es más selectiva frente a organismos que tienen membranas celulares que contienen ergosterol, bien hongos o parásitos. Composiciones biocidas, por ejemplo, composiciones farmacéuticas y/o composiciones antifúngicas para uso agrícola o agroalimentario que contengan dichos polienos amidados o metilados, constituyen un aspecto adicional de esta invención. El empleo de dichos polienos, ya sean amidados ó metilados, en composiciones farmacéuticas con fines sanitarios para uso humano o animal y/o composiciones antifúngicas de uso agrícola o agroalimentario constituye otro aspecto de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con las aplicaciones del polieno AB- 400 (IVb), la correspondiente amida de pimaricina (IVa) (Cañedo L.M. et al., 2000, J. Antibiot. (Tokio) 53: 623-626), basadas en los resultados de los ensayos de este compuesto, aislado a partir de Streptomyces sp. RGU5.3 y puestas de manifiesto en esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de vectores derivados de SCP2* que contengan al menos el gen de resistencia a eritromicina (ermE), tal como pSM784 ó pSM743B, identificados más adelante. El empleo de dichos vectores para generar, a partir de microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen un carboxilo libre, microorganismos recombinantes productores de macrólidos polienos que contienen un grupo amida en lugar del grupo carboxílico, constituye otro aspecto de esta invención.
La invención se relaciona, en otro aspecto, con un procedimiento para la producción de dichos polienos amidados que comprende cultivar un microorganismo recombinante productor de dichos compuestos bajo condiciones que permitan la producción de dichos polienos, ya sean amidados o metilados, y, si se desea, aislar y purificar dichos compuestos. Ejemplos ilustrativos de dichos microorganismos recombinantes incluyen Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces dϊastaticus var. 108/743B y Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B (ver ejemplos), los cuales constituyen un aspecto adicional de esta invención así como el empleo de éstos o similares microorganismos recombinantes en la obtención de dichos polienos amidados y, opcionalmente, en la obtención de mezclas de éstos con polienos que contienen un grupo carboxilo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con la elucidación del mecanismo para la formación del grupo amida de los polienos amidados para lo cual, una interrupción o deleción del gen rimG con objeto de bloquear la formación del grupo carboxilo fue crucial. Una vez bloqueada la formación del grupo carboxilo, si la formación del grupo amida tiene lugar durante el ensamblaje de la cadena policetónica, al transformar la cepa disruptante con un plásmido inductor de la biosíntesis de los tetraenos amidados, éstos deberían detectarse en el caldo de fermentación. En caso negativo, se concluiría que la formación del grupo amida tiene lugar mediante una actividad amidotransferasa sobre el grupo carboxilo libre, una vez que éste se ha formado.
Se eligió la disrupción génica inactivante como alternativa para mutagenizar el gen rimG. No obstante, en estas primeras condiciones, y de forma inesperada la disrupción en el gen rimG realizada tal como se indica más arriba, genera un recombinante incapaz de producir polienos. Esto se interpretó en el sentido de que el promotor utilizado para la disrupción era incapaz de prevenir efectos polares probablemente sobre el gen rimA situado a continuación del punto de inserción. A continuación, una interrupción de este gen rimG en el cromosoma en una cepa donde está presente el plásmido pSM743B (capaz de complementar un efecto polar en el gen rimA situado corriente abajo en el cromosoma, además de inducir la formación de los tetraenos amidados), permitió el aislamiento de dos nuevos polienos metilados a los que se ha dado los nombres de rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb), los cuales presentan una sustitución del grupo carboxilo libre por un grupo metilo como consecuencia de la interrupción del gen rimG. La ausencia de tetraenos amidados en el caldo de fermentación de la cepa resultante (Sfreptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B) (n° depósito DSM 17482) permitió concluir que la formación del grupo amida en rimocidina B (I- la) y CE-108B (I- Ib) tiene lugar mediante una modificación post-PKS específica de sitio una vez que el anillo macrocíclico y el grupo carboxilo lateral libre se han formado, y no durante la elongación de la cadena policetónica, y que se debe a una actividad "de adorno" debida probablemente a una amidotransferasa.
Por otro lado, ensayos de actividad biológica frente a varias estirpes de hongos (Penicillium chrysogenum, Candida krusei, Aspergillus níger, Candida albicans,
Cryptococcus neoformans) y algunos ensayos de toxicidad in vitro mostraron que la modificación química presente en los nuevos compuestos confiere una clara ventaja farmacológica respecto a los polienos nativos de los cuales proceden (Tabla 2, Ejemplo
2). Por lo tanto, la invención se relaciona también con un polieno metilado de fórmula (III), en adelante compuesto de la invención, útil como antifúngico y antiparasitario, y como objetos particulares dicho polieno se describe los siguientes polienos metilados identificados más adelante en esta descripción como rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb). La invención se relaciona, en otro aspecto, con un procedimiento para la producción de dichos polienos metilados de fórmula III que comprende cultivar el microorganismo disruptante productor de dichos compuestos bajo condiciones que permitan la producción de dichos polienos metilados, y, si se desea, aislar y purificar dichos compuestos. En concreto, se incluye Streptomyces diastaticus var. 1O8::PM1- 768/743B (n° depósito DSM 17482, microorganismo de la invención), productor de rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb), el cual constituye un aspecto adicional de esta invención así como el empleo de éste o similares microorganismos disruptantes en la obtención de dichos polienos metilados.
En otro aspecto, la invención se relaciona también con el uso de la interrupción de genes implicados en la misma modificación química propuesta para RimG (algunos de los cuales ya han sido descritos) en otros clusters biosintéticos de polienos con objeto de producir los correspondientes derivados metilados.
La ventaja farmacológica de los polienos metilados de la invención rimocidina C (Illa) y CE-108C (IHb) está basada en una mayor toxicidad selectiva hacia membranas que contienen ergosterol, bien hongos o parásitos, que hacia membranas celulares humanas, lo que reduce notablemente su toxicidad. Composiciones biocidas, por ejemplo, composiciones farmacéuticas y/o composiciones antifúngicas para uso sanitario, agrícola o agroalimentario que contengan dichos polienos metilados, constituyen un aspecto adicional de esta invención.
Otro objeto adicional de la invención lo constituye el uso de una composición biocida que contiene el compuesto de la invención para el tratamiento de enfermedades infecciosas en el campo sanitario humano y animal, agrario y alimentario. Por otra parte, mediante ensayos de amidación in vitro con extractos acelulares de los productores de polienos anudados (S. diastaticus var. 108/743B, S. diastaticus var. 108/784) y utilizando rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) como sustratos, se ha podido concluir que la formación del grupo amida se debe a una actividad amidotransferasa dependiente de ATP/Mg y capaz de utilizar glutamina como donador de grupos amida (ver Ejemplo 2, apartado B). Los mismos ensayos llevados a cabo con extractos acelulares de Streptomyces sp. RGU5.3 han permitido confirmar que el polieno AB-400 (IVb), la amida de pimaricina (IVa), se origina mediante una actividad amidotransferasa muy similar a la de S. diastaticus var. 108, que actúa sobre el grupo carboxilo libre de pimaricina para transformarlo en grupo amida en una reacción también dependiente de ATPMg+"".
Por otro lado, se ha podido concluir, además, que la actividad amidotransferasa presente en los extractos acelulares de los recombinantes genéticos de S. diastaticus var. 108 presenta una especificidad relajada hacia el sustrato siendo capaz de modificar no sólo los sustratos nativos rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) en sus correspondientes amidas rimocidina B (I-la) y CE-108B (I-lb), sino que también es capaz de reconocer sustratos heterólogos como pimaricina (IVa). Esto no ocurrió para la actividad amidotransferasa de Streptomyces sp. RGU5.3, siendo sólo capaz de reconocer pimaricina (IVa) como sustrato en las condiciones ensayadas.
El grupo carboxilo libre se encuentra bastante conservado en la mayoría de polienos típicos, como anfotericina B, nistatina, pimaricina, candicidina, etc. La sustitución de estos grupos carboxílicos por grupos amida probablemente originaría polienos amidados con propiedades farmacológicas mejoradas. Por lo tanto, en este aspecto, la invención proporciona un procedimiento enzimático, en adelante procedimiento enzimático de la invención, para convertir polienos carboxilados en los correspondientes amidados, utilizando extractos acelulares de los productores o componentes seleccionados bien de forma directa o inmovilizados en soportes adecuados siguiendo la tecnología del campo de sistemas inmovilizados a partir de un sustrato y en unas condiciones de cultivo determinadas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con extractos acelulares de productores de polienos amidados, portadores de una actividad amidotransferasa, capaces de convertir "in vitro" polienos carboxilados en sus correspondientes amidas necesarios para la puesta en marcha del procedimiento enzimático de la invención. En otro aspecto particular, la invención se relaciona con los extractos acelulares de los microorganismos S. diastaticus var. 108/743B, S. diastaticus var. 108/784 - ambos productores de los polienos amidados CE-108B (I- Ib) y rimocidina B (I- la) - portadores de una actividad amidotransferasa con capacidad para convertir rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) además de otros sustratos heterólogos en sus correspondientes amidas; y el extracto acelular del microorganismo Streptomyces sp. RGU5.3, productor del polieno amidado AB-400 (IVb), capaz de convertir al menos pimaricina (IVa) en su correspondiente amida AB-400 (IVb) en las condiciones ensayadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una representación esquemática de los mapas físicos de los plásmidos recombinantes pSM743B (gen rimA introducido en pIJ922) [Figura IA] y pSM784 (gen ermE introducido en pIJ941) [Figura IB]. En dichas Figuras IA y IB, xysAp: promotor xysA; rimA: PKS Tipo I involucrada en la ruta biosintética de CE- 108 y rimocidina; Ti: terminador del gen de resistencia de metilenomicina; ermE, tsr y hyg: genes de resistencia a eritromicina, tiostrepton e higromicina, respectivamente; riml*\ riml truncado en su N-terminal. La Figura IC muestra el perfil cromatográfico (HPLC) del caldo de fermentación de la cepa modificada genéticamente Streptomyces diastaticus var. 108/743B. En dicha Figura IC, los números 1-4 representan 1: CE-108B (Mb); 2: CE-108 (Hb); 3: rimocidina B (I- la); y 4: rimocidina (lia). La Figura 2 muestra la actividad antifúngica de los cuatro tetraenos producidos por S. diastaticus var. 108/743B. En dicha figura A: rimocidina (lia), B: rimocidina B (I- Ia), C: CE-108 (Hb), D: CE-108B (I-lb). Los números que aparecen sobre cada uno de los antibiogramas hacen referencia a las cantidades aplicadas de cada uno de los polienos expresadas en nanomoles. Los organismos diana fueron: P. chrysogenum, C. krusei, A. niger, C. albicans y C. neoformans (véase la Tabla 1, Ejemplol).
La Figura 3 muestra las actividades biológicas de los polienos pimaricina (IVa) y AB-400 (IVb) aislados de Streptomyces sp. RGU5.3. Se muestran los análisis por HPLC (cromatogramas) de los caldos de fermentación procedentes de Sti-eptomyces sp. RGU5.3 crecido en medio con acetato (Figura 3 A) ó glucosa (Figura 3B) como fuente de carbono respectivamente. La Figura 3C ilustra la actividad antifúngica de pimaricina (IVa) y AB- 400 (IVb) frente a P. chrysogenum; las muestras de polienos aplicadas fueron (1): pimaricina comercial (Calbiochem 5279962), (2): extracto total del caldo de fermentación de S. sp. RGU5.3 crecido en medio de glucosa, (3): AB-400 purificado procedente de S. sp. RGU5.3 y (4): pimaricina purificada procedente de S. sp. RGU5.3; un total de 200 ng se añadieron en cada test. La Figura 3D muestra la actividad hemolítica para pimaricina (Calbiochem 527962, pureza del 98,8%) y AB-400 (purificado por HPLC como se indica en los Procedimientos Experimentales); los valores de cada polieno se expresan en nanomoles (columna de la izquierda) y las correspondientes actividades hemolíticas se proporcionan como porcentaje de hemolisis total (ver el texto para los procedimientos experimentales).
La Figura 4 muestra, en el panel A, un esquema de la transcripción de los genes en esta región concreta del cromosoma deducido mediante ensayos de protección a endonucleasa Sl llevados a cabo con diferentes fragmentos de ADN (Seco et al, 2004, Chem. Biol. 11: 357-366). Los transcritos se representan por flechas discontinuas correspondiente al policistrón de los genes rimE, rimF, rimG, rimH y ritnA. Los transcritos deducidos se representan con flechas discontinuas. Los fragmentos de ADN utilizados para las inserciones inactivantes de los genes rimG y rimE se indican con una línea gris; los números entre paréntesis se corresponden con la secuencia de ADN depositada bajo el número de acceso AY442225. En el panel B de esta figura se muestra el cromatograma correspondiente al caldo de fermentación de S. diastaticus var. 108::PMl-768/743B, donde a y b se corresponden con CE-108C (HIb) y rimocidina C (Illa) respectivamente. La Figura 5 muestra, en el panel izquierdo, el cromatograma del caldo de fermentación del microorganismo S. diastaticus var. 108::PMl-702B/743B. A la derecha del cromatograma se da la estructura química deducida de los compuestos detectados en la cromatografía. La estructura química fue deducida en base a los análisis de espectrometría de masas.
La Figura 6 muestra los análisis por HPLC de los ensayos de actividad amidotransferasa in vitro llevados a cabo con extractos acelulares de S. diastaticus var.
108/784. Los cromatogramas de las columnas izquierda y derecha muestran la reacción a tiempos de incubación de 0 y 60 minutos, respectivamente. Los picos son: a. CE-108B; b. CE-108; c. rimocidina B; d. rimocidina; e. pimaricina; f. AB-400.
A. Conversión enzimática de CE-108 (Hb) en su amida CE-108B (I-lb). Los picos a y el marcado con un asterisco se corresponden con CE-108B (I-lb) y rimocidina B (I- la) respectivamente, los cuales no han podido ser eliminados totalmente del extracto acelular.
B. Conversión enzimática de rimocidina (lia) en su amida rimocidina B (I -la). Los picos c y el marcado con un asterisco se corresponden con rimocidina B (I- la) y CE- 108B (I-lb) respectivamente, presentes en el extracto celular.
C. Conversión enzimática de pimaricina (IVa) en su correspondiente amida AB- 400 (IVb). El pico marcado con un asterisco se corresponde con rimocidina B (I-la) presente en el extracto acelular. Notar la especificidad relajada sobre el reconocimiento de sustrato por parte de la amidotransferasa presente en el extracto acelular de S. diastaticus var. 108/784, siendo capaz de convertir un sustrato heterólogo (pimaricina) en su correspondiente amida (AB-400). La Figura 7 muestra los análisis por HPLC de ensayos de amidación in vitro sobre pimaricina (IVa) llevados a cabo con extractos acelulares de S. sp. RGU5.3. Los cromatogramas de las columnas izquierda y derecha muestran la reacción a tiempos de incubación de 0 y 60 minutos, respectivamente. El pico a presente a tiempo cero se corresponde con AB-400 (IVb) presente en el extracto acelular de S. sp. RGU5.3 y que no ha podido ser eliminado totalmente. Notar una clara conversión de pimaricina (IVa) (pico a) en su correspondiente amida AB-400 (IVb) (pico b).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe un nuevo compuesto macrólido poliénico caracterizado por la fórmula (I):
Figure imgf000014_0001
en donde:
Rl es alquilo C1-C3;
R2 es un grupo funcional elegido entre CH3- ó CONH2- (metilo ó amida primaria), sus isómeros, sales, profármacos o solvatos.
Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula (I) anteriormente descrita pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples (por ejemplo, Z, E), incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales. Tal como aquí se utiliza, el término "sal" incluye tanto sales farmacéuticamente aceptables, es decir, sales del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizadas en la elaboración de un medicamento, como sales farmacéuticamente no aceptables ya que éstas pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza de la sal farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Entre las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula (I) se encuentran las sales de adición de ácido, las cuales pueden obtenerse a partir de ácidos, orgánicos o inorgánicos, por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia haciendo reaccionar el ácido apropiado con el compuesto de fórmula (I) en la cantidad estequiométrica adecuada. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de ácidos que pueden utilizarse para la obtención de dichas sales de adición de ácido incluyen ácidos orgánicos, por ejemplo, ácido acético, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido p-toluensulfónico, etc., o inorgánicos, por ejemplo, ácido bromhídrico, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, etc. Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran las profármacos de los compuestos de fórmula (I). El término "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto de fórmula (I), por ejemplo, esteres, incluyendo esteres de ácidos carboxílicos, esteres de aminoácidos, esteres de fosfato, esteres de sulfonato de sales metálicas, etc., carbamatos, amidas, etc., que, cuando se administra a un individuo es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, dicho compuesto de fórmula (I) en dicho individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcance de la presente invención. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos por los técnicos en la materia. Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I), sus isómeros, sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% del compuesto de fórmula (I), o de sus sales, solvatos o profármacos.
A menos que se indique lo contrario, los compuestos de la invención también incluyen compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos que tienen dicha estructura, a excepción de la sustitución de un hidrógeno por un deuterio o por tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C o un nitrógeno enriquecido en 15N, están dentro del alcance de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un compuesto de fórmula (1-1), derivado amidado del polieno de la invención de fórmula (I):
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(1-1)
en donde
R es NH2; y
R1 es alquilo C1-C3, o un isómero, sal, profármaco o solvato del mismo.
En una realización particular, dicho compuesto de fórmula (I- 1) se selecciona del grupo formado por los compuestos identificados en esta descripción como "rimocidina B", de fórmula (I-la), y "CE-108B", de fórmula (Mb):
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sus isómeros, sales, profármacos o solvatos.
Estos dos nuevos polienos amidados, rimocidina B (I-la) y CE-108B (I-lb), han sido denominados así porque son las amidas correspondientes de los compuestos naturales rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb)
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La estructura química de dichos compuestos ha sido caracterizada mediante diversas técnicas al igual que su actividad biológica (por ejemplo, espectrometría, RMN, antibiogramas, actividad hemolítica, etc). La sustitución del grupo carboxilo libre, presente en el anillo de macrolactona de la rimocidina y CE- 108, por un grupo amida parece determinar una mayor afinidad hacia membranas con ergosterol (tales como, la de hongos y, otros organismos como los parásitos Trypanosoma y Leishmania) que hacia membranas con colesterol (presente en las células animales). Esta modificación química incrementa la toxicidad selectiva de estos polienos hacia hongos lo que constituye una clara ventaja de cara a su aplicación clínica. De hecho, los ensayos de actividad fungicida (Figura 2) y toxicidad frente a células animales (eritrocitos) (Tabla 2, Ejemplo 1) revelan valores muy similares de toxicidad frente a células animales pero incrementos muy significativos en sus actividades biológicas, lo que se traduce en una mayor toxicidad selectiva hacia los hongos que los tetraenos parentales rimocidina y CE-108. Semejante especificidad es aplicable a otros organismos con ergosterol en sus membranas, tales como los parásitos Leishmania y Trypanosoma. Ambos tetraenos amidados resultaron además ser más solubles que los correspondientes compuestos parentales. Semejantes ensayos fueron llevados a cabo con AB-400 (Cañedo L.M. et al., 2000, J. Antibiot. (Tokio) 53: 623-626) (Figura 3), poniendo de manifiesto una mejora en sus propiedades farmacológicas respecto a su homólogo no amidado (pimaricina) además de un incremento de su solubilidad, por lo que puede ser utilizado como medicamento antifúngico/antiparasitario para el tratamiento de infecciones sistémicas.
En otro aspecto, la invención se relaciona también con un compuesto de fórmula (III), derivado metilado del polieno de la invención de fórmula (I):
Figure imgf000019_0001
en donde R es alquilo C1-C3 , o un isómero, sal, profármaco o solvato del mismo. En una realización particular, dicho compuesto de fórmula (III) se selecciona del grupo formado por los compuestos identificados en esta descripción como "rimocidina C", de fórmula (Illa), y "CE-108C", de fórmula (HIb).
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Los dos nuevos polienos metilados, rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb), han sido denominados así porque son polienos derivados de los compuestos naturales rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) en los que el grupo lateral carboxilo está sustituido por un metilo.
La estructura química de estos compuestos ha sido caracterizada mediante diversas técnicas al igual que su actividad biológica (por ejemplo, espectrometría de masas, RMN, antibiogramas, actividad hemolítica, etc.). L a actividad antifungica, a diferencia de los polienos amidados, no se incrementa respecto a la de los compuestos parentales rimocidina y CE-108; sin embargo, la toxicidad medida en términos hemolíticos sí es más reducida que la de los compuestos rimocidina y CE- 108, lo que supone igualmente un incremento en la toxicidad selectiva hacia membranas de hongos respecto a los polienos nativos (Ejemplo 2). Aplicaciones de los nuevos polienos amidados y mediados
Los compuestos de fórmula (I), y entre ellos los compuestos de fórmula (I-l) y (III) tienen, en general, actividad biocida, y, en particular, actividad biocida frente a organismos que poseen una membrana celular que contiene ergosterol, por lo que son potencialmente útiles como biocidas. Tal como se utiliza en esta descripción, un "biocida" es una sustancia química que detiene el crecimiento o mata a distintos tipos de seres vivos.
Asimismo, la expresión "organismos que poseen una membrana celular que contiene ergosterol" incluye a cualquier organismo provisto de una membrana celular que contiene ergosterol, por ejemplo, hongos, parásitos, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichos organismos incluyen los parásitos Trypanosoma, Leishmania, etc., así como hongos tales como Fusarium oxysporium, Botrytis cinérea (fitopatógenos), Candida albicans, Candida cruzei, Aspergillus niger, Criptococcus neoformans (patógenos humanos), entre otros. Por tanto, dichos compuestos de fórmula (I), y entre ellos los compuestos de fórmula (I- 1) y (III), y en particular, los compuestos rimocidina B (I- la), CE-108B (I- Ib), rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb) son potencialmente útiles como biocidas frente a dichos organismos que poseen una membrana celular que contiene ergosterol. En una realización particular, dichos compuestos son más útiles como agentes antiparasitarios o como agentes antifúngicos que los correspondientes polienos no amidados. El término "antifúngico" incluye tanto fungicidas como fungistáticos.
En consecuencia, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición biocida que comprende un compuesto de fórmula (I), y entre ellos los compuestos de fórmula (1-1) y (III), junto con un vehículo inerte. En una realización particular, dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo de fórmula (I- 1), y preferentemente por rimocidina B (I- la), CE-108B (I- Ib) y sus mezclas; en otra realización, dicho compuesto de fórmula (III) se selecciona del grupo de fórmula (III), y preferentemente por rimocidina C (Illa), CE-108C (IHb) y sus mezclas . Dicha composición biocida es particularmente útil frente a organismos que poseen membranas celulares que contienen ergosterol. En una realización particular, dicha composición biocida es una composición antifúngica que comprende un compuesto de fórmula (I) tal como un compuesto seleccionado entre los compuestos rimocidina B (I- la), CE-108B (I- Ib), rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "inerte" significa que dicho vehículo no tiene una actividad biocida significativa.
Si se desea, dicha composición biocida puede contener, además, otros biocidas, naturales, recombinantes o sintéticos, que, eventualmente, potencien la acción biocida de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, de los compuestos rimocidina B (I- la) y/o CE-108B (Mb), rimocidina C (Illa), CE-108C (IHb) y sus mezclas o bien que incrementen su espectro de acción. 1.- Aplicaciones terapéuticas Un campo importante donde encuentran aplicación los compuestos de fórmula
(I), y en particular, los compuestos rimocidina B, CE-108B, rimocidina C y CE-108C, es en Sanidad humana y animal. Por tanto, en una realización particular, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), y entre ellos un compuesto de fórmula (I- 1) o (III) o sus mezclas, junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre los compuestos rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb) y sus mezclas, así como los compuestos de fórmula (III) se selecciona entre los compuestos rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye adyuvantes, sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc.
Si se desea, dicha composición farmacéutica puede contener, además, uno o más agentes terapéuticos que, eventualmente, potencien la acción terapéutica de dichos compuestos de fórmula (I) por ejemplo, de los compuestos rimocidina B, CE -108B, rimocidina C, CE-108C ó bien que incrementen su espectro de acción.
Dicha composición farmacéutica puede ser utilizada para prevenir y/o tratar infecciones causadas por organismos patógenos de humanos o animales que poseen membranas celulares que contienen ergosterol, por ejemplo, parásitos y hongos patógenos de humanos o animales.
Por tanto, en una realización concreta, dicha composición farmacéutica es una composición antiparasitaria y puede ser utilizada en la prevención y/o el tratamiento de infecciones causadas por parásitos cuyas membranas celulares contienen ergosterol, por ejemplo, Trypanosoma, Leishmania, etc. Si se desea, dicha composición antiparasitaria puede contener, además, uno o más agentes antiparasitarios que, eventualmente, potencien la acción terapéutica de compuestos de fórmulas (I), por ejemplo, de los compuestos rimocidina B, CE-108B, rimocidina C, CE-108C o bien que incrementen su espectro de acción.
En otra realización concreta, dicha composición farmacéutica es una composición antifúngica y puede ser utilizada en la prevención y/o el tratamiento de infecciones causadas por hongos (cuyas membranas celulares contienen ergosterol). Si se desea, dicha composición antifúngica puede contener, además, uno o más agentes antifúngicos que, eventualmente, potencien la acción antifúngica de compuestos de fórmulas (I), por ejemplo, rimocidina B, CE -108B, rimocidina C, CE-108C, ó bien que incrementen su espectro de acción. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos agentes antifúngicos incluyen polienos, tales como anfotericina B, nistatina, AB-400, alilaminas (e.g., terbinafina, naftifina, etc.), amorolfia, tolnaftalato, etc.; azoles, tales como clotrimazol, miconazol, ketoconazol, fluconazol, itraconazol, etc.; benzofúranos, por ejemplo, griseofulvina, etc.; pirimidinas, por ejemplo, fluocitosina, etc.
El compuesto de fórmula (I), y entre ellos un compuesto de fórmula (1-1) y (III), estará presente en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, en una cantidad apropiada para ejercer su efecto terapéutico. En una realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 99,99% en peso de un compuesto de fórmula (I), tal como un compuesto seleccionado entre los compuestos rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb), rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas, y puede presentarse en cualquier forma farmacéutica de administración apropiada en función de la vía de administración elegida, por ejemplo, oral, parenteral o tópica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse, por ejemplo, en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Ia edición, 1993, Luzán 5, S. A. de Ediciones. Por tanto, la invención también se relaciona con el empleo de un compuesto de fórmula (I) y/ó (III) en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la infección causada por organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol, por ejemplo, parásitos de humanos o animales o bien hongos patógenos de humanos o animales. En una realización particular, dicho compuesto de fórmula (I) y/ó (III) se selecciona entre rimocidina B (I- la), CE- 108B (T-Ib), rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas.
Asimismo, en otro aspecto, la invención también proporciona un método para prevenir y/o tratar infecciones causadas por organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol, por ejemplo, parásitos de humanos o animales o bien hongos patógenos de humanos o animales, que comprende la etapa de administrar a un animal o a un ser humano, en necesidad de tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica proporcionada por esta invención.
2.- Aplicaciones agrícolas
Otro sector importante en el que encuentran aplicación los compuestos de fórmula (I), y entre ellos los compuestos de fórmula (I- 1) y (III), es en el sector agrícola. En este sentido, la invención proporciona una composición antifúngica útil para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos (tales como Botrytis cinérea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solana, Rhizoctonia meloni, Ustilago mayáis, entre otros) cuyas membranas celulares contienen ergosterol, que comprende un compuesto de fórmula (I) y/o (III), tal como un compuesto seleccionado entre los compuestos rimocidina B (I-la), CE-108B (Mb), rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes agrícolamente aceptables. La aplicación se extiende a tratamiento, fundamentalmente preventivo, para evitar o controlar infecciones fúngicas en condiciones de almacenamiento de productos agroalimentarios (infecciones post-cosecha), causadas por diversos hongos cuyas membranas contienen ergosterol. Tal como aquí se utiliza, el término "controlar" incluye la inhibición, reducción o paralización de la germinación de las esporas y/o del crecimiento del micelio de hongos que puede resultar en la eliminación de dichos hongos o en la disminución de los daños causados por éstos.
La expresión "vehículo inerte agrícolamente aceptable" tal como aquí se utiliza se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector agrícola, utilizadas para vehiculizar compuestos de interés, e incluye adyuvantes, sólidos o líquidos, diluyentes, disolventes, tensioactivos, etc.
En una realización particular, dicha composición antifúngica comprende, además de dicho compuesto de fórmula (I) y/ó (III), por ejemplo, un compuesto seleccionado entre rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb), rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas, uno o más compuestos con actividad antifúngica, por ejemplo, uno o más compuestos que alteran la membrana celular de los hongos, o uno o más compuestos que inhiben la síntesis de ergosterol, tales como los compuestos mencionados previamente, o bien uno o más compuestos con actividades enzimáticas requeridas para la modificación o degradación de paredes celulares, por ejemplo, una o más enzimas líticas capaces de modificar o degradar paredes celulares de hongos, tales como enzimas con actividad celulolítica, mananolítica, quitinolítica o proteolítica (e.g., celulasas, α-(l,3)-glucanasas, β-(l,6)-glucanasas, β-(l,3)-glucanasas, mananasas, endo- o exo- quitinasas, quitosanasas, proteasas, α- o β-manosidasas, etc.
El compuesto de fórmula (I) y/ó (III) estará presente en dicha composición antifungica en una cantidad antifungica eficaz, es decir, en una cantidad apropiada para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos. En una realización particular, la composición antifungica útil para controlar hongos fitopatógenos proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 100% en peso de dicho compuesto de fórmula (I) y/ó (III), por ejemplo, de dichos compuestos rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb), rimocidina C (Illa), CE-108C (IHb). Dicha composición puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un granulado. Adicionalmente, dicha composición puede contener aditivos, por ejemplo, conservantes y estabilizantes que prolonguen la conservación y estabilidad de la misma.
Dicha composición antifungica puede ser usada, por ejemplo, para controlar infecciones causadas por hongos fitopatógenos en plantas y/o en frutos. Por tanto, la invención proporciona un método para controlar la infección causada por un hongo fitopatógeno en una planta, en particular, un hongo fitopatógeno cuya membrana celular contiene ergosterol, que comprende aplicar a dicha planta, o al medio que la rodea, dicha composición para controlar dicho hongo fitopatógeno. En una realización particular, dicho método comprende la aplicación de dicha composición, en una cantidad adecuada, sobre las partes aéreas de la planta con el fin de prevenir y/o tratar una infección fúngica causada por un hongo fitopatógeno.
La invención también proporciona un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en un fruto, en particular, un hongo fitopatógeno cuya membrana celular contiene ergosterol, que comprende aplicar a dicho fruto dicha composición para controlar hongos fitopatógenos. En una realización particular de dicho método, la aplicación de dicha composición, en una cantidad eficaz, sobre el fruto se realiza antes de la recogida del mismo (pre-cosecha) mientras que en otra realización alternativa la aplicación de la composición se efectúa sobre el fruto ya recogido (post- cosecha).
3.- Aplicaciones agroalimentarias
Los compuestos de fórmula (I) y/ó (III), en particular rimocidina B (I- la), CE- 108B (I-lb), rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb), tienen también aplicación en el sector agroalimentario. En este sentido, la invención proporciona una composición antifúngica útil para el control de hongos que eventualmente puedan desarrollarse sobre preparados alimentarios, por ejemplo, sobre la superficie de preparados alimentarios, tales como derivados lácteos, por ejemplo, quesos, etc., que comprende un compuesto de fórmula (I) tal como un compuesto seleccionado entre los compuestos rimocidina B (I- la), CE-108B (I-lb), rimocidina C (Illa), CE-108C (IHb) y sus mezclas, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes aceptables desde el punto de vista agroalimentario, tales como suspensiones liposómicas, en agua, etc., entre otras.
El término "control" incluye la inhibición, reducción o paralización de la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio de hongos que puede resultar en una notable disminución de los daños causados por éstos; de este modo se puede prevenir o tratar el expolio de alimentos causado por el crecimiento de hongos.
El término "vehículo inerte aceptable desde el punto de vista agroalimentario" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector agroalimentario, utilizadas para vehiculizar compuestos de interés, e incluye adyuvantes, sólidos o líquidos, diluyentes, disolventes, tensioactivos, etc.
En una realización particular, dicha composición antifúngica comprende, además de dicho compuesto de fórmula (I) por ejemplo, un compuesto seleccionado entre rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb), rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas, uno o más compuestos con actividad antifúngica, por ejemplo, uno o más compuestos que alteran la membrana celular de los hongos, o uno o más compuestos que inhiben la síntesis de ergosterol, tales como los compuestos mencionados previamente, o bien uno o más compuestos con actividades enzimáticas requeridas para la modificación o degradación de paredes celulares, por ejemplo, una o más enzimas líticas capaces de modificar o degradar paredes celulares de hongos, tales como enzimas con actividad celulolítica, mananolítica, quitinolítica o proteolítica (e.g., celulasas, α-(l,3)-glucanasas, β-(l,6)-glucanasas, β-(l,3)-glucanasas, mananasas, endo- o exo- quitinasas, quitosanasas, proteasas, α- o β-manosidasas, etc. El compuesto de fórmula (I) estará presente en dicha composición antifúngica en una cantidad antifúngica eficaz, es decir, en una cantidad apropiada para controlar la infección causada por hongos susceptibles de desarrollarse sobre preparados alimentarios. En una realización particular, dicha composición antifúngica útil para controlar hongos capaces de desarrollarse sobre preparados alimentarios proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 100% en peso de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, de dichos compuestos rimocidina B (I-la), CE -108B (I-lb), rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb). Dicha composición puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un granulado. Adicionalmente, dicha composición puede contener aditivos, por ejemplo, conservantes y estabilizantes que prolonguen la conservación y estabilidad de la misma.
Dicha composición antifúngica puede ser usada p ara controlar infecciones causadas por hongos susceptibles de desarrollarse en preparados alimentarios, por ejemplo, sobre la superficie de preparados alimentarios. Por tanto, la invención también proporciona un método para controlar la infección causada por un hongo capaz de desarrollarse en un preparado alimentario, en particular, un hongo susceptible de desarrollarse en un preparado alimentario cuya membrana celular contiene ergosterol, que comprende aplicar a dicho preparado alimentario, o al medio que la rodea, dicha composición antifúngica para controlar dicho hongo capaz de desarrollarse en un preparado alimentario. En una realización particular, dicho método comprende la aplicación de dicha composición, en una cantidad adecuada, sobre la superficie del preparado alimentario con el fin de prevenir y/o tratar el expolio de alimentos debido al crecimiento fήngico. Dicha composición antifúngica se aplica externamente sobre la superficie del preparado alimentario.
Procedimiento de obtención de los nuevos polienos amidados
Compuestos de fórmula (I), y entre ellos los compuestos de fórmula (I- 1), y más particularmente, los compuestos rimocidina B (I-la) y/o CE-108B (I-lb) están presentes en el caldo de fermentación de los microorganismos recombinantes identificados en esta descripción como Streptomyces diastaticus var. 108/743B y Streptomyces diastaticus var. 108/784, obtenidos por transformación de Streptomyces diastaticus var. 108 (Pérez - Zuñiga F. J., et al., 2004, J. Antibiot. (Tokyo) 57:197-204) con los plásmidos identificados en esta descripción como pSM743B y pSM784, respectivamente, o del microorganismo recombinante identificado como Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B obtenido por transformación de Streptomyces diastaticus var. 108/PM1-500 (Seco E.M., et al., 2004, Chem. Biol. 11:357-366) con el plásmido identificado como pSM743B, tal como se describe en el Ejemplo 1 que acompaña a esta descripción y se recoge en la Tabla 1. Dichos compuestos pueden ser obtenidos directamente a partir de dichos caldos de fermentación y purificados con facilidad por procedimientos convencionales relativamente sencillos, por ejemplo, mediante el empleo de columnas de intercambio iónico y/o columnas de interacción hidrofóbica o fase reversa.
El plásmido pSM743B (Tabla 1, Ejemplo 1) (Figura IA) deriva del plásmido pIJ922 y comprende el gen rimA y el gen de resistencia a eritromicina (ermE). El plásmido pSM784 (Tabla 1, Ejemplo 1) (Figura IB) deriva del plásmido pIJ941 y contiene el gen de resistencia a eritromicina (ermE).
Dichos plásmidos pIJ922 y ρIJ941 (Lydiate DJ. et al., 1985, Gene 35: 223-235) son vectores derivados del replicón SCP2*, un plásmido de bajo número de copias procedente de Str-eptomyces coelicolor.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (I- 1), que comprende cultivar un microorganismo seleccionado entre Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B y combinaciones de los mismos, bajo condiciones que permitan la producción de compuestos de fórmula (I), y, si se desea, aislar y purificar dichos compuestos. En una realización particular, los compuestos de fórmula (I) se seleccionan entre rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb) y sus mezclas.
Como se ha comentado anteriormente la formación del grupo amida en polienos se debe a una actividad "de adorno" debida a una amidotransferasa. Mediante ensayos de amidación in vitro con extractos acelulares de los productores de polienos amidados y utilizando rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) como sustratos, se ha podido concluir que la formación del grupo amida se debe, efectivamente, a una actividad amidotransferasa dependiente de ATP/Mg y capaz de utilizar glutamina como donador de grupos amida (ver Ejemplo 2, apartado B). Los mismos ensayos llevados a cabo con extractos acelulares de Streptomyces sp. RGU5.3 han permitido confirmar que AB-400 (IVb), la amida de pimaricina (IVa), se origina mediante una actividad amidotransferasa muy similar a la de S. diastaticus var. 108, que actúa sobre el grupo carboxilo libre de pimaricina (IVa) para transformarlo en grupo amida en una reacción también dependiente de ATP/Mg^.
Por otro lado, se ha podido concluir, además, que la actividad amidotransferasa presente en los extractos acelulares de los recombinantes genéticos de S. diastaticus var. 108 presenta una especificidad relajada hacia el sustrato siendo capaz de modificar no sólo los sustratos nativos rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) en sus correspondientes amidas rimocidina B (I- la) y CE-108B (I- Ib), sino que también es capaz de reconocer sustratos heterólogos como pimaricina (IVa). Esto no ocurrió para la actividad amidotransferasa de Streptomyces sp. RGU5.3, siendo sólo capaz de reconocer pimaricina (IVa) como sustrato en las condiciones ensayadas.
El grupo carboxilo libre se encuentra bastante conservado en la mayoría de polienos típicos, como anfotericina B, nistatina, pimaricina (IVa), candicidina, etc. La sustitución de estos grupos carboxílicos por grupos amida probablemente originaría también polienos anudados con propiedades farmacológicas mejoradas, tales como mayor solub ilidad en agua, mayor actividad antifúngica, y menor actividad hemolítica. En definitiva los compuestos presentarían mayor toxicidad selectiva frente a hongos.
Por tanto, en este aspecto, la invención proporciona un procedimiento enzimático, en adelante procedimiento enzimático de la invención, para obtener un polieno amidado a partir de polienos con grupos carboxílicos libres en el anillo de macrolactona utilizando extractos acelulares de cepas productoras de polienos anudados mediante las siguientes etapas: a) puesta a punto de una mezcla con un sustrato consistente en un polieno con grupos carboxílicos libres o mezclas de varios de ellos, purificado o no, y un extracto proteico proveniente de una cepa o cepas productoras de polienos amidados, y b) reacción de la mezcla de a) en condiciones: de dependencia de ATP/Mg y capaz de utilizar glutamina como donador de grupos amida, y c) purificación de los polienos amidados. Un objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento enzimático de la invención en el que el polieno amidado a obtener es CE-108B (I-lb), rimocidina B (I- Ia) o sus mezclas, el polieno sustrato de a) es CE- 108 (Hb), rimocidina (lia) o sus mezclas, purificado o no, y en el que el extracto de a) se obtiene de las siguientes cepas: S. diastaticus var. 108/784 y S. diastaticus var. 108/743B. Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento enzimático de la invención en el que el polieno amidado a obtener es AB-400 (IVb), el polieno sustrato de a) es pimaricina (IVa), purificado o no, y en el que el extracto de a) se obtiene de las siguientes cepas: S. diastaticus var. 108/784 y & diastaticus var. 108/743B.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento enzimático de la invención en el que el polieno amidado a obtener es AB-400 (IVb), el polieno sustrato de a) es pimaricina (IVa), purificada o no, y en el que el extracto de a) se obtiene de la cepa Streptomyces sp. RGU5.3.
En otro aspecto, la invención se relaciona con extractos acelulares de productores de polienos amidados, portadores de una actividad amidotransferasa, capaces de convertir uin vitro" polienos carboxilados en sus correspondientes amidas necesarios para la puesta en marcha del procedimiento enzimático de la invención.
Por extractos acelulares se entiende aquellos extractos procedentes de la homogenización de las células por procedimientos mecánicos diversos (aplicables habitualmente en el campo de manipulación de proteinas) y posterior fraccionamiento bien por filtración o centrifugación diferencial, para disponer de clarificados conteniendo la mayoría de los componentes celulares bien en suspensión o en solución.
En otro aspecto particular, la invención se relaciona con los extractos acelulares de los microorganismos S. diastaticus var. 108/743B, S. diastaticus var. 108/784 (DSM 17187) - ambos productores de los polienos amidados CE-108B (I-lb) y rimocidina B (I- la) - portadores de una actividad amidotransferasa con capacidad para convertir rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) además de otros sustratos heterólogos en sus correspondientes amidas; y el extracto acelular del microorganismo Streptomyces sp. RGU5.3 (productor del polieno amidado AB-400 (IVb)), capaz de convertir al menos pimaricina (IVa) en su correspondiente amida AB-400 (IVb) en las condiciones ensayadas.
Alternativamente, el procedimiento enzimático de la presente invención puede ser realizado utilizando métodos convencionales de sistemas enzimáticos inmovilizados (extracto acelular de la invención) en soportes sólidos haciendo fluir los componentes de la reacción con las fases móviles correspondientes, siguiendo la tecnología del campo de sistemas inmovilizados conocida por un técnico medio del sector.
Procedimiento de obtención de los nuevos polienos metilados Los compuestos de fórmula (III), en particular, los compuestos rimocidina C
(Illa) y CE-108C (HIb) están presentes en el caldo de fermentación del microorganismo identificado en esta descripción como Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B, obtenido por disrupción del gen rimG mediante recombinación homologa con el fago recombinante PMl -768 (ver Tabla 1, Ejemplo 2) y por la transferencia del plásmido pSM743B por conjugación desde la cepa Streptomyces diastaticus var. 108/743B tal y como se recoge en la Tabla 1, Ejemplo 1. Tanto el fragmento para generar la disrupción del gen rimG, como el fragmento conteniendo el gen rimA completo para evitar efectos polares pueden ser obtenidos fácilmente por personas con cierta habilidad en el campo, mediante técnicas convencionales de amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para las correspondientes amplificaciones puede ser utilizada la cepa depositada en Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSMS), Braunschweig, Alemania (número de acceso DSM 17187). Los correspondientes vectores pueden ser introducidos por técnicas convencionales (transformación, transfección, conjugación, etc.) en la cepa DSM 17187 indicada más arriba. En esta invención, el fago recombinante PMl -768 se obtuvo a partir del fago
PMl, sobre el que se clonó un fragmento interno al gen rimG y se introdujo el promotor ermEp (promotor ampliamente utilizado en manipulaciones de Streptomyces para expresión de genes: Kieser et al. 2000, Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, UK) con idea de evitar un efecto polar sobre genes situados corriente abajo; los clones intermedios hasta llegar a la construcción final se describen en la Tabla 1 del Ejemplo 2 y pueden ser obtenidos fácilmente por operarios con cierta habilidad en el trabajo con Streptomyces, tal como se indica más arriba.
Dichos compuestos rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb) pueden ser obtenidos directamente a partir del caldo de fermentación del microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B y purificados con facilidad por procedimientos convencionales relativamente sencillos, por ejemplo, mediante el empleo de columnas de interacción hidrofóbica o fase reversa.
Por tanto, en otro aspecto adicional, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (III), que comprende las siguientes etapas: cultivo del microorganismo Streptomyces diastaticus var. 1O8::PM1- 768/743B bajo condiciones que permitan la producción de compuestos de fórmula (III), obtención del caldo de fermentación y, si se desea, el aislamiento y purificación de dichos compuestos de fórmula (III). En una realización particular, el procedimiento se lleva a cabo para la obtención de los compuestos de fórmula (III) que se seleccionan entre rimocidina C (Illa), CE- 108C QEb) y sus mezclas.
El medio de cultivo de dicho microorganismo recombinante comprende, en general, una o más fuentes de carbono, una o más fuentes de nitrógeno, una o más sales inorgánicas asimilables por el microorganismo, y, si es necesario, uno o más nutrientes orgánicos, tales como vitaminas y aminoácidos, disueltos en un medio acuoso. Dichos medios, al igual que las condiciones apropiadas (aireación/agitación, temperatura y tiempo de fermentación, etapas, etc.), son conocidos por los expertos en la materia. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de los medios y condiciones para crecer dicho microorganismo recombinante se mencionan en el Ejemplo 2 de la invención (apartado "Procedimientos experimentales"). El caldo de fermentación de dichos microorganismos recombinantes Streptomyces diastaticus y ΆX. 108::PMl-768/743B O SUS equivalentes funcionales comprende un compuesto seleccionado entre un compuesto de fórmula (III), por ejemplo, rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas, y puede utilizarse como tal o bien puede ser tratado posteriormente para separar el compuesto de interés, los cuales pueden aislarse por métodos convencionales. A modo ilustrativo, en una realización particular, el cultivo celular se centrifuga para separar el sobrenadante y el extracto celular y el sobrenadante se utiliza para aislar y, si se desea, purificar, el polieno, amidado o no-amidado, de interés. El estudio de las características físico -químicas de dichos compuestos permite diseñar a un técnico medio un procedimiento para su purificación a partir del sobrenadante.
Microorganismos recombinantes y aplicaciones
1. Microorganismos recombinantes implicados en la obtención de polienos amidados y aplicaciones
Los microorganismos recombinantes Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784 y Streptomyces diastaticus var. 108::PMl- 500/743B, forman parte de la presente invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un microorganismo seleccionado entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784 y Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B5 y proporciona un cultivo de un microorganismo seleccionado entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B y combinaciones de los mismos. Asimismo, la invención se relaciona con el empleo de un microorganismo seleccionado entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B y combinaciones de los mismos, o de dicho cultivo de microorganismos seleccionados entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B y combinaciones de los mismos, en la obtención de un compuesto de fórmula (I), preferentemente compuestos de fórmula (1-1). En una realización particular, el compuesto de fórmula (I- 1) se selecciona entre rimocidina B (I- Ia), CE-108B (I- Ib) y sus mezclas.
Además, los ensayos realizados por los inventores pusieron de manifiesto que el caldo de fermentación de dichos microorganismos recombinantes Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784 y Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B también contiene, además de los polienos anudados rimocidina B (I-la) y/o CE-108B (I-lb), los polienos no anudados rimocidina (lia) y/o CE- 108 (Hb), los cuales contienen un grupo carboxilo libre. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de un compuesto seleccionado entre un compuesto de fórmula (I), rimocidina (lia), CE- 108 (Hb) y sus mezclas, que comprende cultivar un microorganismo seleccionado entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B y combinaciones de los mismos, bajo condiciones que permitan la producción de un compuesto seleccionado entre un compuesto de fórmula (I), rimocidina (lia), CE- 108 (Hb) y sus mezclas, y, si se desea, aislar y purificar dicho compuesto. En una realización particular, el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina B (I- la), CE-108B (I-lb) y sus mezclas. El caldo de fermentación de un microorganismo seleccionado entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B y combinaciones de los mismos, que comprende un compuesto seleccionado entre un compuesto de fórmula (I), rimocidina (lia), CE- 108 (Hb) y sus mezclas, puede ser potencialmente útil como biocida y constituye un aspecto adicional de esta invención. En una realización particular, el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina B (I- la), CE-108B (I- Ib) y sus mezclas.
El medio de cultivo de dichos microorganismos recombinantes comprende, en general, una o más fuentes de carbono, una o más fuentes de nitrógeno, una o más sales inorgánicas asimilables por el microorganismo, y, si es necesario, uno o más nutrientes orgánicos, tales como vitaminas y aminoácidos, disueltos en un medio acuoso. Dichos medios, al igual que las condiciones apropiadas (aireación/agitación, temperatura y tiempo de fermentación, etapas, etc.), son conocidos por los expertos en la materia. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de los medios y condiciones para crecer dichos microorganismos recombinantes se mencionan en el Ejemplo (apartado "Procedimientos experimentales"). El caldo de fermentación de dichos microorganismos recombinantes seleccionados entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B y combinaciones de los mismos, comprende un compuesto seleccionado entre un compuesto de fórmula (I), por ejemplo, rimocidina B (I- la), CE-108B (I- Ib), rimocidina (lia), CE- 108 (Hb) y sus mezclas, y puede utilizarse como tal o bien puede ser tratado posteriormente para separar el compuesto o compuestos de interés, los cuales pueden aislarse por métodos convencionales. A modo ilustrativo, en una realización particular, el cultivo celular se centrifuga para separar el sobrenadante y el extracto celular y el sobrenadante se utiliza para aislar y, si se desea, purificar, el polieno, amidado o no-amidado, de interés. El estudio de las características físico-químicas de dichos compuestos permite diseñar un procedimiento para su purificación a partir del sobrenadante.
2. Microorganismos recombinantes implicados en la obtención de polienos metilados y aplicaciones. El microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B, o cualquier otro equivalente funcional forman parte de la presente invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B o equivalentes funcionales útiles para llevar a cabo el procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (III) y proporcionar un cultivo de estos microorganismos. Una realización particular de la invención lo constituye el microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B (número de depósito: DSM 17482) productor de los polienos metilados rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb). Tal como se utiliza en la presente invención el término "equivalente funcional" se refiere a un elemento - ya sea un microorganismo, vector, construcción genética, o fragmento de un gen, procedimiento de disrupción de un gen, de transformación genética de una célula o microorganismo, según el caso - que puede ser desarrollado por un técnico medio en la materia con las distintas alternativas existentes y que posee características idénticas u homologas al elemento original referido.
Así, en este contexto y a título ilustrativo, por "equivalente/s funcional/es" se entienden aquellos microorganismos recombinantes que pueden ser obtenidos bien por deleción cromosómica del gen rimG, en lugar de inserción inactivante o con cualquier otra técnica; dicha deleción puede ser fácilmente realizada mediante el empleo de vectores convencionales bien plásmidos no replicativos o siendo replicativos con origen de replicación termosensible. Estas deleciones o inserciones pueden ser realizadas por un técnico con cierta experiencia en el campo.
Asimismo, la invención se relaciona con el empleo de los microorganismos Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B o sus equivalentes funcionales para la obtención de un compuesto de fórmula (III). En una realización particular, el compuesto de fórmula (III) se selecciona entre rimocidina C (Illa), CE-108C (IHb) y sus mezclas.
Para determinadas aplicaciones el caldo de fermentación así obtenido con el procedimiento de la invención puede ser utilizado directamente para la elaboración de determinadas soluciones biocidas, sin necesidad de purificar los compuestos de la presente invención. Así, el caldo de fermentación de los microorganismos Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B o sus equivalentes funcionales indicados más arriba, que comprende un compuesto de fórmula (III), puede ser potencialmente útil como biocida y constituye un aspecto adicional de esta invención.
Vectores y aplicaciones
1. Vectores implicados en la inducción de polienos amidados y aplicaciones
El plásmido pSM784, derivado del vector pIJ941 sobre el cual se ha clonado el gen de resistencia a eritromicina, cuando es introducido en S. diastaticus var. 108, da lugar a una cepa (S. diastaticus var. 108/784) productora de los nuevos polienos amidados rimocidina B (I-la) y CE-108B (I-lb), además de rimocidina (lia) y CE-108 (Hb).
Asimismo, cuando el plásmido pSM743B, derivado de un vector SCP2* más el gen ermE y portador, además, de un fragmento del cluster rim (que comprende el gen rimÁ) expresado bajo un promotor, endógeno o exógeno, tal como el promotor xysA
(xysAp) del gen de la xilanasa de Streptomyces halstedü JM8 (Ruiz-Arribas A., et al.,
1997, Appl. Environ. Microbiol., 63: 2983-2988), es introducido en S. diastaticus var.
108 o en S. diastaticus var. 108::PMl-500, se ha observado un incremento en la producción total tanto de polienos amidados [rimocidina B (I-la) y CE-108B (1 -Ib)] como de polienos no amidados [rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb)]. Este hecho podría ser utilizado para incrementar la producción total de polienos con grupo carboxílico y/o polienos amidados en otros organismos productores de dichos polienos.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, en adelante vector de la invención, seleccionado entre: a) un vector derivado del vector SCP2*, o un fragmento del mismo, que comprende el origen de replicación del SCP2* y el gen de resistencia a eritromicina (ermE); b) un vector que comprende (i) el origen de replicación del vector SCP2*, (ii) el gen ermE, y (iii) un fragmento del vector SCP2*; c) un vector que comprende (i) un origen de replicación, (ii) el gen ermE, y (iii) un fragmento del vector SCP2*, en donde dicho origen de replicación es diferente al origen de replicación del vector SCP2*; d) un vector que carece de origen de replicación y comprende el gen ermE y un fragmento del vector SCP2*; e) un vector derivado del vector SCP2* que comprende (i) un origen de replicación, (ii) el gen ermE, y (iii) la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster; í) un vector derivado del vector SCP2* que comprende (i) un origen de replicación, igual o diferente al origen de replicación del vector
SCP2*, (ii) el gen ermE, (iii) un fragmento del vector SCP2* y (iv) la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster; g) un vector que carece de origen de replicación y comprende el gen ermE y la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster; y h) un vector que carece de origen de replicación y comprende (i) el gen ermE, (ii) un fragmento del vector SCP2* y (iii) la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster.
Prácticamente cualquier vector derivado del vector SCP2* puede ser utilizado, por ejemplo, pIJ922, pIJ941, etc. El gen ermE es un gen conocido (Uchiyama et al.,
(1985), Gene 38: 103-110). Tal como aquí se utiliza, la expresión "fragmento del vector SCP2*" se refiere a un ácido nucleico que comprende uno o más fragmentos de SCP2* suficientes para inducir la formación de polienos anudados. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que un ácido nucleico que comprende uno o más fragmentos del vector SCP2*, junto con el gen ermE, es necesario y suficiente para que en los microorganismos recombinantes se generen los polienos amidados. En una realización particular, el vector de la invención es un vector replicativo derivado del SCP2*, que contiene el origen de replicación de SCP2*, y es portador, además, del gen ermE, por ejemplo, pSM784. Dicho plásmido puede ser introducido por métodos convencionales (e.g., transformación, electroporación, conjugación, etc.) en microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen un grupo carboxilo libre (e.g., anfotericina B, nistatina, rimocidina, pimaricina, candicidina, etc.), con objeto de producir los correspondientes polienos amidados. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos microorganismos incluyen S. noursei, S. albidus, S. rimosus, S. nodosus, S. natalensis, S. chattanoogensis, S.griseus, etc.
En otra realización particular, el vector de la invención es un vector replicativo que comprende el origen de replicación del vector SCP2*, el gen ermE y un fragmento del vector SCP2*.
En otra realización particular, el vector de la invención es un vector replicativo que comprende un origen de replicación diferente al origen de replicación de SCP2*, el gen ermE y un fragmento del vector SCP2*. En otra realización particular, el vector de la invención es un vector integrativo o no replicativo que carece de origen de replicación y comprende el gen ermE y un fragmento del vector SCP2*.
En otra realización particular, el vector de la invención es un vector replicativo que comprende' un origen de replicación igual o diferente al origen de replicación del vector SCP2*, el gen ermE y la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster.
En otra realización particular, el vector de la invención es un vector replicativo que comprende un origen de replicación igual o diferente al origen de replicación del vector SCP2*, el gen ermE, un fragmento del vector SCP2* y la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster.
En otra realización particular, el vector de la invención es un vector integrativo o no replicativo que carece de origen de replicación y comprende el gen ermE y la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster.
En otra realización particular, el vector de la invención es un vector integrativo o no replicativo que carece de origen de replicación y comprende el gen ermE, un fragmento del vector SCP2* y la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster. Cuando se utilizan vectores de la invención que comprenden la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento del mismo para transformar microorganismos productores de polienos con grupos carboxilo libres se observa la producción de polienos anudados y/o un incremento en la producción total tanto de polienos amidados como de polienos no amidados, por lo que dichos vectores pueden ser utilizados para incrementar la producción total de polienos con grupos carboxílico libres y/o polienos amidados en organismos productores de polienos.
Prácticamente cualquier cluster biosintético de un polieno o fragmento del mismo puede estar presente en el vector de la invención; no obstante, en una realización concreta dicho vector comprende la totalidad del cluster rim, biosintético de rimocidina, o un fragmento del mismo (Seco E.M., et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366). Aunque puede utilizarse cualquier fragmento del cluster rim, en una realización concreta, dicho fragmento del cluster rim comprende el gen rimA del cluster rim.
Dicho cluster biosintético de un polieno o fragmento del mismo puede encontrarse, opcionalmente, bajo el control de un promotor (es decir, operativamente unido a dicho promotor de manera que dirige la expresión del gen que controla). Dicho promotor puede ser endógeno o exógeno. Aunque prácticamente cualquier promotor exógeno funcional en el microorganismo a transformar posteriormente con dicho vector podría ser utilizado, en una realización particular, dicho promotor exógeno es un promotor funcional en Streptomyces sp., tal como el promotor xysA (xysAp) del gen de la xilanasa de Streptomyces halstedü JM8 (Ruiz- Arribas A., et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63: 2983-2988). El plásmido pSM743B constituye un ejemplo ilustrativo de este tipo de vectores de la invención. Los vectores de la invención pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor, NY, 1989).
Los vectores de la invención pueden ser utilizados para generar polienos amidados o no amidados en microorganismos productores de polienos que contienen un grupo carboxilo libre. Asimismo, combinaciones de vectores que contienen, por una parte, (i) un vector que comprende un cluster biosintético de un polieno, tal como el cluster rim, o un fragmento del mismo, y, por otra parte, (ii) un vector derivado de SCP2* que comprende el gen ermE, o bien un vector que comprende un origen de replicación diferente al de SCP2*, el gen ermE y un fragmento del vector SCP2*, pueden ser introducidas en microorganismos productores de macrólidos polienos que tienen grupos carboxilo, para generar polienos amidados o no amidados en dichos microorganismos.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un vector de la invención para ser introducido, por métodos convencionales, en microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen grupos carboxilo libres (e.g., anfotericina B, nistatina, rimocidina, pimaricina, candicidina, etc.), con objeto de producir los correspondientes polienos amidados a partir de los correspondientes microorganismos recombinantes generados. Entre los microorganismos susceptibles de ser utilizados como huéspedes de los vectores de la invención se incluyen microorganismos productores de polienos que presentan un grupo carboxilo libre tales como Streptomyces nodosus, productor natural de anfotericina B; Streptomyces rimosus, productor de rimocidina; Streptomyces griseus, productor de candicidina; Streptomyces natalensis, productor de pimaricina; Streptomyces noursei, productor de nistatina, etc.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de microorganismos recombinantes productores de macrólidos polienos que contienen un grupo amida que comprende introducir un vector de la invención en microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen grupos carboxilo libres. Alternativamente dichos microorganismos recombinantes productores de macrólidos polienos que contienen un grupo amida pueden obtenerse introduciendo en microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen grupos carboxilo libres combinaciones de vectores que contienen, por una parte, (i) un vector que comprende un cluster biosintético de un polieno, tal como el cluster rim, o un fragmento del mismo, y, por otra parte, (ii) un vector derivado de SCP2* que comprende el gen ermE, o bien un vector que comprende un origen de replicación diferente al de SCP2*, el gen ermE y un fragmento del vector SCP2*, pueden ser introducidas en microorganismos productores de macrólidos polienos que tienen grupos carboxilo, para generar polienos anudados o no anudados en dichos microorganismos. La introducción de dichos vectores de la invención o combinaciones de vectores en dichos microorganismos puede llevarse a cabo por técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, e.g., transformación, electroporación, conjugación, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen grupos carboxilo libres incluyen diversas especies de Streptomyces, por ejemplo, S. noursei, S. rimosus, S. nodosus, S. natalensis, S. griseus, etc.
Los microorganismos recombinantes, obtenidos según se ha indicado previamente, en adelante microorganismos recombinantes de la invención, forman parte de la presente invención y constituyen un aspecto adicional de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un macrólido polieno que comprende cultivar un microorganismo recombinante de la invención bajo condiciones que permitan la producción de dicho macrólido polieno, y, si se desea, aislar y purificar dicho compuesto. En una realización particular, dicho macrólido polieno se selecciona entre un macrólido polieno que contiene un grupo carboxilo libre, un macrólido polieno que contiene un grupo amida y sus mezclas. Entre dichos macrólidos polienos que contienen un grupo amida se encuentran el compuesto AB-400 (IVb) y los compuestos de fórmula (1-1), por ejemplo, los compuestos rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb) y sus mezclas. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de macrólidos polienos que pueden ser obtenidos según el procedimiento mencionado previamente incluyen compuestos de fórmula (I), por ejemplo, compuestos seleccionados entre pimaricina (IVa), AB-400 (IVb), rimocidina (lia), rimocidina B (I-la), CE-108 (Hb), CE-108B (I-lb) y sus mezclas.
Dichos microorganismos recombinantes se cultivarán en cualquier medio adecuado para la fermentación de dichos microorganismos y contendrá, en general, una o más fuentes de carbono, una o más fuentes de nitrógeno, una o más sales inorgánicas asimilables por el microorganismo, y, si es necesario, uno o más nutrientes orgánicos, tales como vitaminas y aminoácidos, disueltos en un medio acuoso, y se aplicarán las condiciones apropiadas (aireación/agitación, temperatura y tiempo de fermentación, etapas, etc.) para el crecimiento de los microorganismos y la producción de los macrólidos polienos. Ventajosamente, los macrólidos polienos obtenidos son secretados al medio de cultivo de donde pueden ser recuperados mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de métodos cromatográficos, opcionalmente previa retirada del extracto celular. El/los polieno/s amidado/s de interés puede/n ser separado/s en base a sus características físico-químicas, lo que permite diseñar un procedimiento para su purificación a partir del medio de cultivo tras el proceso fermentativo.
2. Vectores implicados en la inducción de polienos metilados y aplicaciones La invención se relaciona también con el uso del fago recombinante PM1-768B, derivado del actinofago PMl (Malpartida and Hopwood (1986) Mol. Gen. Genet. 205: 66-73) sobre el cual se ha clonado un fragmento de ADN interno al gen rimG junto con el promotor ermEp; el promotor delante del fragmento interno al gen evita posibles efectos polares sobre los genes situados a continuación del punto de inserción. Alternativamente puede ser utilizado un fragmento de ADN conteniendo otra actividad promotora funcional para Streptomyces, clonado delante de cualquier fragmento interno al gen rimG o btenido por amplificación del ADN cromosómico del productor de rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb); la construcción resultante puede ser clonada indistintamente en el vector PMl ó en otro vector no replicativo en Streptomyces (o siendo replicativo sometido a condiciones de cultivo donde el vector no se replique, tal como plásmidos de origen de replicación termosensibles), según la metodología usada en el campo a la que tiene acceso cualquier operario/a con experiencia en el campo. La cepa recombinante {Streptomyces diastaticus var. 108/PM 1-768) (u otra funcionalmente equivalente que pudiera ser generada por los procedimientos indicados más arriba) debería ser productora de compuestos intermediarios de la ruta biosintética de rimocidina (lia) y CE-108 (Hb), ya que la inserción inactivante, sólo afectaría a la capacidad del recombinante para completar la oxidación del grupo lateral metilo introducido por el módulo 7 de la poliquétido sintetasa de rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) (Seco et al 2004, Chem Biol., citado supra). No obstante, en estas primeras condiciones, y de forma inesperada la disrupción en el gen rimG realizada generó un recombinante incapaz de producir polienos. Esto se interpreta en el sentido de que el promotor utilizado para la disrupción es incapaz de prevenir efectos polares probablemente sobre el gen rimA situado a continuación del punto de inserción. Por ello, para asegurar la ausencia de efectos polares sobre el gen rimA, al disruptante se debe complementar con el plásmido pSM743B u otro vector funcionalmente equivalente, capaz de complementar una disrupción del gen rimA en el cromosoma. El recombinante genético así obtenido contendría una copia adicional del gen rimA en el plásmido pSM743B (u otro vector funcionalmente equivalente) además de la cromosómica situada a continuación de la disrupción del gen rimG. Cualquier efecto polar sobre la copia cromosómica del gen rimA como consecuencia de la inserción sería complementado por la copia extracromosómica clonada en pSM743B (u otro vector funcionalmente equivalente), originando un recombinante afectado exclusivamente en el gen rimG (oxidación del grupo metilo lateral de anillo de macrolactona). El plásmido pSM743B (u otro vector funcionalmente equivalente, tal como se indica más arriba) puede ser transferido mediante cualquier técnica habitualmente disponible para la manipulación de Streptomyces (transformación de protoplastos, infección, conjugación, etc.). Confirmadas las construcciones, los análisis por HPLC del caldo de fermentación de la cepa resultante (Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B u otra funcionalmente equivalente tal como se indica más arriba confirmaron la producción de rimocidina C (Illa) y CE-108C (IHb) pero no de los tetraenos parentales rimocidina (lia) ni CE- 108 (Ub). Opcionalmente la mutación del gen rimG puede ser realizada por deleción de un fragmento interno al gen rimG, siguiendo las técnicas convencionales al uso para manipulación de Streptomyces.
Así, la presente invención se relaciona con un procedimiento de obtención de la cepa de la invención productora de polienos metilados S. diastaticus var. 108::PMl-768/743B o sus equivalentes en el que la cepa resultante está exclusivamente afectada en la expresión del gen rimG y porque comprende las siguientes etapas: a) Obtención de un mutante en el gen rimG del microorganismo S. diastaticus var. 108 o de sus equivalentes funcionales mediante la disrupción o deleción de dicho gen, incapaz de producir polienos, y b) su posterior transformación con un vector, preferentemente un plásmido, capaz de complementar la disrupción del gen rimA en el cromosoma en dicho muíante.
De una forma más concreta, la invención se relaciona con un procedimiento de obtención del microorganismo de la invención en el que el mutante del paso a) se obtiene mediante el uso del fago recombinante PMl -768 ó cualquier otro sistema inactivante que funcionalmente sea equivalente para generar disrupción ó deleción del gen rimG de la cepa S. diastaticus var. 108 y en el que el paso b) re realiza con el plásmido pSM743B (o vector funcionalmente equivalente como se indica más arriba) para complementar el posible efecto polar del gen rimA en el cromosoma del recombinante.
Además de la realización concreta anterior, la invención se relaciona, en otro aspecto, con la interrupción del gen rimG en el cromosoma de Sfreptomyces diastaticus var. 108 por cualquier método convencional y utilizando cualquier vector apropiado. Dicha interrupción podrá llevarse a cabo utilizando un promotor fuerte para evitar un efecto polar como pudiera ser el promotor ermEp (Kieser et al. (2000) Practical Streptomyces
Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, UK), que será responsable de la producción de los polienos metilados rimocidina C (Illa) y CE-108C (IHb) directamente en la cepa disruptante; o bien, complementando el efecto polar sobre el gen rimA mediante la expresión de dicho gen rimA bajo el control de un promotor exógeno utilizando cualquier vector como herramienta.
Además, la invención se relaciona en otro aspecto con la disrupción en otros productores de polienos del gen codificante para la citocromo P450 monooxigenasa implicada en esta misma oxidación (formación del grupo carboxilo a partir del grupo metilo de los correspondientes polienos) con objeto de obtener derivados metilados de los mismos. Está descrito que una citocromo P450 monooxigenasa está implicada en esta oxidación, y se encuentra codificada en los clusters biosintéticos de polienos descritos hasta el momento (Aparicio et al., 2003, Appl Microbiol Biotechnol 61 : 179-188). Algunos genes implicados en esta oxidación ya han sido descritos, cabiendo citar los genespimG (Aparicio et al, 2000, Chem. Biol. 7: 895-905), amphN (Caffrey et al..200\, Chem. Biol. 8:713-723), nysN (Brautaset et al, 2000, Chem. Biol. 7: 395-403) y canC (Campelo et al., 2002, Microbiology 148: 51-59) para la biosíntesis de pimaricina, anfotericina, nistatina y candicidina, respectivamente. Los derivados metilados de estos compuestos presentarían las funciones mejoradas de los compuestos metilados descritos en la invención rimocidina C y CE-108C, es decir, menor toxicidad y mayor especificidad a hongos y parásitos.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de microorganismos productores de macrólidos polienos metilados que comprende interrumpir el gen codificante para la citocromo P450 monooxigenasa implicada en la formación del grupo carboxilo libre - gen homólogo al gen descrito en la invención HmG en otras cepas - en microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen grupos carboxilo libres, utilizando para tal fin cualquier método convencional (transformación, conjugación, electroporación, infección, etc.). Además, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de cualquier vector para llevar a cabo una disrupción del gen codificante para la citocromo P450 monooxigenasa implicada en la formación del grupo carboxilo libre en microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen grupos carboxilo libres, pertenecientes entre otros, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: anfotericina B, nistatina, rimocidina, pimaricina y candicidina con objeto de producir los correspondientes polienos metilados. Entre los microorganismos susceptibles de ser utilizados para la producción de polienos metilados como resultado de la interrupción del gen codificante para la citocromo P450 monooxigenasa implicada en la oxidación del grupo metilo a carboxilo, se encuentran, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención: Streptomyces nodosus, productor natural de anfotericina B; Streptomyces rimosus, productor de rimocidina; Streptomyces griseus, productor de candicidina; Streptomyces natalensis, productor de pimaricina; y, Streptomyces noursei, productor de nistatina.
Además, la invención se relaciona con la expresión adecuada de genes que pudieran haberse visto afectados por un efecto polar al llevarse a cabo la disrupción del gen correspondiente, utilizando cualquier vector como vehículo (plásmidos replicativos, plásmidos integrativos, actinofagos, etc.) y siendo introducidos por cualquiera de los métodos convencionales (transformación, conjugación, electroporación, infección, etc.). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen grupos carboxilo libres incluyen especies de Streptomyces, por ejemplo, S. noursei, S. rimosus, S. nodosus, S. natalensis y S. griseus.
Los microorganismos manipulados genéticamente como se ha indicado previamente, en adelante microorganismos homólogos productores de macrólidos polienos metilados genéticamente manipulados de la invención, forman parte de la presente invención y constituyen un aspecto adicional de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un macrólido polieno metilado que comprende cultivar un microorganismo genéticamente manipulado de la invención bajo condiciones que permitan la producción de dicho polieno metilado, y, si se desea, aislar y purificar dicho compuesto que pertenece a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: anfotericina B metilada, nistatina metilada, pimaricina metilada y candicidina metilada. Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye cualquiera de estos nuevos polienos metilados, anfoterina B metilada, nistatina metilada, pimaricina metilada y candicidina metilada, que pueden ser utilizados para la elaboración de composiciones biocidas y farmacológicas como en el caso de la rimocidina C y CE- 180C.
Dichos microorganismos genéticamente manipulados se cultivarán en cualquier medio adecuado para la fermentación de dichos microorganismos y contendrá, en general, una o más fuentes de carbono, una o más fuentes de nitrógeno, una o más sales inorgánicas asimilables por el microorganismo, y, si es necesario, uno o más nutrientes orgánicos, tales como vitaminas y aminoácidos, disueltos en un medio acuoso, y se aplicarán las condiciones apropiadas (aireación/agitación, temperatura y tiempo de fermentación, etapas, etc.) para el crecimiento de los microorganismos y la producción de los macrólidos polienos. Ventajosamente, los macrólidos polienos obtenidos son secretados al medio de cultivo de donde pueden ser recuperados mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de métodos cromatográficos, opcionalmente previa retirada del extracto celular. El/los polieno/s metilado/s de interés puede/n ser separado/s en base a sus características físico-químicas, lo que permite diseñar un procedimiento para su purificación a partir del medio de cultivo tras el proceso fermentativo.
Compuesto AB-400 (IVb)
El compuesto AB -400 (IVb), la amida correspondiente a la pimaricina (I Va) , es un producto natural conocido procedente de Streptomyces costae (Cañedo L.M. et al, 2000, J. Antibiot. (Tokio) 53: 623-626).
Los ensayos realizados por los inventores con AB-400 (IVb) y pimaricina (IVa) han puesto de manifiesto que AB-400 presenta un incremento sustancial de la actividad fungicida sin ello origine incremento de la actividad hemolítica frente a glóbulos rojos humanos, lo que permite afirmar que presenta una mayor toxicidad selectiva hacia membranas que contienen ergosterol que su homólogo no amidado pimaricina (IVa).
Otros ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que los polienos amidados son significativamente más solubles en agua que los homólogos no amidados. Esta característica junto con las propiedades farmacológicas descritas anteriormente hacen que este compuesto sea susceptible de ser utilizado en clínica, para tratamiento tópico o sistémico de micosis o parasitosis; y, en la industria agroalimentaria.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende el compuesto AB-400 (IVb) junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Si se desea, dicha composición farmacéutica puede contener, además, uno o más agentes terapéuticos que, eventualmente, potencien la acción terapéutica de dicho compuesto AB -400 (IVb), o bien que incrementen su espectro de acción. Dicha composición farmacéutica puede ser utilizada para prevenir y/o tratar infecciones causadas por organismos patógenos de humanos o animales que poseen membranas celulares que contienen ergosterol, por ejemplo, parásitos y hongos patógenos de humanos o animales.
Por tanto, en una realización concreta, dicha composición farmacéutica es una composición antiparasitaria y puede ser utilizada en la prevención y/o el tratamiento de infecciones causadas por parásitos cuyas membranas celulares contienen ergosterol, por ejemplo, Trypanosoma, Leishmania, etc. Si se desea, dicha composición antiparasitaria puede contener, además, uno o más agentes antiparasitarios que, eventualmente, potencien la acción terapéutica de dicho compuesto AB-400 (IVb) o bien que incrementen su espectro de acción.
En otra realización concreta, dicha composición farmacéutica es una composición antifúngica y puede ser utilizada en la prevención y/o el tratamiento de infecciones causadas por hongos (cuyas membranas celulares contienen ergosterol). Si se desea, dicha composición antifúngica puede contener, además, uno o más agentes antifúngicos que, eventualmente, potencien la acción antifúngica de dicho compuesto AB -400 (IVb), o bien que incrementen su espectro de acción. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos agentes antifúngicos incluyen polienos, tales como anfotericina B, nistatina, AB- 400 (IVb) , alilaminas (e.g.5 terbinafma, naftifina, etc.), amorolfia, tolnaftalato, etc.; azoles, tales como clotrimazol, miconazol, ketoconazol, fluconazol, itxaconazol, etc.; benzofuranos, por ejemplo, griseoñilvina, etc.; pirimidinas, por ejemplo, fluocitosina, etc.;
El compuesto AB-400 (IVb) estará presente en dicha composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, en una cantidad apropiada para ejercer su efecto terapéutico. En una realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 99,99% en peso de compuesto AB -400 (IVb) , y puede presentarse en cualquier forma farmacéutica de administración apropiada en función de la vía de administración elegida, por ejemplo, oral, parenteral o tópica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse, por ejemplo, en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Ia edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
Por tanto, la invención también se relaciona con el empleo de AB -400 (IVb) en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la infección causada por organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol, por ejemplo, parásitos de humanos o animales o bien hongos patógenos de humanos o animales.
Asimismo, en otro aspecto, la invención también proporciona un método para prevenir y/o tratar infecciones causadas por organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol, por ejemplo, parásitos de humanos o animales o bien hongos patógenos de humanos o animales, que comprende la etapa de administrar a un animal o a un ser humano, en necesidad de tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica proporcionada por esta invención que comprende el compuesto AB-400 (IVb).
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El siguiente ejemplo ilustra la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
EJEMPLO 1 - Producción y caracterización de rimocidina B (I-la) y CE-108B (I- Ib)
I. Procedimientos experimentales
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento
Las cepas bacterianas y los plásmidos se describen en la Tabla 1.
Streptomyces diastaticus var. 108 y sus derivados por modificación genética se crecieron de forma rutinaria en medio líquido y sólido SYM2 (Atlas R.M.,
Microbiological Media. CRC Press, Boca Ratón, Florida) para el análisis de la producción de tetraenos, y en un medio líquido TSB (Oxoid) para la extracción de plásmidos y de ADN total.
Streptomyces lividans TK21 se utilizó como hospedador general de clonación y se creció en un medio sólido R5 y en medio líquido YEME tal como se describe en manuales de campo (Kieser T. et al, 2000, Practical Streptomyces Genetics, Norwich).
Las cepas de E. coli se crecieron en agar Luria-Bertani (LB) o en caldos LB según se describe en la literatura especializada (Maniatis T. et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y.).
P. chysogenum, C. krusei, A. niger, C. albicans y C. neoformans, hongos empleados para ensayar la actividad antifungica, se crecieron en medio MPDA (composición: 2% de extracto de malta, 2% de glucosa, 0,1% de Bactopeptona).
Tabla 1 Cepas bacterianas y plásmidos empleados en la invención
Cepa o plásmido Propiedades Referencia
Streptomyces diastaticus var. 108 Cepa silvestre, productora de rimocidina y CE-108 (a)
S. diastaticus var.108/922 Cepa derivada de la silvestre S. diastaticus var. 108 por
Esta invención transformación con el plásmido pIJ922 (control)
S. diastaticus var.108/PM 1-500 Cepa derivada de la silvestre con el gen riniA inteiTumpido por integración del fago PMl -500; no (b) productora de tetraenos
S. diastaticus var.lO8/743B Cepa derivada de la silvestre por transformación con el plásmido pSM743B; productora de CE-108, Esta invención rimocidina, CE-108B y rimocidina B
S. diastaticus var.lO8::PMl- 500/743B Cepa derivada de la silvestre con el gen rimA interrumpido por integración del fago PMl -500 y transformada
Esta invención con el plásmido pSM743B; productora de CE-108, rimocidina, CE-108B y rimocidina B
S. diastaticus var. 108/784 Cepa derivada de la silvestre por transformación con el
Esta invención plásmido pSM784; productora de CE-108, rimocidina,
S. sp. RGU5.3 Cepa silvestre; productora de pimaricina y AB -400 Esta invención
E. coli JM101 Hospedador general de clonaje (C)
S. lividans TK21 Hospedador general de clonaje (d)
Penicilium chrysogenum ATCC10003 Ensayos de actividad antifungica ATCC
Candida albicans ATCC 10231 Ensayos de actividad antifungica ATCC
Candida krusei ATCC14243 Ensayos de actividad antifungica ATCC
Aspergillus niger ATCCl 004 Ensayos de actividad antifungica ATCC
Cryptococcus neoformans ATCC10226 Ensayos de actividad antifungica ATCC pIJ922 Vector basado en el replicón SCP2*, tsr, 24 kb (e) pIJ941 Vector basado en el replicón SCP2*, tsr, }ψg, 25 kb (e) pNAe-1 Gen ermE clonado en pUK21 Esta invención pHisl Vector replicativo en E, coli transportando el promotor
(f> xilanasa xysA (xysAp), ApR, 3,7 kb pSM736 Fragmentos de 1,2 kb SacI-DralII y 4,9 kb DralII-BglII que contienen rimA clonado simultáneamente en sitios Esta invención
SacI/BamHI de pIJ2925 pSM738 Fragmento de 6,1 kb BglII-PstI de pSM736 (gen rimA) y fragmento de 1 ,7 kb Pstl-Sphl de pNAe-1 (gen de Esta ¡nvenci5n resistencia ermE) clonados simultáneamente en sitios
SmaT/SnhT de nHisi pSM743B Fragmento de 8,4 kb BgIII de pSM738 (que contiene xysAp, rimA y ermE) clonado dentro del sitio EcoRV de Esta invención plJ922 (ver Figura 1) pGAe-1 Gen ermE clonado en pSL 1180 _ , .
Esta invención pSM784 Fragmento de 1,8 kb SspI-EcoRV de pGAe-1 (gen de Esta invención resistencia ermE) clonado dentro del sitio EcoRV de pIJ941 (ver Figura 1) Ap, ampicilina; Km, kanamicina; ermE, tsr y hyg: genes de resistencia a eritromicina, tioestreptona e higromicina B
(a) Pérez-Zúñiga F.J., et al., 2004, J. Antibiot. (Tokyo) 57:197-204
(b) Seco E.M. et al., 2004, Chem. Biol. 11:357-366
(c) Yanisch-Perron C, et al., 1985, Gene 33:103-119 (d) Kieser T., et al, 2000, Practical Streptomyces Genetics, Norwich
(e) Lydiate D.J., et al., 1985, Gene 35:223-235
(f) Ruiz-Arribas A., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:2983-2988
Procedimientos genéticos Las cepas de E. coli se crecieron y transformaron tal como se describe en
Maniatis et al. (1982). Las cepas de Streptomyces se manipularon tal como se ha descrito previamente (Kieser T., et al., 2000, citado suprά). La conjugación intraespecífica se llevó a cabo creciendo conjuntamente las cepas donadoras y receptoras en un medio sólido R5 sin selección y posteriormente seleccionando en base a las correspondientes resistencias a antibióticos de los plásmidos y a los marcadores genéticos. La manipulación del ADN se realizó tal como se ha descrito previamente (Maniatis T., et al., 1982, citado suprά).
Ensayos para la producción de tetraenos La producción de tetraenos se analizó extrayendo la totalidad de una alícuota del cultivo con metanol tal como se ha descrito previamente (Seco E.M. et al., 2004, citado supra). Los extractos se filtraron y se sometieron a análisis de HPLC con un equipo Waters 600S Controller, equipado con Waters 996 PDA; la determinación cuantitativa y las condiciones cromatográficas fueron las mismas que las descritas previamente (Pérez- Zúfiiga F.J., et al., 2004, citado supra).
Ensayos de HPLC-MS Los espectros de masas se determinaron en un equipo 1100MSD HPLC conectado a un detector cuadrupolo Agilent Technology Detector, usando electrospray como fuente y un modo de ionización positiva. Las condiciones cromatográficas fueron las mismas que las descritas previamente (Pérez-Zúñiga FJ., et al., 2004, citado supra).
Purificación de los nuevos compuestos
Streptomyces diastaticus var. 108/784, o microorganismos eventualmente modificados con construcciones capaces de producir los polienos amidados (tal como se ha indicado anteriormente) se cultivó o cultivaron bien en medio SYM2, sólido o líquido (Pérez-Zúñiga F. J., et al., 2004, citado supra). Transcurridos seis días, el medio sólido completo donde se cultivaron los microorganismos, se fragmentó por cizalla haciéndolo pasar por una jeringuilla de 50 mL; el medio sólido así fragmentado se extrajo con cuatro volúmenes de metanol, previamente acidificado con ácido fórmico 25 mM. Los cultivos procedentes de medio líquido fueron liofilizados antes de realizar extracciones similares con metanol. La suspensión acuosa se agitó durante 1 hora y se centrifugó a 5.000 g durante 20 minutos para eliminar las partículas sólidas en suspensión. El sobrenadante transparente se concentró mediante roto -evaporación a 10-20 X 106 unidades por microlitro (μL) medidas a una longitud de onda de 304 nanometros (nm). La muestra fue posteriormente almacenada en 80% metanol/agua hasta su empleo. Doscientos mililitros del cultivo líquido celular o una placa (24 x 24 cm) cuyo cultivo fue previamente extraído con 5 volúmenes de metanol, dieron lugar a una producción de hasta 40 mg de la mezcla de tetraenos amidados. Las muestras extraídas en metanol se llevaron a 20% de metanol con agua y se filtraron para eliminar el material precipitado. El filtrado se aplicó lentamente a una columna Omnifit (250 x 25 mm, Supelco Cat No. 56010) previamente rellenada con una resina de intercambio iónico, tal como SP-Sepharose, Phast Flow (Pharmacia) que previamente se equilibró con la misma disolución. Bajo estas condiciones, la rimocidina y el compuesto CE- 108 eluyeron con el frente no unido al relleno de la columna, al igual que pigmentos procedentes del cultivo; los correspondientes polienos amidados rimocidina B (I- la) y CE-108B (I- Ib) quedaron completamente retenidos. La columna, conteniendo los compuestos de interés retenidos en la fase sólida, se lavó exhaustivamente con la misma solución para eliminar aquellos compuestos que no interaccionan con el relleno de SP Sepharosa. Los polienos amidados rimocidina B (I-la) y CE-108B (I-lb), retenidos por interacción en la columna, se eluyeron con acetato amónico 300 mM pH 5 en 20% de metanol recogiéndose fracciones a intervalos de tiempo regulares. De las fracciones eluidas se seleccionaron aquéllas que contenían las mezclas de las amidas de interés; éstas se juntaron en y se sometieron a un proceso físico de desalinización, empleando para ello cartuchos Sep-Pak (Waters). Finalmente las fracciones desalinizadas se disolvieron en 20% de metanol. La fracción conteniendo la mezcla de polienos anudados (15 mg) que habian sido desaladas, se fraccionaron finalmente por HPLC (con el fin de separar los polienos amidados); para ello se empleó una columna semi-preparativa (Supelcosil PLC-8, 250 x 21,2 mm). Los parámetros cromatográficos y las fases móviles, controlados con un controlador de gradiente automático (Waters Automated Gradient Controller), fueron: 12 minutos con 100% de B (acetato amónico 20 mM pH 5, etanol 20%), 43 minutos de un gradiente binario hasta 50% de A (metanol) y 50% de B (curva 6 especificada en los controladores cromatográficos de Waters); 35 minutos de un gradiente binario hasta 100% de A (curva 8, de los mismos controladores señalados anteriormente), y un flujo constante de 5 mL/min. Las fracciones se recogieron a intervalos regulares (5 mL por fracción) y aquéllas que llevaban los compuestos aislados purificados se juntaron y se sometieron a una etapa de desalinización adicional, como la descrita anteriormente y, finalmente, se liofilizaron dos veces. También se purificó AB-400 (Cañedo L.M. et al., 2000, J. Antibiot. (Tokio) 53:623-626), a partir de los cultivos líquidos de Sfreptomyces sp. RGU5.3, tal como se ha descrito anteriormente.
Ensayos de actividad hemolítica
Los ensayos se llevaron a cabo según el método descrito por Gómez-Gómez et al. (Gómez-Gómez J.M. et al., 1996, Mol. Microbiol. 19:909-910). Las muestras de polienos se desecaron previamente y se disolvieron en DMSO a una concentración estimada de 10 a 30 mg/mL. Cantidades crecientes de los diferentes polienos se llevaron a un volumen final de 100 μL de DMSO y se mezclaron mediante agitación suave con 500 μL de tampón PBS (Gómez-Gómez J.M. et al., 1996, citado suprά) conteniendo 2,5% de sangre humana o, eventualmente, de caballo. Tras la incubación a 370C durante 30 minutos sin agitación, las células se sedimentaron mediante centrifugación y el grado de hemolisis se evaluó mediante la medida de la absorbancia a 545 nm. Los valores correspondientes a la hemolisis total se estimaron con una suspensión de un 2,5% de sangre de caballo en agua destilada. La sangre humana (fundamentalmente eritrocitos) se obtuvo de Bancos de sangre local (Hospital Ramón y Cajal (Madrid)); la sangre de caballo procedía de Oxoid (sangre desfibrinada). La anfotericina B y la nistatina A se obtuvieron de Sigma (números de catálogo A-4888 y N-3503, respectivamente); y, la pimaricina, de Calbiochem (527962). Todos estos polienos se ensayaron directamente de las muestras comerciales, sin purificación adicional.
II. Resultados
Generación del gen HmA recombinante
El gen HmA (Seco E.M. et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366), codificado dentro de un ARNm policistrónico, fue clonado bajo el control del promotor xysA (xys Ap) del gen de la xilanasa de Streptomyces halstedii JM8 (Ruiz- Arribas A., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 2983-2988). Para ello, el promotor xys Ap fue rescatado a partir de pHisl como un fragmento BgRl/Smal de 547 pares de bases que, además, lleva el terminador del gen de resistencia a metilenomicina (Tl: Adham S.A. et al., 2001, Arch. Microbiol. 177: 91-97) situado en posición anterior al promotor xys Ap. Después de varias etapas descritas en la Tabla 1, siguiendo los procedimientos habituales de clonaje de ADN, el fragmento de ADN que contenía el gen rimA y el extremo 3' del gen HmI (posiciones 9336 a 15445 pares de bases a partir de la secuencia depositada en GenBank bajo el número de acceso AY442225, tal como se indica en la Figural; Seco E.M. et al, 2004, citado suprd) se fusionó con xys Ap en la orientación adecuada que permitía expresar el HmA bajo el promotor xys Ap (recombinante rimA). Finalmente el gen ermE de pNAe-1 (Tabla 1) se rescató por digestión con las enzimas flanqueantes y el fragmento de ADN resultante se clonó, en etapas intermedias, a continuación del gen "recombinante rimA" para generar, en la construcción final, un fragmento de ADN conteniendo (ver Figura IA), de izquierda a derecha: el gen rimA bajo el control del promotor xysAp, el fragmento del gen riml truncado y finalmente el gen ermE completo. El fragmento de ADN resultante se clonó, vía extremos romos, según la técnica habitual en Biología Molecular, en el sitio de restricción único EcoKV, localizado dentro del gen de resistencia a tioestreptona, del vector de Streptomyces pIJ922. El plásmido resultante (pSM743B, Figura IA) confiere resistencia a eritromicina pero no a tioestreptona al tener el correspondiente gen de resistencia a tioestreptona interrumpido por inserción del fragmento de ADN descrito anteriormente.
La correcta funcionalidad del gen HmA recombinante, clonado en pSM743B, tal como se indica más arriba, se comprobó por introducción del plásmido pSM743B en un muíante de Streptomyces diastaticus var. 108 generado previamente por disrupción del gen nativo rimA (Streptomyces. diastaticus var. 108/PM1-500, descrito en Seco E.M. et al, 2004, citado supra). El recombinante genético resultante (generado por introducción del plásmido pSM743B en el muíante de Streptomyces diastaticus var. 108 con el gen rimA previamente iníerrumpido) es capaz de producir los macrólidos poliénicos nativos (rimocidina y CE- 108), así como los nuevos macrólidos amidados (rimocidina B y CE- 108B). Asimismo, el plásmido pSM743B introducido en la cepa silvesíre indujo íambién la producción de los cuaíro tetraenos (amidados y carboxilados) pero con un incremento en la producción íoíal de polienos probablemeníe debida a la expresión de genes biosiníéíicos del clusíer Hm. Paralelameníe se consíruyó el plásmido pSM784. Para ello el gen errriE se clonó, siguiendo la íecnología habitual en Biología Molecular y, en sucesivas eíapas, en vectores adecuados de Escherichia coli como para obiener el gen ermE completo susceptible de ser rescatado como un fragmento de ADN de extremos romos. Finalmente el fragmento de ADN conteniendo el gen ermE en un fragmento de ADN con extremos romos, se clonó en el sitio único de restricción EcoRV del vector pIJ941. El vector resultante confiere resistencia a eritromicina e higromicina B aunque es sensible a tioestreptona al tener interrumpido el gen de resistencia a éste por la inserción inactivante del fragmento del gen ermE (ver Figura IB). Cuando el plásmido pSM784 es introducido en la cepa silvestre Streptomyces diastaticus var. 108, el microorganismo recombinante resultante es capaz de producir, además de los macrólidos rimocidina (lia) y CE-108 (Hb), los nuevos polienos amidados CE-108B (I-lb) y rimocidina B (I-la).
Por tanto, los modificados genéticos de Streptomyces diastaticus var. 108 conteniendo el vector pSM743B o el vector pSM784 producen tanto los polienos originales (rimocidina y CE- 108) como los nuevos polienos amidados (CE- 108B y rimocidina B), con un perfil cromatográfico, analizado en HPLC, semejante, tal como se indica en la Figura 1 C. Pese a que cualitativamente ambos recombinantes genéticos producen los mismos polienos, la producción de ellos es significativamente mayor en aquellos recombinantes que contienen el gen rimA y el gen de eritromicina (plásmido pSM743B).
La producción de ambos tetraenos (rimocidina y CE- 108) se restauró en el muíante Streptomyces diastaticus var. 108 con el gen HmA interrumpido, al introducir el plásmido pSM743B, indicando que el gen rimA recombinante es funcional. Sin embargo, la producción de polienos fue significativamente más baja en este muíante complementado que en la cepa sivestre portando el mismo plásmido pSM743B (Tabla 1); esta producción más baja no se alteró significativamente cuando se añadieron al medio tanto glucosa como xilano. Estos resultados parecen sugerir que la expresión de rimA sería una etapa limitante en la producción de los polienos; esta etapa limitante está claramente superada por el incremento de la dosis génica.
Estos resultados indican claramente que el gen ermE en el vector derivado de SCP2* juega un papel fundamental para generar los nuevos polienos. Se ha de destacar que, ni el gen de resistencia a eritromicina (ermΕ), clonado en otros vectores tales como pHJL401 (Larson J.L. et al., (1986) Plasmid 15: 199-209), ni un vector derivado del SCP2*, independientemente, son suficientes para producir las nuevas estructuras. Caracterización de los nuevos polienos Análisis HPLC-MS
Se llevaron a cabo análisis por HPLC combinado con espectrometría de masas del caldo de fermentación de S. diastaticus var. 108/743B y S. diastaticus var. 1O8::PM1- 500/743B; las masas deducidas para los 2 nuevos tetraenos fueron 738 y 766 para los tiempos de retención más bajos y más altos, respectivamente. En ambos casos, las masas de los nuevos polienos son una unidad más baja que la de los polienos con el tiempo de retención más cercano, CE- 108 (739) y rimocidina (767). Tanto la diferencia de masas como la movilidad cromatográfica apoyaban la idea de que los nuevos polienos derivaban de los macrólidos naturales. Elucidación de la estructura química:
Con el objetivo de elucidar la estructura química, se caracterizaron preliminarmente los dos nuevos polienos con el fin de desarrollar un procedimiento para su purificación. Ambos compuestos interaccionan no sólo con sílica gel en fase reversa como C8 y Cl 8 sino también con una resina de intercambio iónico tal como SP- Sepharosa, sugiriendo que estos compuestos tenían una carga positiva accesible. Esta primera caracterización permitió diseñar un procedimiento de purificación sencillo a partir del caldo de fermentación de Streptomyces diastaticus var. 108/pSM743B o Streptomyces diastaticus var. 108/784 indistintamente (véase el apartado relativo a los Procedimientos Experimentales).
El compuesto CE-108B (I- Ib) se obtuvo como un polvo con un espectro UV/visible típico de tetraenos (λmax = 317, 302, 289 nm), similar al de CE-108 (Hb) (Pérez-Zúñiga FJ. et al., 2004, J. Antibiot. (Tokio) 57: 197-204). El espectro de 1H- RMN con tres señales en el rango de sp2 a δ 6,25 (dd, 14,9, 10,9 Hz), un multiplete a δ 6,00-6,15 y un doblete de doblete a δ 5,87 (15,2, 8,4 Hz) era similar al de CE-108. Dos protones intercambiables aparecieron en a δ 7,30 y 6,83 como singletes anchos. En el rango alifático de δ 1,40-2,50, el espectro mostraba un patrón multiplete complejo, y las señales de tres tripletes de metilos y dobletes, respectivamente, aparecieron en δ 1,17, 1,15, y 0,83. El espectro de masas (+)-ESI MS puso de manifiesto la existencia de iones /wezΛio-moleculares a m/z 739 ([M+H]+) y 761 ([MH-Na]+), que corresponde a la fórmula molecular C37H58N2O13 mediante alta resolución (encontrado 739,40110, calculado 739,401715 para [M+H]+). El espectro de resonancia magnética 13C-RMN indicó 37 señales de carbono como en CE- 108, tal como exige la fórmula molecular. Los datos de 13C-RMN de CE- 108 y CE-108B estaban próximamente relacionados y permitieron concluir que CE- 108 y CE-108B poseían el mismo esqueleto de carbono incluyendo el amino-azúcar. Según estos datos, el segundo nitrógeno debe ser atribuido a una función amida, que identifica a CE-108B (I-lb) como la amida de CE-108 (Hb).
El polvo de rimocidina B (I- la) se disolvió en DMSO. El espectro de masas (+)- ESI MS fijó el peso molecular de rimocidina B (I- la) como 766, que corresponde, mediante alta resolución, a la fórmula molecular C39H62N2O13 (encontrado 767,43254, calculado 767,43301 para [M+N]+). El espectro de 1H-RMN fue similar al de CE-108B (I-lb) y mostró dos protones intercambiables H/D en δ 7,30 y 6,83, dos dobletes de doblete y un multiplete en el intervalo de δ 6,40 -5,80. La región alifática era muy compleja debido a la menor resolución, pero se identificaron fácilmente un triplete y un doblete en δ 1,83 y 1,16 atribuidos a señales metilo. El espectro de 13C-RMN indicó la presencia de 39 señales de carbono. La comparación con el de CE-108B (I-lb) reveló la presencia de tres señales carbonilo en 208,8, 174,1 y 172,1, además de señales sp2 de 8 átomos de carbono en el intervalo 136,7-128,3 y de dos grupos acetal. La similitud estrecha con CE-108B (I-lb) identificó este compuesto finalmente como la amida de rimocidina, identificada en esta descripción como rimocidina B (I- la).
Actividades biológicas de los nuevos compuestos polienos anudados Ensayos de actividad antifúngica:
La actividad antifúngica de los nuevos tetraenos amidados [rimocidina B (I- la) y CE-108B (I-lb)] se ensayó frente a varios hongos: Penicillium chrysogenum, Candida albicans, Aspergillus niger, Candida h'usei y Cryptococcus neoformans. Cantidades crecientes de los diferentes tetraenos, disueltos en metanol, se aplicaron sobre discos de papel (9 mm de diámetro); después de la aplicación, los discos se secaron y se colocaron sobre las placas de bioensayo en las que previamente se había extendido los correspondientes hongos testigos. La actividad de estos tetraenos amidados se comparó con la de las moléculas de las que proceden [rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb)], mostrando que la actividad biológica de los polienos amidados fue sustancialmente mayor que la de los correspondientes tetraenos de los que proceden (Figura 2) en todos los hongos ensayados. En todos los casos, la sustitución del grupo carboxilo libre por el grupo amida incrementó la actividad antifúngica aproximadamente cuatro veces.
Ensayos de toxicidad
En los experimentos anteriores es claro que la modificación de los nuevos polienos amidados, producidos por los recombinantes genéticos de Streptomyces diastaticus var. 108, daba lugar a compuestos con alta actividad antifúngica. Con el objetivo de determinar si la toxicidad también estaba incrementada, se llevaron a cabo determinaciones de la actividad hemolítica de los nuevos compuestos polienos amidados, en comparación con los compuestos que la cepa silvestre produce. Se utilizaron eritrocitos humanos como modelos celulares para este estudio (Cybulska B. et al., 2000, Acta Biochim. PoI. 47: 121-131; Gómez-Gómez J.M. et al, 1996, Mol. Microbiol. 19: 909-910). La actividad hemolítica de los nuevos compuestos se evaluó (véase el apartado relativo a los Procedimientos Experimentales) frente a rimocidina y CE- 108; también se incluyeron anfotericina B y nistatina A. Como se muestra en la Tabla 2, la actividad hemolítica de los tetraenos amidados [rimocidina B (I- la) y CE-108B (1-Ib)] no fue significativamente diferente de la de los correspondientes tetraenos de los que procedían, mientras que su actividad antifúngica era claramente mayor. Merece la pena destacar las diferencias en toxicidad observadas entre CE- 108 (Hb) y CE- 108 B (I- Ib) con rimocidina (lia) y rimocidina B (I- la); mientras que se alcanza el 50% de la hemolisis con 40 a 60 nanomoles de los dos últimos polienos, se necesita una concentración de CE- 108 y su amida de 6 a 7 veces mayor para alcanzar el mismo grado de hemolisis. Por tanto, las propiedades farmacológicas del polieno amidado CE-108B están significativamente mejoradas: mientras que CE-108 muestra una baja actividad antifúngica, su correspondiente derivado amidado (CE- 108B), tiene una actividad antifúngica incrementada a niveles casi tan altos como los de la rimocidina, en tanto que su actividad hemolítica que es de 6 a 7 veces menor. Estos ensayos también se llevaron a cabo con sangre de caballo mostrando resultados similares (datos no mostrados).
Los mismos resultados se obtuvieron comparando pimaricina (IVa) y su derivado amidado AB-400 (IVb). Ambos compuestos se purificaron a partir de la cepa aislada Streptomyces sp. RGU5.3, tal como se indica en el apartado relativo a los Procedimientos Experimentales. La cepa se cultivó en un medio suplementado tanto con glucosa como con acetato de sodio, encontrándose que la producción del derivado amidado se ve altamente incrementada cuando al cultivo se añade acetato de sodio. De esta forma, usando un caldo de fermentación que contiene glucosa como fuente de carbono, y no acetato sódico, el balance pimaricina/ AB -400 es de 70/30; cuando el mismo medióse suplementa con acetato sódico, el perfil de producción se revierte, siendo AB-400 (IVb) el principal compuesto poliénico producido (Figura 3). Este efecto no se observó para la producción de los polienos amidados producidos por la cepa Streptomyces diastaticus var. 108 modificada genéticamente. El polieno amidado se purificó a partir de este medio y se ensayó para ambas actividades antifúngica y hemolítica. Los resultados, resumidos en la Figura 3C, están de acuerdo con los resultados anteriormente observados con los polienos amidados obtenidos de los recombinantes genéticos de Streptomyces diastaticus var. 108: mientras que a la concentración ensayada de pimaricina (IVa) no se detectó actividad antifúngica la misma cantidad de AB -400 (IVb) fue altamente activa; se observaron diferencias de actividad cercanas a 1 orden de magnitud cuando se utilizó Penicillium chrysogenum. Sin embargo, los ensayos de actividad hemolítica llevados a cabo con AB-400 (IVb) y pimaricina comercial no mostraron diferencias significativas entre ambos polienos. Tomados estos datos en su conjunto, se puede concluir que el derivado amidado de pimaricina ofrece ventajas farmacológicas claras sobre el carboxilado pimaricina. Tabla 2
Actividad hemolítica comparativa de varios polienos. Los valores probados para cada polieno se dan en nanomoles (columna de la izquierda) y las correspondientes actividades hemolíticas como porcentaje total de hemolisis (ver Procedimientos Experimentales)
Anfotericina B Nistatina A Rimocidina Rimocidina B CE-108 CE-108B
(Ha) C-Ia) (Hb) (I-lb)
1 1,97
2 4,47
3 82,26
4 100
20 2,20 10,00 10,00
40 49,53 21,18 33,51
60 76,80 65,02 84,80
80 92,79 95,59 94,80
100 100,00 100,00 100,00
120 11,72 12,01
160 14,48 15,86
200 16,60 23,29
240 26,89 30,22
280 32,47 34,86
320 44,25 40,39
360 63,56 61,34
400 82,12 88,26
440 100,00 100,00
III. Discusión
Se describe la biosíntesis de dos nuevos polienos anudados con cambios en el grupo carboxílico producidos mediante manipulación genética de un organismo natural productor de dos polienos mayoritarios no anudados: rimocidina y CE-108.
Streptomyces diastaticus var, 108, un productor de dos tetraenos naturales (rimocidina y CE- 108), adquiere la capacidad de producir, de forma natural y como principales compuestos, las correspondientes amidas (rimocidina B y CE- 108B) si es modificado adecuadamente mediante manipulación genética. Al igual que otros derivados poliénicos semi-sintéticos, la conversión del grupo carboxílico libre en un grupo amida conlleva una mejora clara en alguna de sus propiedades farmacológicas (aumento sustancial de actividad antifúngica pero no en las actividades hemolíticas), proporcionando así una ventaja significativa, como agentes antifúngicos, frente a los tetraenos nativos. Esta modificación química en ambos derivados conlleva un aumento en la toxicidad selectiva para las membranas de organismos en cuya composición interviene el ergosterol. Los inventores han puesto de manifiesto que se obtiene un resultado similar con pimaricina (IVa) y su derivado AB -400 (IVb), que refuerza la idea de que la sustitución del grupo carboxílico en los polienos por un grupo amida aumentará también la toxicidad relativa de otros polienos.
Para la biosíntesis de estos nuevos polienos amidados pueden postularse, al menos, dos posibles mecanismos: (a) las amidas serían el resultado de una actividad amidotransferasa posterior al ensamblaje de la cadena policetónica de la aglicona (actividad de "adorno" o modificación post-PKS), la cual bajo las condiciones experimentales descritas en esta invención podría activarse, o (b) una actividad malonamil-CoA transferasa incorporaría, mediante el módulo 7 de condensación de la correspondiente PKS (Seco E.M. et al, 2004, Chem. Biol. 11: 357-366), malonamil-CoA en lugar de la metilmalonil-CoA como se propone en el modelo biosintético para la producción de CE- 108 y rimocidina. En este último caso, se requeriría una de condensación no decarboxilante tipo Claysen, tal como sucede en las tiolasas biosintéticas (Heath & Rock, 2002, Nat. Prod. Rep. 19:581-596), para la incorporación de malonamida en la cadena policetónica; en este caso la disponibilidad in vivo de malonamida como unidad condensante sería crucial para una buena incorporación en la cadena policetónica creciente. Merece la pena destacar que la cepa productora también biosintetiza oxitetraciclina, cuya unidad postulada "de arranque" para la cadena policetónica es la malonamida; así pues este metabolito estaría, en esta cepa, fácilmente disponible para la producción de otros metabolitos secundarios, además de oxitetraciclina. Aunque se desconoce el mecanismo genético que conduce a la producción de CE-
108B y rimocidina B, parece claro que se requieren, al menos los plásmidos derivados de SCP2* (tales como pIJ922 o pIJ941) y el gen ermE. Recientemente se ha descrito que concentraciones sub-inhibitorias de eritromicina pueden modular la transcripción bacteriana (Goh et al, 2002, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99: 17025-17030). No obstante, la posibilidad de que la eritromicina pueda modular la expresión de un posible regulador transcripcional haciendo posible la etapa de amidación en un organismo productor de polieno puede descartarse ya que las amidas también se detectaron en cultivos en los que no se había adicionado eritromicina. Esto abre la posibilidad de que el producto del gen ermE (una metilasa) pueda actuar sobre otro gen intermedio, codificado dentro del ADN de los plásmidos derivados de SCP2* (pIJ922 ó pIJ941) cuyo resultado final sería la activación de un gen cromosómico responsable de la amidación de los polienos naturales de Streptomyces diastaticus var. 108 (riinocidina y CE- 108). La presente invención proporciona un sistema para generar nuevos polienos amidados mediante biotransformación por una cepa modificada genéticamente. Este proceso, aplicado de forma satisfactoria a la ruta biosintética de polienos comerciales, sería indudablemente un proceso sencillo para la producción de compuestos farmacéuticos mejorados. Dada la complejidad de las estructuras poliénicas a que hace referencia esta invención, la biotransformación que se propone en esta invención para generar compuestos poliénicos amidados constituye un proceso indudablemente más eficiente que los descritos hasta el momento por síntesis orgánica para generar algunas estructuras semisintéticas.
EJEMPLO 2.- Producción y caracterización de rimocidina C (Illa) y CE-108C (πib)
I. Procedimientos experimentales
Cepas bacterianas, vectores de clonaje y condiciones de crecimiento
Las cepas bacterianas y los plásmidos se describen en la Tabla 1. Sti'eptomyces diastaticus var. 108 y sus derivados fueron cultivados en medio
SYM2 (Atlas R.M., Microbiological Media. CRC Press, Boca Ratón, Florida).
Streptomyces lividans TK21 fue utilizado para la propagación de fagos y como cepa hospedadora, y se creció en un medio sólido R5 y en medio líquido YEME tal como se describe en manuales del campo (Kieser T., et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, Norwich).
La cepa E. coli JM101 fue crecida en medio Luria-Bertani (LB) o en caldo LB según se describe en la literatura especializada (Maniatis T. et al., 1982, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring
Harbor, N. Y.). Penicillium chrysogenum ATCC 10003 fue utilizado para ensayar la actividad antifúngica y se creció en medio MPDA (composición: 2% de extracto de malta, 2% de glucosa, 0,1% de Bactopeptona). Tabla 1 : Cepas bacterianas y vectores utilizados en la invención
Cepa, plásmidoó Propiedades Referencia fago
E. co/z JM101 Hospedador general de clonaje Penicillium Cepa utilizada en pruebas antifúngicas ATCC1000 chrysogenum 3 S. lividans TK21 Hospedador general para clonaje en b
Streptomyces
S. diastaticus var. 108 Cepa silvestre, productora de rimocidina y CE-
108
S. diastaticus var. Derivados de S. diastaticus var. 108 silvestre Esta 108::PMl-768 con el gen rimG interrumpido por inserción invención del fago PMl -768
S. diastaticus var. Cepa anterior donde se ha introducido el Esta 108::PMl-768/743B plásmido pSM743B; productora de rimocidina invención
C y CE-108C
S. diastaticus var. Derivado de S. diastaticus var. 108 silvestre en Esta 108/743B la que se ha introducido el plásmido pSM743B invención (Ejemplo 1)
& diastaticus var. Derivado de S. diastaticus var. 108 silvestre Esta
108/PM1 -702B con el gen rimE interrumpido por integración invención del fago PMl -702B
S. diastaticus var. Cepa anterior donde se ha introducido el Esta 108::PMl-702B/743B plásmido pSM743B. invención
S. diastaticus var. Derivado de S. diastaticus var. 108 silvestre en Esta
108/784 la que se ha introducido el plásmido pSM784 invención
(Ejemplo 1)
S. diastaticus var. Derivado de S. diastaticus var. 108 silvestre d 108/PM1-500 con el gen rim A interrumpido por integración del fago PMl -500
S. diastaticus var. Cepa anterior donde se ha introducido el Esta 108 ::PM1 -500/784 vector pSM784. invención pHJL401 Vector para clonaje; contiene el replicón e SCP2* y pUC19; contiene el gen de resistencia a tiostrepton. Bifüncional E. coli/Streptomyces ρEL-1 Fragmento de ADN EcoRI-HMIII de pIJ4090 Esta correspondiente al promoter ermEp (ref. invención b)clonado en el sitio EcoRI-HmdlIIdel vector pHJL401
PMl Actinofago derivado de φC31(att"), hyg, tsr f pSM743B Vector recombinante, derivado de pIJ922, Esta conteniendo el gen rimA bajo el control del invención promoter de xilanasa Xy s A. (Ejemplo 1) pCNB5006 Vector derivado de pIJ2925 conteniendo el d promotor ermEp. pSM721 Fragmento de ADN de 0.7-kb (Saclϊ) interno Esta al gen rimG clonado en el sitio Hincll de invención pIJ2925 pSM768 Fragmento de 0.7 kb de AND Hindlϊl-Xbal Esta del vector pSM721 clonado en el sitio BamΗl- invención
Xbal de pCNB5006. PMl -768 Fragmento de ADN Bglll-Pstl de 1.0 kb del Esta vector pSM768 clonado en el sitio BamHL-Pstl invención del fago PMl. pEL-1/702 Fragmento de ADN Salí de 0.8 kb interno al Esta gen rimE clonado en el sitio BamΗl del vector invención pEL-1 PMl -702B Fragmento de ADN Ecoül-Xbal de 1.1 -kb del Esta vector pEL-1/702 clonado en el sitio Ec/136II invención del fago PMl. a Yanisch-Perron et al, 1985, Gene 33:103-119 b Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetic, Norwich c Pérez-Zúñiga etal., 2004, J Antibiot. 57:197-204 d Seco et al., 2004, Chem.Biol 11:357-366 e Laron etal. 1986, Plasmad 15.199209 f Malpartida et al., 1986, Mol.Gen.Gen. 205:66-77 Procedimientos genéticos
La cepa E. coli JMlOl se creció y transformó usando protocolos descritos previamente (Maniatis et. al., 1982, Molecular Cloning, CoId Spring Harbor, N. Y). Las cepas de Streptomyces se manipularon tal como se ha descrito previamente (Kieser T. et al., 2000, citado supra). La conjugación intraespecífica se llevó a cabo como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Las manipulaciones de ADN se llevaron a cabo como ha sido descrito previamente por Maniatis et al , 1982 (citado supra). Ensayos para la producción de tetraenos
La producción de tetraenos se analizó tal como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Los análisis por HPLC se llevaron a cabo en las mismas condiciones descritas previamente (Pérez-Zúñiga F.J., et al., 2004, citado supra). Ensayos de HPLC-MS
Los espectros de masas se determinaron en un equipo 1100MSD HPLC conectado a un detector cuadrupolo Agilent Technology, usando electrospray como fuente y un modo de ionización positiva. Las condiciones cromatográficas fueron las mismas que las descritas previamente (Pérez-Zúñiga F.J., et al., 2004, citado supra). Análisis de RMN
Los espectros de RMN fueron medidos en un espectrómetro Varían Inova 600 (5999.740 MHz). Los espectros de masa ESI fueron grabados en un equipo Finnigan LCQ con bomba cuaternaria Rheos 4000 (Flux Instrument). Los espectros de masas HR ESI fueron medidos en un espectrómetro Bruker FTICR 4.7 T. Purificación de los polienos metilados
Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B se cultivó en medio SYM2 sólido (Pérez-Zúñiga F. J., et al, 2004, citado supra) suplementado con tiostreptona (50μg/ml) y eritromicina (25 μg/ml) para la correcta selección de la inserción del fago PMl -768 en el cromosoma y la presencia de plásmido pSM743B, respectivamente. Después de 6 días, el medio sólido completo donde se cultivaron los microorganismos, fue fragmentado y procesado tal y como se describió previamente en el Ejemplo 1. CE- 108C (HIb) y rimocidina C (Illa) fueron purificados por HPLC usando una columna semipreparativa (Supelcosil PLC-8, 250 x 21.2 mm); el gradiente aplicado fue similar al descrito previamente para fraccionamiento analítico (citado supra) y controlado por un controlador de gradiente automático (Waters Automated Gradient). Las fracciones que llevaban los polienos puros se juntaron, se sometieron a una etapa de desalinización usando cartuchos Sep-Pak (Waters) y, finalmente, se liofilizaron dos veces. Este método puede ser utilizado para purificar cualquier polieno metilado a partir del cultivo del correspondiente microorganismo genéticamente modificado. Ensayos de actividad hemolítica Los ensayos se llevaron a cabo sobre sangre humana enriquecida en eritrocitos tal como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Preparación de extractos acelulares y ensayos de amidación "in yrtro "
Para la preparación de los extractos libres de células, el recombinante genético Streptomyces diastaticus var. 108/784 y Streptomyces sp. RGU5.3, productores de polienos amidados, se crecieron en 50 mililitros de medio SYM2 (Atlas et al., 1993, Microbiological Media, CRC Press, Boca Ratón, Florida) durante 3 días. El micelio se recogió por centrifugación durante 10 minutos a 5.000 g, 4°C; se lavó con una solución del 20% de glicerol y se resuspendió en 15 mi de una solución al 20% de glicerol. Alícuotas de 500 microlitros se almacenaron a -2O0C hasta su uso. Al tiempo de uso, las células se recogieron por centrifugación como se ha descrito anteriormente y se resuspendieron en un tampón de 50 mM Tris-CIH, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 5% glicerol, 50 mM ClNa, 0.5 mM PMSF y 1 mM beta-mercaptoetanol (tampón TEPM). Las células resuspendidas se sometieron a disrupción por ultrasonido; el homogenado se clarificó por centrifugación dos veces a 8,000 g durante 15 minutos y 4 0C. Los polienos contaminando el homogenado acelular se eliminaron parcialmente pasando el sobrenadante por un cartucho de Sep-Pak Cl 8 (Waters). Estas fracciones se sometieron a fraccionamiento con sulfato amónico llevándoles secuencialmente a 45 y 60% de saturación. El precipitado del 60% de saturación se disolvió a una concentración de cuatro veces respecto al original y se utilizó para las valoraciones de amidotransferasa. Los ensayos de amidotransferasa se realizaron en 200 microlitros conteniendo 100 microlitros de la solución descrita anteriormente, 4 x 106 Unidades de densidad óptica medida a 340 nm de las soluciones conteniendo los distintos polienos, 2,5 mM de glutamina, 25 mM de ClNa, 10 mM de Cl2Mg, 4 mM ATP y 125 mM tampón TES a pH 7,2. Las reacciones se incubaron a 30 0C durante 60 minutos y se pararon por adición de 1 volumen de metanol; el precipitado se eliminó por centrifugación a 4.000 g y se analizó por HPLC como se describe en Pérez-Zúñiga et al, 2004, citado supra. II. Resultados a) NUEVOS POLIENOS METILADOS a.l.- Determinación del mecanismo de biosíntesis de las amidas de polienos
Se han sugerido previamente dos posibles mecanismos alternativos de biosíntesis de rimocidina B (I-la) y CE-108B (I-lb): (a) condensación de unidades de elongación malonamil-CoA en el módulo 7 en lugar de las unidades metilmalonil-CoA propuestas para la formación de rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) y (b) una actividad de "adorno" (tal como amidotransferasa), que originaría la amida a partir del carboxilo lateral de rimocidina (lia) y/o CE- 108 (Hb). Para discernir entre uno u otro mecanismo se consideró que el papel de rimG podría ser crucial: la disrupción del gen rimG daría origen a un muíante capaz de producir las amidas correspondientes al ser portador de un plásmido implicado en la inducción de la formación de los tetraenos anudados si el mecanismo fuera el (a) o incapaz de ello en la posibilidad (b).
Por ello, se generó un muíante por disrupción en el gen rimG utilizando como vector el actinofago PMl (Malpartida et. al., 1986, citado suprd). Para evitar posibles efectos polares sobre genes situados corriente abajo del rimG (ver Figura 4), un fragmento de 0.6 kpb Sacϊl interno a rimG (coordenadas 8267-8849 de la secuencia depositada en GeneBank AY442225) se clonó a continuación del fragmento conteniendo el promotor del gen ermEv y el conjunto en el fago PMl. El actinofago recombinante PM1-768B se utilizó para infectar esporas de S. diastaticus var. 108 dando lugar a lisógenos S. diastaticus var. 1O8::PM1 -768. Estos lisógenos no produjeron ningún polieno, lo que sugirió una menor expresión del promotor ermEv respecto al promotor nativo. Intentos de interrumpir el gen rimG utilizando un promotor más fuerte como el ermEp* (Kieser et. αl. , 2000, citado suprα) no han sido satisfactorios. Dos son los genes situados por debajo del punto de inserción: rimH y rimA. Dado que rirríΑ codifica una ferredoxina cuyo papel se ha propuesto que sea el de mediar el transporte electrónico requerido por RimG (Seco et. αl., 2004, citado suprα), es razonable pensar que una apropiada expresión del gen rimA sería probablemente el parámetro crítico para restaurar la producción de polienos. Por ello, el plásmido pSM743B, capaz de complementar la disrupción de rimA e inducir la formación de los polienos anudados (citado supra), se transfirió por conjugación intraespecífica desde la cepa silvestre S. diastaticus y ΆX. 108/743B al lisógeno S. diastaticus var. 108::PMl-768, siendo S. diastaticus var. 108::PMl-768/743B el recombinante resultante. Una vez confirmados los genotipos correspondientes, los caldos de fermentación se analizaron para la producción de polienos. Dos compuestos mayoritarios fueron detectados en los caldos fermentativos; los análisis por HPLC y espectros de masas determinaron que éstas eran de 709 y 737 unidades de masa (30 unidades menos que las de CE- 108 (Hb) y rimocidina (lia) respectivamente). Los datos sugerían que se trataba de tetraenos derivados de CE-108 (Hb) y rimocidina (lia) donde el carboxilo lateral del anillo macrolactona había sido sustituido por un grupo metilo como consecuencia de la disrupción de rimG. Los compuestos se han llamado rimocidina C (Illa) y CE-108C (IHb). La ausencia de polienos amidados CE-108B (I- Ib) y rimocidina B (I- la), en estas condiciones donde su producción se encuentra inducida, claramente sugiere que la formación de derivados amidados requiere previamente la formación del grupo carboxilo lateral y que la formación del grupo amida se debe a una actividad "de adorno" en lugar de condensación de unidades malonamil-CoA en el módulo 7 de la poliquétido sintasa. Esta actividad "de adorno" es probable que sea debida a una amidotransferasa.
a.2,- Elucidación de las estructuras químicas de rimocidina C TIIIa) y CE-108C (HIb).
Con objeto de elucidar las estructuras químicas de los nuevos tetraenos rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb), ambos fueron purificados desde el caldo de fermentación de S. diastaticus var. 108::PMl-768/743B usando una columna de sílice C8 de fase reversa (ver Procedimientos Experimentales).
El compuesto rimocidina C (Illa) se obtuvo como un polvo amarillo, el cual manifestó la existencia de iones /«ez/¿fo-moleculares a m/z 738 ([M+H]) y 760 [(MH-Na+]), que corresponde a la fórmula molecular C^H63NO12 mediante alta resolución (encontrado 738,442217, calculado 738,442300 para [M+H]). Comparado con rimocidina (lia) (C^H61NO14), este compuesto se corresponde con la pérdida de dos átomos de oxígeno y la adicción de dos protones en rimocidina C (Illa), que formalmente puede ser interpretado como una sustitución del grupo carboxilo en el carbono C- 14 por un residuo metilo.
El espectro de 1H-RMN fue muy similar al de rimocidina (lia) y mostró tres señales en el rango de sp2, un doblete de doblete (dd) a δ 6.30, un multiplete a δ 6.05- 6.18, y un segundo dd a δ 5.90 (Tabla 2). Los protones del azúcar aparecieron en el rango de δ 3.25-4.62. La región alifática del espectro 1H-RMN exhibió también similitudes con la de rimocidina (lia), especialmente con respecto a cinco patrones multiplete complejos en el rango de δ 1.30-2.50. Cuatro grupos metilo en lugar de tres como en rimocidina (lia) aparecieron como dos tripletes y dos dobletes a δ 0.90, 0.95, y 1.26, 1.00, respectivamente. La mayor diferencia entre rimocidina (lia) y rimocidina C (Illa) fue la presencia del doblete metilo a δ 1.00, el cual mostró una señal H3H cross en el espectro COSY con el l4-H a δ l.22 (δc 43.8).
El espectro de resonancia magnética 13C-RMN indicó 39 señales de carbono como en rimocidina (lia), tal como exige la fórmula molecular. Ésta y las similitudes de los espectros de protones permitieron concluir que rimocidina (lia) y rimocidina C (Illa) poseen el mismo esqueleto de carbono incluyendo el azúcar micosamina, siendo la única diferencia la presencia de sólo dos grupos carbonilo en lugar de tres como en rimocidina (lia). Las señales a δ 211.6 y 174.5 fueron atribuidas a un grupo cetona y un carbonilo lactona, respectivamente. El acoplamiento HMBC 3J del protón a δ 5.03 (C-27) al carbonilo a 174.5 confirmaron la lactona, así que rimocidina C (Illa) debe ser 14- decarboxi- 14-metil-rimocidina (I- 1 a) . El polvo amarillo de CE-108C (HIb) fue fácilmente solubilizado en metanol. En este caso también, el espectro de 1H-RMN exhibió similitudes con los de rimocidina C (Illa) y CE- 108 (Hb). La región alifática exhibió las señales de cuatro grupos metilo así como tres dobletes a δ 1.25, 1.23, 0.99 y un triplete a 0.90, en lugar de las tres señales metilo como en CE- 108 (Hb). El espectro de masas (+)-ESI NS determinó el peso molecular de CE-108C (HIb) como miz 709, que corresponde a la fórmula molecular C37H59NO12 mediante alta resolución (encontrado 710.410905, calculado 710,411000 para [M+H]+). El espectro de resonancia magnética 13C-RMN confirmó la presencia de 37 señales de carbono como en CE-108 (Hb), tal como exige la fórmula molecular. La comparación con el espectro de resonancia magnética 13C-RMN de CE-108B (I-lb) reveló la presencia de sólo dos señales carbonilo a δ 211.3 y 174.3 atribuidas de nuevo a un grupo cetona y un carbonilo lactona. La mayor diferencia en este caso fue la ausencia de ácido carbonilo, el cual apareció a δ 179.3 en CE-108C (HIb), y la presencia de una señal metilo adicional a 13.7 perteneciente al doblete metilo a δ 0.99 en el espectro de 1H-RMN. Una comparación cuidadosa de los datos de CE- 108 (Hb) y CE-108C (HIb) indicó claramente que también en este tetraeno, el grupo carboxilo del C-14 de CE-108 (Hb) fue reemplazado por un grupo metilo, lo que identifica CE-108C (HIb) como el derivado 14-decarboxi-metil- CE- 108. a.3.- Actividades biológicas de los nuevos tetraenos
La actividad antifúngica de los nuevos tetraenos no carboxilados rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb) fue medida frente a Penicillium chrysogenum, Candida albicans, Aspergillus níger, Candida h'usei y Criptococcus neoformans comparada con la de los tetraenos nativos rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb). Las actividades antifúngicas de los dos intermediarios, rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb), medidas conforme se indicó en el Ejemplo 1, no fueron significativamente diferentes de las de los productos finales rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb).
Para medir si otras propiedades farmacológicas de los nuevos tetraenos eran diferentes, ensayos de actividad hemolítica fueron llevados a cabo y comparados con los compuestos parentales. Eritrocitos humanos fueron usados para esos ensayos. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Es de destacar que aunque las actividades antifúngicas de rimocidina (lia) y rimocidina C (Illa) fueron similares, sus toxicidades (medidas en términos de actividad hemolítica) fueron 2.5-5 veces más bajas para rimocidina C (Illa) que para rimocidina (lia). Cantidades crecientes hasta alcanzar los 600 nmoles de CE-108C (HIb) fueron usadas para los ensayos hemolíticos; la hemolisis detectada fue inferior al 20%, sugiriendo una menor toxicidad del tetraeno no carboxilado CE-108C (HIb) que para cualquiera de los restantes tetraenos. Esto sugiere una interesante mejora en las propiedades farmacológicas.
Tabla 2.- Actividad hemolítica comparativa de rimocidina (lia), rimocidina C (Illa), CE-108 (Ilb) y CE-108C (IHb). Las cantidades aplicadas para cada tetraeno se expresan en nanomoles (columna izquierda). Los valores de las correspondientes actividades hemolíticas se expresan como porcentajes respecto a hemolisis total.
nm Rimocidina Rimocidina C CE-108
(lia) (Illa) (Hb)
20 15.55
40 44.57
60 73.82
80 85.01
100 100 8.27
120 21.07
140 53.96 7.83
160 78.92 17.03
200 84.7 22.64
240 100 24.29
280 37.95
320 57.8
360 67.72
400 86.12
440 100
b) DETERMINACIÓN DEL SUSTRATO DE LA ACTIVIDAD AMIDOTRANS- FERASA b.l.- Disrupción del gen rimE Con el fin de determinar cual era el sustrato de la actividad "de adorno" o presunta amidotransferasa, se procedió a la disrupción de gen rimE, que codifica la glicosiltransferasa responsable de la incorporación del azúcar micosamina al anillo de macrolactona.
Debido a que el gen rimE se transcribe en un policistrón de aproximadamente 9 Kb que alberga además los genes rimF, rimG, HmH y rimA (Seco E.M. et al., 2004, Chem. Biol. 11 : 357-366) (Figura 4A), fue necesario prevenir un efecto polar sobre genes situados corriente abajo en el cromosoma. Para efectuar la disrupción, el promotor fuerte ermEp* (Kieser et al. 2000, citado supra) se clonó delante del fragmento de 0.8 kpb Salí interno al gen rimE (coordenadas 5629-6484 de la secuencia depositada en GeneBank AY442225) en la orientación correcta para permitir la transcripción del resto del ARN mensajero. La construcción resultante fue clonada en el fago PMl en varios pasos descritos en la Tabla 1. El fago recombinante resultante (PMl -702B) fue utilizado para infectar esporas de Streptomyces diastaticus var. 108, permitiendo el aislamiento de lisógenos S. diastaticus var. 108::PMl-702B. La integración correcta en el cromosoma se confirmó mediante la técnica de Southern blotting. Los análisis de los caldos de fermentación por HPLC y análisis de espectrometría de masas, determinaron la presencia de cuatro compuestos mayoritarios (ver Figura 5) que se corresponden con las agliconas de CE- 108 y rimocidina, así como con las agliconas de rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb). Cuando a este lisógeno se le introdujo por conjugación el plásmido pSM743B, capaz de inducir en el silvestre S. diastaticus var. 108 la formación de las amidas rimocidina B (I-la) y CE-108B (I-lb), no se observó formación alguna de agliconas anudadas. Los datos se interpretan como que el sustrato de la posible actividad amidotransferasa sería realmente rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) pero no sus agliconas.
b.2,- Ensayo de amidación "in vitro" de rimocidina (lia) y CE-108 (Ilb)
Por todos los datos expuestos anteriormente, la conversión de rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) a sus amidas correspondientes parece ser realizada por una actividad "de adorno" amidotransferasa que utiliza como sustratos ambos tetraenos rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb) totalmente formados. Para determinar la presencia de tal actividad, se realizaron ensayos de actividad amidotransferasa, utilizando como sustratos CE- 108 (Hb) y rimocidina (lia) purificados por HPLC. Para realizar los ensayos, la cepa S. diastaticus var. 108/784 citada en el Ejemplo 1, se creció en medio líquido SYM2 durante 3 dias, tal como se indica en Procedimientos Experimentales para la obtención de extractos acelulares. Inicialmente se probaron diferentes parámetros: sustratos, co-factores enzimáticos, donadores del grupo amida, pH óptimo de la reacción. Los productos de las reacciones se analizaron por HPLC y se optimizó la valoración utilizando para los ensayos enzimáticos el sedimento de varios fraccionamientos con sulfato amónico, realizados según las condiciones de uso estandarizado en los trabajos bioquímicos del campo. Finalmente las condiciones encontradas más óptimas para la valoración de la actividad amidotransferasa se indican en la sección de Procedimientos Experimentales. Se observó una clara conversión tanto de CE- 108 (Hb) como de rimocidina (lia) en sus correspondientes amidas rimocidina B (I- la) y CE-108B (I-lb), respectivamente (ver Figura 6A y 6B). La identidad de los compuestos observados se determinó por análisis de espectrometría de masas. Los datos permiten determinar que la actividad "de adorno" es realmente una actividad amidotransferasa dependiente de ATP y que utiliza glutamina como donador del grupo amida. La actividad no sólo pudo ser detectada en los extractos de S1. diastaticus var. 108/784 [productor de rimocidina (lia), rimocidina B (I- la), CEl 08 (Hb) y CE-108B (1-Ib)] sino también en extractos de Streptomyces sp. RGU5.3 [productor de pimaricina (IVa) y AB-400 (IVb)], cuya actividad amidotransferasa resultó ser similar a la de S. diastaticus var. 108/784.
Para determinar la especificidad de sustrato en la reacción amidotransferasa, los extractos acelulares de S. diastaticus var. 108/784 se ensayaron también frente a sustratos heterólogos como anfotericina B y pimaricina (IVa) aunque los resultados sólo fueron satisfactorios utilizando pimaricina (IVa) como sustrato. Como se muestra en la Figura 6C, los extractos acelulares de S. diastaticus var.108/784 fueron capaces de convertir pimaricina (IVa) a su correspondiente amida AB-400 (IVb). Sin embargo, no se pudo detectar actividad amidotransferasa de extractos acelulares de Streptomyces sp. RGU5.3 utilizando como sustratos rimocidina (lia), CE- 108 (Hb) ó anfotericina B, siendo únicamente capaz de anudar pimaricina (IVa) (Figura 7). Los datos permiten concluir que la actividad amidotransferasa de & diastaticus var. 108/784 tiene un rango más amplio de reconocimiento de sustrato que la de Streptomyces sp. RGU5.3.
DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Un cultivo del microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108/784, correspondiente a la cepa silvestre S. diastaticus var. 108 a la que se ha introducido el plásmido pSM784, fue depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Alemania, el 14 de Marzo de 2005. Su número de acceso es DSM 17187. La cepa contiene la ruta completa para producir rimocidina (lia) y CE- 108 (Hb), siendo además capaz de producir los correspondientes amidados rimocidina B (I-la) y CE-108B (I-lb).
Un cultivo del microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-
768/743B fue depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)3 Braunschweig, Alemania, el 18 de Julio de 2005. Su número de acceso es DSM 17482. Esta cepa es productora de los polienos metilados rimocidina C (Illa) y CE-108C (HIb).
Las técnicas habitualmente utilizadas para la manipulación genética del género Streptomyces y el depósito de genes/promotores para su acceso público pueden permitir generar las construcciones que se describen en esta invención u otras funcionalmente equivalentes. Los vectores utilizados para ello son de uso público y son utilizados rutinariamente en los laboratorios en los que se trabaja habitualmente en Streptomyces.
La secuencia del ADN codificante para los genes que se hacen mención en esta invención se encuentra depositado y es públicamente accesible en las bases de datos de GeneBank bajo el número de acceso AY442225.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un compuesto macrólido poliénico caracterizado por la fórmula (I):
Figure imgf000074_0001
En donde:
Rl es alquilo C1-C3;
R2 es un grupo funcional elegido entre CH3- ó CONH2- (metilo ó amida primaria), sus isómeros, sales, profármacos o solvatos.
2.- Un compuesto según la reivindicación 1 caracterizado por la fórmula (1-1)
Figure imgf000074_0002
en donde R es NH2; y R1 es alquilo Ci-C3 sus isómeros, sales, profármacos o solvatos.
3.- Compuesto según la reivindicación 2 caracterizado porque se selecciona entre los compuestos amidados pertenecientes a la fórmula I identificados como rimocidina B (I- la) y CE-108B (I-lb):
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000075_0002
4.- Un compuesto según la reivindicación 1 caracterizado por la fórmula (III):
Figure imgf000076_0001
donde:
R1 es alquilo C1-C3, sus isómeros, sales, profármacos o solvatos.
5.- Compuesto según la reivindicación 4 caracterizado porque se selecciona entre los compuestos pertenecientes a la fórmula III identificados como rimocidina C (Illa) y CE- 108C (HIb):
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000077_0001
6.- Composición biocida caracterizada porque comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, junto con un vehículo inerte.
7.- Composición biocida según la reivindicación 6 caracterizada porque el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre un compuesto de fórmula (I- 1) según la reivindicación 2.
8.- Composición biocida según la reivindicación 7 caracterizada porque el compuesto de fórmula (1-1) se selecciona entre rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb) y sus mezclas.
9.- Composición biocida según la reivindicación 6 caracterizada porque el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre un compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 4.
10.- Composición biocida según la reivindicación 9 caracterizada porque el compuesto de fórmula (III) se selecciona entre rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas.
11.- Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
12.- Composición farmacéutica según la reivindicación 11 caracterizada porque el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre un compuesto de fórmula (I- 1) según la reivindicación 2.
13.- Composición farmacéutica según la reivindicación 12 caracterizada porque el compuesto de fórmula (I- 1) se selecciona entre rimocidina B (I- la), CE-108B (I- Ib) y sus mezclas.
14.- Composición farmacéutica según la reivindicación 115 en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre un compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 2.
15.- Composición farmacéutica según la reivindicación 12 caracterizada porque el compuesto de fórmula (III) se selecciona entre rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas.
16.- Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a la 15, que comprende, además, uno o más agentes terapéuticos.
17.- Empleo de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la infección causada por organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol ó que sin contenerlo sean sensibles a macrólidos polienos.
18.- Empleo según la reivindicación 17 caracterizado porque el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre un compuesto de fórmula (I- 1) según la reivindicación 2.
19.- Empleo según la reivindicación 18 caracterizado porque el compuesto de fórmula (I- 1) se selecciona entre rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb) y sus mezclas.
20.- Empleo según la reivindicación 17 caracterizado porque el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre un compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 4.
21.- Empleo según la reivindicación 20 caracterizado porque el compuesto de fórmula (III) se selecciona entre rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas.
22.- Composición antifúngica caracterizada porque comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes.
23.- Composición antifungica según la reivindicación 22 caracterizada porque el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre un compuesto de fórmula (I- 1) según la reivindicación 2.
24.- Composición farmacéutica según la reivindicación 23 caracterizada porque el compuesto de fórmula (1-1) se selecciona entre rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb) y sus mezclas.
25.- Composición antifungica según la reivindicación 22 caracterizada porque el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre un compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 4.
26.- Composición farmacéutica según la reivindicación 25 caracterizada porque el compuesto de fórmula (III) se selecciona entre rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas.
27.- Composición según cualquiera de las reivindicaciones 22 a la 26, que comprende, además, uno o más agentes antifúngicos.
28.- Un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en una planta que comprende aplicar a dicha planta, o al medio que la rodea, una composición antifungica según cualquiera de las reivindicaciones 22 a la 27.
29.- Un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en un fruto que comprende aplicar a dicho fruto una composición antifungica según cualquiera de las reivindicaciones 22 a la 27.
30.- Un método para controlar la infección causada por un hongo capaz de desarrollarse en un preparado alimentario que comprende aplicar a dicho preparado alimentario una composición antifungica según cualquiera de las reivindicaciones 22 a la 27.
31.- Un procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (I- 1) según la reivindicación 2 caracterizado porque comprende cultivar un microorganismo seleccionado entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B y combinaciones de los mismos, bajo condiciones que permitan la producción de dicho compuesto de fórmula (I- 1), y, si se desea, aislar y purificar dicho compuesto.
32.- Procedimiento según la reivindicación 31 caracterizado porque el compuesto de fórmula (1-1) a producir se selecciona entre rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb) y sus mezclas.
33.- Procedimiento según las reivindicaciones 31 y 32 caracterizado porque conjuntamente con el macrólido polieno de fórmula (1-1), de forma preferente rimocidina B (I-la), CE-108B (I-lb) o sus mezclas, se produce simultáneamente el polieno de partida rimocidina (lia), CE- 108 (Hb) o sus mezclas.
34.- Procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 4 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- cultivo del microorganismo Streptomyces diastaticus var. 1O8::PM1- 768B/743B bajo condiciones que permitan la producción de compuestos de fórmula (III),
- obtención del caldo de fermentación y, si se desea,
- el aislamiento y purificación de dichos compuestos de fórmula (III).
35.- Procedimiento según la reivindicación 34 caracterizado porque el compuesto de fórmula (III) pertenece al siguiente grupo: rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb) y sus mezclas.
36.- Microorganismo recombinante necesario para llevar a cabo el procedimiento según las reivindicaciones 31 a la 33 caracterizado porque se selecciona entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784 (DSM 17187) y Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B.
37.- Microorganismo necesario para llevar a cabo el procedimiento según las reivindicaciones 34 y 35 caracterizado porque produce el compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 4 y porque tiene de forma exclusiva afectada la expresión del gen rimG o un gen homólogo.
38.- Microorganismo según la reivindicación 37 caracterizado porque es el microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B (número de depósito: DSM 17482) y es productor de los polienos metilados de fórmula general (III) rimocidina C, CE-108C y sus mezclas.
39.- Microorganismo según la reivindicación 38 caracterizado porque son microorganismos equivalentes funcionales del microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-768/743B (número de depósito: DSM 17482).
40.- Un cultivo de un microorganismo caracterizado porque se selecciona entre Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl-500/743B, Streptomyces diastaticus var. 108:::PMl-768B/743B y combinaciones de los mismos.
41.- Empleo de un microorganismo según las reivindicaciones 36 a la 39, o de un cultivo de un microorganismo según la reivindicación 40, para la obtención de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1.
42.- Empleo de un microorganismo según la reivindicación 41 caracterizado porque el compuesto de fórmula (1-1) y (III) se selecciona entre rimocidina B (I-la) o CE-108B (I- Ib), entre rimocidina C (Illa) o CE-108C (IHb), respectivamente, o entre mezclas de dichos compuestos.
43. El caldo de fermentación de un microorganismo según las reivindicaciones 36 a la 39 caracterizado porque comprende un compuesto de fórmula (I).
44. Caldo de fermentación según la reivindicación 43 caracterizado porque el microorganismo pertenece al siguiente grupo: Streptomyces diastaticus var. 108/743B, Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108::PMl- 500/743B5 y combinaciones de los mismos, y porque comprende un compuesto de fórmula (I- 1) según la reivindicación 2 perteneciente al siguiente grupo: rimocidina B (I- Ia), CE-108B (Mb), y sus mezclas.
45.- Caldo de fermentación según la reivindicación 43 caracterizado porque el microorganismo es el Streptomyces diastaticus var. 108:::PMl-768B/743B y porque comprende un compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 4 perteneciente al siguiente grupo: rimocidina C (Illa), CE-108C (HIb), y sus mezclas.
46.- Un procedimiento para la obtención de un microorganismo recombinante productor de macrólidos polienos que contienen un grupo amida según la reivindicación 36 caracterizado porque comprende introducir un vector de expresión en microorganismos productores de macrólidos polienos que contienen grupos carboxilo libres, o bien introducir una combinación de vectores que contienen, por una parte, (i) un vector que comprende un cluster biosintético de un polieno o un fragmento del mismo, y, por otra parte,
(ii) un vector derivado de SCP2* que comprende el gen ermE, o bien un vector que comprende un origen de replicación diferente al de SCP2*, el gen ermE y un fragmento del vector SCP2*, en microorganismos productores de macrólidos polienos que tienen grupos carboxilicos libres.
47.- Procedimiento de obtención de un microorganismo según las reivindicaciones 37 a la 39 caracterizado porque en la cepa resultante está exclusivamente afectada en la expresión del gen rimG y porque comprende las siguientes etapas: a) Obtención de un muíante en el gen rimG del microorganismo S. diastaticus var. 108 o de sus equivalentes funcionales mediante la disrupción o deleción de dicho gen, incapaz de producir polienos, y b) su posterior transformación con un vector, preferentemente un plásmido, capaz de complementar la disrupción del gen rimA en el cromosoma en dicho muíante.
48.- Procedimiento de obtención de un microorganismo según la reivindicación 46 caracíerizado porque la cepa resulíante es la cepa S. diastaticus var. 108::PMl-768/743B.
49.- Procedimiento de obtención de un microorganismo según la reivindicación 37 caracterizado porque en la cepa resultante está exclusivamente afectada la expresión de un gen homólogo al gen rimG y porque comprende las siguientes etapas: a) Obtención de un muíante en el gen homólogo del microorganismo original mediante la disrupción o deleción de dicho gen, incapaz de producir polienos, y b) su posterior transformación con un vector, preferentemente un plásmido, capaz de complementar la disrupción del dicho gen en el cromosoma en dicho muíante.
50.- Procedimiento de obíención de un microorganismo según la reivindicación 49 caracíerizado porque el gen homólogo del gen rimG es un gen con actividad ciiocromo P450 monooxigenasa períenecieníe al siguieníe genes pimG, amphN, nysN, canC).
51.- Procedimiento de obtención de un microorganismo según la reivindicación 46 y 50 caracíerizado porque el microorganismo original es un Aciinomiceío.
52.- Procedimiento de obíención de un microorganismo según la reivindicación 51 caracíerizado porque el Aciinomiceío es Streptomyces sp.
53.- Procedimiento de obíención de un microorganismo según la reivindicación 52 caracíerizado porque el Streptomyces sp. pertenece al siguieníe grupo: Streptomyces noursei, Streptomyces albidus, Strepotmyces rimosus, Streptomyces diastaticus var. 108, Streptomyces nodosus, Streptomyces natalensis, Streptomyces chattanoogensis y Streptomyces griseus.
54.- Un microorganismo recombinaníe obtenible según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 46 a 53.
55.- Un vector de expresión según la reivindicación 46 caracíerizado porque se selecciona eníre: a) un vector derivado del vector SCP2*, o un fragmento del mismo, que comprende el origen de replicación del SCP2* y el gen de resistencia a eritromicina
(ermE); b) un vector que comprende (i) el origen de replicación del vector SCP2*, (ii) el gen ermE, y (iii) un fragmento del vector SCP2*; c) un vector que comprende (i) un origen de replicación, (ii) el gen ermE, y (iii) un fragmento del vector SCP2*, en donde dicho origen de replicación es diferente al origen de replicación del vector SCP2*; d) un vector que carece de origen de replicación y comprende el gen ermE y un fragmento del vector SCP2*; e) un vector derivado del vector SCP2* que comprende (i) un origen de replicación, (ii) el gen ermE, y (iii) la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster; í) un vector derivado del vector SCP2* que comprende (i) un origen de replicación, igual o diferente al origen de replicación del vector SCP2*, (ii) el gen ermE, (iii) un fragmento del vector SCP2* y (iv) la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster; g) un vector que carece de origen de replicación y comprende el gen ermE y la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster; y h) un vector que carece de origen de replicación y comprende (i) el gen ermE, (ii) un fragmento del vector SCP2* y (iii) la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster.
56.- Vector de expresión según la reivindicación 55 caracterizado porque es derivado de un vector SCP2* y portador del gen de resistencia a eritromicina (ermE).
57. -Vector de expresión según la reivindicación 56 caracterizado porque es el plásmido pSM784.
58. -Vector de expresión según la reivindicación 55 caracterizado porque comprende el origen de replicación de SCP2*, el gen de resistencia a eritromicina (ermE) y un fragmento del vector SCP2*.
59. -Vector de expresión según la reivindicación 54 caracterizado porque comprende un origen de replicación distinto al origen de replicación de SCP2*, el gen de resistencia a eritromicina (ermE) y un fragmento del vector SCP2*.
60.-Vctor de expresión según la reivindicación 55 caracterizado porque es derivado de SCP2* que comprende el gen ermE y la totalidad del cluster biosintético de un polieno o un fragmento de dicho cluster, bajo el control de un promotor.
61.- Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 57 a la 59 caracterizado porque comprende, además, la totalidad del cluster rim o un fragmento de dicho cluster.
62.- Vector de expresión según la reivindicación 61 caracterizado porque es el plásmido pSM743B.
63.- Procedimiento enzimático para obtener un polieno amidado a partir de polienos con grupos carboxílicos libres en el anillo de macrolactona caracterizado porque se utilizan extractos acelulares de cepas productoras de polienos anudados y porque comprende las siguientes etapas: a) puesta a punto de una mezcla con un sustrato consistente en un polieno con grupos carboxílicos libres o mezclas de varios de ellos, purificados o no, y un extracto proteico proveniente de una cepa o cepas productoras de polienos anudados, b) reacción de la mezcla de a) en presencia de ATP/Mg4^ y glutamina u otros donadores de grupos amida, y c) purificación de los polienos anudados.
64.- Procedimiento enzimático según la reivindicación 63 caracterizado porque el polieno amidado a obtener es CE-108B (I-lb), rimocidina B (I-la) o sus mezclas, el polieno sustrato de a) es CE- 108 (Hb), rimocidina (lia) o sus mezclas, purificado o no, y en el que el extracto de a) se obtiene de las siguientes cepas: S. diastaticus var. 108/784 y S. diastaticus var. 108/743B .
65.- Procedimiento enzimático según la reivindicación 63 caracterizado porque el polieno amidado a obtener es AB-400 (IVb), el polieno sustrato de a) es pimaricina (IVa), purificado o no, y en el que el extracto de a) se obtiene de las siguientes cepas: & diastaticus var. 108/784 y S. diastaticus var. 108/743B.
66.- Procedimiento enzimático según la reivindicación 63 caracterizado porque el polieno amidado a obtener es AB-400 (IVb), el polieno sustrato de a) es pimaricina (IVa), purificada o no, y en el que el extracto de a) se obtiene de la cepa Streptomyces sp. RGU5.3.
67.- Extracto acelular necesario para la puesta en marcha del procedimiento enzimático según las reivindicaciones 63 a la 67 de productores de polienos amidados caracterizado porque porta una actividad amidotransferasa, capaz de convertir "in vitro" polienos carboxilados en sus correspondientes amidas y porque provienen de cepas productoras de polienos amidados.
68.- Extracto acelular según la reivindicación 67 caracterizado porque se obtiene de los siguientes microorganismos: S. diastaticus var. 108/743B, S. diastaticus var. 108/784 (DSM 17187) y/o Streptomyces sp. RGU5.3.
69. Compuestos polienos metilados caracterizados porque pertenecen al siguiente grupo: anfoterina B metilada, nistatina metilada, pimaricina metilada y candicidina metilada.
70.- Empleo de los polienos metilados según la reivindicación 69 para la elaboración de composiciones biocidas y farmacológicas.
71.- Un procedimiento para producir un macrólido polieno caracterizado porque comprende cultivar un microorganismo recombinante según la reivindicación 54, bajo condiciones que permitan la producción de dicho compuesto, y, si se desea, aislar y purificar dicho compuesto.
72. Procedimiento según la reivindicación 71 caracterizado porque el macrólido polieno se selecciona entre un macrólido polieno que contiene un grupo carboxilo libre, un macrólido polieno que contiene un grupo amida y sus mezclas.
73.- Procedimiento según la reivindicación 72 caracterizado porque el macrólido polieno que contiene un grupo carboxilo libre se selecciona entre anfotericina B, nistatina, rimocidina, pimaricina, candicidina y sus mezclas.
74.- Procedimiento según la reivindicación 72 caracterizado porque el macrólido polieno que contiene un grupo amida se selecciona entre el compuesto AB-400 (IVb) y un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1.
75.- Procedim iento según la reivindicación 74 caracterizado porque el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina B (I- la), CE-108B (I- Ib) y sus mezclas.
76.- Procedimiento según la reivindicación 72 caracterizado porque el macrólido polieno se selecciona entre pimaricina (IVa), AB-400 (IVb), rimocidina (lia), rimocidina B (I- Ia), CE-108 (Hb), CE-108B (I-lb) y sus mezclas.
77.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto AB- 400 (IVb) junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
78.- Empleo del compuesto AB-400 (IVb) en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una infección causada por organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol.
79.- Empleo según la reivindicación 78 caracterizado porque los organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol se seleccionan entre parásitos y hongos.
80.- Empleo del medicamento según las reivindicaciones 78 y 79 para el tratamiento de una infección sistémica causada por organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol.
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