ES2371615A1 - Macrólidos polienos con actividad antimicrobiana y su procedimiento biotecnológico de obtención. - Google Patents
Macrólidos polienos con actividad antimicrobiana y su procedimiento biotecnológico de obtención. Download PDFInfo
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Abstract
Macrolidos polienos con actividad antimicrobiana y su procedimiento biotecnológico de obtención.La presente invención se engloba en el campo de la biología molecular y la biotecnología y se refiere a genes que codifican para la actividad amidotransferasa, implicados en la biosíntesis de macrolidos polienos, a una célula hospedadora que comprende estos genes y a un procedimiento de obtención de macrolidos polienos mediante dicha célula hospedadora. También se refiere a macrolidos polienos con actividad antibiótica obtenidos mediante este proceso biotecnológico.
Description
Macrólidos polienos con actividad antimicrobiana
y su procedimiento biotecnológico de obtención.
En las últimas décadas se han producido
progresos importantes en el área de la sanidad humana, se han
desarrollado tratamientos satisfactorios para graves enfermedades,
bien mediante técnicas quirúrgicas, con la aplicación de nuevos
agentes químicos ó con ambos procedimientos simultáneamente.
Particularmente dos áreas se han visto favorablemente influenciadas:
tratamientos oncológicos y trasplantes de órganos. Paralelo al
progreso conseguido en estos campos, se ha producido un notable
incremento en ciertas enfermedades infecciosas, tales como micosis
severas, ocasionadas por microorganismos "oportunistas", que
han encontrado un nuevo nicho en pacientes oncológicos o
trasplantados sometidos a quimioterapias agresivas. El incremento de
estas infecciones fúngicas constituyen una de las mayores amenazas
para el éxito de las terapias aplicadas en las poblaciones de
riesgo. A diferencia de los antibacterianos, el arsenal de
compuestos antifúngicos disponibles es escaso. Tradicionalmente los
compuestos macrolidos polienos vienen siendo utilizados, con
eficacia probada, desde hace 50 años; en los últimos años los
derivados de azoles se han sumado al arsenal de compuestos
antifúngicos. A diferencia de los macrolidos polienos, los azoles
adolecen de un problema importante: incremento en la aparición de
microorganismos resistentes que, en algunos casos los hacen
inoperante como drogas antifúngicas. Esta situación contrasta
fuertemente con el uso de macrolidos polienos, particularmente
Anfotericina B, para la que la aparición de formas resistentes
parece ser un evento muy raro. A pesar de la excelente eficacia de
Anfotericina B como agente fungicida, su uso clínico se ve
fuertemente comprometido debido, fundamentalmente, a una
considerable nefrotoxicidad y su muy baja solubilidad en agua. Por
ello se han realizado por parte de diferentes laboratorios numerosos
esfuerzos en la búsqueda de antifúngicos alternativos.
Varias han sido las aproximaciones para la
obtención de polienos alternativos con menor toxicidad. Numerosos
análogos se han obtenido tanto por vía semisintética como por
ingeniería genética de rutas biosintéticas conocidas. Muchos
derivados de Anfotericina B se han obtenido por síntesis orgánica,
centrándose en la modificación del grupo carboxílico exocíclico ó en
el grupo amino de la molécula del azúcar micosamina. Pese a que los
cambios introducidos han servido para conocer las relaciones
estructura-función y aspectos importantes para
incrementar significativamente la toxicidad selectiva hacia los
microorganismos diana, ningún derivado nuevo de Anfotericina B ha
salido al mercado. No obstante, el conocimiento adquirido con las
nuevas estructuras obtenidas, sugieren que el cambio de carga en el
grupo carboxilo tiene un efecto importante sobre la actividad
hemolítica. Todo ello permitió establecer que el diseño de nuevos
derivados podría orientarse a la modificación bien en el grupo
carboxílico como en el amino del azúcar; de esta forma derivados
catiónicos de Anfotericina B serían compuestos potencialmente más
activos que los parentales. En ausencia de nuevos derivados
catiónicos, las nuevas formulaciones de Anfotericina B, asociadas a
liposomas han permitido lanzar al mercado preparaciones para su
aplicación como antifúngico con una sustancial reducción en sus
niveles de toxicidad. Pese a esa reducción en los niveles de
toxicidad, la toxicidad remanente es aún muy alta y su uso queda
reducido a situaciones extremas donde otros tratamientos son
infructuosos. Todo ello permite establecer que la obtención de
nuevos compuestos macrolidos polienos para sanidad humana supone un
campo prometedor para incrementar la disponibilidad de nuevas drogas
aprovechando las ventajas ofrecidas por los macrolidos
polienos.
polienos.
La presente invención se basa en el aislamiento
y caracterización de genes que han sido capaces de modificar tanto
in vivo como in vitro compuestos antifúngicos del
grupo de los polienos carboxilados para generar nuevos macrolidos
polienos amidados. Las secuencias nucleotídicas de estos genes
codifican para una actividad amidotransferasa, dependiente de ATP
capaz de amidar polienos carboxilados convencionales para obtener
los correspondientes derivados amidados con ciertas propiedades
biológicas optimizadas respecto a los parentales. La utilización de
los genes permite obtener recombinantes genéticos que incrementan la
capacidad para la producción de los polienos amidados y facilitar el
proceso de producción y purificación de los polienos amidados de
interés; los recombinantes genéticos que se obtengan pueden ser
usados industrialmente para la producción, con alta eficiencia, de
macrolidos polienos
amidados.
amidados.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un polinucleótido aislado, de ahora en adelante
polinucleótido de la invención, capaz de traducirse a la secuencia
aminoacídica que se selecciona de la lista que comprende:
- a)
- la SEQ ID NO: 1,
- b)
- la SEQ ID NO: 2,
o a una variante o a un fragmento biológicamente
activo de dichas secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 1 y SEQ
ID NO: 2 presentan una identidad de aproximadamente un 87%, estando
estructuralmente relacionadas, y tienen una actividad biológica
común, la conversión del grupo carboxilo de ciertos polienos en sus
amidas derivadas (actuando como polienos carboxamida sintasas).
La secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 3 engloba
la secuencia parcial del gen pgm (nucleótidos 1 a 524), la secuencia
del gen pcsA (nucleótidos 759 a 2606), del gen phoU (nucleótidos
3561 a 4238), del gen phoR (nucleótidos 4472 a 5746), y la secuencia
parcial del gen phoP (nucleótidos 5800 a 6079), de Streptomyces
diastaticus var. 108.
La secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 4 engloba
la secuencia parcial del ORF1 (nucleótidos 1 a 323), la secuencia
del gen pgm (nucleótidos 572 a 1333), la secuencia del gen pcsB
(nucleótidos 1587 a 3434), del ORF2 (nucleótidos 3599 a 3922), del
ORF3 (nucleótidos 3919 a 4620), del gen phoU (nucleótidos 5278 a
5958), y la secuencia parcial del gen phoR (nucleótidos 6155 a
7391), de Streptomyces sp. cepa RGU5.3.
El término "aislado", tal y como se utiliza
en esta memoria, hace referencia a nucleótidos o péptidos que: 1) se
encuentran sustancialmente libres de componentes que normalmente
acompañan o interaccionan con él en la naturaleza, o 2) si se
encuentran en su medio natural, han sido sintéticamente (no
naturalmente) alterados por la intervención humana y/o introducidos
en una célula que no los posee de forma nativa. Por ejemplo, un
nucleótido natural se convierte en "aislado" si se ha alterado,
o si proviene de un ADN que ha sido alterado por medio de la
intervención humana (por medio de, por ejemplo pero sin limitarnos,
mutagénesis dirigida, inserciones, deleciones, etc). De la misma
manera, un nucleótido natural se convierte en "aislado" si se
introduce por medios no naturales en un genoma no nativo a dicho
nucleótido (transfección). Por tanto, el término "aislado" en
este último caso, es equivalente al término
"heterólogo".
"heterólogo".
El término "identidad", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de
nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias
nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de
comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica,
e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG,
incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12:
287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison,
(WI); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol.
Biol. 215: 403-410 (1999).
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "variante" se refiere a una secuencia aminoacídica
sustancialmente homologa a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1
o SEQ ID NO: 2. En general, una variante incluye adiciones,
deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término
"variante" incluye también a las proteínas resultantes de
modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin
limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación.
El término "homología", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos
estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, o a una
función común, y más concretamente, a la semejanza entre dos o más
secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Puesto que dos secuencias
se consideran homologas si tienen el mismo origen evolutivo o si
tienen función y estructura similares, en general, se asume que
valores superiores de similitud o identidad del 30% indicarían
homología. Tal como aquí se utiliza, una proteína es
"sustancialmente homologa" a cualquiera de las secuencias SEQ
ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, cuando su secuencia de aminoácidos presenta
un buen alineamiento con dichas secuencias, respectivamente; es
decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de
identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y/o
SEQ ID NO: 2, respectivamente de, al menos, un 50%, típicamente de,
al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%,
preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al
menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%. Las
secuencias homologas a cualquiera de secuencias SEQ ID NO: 1 o SEQ
ID NO: 2 pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la
materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático
apropiado para comparar
secuencias.
secuencias.
Un experto en la materia conoce que:
- a)
- debido a la degeneración del código genético, varias secuencias nucleotídicas podrían dar lugar a una misma secuencia aminoacídica con la actividad biológica de interés,
- b)
- variantes que comprenden sustituciones, adiciones o deleciones individuales de un ácido nucléico, péptido, polipéptido o proteína puede alterar, adicionar o delecionar un solo aminoácido o un grupo de aminoácidos, conservando la actividad biológica de dicho péptido, o una actividad similar (al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% del péptido original), especialmente cuando se sustituye uno o varios aminoácidos por otros químicamente similares. Estas variantes serían funcionalmente equivalentes a las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "funcionalmente equivalente",
tal como aquí se utiliza, significa que los péptidos o el/los
fragmento/s de lo/s péptido/s en cuestión mantiene/n esencialmente
las propiedades biológicas descritas en este documento. Dicha
capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales
como los descritos en los ejemplos que acompañan a esta
descripción.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una construcción genética de ADN o ARN, de ahora en
adelante construcción genética de la invención, que comprende uno de
los siguientes tipos de secuencias:
- a.
- secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido según descrito anteriormente, para su transcripción in vitro o in vivo, o
- b.
- secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende el polinucleótido de la invención, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y opcionalmente con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos "polinucleótido" y "ácido
nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a
formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto
ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó
DNA).
Un "vector" es un replicón, o un vector
integrativo, al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para
realizar la replicación y/o expresión del segmento unido.
Un "replicón" es cualquier elemento
genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación
polinucleotídica dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse
bajo su propio control.
Un vector integrativo es cualquier elemento
genético que se integra y se mantiene estable en el genoma de una
célula.
Como se usa aquí, el término "promotor"
hace referencia a una región del ADN aguas arriba del punto de
inicio de la transcripción, y en el particular, que es capaz de
iniciar la transcripción en una célula, sea el origen del promotor
un microorganismo o no. Ejemplos de promotores incluyen, pero no se
limitan a promotores de Streptomyces conocidos en el estado
de la técnica, como ermE*p o tipA. Por tanto, en una
realización preferida de este aspecto de la invención, el promotor
es ermE*p (Kieser et al., 2000, Practical
Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich
UK). En otra realización preferida de este aspecto de la invención,
el promotor es tipA (Kieser et al., 2000, Practical
Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich
UK). En otra realización aún más preferida, la construcción genética
es el plásmido pHJL401 (Larson & Hershberger 1986,
Plasmid 15:199-209). En otra realización aún
más preferida, la construcción genética es el plásmido plJ941
(Lydiate et al, 1985, Gene
35:223-235).
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una célula hospedadora, de ahora en adelante célula
hospedadora de la invención, que comprende el polinucleótido de la
invención, o la construcción genética de la invención, según se han
descrito anteriormente.
Un "hospedador", "célula hospedadora"
ó "célula hospedante" como se emplea en esta memoria se refiere
a un organismo, célula o tejido, particularmente a una célula
bacteriana, que sirve como diana o recipiente de los elementos
transfectados (por ejemplo, los polinucleótidos o las construcciones
genéticas de la invención). Una célula hospedadora u hospedador
puede indicar, también, una célula u hospedador que expresa una
proteína recombinante de interés (por ejemplo, el producto de la
expresión del polinucleótido de la invención) donde la célula
hospedadora se transforma con un vector de expresión conteniendo el
polinucleótido de la invención, o también, los promotores de la
invención que dirigen la expresión de un gen de interés.
En una realización preferida, la célula
hospedadora es una bacteria, más preferiblemente una bacteria
perteneciente al género Streptomyces y aún más
preferiblemente a la especie Streptomyces diastaticus var.
108.
Los organismos del género Streptomyces
pertenecen al superreino Bacteria, phylum Actinobacteria,
clase
Actinobacteria, orden Actinomycetales y familia Streptomycetaceae.
Actinobacteria, orden Actinomycetales y familia Streptomycetaceae.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método de obtención de macrolidos polienos que
comprende cultivar la célula hospedadora de la invención en un medio
adecuado. Medios de cultivo adecuados son conocidos en el estado de
la técnica, y dependerán de la célula hospedadora.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al uso de la célula hospedadora según descrita anteriormente
para la obtención de macrolidos polienos.
En la presente invención se entiende como
"macrólido polieno" un compuesto formado por un anillo
lactónico macrocíclico con un número de carbonos de entre 10 a 30,
más preferiblemente entre 20 y 30, y que contiene varios enlaces
dobles, al que se unen una o varios desoxiazúcares tales como, pero
sin limitarse a, micosamina.
\newpage
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un compuesto de fórmula (I)
donde
R_{1} se selecciona entre -COOH ó
-CONH_{2}.
R_{2} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{4}.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "alquilo" se refiere, en la
presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas,
que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, i-propilo, n-butilo,
terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo,
n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo
tiene entre 1 y 4 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden estar
opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como
halógeno, hidroxilo, azida, ácido carboxílico o un grupo sustituido
o no sustituido seleccionado de entre amino, amido, éster
carboxílico, éter, tiol, acilamino o carboxamido. Cuando el grupo
alquilo está sustituido, lo está preferentemente por un o varios
grupos amina, amida o éter, que a su vez pueden estar o no
sustituidos por grupos alquilo, amida, cicloalquilo o éteres y estos
a su vez, pueden estar igualmente sustituidos o no.
En una realización preferida, en el compuesto de
fórmula (I) R_{1} es -CONH_{2}. En otra realización preferida de
este aspecto de la invención, el compuesto de fórmula (I) se
encuentra en forma de sal, profármaco, derivado o análogo, o
cualquiera de sus combinaciones.
Tal como aquí se utiliza, el término
"derivado" incluye tanto a compuestos farmacéuticamente
aceptables, es decir, derivados del compuesto de fórmula (I) que
pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como
derivados farmacéuticamente no aceptables, ya que éstos pueden ser
útiles en la preparación de derivados farmacéuticamente
aceptables.
Asimismo, dentro del alcance de esta invención
se encuentran los profármacos de los compuestos de fórmula (I). El
término "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye a
cualquier compuesto derivado de un compuesto de fórmula (I), por
ejemplo, ésteres, incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres
de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales
metálicas, etc., carbamatos, amidas, etc., que, cuando se administra
a un individuo es capaz de proporcionar, directa o indirectamente,
dicho compuesto de fórmula (I) en dicho individuo. Ventajosamente,
dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del
compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que
potencia la liberación del compuesto de fórmula (I) en un
compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es
crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y
proporcione el compuesto de fórmula (I) en un compartimento
biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede
llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los
expertos en la materia.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de
un medicamento, o alternativamente al compuesto de fórmula (I) para
su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de una infección, o alternativamente al
compuesto de fórmula (I) para su uso en el tratamiento de una
infección. Preferiblemente, dicha infección es producida por
hongos.
El compuesto de fórmula (I) de la invención,
puede formularse para su administración a un animal, y más
preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad
de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, puede estar,
sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos,
tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o
no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales.
Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza
iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes
antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes
incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales.
Alternativamente, el compuesto de fórmula (I) de la invención puede
prepararse para su administración en forma sólida. El compuesto de
fórmula (I) de la invención puede combinarse con varios vehículos o
excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes
tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina;
excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales
como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como
estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio
coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o
agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.
El compuesto de fórmula (I) de la invención,
preparaciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un
animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una
variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a,
intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal,
intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o
dérmico.
La dosificación para obtener una cantidad
terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores (como
por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia, estado del sistema
inmune, tipo de agente infeccioso y gravedad de la infección) del
animal, preferiblemente mamífero, y más preferiblemente humano. En
el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad
terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de compuesto
de fórmula (I) de la invención, profármacos, derivados o análogos de
dicho compuesto que produzcan el efecto deseado y, en general,
vendrá determinada, entre otras causas, por las características
propias de dichos profármacos, derivados o análogos y el efecto
terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos
farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas
composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la
materia.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) como antibiótico,
preferiblemente como antifúngico.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un
compuesto de fórmula (I) junto a un vehículo farmacéutico. En otro
aspecto, la presente invención se refiere a una composición
farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula (I)
y,adicionalmente, otro principio activo.
Como se emplea aquí, el término "principio
activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente
activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente
farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que
potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto
diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o
prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función
del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos
componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del
fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada
prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
Los términos "polinucleótido" y "ácido
nucléico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a
formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto
ribonucleótidos como desoxiribonucleótidos.
Los términos "péptido",
"oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan
aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica
de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o
no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Muestra los dominios conservados en las
diferentes Asparaginas sintasas, utilizados para el diseño de los
oligonucleótidos degenerados que se citan en la parte experimental
de la presente invención.
Fig. 2. Muestra el análisis comparativo, por
cromatografía de HPLC, de producción de polienos de S.
diastaticus var. 108 y su recombinante con copias adicionales
del gen pcsA. Los cromatogramas visualiza la señal integrada
a 304 nm. Los números sobre los picos cromatográficos corresponden
a: 1, CE-108B; 2, CE-108; 3,
rimocidina B; 4, rimocidina; 5. CE-108E y 6,
CE-108D.
Fig. 3. Perfil cromatográfico en HPLC de los
caldos de fermentación de Streptomyces sp. RGU5.3 silvestre,
(A) y recombinante con copias adicionales del gen pcsB. Los
números corresponden a: 1, pimaricina; 2, AB-400; 3,
deepoxipimaricina y 4, 4,5 deepoxiAB-400. Los
cromatogramas visualiza la señal integrada a 304 nm.
Fig. 4. Alineamiento de las secuencias SEQ ID
NO. 1 y SEQ ID NO: 2 de interés.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad del método de obtención de
macrolidos polienos descrito en la presente invención.
Dado que la actividad de amidotransferasa es una
herramienta susceptible de introducir mejoras farmacológicas en
compuestos polienos, se ha abordado el aislamiento de los genes
responsable de la actividad amidotransferasa de S.
diastaticus var. 108 y de Streptomyces sp RGU5.3. La
diferencia en el reconocimiento de sustratos entre la
amidotransferasa de S. diastaticus y la de
Streptomyces sp. RGU5.3, valoradas a partir de los
correspondientes extractos acelulares, abre la posibilidad para que
una vez manipulado "in vitro" el gen correspondiente,
sea posible incrementar el rango de reconocimiento de sustratos y
facilitar la conversión de un mayor número de polienos carboxilados
a sus correspondientes carboxamidas.
La estrategia utilizada para el aislamiento de
ambos genes amidotransferasa (el de S. diastaticus var. 108 y
el de Streptomyces sp. RGU5.3), se ha basado en "genética
reversa". Inicialmente se alinearon varios genes codificantes de
amidotransferasas, pertenecientes a la familia de "asparagina
sintetasa" Tipo II a la que con toda probabilidad, en base a los
datos previos obtenidos a partir de las valoraciones de los
extractos acelulares, pertenecerían ambos genes. A partir de los
alineamientos obtenidos se estableció una secuencia consenso. Se
localizaron diferentes regiones con un alto grado de conservación:
una de ella localizada en el dominio "glutaminasa" y dos en el
dominio "sintetasa" (Figura 1). De esa forma se diseñaron dos
parejas de oligonucleóticos "degenerados", adaptados al uso de
codones de Streptomyces y que permitieran amplificación por
la técnica de PCR. Las parejas de oligonucleótidos diseñados
fueron:
| AsnB-deg1/AsnB-deg3rev: | SEQ ID NO: 5/ SEQ ID NO: 6 |
| AsnB-deg2/AsnB-deg4rev: | SEQ ID NO: 7/ SEQ ID NO: 8. |
El DNA total de Streptomyces diastaticus
var. 108 y Streptomyces sp. RGU5.3 se utilizó como molde para
la amplificación mediante la técnica de PCR, utilizando los
"primers" diseñados según se describe anteriormente y en las
siguientes combinaciones:
AsnB-deg1/AsnB-deg3rev;
AsnB-deg1/AsnB-deg4rev;
AsnB-deg2/AsnB-deg3rev;
AsnB-deg2/AsnB-deg4rev. Se
obtuvieron amplificaciones del DNA con los pares de "primers":
AsnB-deg1/AsnB-deg3rev y
AsnB-deg2/AsnB-deg3rev. A partir de
la pareja de "primers"
AsnB-deg1/AsnB-deg3rev se obtuvo un
fragmento de amplificación del DNA de S. diastaticus var. 108
de 1.143 pares de bases y a partir de la pareja de "primers"
AsnB-deg2/AsnB-deg3rev se obtuvo un
fragmento de amplificación, a partir del DNA de Streptomyces
sp. RGU5.3, de 668 pares de bases.
Ambos fragmentos se clonaron separadamente en el
sitio SmaI del plásmido de Escherichia coli pUC19.
Para cada uno de ellos se obtuvieron diversos plásmidos
recombinantes conteniendo distintos fragmentos que se agruparon
primariamente en base al patrón de enzimas de restricción. El DNA de
los distintos fragmentos se secuenció para determinar el gen
codificante y posteriormente los fragmentos de DNA se clonaron
independientemente en el vector actinofago PM1 para proceder a la
disrupción de cada uno de ellos y así determinar cual de ellos
codifica para la amidotransferasa responsable de la amidación de los
polienos de S. diastaticus var. 108 modificado genéticamente
(rimocidina y CE-108 para sintetizar rimocidina B y
CE-108B) y de pimaricina en Streptomyces sp.
RGU5.3 (para generar AB-400). En ambos casos se
identificó el fragmento del gen codificante de la actividad
amidotransferasa, a los que se han llamado pcsA (para el gen
procedente de S. diastaticus var. 108) y pcsB (para el
gen procedente de Streptomyces sp. RGU5.3). Ambos genes
completos se aislaron a partir de las librerías genómicas de S.
diastaticus var. 108 ó Streptomyces sp. RGU5.3,
utilizando como sonda, en cada caso, el respectivo fragmento
obtenido por amplificación de PCR y, posteriormente, utilizado para
la disrupción génica. La región cromosómica solapante a cada uno de
los genes se ha identificado por secuenciación de un fragmento
solapante, en cada caso, a cada uno de los genes (tanto de S.
diastaticus var. 108 como de Streptomyces sp. RGU5.3). La
región cromosómica procedente tanto de Streptomyces sp.
RGU5.3 como de S. diastaticus var. 108 se analizó
informáticamente para obtener las posibles fases de lecturas de los
genes codificantes. Para ello se utilizó el paquete informático
"EMBOSS Suite" utilizado en entorno WEB, (M. Sarachu & M.
Colet 2005, Bioinformatics 21:540-541; P.
Rice et al., 2000, Trends in Genetics
6:276-277), utilizando como Tabla para uso de
codones la de Streptomyces coelicolor.
Para analizar "in vitro" la
expresión de los dos genes codificantes para la amidotransferasa,
tanto de S. diastaticus var. 108 como de Streptomyces
sp. RGU5.3, se realizaron sendas ingenierías en los genes
codificantes. La región promotora de ambos genes se sustituyó por
promotores de Streptomyces conocidos, tales como
ermE*p o tipA, de forma que la expresión de cada uno
de los genes estuviera fuera del control de los promotores nativos.
Los genes recombinantes, tanto pcsA ó pcsB, se
clonaron en vectores adecuados de Streptomyces, bien en bajo
o número alto de copias. Los plásmidos recombinantes se introdujeron
por transformación en las estirpes correspondientes, productoras de
los macrolidos polienos (bien S. diastaticus var. 108 ó
Streptomyces sp RGU5.3). Las cepas transformantes,
conteniendo los plásmidos con el gen de la amidotransferasa, se
analizaron mediante HPLC para valorar los niveles de producción de
los polienos amidados. En la Figura 3 se compara la producción de
los polienos amidados producidos por S. diastaticus var. 108
en la cepa con el gen pcsA recombinante en un plásmido
replicativo como pHJL401, respecto a la cepa silvestre, se observa
una producción sustancialmente mayor en la cepa recombinante
respecto a la silvestre. Los valores de producción de los polienos
amidados son, incluso, superiores a la cepa de S. diastaticus
var. 108 a la que se ha introducido por transformación los plásmidos
descritos previamente como inductores de la sobreproducción de
polienos amidados tal como pSM784.
El análisis de los caldos de fermentación de las
cepas recombinantes de S. diastaticus var. 108, con copias
adicionales del gen pcsA en plásmidos replicativos (tales
como pHJL401 ó plJ941) permiten incrementar los niveles de amidación
en aquellas moléculas susceptibles de ser amidadas, por lo que se
sintetizan nuevos compuestos, no identificados previamente, tal como
CE-108E (pico número 5 en el cromatograma B de la
Figura 3) en cantidades suficientes para poder ser purificados y
analizados. Los análisis previos utilizando espectros de masas,
realizados con el compuesto CE-108E, purificado por
HPLC, permitió establecer que es un macrólido polieno amidado
derivado del compuesto señalado como pico 6 en el cromatograma. La
utilización de técnicas habituales de RMN se pudo confirmar la
estructura química de ambos polienos que se representan a
continuación:
Desde el punto de vista estructural ambos
macrolidos polienos (CE-108D y
CE-108E) parecen proceder de la incorporación de
"metilmalonil-CoA" en el último ciclo de
condensación de la poliquétido sintetasa del cluster biosintético de
rimocidina y CE-108, en lugar de
butiril-CoA. La actividad biológica como fungicida
de CE-108E es sustancialmente mayor que la de
CE-108D y, aunque la actividad fungicida de
CE-108E es menor que la de otros macrolidos
similares para la mayoría de los hongos ensayados, la actividad
hemolítica de CE-108E es significativamente menor,
pudiendo tener una cierta ventaja terapéutica en relación a estos
otros macrolidos en función de las distintas aplicaciones.
Similarmente el recombinante genético de
Streptomyces sp. RGU5.3 obtenido al introducir copias
adicionales del gen pcsB de Streptomyces RGU5.3,
responsable de la amidación de pimaricina para generar su derivado
amidado AB-400 genera una cepa en la que
AB-400 es sintetizado como macrólido polieno
mayoritario, a diferencia de la cepa Streptomyces sp. RGU5.3
silvestre en la que la proporción de AB-400
producido es similar a pimaricina, sugiriendo una mayor
bioconversión de la pimaricina a su derivado amidado en el
microorganismo recombinante.
A diferencia de 4,5 deepoxipimaricina, el nuevo
compuesto detectado en los caldos de fermentación del recombinante
de Streptomyces sp. RGU5.3 portando copias adicionales del
gen pcsB (4,5-deepoxiAB-400)
retiene una actividad biológica como antifúngico próxima a la de
pimaricina, en lugar de siete veces menor a la de pimaricina como ha
sido descrito previamente para el polieno carboxilado
4.5-deepoxipimaricina (Mendes et al.,2001.
Chem&Biol, 8:635-644). La fórmula química
de ambos compuestos es como se muestra a continuación:
Tanto PcsA como PcsB, en presencia de ATP, Mg y
glutamina son capaces de amidar "in vitro" los polienos
correspondientes, resultando en compuestos con mayor actividad
biológica que la de los compuestos parentales. Pese a la diferente
especificidad de sustratos valorados "in vitro" que
muestran ambas proteínas (PcsA y PcsB), los alineamientos realizados
entre ambas proteínas, utilizando el programa "Supermatcher"
del paquete "EMBOSS Suite" referenciado más arriba, muestran
una identidad a lo largo de toda la proteína del 87% con una
similitud del 93.5%.
<110> Consejo Superior de investigaciones
Científicas (CSIC)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Macrolidos polienos con actividad
antimicrobiana y su procedimiento biotecnológico de obtención
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1641.434
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 615
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces diastaticus var.
108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 615
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces sp. RGU5.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6079
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces diastaticus var.
108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces sp. RGU5.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
AsnB-deg1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
AsnB-deg3rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
AsnB-deg2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, t o u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AsnB-deg4rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, t o u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, t o u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, t o u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (22)
1. Polinucleótido aislado capaz de traducirse a
la secuencia aminoacídica que se selecciona de la lista que
comprende:
- a.
- la SEQ ID NO: 1,
- b.
- la SEQ ID NO: 2,
o a una variante o a un fragmento biológicamente
activo de dichas secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Construcción genética de ADN o ARN que
comprende uno de los siguientes tipos de secuencias:
- c.
- secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido según la reivindicación 1, para su transcripción in vitro o in vivo, o
- d.
- secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Construcción genética según la reivindicación
2, donde el promotor es ermE*p.
4. Construcción genética según la reivindicación
2, donde el promotor es tipA.
5. Construcción genética según la reivindicación
2, que es el plásmido replicativo pHJL401.
6. Construcción genética según la reivindicación
2, que es el plásmido replicativo pIJ941.
7. Célula hospedadora que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 1, o una construcción
genética según cualquiera de las reivindicaciones
2-6.
8. Célula según la reivindicación 7 que es una
bacteria.
9. Célula según la reivindicación 8 que
pertenece al género Streptomyces.
10. Célula hospedadora según la reivindicación 8
que pertenece a la especie Streptomyces diastaticus.
11. Método de obtención de macrolidos polienos
que comprende cultivar la célula hospedadora según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 10.
12. Uso de la célula hospedadora según
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 para la obtención de
macrolidos polienos.
\newpage
13. Compuesto de fórmula (I)
donde
R_{1} se selecciona entre -COOH ó
-CONH_{2}.
R_{2} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{4}.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Compuesto según la reivindicación 13 donde
R_{1} es -CONH_{2}.
15. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 13-14 en forma de sal, profármaco,
derivado o análogo, o cualquiera de sus combinaciones.
16. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 13-15 para la fabricación de un
medicamento.
17. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 13-15 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de una infección.
18. Uso según la reivindicación 17 donde la
infección está producida por hongos.
19. Uso del compuesto de fórmula (I) según las
reivindicaciones 13-15 como antibiótico.
20. Uso del compuesto de fórmula (I) según las
reivindicaciones 13-15 como como antifúngico.
21. Composición farmacéutica que comprende al
menos un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las
reivindicaciones 13-15 junto a un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
22. Composición farmacéutica que comprende un
compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones
13-15 y, adicionalmente, otro principio activo.
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006100330A2 (es) * | 2005-03-23 | 2006-09-28 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Antibióticos polienos, composiciones que los contengan, procedimiento y microorganismos para su obtención y sus aplicaciones |
-
2009
- 2009-07-31 ES ES200930550A patent/ES2371615B1/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006100330A2 (es) * | 2005-03-23 | 2006-09-28 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Antibióticos polienos, composiciones que los contengan, procedimiento y microorganismos para su obtención y sus aplicaciones |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ELENA M. SECO ET AL "A tailoring activity is responsible for generating polyene amide derivatives in Streptomyces diastaticus var. 108" CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 12, octubre 2005, páginas 1093-1101. Figura 1, tabla 1, página 1098, columna derecha y página 1099. * |
| ELENA M. SECO ET AL "Starter unit choise determines the production of two tetraene macrolides, rimocidin and CE-108, in Streptomyces diastaticus var.108" CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 11, mazro 2004, páginas 357-366. Página 357; página 358, columna izquierda, segundo párrafo; página 364 y figura 6. * |
| ELENA M. SECO ET AL "Two polyene amides produced by genetically modified Streptomyces diastaticus var. 108" CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 12, mayo 2005, páginas 535-543. Resumen, figura 1, tabla 1 y página 541. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2371615B1 (es) | 2013-01-24 |
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