WO2006114266A2 - Vorrichtung zur optischen untersuchung einer mehrzahl von proben in vertiefungen einer mikrotiterplatte - Google Patents

Vorrichtung zur optischen untersuchung einer mehrzahl von proben in vertiefungen einer mikrotiterplatte Download PDF

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WO2006114266A2
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perforated
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Berthold Breitkopf
Jürgen Dr. Wulf
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Stratec Biomedical Systems AG
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates

Definitions

  • the invention relates to an analysis device for the optical examination of a plurality of samples in wells of a microtiter plate, which can be successively brought into an excitation light path of an excitation light emitting light source and emit emission light via an emission light path to a detector upon excitation with the excitation light.
  • the invention further relates to a device for optical examination of a plurality of samples in wells of a microtiter plate, which can be brought simultaneously in excitation light paths of excitation light emitting light sources and emit emission light via emission light paths to associated detectors.
  • Analytical or measuring devices for the optical examination of samples in a microtiter plate with a plurality of cavities or depressions arranged in a matrix are known and are used, inter alia, in the field of laboratory medicine to obtain by optical means, for example by measuring fluorescence, time-resolved fluorescence, fluorescence polarization To determine luminescence or absorption concentrations of ingredients of the samples, for example, the concentration of a particular blood component.
  • Devices of the former type have the advantage of a short observation period because of the synchronous or multiplexed examination of the samples in all wells of the microtiter plate, however, their detectors have a significantly lower sensitivity and a lower dynamic range than those of the devices of the latter type
  • the examination of the samples may take a very long time, for example up to one hour, when the kinetics of the reaction are measured with a period of observation of a few seconds per cavity after the addition of a particular chemical to the samples of a 1536-well microtiter plate.
  • a further requirement of the devices of the type mentioned at the outset is to enable analysis of several different wavelengths of emission light from a sample in order, for example, to obtain different information about the sample by forming signal ratios can.
  • this is usually done with the aid of dichroic filters which are arranged in the excitation light path or in the emission light path and are wavelength-selective permeable / - which, however, necessitates frequent filter changes to examine several wavelengths of light.
  • the present invention seeks to provide a device of the type mentioned above with high sensitivity and dynamism whose beam path allows a modular combination with several similar devices to a device of the type mentioned.
  • a device is to be provided which, by using a plurality of individual light sources and detectors and in particular using a plurality of devices of the aforementioned type without the risk of signal crosstalk through partially parallelized processing, enables an accelerated performance of examinations and has a wide range of applications.
  • a device with the features of claim 1 or 2 is proposed according to a first aspect of the invention, which is particularly well with other similar devices to a partially parallel or sequential device for optical due to their very narrow elongated beam path Investigation of samples in the wells of a microtiter plate can combine, but in principle can also be used alone.
  • the feature combination according to the invention enables a very effective separation of excitation light and emission light at the hole element (perforated mirror or perforated grating) and a coupling out of different wavelengths of the emission light behind the hole element, so that the specimen can be excited with multispectral light of high light intensity.
  • the emission species can be diffracted into the desired axis, while the unwanted excitation light is bent at a different angle because of its different wavelength and thus kept away from the detector.
  • the Lochspie- gel is a plane mirror, which allows a sharper image and thus a higher light output at the detector compared to a curved mirror.
  • the plane seal is preferably inclined at an angle of 45 degrees with respect to an optical axis of the excitation light path, so that the emission light reflected from the hole mirror can be deflected 90 degrees away from the excitation light path through the hole in the mirror toward the detector.
  • the perforated grid is a flat grid and inclined at an angle set in accordance with the wavelength of the emission light with respect to an optical axis of the excitation light path.
  • an adjustment to the wavelength of the emission light can be made by the angular position, such that only this is diffracted into the inlet cross-section of the detector.
  • At least one light guide is preferably arranged, so that different radiation paths can be realized starting from the light source. Since the coupling of the excitation light from the light source into the light entry surface of the light guide causes an uneven light distribution in the individual fibers of the light guide, an additional light guide rod in the region of the light guide can be provided for homogenizing the location-dependent source luminance.
  • a collection optic in the form of a short focal length lens is arranged, which guides the end of the light guide through the hole of the hole element an image element located behind the hole element F1 maps, wherein the optical axis of the passing through the hole excitation light in the EPI mode is aligned perpendicular to the plane of the microtiter terplatte.
  • the objective lens picks up the image of the light guide end and images it down in the plane of the microtiter plate within the cavity in a pixel F2, so that the light also focuses exactly in the desired cavity in microtiter plates with 1536 wells and at the same time a high opening for the emission can be achieved.
  • the distance between the pixel F1 and the objective lens is expediently more than three times greater than the distance between the objective lens and the pixel F2, so that the pixel F1 is smaller than the pixel F2.
  • this large depth image scale causes a small change in the volume of the sample to lead to a large change in the size of the sample.
  • tion point of the emission light on the hole element results, so that the emission light from area above the pixel F2 in the sample and in particular from the region of the focal point F3 of the objective lens outside of the hole impinges on the hole element and is reflected with high light output to the detector ,
  • the slim excitation light cone that it is completely enclosed by the emission light cone, whereby only the emission light from the area of the pixel F2 is thrown back through the hole of the hole member, while the remaining emission light incident on the hole element around the hole and with high collection effect is deflected to the detector.
  • a pinhole in the emission light path is arranged in front of the detector whose opening is confocal to the above the light spot F2 in the sample located focal point F3 of the objective lens, so that the pinhole a sample volume surrounding the focal point F3 is selected, the emission light of which is evaluated while scattered light or extraneous light is suppressed.
  • the collection optics is advantageously designed such that the emission light is embodied as a parallel bundle of rays at least along a part of the emission light path between the perforated mirror and the detector, so that optical measures can be taken on the emission light in this region, for example a separation into different spectral Wavelengths by retraction of beam splitters and color or interference filters or by dichroic beam splitters in the emission light path, or a separation of the different polarization planes of the emission light by retraction of beam splitters and crossed polarizing filters.
  • a device having the features of claim 18 comprising a plurality of light sources and detectors, preferably in the form of a series of modular devices according to claims 1 to 17, the detectors of which are either simultaneous or in the manner described above parallel extraction of one piece of information from multiple samples in different wells of the microtiter plate, or alternatively for simultaneously obtaining several different pieces of information from a single sample in the same well of the microtiter plate by exposing the emission light from that sample or cavity to multiple emission light paths divided and examined in several detectors in parallel with respect to the desired information, for example, each detector is exposed to emission light of different spectral wavelengths or different polarization.
  • the device preferably has at least one mirror or beam splitter arrangement which can be selectively moved into the emission light path between a sample or cavity and a detector receiving the emission light from the sample or cavity in order to at least partially offset the emission light To direct a further detector, or move out of the emission light path to direct the emission light from this sample or cavity only to a single detector and to use the other detectors for the simultaneous examination of other samples or cavities.
  • the emission light from a sample or cavity is split between a first detector and one or more further detectors to obtain different information from a single sample or cavity, it is desirable to avoid emitting light from those samples or cavities in their emission light path the other detectors are located.
  • an opaque element of the Blocking excitation light path to these samples or cavities by the opaque element is moved, for example by means of a simple slider or pivoting mechanism in the excitation light path.
  • the mirror or beam splitter arrangement preferably comprises at least one semitransparent plane mirror oriented at 45 degrees to the light emission path, each of which transmits or reflects part of the emission light to different detectors and which is used to mask unwanted spectral wavelengths or planes of polarization by an interference or color filter or color filter.
  • a polarizer can be added.
  • dichroic plano mirrors may be moved into the emission light path in front of the respective detectors.
  • FIG. 1 shows a schematic view of a device for the optical examination of samples in wells of microtiter plates with a light source and a detector;
  • Fig. 2 is an enlarged view of the section A of Fig. 1;
  • FIG. 3 shows a schematic view of a device for the optical examination of samples in wells of microtiter plates with a
  • the device 2 shown in FIG. 1 is used for the optical examination of samples 4 in cavities 6 of a microtiter plate 8, for example for measuring the concentration of ingredients of biological or biochemical samples 4 by excitation light excitation (in solid lines in FIGS shown) and measuring the at the excitation of the pro- emitted emission light (shown in dotted lines in FIGS. 1 and 2), such as fluorescent light.
  • either the microtiter plate 8 can be pushed stepwise past the device 2 or, alternatively, the device 2 gradually over the individual by means of an actuator, not shown Cavities 8 of the microtiter plate 8 are moved, wherein a movement in two mutually perpendicular directions is possible, as indicated by double arrows P1 and P2 in Fig. 3.
  • the device 2 consists essentially of a light source 10 for generating the excitation light, an excitation light path 12 between the light source 10 and the samples to be examined 4, by a collecting optics 14, a light guide 16, a short focal length lens 18, the hole 20 of a perforated mirror 22 and behind the perforated mirror 22 perpendicular to the plane of the microtiter plate 8 through a arranged at a small distance above the microtiter plate 8 lens or converging lens 24 extends into a filled with the sample 4 cavity 6, and an emission light path 26 between the examining sample 4 and the emission light detecting and measuring detector 28, wherein the emission light path 26 from the sample 4 from also through the objective lens 24 to the perforated mirror 22, where the emission light from a hole surrounding the microtiter plate 8 facing mirror surface 30 of the hole mirror 22 is deflected laterally and you pass through a receiver-side collecting optics 32 is focused on an opening 36 of a pinhole 34 arranged in front of the detector 28 before it enters the detector 28.
  • a diffraction grating (perforated grid 22) provided with a hole 20 can be used, which diffracts incident light in accordance with the wavelength.
  • the unwanted excitation light is at a different angle. bends so that it falls on the edge of the aperture 34 and is therefore blocked.
  • the grating 22 thus improves the blocking much like a dichroic mirror.
  • the advantage is that the grating 22 can be adjusted to the desired wavelength by rotation about an axis arranged perpendicular to the image plane, while the wavelength characteristics of a dichroic are fixedly predetermined.
  • the light source 10 is designed as a flashlight which, in synchronization with a movement of the microtiter plate 8 with respect to the device 2, emits pulsed high-intensity flashes, so that the number of flashes of light supplied into each cavity 6 is identical, but also the intensity the flashes is adjustable to change the signal-to-noise ratio.
  • the time interval of the flashes can also be changed, for example, to measure time-delayed fluorescence.
  • a laser can also be used, for example for exciting certain fluorophores, the laser being provided alternatively or additionally to the flash light and, in the latter case, swung into the excitation light path 12 in order to light the light emitted by the laser Coupling light entrance surface 38 of the light guide 16.
  • the collection optics 14 arranged behind the light source 10 in the excitation light path 12 serves to focus the light emitted by the light source 10 onto the light entry surface 38 of the light guide 16, with the aid of which different radiation paths can be realized starting from the light source 10.
  • the collection optics 14 comprises two convex lenses 40, 42, between which the excitation light is in the form of a parallel beam, so that in this area if necessary one of a plurality of filters 44 (only one shown) by means of an electromechanical actuator (not shown) in the excitation light path 12 can be retracted, for example, a polarizing filter, if the samples to be examined 4 are to be excited with polarized light, or an interference filter, when the samples 4 are to be excited with light of a selected wavelength.
  • the light guide 16 may include a light guide rod (not shown) for homogenizing a nonuniform luminance of the light source 10.
  • the light exit surface 46 at its front end remote from the light source 10 is imaged by the short focal length converging lens 18 through the hole 20 in the perforated mirror 22 in an object-side pixel F1 between the perforated mirror 22 and the objective lens 24.
  • the perforated mirror 22 is designed as a plane mirror in order to avoid aberrations of the emission light reflected by the object-side mirror surface 30 and is inclined at an angle of 45 degrees to the plane of the microtiter plate 8, so that the optical axis of the emission light path 26 behind the perforated mirror 22 to the optical axis of the excitation light path 12 between the lenses 18 and 24 is perpendicular.
  • the size of the hole 20 in the center of the hole mirror 22 is about 5% of the mirror surface 30th
  • the converging lens 18 bundles the exciting light emerging with a broad light exit angle from the light exit surface 46 of the light guide 16 into a narrow excitation light cone which, despite the small size of the hole 20 in the perforated mirror 22, completely passes through it without loss of light, does not over-radiate the objective lens 24 and within the specimen 24 also rejuvenated with a slender shape.
  • the objective lens 24 is arranged at a large distance from the hole mirror 22 and from the pixel F1 and in the vicinity of the plane of the microtiter plate 8, so that its focal point or focus F3 in the region of the sample 4 to be examined within the respective cavity 6 of the microtiter plate. 8 is as best shown in Fig. 2. With the aid of the objective lens 24, the stimulation be focused even in the smallest cavities 6, such as the cavities 6 of a microtiter plate 8 with 1536 cavities.
  • the objective lens 24 picks up the image of the light exit surface 46 of the light guide 16 and images it at the bottom of the cavity 6 in a pixel F2 which is located at a distance below the focal point F3 of the objective lens, as best shown in FIG. so that the slim excitation light cone within the sample 4 as well as between the objective lens 24 and the perforated mirror 22 is enveloped by the broader emission light cone in a beam-optical manner.
  • the pixel F1 represents a reduced image of the light exit surface 46 of the light guide 16 in comparison to the pixel F2, as a result of which a large depth image scale is achieved. This means that even a small change of location in the sample volume leads to a large change in the point of impact of the light emitted by this sample volume on the mirror surface 30 of the perforated mirror 22.
  • the receiver-side collection optic 32 is designed such that it focuses the light reflected by the mirror surface 30 onto the pinhole diaphragm 34 arranged in front of the detector 28, whose aperture 36 is confocal to the focal point F3 of the objective lens 24.
  • the emission light from the sample volume around the focal point F3 can be selected by means of the Lochblsnde 34 and fed into the detector 28, while the incidence of stray light or extraneous light is suppressed in the detector 28.
  • the detector 28 itself consists of a photomultiplier tube (photomultiplier tube PMT), with which a detection of very low light intensities is possible.
  • photomultiplier tube PMT photomultiplier tube
  • the receiver-side collecting optics 32 comprises two collecting lenses 48, 50 arranged at a distance from one another, of which the first collecting lens 48 arranged immediately behind the perforated mirror 22 has a large focal length, in order to deliver an optionally somewhat divergent emission light cone between the objective lens 24 and the perforated mirror 22 to merge a parallel bundle of rays.
  • the parallel beam between the two spaced collection lenses 48, 50 makes it possible in this area as in 52 interference filter, polarizers, beam splitters or other optical components with electromechanical actuators (not shown in Fig.
  • the device 54 illustrated in FIG. 3 comprises a plurality of devices 2 of the type previously described with reference to FIG. 1, for example a total of six or eight modularly juxtaposed devices 2, of which, however, only two in parts for simplicity in FIG shown and described below only two. It goes without saying that the mode of operation described for the two devices 2 also applies to a device 54 consisting of more than two devices 2 or consisting of modified devices 2.
  • the device 54 shown in Fig. 3 and described below makes it possible, with the aid of the two detectors 28 of the devices 2, to optionally form a parallel, i.e., parallel, detector 2. simultaneous examination of two samples 4 or a parallel, i. simultaneous examination of two different properties of a single sample 4.
  • the device 54 comprises a mirror arrangement 56 and a light-impermeable element 58, both of which can be pivoted by means of an actuator 60 about an axis 62 oriented perpendicular to the light paths 12, 26 of the two devices 2, or alternatively in the direction of the double arrow
  • the axis 60 can be displaced, so that the mirror arrangement 54 can be moved into the emission light path 26 of the two devices 2 during the switchover from a parallel examination of two samples 4 to a parallel examination of two different properties of a sample 4 by actuation of the actuator 60 opaque element 58 in the excitation light path 12 of one of the two devices 2 is movable bar.
  • the mirror arrangement 54 comprises a steel divider mirror 64 and a feedback mirror 66 which in each case in the region of the parallel beam between the lenses 48, 50 of the collection optics 32 (not shown in FIG. 3) in front of the detector 28 the first and second device 2 are moved.
  • the beam splitter mirror 64 and the feedback mirror 66 are plane mirrors. which are arranged at an angle of 45 degrees to the optical axis in the emission light path 12 of the first device 2, so that the beam splitter mirror 64 reflects a part of the emission light of this device 2 to the feedback mirror 66, which in turn transmits it to the detector 28 of the second device 2 reflected.
  • either different color or interference filters 68 or polarization filters with mutually perpendicular polarization planes can be pivoted between the mirrors 64, 66 and the associated detector 28.
  • dichroic mirrors can also be used instead of partially transmissive mirrors and color filters.
  • the light-impermeable element 58 is used in the position of the mirror arrangement 54 shown in FIG. 3 for interrupting the excitation light path 12 of the second device 2, so that no light is radiated from the light source 10 (not shown) of this device into the cavity 8 located at the end of the excitation light path becomes.
  • the microtiter plate 8 is movable relative to the device 54 in two mutually perpendicular directions to bring the cavities 6 of the plate 8 successively in the excitation light path 12 of one of the two devices 2, so that of the Detectors 28 of the two devices 2 either for faster processing of the samples 4 simultaneously detected and evaluated the emission light from two spaced-apart cavities 6, or alternatively, for example, to form a signal ratio, the emission light from a single cavity 6 of the plate. 8 in different separated spectral wavelengths or different polarization planes and these separate wavelengths or polarization planes can be examined simultaneously.
  • the distance AL between the adjacent excitation light paths 12 of the two devices 2 above the plate 8 is an integer multiple of the distance A ⁇ of adjacent cavities 8 of the microtiter plate 8, so that in the EPI mode vertically from above
  • excitation light of both devices 2 incident on the plate 8 is focused precisely into the centers of two cavities 8 arranged at a distance, and the emission light of the samples 4 therein to the detector 28 in the manner described above the respective device 2 can be passed.
  • the microtiter plate 8 can be scanned in grid fashion with the excitation light of the devices 2.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (2) zur optischen Untersuchung einer Mehrzahl von Proben (4) in Vertiefungen (6) einer Mikrotiterplatte (8), die sich nacheinander in einen Anregungslichtpfad (12) einer Anregungslicht emittierenden Lichtquelle (10) bringen lassen und dabei Emissionslicht über einen Emissionslichtpfad (26) zu einem Detektor (28) emittieren. Erfindungsgemäß ist zwischen der Lichtquelle (10) und dem Detektor (28) ein Lochspiegel oder Lochgitter (22) derart im Anregungslichtpfad (12) und im Emissionslichtpfad (26) angeordnet ist, dass das Anregungslicht durch das Loch (20) auf die zu untersuchende Probe (4) fällt und das Emissionslicht aus der Probe (4) im Wesentlichen von einer das Loch (20) umgebenden Fläche (30) reflektiert bzw. gebeugt wird, um es getrennt vom Anregungslicht zum Detektor (28) zu lenken, wobei zwischen dem Lochspiegel oder Lochgitter (22) und der Mikrotiterplatte (8) eine Objektivlinse (24) angeordnet ist, deren Brennpunkt (F3) im Bereich der zu untersuchenden Probe (4) liegt.

Description

Vorrichtung zur optischen Untersuchung einer Mehrzahl von Proben in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine Analysevorrichtung zur optischen Untersuchung einer Mehrzahl von Proben in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die sich nacheinander in einen Anregungslichtpfad einer Anregungslicht emittierenden Lichtquelle bringen lassen und bei Anregung mit dem Anregungslicht Emissionslicht über einen Emissionslichtpfad zu einem Detektor emittieren. Die Erfindung betrifft weiter eine Einrichtung zur optischen Untersuchung einer Mehrzahl von Proben in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die sich jeweils gleichzeitig in Anregungslichtpfade von Anregungslicht emittierenden Lichtquellen bringen lassen und dabei Emissionslicht über Emissionslicht- pfade zu zugehörigen Detektoren emittieren.
Analyse- oder Messgeräte zur optischen Untersuchung von Proben in Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl von matrixartig angeordneten Kavitäten oder Vertiefungen sind bekannt und werden unter anderem im Bereich der La- bormedizin eingesetzt, um auf optischem Wege, zum Beispiel durch Messung von Fluoreszenz, zeitaufgelöster Fluoreszenz, Fluoreszenzpolarisation, Lumineszenz oder Absorption Konzentrationen von Inhaltsstoffen der Proben zu ermitteln, zum Beispiel die Konzentration eines bestimmten Blutbestandteils.
In der Regel ist bei diesen optischen Untersuchungen eine hohe Messempfindlichkeit und ggf. auch ein großer dynamischer Messbereich erforderlich. Insbesondere bei einer angeregten Lichtemission ist es darüber hinaus erforderlich, dass das Anregungslicht mit hoher Intensität eingestrahlt wird, so dass sich die um viele Größenordnungen geringere Intensität des Emissionslichts noch mit ausreichender Genauigkeit erfassen lässt. Für optische Untersuchungen von Proben in Kavitäten von Mikrotiterplatten werden gewöhnlich zwei verschiedene Arten von Geräten eingesetzt, zum einen parallel arbeitende Geräte, welche mittels eines einzigen Detektors die gesamte Mikrotiterplatte beobachten und das Emissionslicht aus den Proben in sämtlichen Kavitäten gleichzeitig erfassen und messen, wobei als Lichtquelle für das Anregungslicht zumeist mehrere Blitzlampen oder ein Laser und als Detektor eine sehr teuere Kamera mit gekühltem Chip eingesetzt wird, sowie zum anderen sequentiell arbeitende Geräte, bei denen farbiges Licht aus einem Monochromator in die Probe in einer einzelnen Kavität fo- kussiert und das Emissionslicht aus der Probe zu einem zumeist als Foto- vervielfacherröhre (Photomultipiertube PMT) ausgebildeten Detektor gelenkt wird, wobei die Mikrotiterplatte einerseits und die Lichtquelle und der Detektor andererseits in Bezug zueinander bewegt werden, um sämtliche Kavitäten zur Untersuchung der darin enthaltenen Proben nacheinander in den Anregungslichtpfad zu bringen.
Geräte der zuerst genannten Art weisen wegen der synchronen oder mul- tiplexierten Untersuchung der Proben in sämtlichen Kavitäten der Mikrotiterplatte den Vorteil einer kurzen Beobachtungsdauer auf, jedoch besitzen ihre Detektoren eine erheblich geringere Empfindlichkeit und einen geringeren Dynamikbereich als diejenigen der Geräte der zuletzt genannten Art, bei denen jedoch die Untersuchung der Proben zum Teil sehr lange dauern kann, zum Beispiel bis zu einer Stunde, wenn jeweils nach Zugabe einer bestimmten Chemikalie in die Proben einer Mikrotiterplatte mit 1536 Kavitäten die Kinetik der Reaktion mit einer Beobachtungsdauer von einigen Sekunden pro Kavität gemessen wird.
Da die Durchmesser der Kavitäten und die Abstände benachbarter Kavitäten von Mikrotiterplatten mit 1536 Kavitäten sehr klein sind, kann bei einer Un- tersuchung von Proben in derartigen Platten zudem das Problem eines Signalübersprechens aus benachbarten Kavitäten auftreten, das heißt eine Ver- fälschung der Untersuchungsergebnisse einer Probe durch Emissionslicht aus der Probe in einer benachbarten Kavität.
Insbesondere bei einer Untersuchung zeilbasierender Proben in Mikroti- terplatten besteht eine weitere Anforderung an die Vorrichtungen der eingangs genannten Art darin, eine Analyse mehrerer unterschiedlicher Weilenlängen des Emissionslichts aus einer Probe zu ermögliche^ um zum Beispiel durch Bildung von Signalverhältnissen unterschiedliche Informationen über die Probe gewinnen zu können. Bei bekannten Geräten erfolgt dies ge- wohnlich mit Hilfe von dichrotischen Filtern, die im Anregungslichtpfad bzw. im Emissionslichtpfad angeordnet und wellenlängenselektiv durchlässig sind/- was jedoch zur Untersuchung mehrerer Lichtwellenlängen einen häufigen Filterwechsel erforderlich macht.
Ausgehend hiervon liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art mit hoher Messempfindlichkeit und Dynamik bereitzustellen, deren Strahlengang eine modulare Kombination mit mehreren gleichartigen Vorrichtungen zu einer Einrichtung der eingangs genannten Art gestattet. Speziell soll eine Einrichtung bereitgestellt werden, die unter Verwendung mehrerer einzelner Lichtquellen und Detektoren und insbesondere unter Verwendung von mehreren Vorrichtungen der eingangs genannten Art ohne die Gefahr eines Signalübersprechens durch teilparalle- lisierte Bearbeitung eine beschleunigte Durchführung von Untersuchungen ermöglicht und einen breiten Anwendungsbereich besitzt.
Um die genannte Aufgabe zu lösen, wird gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 bzw. 2 vorgeschlagen, die sich aufgrund ihres sehr schmalen langgestreckten Strahlengangs besonders gut mit weiteren gleichartigen Vorrichtungen zu einer teilparallel oder sequentiell arbeitenden Einrichtung zur optischen Untersuchung von Proben in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte kombinieren lässt, grundsätzlich jedoch auch in Alleinstellung verwendet werden kann. Durch die erfindungsgemäße Merkmalskombination wird eine sehr effektive Trennung von Anregungslicht und Emissionslicht am Lochelement (Lochspiegel oder Lochgitter) und eine Auskopplung von verschiedenen Wellen- längen des Emissionslichts hinter dem Lochelement ermöglicht, so dass die Probe mit multispektralem Licht hoher Lichtintensität angeregt werden kann. Bei Verwendung eines Plangitters kann das Emissionsücht in die gewünschte Achse gebeugt werden, während das unerwünschte Anregungslicht aufgrund seiner abweichenden Wellenlänge unter einem anderen Winkel ge- beugt und somit vom Detektor ferngehalten wird. Durch die Objektivlinse
■ wird selbst bei Verwendung von Mikrotiterplatten mit 1536 Kavitäten eine gute Fokussierung des Anregungslichts in den Kavitäten der Mikrotiterplatte erreicht, wodurch eine hohe Lichtausbeute erzielt und ein Übersprechen von
Anregungslicht aus benachbarten Kavitäten verhindert wird. Außerdem kann mit der erfindungsgemäßen Merkmalskombination auf die Verwendung dich- roitischer Strahlteiler oder gekrümmter Spiegel verzichtet werden, so dass eine hohe Messgenauigkeit erzielt werden kann.
Eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass der Lochspie- gel ein Planspiegel ist, der im Vergleich zu einem gekrümmten Spiegel eine schärfere Abbildung und damit eine höhere Lichtausbeute am Detektor ermöglicht. Der Plansiegel ist vorzugsweise unter einem Winkel von 45 Grad in Bezug zu einer optischen Achse des Anregungslichtpfades geneigt, so dass das vom Lochspiegel reflektierte Emissionslicht unter einem Winkel von 90 Grad von dem durch das Loch im Spiegel verlaufenden Anregungslichtpfad weg zum Detektor hin abgelenkt werden kann.
Bei Verwendung eines Lochgitters ist es vorteilhaft, wenn das Lochgitter ein Plangitter ist und unter einem nach Maßgabe der Wellenlänge des Emissi- onslichts eingestellten Winkel in Bezug zu einer optischen Achse des Anregungslichtpfades geneigt ist. Somit kann durch die Winkelstellung eine Anpassung auf die Wellenlänge des Emissionslichts vorgenommen werden, derart, dass nur dieses in den Eintrittsquerschnitt des Detektors gebeugt wird.
Im Anregungslichtpfad zwischen der Lichtquelle und dem Lochelement ist vorzugsweise mindestens ein Lichtleiter angeordnet, so dass sich ausgehend von der Lichtquelle verschiedene Strahlungspfade realisieren lassen. Da die Einkopplung des Anregungslichts aus der Lichtquelle in die Lichteintrittsfläche des Lichtleiters eine ungleichmäßige Lichtverteilung in den einzelnen Fasern des Lichtleiters bewirkt, kann zur Homogenisierung der orts- abhängigen Quellleuchtdichte ein zusätzlicher Lichtleiterstab im Bereich des Lichtleiters vorgesehen werden.
Um das Anregungslicht im Wesentlichen vollständig durch das Lochelement hindurch in die Probe zu lenken, ist hinter dem Lichtleiter und vor dem Loch- element vorzugsweise eine Sammeloptik in Form einer Linse mit kurzer Brennweite angeordnet, die das Ende des Lichtleiters durch das Loch des Lochelements hindurch in einem hinter dem Lochelement gelegenen Bildpunkt F1 abbildet, wobei die optische Achse des durch das Loch hindurchtretenden Anregungslichts im EPI-Mode senkrecht zur Ebene der Mikroti- terplatte ausgerichtet ist. In einem weiten Abstand vom Lochelement nimmt die Objektivlinse das Bild des Lichtleiterendes auf und bildet es in der Ebene der Mikrotiterplatte innerhalb der Kavität in einem Bildpunkt F2 verkleinert ab, so dass das Licht auch in Mikrotiterplatten mit 1536 Kavitäten genau in der gewünschten Kavität fokussiert und gleichzeitig eine hohe Öffnung für die Emission erzielt werden kann.
Um einen großen Tiefenabbildungsmaßstab zu erreichen, ist der Abstand zwischen dem Bildpunkt F1 und der Objektivlinse zweckmäßig um mehr als das Dreifache größer als der Abstand zwischen der Objektivlinse und dem Bildpunkt F2, so dass der Bildpunkt F1 gegenüber dem Bildpunkt F2 verkleinert ist. Dieser große Tiefenabbildungsmaßstab bewirkt zum einen, dass eine kleine Ortsveränderung im Probenvolumen zu einer großen Verände- rung des Auftreffpunkts des Emissionslichts auf dem Lochelement führt, so dass das Emissionslicht aus Bereich oberhalb des Bildpunkts F2 in der Probe und insbesondere aus dem Bereich des Brennpunkts F3 der Objektivlinse außerhalb des Lochs auf das Lochelement auftrifft und mit hoher Lichtaus- beute zum Detektor reflektiert wird. Zum anderen wird durch den schlanken Anregungslichtkegel erreicht, dass dieser vollständig vom Emissionslichtkegel umschlossen wird, wodurch nur das Emissionslicht aus dem Bereich des Bildpunktes F2 durch das Loch des Lochelements zurück geworfen wird, während das übrige Emissionslicht um das Loch herum auf das Lochelement auftrifft und mit hoher Sammelwirkung zum Detektor abgelenkt wird.
Um vor allem das Emissionslicht aus dem Bereich des Brennpunkts F3 der Objektivlinse im Detektor auszuwerten, ist vor dem Detektor eine Lochblende im Emissionslichtpfad angeordnet, deren Öffnung konfokal zu dem oberhalb des Lichtpunkts F2 in der Probe gelegenen Brennpunkt F3 der Objektivlinse ist, so dass die Lochblende ein den Brennpunkt F3 umgebendes Probenvolumen selektiert, dessen Emissionslicht ausgewertet wird, während Streulicht oder Fremdlicht unterdrückt wird.
Vor der Lochblende ist zweckmäßig eine Sammeloptik im Emissionslichtpfad angeordnet, in deren Brennpunkt F4 die Öffnung der Lochblende liegt, so dass das gesamte Emissionslicht auf die Lochblende fokussiert wird und Lichtverluste so gering wie möglich sind. Zum anderen ist die Sammeloptik vorteilhaft so ausgelegt, dass das Emissionslicht mindestens entlang eines Teils des Emissionslichtpfades zwischen dem Lochspiegel und dem Detektor als paralleles Strahlenbündel ausgebildet ist, so dass in diesem Bereich optische Maßnahmen am Emissionslicht getroffen werden können, zum Beispiel eine Trennung in unterschiedliche spektrale Wellenlängen durch Einfahren von Strahlteilern und Färb- oder Interferenzfiltern bzw. von dichroit- sehen Strahlteilern in den Emissionslichtpfad, oder eine Trennung der unterschiedlichen Polarisationsebenen des Emissionslichts durch Einfahren von Strahlteilern und gekreuzten Polarisationsfiltern. Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine Einrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 18 vorgeschlagen, die mehrere Lichtquellen und Detektoren umfasst, vorzugsweise in Form einer Reihe von modularen Vorrichtungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 17, deren Detektoren entweder in der zuvor beschriebenen Weise zur gleichzeitigen oder parallelen Gewinnung von jeweils einer Information aus mehreren Proben in unterschisdli- chen Kavitäten der Mikrotiterplatte genutzt werden können, oder alternativ zur gleichzeitigen Gewinnung von mehreren unterschiedlichen Informationen aus einer einzigen Probe in derselben Kavität der Mikrotiterplatte, indem das Emissionslicht aus dieser Probe oder Kavität auf mehrere Emissionslichtpfade aufgeteilt und in mehreren Detektoren parallel hinsichtlich der gewünschten Informationen untersucht wird, wobei zum Beispiel jeder Detektor mit Emissionslicht unterschiedlicher spektraler Wellenlängen oder unterschiedli- eher Polarisation beaufschlagt wird.
Zum Umschalten zwischen den beiden Nutzungsarten weist die Einrichtung bevorzugt mindestens eine Spiegel- oder Strahlteileranordnung auf, die sich wahlweise in den Emissionslichtpfad zwischen einer Probe oder Kavität und einem das Emissionslicht aus der Probe oder Kavität empfangenden Detektor bewegen lässt, um einen Teil des Emissionslichts zu mindestens einem weiteren Detektor zu lenken, oder aus dem Emissionslichtpfad heraus bewegen lässt, um das Emissionslicht aus dieser Probe oder Kavität nur zu einem einzigen Detektor zu lenken und die anderen Detektoren zur gleich- zeitigen Untersuchung anderer Proben oder Kavitäten einzusetzen.
Wenn das Emissionslicht aus einer Probe oder Kavität auf einen ersten Detektor und einen oder mehrere weitere Detektoren aufgeteilt wird, um verschiedene Informationen aus einer einzigen Probe oder Kavität zu gewinnen, ist es zweckmäßig, eine Lichtemission aus denjenigen Proben oder Kavitäten zu vermeiden, in deren Emissionslichtpfad die weiteren Detektoren liegen. Dazu wird bevorzugt mittels eines lichtundurchlässigen Elements der Anregungslichtpfad zu diesen Proben oder Kavitäten blockiert, indem das lichtundurchlässige Element zum Beispiel mittels einer einfachen Schieberoder Schwenkmechanik in den Anregungslichtpfad bewegt wird.
Die Spiegel- oder Strahlteileranordnung umfasst vorzugsweise mindestens einen unter 45 Grad zum Lichtemissionspfad ausgerichteten teildurchlässigen Planspiegel, der jeweils einen Teil des Emissionslichts zu verschiedenen Detektoren durchlässt bzw. reflektiert und der zur Ausblendung unerwünschter spektraler Wellenlängen oder Polarisationsebenen durch einen Interfe- renz- oder Farbfilter bzw. einen Polarisator ergänzt werden kann. Alternativ können zur Untersuchung unterschiedlicher Wellenlängen aus einer einzigen Probe oder Kavität dichroitische Planspiegel in den Emissionslichtpfad vor den jeweiligen Detektoren bewegt werden.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 : eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zur optischen Untersuchung von Proben in Kavitäten von Mikrotiterplatten mit einer Lichtquelle und einem Detektor;
Fig. 2: eine vergrößerte Ansicht des Ausschnitts A der Fig. 1;
Fig. 3: eine schematische Ansicht einer Einrichtung zur optischen Untersu- chung von Proben in Kavitäten von Mikrotiterplatten mit einer
Mehrzahl von Lichtquellen und Detektoren.
Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung 2 dient zur optischen Untersuchung von Proben 4 in Kavitäten 6 einer Mikrotiterplatte 8, zum Beispiel zur Messung der Konzentration von Inhaltsstoffen von biologischen oder biochemischen Proben 4 durch Anregung mit Anregungslicht (in Fig. 1 und 2 in durchgezogenen Linien dargestellt) und Messung des bei der Anregung von den Pro- ben emittierten Emissionslichts (in Fig. 1 und 2 in punktierten Linien dargestellt), wie zum Beispiel Fluoreszenzlicht.
Um nacheinander die Proben 4 in den Kavitäten 6 zu untersuchen, die in einem Raster auf der Mikrotiterplatte 8 angeordnet sind, kann mit Hilfe eines nicht dargestellten Stellantriebs entweder die Mikrotiterplatte 8 schrittweise an der Vorrichtung 2 vorbei geschoben oder alternativ die Vorrichtung 2 schrittweise über die einzelnen Kavitäten 8 der Mikrotiterplatte 8 verfahren werden, wobei eine Bewegung in zwei zueinander senkrechten Richtungen möglich ist, wie durch Doppelpfeile P1 und P2 in Fig. 3 angezeigt.
Die Vorrichtung 2 besteht im Wesentlichen aus einer Lichtquelle 10 zur Erzeugung des Anregungslichts, einem Anregungslichtpfad 12 zwischen der Lichtquelle 10 und den zu untersuchenden Proben 4, der durch eine Sam- meloptik 14, einen Lichtleiter 16, eine Sammellinse 18 mit kurzer Brennweite, das Loch 20 eines Lochspiegels 22 und hinter dem Lochspiegel 22 senkrecht zur Ebene der Mikrotiterplatte 8 durch eine in geringem Abstand über der Mikrotiterplatte 8 angeordnete Objektiv- bzw. Sammellinse 24 bis in eine mit der Probe 4 gefüllte Kavität 6 verläuft, sowie einem Emissionslichtpfad 26 zwischen der zu untersuchenden Probe 4 und einem das Emissionslicht erfassenden und messenden Detektor 28, wobei der Emissionslichtpfad 26 von der Probe 4 aus ebenfalls durch die Objektivlinse 24 bis zum Lochspiegel 22 verläuft, wo das Emissionslicht von einer das Loch umgebenden, der Mikrotiterplatte 8 zugewandten Spiegelfläche 30 des Lochspiegels 22 seitlich abgelenkt wird und beim Hindurchtritt durch eine empfängerseitige Sammeloptik 32 auf eine Öffnung 36 einer vor dem Detektor 28 angeordneten Lochblende 34 fokussiert wird, bevor es in den Detektor 28 eintritt.
Wie weiter oben ausgeführt, kann anstelle eines Lochspiegels auch ein mit einem Loch 20 versehenes Beugungsgitter (Lochgitter 22) eingesetzt werden, welches auftreffendes Licht entsprechend der Wellenlänge beugt. Dabei wird das unerwünschte Anregungslicht unter einem anderen Winkel ge- beugt, so dass dieses auf den Rand der Blende 34 fällt und daher geblockt wird. Das Gitter 22 verbessert somit die Blockung ähnlich wie ein dichroiti- scher Spiegel. Der Vorteil besteht darin, dass das Gitter 22 durch Drehen um eine senkrecht zur Bildebene angeordnete Achse auf die gewünschte WeI- lenlänge eingestellt werden kann, während die Wellenlängeneigenschaften eines Dichroits fest vorgegeben sind.
Die Lichtquelle 10 ist als Blitzlicht ausgebildet, das in Synchronisation mit einer Bewegung der Mikrotiterplatte 8 in Bezug zur Vorrichtung 2 gepulste Blitze mit hoher Lichtintensität emittiert, so dass die Anzahl der in jede Kavi- tät 6 zugeführten Lichtblitze identisch ist, jedoch ebenso wie die Intensität der Blitze einstellbar ist, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verändern. Auch der zeitliche Abstand der Blitze kann verändert werden, zum Beispiel zur Messung von zeitverzögerter Fluoreszenz. Weiter kann als Lichtquelle 10 bei Bedarf auch ein Laser verwendet werden, zum Beispiel zur Anregung bestimmter Fluorophore, wobei der Laser alternativ oder zusätzlich zum Blitzlicht vorgesehen und im zuletzt genannten Fall in den Anregungslichtpfad 12 eingeschwenkt werden kann, um das von Laser emittierte Licht in die Lichteintrittsfläche 38 des Lichtleiters 16 einzukoppeln.
Die hinter der Lichtquelle 10 im Anregungslichtpfad 12 angeordnete Sammeloptik 14 dient dazu, das von der Lichtquelle 10 emittierte Licht auf die Lichteintrittsfläche 38 des Lichtleiters 16 zu fokussieren, mit dessen Hilfe ausgehend von der Lichtquelle 10 verschiedene Strahlungspfade realisiert werden können. Die Sammeloptik 14 umfasst zwei konvexe Linsen 40, 42, zwischen denen das Anregungslicht in Form eines parallelen Strahlenbündels verläuft, so dass in diesem Bereich bei Bedarf einer von mehreren Filtern 44 (nur einer dargestellt) mittels eines elektromechanischen Stellorgans (nicht dargestellt) in den Anregungslichtpfad 12 eingefahren werden kann, zum Beispiel ein Polarisationsfilter, wenn die zu untersuchenden Proben 4 mit polarisiertem Licht angeregt werden sollen, oder ein Interferenzfilter, wenn die Proben 4 mit Licht einer ausgewählten Wellenlänge angeregt werden sollen.
Der Lichtleiter 16 kann einen Lichtleiterstab (nicht dargestellt) zur Homogeni- sierung einer ungleichmäßigen Leuchtdichte der Lichtquelle 10 umfassen. Die Lichtaustrittsfläche 46 an seinem von der Lichtquelle 10 abgewandten Stirnende wird von der Sammellinse 18 mit kurzer Brennweite durch das Loch 20 im Lochspiegel 22 hindurch in einem objektseitigen Bildpunkt F1 zwischen dem Lochspiegel 22 und der Objektivlinse 24 abgebildet.
Der Lochspiegel 22 ist als Planspiegel ausgebildet, um Abberationen des von der objektseitigen Spiegelfläche 30 reflektierten Emissionslichts zu vermeiden, und ist unter einem Winkel von 45 Grad zur Ebene der Mikroti- terplatte 8 geneigt, so dass die optische Achse des Emissionslichtpfades 26 hinter dem Lochspiegel 22 zur optischen Achse des Anregungslichtpfades 12 zwischen den Linsen 18 und 24 senkrecht ist. Die Größe des Lochs 20 in der Mitte des Lochspiegels 22 beträgt etwa 5 % von dessen Spiegelfläche 30.
Die Sammellinse 18 bündelt das mit breiten Lichtaustrittswinkel aus der Lichtaustrittsfläche 46 des Lichtleiters 16 austretende Anregungslicht zu einem schlanken Anregungslichtkegel, der trotz der geringen Größe des Lochs 20 im Lochspiegel 22 ohne Lichtverlust vollständig durch dieses hindurchtritt, die Objektivlinse 24 nicht überstrahlt und sich innerhalb der Probe 24 eben- falls mit einer schlanken Form verjüngt.
Die Objektivlinse 24 ist in einem großen Abstand vom Lochspiegel 22 und vom Bildpunkt F1 und in der Nähe der Ebene der Mikrotiterplatte 8 angeordnet, so dass ihr Brennpunkt oder Fokus F3 im Bereich der zu untersuchen- den Probe 4 innerhalb der jeweiligen Kavität 6 der Mikrotiterplatte 8 liegt, wie am besten in Fig. 2 dargestellt. Mit Hilfe der Objektivlinse 24 kann das Anre- gungslicht auch in kleinste Kavitäten 6 fokussiert werden, wie die Kavitäten 6 einer Mikrotiterplatte 8 mit 1536 Kavitäten.
Die Objektivlinse 24 nimmt das Bild der Lichtaustrittsfläche 46 des Lichtlei- ters 16 auf und bildet es am Boden der Kavität 6 in einem Bildpunkt F2 ab, der sich im Abstand unterhalb des Brennpunkts F3 der Objektivlinse befindet, wie am besten in Fig. 2 dargestellt, so dass der schlanke Anregungslichtkegel innerhalb der Probe 4 sowie zwischen der Objektivlinse 24 und dem Lochspiegel 22 vom breiteren Emissionslichtkegel strahlenoptisch ein- gehüllt wird. t
Durch den größeren Abstand von der Objektivlinse 24 stellt der Bildpunkt F1 im Vergleich zum Bildpunkt F2 eine verkleinerte Abbildung der Lichtaustrittsfläche 46 des Lichtleiters 16 dar, wodurch ein großer Tiefenabbildungsmaß- stab erreicht wird. Dies bedeutet, dass bereits eine kleine Ortsveränderung im Probenvolumen zu einer großen Veränderung des Auftreffpunktes des von diesem Probenvolumen emittierten Lichts auf der Spiegelfläche 30 des Lochspiegels 22 führt. Aus diesem Grund und aufgrund der Einhüllung des Anregungslichtkegels durch den Emissionslichtkegel sowie aufgrund der großen Nähe der Objektivlinse 24 zur Mikrotiterplatte 8 kann nahezu das gesamte Emissionslicht aus der Probe 4 aufgefangen und zum Lochspiegel 22 zurück gelenkt werden, wobei der weitaus größte Teil und insbesondere das Emissionslicht aus dem Bereich des Brennpunkts F3 der Objektivlinse 24 abseits vom Loch 20 auf den Lochspiegel 22 auftrifft und von dort zum Detektor 28 reflektiert wird, was eine hohe Lichtausbeute gewährleistet. Lediglich das Emissionslicht aus einem im unmittelbaren Bereich des Bildpunkts F2 gelegenen Probenvolumen wird von der Objektivlinse 24 wieder durch das Loch 20 im Lochspiegel 22 zurück reflektiert. Somit wird eine sehr effektive Trennung von Anregungslicht und Emissionslicht ermöglicht, ohne dass diese Trennung applikationsspezifisch hinsichtlich verschiedener Wellenlängen wäre. Da sich das Emissionslicht aus dem oberhalb des Bildpunkts F2 gelegenen Brennpunkt F3 der Objektivlinse 24 besonders gut zur Auswertung eignet, ist die empfängerseitige Sammeloptik 32 so ausgelegt, dass sie das von der Spiegelfläche 30 reflektierte Licht auf die vor dem Detektor 28 angeordneten Lochblende 34 fokussiert, deren die Öffnung 36 konfokal zum Brennpunkt F3 der Objektivlinse 24 ist. Auf diese Weise kann das Emissionslicht aus dem Probenvolumen um den Brennpunkt F3 herum mit Hilfe der Lochblsnde 34 selektiert und in den Detektor 28 zugeführt werden, während der Einfall von Streulicht oder Fremdlicht in den Detektor 28 unterdrückt wird.
/ Der Detektor 28 selbst besteht aus einer Fotovervielfacherröhre (Photomulti- pliertube PMT), mit der eine Erfassung sehr geringer Lichtintensitäten möglich ist.
Die empfängerseitige Sammeloptik 32 umfasst zwei im Abstand voneinander angeordnete Sammellinsen 48, 50, von denen die erste, unmittelbar hinter dem Lochspiegel 22 angeordnete Sammellinse 48 eine große Brennweite besitzt, um einen ggf. noch etwas divergenten Emissionslichtkegel zwischen der Objektivlinse 24 und dem Lochspiegel 22 zu einem parallelen Strahlen- bündel zusammenzuführen. Das parallele Strahlenbündel zwischen den beiden im Abstand angeordneten Sammellinsen 48, 50 ermöglicht es, in diesem Bereich wie bei 52 Interferenzfilter, Polarisatoren, Strahlteiler oder andere optische Komponenten mit elektromechanischen Stellorganen (in Fig. 1 nicht dargestellt) in den Emissionslichtpfad 26 hinter dem Lochspiegel 22 einzu- schwenken oder einzufahren, um das Emissionslicht Wellenlängen- oder polarisationsselektiv auf den Detektor 28 zu lenken oder einen Teil des Emissionslichts aus dem Strahlengang auszukoppeln, um es zum Beispiel auf andere Detektoren zu lenken, wie nachfolgend unter Bezugnahme auf Fig. 3 beschrieben wird. Denkbar ist es auch, dass anstelle eines Anregungsfilters ein geeigneter Monochromator verwendet wird. Ebenso kann im Emissionsstrahlengang ein Monochromator eingesetzt werden. Die in Fig. 3 dargestellte Einrichtung 54 umfasst einem Mehrzahl von Vorrichtungen 2 von der zuvor unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschriebenen Art, beispielsweise insgesamt sechs oder acht modulartig nebeneinander angeordnete Vorrichtungen 2, von denen jedoch zur Vereinfachung in Fig. 3 nur zwei in Teilen dargestellt und nachfolgend auch nur zwei beschrieben sind. Dabei versteht sich, dass die für die beiden Vorrichtungen 2 beschriebene Funktionsweise auch für eine aus mehr als zwei Vorrichtungen 2 bestehende oder aus modifizierten Vorrichtungen 2 bestehende Einrichtung 54 gilt.
Die in Fig. 3 dargestellte und nachfolgend beschriebene Einrichtung 54 ermöglicht es, mit Hilfe der beiden Detektoren 28 der Vorrichtungen 2 wahlweise eine parallele, d.h. gleichzeitige Untersuchung zweier Proben 4 oder eine parallele, d.h. gleichzeitige Untersuchung zweier unterschiedlicher Eigenschaften einer einzigen Probe 4 vorzunehmen. Zu diesem Zweck um- fasst die Einrichtung 54 eine Spiegelanordnung 56 und ein für Licht undurchlässiges Element 58, die beide mittels eines Stellglieds 60 um eine senkrecht zu den Lichtpfaden 12, 26 der beiden Vorrichtungen 2 ausgerichtete Achse 62 verschwenkbar oder alternativ in Richtung des Doppelpfeils entlang der Achse 60 verschiebbar sind, so dass sich zur Umschaltung von einer paralle- len Untersuchung zweier Proben 4 zu einer parallelen Untersuchung zweier unterschiedlicher Eigenschaften einer Probe 4 durch Betätigung des Stellglieds 60 die Spiegelanordnung 54 in den Emissionslichtpfad 26 der beiden Vorrichtungen 2 bewegen lässt während das lichtundurchlässige Element 58 in den Anregungslichtpfad 12 von einer der beiden Vorrichtungen 2 beweg- bar ist.
Wie in Fig. 3 dargestellt, umfasst die Spiegelanordnung 54 einen Stahlteilerspiegel 64 und einen Rückkopplungsspiegel 66, die bei der Umschaltung jeweils im Bereich des parallelen Strahlenbündels zwischen den Linsen 48, 50 der Sammeloptik 32 (in Fig. 3 nicht dargestellt) vor den Detektor 28 der ersten bzw. zweiten Vorrichtung 2 bewegt werden. Bei dem Strahlteilerspiegel 64 und bei dem Rückkopplungsspiegel 66 handelt es sich um Planspie- gel, die unter einem Winkel von 45 Grad zur optischen Achse im Emissionslichtpfad 12 der ersten Vorrichtung 2 angeordnet sind, so dass der Strahlteilerspiegel 64 einen Teil des Emissionslichtes dieser Vorrichtung 2 zum Rückkopplungsspiegel 66 reflektiert, der ihn wiederum in den Detektor 28 der zweiten Vorrichtung 2 reflektiert.
Je nach Art der zu untersuchenden Eigenschaften der Probe 4 können zwischen den Spiegel 64, 66 und den zugehörigen Detektor 28 entweder unterschiedliche Färb- oder Interferenzfilter 68 oder Polarisationsfilter mit zuein- ander senkrechten Polarisationsebenen eingeschwenkt werden. Zur Trennung von unterschiedlichen spektralen Wellenlängen des Emissionslichts können an Stelle von teildurchlässigen Spiegeln und Farbfiltern auch dichroi- tische Spiegel verwendet werden.
Grundsätzlich ist es auch möglich, den Planspiegel 66 durch ein Plangitter zu ersetzen, wie es weiter oben bereits beschrieben wurde.
Das lichtundurchlässige Element 58 dient in der in Fig. 3 dargestellten Stellung der Spiegelanordnung 54 zur Unterbrechung des Anregungslichtpfades 12 der zweiten Vorrichtung 2, so dass aus der Lichtquelle 10 (nicht dargestellt) dieser Vorrichtung kein Licht in die am Ende des Anregungslichtpfades gelegene Kavität 8 eingestrahlt wird.
Wie durch die Doppelpfeile P1 und P2 angezeigt, ist die Mikrotiterplatte 8 in Bezug zur Einrichtung 54 in zwei zueinander senkrechten Richtungen beweglich, um die Kavitäten 6 der Platte 8 nacheinander in den Anregungslichtpfad 12 von einer der beiden Vorrichtungen 2 zu bringen, so dass von den Detektoren 28 der beiden Vorrichtungen 2 entweder zur schnelleren Bearbeitung der Proben 4 gleichzeitig das Emissionslicht aus zwei im Abstand voneinander angeordneten Kavitäten 6 erfasst und ausgewertet werden kann, oder alternativ, zum Beispiel zur Bildung eines Signalverhältnisses, das Emissionslicht aus einer einzigen Kavität 6 der Platte 8 in unterschiedli- che spektrale Wellenlängen oder unterschiedliche Polarisationsebenen getrennt und diese getrennten Wellenlängen oder Polarisationsebenen gleichzeitig untersucht werden können.
Wie in Fig. 3 dargestellt, beträgt der Abstand AL zwischen den benachbarten Anregungslichtpfaden 12 der beiden Vorrichtungen 2 oberhalb der Platte 8 ein ganzzahliges Vielfaches des Abstands Aκ von benachbarten Kavitäten 8 der Mikrotiterplatte 8, so dass das im EPI-Mode senkrecht von oben her auf die Platte 8 einfallende Anregungslicht beider Vorrichtungen 2 nach jeder Verschiebung der Platte 8 in Richtung der Pfeile P1 oder P2 genau in die Mitten zweier im Abstand angeordneter Kavitäten 8 fokussiert wird und das Emissionslicht der darin befindlichen Proben 4 in der zuvor beschriebenen Weise zum Detektor 28 der jeweiligen Vorrichtung 2 geleitet werden kann. Auf diese Weise kann die Mikrotiterplatte 8 rasterartig mit dem Anregungs- licht der Vorrichtungen 2 abgetastet werden.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur optischen Untersuchung einer Mehrzahl von Proben in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (8), die sich nacheinander in einen Anregungslichtpfad (12) einer Anregungslicht emittierenden Lichtquelle
(10) bringen lassen und dabei Emissionslicht über einen Emissionslichtpfad (26) zu einem Detektor (28) emittiere^ dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Lichtquelle (10) und dem Detektor (28) ein Lochspiegel (22) derart im Anregungslichtpfad (12) und im Emissions- lichtpfad (26) angeordnet ist, dass Anregungslicht durch das Loch (20) des Lochspiegels (22) auf die zu untersuchende Probe (4) fällt und E- missionslicht aus der Probe (4) von einer das Loch (20) umgebenden Spiegelfläche (30) des Lochspiegels (22) reflektiert wird, um es getrennt vom Anregungslicht zum Detektor (28) zu lenken, und dass zwi- sehen dem Lochspiegel (22) und der Mikrotiterplatte (8) eine Objektivlinse (24) angeordnet ist, deren Brennpunkt (F3) im Bereich der zu untersuchenden Probe (4) liegt.
2. Vorrichtung zur optischen Untersuchung einer Mehrzahl von Proben in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (8), die sich nacheinander in einen
Anregungslichtpfad (12) einer Anregungslicht emittierenden Lichtquelle (10) bringen lassen und dabei Emissionslicht über einen Emissionslichtpfad (26) zu einem Detektor (28) emittieren, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Lichtquelle (10) und dem Detektor (28) ein Lochgitter (22) derart im Anregungslichtpfad (12) und im Emissionslichtpfad (26) angeordnet ist, dass Anregungslicht durch das Loch (20) des Lochgitters (22) auf die zu untersuchende Probe (4) fällt und Emissionslicht aus der Probe (4) von einer das Loch (20) umgebenden Gitterfläche (30) des Lochgitters (22) gebeugt wird, um es getrennt vom Anregungslicht zum Detektor (28) zu lenken, und dass zwischen dem
Lochgitter (22) und der Mikrotiterplatte (8) eine Objektivlinse (24) ange- ordnet ist, deren Brennpunkt (F3) im Bereich der zu untersuchenden Probe (4) liegt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Lochspiegel (22) ein insbesondere dichroitischer Planspiegel ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Planspiegel unter einem Winkel von 45 Grad in Bezug zu einer optischen Achse des Anregungslichtpfades (12) geneigt ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Lochgitter (22) ein Plangitter ist, und dass das Plangitter unter einem nach Maßgabe der Wellenlänge des Emissionslichts eingestellten Winkel in Bezug zu einer optischen Achse des Anregungslichtpfades (12) geneigt ist.
6. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Anregungslichtpfad (12) vor dem Lochspiegel bzw. Lochgitter (22) eine Sammeloptik (18) angeordnet ist, die das An- regungslicht durch das Loch (20) hindurch auf einen hinter dem Lochspiegel bzw. Lochgitter (22) gelegenen Bildpunkt (F1) fokussiert.
7. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Objektivlinse (24) das Anregungslicht in einem unterhalb des Brennpunkts (F3) im Bereich der Probe (4) liegenden
Bildpunkt (F2) fokussiert.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand des Bildpunktes (F1 ) von der Objektivlinse (24) um mehr als das Dreifache größer ist als der Abstand des Bildpunkts (F2) von der Objektivlinse (24).
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Sammeloptik (18) mindestens ein Lichtleiter (16) im Anregungslichtpfad (12) angeordnet ist.
10. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Detektor (28) eine Lochblende (34) im Emissionslichtpfad (26) angeordnet ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Lochblende (34) eine Sammeloptik (32) im Emissionslichtpfad (26) angeordnet ist, deren Brennpunkt (F4) in der Ebene der 'Lochblende (34) liegt.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Brennpunkt (F4) der Sammeloptik (32) bzw. eine Öffnung (36) der
Lochblende (34) zum Brennpunkt (F3) der Objektivlinse (24) konfokal ist.
13. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, dass der Anregungslichtpfad (12) zwischen dem Lochspiegel bzw. Lochgitter (22) und der Mikrotiterplatte (8) vom Emissionslichtpfad (26) umschlossen wird.
14. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, dass das Emissionslicht mindestens entlang eines Teils des Emissionslichtpfades (26) zwischen dem Lochspiegel bzw. Lochgitter (22) und dem Detektor (28) als paralleles Strahlenbündel ausgebildet ist.
15. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Interferenz- oder Farbfilter (44, 52) in den Anregungslichtpfad (12) vor dem Lochspiegel bzw. Lochgitter (22) und/oder in den Emissionslichtpfad (26) hinter dem Lochspiegel bzw. Lochgitter (22) bewegbar ist.
16. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, dass mindestens ein Polarisator in den Anregungslichtpfad (12) vor dem Lochspiege! bzw. Lochgitter (22) und/oder in den Emissionslichtpfad (26) hinter dem Lochspiegel bzw. Loc-hgitter (22) bewegbar ist.
17. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Strahlteiler (64) in den Emissionslichtpfad (26) hinter dem Lochspiegel bzw. Lochgitter (22) bewegbar ist.
18. Einrichtung zur optischen Untersuchung einer Mehrzahl von Proben in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die sich jeweils gleichzeitig in Anregungslichtpfade von Anregungslicht emittierenden Lichtquellen bringen lassen und dabei Emissionslicht über Emissionslichtpfade zu zugehörigen Detektoren emittieren, dadurch gekennzeichnet, dass wahlweise mehrere Detektoren (28) gleichzeitig mit Emissionslicht aus einer einzi- gen Probe (4) bzw. Vertiefung (6) oder mit Emissionslicht aus mehreren
Proben (4) bzw. Vertiefungen (6) beaufschlagbar sind.
19. Einrichtung nach Anspruch 18, gekennzeichnet durch eine in den E- missionslichtpfad (26) zu einem der Detektoren (28) bewegliche Spie- gel- oder Strahlteileranordnung (54), die einen Teil des zu diesem Detektor (28) gelenkten Emissionslichts zu mindestens einem anderen der Detektoren (28) ablenkt.
20. Einrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Spiegel- oder Strahlteileranordnung (56) mindestens einen Strahlteilerspiegel (64) umfasst.
21. Einrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteilerspiegel (64) ein teildurchlässiger Planspiegel ist.
22. Einrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteilerspiegel ein dichroitischer Planspiegel ist.
23. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 22. dadurch gekeπn.= zeichnet, dass die Spiegel- oder Strahlteileranordnung (56) entlang eines Teils des Emissionslichtpfades (26) in den Emissionslichtpfad (26) beweglich ist, in dem das Emissionslicht als paralleles Strahlenbündel ausgebildet ist.
24. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Spiegel- oder Strahlteileranordnung (56) und den Detektoren gekreuzte Polarisatoren in den Emissionslichtpfad
(26) bewegbar sind.
25. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 24, gekennzeichnet durch ein lichtundurchlässiges Element (58), das in den Anregungs- lichtpfad (12) oder den Emissionslichtpfad (26) des mindestens einen anderen Detektors (28) beweglich ist.
26. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand (AL) zwischen optischen Achsen von be- nachbarten Anregungs- und/oder Emissionslichtpfaden (12, 26) ein ganzzahliges Vielfaches des Abstands (Aκ) von benachbarten Vertiefungen (6) der Mikrotiterplatte (8) beträgt.
PCT/EP2006/003794 2005-04-25 2006-04-04 Vorrichtung zur optischen untersuchung einer mehrzahl von proben in vertiefungen einer mikrotiterplatte Ceased WO2006114266A2 (de)

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