WO2006136892A2 - Neuartige cherlasky - fusionsproteine enthalten antikorperbindeproteine oder ihre regionen - Google Patents

Neuartige cherlasky - fusionsproteine enthalten antikorperbindeproteine oder ihre regionen Download PDF

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the invention relates to the fields of molecular biology, immunology and biotechnology.
  • fusion proteins comprising Fc region binding domains, such as e.g. Staphylococcal protein A (SPA) or Fc receptor ecto or ligand binding domain and sequence - specific nucleic acid binding domains as well as the fusion proteins containing antibody binding regions such as preferably staphylococcal protein A (SPA) 5 extracellular region of the Fc receptor CD 64 or its regions and Microtubule binding regions, preferably gephyrin, tau, MAP or describe their regions.
  • Fc region binding domains such as e.g. Staphylococcal protein A (SPA) or Fc receptor ecto or ligand binding domain and sequence - specific nucleic acid binding domains
  • SPA staphylococcal protein A
  • SPA staphylococcal protein A
  • Microtubule binding regions preferably gephyrin, tau, MAP or describe their regions.
  • the broad spectrum and uses of fusion proteins containing antibody binding regions have not yet been worked out.
  • the object of the invention is novel substances with novel properties and uses that bind antibodies, arrange, enhance their effect and can bind their antigens.
  • the object of the invention is achieved by novel fusion proteins containing antibody binding regions according to the invention.
  • Fusion Proteins Containing Antibody-binding Proteins or their regions include novel classes of substances, materials, medicines, diagnostic system, adhesives, dyes and markers, and many other substances and systems.
  • Elevated levels of IgE antibodies include asthma, atopic dermatitis, some allergies and inflammation.
  • the goal of certain therapies is therefore to reduce IgE levels, ie to develop drugs that remove IgE molecules and thereby lower their concentration.
  • Anti-IgE antibodies from Genentech are known under the tradename Xolair. Since the removal of IgE by antibodies by macrophages or their activation should take place and they release inflammatory factors even during activation, the effect of anti - IgE antibodies is not as effective as expected.
  • Cherkasky fusion proteins containing IgE antibody binding regions and hydrophilic regions can bind IgE antibodies and remove them from an inflammatory site through hydrophilic regions with the circulation, without relying on the activation of macrophages. This allows the treatment to be carried out more effectively and with fewer side effects.
  • the receptors of the fusion proteins preferably bind inflammatory factors such as TNF-alpha, C 5a, C3a and C4a. These fusion proteins thus have a double effect.
  • the binding of the IgE antibodies to their receptors is blocked by binding to fusion proteins according to the invention or example 2, on the other hand inflammatory factors such as TNF-alpha which are released are bound to the receptor regions of the fusion proteins.
  • the anti-inflammatory double action can provide a more effective treatment with fewer side effects.
  • Enzymes which are preferably DNA sen, DNAse 1, S l endonuclease, catlase or peroxidase, also have an antiinflammatory and soothing effect on systemic lupus erythematosus (SLE).
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • the anti-inflammatory double action of the fusion proteins according to this example is therefore similar to the double action according to Example 2.
  • fusion proteins have a triple antiinflammatory effect of the fusion proteins described in Examples 2 and 3 when enzymes are DNA, S l are endonuclease, catalase, peroxidase or other antiinflammatory enzymes, and receptors such as e.g. TNF alpha receptor, C5a, C3a, C4a receptors or other receptors that bind to inflammatory factors.
  • enzymes are DNA
  • S l are endonuclease, catalase, peroxidase or other antiinflammatory enzymes
  • receptors such as e.g. TNF alpha receptor, C5a, C3a, C4a receptors or other receptors that bind to inflammatory factors.
  • antibodies can e.g. IgG or IgE antibodies are specifically labeled.
  • the main advantage of labeling the antibodies by these fusion proteins is the gene attachment.
  • An example of a fluorine-resistant protein is e.g. GFP (Green Fluorescent Protein) or its region.
  • fusion proteins complexed with metal atoms or ions, can be directed by magnetic fields. This solves the problem of molecular orientation.
  • Metal binding proteins are e.g. Astacin (from Astacus fish), ferritin, ceruloplasmin, a cysteine rich region, and others. Protein or its regions.
  • the fusion proteins can be labeled and oriented, which is advantageous, for example, in the isolation and purification of the corresponding antigens of the antibodies bound to fusion proteins.
  • fusion proteins may bind to a polymer, preferably biopolymer such as e.g. a DNA sequence or a polysaccharide such as cellulose, chitin, pectin, starch, bind by polymer binding region through antibody binding region e.g. IgG or monoclonal antibodies bind and be guided or oriented by metal ions and atoms complexed metal binding domain.
  • a polymer preferably biopolymer such as e.g. a DNA sequence or a polysaccharide such as cellulose, chitin, pectin, starch
  • bind by polymer binding region through antibody binding region e.g. IgG or monoclonal antibodies bind and be guided or oriented by metal ions and atoms complexed metal binding domain.
  • Such complexes of fusion proteins and polysaccharides can e.g. for the infiltration of certain substances or substances, preferably antigens, e.g. viral antigens.
  • the antibody binding region is preferably an IgG binding region such as SPA, wherein receptor binds, for example, an inflammatory factor such as TKF alpha, C5a, C4a or C3a.
  • an inflammatory factor such as TKF alpha, C5a, C4a or C3a.
  • Ligands are e.g. C3b or C4b Proteins of the immune system or their regions, which bind to CR 1 receptors of the erythrocytes, and in the Opsoni ⁇ rung and the removal of immune complexes are involved.
  • Such fusion proteins can be used to detect antibodies such as IgE in inflammation or IgG autoantibodies, e.g. in Epidermolysis bullosa acquesita (EBA) and be discharged and disposed of in alternative ways, which leads to alleviation.
  • Receptors are e.g. Receptors of inflammatory factors such as TNF alpha, ligands are e.g. C3b and C4b or their regions. These fusions have the double anti-inflammatory effect as the proteins described in Examples 2-4, 11 and 12.
  • Receptors are e.g. Inflammatory Factor - Receptors and enzymes such as DNAsel, Sl endonuclease, kalalase or peroxidase and have anti-inflammatory.
  • the additional binding of the antibodies IgE or IgG increases the anti-inflammatory effect of the fusion proteins according to this example.
  • the autoantibodies If there are no or only a few or in low concentration, the autoantibodies, the autoantigens corresponding regions of the fusion proteins are not bound accordingly and the multimolecular complex does not arise. The precipitation in your measure is not observed.
  • animal proteins such as caseins or those of plant origin such as vicilins, legumines, gliadin, glutenin, lupine, Avenine, Secaline, Hordeine, Trifoliin can be used as storage proteins.
  • the use of these fusion proteins or fusion protein - antibody complexes consists in novel substances that are amorphous or elastic, and can recognize and bind certain antigens preferably on the surface. Such substances can preferably be used as novel antigen-specific filters, or applied as security features to certain surfaces.
  • Structural proteins may preferably be selected from the following proteins: Lamprin, a cell protein, resilin, abducin, crystalline alpha, beta, gamma, collagen or keratin.
  • Example 18 The uses are similar to those in Example 18, where the fabric may be elastic or solid.
  • fusion proteins containing antibody binding proteins or their regions and plant proteins such as e.g. Phloem protein 1 (PPl) from cucurbitas, fish proteins such as e.g. Astacin from Astacus, neuronal proteins such as e.g. GFAP, MBP, (myelin basic protein), polymer binding protein - enzyme - fusion, wherein the polymer binding region preferably comprises a cellulosic binding region, e.g.
  • Cip A is; rubredoxin; which is a heat stable protein, antifreeze protein or glycoprotein, a serine or serine rich region, a laminin, actin, myosin, a cytokine, an interleukin, a blood protein, e.g.
  • Serum albumins a transprotein, a basic protein or its region, an acidic protein or its region, a spacer, a hydrophobic protein or its region, a hydrophilic protein or its region, a cell protein, a nuclear protein or its regions, a neurofilament or its region , a viral protein such as phage T4, Tobacco mosaic virus TMV, an opsonin, CRP or C - reactive protein, MBP (mannose binding protein), nucleic acid binding proteins or their regions, LH, FSH, vicilin like protein or another protein or its regions.
  • the fusion proteins or fusion protein-antibody complexes can be used as novel substances for different purposes. All have elastic, amorphous or solid mechanical properties and specific binding capacity of the antibodies.
  • fusion protein-antibody complexes can recognize certain antigens and can be used as a basis for sensors. Once these fusion protein-antibody complexes conduct electrical current, and antibodies specifically recognize their antigens, the conductivity is slightly changed so that this change can be easily registered and measured. This is the basis for the construction of novel diagnostic, test; Control - sensor - and alarm or alarm systems that can be reduced or miniaturized very much and can work much more efficiently than electronic systems with immobilized antibodies, because with big ones Concentrations of fusion proteins or fusion protein - antibody complexes already few antigens, such as dangerous toxins such as anthrax, botulinus, or tetanus toxins, viruses such as HIV or Ebola virus, bacteria such as Bacillus anthracis, for registration in the interaction with the bound antibodies and measurement or sufficient.
  • dangerous toxins such as anthrax, botulinus, or tetanus toxins
  • viruses such as HIV or Ebola virus
  • bacteria such as Bacillus anthracis
  • the bound antibodies or the fusion protein-antibody complexes form an amorphous or elastic mass, which can also comply with salts and represents the sensor component of the registration devices according to this invention.
  • This mass conducts electrical current and any interaction of the antigens with the bound antibodies of the fusion protein-antibody complexes alters the current and resistance. These changes are registered and evaluated, which leads to a meaningful result.
  • Fig. Ia there is shown a system for making diagnoses, controls and tests to detect or register certain antigens, e.g. HI V - viruses, bacteria, proteins, protozoa, or other molecules, microorganisms, or cells or substances, shown schematically.
  • the system contains the registration body 7, which represents a mass consisting of antibody-fusion protein complexes, which are preferably applied to a substrate.
  • the registration body 7 contains antibodies 1, which are bound to the fusion proteins, consisting of antibody binding domains 14 and storage proteins 10, or structure or other proteins.
  • the registration body 7 is connected by the line 22 to the current amplifier 6 and the evaluation system or to the computer 5 for evaluating the changes of electrical signals.
  • Fig. Ib the interaction of antigen 2 is shown schematically, which is e.g. HIV virus is, with the antibodies 1, bound to the fusion proteins consisting of the antibody binding regions 14 and the storage proteins 10.
  • antigen 2 is shown schematically, which is e.g. HIV virus is, with the antibodies 1, bound to the fusion proteins consisting of the antibody binding regions 14 and the storage proteins 10.
  • FIG. 2 a shows the fusion protein-antibody complex which binds to CR 1 receptor 21, the erythrocyte 19.
  • the fusion protein-antibody complex consists of the fusion protein containing antibody binding domain 14 and the specific ligand 23 C3b or C4b, and antibody 1.
  • an antigen can be removed and disposed of in an inflammatory manner by alternative means.
  • the fusion protein-antibody 1-ligand 20 complex in FIG. 2b which binds to the erythrocytes 19, contains additional central receptor domain 13, which, for example, binds inflammatory factors such as TNF-alpha and with discharged or mitentscene. In this case, an additional anti-inflammatory effect is achieved.
  • FIG. 3 schematically shows a possible embodiment of the test, diagnosis or control system according to the invention, as well as the corresponding molecular procedure.
  • the antibody for example a monoclonal antibody in FIG. 3a 1 .1, is linked to a polymer such as a nucleic acid sequence or a polysaccharide by the fusion protein containing an antibody binding region and a polymer binding region.
  • An antigen for example a virus, is bound by this antibody in FIG. 3 b 1.1.
  • Optical visualization ( Figure 3c 1.1) is performed by fluorescent fusion protein containing an antibody binding domain - eg SPA and a fluorescent domain eg GFP.
  • the fusion proteins in FIGS. 3a 1.2, b 1 . 2 and c 1.2 contain longer spacer regions, eg polyglycine, to increase the range of the atom.
  • FIGS. 3a 2, b 2 and c 2 Shown in FIGS. 3a 2, b 2 and c 2 and the corresponding test procedure of manual or automatic execution.
  • the pin 25 with the handle 24 contains the molecular surface structure corresponding to the figures a 1.1 or a 1.2.
  • This pen in Fig. 3a is placed in the vessel 26 with a blood sample or serum, for some time e.g. Held for 2 minutes and taken out. Thereafter, this pin (b2) is placed in the solution containing fusion protein-antibody complexes.
  • the fusion proteins consist of antibody binding regions and fluorescent regions.
  • antigens such as HIV, or SARS or hepatitis
  • these are detected and bound by appropriate antibodies of the fusion protein - antibody complexes.
  • the pin After the pin is removed from the sample, it lights up. In order to establish whether this luminescence is either high or medium affinity specific antigen-antibody interactions or nonspecific or low affinity interactions, the stick is placed in water or in a buffer solution and stirred gently, and then removed from the solution ( c2). If the light stays on, the intensity is measured.
  • the illumination is interpreted as follows: The antigens have bound specifically to the antibodies of the fusion proteins, which are bound to polymers and these are bound to the lateral surface of the pen. The fusion protein-antibody complexes are specifically linked to these antigens on the other free sides of the antigen.
  • the fusion proteins bind to the antibody binding domains and fluoresce through fluorescent domains.
  • persistent fluorescence means the fact that antigens were present in the blood or serum sample. Should the light after stirring disappear, it means that there were no antigens in the serum or in the blood sample.
  • the fusion proteins in FIGS. 4 a, 4 b and 4 c contain fluorine-resistant regions and can be used as constituents of the sensors because of
  • the fusion protein in FIG. 4 a contains a fluorescent region 18, a
  • Antibody is connected.
  • the fusion protein is bound to a polymer 9 through the polymer binding region 16.
  • the fusion protein in Figure 4b additionally contains a longer spacer region 8, e.g. a polyglycine domain that increases the range.
  • the fusion protein in FIG. 4 c additionally contains a domain of a
  • FIGS. 1-10 Some possible embodiments of the fusion protein-antibody-polymer complexes are shown schematically in FIGS.
  • the fusion protein in FIG. 5.1 contains the polymer binding region 16, and the antibody binding region 14, which is linked to the antibody 1.
  • the fusion protein in FIG. 5.2 additionally contains a spacer region 8.
  • the spacer region of the fusion protein in FIG. 5.3 contains Kniks which are formed by proline in the polyglycine region.
  • the spacer region of the fusion protein in FIG. 5.4 contains a helix.
  • the fusion protein in Figure 5.5 additionally contains a region of a structural protein, storage protein or metal binding protein to increase stability.
  • This fusion protein may contain either a linear ( Figure 5.6), clipped (Figure 5.7) or helical (Figure 5.8) spacer region.
  • the fusion protein in Fig. 5.9 additionally contains two regions, e.g. one of one structure - and the other of a storage protein or a metal binding protein.
  • This fusion protein may contain either a linear (Figure 5.10), clipped (Figure 5.1.1) or helical ( Figure 5.12) spacer region.
  • the fusion protein in Fig. 5.13 contains a terminal domain such as e.g. GFP or a metal binding domain, wherein the middle domain is the polymer binding domain.
  • This fusion protein may contain either a linear (Figure 5.14), clipped ( Figure 5.15) or helical ( Figure 5.16) spacer domain.
  • the fusion protein in Figure 5.17 contains two terminal domains before and after the polymer binding domain, respectively.
  • This fusion protein may contain either a linear ( Figure 5.18), a clipped ( Figure 5.19), or a helical (5.20) spacer region.
  • the fusion protein in Fig. 5.21 contains an intermediate polymer binding region (terms "region” and "domain” are to be understood as synonyms) and in each case two lateral domains, wherein the one N- or C-terminal domain, the antibody binding domain, which is linked to a Antibody is connected.
  • the adjacent domains are e.g. a metal binding domain, the polymer binding domain, a structural protein domain and a fluorescent domain and / or domain of a storage protein to achieve stability, fluorescence and molecular orientation by directing the complexed zones.
  • the cloned domain can e.g.
  • This fusion protein may e.g. either a linear ( Figure 5.22), a clipped ( Figure 5.23), or a helical ( Figure 5.24) domain.
  • the fusion protein in FIG. 6 contains antibody binding domain 14 and metal binding regions 11, and is linked to antibody 1. The antibody can be oriented in solution through the fusion protein and electromagnetic fields.
  • Fig. 7 the complex consisting of antibodies and fusion proteins containing autoantigens or autoantigen regions 15 and antibody binding regions, is shown schematically. These fusion proteins serve to diagnostically determine the presence of certain autoantibodies in blood or serum. If autoantibodies are present, the Fab fragments bind the autoantigen domains of the fusion proteins and the complex is formed.
  • FIG. 8 schematically shows a polymer-antibody-fusion-protein-complex. Fusion proteins contain antibody binding domains 14, polymer binding regions 16, and receptors 17, and are bound to polymer 9 through polymer binding regions 16 and to antibody 1 through antibody binding regions 14.
  • the receptors 17 bind ligands 20.
  • the receptors bind eg inflammatory factors such as TNF-alpha, these correspond to the ligands.
  • FIG. 9 shows the steering of a T cell 4 against a target cell 3 by means of fusion protein-antibody complexes.
  • Antibody .1 binds specifically to a target cell-specific antigen, and the ligand domain 20 binds to the receptor 17 of the T cell.
  • the ligand domain is a region of HLA-B7.1 or B7.2 and elicits T-cell activation, which leads to target cell targeting.
  • the fusion protein in Figure 10 contains a terminal hydrophilic domain consisting of hydrophilic amino acids such as serine to increase the solubility of the polymer-fusion protein-antibody complex.
  • the fusion proteins in FIGS. 11a, b, c, d and e are characterized by an enzyme, eg protease, nuclease, lipase, catalase, peroxidase or another enzyme.
  • sequences for proteins are publicly available and in the Internet e.g. available from the National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda MP, 20894, USA (NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • N - keratin - SPA - C c DNA sequences for keratin and staphylococcal protein A are cloned by PCR or RT - PCR.
  • the fusion protein is composed of PCR products.
  • the PCR primers are designed to be
  • the 5 'and 3' ends of the SPA - PCR product contain EcoRI and Kpnl
  • keratin PCR product is ligated into the appropriate preparatory vector.
  • the vector is treated with Kpnl and Eco RI to inoculate SPA-PCR product.
  • Ligation product is transformed into E. coli, expressed and finally purified.
  • Figure 1 is the amino acid sequence of the fusion protein containing human low affinity receptor for Fc fragment of IgG and human keratin 7 shown.
  • FIG. 2 is the amino acid sequence of the fusion protein containing human low affinity receptor for Fc fragment of IgG and vicilin-like protein shown by Lupinus albus.
  • the receptor domain is 290 amino acids long and the length of the vicilin - like protein is 182 amino acids, so the length of the fusion protein is 472 amino acids.

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Abstract

Neuartige Fusionsproteine enthalten Antikörperbinderegionen und bestimmte andere Regionen und können Komplexe mit Antikörpern bilden. Diese können somit modifiziert und in ihrer Wirkung verstärkt sowie räumlich angeordnet werden.

Description

Neuartige Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbindeproteine oder ihre Regionen
Die Erfindung betrifft die Bereiche der Molekularbiologie, Immunologie und Biotechnologie.
Aus dem Stand der Technik sind Arbeiten und Veröffentlichungen (DE 102 02 191 Al5 DE 103 501 31. A 1, und WO 2005 / 040382 ) bekannt, die Fusionsproteine enthaltend Fc - Region - Bindedomänen wie z. B. Staphylokokken Protein A (SPA) oder Fc Rezeptor Ekto bzw. Ligandbindedomäne und sequenz - spezifische Nukleinsäure - Bindedomänen sowie die Fusionsproteinen, enthaltend Antikörper Binderegionen wie vorzugsweise Staphylokokken - Protein A (SPA)5 extrazelluläre Region des Fc Rezeptors CD 64 oder ihre Regionen und Mikrotubuli Binderegionen, vorzugsweise Gephyrin, Tau, MAP oder ihre Regionen beschreiben. Diese Stoffe können nicht vielfältig eingesetzt werden.
Das breite Spektrum sowie Verwendungen der Fusionsproteinen enthaltend Antikörperbinderegionen sind noch nicht ausgearbeitet worden. Die Aufgabe der Erfindung besteht in neuartigen Stoffen mit neuartigen Eigenschaften und Verwendungen, die Antikörper binden, anordnen, in ihrer Wirkung verstärken und deren Antigene binden können. Die Aufgabe der Erfindung wird durch neuartige Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinderegionen gemäß der Erfindung gelöst. Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinde Proteine oder ihre Regionen umfassen neuartige Klassen von Stoffen, Werkstoffen, Medikamenten, diagnostischen System, Klebstoffen, Färb und Markierungs Stoffen und vielen anderen Substanzen und Systemen. Anhand einiger Beispiele soll die Breite bzw. die Verwendungsbreite und Vorteile dieser Substanzen und derer Verwendung möglichkeiten dargestellt werden. Diese Breite bzw. zahlreiche Verwendungen und Vorteile sind bei Weitem nicht nur auf diese folgende Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend IgE - Antikörperbinderegionen und hydrophile Regionen
Erhöhte Werte von IgE - Antikörpern kennzeichnen unter anderem Asthma, atopisches Ekzem, einige Allergien und Entzündungen. Die Zielsetzung bestimmter Therapien ist deswegen auf Verminderung der IgE - Werten gerichtet, d.h. Medikamente zu entwickeln, die IgE - Moleküle entfernen und dadurch ihre Konzentration senken. Bekannt sind Anti - IgE - Antikörper von Genentech unter dem Handelnamen Xolair. Da die Entfernung der IgE mittels Antikörper durch Makrophagen bzw. derer Aktivierung erfolgen sollte und diese selbst bei der Aktivierung Entzündungsfaktoren freisetzen, ist die Wirkung der Anti - IgE - Antikörper nicht so effektiv wie erwartet.
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend IgE - Antikörperbinderegionen und hydrophile Regionen können IgE - Antikörper binden und durch hydrophile Regionen mit dem Kreislauf aus einer Entzündungsherde entfernen und sind dabei nicht auf die Aktivierung von Makrophagen angewiesen. Dadurch kann die Behandlung effektiver und nebenwirkungsarmer durchgerührt werden.
Beispiel 2
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend IgE - Antikörperbinderegionen und Rezeptoren
Die Aufgabenstellung ist im Beispiel 1 erörtert worden. Die Rezeptoren der Fusionsproteine binden vorzugsweise Entzündungsfaktoren wie TNF - Alpha, C 5a, C3a und C4a. Diese Fusionsproteine besitzen dadurch eine Doppelwirkung. Einerseits wird die Bindung der IgE Antikörper and ihre Rezeptoren durch Bindung an Fusionsproteinen gemäß der Erfindung bzw. dem Beispiel 2 blockiert, andererseits werden Entzündungsfaktoren wie TNF - Alpha, die freigesetzt sind, an die Rezeptorregionen der Fusionsproteinen gebunden. Die entzündungshemmende Doppelwirkung kann eine effektivere und nebenwirkungsärmere Behandlung ermöglichen.
Beispiel 3
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend IgE oder IgG - Antikörperbinderegionen und Enzyme.
Enzyme, die vorzugsweise, DNA sen, DNAse 1, S l Endonuklease, Katlase oder Peroxidase sind, wirken ebenfalls entzündungshemmend sowie lindernd bei der Systemischen Lupus Erythemathosus (SLE).
Die entzündungshemmende Doppelwirkung der Fusionsproteinen nach diesem Beispiel ist also ähnlich wie die Doppelwirkung nach dem Beispiel 2.
Beispiel 4 Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend IgE oder IgG - Antiköφerbinderegionen, Rezeptoren und Enzyme
Diese Fusionsproteine besitzen eine dreifache entzündungshemmende Wirkung der Fusionsproteinen, die in den Beispielen 2 und 3 beschrieben sind, wenn Enzyme DNA sei , S l Endonuklease, Katalase, peroxidase oder andere entzündungshemmende Enzyme sind, und Rezeptoren, wie z.B. TNF Alpha Rezeptor, C5a, C 3a, C4a Rezeptoren oder andere Rezeptoren sind, die Entzündungsfaktoren binden.
Beispiel 5
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antiköφerbinderegionen und fluoreszente Proteinen oder ihre Regionen
Mit Hilfe dieser Fusionsproleinen können Antikörper z.B. IgG oder IgE - Antikörper spezifisch markiert werden. Der Hauptvorteil der Markierung der Antikörper durch diese Fusionsproteinen ist die Genaugkeil. Ein Beispiel für ein fluorestentes Protein ist z.B. GFP (Grünes fluoreszentes Protein) oder seine Region.
Beispiel 6
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antiköφerbinderegionen und Metallbindeproteinen oder ihre Regionen
Diese Fusionsproteinen, koinplexiert mit Metallatoinen oder Ionen, können durch Magnetfelder gelenkt bzw. orientiert werden. Dadurch wird die Aufgabe der molekularen Orientierung gelöst. Metallbindeproteinen sind z.B. Astacin (von Astacus Fischen), Ferritin, Coeruloplasmin, eine Cystein - reiche Region u.v.a. Protein oder ihre Regionen.
Beispiel 7
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinde, Metallbinde - und fluoreszente Regionen
Die Fusionsproteine können markieren und orientiert werden, welches z.B. bei der Isolierung und Reinigung der entsprechenden Antigenen der an Fusionsproteinen gebundenen Antiköφer von Vorteil ist. Beispiel 8
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinde - , Polymerbinde - und Metallbinderegion
Diese Fusionsproteine können sich an ein Polymer, vorzugsweise Biopolymer wie z.B. eine DNA - Sequenz oder ein Polysaccharid wie Cellulose, Chitin, Pektin, Stärke, durch Polymerbinderegion binden, durch Antikö.perbinderegion z.B. IgG bzw. monoklonale Antikörper binden und durch mit Metall ionen and Atome komplexierte Metallbindedomäne gelenkt bzw. orientiert werden. Solche Komplexe aus Fusionsproteinen und Polysacchariden können z.B. zur Infiltration bestimmter Stoffe bzw. Substanzen, vorzugsweise Antigenen z.B. viralen Antigenen, verwendet werden.
Beispiel 9
_Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinde-, Polymerbinde - und fluoreszente Proteine oder ihre Regionen
Die Vorteile und Verwendungen dieser Fusionsproteine sind ähnlich mit denen des Beispiel 8, wobei die fluoreszente Regionen ihre Farbe, Helligkeit oder Intensität in Abhängigkeit von Konzentrationen der gebundenen bzw. infiltrierten Antigenen ändern.
Beispiel 10
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinde -, Metallbinde-, Polymerbinde und fluoreszente Proteine oder ihre Regionen
Die Verwendungen dieser Fusionsproteine sind ähnlich mit denen der Beispiele 8 und 9, wobei durch Metalle, die an Metallbinderegionen gebunden bzw. komplexiert sind, mittels Magnetfelder bessere molekulare Orientierung erreicht wird.
Beispiel 1 1
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinderegion, und mindestens ein Rezeptor oder seine Region
Die Antikörperbinderegion ist vorzugsweise eine IgG Binderegion, wie z.B. SPA, wobei Rezeptor z.B. ein Entzündungsfaktor wie TKF Alpha, C5a, C4a oder C3a bindet. Die Wirkung ist SLE - lindernd und ähnlich, wie in den Beispielen 2 -4 beschrieben ist.
Beispiel 12
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinderegion 211 und Liganden oder ihre Regionen
Liganden sind z.B. C3b oder C4b Proteine des Immunsystems oder ihre Regionen, die an CR 1 - Rezeptoren der Erythrozyten binden, und an der Opsoniβrung und der Beseitigung der Immunkomplexe beteiligt sind. Durch solche Fusionsproteinen können Antikörper wie IgE bei Entzündungen oder IgG - Autoantikörper z.B. bei Epidermolysis bullosa acquesita (EBA) gebunden und auf alternativen Wege abgeführt und entsorgt werden, welches zur Linderung führt.
Beispiel 13
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinderegionen, Rezeptoren und Liganden.
Rezeptoren sind z.B. Rezeptoren der Entzündungsfaktoren wie TNF Alpha, Liganden sind z.B. C3b und C4b oder ihre Regionen. Diese Fusionen haben die doppelte entzündungshemmende Wirkung wie die Proteine die in den Beispielen 2 - 4, 1 1 und 12 beschrieben sind.
Beispiel 14
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinderegionen, Rezeptoren und Enzyme
Rezeptoren sind z.B. Entzündungsfaktor - Rezeptoren und Enzyme wie DNAsel, Sl Endonuklease, Kalalase oder Peroxidase und wirken entzündungshemmend. Die zusätzliche Bindung der Antikörper IgE oder IgG erhöht die entzündungshemmende Wirkung der Fusionsproteinen nach diesem Beispiel.
Beispiel 15
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinderegionen oder ihre Regionen und Autoantigene oder ihre Regionen Diese Fusionsproteine können zur Diagnose der Aiitυimmunerkrankungen verwendet werden. Die Fusionsproteine werden dabei in Serum hinzuge führt. Sollten sich im Serum Autoantikörper in geringen oder größeren Konzentrationen befinden, so binden sie sich an die Autoantigene oder autoantigene Regionen der Fusionsproteine. Die Fc Regionen werden aber Antikörper unspezifϊsch gebunden. Dadurch entsteht der multimolekulare Komplex, der niederschlägt.
Sollten sich keine oder nur wenige bzw. in geringer Konzentration, die Autoantikörper befinden, so werden die Autoantigene Regionen der Fusionsproteine entsprechend nicht gebunden und der multimolekularer Komplex entsteht dem zufolge nicht. Der Niederschlag in dein Maße ist nicht zu beobachten.
Beispiel 16
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinde-, autoanigene und fluoreszente Regionen
Die Verwendung dieser Fusionsproteine als diagnostische Tools bzw. Mittel ist ähnlich wie im Beispiel 15, wobei die Komplexbildung durch fluoreszente Proteine oder ihre Regionen verdeutlicht und besser visualisiert wird.
Beispiel 17
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbinde-, und T - Zell Reaktion auslösende Regionen
Die Modifikation monoklonaler IgG - Antikörper mit diesen Fusionsproteinen führt zur verbesserten Verwendung der Antikörper im Einsatz gegen virale, fungale bakterielle und Protozoenl<ranklieitserreger, weil diese durch T - Zellen angegriffen werden.
Beispiel 18
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbindeproteinen oder ihre Regionen und Speicherproteinen oder ihre Regionen
Als Speicherproteine können z.B. die die tierischer Herkunft wie Kaseine oder die die pflanzlicher Herkunft wie Viciline, Legumine, Gliadin, Glutenin, Lupine, Avenine, Secaline, Hordeine, Trifoliin verwendet werden. Die Verwendung dieser Fusionsproteine bzw. Fusionsprotein - Antikörper - Komplexe besteht in neuartigen Stoffen, die amorph oder elastisch sind, und bestimmte Antigene vorzugsweise an der Oberfläche erkennen und binden können. Solche Stoffe können vorzugsweise als neuartige Antigen - spezifische Filter verwendet werden, oder als Sicherheitsmerkmale auf bestimmte Oberflächen aufgetragen werden.
Beispiel 19
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbindeproteinen oder ihre Regionen und Strukturproteinen oder ihre Regionen
Strukturproteine können vorzugsweise aus folgenden Proteinen ausgewählt werden: Lamprin, ein Zellprotein, Resilin, Abducin, Kristalline Alpha, Beta, Gamma, Kollagen oder Keratin.
Die Verwendungen sind ähnlich wie die im Beispiel 18, wobei der Stoff elastisch oder fest sein kann.
Beispiel 20
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbindeproteinen oder ihre Regionen, Speicherproteinen oder ihre Regionen und Strukturproteine oder ihre Regionen
Die Stoffe bestehend aus diesen Fusionsproteinen bzw. Fusionsprotein - Antikörperkomplexen haben ähnliche Anwendungen und Eigenschaften wie die, die in den Beispielen 18 und 19 beschrieben wurden.
Beispiel 21
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbindeproteinen oder ihre Regionen, Metallbinderegionen und Speicherproteinen oder ihre Regionen
Die Eigenschaften und Verwendungen sind ähnlich wie die die in den Beispielen 18 - 20 beschrieben sind.
Beispiel 22
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbindeproteinen oder ihre Regionen, Metallbinderegionen und Strukturproteinen oder ihre Regionen Die Eigenschaften und Verwendungen sind ähnlich wie die die in den Beispielen 18 und 19 beschrieben sind.
Beispiel 23
Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbindeproteinen oder ihre Regionen, Metallbindeproteinen oder ihre Regionen, Strukturproteinen oder ihre Regionen und Speicherproteine oder ihre Regionen
Die Eigenschaften und Verwendungen sind ähnlich wie die die in den Beispielen 18 und 19 beschrieben sind.
Weitere Beispiele umfassen Fusionsproteine enthaltend Antikörperbindeproteine oder ihre Regionen und pflanzliche Proteine wie z. B. Phloemprotein 1 (PPl) aus Cucurbitas, Fischproteine wie z.B. Astacin von Astacus, Neuronenproteine wie z.B. GFAP, MBP, (Myelin Basistes Protein), Polymerbindeprotein - Enzym - Fusion, wobei die Polymerbinderegion vorzugsweise eine Cellulosebinderegion wie z.B. Cip A ist; Rubredoxin; welches eine hitze stabiles Protein ist, antifreeze Protein oder Glykoprotein, eine Serin oder Serinreiche Region, ein Laminin, Aktin, Myosin, ein Cytokin, ein Interleukin, ein Blutprotein, wie z.B. Serumalbumine, ein Transprotein, ein basisches Protein oder seine Region, ein saures Protein oder seine Region, ein Spacer, ein hydrophobes Protein oder seine Region, ein hydrophiles Protein oder seine Region, ein Zellprotein, ein Zellkernprotein oder ihre Regionen, ein Neurofilament oder seine Region, ein virales Protein wie z.B. vom Phagen T4, Tobacco mosaic virus TMV, ein Opsonin, CRP oder C - Reaktive Protein, MBP (Mannose Bindeprotein), Nukleinsäurebindeproteine oder ihre Regionen, LH, FSH, Vicilin like Protein oder ein anderes Protein oder seine Regionen. Die Fusionsproteine bzw. Fusionsprotein - Antikörper - Komplexe können als neuartige Stoffe für unterschiedliche Zwecke verwendet werden. Alle haben elastische, amorphe oder feste mechanische Eigenschaften und spezifische Bindungsfähigkeit der Antikörper.
An Oberflächen gebundene Antikörper können bestimmte Antigene erkennen und als Basis für Sensoren eingesetzt werden. Sobald diese Fusionsprotein - Antikörper - Komplexe elektrischen Strom leiten und dabei Antikörper ihre Antigene spezifisch erkennen, wird die Leitfähigkeit bzw. der Widerstand leicht geändert, und zwar so dass diese Änderung leicht registriert und gemessen werden kann. Dies ist die Basis für den Bau neuartiger diagnostischen, Test; Kontroll - Sensor - und Alarm bzw. Warnungssystemen, die sehr stark reduziert bzw. miniaturisiert werden können und viel effizienter arbeiten können als elektronische Systeme mit immobilisierten Antikörper, weil bei grossen Konzentrationen der Fusionsproteinen bzw. Fusionsprotein - Antikörper - Komplexe schon wenige Antigene, wie z.B. gefährliche Toxine wie Anthrax, Botulinus, oder Tetanus - Toxine, Viren wie z.B. HIV oder Ebola - Virus, Bakterien wie Bacillus anthracis, für eine Registrierung bei der Interaktion mit den gebundenen Antikörpern und Messung aus bzw. hinreichen. Die gebundene Antikörper bzw. die Fusionsprotein - Antikörper - Komplexe bilden eine amorphe oder elastische Masse, die auch Salze einhalten kann und den Sensorbestandteil der Registrierungsgeräte gemäß dieser Erfindung darstellt. Durch diese Masse wird elektrischer Strom geleitet und jede Interaktion der Antigenen mit den gebundenen Antikörpern der Fusionsprotein - Antikörper - Komplexe ändert die Stromstärke und den Widerstand. Diese Änderungen werden registriert und ausgewertet, welches zu einem aussagekräftigem Ergebnis führt.
In der Fig. Ia ist ein System zur Durchführung von Diagnosen, Kontrollen und Tests zur Feststellung oder Registrierung bestimmter Antigene wie z.B. HI V - Viren, Bakterien, Proteine, Protozoen, oder andere Moleküle, Mikroorganismen, oder Zellen oder Substanzen, schematisch dargestellt. Das System enthält den Registrierkörper 7, welches eine Masse bestehend aus Antikörper - Fusionsprotein - Komplexen, welche vorzugsweise auf einen Substrat aufgetragen sind, darstellt.
Der Registrierkörper 7 enthält Antikörper 1 ,, die an die Fusionsproteine, bestehend aus Antikörperbindedomänen 14 und Speicherproteinen 10, oder Struktur oder andere Proteine gebunden sind. Der Registrierkörper 7 ist durch die Leitung 22 mit dem Stromverstärker 6 und dem Auswertungssystem bzw. mit dem Rechner 5 zur Auswertung der Änderungen elektrischer Signale verbunden.
In der Fig. Ib ist die Interaktion des Antigens 2 schematisch dargestellt, welches z.B. HIV Virus ist, mit den Antikörpern 1, die an die Fusionsproteine bestehend aus den Antikörperbinderegionen 14 und den Speicherproteinen 10 gebunden sind.
In der Fig. 2a ist das Fusionsprotein - Antikörper - Komplex, welcher sich an CR 1 Rezeptor 21, des Erythrozyts 19 bindet, dargestellt. Der Fusionsprotein - Antikörper - Komplex besteht aus dem Fusionsprotein enthaltend Antikörperbindedomäne 14 und dem spezifischen Ligand 23 C3b oder C4b, und Antikörper 1. Durch dieses Fusionsprotein kann ein Antigen auf alternativem Wege entzündungsfrei abgeführt und entsorgt werden. Der Fusionsprotein - Antikörper 1 - Ligand 20 - Komplex, in der Fig. 2b welcher sich an den Erythrozyten 19 bindet, enthält zusätzliche mittlere Rezeptordomäue 13, welche z.B. Entzündungsfaktoren wie TNF - Alpha bindet und mit abführt bzw. mitentsorgt. Dabei wird eine zusätzliche entzündungshemmende Wirkung erreicht.
In den Fig. 3 ist eine mögliche Ausführung des Test -, Diagnose oder Kontroll Systems gemäß der Erfindung, sowie der entsprechende molekularer Vorgang schematisch dargestellt.
Der Antikörper z.B. ein monoklonaler Antikörper in der Fig. 3a 1 .1 ist durch das Fusionsprotein enthaltend eine Antikörperbinderegion und eine Polymerbinderegion, an ein Polymer wie z.B. eine Nukleinsäuresequenz oder ein Polysaccharid gebunden. Ein Antigen z.B. ein Virus wird von diesem Antikörper in der Fig. 3 b 1.1 gebunden. Die optische Visualisierung (Fig. 3c 1.1) erfolgt durch fluoreszenten Fusionsprotein enthaltend eine Antiköiperbindedomäne - z.B. SPA und eine fluoreszente Domäne z.B. GFP. Die Fusionsproteine in den Fig. 3a 1.2, b 1.2 und c 1.2 enthalten längere Spacer - Regionen z.B. Polyglycin, um die Reichsweite zu vergrößern.
In den Fig. 3a 2, b 2 und c 2 und der entsprechende Testvorgang manueller oder automatischer Ausführung dargestellt. Der Stift 25 mit dem Griff 24 enthält die molekulare Oberflächenstruktur, die den Figuren a 1.1 oder a 1.2 entspricht. Dieser Stift in der Fig. 3 a 3 wird in das Gefäß 26 mit einer Blutprobe oder Serum getan, einige Zeit z.B. 2 Minuten gehalten und rausgenommen. Danach wird dieser Stift ( b2 ) in die Lösung enthaltend Fusionsprotein - Antikörper - Komplexe getan. Die Fusionsproteine bestehen aus Antikörperbinderegionen und fluoreszenten Regionen.
Sollten sich in der Blut - oder Serumprobe Antigenen z.B. Viren wie HIV, oder SARS oder Hepatitis enthalten, werden diese durch entsprechende Antikörper der Fusionsprotein - Antikörper - Komplexen erkannt und gebunden. Nachdem der Stift aus der Probe entfernt wird leuchtet dieser. Um nachzuweisen, ob es sich bei dieser Leuchtung entweder um hoch oder mittel - affinen spezifischen Antigen - Antikörper Interaktionen oder um unspezifϊsche oder niederaffine Interaktionen handelt, wird der Stift ins Wasser oder in eine Pufferlösung getan und leicht gerührt, und danach von der Lösung genommen ( c2 ). Bleibt die Leuchtung so wird die Intensität gemessen. Die Leuchtung wird folgenderweise interpretiert: Die Antigene haben sich spezifisch an die Antikörper der Fusionsproteinen gebunden, welche an Polymere gebunden sind und diese sind an die Mantelfläche des Stiftes gebunden. Die Fusionsprotein - Antikörper - Komplexe sind an diese Antigene auf der anderen freien Seiten der Antigens spezifisch gebunden.
Die Fusionsproteine sind mit den Antikörper Bindedomänen an Antikörper gebunden und leuchten durch fluoreszente Domänen. Also bedeutet die anhaltende Fluoreszenz die Tatsache, das sich in der Blutprobe oder Serumprobe Antigene enthaltend waren. Sollte die Leuchtung nach der Rührung verschwinden, bedeutet das, dass im Serum oder in der Blutprobe keine Antigene waren.
Die Fusionsproteine in den Fig. 4 a, 4 b und 4c enthalten fluorestente Regionen und können als Bestandteile der Sensoren verwendet werden, weil durch
Antigen - Antikörper - Interaktionen die Lichtintensität verändert wird. Diese
Änderung wird registriert.
Das Fusionsprotein in der Fig. 4 a enthält eine fluoreszente Region 18, eine
Polymerbinderegion 16, und die Antikörperbinderegion 14, die mit einem
Antikörper verbunden ist.
Das Fusionsprotein ist durch die Polymerbinderegion 16 an ein Polymer 9 gebunden.
Das Fusionsprotein in der Fig. 4b enthält zusätzlich eine längere Spacerregion 8, wie z.B. eine Polyglycindomäne, die die Reichweite erhöht.
Das Fusionsprotein in der Fig. 4 c enthält zusätzlich eine Domäne eines
Speicheiproteins, Struktur oder Metallbindeproteins, um Stabilität zu erhöhen.
In den Figuren 5 sind einige mögliche Ausführungen der Fusionsprotein - Antikörper - Polymer - Komplexen schematisch dargestellt.
Das Fusionsprotein in der Fig. 5.1 enthält die Polymerbinderegion 16, und die Antikörperbinderegion 14, die mit dem Antikörper 1 verbunden ist. Das Fusionsprotein in der Fig. 5.2 enthält zusätzlich eine Spaceregion 8. Die Spacerregion des Fusionsproteins in der Fig. 5.3 enthält Kniks, die durch Proline in der Polyglycin - Region entstehen.
Die Spacerregion des Fusionsproteines in der Fig. 5.4 enthält eine Helix. Das Fusionsprotein in der Fig. 5.5 enthält zusätzlich eine Region eines Strukturproteins, Speicherproteins oder eines Metallbindeproteins um die Stabilität zu erhöhen.
Dieses Fusionsprotein kann entweder eine lineare (Fig. 5.6), geknikte (Fig. 5.7) oder helicale (Fig. 5.8) Spacerregion enthalten.
Das Fusionsprotein in der Fig. 5.9 enthält zusätzlich zwei Regionen z.B. eine von einem Struktur - und die andere von einen Speicherprotein oder einem Metallbindeprotein.
Dieses Fusionsprotein kann entweder eine lineare (Fig. 5.10), geknikte (Fig. 5.1 1 ) oder eine helikale (Fig. 5.12) Spacerregion enthalten. Das Fusionsprotein in der Fig. 5.13 enthält eine terminale Domäne wie z.B. GFP oder eine Metallbindedomäne, wobei die mittlere Domäne, die Polymerbindedomäne ist.
Dieses Fusionsprotein kann entweder eine lineare (Fig. 5.14), geknikte (Fig. 5.15) oder helikale (Fig. 5.16) Spacerdomäne enthalten. Das Fusionsprotein in der Fig. 5.17 enthält zwei terminale Domänen vor bzw. nach der Polymerbinde Domäne.
Dieses Fusionsprotein kann entweder eine lineare (Fig. 5.18), eine geknikte (Fig. 5.19) oder eine helikale (5.20) Spacerregion enthalten. Das Fusionsprotein in der Fig. 5.21 enthält eine mittlere Polymerbinderegion (Ausdrücke „Region" und „Domäne" sind als Synonyme zu verstehen) und jeweils zwei seitliche Domänen, wobei die eine N - oder C - terminale Domäne, die Antikörperbindedomäne ist, welche mit einem Antikörper verbunden ist. Die benachbarte Domänen sind z.B. eine Metallbindedomäne, die Polymerbindedomäne, eine Strukturproteindomäne und eine fluoreszente Domäne und/oder Domäne eines Speicherproteins, um Stabilität, Fluoreszenz und molekulare Orientierung durch Lenkung der komplexerten Zonen zu erreichen, bzw. zu ermöglichen. Die geknikte Domäne kann z.B. folgende Formel (Pro (Gly)n)m haben, wobei n und m beliebig sein können. Dieses Fusionsprotein kann z.B. entweder eine lineare (Fig. 5.22), eine geknikte (Fig. 5.23) oder eine helikale (Fig. 5.24) Domäne enthalten. Das Fusionsprotein in der Fig. 6 enthält Antikörperbindedomäne 14 und Metallbinderegionen 11, und ist mit dem Antikörper 1 verbunden. Der Antikörper kann in einer Lösung durch das Fusionsprotein und elektromagnetische Felder orientiert werden.
In der Fig. 7 ist der Komplex bestehend aus Antikörpern und Fusionsproteinen enthaltend Autoantigene oder Autoantigene Regionen 15 und Antikörper Binderegionen, schematisch dargestellt. Diese Fusionsproteine dienen der diagnostischen Feststellung des Vorhandenseins bestimmter Autoantikörper in Blut bzw. Serum. Sollten sich Autoantikörper befinden, so binden die Fab Fragmente die Autoantigene Domänen der Fusionsproteinen und der Komplex entsteht.
Wenn keine Antikörper vorhanden sind, binden diese sich nicht an die Autoantigene Domänen der Fusionsproteinen und die Komplexe entstehen nicht. In der Fig. 8 ist ein Polymer - Antikörper • Fusionsprotein - Komplex schematisch dargestellt. Fusionsproteine enthalten Antikörperbindedomänen 14, Polymerbinderegionen 16, und Rezeptoren 17, und sind durch Polymerbinderegionen 16 an Polymer 9 und durch Antiköperbinderegionen 14 an Antikörper 1 gebunden.
Die Rezeptoren 17 binden Liganden 20. Die Rezeptoren binden z.B. Entzündungsfaktoren wie TNF - Alpha, diese entsprechen den Liganden. In der Fig. 9 ist die Lenkung einer T - Zelle 4 gegen eine Zielzelle 3 durch Fusionsprotein - Antikörperkomplexen dargestellt. Antikörper .1 bindet sich spezifisch an ein Zielzeil - spezifisches Antigen und die Liganddomäne 20 bindet sich an den Rezeptor 17 der T - Zelle. Die Liganddomäne ist z.B. eine Region von HLA - B7.1 oder B7.2 und ruft die T - Zell - Aktivierung hervor, welche zum Angriff gegen die Zielzelle fuhrt. Das Fusionsprotein in der Fig. 10 enthält eine terminale hydrophile Domäne, bestehend aus hydrophilen Aminosäuren wie z.B. Serin, um die Löslichkeil des Polymer - Fusionsprotein - Antikörper - Komplexen zu erhöhen. Die Fusionsproteine in den Fig. 1 1 a, b, c, d und e sind durch ein Enzym, z.B. Protease, Nuklease, Lipase, Katalase, Peroxidase oder ein anderes Enzym gekennzeichnet.
In der Fig. 12 ist der Teststift mit 10 Sektoren oder Segmenten sowie das Vorgehen der Vorbereitung und der Tesldurchführiiiig schematisch dargestellt (siehe Fig. 3). Durch Überschuss der Fusionsproteine in Lösung werden die an Polymere gebundene Fusionsproteine verdichtet.
Die Sequenzen für Proteine sind öffentlich zugänglich und im Iπrernet z.B. beim National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda MP, 20894, USA (NCBI http:// www.ncbi.nlm.nih.gov) erhältlich.
Ausführungsbeispiel 1
Klonierung und Expression des Fusion skonstruktes N - Keratin - SPA - C c DNA Sequenzen für Keratin und Staphylokokkenprotein A werden durch PCR oder RT - PCR kloniert. Das Fusionsprotein wird aus PCR - Produkten zusammengesetzt. Die PCR - Primern sind so konstruiert, dass sie
Restriktionsstellen auf 5' und 3' Enden enthalten, um spätere Ligationsschtitte durchzuführen. Die 5' und 3' Enden des Keratin - PCR Produktes enthalten
Bam HI und Hind III Restriktions stellen.
Die 5' und 3' Enden des SPA - PCR Produkts enthalten EcoRI und Kpnl
Restriktionsstellen.
Durch Behandlung mit Bam Hl und Hind III wird Keratin PCR Produkt in den entsprechend vorbereitenden Vektor hineinligiert. Der Vektor wird mit Kpnl und Eco RI behandelt, um SPA - PCR Produkt hineinzuligieren. Das
Ligationsprodukt wird in E.Coli transformiert, exprimiert und abschliessend gereinigt.
In der Seq. 1 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins enthaltend menschliches niedrig affinen Rezeptor für Fc Fragment des IgG und menschliches Keratin 7, dargestellt.
In der Seq. 2 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins, enthaltend menschliches niedrig affines Rezeptor für Fc Fragment des IgG und Vicilin - like Protein vom Lupinus albus dargestellt. Die Rezeptordomäne ist 290 Aminosäure lang und die Länge des Vicilin - ähnlichen Proteins beträgt 182 Aminosäuren, also ist die Länge des Fusionsproteins 472 Aminosäuren.

Claims

Neuartige Cherkasky - Fusionsproteine enthaltend Antikörperbindeproteine oder ihre RegionenPatentansprücheBeansprucht werden:
1. Neuartige Fusionsproteine, Cherkasky Fusionsproteine genannt, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Antikörperbindeprotein oder seine Region bzw. Domäne und mindestens eine Nicht - Antikörperbinderegion oder eine beliebige Region enthalten.
2. Fusionsproteine, Cherkasky Fusionsproteine genannt, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Antikörperbindeprotein oder seine Region vorzugsweise Staphylokokkenprotein (SPA), eine andere IgG oder eine IgE - Binderegion und mindestens eine Region enthalten, die teilweise oder ganz aus folgenden Proteinen, Fusionsproteinen oder ihren Regionen ausgewählt werden kann: HLA - B7.1, HLA - B7.2, eine ihre Region, eine T - Zell aktivierende Domäne, ein Enzym, DNAsel, Sl Endonuklease, ein Rezeptor, vorzugsweise für Entzündungsfaktoren TNF - Alpha, C5a, C3a, C4a, ein fluoreszentes Protein vorzugsweise GFP, ein Ligand vorzugsweise C3b, C4b, ein Opsonin, CRP oder C - Reaktives Protein, MBP oder Mannose - Bindeprotein, und Myelin Basisches Protein, ein neurales Protein, ein saures, ein basisches, ein hydrophiles, ein hydrophobes Protein, eine Cystein - reiche Region, Antifreeze Protein oder Glykoprotein, Rubredoxin, ein Autoantigen oder seine Region, ein Strukturprotein vorzugsweise, Resilin, Abducin, Lamprin, Kollagen, Keratin, ein Speicherprotein, Casein ein Zellprotein, ein Neurofilament, ein Muskelprotein vorzugsweise Myosin oder seine Region, Aktiv, Laminin, ein Cytokin, ein interleukin, ein Blutprotein, vorzugsweise Serumalbumin, ein virales Protein, ein Metalloprotein oder MetallbindepiOtein, ein Transportprotein, oder seine Region, ein Polysaccharid - Bindeprotein, (PBD), CipA Cellulose - Binderegion, ein Nukleinsäure - Bindeprotein oder seine Region, Crystallin oder Kristallin Alpha, Beta oder Gamma, ein Ichtyoprotein vorzugsweise Astacin, Phloemprotein 1 (PPl), Phloemprotein 2 (PP2) aus Cucuribitas, ein Spacer oder ein Linker, eine Serin oder Serinreiche region, Viciline, Legumine, Gliadin, Glutenin, Hordeine, Trifolin, Vicilin - like oder ähnliches Protein vom Lupinus albus, ein Honnon, LH, FSH oder PBD - Enzym Fusionsprotein.
3. Fusionsproteine nach einem der Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein His - tag oder einen anderen Tag zur Reinigung, ein Linker oder eine Gelenkregion oder mindestens eine andere Region enthalten.
4. Nukleinsäuren, Vektoren, Expressions und Transformationssysteme für die Fusionsproteinen nach den Ansprüchen 1 - 3.
5. Verwendungen der Substanzen nach den Ansprüchen 1 bis 4 vorzugsweise als Werkstoffe, Medikamente, Färb - und Markierungsstoffe, Klebemittel, und diagnostischen Systemen.
6. Linker oder Spacer, gekennzeichnet durch die Formel (Pro (Gly)n) m, wobei in Glycinen durch Proline Knicks gebildet werden.
7. Verwendung der Polymere für Verdichtung und Anordnung der Fusionsproteine insbesondere der nach den Ansprüchen 1 - 5.
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