WO2007014971A2 - Genes involucrados en la biosíntesis de tiocoralina y producción heteróloga de la misma - Google Patents

Genes involucrados en la biosíntesis de tiocoralina y producción heteróloga de la misma Download PDF

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José Antonio SALAS FERNÁNDEZ
Ana Velasco Iglesias
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    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • C12P17/187—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system containing two or more directly linked sulfur atoms, e.g. epithiopiperazines

Definitions

  • the present invention is related to the group of genes responsible for the biosynthesis of thiocoraline and its use in the heterologous production of thiocoraline.
  • heterologous expression of the cluster (cluster) of genes involved in the biosynthesis of thiocoraline in other actinomycetes more appropriate for fermentation and genetic manipulation would allow to produce said compound with more reproducible yields in shorter fermentation times.
  • An important objective of the present invention is to isolate and characterize the complete nucleotide sequence encoding the proteins responsible for thiocoraline production. From there, the function of the amino acid sequences comprising the proteins involved in the biosynthesis of thiocoraline can be isolated and determined. This objective can be achieved by providing a new nucleic acid molecule, isolated and, optionally, purified, which encodes all proteins related to the complete biosynthetic pathway of thiocoraline production. The inventors have been able to identify and clone all the genes responsible for the biosynthesis of thiocoraline, that is, the cluster of genes involved in the biosynthesis of thiocoraline, providing the genetic basis to improve and manipulate the production of this compound in a targeted way.
  • NRPSs non-ribosomal peptide synthetase
  • PCR polymerase chain reaction
  • MLl all of them containing fragments of the adenylation domains of putative (hypothetical) NRPSs called PSVl, PSV2, PSV3, PSV4, PSV5 and PSV6 (Example 3).
  • the present invention relates to the identification and cloning of the cluster of genes responsible for thiocoraline biosynthesis.
  • Said cluster of genes responsible for the biosynthesis of thiocoraline and its expression in an appropriate host cell allows the efficient production of thiocoraline.
  • the invention relates to a composition comprising at least one nucleic acid molecule provided by this invention.
  • the invention relates to a probe comprising a nucleic acid molecule provided by this invention or a fragment thereof.
  • the invention relates to a method, based on the use of genes responsible for the thiocoraline biosynthesis of Micromonospora sp. MLl, for the production of thiocoraline in another actinomycete.
  • Figure 4 Scheme of clones performed for the construction of plasmid pFL1041.
  • ori origin of replication for E. coli.
  • SCP2 origin of replication for Streptomyces.
  • oriT origin of conjugative transfer.
  • lacZ beta-galactosidase gene.
  • aac (3) ⁇ V apramycin resistance gene.
  • coli lacZ beta-galactosidase gene.
  • lacl lactose operon repressor gene.
  • int ⁇ C31 phage integrase gene ⁇ C31.
  • attP site-specific recombination site.
  • Kan R Kanamycin resistance gene.
  • aac (3) W apramycin resistance gene.
  • ⁇ cut site treated with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase.
  • PermE'- promoter of the ermE gene is the lactosidase gene.
  • Figure 7 Representation of plasmids pFL1048, pFL1048r and pFL1049.
  • ori pl5A origin of replication for E. coli.
  • oriT origin of conjugative transfer.
  • int ⁇ C31 phage integrase gene ⁇ C31.
  • attP site-specific recombination site.
  • aac (3) W apramycin resistance gene.
  • Figure 8C Mass spectrum of the product (thiocoraline) present in the 27-minute peak shown in Figure 8A.
  • the invention relates to a nucleic acid molecule, hereinafter, nucleic acid molecule of the invention, preferably an isolated, optionally purified nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding at least a protein from the biosynthetic pathway of thiocoraline production, or a biologically active fragment thereof.
  • said protein of the biosynthetic pathway of thiocoraline production is a non-ribosomal peptide synthetase (NRPS).
  • NRPSs are responsible for the biosynthesis of thiocoraline.
  • biologically active fragment applied to a protein of the biosynthetic pathway 'thiocoraline production refers to a part of the protein structure retaining the active function of the full - length protein.
  • Said biologically active fragments can be encoded by the corresponding regions of the nucleic acid molecule of the invention.
  • the size of said regions of the nucleic acid molecule of the invention may vary within a wide range; however, in a particular embodiment, said regions may have at least 10, 15, 20, 25, 50, 100, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 20,000,
  • the nucleic acid molecule of the invention is an isolated, optionally purified nucleic acid molecule, which comprises a nucleotide sequence encoding all of the proteins of the biosynthetic pathway of thiocoraline production, or biologically active fragments. from the same.
  • the nucleic acid molecule of the invention comprises the nucleotide sequence that contains the complete cluster of genes responsible for the biosynthesis of thiocoraline.
  • the nucleotide sequence of the complete cluster of genes responsible for thiocoraline biosynthesis is collected in SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 1 that is, formed by nucleotides that are complementary to those indicated in SEQ ID NO: 1 (eg, A substituted by T, C substituted by G and vice versa) and / or reverse nucleotide sequences [is that is, the sequences generated by changing the direction of the reading direction eg, from (5 ' ⁇ 3') to (3 ' ⁇ 5')].
  • the complete chromosomal (genomic) DNA molecule that contains the cluster of genes responsible for the thiocoraline biosynthesis, which encodes all the biosynthetic proteins essential for thiocoraline production, has been efficiently packaged in two plasmids, specifically in the SuperCosl and pKC505 cosmids (Examples 1 and 2). These two cosmids, which contain the cluster of genes responsible for the biosynthesis of thiocoraline, are sufficient to regenerate the complete biosynthetic pathway for the production of thiocoraline. Therefore, in a particular embodiment, the invention provides the complete cluster of thiocoraline biosynthetic genes in two cosmids which makes it possible to have substantially more efficient means to produce thiocoraline.
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 2-535 of SEQ ID NO: 1 ⁇ orfl
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 993-1 130c of SEQ ID NO: 1 ⁇ orf2);
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 3794-4777c of SEQ ID NO: 1 (Iio6); the nucleic acid molecule comprising nucleotides 4904-561 1 of SEQ ID NO: 1 ⁇ thio7);
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 5701-6426c of SEQ ID NO: 1 ⁇ thio8; - the nucleic acid molecule comprising the nucleotides
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 8791-10002 of SEQ ID NO: 1 ⁇ thiol 1);
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 15005-16354c of SEQ ID NO: 1 (cold J 5); - the nucleic acid molecule comprising nucleotides 16441-18744c of SEQ ID NO: 1 (thiol ⁇ );
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 18774-195555 of SEQ ID NO: 1 (izo 17); - the nucleic acid molecule comprising the nucleotides
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 20146-20880c of SEQ ID NO: 1 (thiol 9);
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 21 188-28969 of SEQ ID NO: 1 ⁇ thio20
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 28979-38398 of SEQ ID NO: 1 [thio21);
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 38449-38661 of SEQ ID NO: 1 ⁇ thio22); - the nucleic acid molecule comprising the nucleotides
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 41835-42368 of SEQ ID NO: 1 ⁇ thio24
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 42395-43255c of SEQ ID NO: 1 (thio25); the nucleic acid molecule comprising nucleotides 43340-4374 Ic of SEQ ID NO: 1 (thio26);
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 44152-49563 of SEQ ID NO: 1 (thio27); - the nucleic acid molecule comprising the nucleotides
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 55384-57222c of SEQ ID NO: 1 (orf30); the nucleic acid molecule comprising nucleotides 57895-58467c of SEQ ID NO: 1 ⁇ orf31); - the nucleic acid molecule comprising nucleotides 58535-59206c of SEQ ID NO: 1 (orf32);
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 59298-59564c of SEQ ID NO: 1 ⁇ orf33); - the nucleic acid molecule comprising the nucleotides
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 60202-60888 of SEQ ID NO: 1 ⁇ orf35
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 60960-62240 of SEQ ID NO: 1 ⁇ orf36
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 62300-62833 of SEQ ID NO: 1 ⁇ orf37);
  • nucleic acid molecule comprising nucleotides 62925-64650 of SEQ ID NO: 1 [orf38); or fragments thereof that encode biologically active fragments of thiocoraline production biosynthetic pathway proteins.
  • the nucleic acid molecule of the invention is an isolated, optionally purified nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding two or more proteins from the biosynthetic pathway of thiocoraline production, or biologically active fragments of the same.
  • the nucleic acid molecule of the invention comprises a nucleotide sequence comprising two or more genes selected from the genes identified as orfl, orf2, thio3, thio4, thio5, thio6, thio7, thio8, fio 9, fio 10, fio JJ, thiol2, thiol3, Ho 14, fio 15, uncle 16, thiol 7, uncle 18, thiol 9, uncle20, uncle21, uncle22, uncle23, uncle24, uncle25, uncle26, uncle27, uncle28, o ⁇ f29, orf30, or ⁇ l , orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, orf37, orf38 and fragments thereof encoding biologically active fragments of thiocoraline production biosynthetic pathway proteins.
  • the nucleic acid molecule of the invention is an isolated nucleic acid molecule, optionally one
  • ORFl SEQ ID NO: 2
  • ORF2 SEQ ID NO: 3
  • Tio3 SEQ ID NO: 4
  • Tio4 SEQ ID NO: 5
  • Tio5 SEQ ID NO: 6
  • Tio ⁇ SEQ ID NO: 7
  • Tio7 SEQ ID NO: 8
  • Tio8 SEQ ID NO: 9
  • Tio9 SEQ ID NO: 10
  • TiolO SEQ ID NO: 11
  • Tiol l SEQ ID NO: 12
  • Tiol2 SEQ ID NO: 13
  • Tiol3 SEQ ID NO: 14
  • Tiol4 SEQ ID NO: 15
  • Tiol5 SEQ ID NO: 16
  • Tiol ⁇ SEQ ID NO: 17
  • Said proteins can be obtained from the corresponding previously mentioned orfs (orfl, orf2, uncle3, uncle4, uncle5, thio ⁇ , uncle7, uncle8, uncle9, thiol O, thiol l, uncle! 2, uncle! 3, thiol4, uncle! 5 , thiol ⁇ , uncle!
  • the nucleic acid molecule of the invention is an isolated, optionally purified nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding at least one variant of a protein from the biosynthetic pathway of thiocoraline production, or a biologically active fragment thereof, wherein said variant is at least 30%, advantageously 50%, preferably 60%, more preferably 70%, even more preferably 80%, particularly 90%, more particularly 95% or more, identical in their amino acid sequence to that of a protein selected from proteins whose amino acid sequences are shown in SEQ ID NO: 2-39, or biologically active fragments thereof.
  • Said variant retains at least one of the biological activities or functions of the corresponding protein encoded by any of the orfs in the cluster of genes responsible for the biosynthesis of thiocoraline.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising at least one nucleic acid molecule of the invention, preferably an isolated nucleic acid molecule.
  • said composition comprises a nucleic acid molecule of the invention.
  • said composition comprises two or more nucleic acid molecules of the invention. Said nucleic acid molecules can be both DNA and RNA.
  • the nucleic acid molecule of the invention can be isolated from any thiocoraline producing organism, either naturally or recombinantly because the cluster of genes responsible for thiocoraline biosynthesis has been inserted into a host cell (host) appropriate; however, in a particular embodiment, said nucleic acid molecule of the invention has been isolated from the marine actinomycete Micromonospora sp. MLl (see experimental part, Stage 1, Examples 1-4).
  • the invention relates to a probe comprising a nucleic acid molecule of the invention or a fragment thereof.
  • the probes conveniently comprise a sequence of at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 or more nucleotides. Sequences with a length of 20 to 60 nucleotides are preferred.
  • said probe can be used for the detection of genes involved in the biosynthesis of thiocoraline in Micromonospora sp.
  • the use of said probe for the detection of a nucleic acid, eg, gDNA, cDNA or mRNA, related to the biosynthesis of thiocoraline constitutes an additional aspect of this invention.
  • genomic DNA chromic chromium
  • cloned recombinant DNA from appropriate host cells
  • genomic DNA chromic chromium
  • cloned recombinant DNA from appropriate host cells
  • techniques based on the enzymatic amplification of nucleic acids By way of illustration, initiating oligonucleotides (based on known DNA and protein sequences involved in thiocoraline biosynthesis) that can be used in enzymatic amplification reactions, for example, PCR, can be designed to amplify and identify other identical sequences or related.
  • nucleic acid molecules of the invention can be isolated and, if desired, purified, by conventional methods.
  • the invention relates to a vector, hereinafter vector of the invention, comprising a nucleic acid molecule of the invention that encodes at least one protein from the biosynthetic pathway of thiocoraline production, or a biologically active fragment.
  • the vector of the invention is a biologically functional vector or plasmid, such as a cloning vector or an expression vector.
  • the vector of the invention is a cloning vector, preferably a cosmid.
  • Preferred cloning vectors are selected for their ability to incorporate large DNA sequences (e.g., complete clusters of genes involved in the biosynthesis of products of interest). In general, said vectors are conventional vectors and are commonly available.
  • the genetic material can be reduced to finally be contained in a single vector or cloning plasmid (e.g., cosmid) by genetic manipulation by techniques known to those skilled in the art. The assembly can be carried out by cloning, PCR or synthetic genes or combination of any of these techniques known in the state of the art.
  • the vector of the invention is an appropriate expression vector for insertion into a suitable host cell.
  • the insertion of said vector into said suitable host cell can be carried out by any conventional method of transferring genetic material (e.g., transformation, transfection, etc.).
  • the invention relates to a host cell, hereinafter host cell of the invention, transformed or transfected with a vector of the invention.
  • Said host cell of the invention contains one or more acid molecules. nucleic of the invention.
  • the host cell of the invention contains a nucleic acid molecule of the invention.
  • the host cell of the invention contains two or more nucleic acid molecules of the invention; in this case, said nucleic acid molecules of the invention may be the same or different from each other.
  • a preferred host cell of the invention is a host cell stably transformed or transfected with a vector of the invention comprising a nucleic acid (exogenous) molecule of the invention comprising a nucleotide sequence encoding at least one protein in the biosynthetic pathway. of thiocoraline production, or a biologically active fragment thereof, sufficiently to direct the biosin thesis and / or thiocoraline assembly.
  • the host cell is a microorganism, more preferably a bacterium.
  • said host cell is a Gram-positive bacterium, such as an actinomycete, for example, a streptomycete.
  • the invention provides a host cell of the invention, such as, for example, a recombinant bacterium, in which at least one region of the nucleic acid molecule of the invention has been altered to give rise to a cell Recombinant host, such as a recombinant bacterium, that produces altered levels of thiocoraline with respect to the corresponding non-recombinant thiocoraline-producing cell (bacterium), i.e. wt.
  • a host cell of the invention such as, for example, a recombinant bacterium, in which at least one region of the nucleic acid molecule of the invention has been altered to give rise to a cell Recombinant host, such as a recombinant bacterium, that produces altered levels of thiocoraline with respect to the corresponding non-recombinant thiocoraline-producing cell (bacterium), i.e. wt.
  • the invention relates to a protein, hereinafter protein of the invention, encoded by the nucleic acid molecule of the invention.
  • said proteins involved in thiocoraline biosynthesis can be produced through conventional recombinant DNA technology by inserting a nucleotide sequence that encodes the protein in an appropriate expression vector and expressing the protein in an appropriate host cell or through conventional chemical synthesis of peptides, for example, by the Merrifield solid phase synthesis method (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)) in which the amino acids bind individually and sequentially to the amino acid chain.
  • protein synthesis of the invention can be performed using equipment for automated protein synthesis marketed by different manufacturers (eg, Perkin-Elmer, Inc.).
  • Biologically active variants of the proteins of the invention include active amino acid structures in which amino acids have been removed, substituted or added, naturally occurring alleles, etc.
  • the biologically active fragment can be easily identified by subjecting the protein, full length, to chemical or enzymatic digestion to prepare fragments and then testing said fragments by conventional assays to analyze the amino acid structure fragments that retain it, or substantially the same, biological activity as the full length protein.
  • the protein of the invention is an isolated, optionally purified protein, involved in thiocoraline biosynthesis, encoded by a gene selected from the group formed. by the genes identified as orfl, orf2, uncle3, uncle4, uncle5, unio ⁇ , uncle7, uncle8, uncle9, thiol O, thiol l, thiol2, thiol3, thiol4, thiol ⁇ , thiol 6, thiol 7, thiol 8, thiol 9, uncle20 s uncle21, uncle22, uncle23, uncle24, uncle25, uncle26, uncle27, uncle28, orf29, orf30, o ⁇ l, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, or / 37 and orf38.
  • the invention in another aspect, relates to a process for producing a protein of the invention involved in the biosynthesis of thiocoraline which comprises growing, under appropriate conditions (nutrients and environmental), a thiocoraline producing organism, and, if desired, isolating one or more of said proteins involved in the biosynthesis of thiocoraline.
  • said protein of the invention can be isolated and purified by conventional methods, such as those described previously.
  • the invention in another aspect, relates to a method for producing thiocoraline which comprises growing, under appropriate conditions to produce said compound, a thiocoraline producing organism. in which the number of copies of genes encoding proteins involved in the biosynthesis of thiocoraline has been increased, and, if desired, isolate the thiocoraline.
  • the thiocoraline producing organism is an actinomycete, such as, for example, Micromonospora sp, in which the number of copies of genes encoding proteins involved in the biosynthesis of thiocoraline has been increased.
  • the increase in the number of copies of genes encoding proteins involved in the biosynthesis of thiocoraline can be done by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the previously described method comprises fermenting said organism under nutrient and environmental conditions suitable for the expression of the genes involved in the production of thiocoraline.
  • the thiocoraline produced can be isolated and purified from the culture medium by conventional methods.
  • the invention in another aspect, relates to a method for producing thiocoraline comprising growing, under appropriate conditions to produce said compound, a thiocoraline producing organism in which the expression of the genes encoding the proteins responsible for the biosynthesis of thiocoraline has been modulated by manipulation or replacement of one or more genes that encode proteins involved in the biosynthesis of thiocoraline or by manipulating the sequences responsible for regulating the expression of said genes, and, if desired, isolating the thiocoraline.
  • the expression of the genes encoding said proteins responsible for the biosynthesis of thiocoraline has been improved.
  • the non-essential gene sequences in the thiocoraline biosynthesis process can be eliminated, or the efficiency of the gene expression regulatory sequences of said genes can be increased by genetic engineering techniques known to those skilled in the art.
  • the production yield of thiocoraline Genetic manipulation to eliminate non-essential gene sequences in the thiocoraline biosynthesis process, or to increase the efficiency of the gene expression regulatory sequences of said genes can be carried out by genetic engineering techniques known to those skilled in the art. matter.
  • the thiocoraline-producing organism is an actinomycete, such as, for example, Micromonospora sp, in which the expression of the genes encoding the proteins responsible for thiocoraline biosynthesis has been modulated by manipulation or replacement of one. or more genes that encode proteins involved in the biosynthesis of thiocoraline or by manipulating the sequences responsible for regulating the expression of said genes, which can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the previously described method comprises fermenting said organism under nutrient and environmental conditions suitable for the expression of the genes involved in the production of thiocoraline. If desired, the thiocoraline produced can be isolated and purified from the culture medium by conventional methods.
  • the invention in another aspect, relates to a method for producing thiocoraline comprising growing, under appropriate conditions to produce said compound, a host cell of the invention transformed or transfected with a vector of the invention comprising the gene cluster responsible for the thiocoraline biosynthesis, and, if desired, isolate thiocoraline.
  • the conditions (nutrients, environmental, etc.) will be selected based on the nature of the host cells.
  • the host cell of the invention is selected from a thiocoraline-producing organism natively, a non-thiocoraline-producing organism natively and an organism genetically engineered to produce thiocoraline.
  • said host cell of the invention is an actinomycete or a streptomycete.
  • the invention relates to a method, based on the use of genes responsible for the thiocoraline biosynthesis of Micromonospora sp. MLl, for the production of said compound in another actinomycete, comprising:
  • Affected mutants in specific genes of the thiocoraline biosynthesis pathway can be identified by conventional methods.
  • said mutants can be identified by culture and measurement of thiocoraline production by conventional methods, for example, by HPLC-MS, as mentioned in Example 5.
  • All or part of the cluster of genes responsible for thiocoraline biosynthesis can be introduced into an actinomycete by conventional methods, eg, by transformation or transfection, for the heterologous production of thiocoraline by fermentation of an appropriate nutrient medium, under appropriate conditions.
  • for the production of thiocoraline and, if desired, the thiocoraline thus obtained can be isolated and / or purified by conventional methods.
  • the determination of the gene cluster responsible for the biosynthesis of thiocoraline is of great commercial importance.
  • the isolation and complete description of the cluster of genes responsible for the biosynthesis of thiocoraline provided by this invention allows to increase thiocoraline production and manipulate organisms to produce thiocoraline.
  • the number of copies of the genes responsible for the most important domains of the NRPSs involved in the production of thiocoraline can be increased or the efficiency of the gene expression regulatory sequences of these genes can be increased by known genetic engineering techniques. in the state of the art and thus increase the yield in its production.
  • Another advantage associated with the identification and cloning of the complete thiocoraline gene cluster is related to the efficient production of thiocoraline. In fact, it allows to obtain a compound of great interest in a smaller number of steps. The elimination of non-essential sequences in the biosynthesis process in cluster mutants considerably reduces the time required to produce the compound of interest. The remaining sequences are sufficient and maintain their functionality to produce thiocoraline.
  • Stage 1 Isolation of the chromosome region of Micromonospora sp. MLl containing the genes of the thiocoraline biosynthesis pathway
  • Example 1 Construction of a SuperCosl library from chromosomal DNA of Micromonospora sp. MH From a culture of Micromonospora sp. MLl (Espliego, F.
  • This chromosomal DNA was subjected to partial digestion with the Bar ⁇ Hl endonuclease and the fragments obtained were used to generate a library in the cosmid SuperCos 1 (Stratagene), digested with BamHl.
  • the generation of this library in E. coli XL-I Blue MR (Stratagene) was performed following procedures already described (Sambrook et al. 2001) and the kit in vitro packaging Gigapack III GoId Packaging Extract Kit (Stratagene).
  • chromosomal DNA was obtained using the "salting out" protocol (Kieser et al. 2000). This chromosomal DNA was subjected to partial digestion with the Sau3Al endonuclease and the fragments obtained were used to generate a library in the bifunctional cosmid Escherichia coli / Streptomy ees pKC505 (Richardson at al. 1987, Gene 61, 231-241), digested with BamHl . The generation of this library in E. coli ED8767 was carried out following previously described procedures (Sambrook et al. 2001) and the Gigapack III GoId Packaging Extract Kit (Stratagene) in vitro packaging kit.
  • Example 3 Design of oligonucleotides specific for adenylation domains in NRPS and their amplification by PCR from chromosomal DNA of Micromonospora sp. MLl Based on the structure of thiocoraline, it was expected that
  • the PCR program used was an initial cycle of 95 ° C-2 min; 60 ° C- 15 min; 72 ° C-6 min followed by 20 cycles of 95 ° C- 1 min; 60 ° C-2 min; 72 ° C-2 min. Chromosomal DNA from Micromonospora sp. MLl.
  • a nested or "nested-PCR" PCR was performed (30 cycles of 95 ° C-1 min; 6O 0 C-I min; 72 ° C-1 min ) with the PS2-TG initiator oligonucleotides: ⁇ ' -ACNGGNMRNCCNAARGG-S' and MTR: 5 ' - CCNCGDATYTTNACY-3 ' (Neilan et al. 1999. J. Bacteriol. 181 (13): 4089-4097) to obtain a band 750 bp that was cloned into a pGEM-T Easy vector (Promega).
  • PCR amplification with the initiator oligonucleotides PS2M: 5 '- TACACSGGCWSSACSGG-3' and PSV-4 resulted in a band of 1, 3 kb was cloned into a pGEM-T Easy vector (Promega).
  • cosVl-F8 positive cosmids (clones) that hybridized with the PSV2 fragment, called cosVl-F8, cosV7-D2, cosV7-D 12, cosV14-H4, cosV19-B4, cosV29-B9, cosV31-B ll, cosV31-H 10, cosV33-D12, cosV33-F7;
  • the samples (10 ⁇ l) were analyzed by HPLC, using a reverse phase column (Symmetry Cis, 2.1 X 150 mm, Waters), using acetonitrile and a mixture of 0.1% trifluoroacetic acid in water as solvents. During the first 4 minutes a concentration of the mobile phase with 10% acetonitrile is maintained in an isocratic manner. Then, until 30 minutes, a linear gradient from 10% to 100% acetonitrile is started. The flow used is 0.25 mL / min. The detection and spectral characterization of the peaks were carried out using a photodiode detector and using the Millennium software (Waters). The chromatograms were extracted at an absorbance of 230 nm.
  • the PSV1 region was obtained from plasmid pBPSVl as a 1.3 kb EcoRI band and cloned into the EcoRI site of the conjugative plasmid E. coli / Streptomy ees pOJ260, generating pFL903.
  • pOJ260 contains a gene that confers resistance to apramycin in Streptomyces and in these cells is a suicide plasmid.
  • ⁇ PSV1 was grown in MT4 thiocoraline production medium and subsequently its mycelium was extracted with acetonitrile and analyzed by HPLC-MS (see Example 5), proving to be a thiocoraline producer.
  • the composition of the MT4 culture medium per liter is as follows: 6 g of soybean meal, 2.5 g of malt extract, 2.5 g of peptone, 5 g of dextrose, 20 g of dextrin, 4 g of CaCÜ3 , 10 g of sea salts, adjust the pH to 6.8.
  • Construction pFL904 was introduced in the conjugative strain E. coli ET 12567 (pUB307) and from there, by conjugation, in the strain Micromonospora sp. MLl.
  • the transconjugant clones were selected with 25 ⁇ g / ml apramycin and from their chromosomal DNA it was verified by Southern hybridization that indeed the PSV2 region had been interrupted.
  • the probe used in this case was the PSV2 band.
  • the mutant Micromonospora sp. ⁇ PSV2 was grown in MT4 thiocoraline production medium and subsequently its mycelium was extracted with acetonitrile and analyzed by HPLC-MS (Example 5), resulting in this strain not producing thiocoraline.
  • plasmid pBPSV3 From plasmid pBPSV3 the PSV3 region was obtained as a 1.4 kb EcoRI band and cloned into the EcoRI site of plasmid pOJ260, generating pFL905.
  • Construction pFL905 was introduced in the conjugative strain E. coli ET 12567 (pUB307) and from there, by conjugation, in the strain Micromonospora sp. MLl.
  • the transconjugant clones were selected with 25 ⁇ g / ml apramycin and from their chromosomal DNA it was verified by Southern hybridization that the PSV3 region had indeed been disrupted.
  • the probe used in this case was the PS V3 band.
  • the mutant Micromonospora sp. ⁇ PSV3 was grown in MT4 thiocoraline production medium and subsequently its mycelium was extracted with acetonitrile and analyzed by HPLC-MS (Example 5), resulting to be a thiocoraline producer.
  • the PCR program used was: 2 min at 94 ° C, 30 cycles (30 s at 94 ° C, 60 s at 53 ° C, 90 s at 68 ° C), 5 min at 68 ° C and 15 min at 4 ° C.
  • the obtained PCR product was cloned into the EcoRV site of plasmid pOJ260, generating pFL971.
  • Construction pFL971 was introduced in the conjugative strain E. coli ET12567 (pUB307) and from there, by conjugation, in the strain Micromonospora sp. MLl.
  • the transconjugant clones were selected with 25 ⁇ g / mL of apramycin and from their chromosomal DNA it was verified by Southern hybridization that indeed the PSV7 region had been disrupted.
  • the probe used in this case was the PSV7 PCR product.
  • the mutant Micromonospora sp. ⁇ PSV7 was grown in MT4 thiocoraline production medium and subsequently its mycelium extracted with acetonitrile and analyzed by HPLC-MS (Example 5), resulting in this strain not producing thiocoraline.
  • Streptomyces This region of DNA contains all the ORFs located between thio3 and thio28, both inclusive and complete ( Figure 1). The choice of this region of DNA was due to the fact that the Tio3 and Tio28 proteins are the most external within the sequenced region that showed similarities with secondary metabolism proteins.
  • the entire DNA fragment was first subcloned into the replicative plasmid in E. coli pOJ260 (Example 14).
  • the insert was rescued and subcloned into a replicative vector in E. co Zi / in te grati ve of Streptomyces containing the erythromycin resistance promoter (ertnEp) (pARP) [Example 16] or without said promoter (pAR15AT) [Example 15 ].
  • This region of selected DNA was cloned into said Streptomyces pAR15AT integrative plasmids, in both directions (Example 17) and pARP (Example 18).
  • said constructs were introduced into several streptomycetes (Example 19).
  • pUKA is a derivative of plasmid pUK21 (Vieira et al. 1991, Gene 100, 189-194) that contains in its Psü-Accl restriction sites the apramycin resistance gene obtained from cosmid pKC505 (Richardson at al. 1987, Gene 61, 231-241) as a Pstl-EcoRI band.
  • Plasmid pFL1048r ( Figure 7) was introduced by conjugation from E. coli strain ETl 2567 (pUB307) in the Streptomyces lividans TK21 species.
  • Figure 8A The results of the Streptomyces albus clone culture (pFL1049) in R5A production medium (Fernández et al. 1998, J. Bacteriol. 180, 4929-4937) are shown in Figure 8A.
  • Figure 8B shows the absorption spectrum of the peak with retention time of 27 minutes in this chromatogram, and its mass spectrum (Figure 8C), both being identical to those of purified Thiocoraline.

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Abstract

Se ha identificado y clonado el grupo de genes (cluster) responsables de la biosíntesis de tiocoralina. Dicho grupo de genes puede ser utilizado en la producción heteróloga de tiocoralina. La tiocoralina tiene actividad antitumoral y antibacteriana.

Description

GENES INVOLUCRADOS EN LA BIOSÍNTESIS DE TIOCORALINA Y PRODUCCIÓN HETERÓLOGA DE LA MISMA
Campo de la invención
La presente invención está relacionada con el grupo de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina y su uso en la producción heteróloga de tiocoralina.
Antecedentes de la invención
La tiocoralina (I)
Figure imgf000002_0001
(I)
es un tiodepsipéptido ciclodimérico aislado de un actinomiceto marino, en concreto de la familia Micromonosporaceae (Pérez Baz et al., J. Antibiotics, 50(9), 738-741 , 1997; Romero et al., J. Antibiotics, 50(9), 734-737, 1997). Aunque se ha descrito que la tiocoralina se obtiene de Micromonospora marina o Micromonospora sp. L- 13-ACM-092, posteriores estudios han puesto de manifiesto que el compuesto también puede ser aislado del actinomiceto Micromonospora sp. MLl , el cual fue aislado de un molusco marino encontrado en la costa del Océano índico, en Mozambique (Espliego, F. Tesis Doctoral, 1996, Universidad de León; de la Calle, F. Tesis Doctoral, 1998, Universidad Autónoma de Madrid) .
Estudios in υitro han demostrado la capacidad de la tiocoralina para inhibir el crecimiento de líneas celulares de diferentes tipos de tumores sólidos, tales como melanoma, cáncer de mama, pulmón no microcítico y colon. Asimismo, la tiocoralina ha mostrado poseer una marcada actividad antitumoral en ensayos in vivo frente a xenoinjertos (xenografts) de carcinomas humanos (Faircloth et al. Eur. J. Cáncer, 33, 175, 1997 (abstract)). Además, la tiocoralina muestra actividad antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas.
Aunque la obtención de tiocoralina a partir de dicho actinomiceto marino (Micromonospora sp. MLl) es factible a pequeña escala, a gran escala dicha obtención se halla limitada debido a la variabilidad en la producción que se observa con ese microorganismo. Efectivamente, la producción de tiocoralina a partir de dicho organismo es un proceso que consume mucho tiempo debido a la baja tasa de crecimiento de ese organismo y muestra importantes fluctuaciones en los rendimientos de producción en diferentes lotes.
Por tanto, debido a que, por una parte, la obtención de tiocoralina a partir de dicho actinomiceto marino se halla bastante limitada, y, por otra parte, al hecho de que la molécula de tiocoralina posee una estructura compleja y su síntesis puede ser complicada a nivel industrial, es deseable entender las bases genéticas de su biosíntesis con el fin de crear unos medios para que influyan en su obtención de una manera dirigida. Ello podría dar lugar a un incremento en las cantidades de tiocoralina producidas, dado que las cepas productoras naturales generalmente producen el producto en baja concentración y de forma muy desigual. Asimismo, también podría permitir la producción de tiocoralina en huéspedes que de forma natural no producen este compuesto.
El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de investigación para la generación y producción de compuestos bioactivos mediante la manipulación de genes implicados en la biosíntesis de tales compuestos bioactivos, principalmente de bacterias del grupo de los actinomicetos. Estas técnicas pueden ser usadas para mejorar la producción de compuestos naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del metabolito de interés.
Asimismo, la expresión heteróloga del agrupamiento (cluster) de genes involucrados en la biosíntesis de tiocoralina en otros actinomicetos más apropiados para fermentación y manipulación genética permitiría producir dicho compuesto con rendimientos más reproducible en tiempos de fermentación más cortos.
Como es conocido, numerosas bacterias y hongos sintetizan una amplia variedad de péptidos biológicamente activos de origen no ribosomal, incluyendo antitumorales, antibióticos, etc. La biosíntesis de esta familia de compuestos se lleva a cabo por péptido sintetasas no ribosomales (NRPSs), que son enzimas multifuncionales con una organización modular de dominios catalíticos. Cada uno de estos módulos lleva a cabo un ciclo de elongación, es decir, activa e incorpora un aminoácido concreto en la estructura final del compuesto. Un módulo mínimo está constituido por tres dominios: (i) un dominio de adenilación (A, de aproximadamente 550 aminoácidos) que se encarga de seleccionar un determinado aminoácido y generar la versión aminoacil adenilada del mismo mediante el empleo de ATP; (ii) un dominio transportador peptidil (P, de aproximadamente 80 aminoácidos) que contiene un grupo prostético de fosfopan te teína (PP) que actúa como cofactor y se une por enlace covalente al dominio P; este dominio se encarga de fijar él aminoácido adenilado activado antes de pasar a siguientes centros de reacción; y (iii) un dominio de condensación (C, de aproximadamente 450 aminoácidos) que genera un nuevo enlace peptídico entre dos restos aminoacil adenilados que se localizan en dos dominios P consecutivos. Los dominios C están ausentes en los módulos que activan el primer aminoácido del sistema. Algunas NRPSs poseen unos dominios extra para llevar a cabo actividades específicas, como epimerizaciones dando lugar a D- aminoácidos, metilaciones tipo N- o C-, circularizaciones actuando sobre los aminoácidos L-Cys o L-Ser. Generalmente, un último dominio, situado después del último módulo, se encarga de la liberación del enzima intermediario, generando un péptido linear o cíclico. Como regla general, la estructura de los diferentes módulos refleja la secuencia final de aminoácidos del péptido producto. Esta regla de colinealidad permite la asignación a cada módulo de una función específica de activación en una NRPS. Información sobre NRPSs puede encontrarse, por ejemplo, en Quing-Tao, S. et al, 2004. Dissecting and Exploiting Nonribosomal Peptide Synthetases. Acta Biochimica et Biophysica. Sínica, 36 (4): 243-249.
Compendio de la invención
Un objetivo importante de la presente invención consiste en aislar y caracterizar la secuencia de nucleótidos completa que codifica las proteínas responsables de la producción de tiocoralina. A partir de ahí, se puede aislar y determinar la función de las secuencias aminoacídicas que comprenden las proteínas involucradas en la biosíntesis de tiocoralina. Este objetivo puede alcanzarse proporcionando una nueva molécula de ácido nucleico, aislada y, opcionalmente, purificada, que codifica todas las proteínas relacionadas con la ruta biosintética completa de producción de tiocoralina. Los inventores han sido capaces de identificar y clonar todos los genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina, es decir, el cluster de genes implicados en la biosíntesis de tiocoralina, proporcionando las bases genéticas para mejorar y manipular de forma dirigida la producción de este compuesto.
Mediante el empleo de oligonucleótidos iniciadores derivados de secuencias consenso de los dominios de adenilación de péptido sintetasas no ribosomales (NRPSs) se amplificaron, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), 6 fragmentos del cromosoma de Micromonospora sp. MLl, conteniendo todos ellos fragmentos de los dominios de adenilación de las NRPSs putativas (hipotéticas) denominados PSVl, PSV2, PSV3, PSV4, PSV5 y PSV6 (Ejemplo 3). La inactivación, por inserción, de dichos dominios de adenilación puso de manifiesto que dos de ellos (PSV2 y PSV5) generaban mutantes no- productores de tiocoralina, lo que indicaba que estaban implicados en la biosíntesis de tiocoralina (Ejemplos 7 y 10).
La secuenciación de una región de ADN de aproximadamente 64,6 kilobases (kb) (SEQ ID NO: 1) reveló la presencia de 36 marcos de lectura abiertos (ORFs) completos y otros 2 ORFs incompletos (Ejemplo
12, Tabla 1). La expresión heteróloga de una región de 53 kb aproximadamente, conteniendo 26 de dichas ORFS, en Streptomyces coelicolor, Streptomyces albus y Streptomyces lividans condujo a la producción de tiocoralina en dichos actinomicetos (Ejemplo 19).
El cluster de genes responsable de la biosíntesis de la tiocoralina se representa esquemáticamente en la Figura 1. Sorprendentemente, el cluster de genes de tiocoralina contiene más genes codificantes de NRPSs que los que cabría esperar en base al número de aminoácidos del esqueleto peptídico. Algunas de las proteínas identificadas están implicadas en la formación de la estructura peptídica de la tiocoralina, como, por ejemplo, varias de las NRPSs identificadas como Tiol2, Tiol7, Tiolδ, Tiol9, Tio20, Tio21, Tio22, Tio27 y Tio28. Las proteínas identificadas como Tio20 y Tio21 constituyen probablemente las NRPSs implicadas en la biosíntesis del esqueleto de la tiocoralina y, probablemente, otras dos NRPSs, identificadas como Tio27 y Tio 28 podrían ser las responsables de la biosíntesis de un péptido pequeño que podría estar implicado en la regulación de la biosíntesis de tiocoralina en Micromonospora sp. MLl . Aparecen también varias proteínas que pueden estar relacionadas con procesos de resistencia, como Tio5, Tio6 y Tio23. Los posibles reguladores de la ruta de tiocoralina identificados en la región secuenciada corresponden a Tk>3, Tio4, Tio7, Tio24 y Tio25. Aparecen por último también varias proteínas relacionadas con la generación de la unidad iniciadora 3-hidroxi- quinaldato, Tio8, Tio9, TiolO y Tiol l . Los genes cuya interrupción génica genera un fenotipo no productor de tiocoralina se encuentran señalizados en la Figura 1 mediante un asterisco (tio20, tio27y tio28).
Por tanto, la presente invención se relaciona con la identificación y clonaje del cluster de los genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina. Dicho cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina y su expresión en una célula hospedadora apropiada permite la producción eficiente de tiocoralina.
En consecuencia, en un aspecto, la invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende, al menos, una molécula de ácido nucleico proporcionada por esta invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con una sonda que comprende una molécula de ácido nucleico proporcionada por esta invención o un fragmento de la misma.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico proporcionada por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora trasformada o transfectada con un vector proporcionada por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico proporcionada por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir una proteína implicada en la biosíntesis de tiocoralina, que comprende el empleo de un organismo productor de tiocoralina cuyo genoma ha sido manipulado.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento, basado en la utilización de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina de Micromonospora sp. MLl, para la producción de tiocoralina en otro actinomiceto.
Descripción de las figuras
Figura 1. Representación esquemática del cluster de genes de la tiocoralina y de los genes que los rodean incluyendo la organización génica de la zona del cromosoma de Micromonospora sp. MLl secuenciada. Se muestran los sitios de restricción utilizados para la construcción de los plásmidos para la expresión heteróloga del cluster de genes de tiocoralina.
Figura 2. Representación esquemática de los cósmidos cosV33-D 12 y pCT2c. orí: origen de replicación para E. coli. SCP2: origen de replicación para Streptomyces. aac(3)W: gen de resistencia a apramicina. neo: gen de resistencia a neomicina. bla: gen de resistencia a ampicilina. SV40 orí: origen eucariótico para replicación episómica.
Figura 3. Esquema de clonaciones realizadas para la construcción del plásmido pFL1036. ori: origen de replicación para E. coli. M13 ori: origen de replicación para el fago M13. oriT: origen de transferencia conjugativa. lacZ: gen de la beta-galactosidasa. kanR: gen de resistencia a kanamicina. aac(3)W: gen de resistencia a apramicina. bla: gen de resistencia a ampicilina.
Figura 4. Esquema de clonaciones realizadas para la construcción del plásmido pFL1041. ori: origen de replicación para E. coli. SCP2: origen de replicación para Streptomyces. oriT: origen de transferencia conjugativa. lacZ: gen de la beta-galactosidasa. aac(3)ΪV: gen de resistencia a apramicina.
Figura 5. Esquema de clonaciones realizadas para la construcción del plásmido pAR15AT. ori pl5A: origen de replicación para E. coli. oriT: origen de transferencia conjugativa. intφC31 : gen de la integrasa del fago φC31. attP: sitio de recombinación sitio-específica. kanR: gen de resistencia a kanamicina. aac(3)TV: gen de resistencia a apramicina. κ: sitio de corte tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli. Figura 6. Esquema de clonaciones realizadas para la construcción del plásmido pAPR. ori pl5A: origen de replicación para E. coli oriT: origen de transferencia conjugativa. ori M 13: origen de replicación del fago M 13. ori: origen de replicación para E. coli lacZ: gen de la beta- galactosidasa. lacl: gen del represor del operón lactosa. intφC31: gen de la integrasa del fago φC31. attP: sitio de recombinación sitio-específica. kanR: gen de resistencia a kanamicina. aac(3)W: gen de resistencia a apramicina. κ: sitio de corte tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli. PermE'- promotor del gen ermE.
Figura 7. Representación de los plásmidos pFL1048, pFL1048r y pFL1049. ori pl5A: origen de replicación para E. coli. oriT: origen de transferencia conjugativa. intφC31: gen de la integrasa del fago φC31. attP: sitio de recombinación sitio-específica. aac(3)W: gen de resistencia a apramicina.
Figura 8A. Cromatograma de HPLC de un extracto de un cultivo de Streptomyces albus (pFL1049) después de 7 días de crecimiento en medio R5A. Se muestra el pico correspondiente a tiocoralina y su tiempo de retención, 27 minutos.
Figura 8B. Espectro de absorción UV del producto (tiocoralina) presente en el pico de 27 minutos mostrado en la Figura 8A.
Figura 8C. Espectro de masas del producto (tiocoralina) presente en el pico de 27 minutos mostrado en la Figura 8A.
Descripción detallada de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una nueva molécula de ácido nucleico, aislada y, opcionalmente purificada, que codifica la totalidad o parte de las proteínas involucradas en la ruta biosintética completa de producción de tiocoralina.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico, en adelante, molécula de ácido nucleico de la invención, preferentemente una molécula de ácido nucleico aislada, opcionalmente purificada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma. En general, dicha pro teína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina es una péptido sintetasa no ribosomal (NRPS). Las NRPSs son las responsables de la biosíntesis de tiocoralina.
Tal como aquí se utiliza, la expresión "fragmento biológicamente activo", aplicado a una proteína de la ruta biosintética de 'producción de tiocoralina, se refiere a una parte de la estructura de la proteína que retiene la función activa de la proteína longitud completa. Dichos fragmentos biológicamente activos pueden ser codificados por las regiones correspondientes de la molécula de ácido nucleico de la invención. El tamaño de dichas regiones de la molécula de ácido nucleico de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular, dichas regiones pueden tener al menos 10, 15, 20, 25, 50, 100, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 20.000,
25.000 o más nucleótidos de longitud. Normalmente dichas regiones tienen entre 100 y 10.000 nucleótidos de longitud, preferentemente entre 100 y 7.500, y son biológicamente funcionales, es decir, pueden codificar un fragmento biológicamente activo de una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina.
La molécula de ácido nucleico de la invención puede ser una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) o de ácido ribonucleico (ARN). Asimismo, la molécula de ácido nucleico de la invención puede ser una molécula de ácido nucleico monocatenario o bien una molécula de ácido nucleico bicatenario derivada. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de moléculas de ácido nucleico de la invención moléculas de ADN genómico (ADNg), moléculas de ARN mensajero (ARNm) y moléculas de ADN complementarias (ADNc) a moléculas de ARNm.
Quedan incluidos dentro del ámbito de la presente invención los mutantes y variantes de la molécula de ácido nucleico de la invención. Entre dichos mutantes y variantes se incluyen las moléculas de ácido nucleico de la invención en las que, al menos, un nucleótido ha sido alterado, sustituido, eliminado o insertado. A modo ilustrativo, los mutantes y variantes de la molécula de ácido nucleico de la invención pueden tener 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 200, 500 y más cambios (alteraciones, sustituciones, eliminaciones o inserciones) de nucleótidos. También son posibles variantes degeneradas que codifican la misma pro teína, así como variantes no degeneradas que codifican una proteína distinta. La secuencia de nucleótidos de dichos mutantes y variantes codifica una proteína, o un fragmento biológicamente activo de la misma, que conserva, al menos, una de las actividades o funciones biológicas de la proteína correspondiente codificada por cualquier marco de lectura abierto (ORF) del cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina. Las formas alélicas de los genes de dicho cluster así como los polimorfismos también se hallan comprendidos dentro del ámbito de la presente invención.
En una realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención es una molécula de ácido nucleico aislada, opcionalmente purificada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la totalidad de las proteínas de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o fragmentos biológicamente activos de las mismas. En este caso, la molécula de ácido nucleico de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que contiene el cluster completo de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina. La secuencia de nucleótidos del cluster completo de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina se recoge en la SEQ ID NO:
1, una secuencia de ADN genómico de 64.650 pares de bases (pb) de
Micromonospora sp. MLl . El ámbito de la invención también incluye la cadena complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEQ ID NO: 1 , es decir, la formada por nucleótidos que son complementarios a los indicados en la SEQ ID NO: 1 (e.g., A sustituido por T, C sustituido por G y viceversa) y/ o secuencias de nucleótidos inversas [es decir, las secuencias generadas cambiando la dirección del sentido de la lectura e.g., de (5' → 3') a (3' → 5')].
La presente invención incluye, además, una molécula de ácido nucleico que hibrida con la molécula de ácido nucleico de la invención que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o su cadena complementaria; dicha molécula puede ser aislada de uri organismo productor de tiocoralina y codifica, al menos, una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina. Las técnicas y condiciones típicas de hibridación, conocidas por los expertos en la materia, se mencionan, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY (1989). En general, se utilizan condiciones convencionales o severas de hibridación para sondas homologas, mientras que se usan condiciones de hibridación menos severas para sondas parcialmente homologas que tienen menos del 100% de homología con la secuencia de la molécula del ácido nucleico diana. En este último caso (sondas parcialmente homologas), se pueden realizar una serie de hibridaciones Southern o Northern con diferentes condiciones. A modo ilustrativo, cuando la hibridación se lleva a cabo en un disolvente que contiene formamida, las condiciones preferidas incluyen el empleo de una temperatura y una fuerza iónica constante de, aproximadamente, 42°C con una solución que contiene 6X SSC, 50% de formamida. Condiciones de hibridación menos severas pueden utilizar la misma temperatura y fuerza iónica aunque, en este caso, la cantidad de formamida en el tampón de anillamiento sería menor (de aproximadamente 45% a 0%). Alternativamente, la hibridación puede llevarse a cabo en soluciones acuosas que no contienen formamida. En general, para la hibridación en medio acuoso, la fuerza iónica de la solución acuosa se mantiene igual, típicamente de aproximadamente Na+ 1 M, mientras que la temperatura de anillamiento puede reducirse de 68°C a 42°C.
La secuenciación del cluster completo de genes responsables de la biosín tesis de tiocoralina (SEQ ID NO: 1) reveló la presencia de 36 marcos de lectura abiertos (ORFs) completos y de otros 2 ORFs incompletos (ORFl y ORF38, véase más adelante). En la Tabla 1
(Ejemplo 12) se recoge la posición de los distintos ORFs implicados en la ruta biosintética de producción de tiocoralina, así como las secuencias de aminoácidos codificadas por dichos ORFs.
La molécula completa de ADN cromosómico (genómico) que contiene el cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina, que codifica todas las proteínas biosintéticas esenciales para la producción de tiocoralina, ha sido empaquetada eficientemente en dos plásmidos, concretamente en los cósmidos SuperCosl y pKC505 (Ejemplos 1 y 2). Esos dos cósmidos, que contienen el cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina, son suficientes para regenerar la ruta biosintética completa para la producción de tiocoralina. Por tanto, en una realización particular, la invención proporciona el cluster completo de genes biosintéticos de tiocoralina en dos cósmidos lo que permite disponer de unos medios sustancialmente más eficientes para producir tiocoralina.
En una realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención es una molécula de ácido nucleico aislada, opcionalmente purificada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma. En una realización concreta, la molécula de ácido nucleico de la invención se selecciona del grupo de genes formado por:
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 2- 535 de la SEQ ID NO: 1 {orfl);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 993- 1 130c de la SEQ ID NO: 1 {orf2);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1517-2131 de la SEQ ID NO: 1 (tio3); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
2154-2822c de la SEQ ID NO: 1 (Ízo4); la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 2970-379 Ic de la SEQ ID NO: 1 [UoS);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 3794-4777c de la SEQ ID NO: 1 (Íio6); la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 4904-561 1 dé la SEQ ID NO: 1 {tio7);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 5701 -6426c de la SEQ ID NO: 1 {tio8); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
6426-7688c de la SEQ ID NO: 1 {tio9); la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 7733-8524c de la SEQ ID NO: 1 (tiol O);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 8791-10002 de la SEQ ID NO: 1 {tiol l);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 10002-1 159Oc de la SEQ ID NO: 1 (tiol2);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 11847-13634 de la SEQ ID NO: 1 {tiol3); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
13734-15005c de la SEQ ID NO: 1 {tiol4);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 15005-16354c de la SEQ ID NO: 1 (fío J 5); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 16441- 18744c de la SEQ ID NO: 1 (tiol β);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 18774- 19055c de la SEQ ID NO: 1 (izo 17); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
19260-20036 de la SEQ ID NO: 1 {tiol8);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 20146-20880c de la SEQ ID NO: 1 (tiol 9);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 21 188-28969 de la SEQ ID NO: 1 {tio20);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 28979-38398 de la SEQ ID NO: 1 [tio21);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 38449-38661 de la SEQ ID NO: 1 {tio22); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
38642-41263 de la SEQ ID NO: 1 (tio23);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 41835-42368 de la SEQ ID NO: 1 {tio24);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 42395-43255c de la SEQ ID NO: 1 (tio25); la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 43340-4374 Ic de la SEQ ID NO: 1 (tio26);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 44152-49563 de la SEQ ID NO: 1 (tio27); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
49635-53669 de la SEQ ID NO: 1 (tio28); la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 53749-55305c de la SEQ ID NO: 1 (orf29);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 55384-57222c de la SEQ ID NO: 1 (orf30); la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 57895-58467c de la SEQ ID NO: 1 {orf31); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 58535-59206c de la SEQ ID NO: 1 (orf32);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 59298-59564c de la SEQ ID NO: 1 {orf33); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
5961 1-601 14c de la SEQ ID NO: 1 (orf34);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 60202-60888 de la SEQ ID NO: 1 {orf35);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 60960-62240 de la SEQ ID NO: 1 {orf36);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 62300-62833 de la SEQ ID NO: 1 {orf37);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 62925-64650 de la SEQ ID NO: 1 [orf38); o fragmentos de las mismas que codifican fragmentos biológicamente activos de proteínas de la ruta biosintética de producción de tiocoralina.
En otra realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención es una molécula de ácido nucleico aislada, opcionalmente purificada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dos o más proteínas de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o fragmentos biológicamente activos de las mismas. En una realización concreta, la molécula de ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que comprende dos o más genes seleccionados entre los genes identificados como orfl, orf2, tio3, tio4, tio5, tio6, tio7, tio8, fio 9, fio 10, fio J J, tiol2, tiol3, Ho 14, fio 15, tío 16, tiol 7, tío 18, tiol 9, tio20, tio21, tio22, tio23, tio24, tio25, tio26, tio27, tio28, oτf29, orf30, orβl, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, orf37, orf38 y fragmentos de los mismos que codifican fragmentos biológicamente activos de proteínas de la ruta biosintética de producción de tiocoralina.
En otra realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención es una molécula de ácido nucleico aislada, opcionalmente 1
purificada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un mutante o variante de la misma, en donde dicha proteína se selecciona del grupo formado por las proteínas identificadas como ORFl (SEQ ID NO: 2), ORF2 (SEQ ID NO: 3), Tio3 (SEQ ID NO: 4), Tio4 (SEQ ID NO: 5), Tio5 (SEQ ID NO: 6), Tioδ (SEQ ID NO: 7), Tio7 (SEQ ID NO: 8), Tio8 (SEQ ID NO: 9), Tio9 (SEQ ID NO: 10), TiolO (SEQ ID NO: 11), Tiol l (SEQ ID NO: 12), Tiol2 (SEQ ID NO: 13), Tiol3 (SEQ ID NO: 14), Tiol4 (SEQ ID NO: 15), Tiol5 (SEQ ID NO: 16), Tiolβ (SEQ ID NO: 17), Tiol7 (SEQ ID NO: 18), Tiolδ (SEQ ID NO: 19), Tiol9 (SEQ ID NO: 20), Tio20 (SEQ ID NO: 21), Tio21 (SEQ ID NO: 22), Tio22 (SEQ ID NO: 23), Tio23 (SEQ ID NO: 24), Tio24 (SEQ ID NO: 25), Tio25 (SEQ ID NO: 26), Tio26 (SEQ ID NO: 27), Tio27 (SEQ ID NO: 28), Tio28 (SEQ ID NO: 29), ORF29 (SEQ ID NO: 30), ORF30 (SEQ ID NO: 31), ORF31 (SEQ ID NO: 32), ORF32 (SEQ ID NO: 33), ORF33 (SEQ ID NO: 34), ORF34 (SEQ ID NO: 35), ORF35 (SEQ ID NO: 36), ORF36 (SEQ ID NO: 37), ORF37 (SEQ ID NO: 38), ORF38 (SEQ ID NO: 39). Dichas proteínas pueden obtenerse a partir de los correspondientes orfs previamente mencionados (orfl, orf2, tio3, tio4, tio5, tioδ, tio7, tio8, tio9, tiol O, tiol l, tio!2, tio!3, tiol4, tio! 5, tiol δ, tio! 7, tiolδ, tiol 9, tio20, tio21, tio22, tio23, tio24, tio25, tio26, tio27, tio28, orf29, orf30, orβl, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, orf37, orf38) del cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina (SEQ ID NO: 1), o de las correspondientes regiones, mutantes o variantes de los mismos.
En otra realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención es una molécula de ácido nucleico aislada, opcionalmente purificada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una variante de una pro teína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma, en donde dicha variante es, al menos, un 30%, ventajosamente un 50%, preferentemente un 60%, más preferentemente un 70%, aún más preferentemente un 80%, particularmente un 90%, más particularmente un 95% o más, idéntica en su secuencia de aminoácidos a la de una proteína seleccionada entre las proteínas cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en SEQ ID NO: 2-39, o a fragmentos biológicamente activos de las mismas. Dicha variante conserva, al menos, una de las actividades o funciones biológicas de la correspondiente proteína codificada por cualquiera de los orfs del cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición que comprende, al menos, una molécula de ácido nucleico de la invención, preferentemente una molécula aislada de ácido nucleico. En una realización particular, dicha composición comprende una molécula de ácido nucleico de la invención. En otra realización particular, dicha composición comprende dos o más moléculas de ácido nucleico de la invención. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden ser tanto de ADN como de ARN.
La molécula de ácido nucleico de la invención puede ser aislada a partir de cualquier organismo productor de tiocoralina, bien de forma natural o bien de forma recombinante porque se haya insertado el cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina en una célula hospedadora (host) apropiada; no obstante, en una realización particular, dicha molécula de ácido nucleico de la invención ha sido aislada del actinomiceto marino Micromonospora sp. MLl (véase la parte experimental, Etapa 1 , Ejemplos 1-4).
El aislamiento y caracterización del ADN genómico (cromosómico) y del ADN recombinante clonado, a partir de células hospedadoras apropiadas puede realizarse mediante técnicas de hibridación convencionales o severas, utilizando la totalidad o parte de una secuencia de nucleótidos como sonda para rastrear una genoteca apropiada. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una sonda que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención o un fragmento de la misma. En general, las sondas comprenden convenientemente una secuencia de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 o más nucleótidos. Las secuencias con una longitud de 20 a 60 nucleótidos son las preferidas. En una realización particular, dicha sonda puede utilizarse para la detección de genes implicados en la biosíntesis de tiocoralina en Micromonospora sp. El empleo de dicha sonda para la detección de un ácido nucleico, e.g., ADNg, ADNc o ARNm, relacionado con la biosíntesis de tiocoralina constituye un aspecto adicional de esta invención.
Alternativamente, el aislamiento y caracterización del ADN genómico (cromo sómico) y del ADN recombinante clonado, a partir de células hospedadoras apropiadas puede realizarse mediante técnicas basadas en la amplificación enzimática de ácidos nucleicos. A modo ilustrativo, se pueden diseñar oligonucleótidos iniciadores (en base a las secuencias conocidas de ADN y de proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina) que pueden ser utilizados en reacciones de amplificación enzimática, por ejemplo, PCR, para amplificar e identificar otras secuencias idénticas o relacionadas.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser aisladas y, si se desea, purificadas, por métodos convencionales.
Aunque, en general, las moléculas de ácido nucleico de la invención se obtendrán por métodos recombinantes o de aislamiento, la invención también contempla la posibilidad de que las moléculas de ácido nucleico de la invención sean obtenidas por síntesis química, las cuales tendrán la misma, o sustancialmente la misma, estructura que las derivadas directamente de los organismos productores de tiocoralina, tanto tipo salvaje (wt) como mutantes. En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, en adelante vector de la invención, que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica al menos una pro teína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma. En una realización particular, el vector de la invención es un vector o un plásmido biológicamente funcional, tal como un vector de clonación o un vector de expresión.
En una realización concreta, el vector de la invención es un vector de clonación, preferentemente, un cósmido. Los vectores de clonación preferidos se seleccionan por su capacidad para incorporar grandes secuencias de ADN (e.g., clusters completos de genes implicados en la biosíntesis de productos de interés). En general, dichos vectores son vectores convencionales y están disponibles comúnmente. En la presente invención se contempla, además, que el material genético pueda reducirse para finalmente contenerse en un sólo vector o plásmido de clonación (e.g., cósmido) mediante manipulación genética por técnicas conocidas por el experto en la materia. El ensamblaje puede llevarse a cabo mediante clonaje, PCR o genes sintéticos o combinación de cualquiera de estas técnicas conocidas en el estado de la técnica.
En otra realización particular, el vector de la invención es un vector de expresión apropiado para su inserción en una célula hospedadora adecuada. La inserción de dicho vector en dicha célula hospedadora adecuada puede realizarse por cualquier método convencional de transferencia de material genético (e.g., transformación, transfección, etc.).
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, en adelante célula hospedadora de la invención, trasformada o transfectada con un vector de la invención. Dicha célula hospedadora de la invención contiene una o más moléculas de ácido nucleico de la invención. En una realización particular, la célula hospedadora de la invención contiene una molécula de ácido nucleico de la invención. En otra realización particular, la célula hospedadora de la invención contiene dos o más moléculas de ácido nucleico de la invención; en este caso, dichas moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Una célula hospedadora de la invención preferida es una célula hospedadora trasformada o transfectada establemente con un vector de la invención que comprende una molécula de ácido nucleico (exógeno) de la invención que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma, de forma suficiente como para dirigir la biosín tesis y/ o ensamblaje de la tiocoralina. Preferentemente, la célula hospedadora es un microorganismo, más preferentemente una bacteria. En una realización particular, dicha célula hospedadora es una bacteria Gram-positiva, tal como un actinomiceto, por ejemplo, un estreptomiceto.
Aunque en los ejemplos de la presente invención se han usado diversas especies de estreptomicetos, tales como Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Streptomyces albus y Streptomyces aveimitilis como hospedadores heterólogos, la expresión heteróloga de los genes implicados en la biosíntesis de la tiocoralina se puede realizar en otros estreptomicetos, actinomicetos, etc., siempre y cuando sean capaces de ser transformados, preferentemente de forma estable, con los vectores de la invención. La expresión in υitro de las proteínas puede ser realizada, si se desea, usando métodos convencionales.
En una realización particular, la invención proporciona una célula hospedadora de la invención, tal como, por ejemplo, una bacteria recombinante, en la que, al menos, una región de la molécula de ácido nucleico de la invención ha sido alterada para dar lugar a una célula hospedadora recombinante, tal como una bacteria recombinante, que produce niveles alterados de tiocoralina con respecto a la correspondiente célula (bacteria) productora de tiocoralina no recombinante, es decir, wt. Para ello, se pueden utilizar técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia que incluyen por ejemplo, aumentar el número de copias de los genes responsables de los dominios más importantes de las NRPSs implicadas en la producción de tiocoralina o aumentar las secuencias reguladoras de la expresión génica de esos genes por técnicas de ingeniería genética conocidas en el estado de la técnica y así aumentar el rendimiento en la producción de tiocoralina.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína, en adelante proteína de la invención, codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención.
Tal como aquí se utiliza, el término "proteína" significa polipéptidos, enzimas y similares, codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención que comprende la ruta biosintética para la producción de tiocoralina. Las proteínas de la invención incluyen cadenas de aminoácidos de longitudes variables, incluyendo cadenas de aminoácidos de longitud completa, en donde los restos de los aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos covalentes, así como fragmentos biológicamente activos de dichas proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina, así como las variantes biológicamente activas de las mismas. Las proteínas de la invención pueden ser naturales, recombinantes o sintéticas. A modo ilustrativo, dichas proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina pueden ser producidas a través de la tecnología del ADN recombinante convencional insertando una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína en un vector de expresión apropiado y expresar la proteína en una célula hospedadora apropiada o bien a través de síntesis química convencional de péptidos, por ejemplo, mediante el método de síntesis en fase sólida de Merrifield (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)) en el que los aminoácidos se unen de forma individual y secuencial a la cadena aminoacídica. Alternativamente, la síntesis de proteínas de la invención puede realizarse utilizando equipos para la síntesis automatizada de proteínas comercializados por distintos fabricantes (e.g., Perkin-Elmer, Inc.).
Las variantes biológicamente activas incluidas dentro del ámbito de la presente invención comprenden, como mínimo, un fragmento biológicamente activo de la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención, es decir, una parte de la estructura de la proteína que retiene la función activa de la proteína, por ejemplo, la parte de la tioesterasa codificada por el gen tiol8 que tiene la misma, o sustancialmente la misma, actividad que la proteína Tio 18 codificada por dicho gen tiol 8, es decir, tiene, al menos, una similaridad o potencia de, al menos, aproximadamente un 70%, ventajosamente de, al menos, un 80%, preferentemente de, al menos, un 90%, más preferentemente, de alrededor del 95% aproximadamente.
Las variantes biológicamente activas de las proteínas de la invención incluyen estructuras de aminoácidos activas en las que se han eliminado, sustituido o añadido aminoácidos, alelos que ocurren de forma natural, etc. El fragmento biológicamente activo puede ser identificado fácilmente sometiendo la proteína, longitud completa, a digestión química o enzimática para preparar fragmentos y, a continuación, ensayar dichos fragmentos mediante ensayos convencionales para analizar los fragmentos de la estructura aminoacídica que conservan la misma, o sustancialmente la misma, actividad biológica que la proteína longitud completa.
En una realización particular, la proteína de la invención es una proteína aislada, opcionalmente purificada, implicada en la biosíntesis de tiocoralina, codificada por un gen seleccionado del grupo formado por los genes identificados como orfl, orf2, tio3, tio4, tio5, tioβ, tio7, tio8, tio9, tiol O, tiol l, tiol2, tiol3, tiol4, tiol δ, tiol 6, tiol 7, tiol 8, tiol 9, tio20s tio21, tio22, tio23, tio24, tio25, tio26, tio27, tio28, orf29, orf30, oφl, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, or/37y orf38.
En otra realización particular, la proteína de la invención es una proteína aislada, opcionalmente purificada, implicada en la biosíntesis de tiocoralina, seleccionada del grupo formado por las proteínas identificadas como ORFl (SEQ ID NO: 2), ORF2 (SEQ ID NO: 3), Tio3 (SEQ ID NO: 4), Tio4 (SEQ ID NO: 5), Tio5 (SEQ ID NO: 6), Tio6 (SEQ ID NO: 7), Tio7 (SEQ ID NO: 8), Tio8 (SEQ ID NO: 9), Tio9 (SEQ ID NO: 10), TiolO (SEQ ID NO: 11), Tiol l (SEQ ID NO: 12), Tiol2 (SEQ ID NO: 13), Tiol3 (SEQ ID NO: 14), Tiol4 (SEQ ID NO: 15), Tiol5 (SEQ ID NO: 16), Tiol6 (SEQ ID NO: 17), Tiol7 (SEQ ID NO: 18), Tiolβ (SEQ ID NO: 19), Tiol9 (SEQ ID NO: 20), Tio20 (SEQ ID NO: 21), Tio21 (SEQ ID NO: 22), Tio22 (SEQ ID NO: 23), Tio23 (SEQ ID NO: 24), Tio24 (SEQ ID NO: 25), Tio25 (SEQ ID NO: 26), Tio26 (SEQ ID NO: 27), Tio27 (SEQ ID NO: 28), Tio28 (SEQ ID NO: 29), ORF29 (SEQ ID NO: 30), ORF30 (SEQ ID NO: 31), ORF31 (SEQ ID NO: 32), ORF32 (SEQ ID NO: 33), ORF33 (SEQ ID NO: 34), ORF34 (SEQ ID NO: 35), ORF35 (SEQ ID NO: 36), ORF36 (SEQ ID NO: 37), ORF37 (SEQ ID NO: 38), ORF38 (SEQ ID NO: 39), y combinaciones de las mismas, o fragmentos biológicamente activos de las mismas. Las funciones hipotéticas de dichas proteínas se recogen en la Tabla 1.
Los orfs del cluster de genes responsable de la biosíntesis de tiocoralina, que codifican las proteínas implicadas en la biosíntesis de dicho compuesto, pueden ser identificados utilizando técnicas convencionales. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas técnicas incluyen el análisis computacional para localizar los codones de inicio y parada, las localizaciones putativas de los marcos de lectura basadas en las frecuencias de los codones, alineamientos por similitud a genes expresados en otros actinomicetos y similares. De esta manera, las proteínas de la invención pueden ser identificadas utilizando la secuencia de nucleótidos de la presente invención y los orfs o las proteínas codificadas por los mismos pueden ser aisladas y, si se desea, purificadas, o, alternativamente, sintetizadas por métodos químicos. Se pueden diseñar construcciones génicas para la expresión de dichos productos en base a los orfs e incluir los elementos de regulación de expresión (promotores, terminadores, etc.) apropiados y dichas construcciones génicas pueden ser introducidas en células hospedadoras apropiadas para expresar la proteína o proteínas codificadas por una o más orfs.
Las proteínas de la invención pueden ser aisladas y, si se desea, purificadas, por métodos convencionales. Preferentemente, las proteínas se obtienen en una forma sustancialmente pura, aunque también puede ser aceptable un grado inferior de pureza, típicamente del 80% al 90% aproximadamente. La invención también contempla la posibilidad de que las proteínas de la invención sean obtenidas por síntesis química, las cuales tendrán la misma, o sustancialmente la misma, estructura que las derivadas directamente de los organismos productores de tiocoralina, tanto tipo salvaje (wt) como mutantes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir una proteína de la invención implicada en la biosíntesis de tiocoralina que comprende crecer, bajo condiciones (nutrientes y ambientales) apropiadas, un organismo productor de tiocoralina, y, si se desea, aislar una o más de dichas proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina. Si se desea, dicha proteína de la invención puede ser aislada y purificada por métodos convencionales, tales como los descritos previamente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir tiocoralina que comprende crecer, bajo condiciones apropiadas para producir dicho compuesto, un organismo productor de tiocoralina en el que se ha aumentado el número de copias de genes que codifican proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina, y, si se desea, aislar la tiocoralina.
En una realización particular, el organismo productor de tiocoralina es un actinomiceto, tal como, por ejemplo, Micromonospora sp, en el que se ha aumentado el número de copias de genes que codifican proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina. El aumento en el número de copias de genes que codifican proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. En este caso, el método descrito previamente comprende fermentar dicho organismo bajo condiciones nutrientes y ambientales adecuadas para la expresión de los genes implicados en la producción de tiocoralina. Si se desea, la tiocoralina producida puede ser aislada y purificada del medio de cultivo por métodos convencionales.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir tiocoralina que comprende crecer, bajo condiciones apropiadas para producir dicho compuesto, un organismo productor de tiocoralina en el que la expresión de los genes que codifican las proteínas responsables de la biosíntesis de tiocoralina ha sido modulada mediante manipulación o reemplazo de uno o más genes que codifican proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina o bien mediante la manipulación de las secuencias responsables de regular la expresión de dichos genes, y, si se desea, aislar la tiocoralina. Preferentemente, la expresión de los genes que codifican para dichas proteínas responsables de la biosíntesis de tiocoralina ha sido mejorada. Para ello, se pueden eliminar las secuencias génicas no esenciales en el proceso de biosíntesis de tiocoralina, o bien se puede aumentar la eficiencia de las secuencias reguladoras de la expresión génica de dichos genes por técnicas de ingeniería genética conocidas por los expertos en la materia. De este modo se puede aumentar el rendimiento en la producción de tiocoralina. La manipulación genética para eliminar las secuencias génicas no esenciales en el proceso de biosíntesis de tiocoralina, o bien para aumentar la eficiencia de las secuencias reguladoras de la expresión génica de dichos genes puede llevarse a cabo por técnicas de ingeniería genética conocidas por los expertos en la materia.
En una realización particular, el organismo productor de tiocoralina es un actinomiceto, tal como, por ejemplo, Micromonospora sp, en el que la expresión de los genes que codifican las proteínas responsables de la biosíntesis de tiocoralina ha sido modulada mediante manipulación o reemplazo de uno o más genes que codifican proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina o bien mediante la manipulación de las secuencias responsables de regular la expresión de dichos genes, lo que puede llevarse a cabo por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. En este caso, el método descrito previamente comprende fermentar dicho organismo bajo condiciones nutrientes y ambientales adecuadas para la expresión de los genes implicados en la producción de tiocoralina. Si se desea, la tiocoralina producida puede ser aislada y purificada del medio de cultivo por métodos convencionales.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir tiocoralina que comprende crecer, bajo condiciones apropiadas para producir dicho compuesto, una célula hospedadora de la invención transformada o transfectada con un vector de la invención que comprende el cluster de genes responsable de la biosíntesis de tiocoralina, y, si se desea, aislar la tiocoralina. Las condiciones (nutrientes, ambientales, etc.) se seleccionarán en función de la naturaleza de la células hospedadora.
En una realización particular, la célula hospedadora de la invención se selecciona entre un organismo productor de tiocoralina de forma nativa, un organismo no-productor de tiocoralina de forma nativa y un organismo manipulado genéticamente para producir tiocoralina. En una realización particular, dicha célula hospedadora de la invención es un actinomiceto o un estreptomiceto.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento, basado en la utilización de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina de Micromonospora sp. MLl , para la producción de dicho compuesto en otro actinomiceto, que comprende:
(1) la obtención de mutantes afectados en genes específicos de la ruta de biosíntesis de tiocoralina;
(2) el aislamiento de la región del cromosoma de Micromonospora sp. MLl que contiene el cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina;
(3) la obtención y análisis de la secuencia de nucleótidos del cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina; y
(4) la producción heteróloga de tiocoralina en otros actinomicetos.
La identificación y el aislamiento de la región del cromosoma de Micromonospora sp. MLl que contiene el cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina, así como el análisis de la secuencia de nucleótidos de dicho cluster puede llevarse a cabo en base a las enseñanzas proporcionadas por esta invención, ilustrada, de forma no limitativa, en los Ejemplos que acompañana a esta descripción.
Los mutantes afectados en genes específicos de la ruta de biosíntesis de tiocoralina pueden ser identificados por métodos convencionales. En una realización particular, dichos mutantes pueden ser identificados mediante cultivo y medida de la producción de tiocoralina por métodos convencionales, por ejemplo, por HPLC-MS, tal como se menciona en el Ejemplo 5.
La totalidad o una parte del cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina puede ser introducida en un actinomiceto por métodos convencionales, e.g., por transformación o transfección, para la producción heteróloga de tiocoralina por fermentación de un medio nutriente apropiado, bajo las condiciones apropiadas para la producción de tiocoralina y, si se desea, la tiocoralina así obtenida puede ser aislada y/o purificada por métodos convencionales.
La determinación del cluster de genes responsable de la biosíntesis de la tiocoralina es de gran importancia comercial. El aislamiento y descripción completa del cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina proporcionado por esta invención permite aumentar la producción de la tiocoralina y manipular organismos para que produzcan tiocoralina. En este sentido, se puede aumentar el número de copias de los genes responsables de los dominios más importantes de las NRPSs implicadas en la producción de tiocoralina o aumentar la eficiencia de las secuencias reguladoras de la expresión génica de esos genes por técnicas de ingeniería genética conocidas en el estado de la técnica y así aumentar el rendimiento en su producción.
Otra ventaja asociada con la identificación y clonaje del cluster completo de genes de la tiocoralina proporcionado por la presente invención se relaciona con la producción eficiente de tiocoralina. De hecho, permite obtener un compuesto de gran interés en un menor número de pasos. La eliminación de secuencias no esenciales en el proceso de biosíntesis en mutantes del cluster reduce considerablemente el tiempo necesario para producir el compuesto de interés. Las secuencias restantes son suficientes y mantienen su funcionalidad para producir tiocoralina. PARTE EXPERIMENTAL
Los procedimientos experimentales de la presente invención incluyen métodos de Biología Molecular convencionales en el actual estado de la técnica. Pueden encontrarse descripciones detalladas de las técnicas no explicadas aquí en los manuales de Kieser et al.
(Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich,
Gran Bretaña, 2000) y Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor,
Nueva York, EE. UU, 2001). Las siguientes etapas describen en detalle, sin limitación, la presente invención.
Etapa 1. Aislamiento de la región del cromosoma de Micromonospora sp. MLl que contiene los genes de la ruta de biosíntesis de tiocoralina
Ejemplo 1. Construcción de una genoteca en SuperCosl a partir de ADN cromosómico de Micromonospora sp. MH A partir de un cultivo de Micromonospora sp. MLl (Espliego, F.
Tesis Doctoral, 1996, Universidad de León; de la Calle, F. Tesis Doctoral, 1998, Universidad Autónoma de Madrid), disponible en la colección de cultivos de Pharma Mar, S. A., en medio MIAM2 (5 g/L de extracto de levadura, 3 g/L de extracto de carne, 5 g/L de triptona, 5 g/L de glucosa, 20 g/L de dextrina, 4 g/L de CaCÜ3, 10 g/L de sales marinas. pH 6,8) se obtuvo ADN cromosómico utilizando el protocolo "salting out" (Kieser et al. 2000). Este ADN cromosómico fue sometido a digestión parcial con la endonucleasa BarήHl y los fragmentos obtenidos fueron utilizados para generar una genoteca en el cósmido SuperCos 1 (Stratagene), digerido con BamHl. La generación de esta genoteca en E. coli XL-I Blue MR (Stratagene) se realizó siguiendo procedimientos ya descritos (Sambrook et al. 2001) y el kit de empaquetamiento in vitro Gigapack III GoId Packaging Extract Kit (Stratagene) .
1.000 colonias transductantes de E. coli fueron depositadas sobre membranas de nylon para realizar un análisis de hibridación de colonia in situ mediante los protocolos habituales (Sambrook et al. 2001).
Ejemplo 2. Construcción de una genoteca en pKC505 a partir de ADN cromosómico de Micromonospora sp. MLl
A partir de un cultivo de Micromonospora sp. MLl en medio MIAM2 se obtuvo ADN cromosómico utilizando el protocolo "salting out" (Kieser et al. 2000). Este ADN cromosómico fue sometido a digestión parcial con la endonucleasa Sau3Al y los fragmentos obtenidos fueron utilizados para generar una genoteca en el cósmido bifuncional Escherichia coli/ Streptomy ees pKC505 (Richardson at al. 1987, Gene 61, 231-241), digerido con BamHl. La generación de esta genoteca en E. coli ED8767 se realizó siguiendo procedimientos ya descritos (Sambrook et al. 2001) y el kit de empaquetamiento in vitro Gigapack III GoId Packaging Extract Kit (Stratagene).
3.300 colonias transductantes de E. coli fueron depositadas sobre placas de microtitulación de 96 pocilios conteniendo medio TSB (Merck) con 25 μg/ml de apramicina e incubadas a 30°C durante 24 horas. Estos clones fueron replicados a placas de TSA (Tryptic Soy Agar) con 25 μg/ml de apramicina, y tras una noche a 30°C, las colonias fueron transferidas a membranas de nylon para realizar un análisis de hibridación de colonia in situ mediante los protocolos habituales (Sambrook et al. 2001).
Ejemplo 3. Diseño de oligonucleótidos específicos para dominios de adenilación en NRPS y su amplificación por PCR a partir de ADN cromosómico de Micromonospora sp. MLl En base a la estructura de la tiocoralina se esperaba que las
NRPSs encargadas de su biosíntesis poseyeran de uno a tres dominios de adenilación que activasen L-cisteína y un dominio que activase glicina. En base a esto se diseñaron oligonucleótidos degenerados, basados en regiones conservadas dentro de los dominios de adenilación de NRPSs, capaces de amplificar específicamente fragmentos de ADN codificantes de dominios de adenilación de NRPSs que se combinaron con oligonucleótidos descritos en la bibliografía para la amplificación de dominios de adenilación de NRPSs.
La amplificación por PCR con los oligonucleótidos iniciadores: MTF2 (5'- GCNGGYGGYGCNTAYGTNCC-3'; Neilan et al. 1999. J. Bacteriol. 181(13):4089-4097) y PSV-4 (5'-SAGSAGGSWGTGGCCGCCSAGCTCGAAGAA-S') dio como resultado una banda de 1 ,3 kb que fue clonada en un vector pGEM-T Easy (Promega). El programa de PCR utilizado fue de un ciclo inicial de 95°C-2 min; 60°C- 15 min; 72°C-6 min seguido de 20 ciclos de 95°C- 1 min; 60°C-2 min; 72°C-2 min. Como molde se utilizó ADN cromosómico de Micromonospora sp. MLl .
El análisis de los clones por la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) demostró que había tres tipos de clones diferentes correspondientes a péptido sintetasas, pGPSVl, pGPSV2 y pGPSV3, que contenían los fragmentos de los dominios de adenilación denominados
PSVl, PS V2 y PS V3, respectivamente.
Posteriormente, el inserto de los clones fue liberado con una digestión EcoRI y el fragmento fue clonado en pBBRl-MCS2 (Kovach, M. E. et al. 1995. Gene. 166: 175-176), para construir los plásmidos pBPSVl, pBPSV2 y pBPSV3, respectivamente, que contenían los fragmentos de los dominios de adenilación denominados PSVl, PSV2 y PSV3, respectivamente. A partir de la banda de PCR obtenida con los oligonucleótidos iniciadores MTF2 y PS4 se realizó una PCR anidada o "nested-PCR" (30 ciclos de 95°C-1 min; 6O0C- I min; 72°C-1 min) con los oligonucleótidos iniciadores PS2-TG: δ'-ACNGGNMRNCCNAARGG-S' y MTR: 5'- CCNCGDATYTTNACY-3' (Neilan et al. 1999. J. Bacteriol. 181 (13):4089- 4097) para obtener una banda de 750 pb que fue clonado en un vector pGEM-T Easy (Promega). El análisis de los clones por RFLP demostró que había dos nuevos tipos de clones diferentes correspondientes a péptido sintetasas, pGPSV4 y pGPSV5 respectivamente, que contenían los fragmentos de los dominios de adenilación denominados PSV4 y PSV5, respectivamente.
La amplificación por PCR con los oligonucleótidos iniciadores PS2M: 5'- TACACSGGCWSSACSGG-3' y PSV-4 dio como resultado una banda de 1 ,3 kb que fue clonada en un vector pGEM-T Easy (Promega).
El programa utilizado fue un Touch-down empezando con 5 ciclos a la temperatura de anillamiento de 72°C, seguido de 10 ciclos a 700C de anillamiento para terminar con 20 ciclos a 68°C (96°C-1 min; 72°C- 68°C-2 min; 72°C-3 min). El análisis de los clones por RFLP demostró que había un nuevo tipo de clon correspondiente a una péptido sintetasa, pGPSVδ que contenía el fragmento del dominio de adenilación denominado PSV6.
Ejemplo 4. Análisis de las genotecas por hibridación en colonia
Las genotecas construidas en SuperCosl y en pKC505 (Ejemplos
1 y 2) fueron sometidas a sendos análisis de hibridación de colonias in situ (Sambrook et al. 2001) utilizando el sistema DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche). Como sondas se utilizaron los 6 fragmentos de los dominios de adenilación denominados PSVl- PSV6.
A partir de la genoteca construida en SuperCosl se obtuvieron: - 3 cósmidos (clones) positivos que hibridaban con el fragmento PSVl , denominados pCTla, pCTlb y pCTlc;
- 3 cósmidos (clones) positivos que hibridaban con el fragmento PSV2, denominados pCT2a, pCT2b y ρCT2c; de éstos, ρCT2c hibridaba también con el fragmento PS V5;
- 2 cósmidos (clones) positivos que hibridaban con el fragmento PSV3, denominados pCT3a y pCT3b; además, ambos hibridaban también con el fragmento PS V6; y
- 1 cósmido (clon) positivo que hibridaba con PSV4, denominado pCT4a.
A partir de la genoteca construida en pKC505 se obtuvieron 55 cósmidos positivos:
- 10 cósmidos (clones) positivos que hibridaban con el fragmento PSV2, denominados cosVl-F8, cosV7-D2, cosV7-D 12, cosV14-H4, cosV19-B4, cosV29-B9, cosV31-B l l , cosV31-H 10, cosV33-D12, cosV33-F7;
- 7 cósmidos positivos que hibridaban con el fragmento PSV5, denominados cosVl-B6, cosV6-H8, cosVl l-FlO, cosV20-F8, cosV22-F7, cosV25-B3, cosV32-B4; y
- 38 cósmidos positivos que hibridaban con los fragmentos PSVl , PSV3, PSV4 o PSV6, denominados cosVl-B7, cosVl-F5, cosV2-E5, cosV2-Fl l, cosV3-D9, cosV4-D2, cosV5-D7, cosV5-G6, cosV6-A7, cosV6-A12, cosV7-E7, cosV8-F8, cosV9-H7, cosV10-A3, cosVl l-B4, cosVl l-G2, cosV12-B12, cosV13-B2, cosV16-Hl l, cosV17-A3, cosV19- F4, cosV20-B3, cosV20-H5, cosV21-H6, cosV22-B l l, cosV23-F8, cosV26-Hl l, cosV28-Gl , cosV29-El , cosV29-G6, cosV30-G5, cosV31- A12, cosV31-E10, cosV32-A7, cosV32-D 10, cosV33-A8, cosV33-D10, cosV33-F10.
Etapa 2. Generación de imitantes en seis regiones de adenilación aisladas Los seis fragmentos de los dominios de adenilación amplificados previamente a partir de ADN cromosómico de Micromonospora sp. MLl (PSVl , PSV2, PSV3, PSV4, PSV5 y PSV6) fueron utilizados para experimentos independientes de interrupción génica con el fin de evaluar las regiones implicadas en la biosíntesis de tiocoralina (Ejemplos 6-1 1).
El plásmido conjugativo E. coli/ Streptomyces pOJ260 (Bierman et al. 1992, Gene 1 16, 43-49) fue utilizado para generar las construcciones pFL903, pFL904, pFL905, pFL906, pFL940 y pFL941 que contenían las regiones PSVl a PSV6, respectivamente. Estas construcciones fueron introducidas en la cepa conjugativa E. coli ET12567 (pUB307) (Kieser et al. 2000) y desde aquí, por conjugación, en la cepa Micromonospora sp. MLl , utilizando procedimientos descritos (Kieser et al. 2000). Los clones transconjugantes se seleccionaron con apramicina y la integración en la región cromo sómica apropiada fue comprobada mediante hibridación Southern utilizando como sondas las regiones de los fragmentos de los dominios de adenilación PSVl a PSV6 correspondientes. Los transconjugantes seleccionados de cada región de los dominios de adenilación PSV (PSV1-PSV6) se crecieron en medio MT4 de producción de tiocoralina y posteriormente su micelio extraído con acetonitrilo y analizado por HPLC-MS (Ejemplo 5). Solo los mutantes afectados en los dominios de adenilación PSV2 y PSV5 poseían un fenotipo no-productor de tiocoralina (Ejemplos 7 y 10). La producción de tiocoralina en mutantes con deleciones en PSVl , PSV3, PSV4 y PSV6 fue similar a la de la cepa wt (Ejemplos 6, 8, 9 y 1 1). Estos experimentos pusieron de manifiesto que los dominios de adenilación PSV2 y PSV5 estaban implicados en la biosíntesis de tiocoralina.
Ejemplo 5. Detección por HPLC de la producción de tiocoralina Los extractos con acetonitrilo de las diferentes cepas analizadas fueron concentrados en rotavapor y resuspendidos en DMSO antes de ser utilizados para análisis por HPLC-MS.
Las muestras (10 μl) se analizaron por HPLC, utilizando una columna de fase reversa (Symmetry Cis, 2.1 X 150 mm, Waters), usando como disolventes acetonitrilo y una mezcla de 0, 1% de ácido trifluoroacético en agua. Durante los primeros 4 minutos se mantiene un concentración de la fase móvil con 10% de acetonitrilo de forma isocrática. Después, hasta los 30 minutos, se inicia un gradiente lineal desde el 10% hasta el 100% de acetonitrilo. El flujo utilizado es de 0,25 mL/min. La detección y caracterización espectral de los picos se llevaron a cabo utilizando un detector de fotodiodos y mediante el empleo del software informático Millennium (Waters). Los cromatogramas se extrajeron a una absorbancia de 230 nm.
Ejemplo 6. Interrupción génica en la región PSVl
A partir del plásmido pBPSVl se obtuvo la región PSVl como una banda EcoRI de 1,3 kb y se clonó en el sitio EcoRI del plásmido conjugativo E. coli/ Streptomy ees pOJ260, generándose pFL903. pOJ260 contiene un gen que confiere resistencia a apramicina en Streptomyces y en estas células es un plásmido suicida.
La construcción pFL903 fue introducida en la cepa conjugativa E. coli ETl 2567 (pUB307) y desde ahí, por conjugación, en la cepa Micromonospora sp. MLl, utilizando procedimientos descritos (Kieser et al. 2000). Los clones transconjugantes se seleccionaron con 25 μg/ml de apramicina y a partir de ADN cromosómico de los mismos se comprobó mediante hibridación Southern que efectivamente la región PSVl había sido interrumpida. La sonda utilizada en este caso fue la banda PSVl . El muíante Micromonospora sp. ΔPSV1 fue crecido en medio MT4 de producción de tiocoralina y posteriormente su micelio fue extraído con acetonitrilo y analizado por HPLC-MS (véase el Ejemplo 5), resultando ser productor de tiocoralina. La composición del medio de cultivo MT4 por litro es la siguiente: 6 g de harina de soja, 2,5 g de extracto de malta, 2,5 g de peptona, 5 g de dextrosa, 20 g de dextrina, 4 g de CaCÜ3, 10 g de sales marinas, ajustar el pH hasta 6,8.
Ejemplo 7. Interrupción génica en la región PSV2
A partir del plásmido pBPSV2 se obtuvo la región PSV2 como una banda EcoRl de 1 ,3 kb y se clonó en el sitio EcoRI del plásmido pOJ260, generándose pFL904.
La construcción pFL904 fue introducida en la cepa conjugativa E. coli ET 12567 (pUB307) y desde ahí, por conjugación, en la cepa Micromonospora sp. MLl . Los clones transconjugantes se seleccionaron con 25 μg/ml de apramicina y a partir de ADN cromosómico de los mismos se comprobó mediante hibridación Southern que efectivamente la región PSV2 había sido interrumpida. La sonda utilizada en este caso fue la banda PSV2.
El muíante Micromonospora sp. ΔPSV2 fue crecido en medio MT4 de producción de tiocoralina y posteriormente su micelio fue extraído con acetonitrilo y analizado por HPLC-MS (Ejemplo 5), dando como resultado que esta cepa no producía tiocoralina.
Ejemplo 8. Interrupción génica en la región PSV3
A partir del plásmido pBPSV3 se obtuvo la región PSV3 como una banda EcoRI de 1 ,4 kb y se clonó en el sitio EcoRI del plásmido pOJ260, generándose pFL905. La construcción pFL905 fue introducida en la cepa conjugativa E. coli ET 12567 (pUB307) y desde ahí, por conjugación, en la cepa Micromonospora sp. MLl . Los clones transconjugantes se seleccionaron con 25 μg/ml de apramicina y a partir de ADN cromosómico de los mismos se comprobó mediante hibridación Southern que efectivamente la región PSV3 había sido interrumpida. La sonda utilizada en este caso fue la banda PS V3.
El mutante Micromonospora sp. ΔPSV3 fue crecido en medio MT4 de producción de tiocoralina y posteriormente su micelio fue extraído con acetonitrilo y analizado por HPLC-MS (Ejemplo 5), resultando ser productor de tiocoralina.
Ejemplo 9. Interrupción génica en región PSV4
A partir del plásmido pGPSV4 se obtuvo la región PSV4 como una banda EcoRl de 1,2 kb y se clonó en el sitio EcoRΪ del plásmido pOJ260, generándose pFL906.
La construcción pFL906 fue introducida en la cepa conjugativa E. coli ETl 2567 (pUB307) y desde ahí, por conjugación, en la cepa Micromonospora sp. MLl . Los clones transconjugantes se seleccionaron con 25 μg/ml de apramicina y a partir de ADN cromosómico de los mismos se comprobó mediante hibridación Southern que efectivamente la región PSV4 había sido interrumpida. La sonda utilizada en este caso fue la banda PS V4.
El mutante Micromonospora sp. ΔPSV4 fue crecido en medio MT4 de producción de tiocoralina y posteriormente su micelio fue extraído con acetonitrilo y analizado por HPLC-MS (Ejemplo 5), resultando ser productor de tiocoralina.
Ejemplo IQ. Interrupción génica en región PSV5 A partir del plásmido pGPSV5 se obtuvo la región PSV5 como una banda EcoRl de 1, 1 kb y se clonó en el sitio EcoRI del plásmido pOJ260, generándose pFL940.
La construcción pFL940 fue introducida en la cepa conjugativa JEC. coli ET12567 (pUB307) y desde ahí, por conjugación, en la cepa Micromonospora sp. MLl . Los clones transconjugantes se seleccionaron con 25 μg/ml de apramicina y a partir de ADN cromosómico de los mismos se comprobó mediante hibridación Southern que efectivamente la región PSV5 había sido interrumpida. La sonda utilizada en este caso fue la banda PS V5.
El mutante Micromonospora sp. ΔPSV5 fue crecido en medio MT4 de producción de tiocoralina y posteriormente su micelio fue extraído con acetonitrilo y analizado por HPLC, dando como resultado que esta cepa no producía tiocoralina.
Ejemplo 11. Interrupción gέnica en región PSV6
A partir del plásmido pGPSVó se obtuvo la región PSV6 como una banda EcoRI de 1 , 1 kb y se clonó en el sitio EcoRI del plásmido pOJ260, generándose pFL941.
La construcción pFL941 fue introducida en la cepa conjugativa E. coli ET12567 (pUB307) y desde ahí, por conjugación, en la cepa Micromonospora sp. MLl . Los clones transconjugantes se seleccionaron con 25 μg/ml de apramicina y a partir de ADN cromosómico de los mismos se comprobó mediante hibridación Southern que efectivamente la región PSV6 había sido interrumpida. La sonda utilizada en este caso fue la banda PSV6. El mutante Micromonospora sp. ΔPSV6 fue crecido en medio MT4 de producción de tiocoralina y posteriormente su micelio fue extraído con acetonitrilo y analizado por HPLC, resultando ser productor de tiocoralina.
Etapa 3. Obtención y análisis de la secuencia nucleotídica del agrupamiento génico responsable de la biosíntesis de Tiocoralina
En base a los resultados anteriores, en los que las zonas amplificadas de los dominios de adenilación PSV2 y PSV5 habían sido las únicas cuya interrupción génica causaba un fenotipo no productor de tiocoralina, se eligieron dos cósmidos solapantes para ser secuenciados, cosV33-D12 (que contiene la región del dominio de adenilación PSV2) y pCT2c (que contiene las regiones de los dominios de adenilación PSV2 y PS V5). El análisis de las 64.650 pb obtenidas a partir de dichos cósmidos reveló la presencia de 36 ORFs completos y 2 incompletos cuya organización se muestra en la Figura 1. La comparación con las secuencias de proteínas existentes en bases de datos de los productos deducidos de los diferentes genes permitió deducir las funciones para la mayoría de ellos (Tabla 1).
Ejemplo 12. Determinación y análisis de la secuencia nucleotídica del inserto de los cósmidos cosV33-D12 y pCT2c
La secuenciación de ambos cósmidos se realizó utilizando la metodología habitual y para el análisis informático de la secuencia se empleó el paquete de programas GCG, de Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin (Devereux et al. 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395).
Se obtuvo así una secuencia de 64.650 nucleótidos, cuyo análisis informático reveló la existencia de 38 ORFs [36 ORFs completos y 2 incompletos] cuya organización se muestra en la Figura 1. Los productos de expresión génica deducidos de dichas ORFs fueron comparados con proteínas de función conocida presentes en las bases de datos empleando el programa BLAST (Altschul et al. 1997, Nucleic Acid Res. 25, 3389-3402), con lo que se asignaron funciones probables para la mayoría de estas ORFs (Tabla 1).
Tabla 1
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ORF incompleta
Algunas de las proteínas identificadas están implicadas en la formación de la estructura peptídica de la tiocoralina, como por ejemplo varias de las NRPSs identificadas, Tiol2, Tiol7, Tiolδ, Tiol9, Tio20, Tio21, Tio22, Tio27 y Tio28. Aparecen también varias proteínas que pueden estar relacionadas con procesos de resistencia, como Tio5, Tio6, y Tio23. Los posibles reguladores de la ruta de tiocoralina identificados en la región secuenciada corresponden a Tio3, Tio4, Tio7, Tio24, Tio25. Aparecen por último también varias proteínas relacionadas con Ia generación de la unidad iniciadora 3-hidroxi-quinaldato, Tio8, Tio9, TiolO y Tiol l .
Los genes cuya interrupción génica genera un fenotipo no productor de tiocoralina se encuentran señalizados en la Figura 1 mediante un asterisco (tio20, tio27y tio28).
Ejemplo 13. Interrupción génica en tio28
Con el fin de demostrar la implicación o no de la proteína Tio28 en la biosíntesis de tiocoralina se llevó a cabo la inactivación por interrupción génica del gen tio28, y en concreto del único de los dominios de adenilación que posee.
Se diseñaron dos oligonucleótidos iniciadores internos a este dominio de adenilación (FL-T- 102up y FL-T- 102rp) y se utilizaron para amplificar una zona de 1.428 pares de bases en tio28. Las secuencias de dichos oligonucleótidos iniciadores son las siguientes: FL-T-102up: 5'-ACCTGAGGTACTGGGCGCAGC-3' (21 nucleótidos)
FL-T- 102rp: 5'- CCGATCACCACCACCGTGGC-3' (20 nucleótidos)
El programa de PCR utilizado fue: 2 min a 94°C, 30 ciclos (30 s a 94°C, 60 s a 53°C, 90 s a 68°C), 5 min a 68°C y 15 min a 4°C. La mezcla de la reacción de PCR contenía: 1 μL de ADN molde del cósmido pCT2c, 1 μL de cada oligonucleótido a una concentación 30 pmol/μL, 7,5 μL de solución dNTPs (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) 2 mM, 1 μL de MgSθ4 50 mM, 5 μL de tampón de reacción para Pfx (Invitrogene), 5 μL de solución Enhancer para Pfx (Invitrogene), 28 μL de agua destilada y 0,5 μL de polimerasa Pfx (Invitrogene).
El producto de PCR obtenido, denominado PSV7, fue clonado en el sitio EcoRV del plásmido pOJ260, generándose pFL971. La construcción pFL971 fue introducida en la cepa conjugativa E. coli ET12567 (pUB307) y desde ahí, por conjugación, en la cepa Micromonospora sp. MLl . Los clones transconjugantes se seleccionaron con 25 μg/mL de apramicina y a partir de ADN cromosómico de los mismos se comprobó mediante hibridación Southern que efectivamente la región PSV7 había sido interrumpida. La sonda utilizada en este caso fue el producto de PCR PSV7.
El mutante Micromonospora sp. ΔPSV7 fue crecido en medio MT4 de producción de tiocoralina y posteriormente su micelio extraído con acetonitrilo y analizado por HPLC-MS (Ejemplo 5), dando como resultado que esta cepa no producía tiocoralina.
Etapa 4. Expresión heteróloga de tiocoralina en otros actinomicetos
Para verificar la implicación de los genes identificados en la biosíntesis de tiocoralina, se ensayó la expresión heteróloga del cluster de genes de tiocoralina en varias especies de Streptomyces. Se eligió la región de ADN comprendida entre las posiciones 1.393 (sitio de restricción Msel) y 54.301 (sitio de restricción AcZI) de la SEQ ID NO: 1 como fragmento de ADN a ser clonado en un plásmido replicativo en E. coli y posteriormente en un plásmido replicativo en E. coli/ integrativo en
Streptomyces. Esta región de ADN contiene todas las ORFs situadas entre tio3 y tio28, ambas inclusive y completas (Figura 1). La elección de esta región de ADN fue debida a que las proteínas Tio3 y Tio28 son las más externas dentro de la región secuenciada que mostraban similitudes con proteínas del metabolismo secundario.
Dicha región de ADN, debido a su gran tamaño, fue obtenida por pasos uniendo 3 fragmentos de ADN independientes, los cuales fueron obtenidos a partir de 3 cósmidos diferentes (cosV33-D12, cosV19-B4 y pCT2c):
- fragmento A (20,2 kb): Msel (posición 1.393 de SEQ ID NO: 1) - Nsü (posición 21.585 de SEQ ID NO: 1); - fragmento B (19 kb): NsU (posición 21.585 de SEQ ID NO: 1) -
EcoRl (posición 40.636 de SEQ ID NO: 1); y
- fragmento C (13,7 kb): EcoRI (posición 40.636 de SEQ ID NO: 1) - AcH (posición 54.301 de SEQ ID NO: 1).
Para facilitar el subclonaje, el fragmento de ADN completo se subclonó primero en el plásmido replicativo en E. coli pOJ260 (Ejemplo 14). El inserto se rescató y subclonó en un vector replicativo en E. co Zi/ in te grati vo de Streptomyces que contenía el promotor de resistencia a eritromicina (ertnEp) (pARP) [Ejemplo 16] o sin dicho promotor (pAR15AT) [Ejemplo 15]. Esta región de ADN seleccionada se clonó en dichos plásmidos integrativos de Streptomyces pAR15AT, en ambas direcciones (Ejemplo 17) y pARP (Ejemplo 18). Finalmente, mediante conjugación intergenérica dichas construcciones se introdujeron en varios estreptomicetos (Ejemplo 19).
Ejemplo 14. Clonación en el plásmido de E. coli pOJ260 de la región de ADN seleccionada
A partir del cósmido pCT2c (Figura 2) se obtuvo mediante procedimientos habituales (Sambrook et al. 2001) la región de ADN situada entre los sitios de restricción EcoRI (posición 40.636 de SEQ ID
NO: 1) y AcR (posición 54.301 de SEQ ID NO: 1). Este fragmento de ADN se clonó en los sitios de restricción únicos EcoRI y CIaI del plásmido de
E. coli pUK21 (Vieira et al. 1991, Gene 100, 189- 194), generándose la construcción pFL1023 (Figura 3).
A partir del cósmido cosV19-B4 se obtuvo, mediante procedimientos habituales (Sambrook et al. 2001), la región de ADN situada entre los sitios de restricción Nsü (posición 21.585 de SEQ ID NO: 1) y EcoRl (posición 40.636 de SEQ ID NO: 1). Este fragmento de ADN se clonó en los sitios de restricción únicos Nsü y EcoRl del plásmido de E. coli pGEM-HZf (Promega), generándose la construcción pFL 1022 (Figura 3).
Estos dos fragmentos de ADN se unieron a continuación. Para ello, el fragmento de ADN situado entre los sitios de restricción Nsü (posición 21.585 de SEQ ID NO: 1) y EcoRl (posición 40.636 de SEQ ID NO: 1) presente en pFL1022 fue rescatado digiriendo con los enzimas de restricción Hindlll (situado en el sitio de clonación múltiple e inmediatamente antes del sitio de restriccción Nsü) y EcoRl. A continuación, este fragmento fue clonado en los sitios únicos de restricción Hindlll y EcoRl presentes en la construcción pFL1023, generándose así el plásmido pFL1024 (Figura 3).
Toda la región clonada en pFL1024 fue rescatada como una banda Spel (gracias a estos dos sitios de restricción presentes en ambos extremos del sitio de clonación múltiple de pUK21) y clonada en el sitio único Spel del plásmido pOJ260, generando así el plásmido pFL1036
(Figura 3).
Por último, a partir del cósmido cosV33-D12 se obtuvo el fragmento situado entre los sitios de corte Msel (posición 1.393 de SEQ ID NO: 1) y Nsü (posición 21.585 de SEQ ID NO: 1) y se clonó en los sitios Ndel y Nsñ respectivamente de pFL1036, generándose la construcción pFL1041 (Figura 4) que contiene en pOJ260 (Bierman et al. 1992, Gene 1 16, 43-49) toda la región comprendida entre las posiciones 1.393 (sitio de restricción Msel) y 54.301 (sitio de restricción AcH) de SEQ ID NO: 1, es decir, desde la ORF tio3 a tio28, ambas incluidas y completas. Además, en pFL1041, esta región se encuentra flanqueada por dos sitios de restricción Spel. pFL1041 es un plásmido replicativo en E. coli. Ejemplo 15. Construcción del plásmido integrativo de Streptomyces pAR15AT
El origen de replicación del plásmido pACYC 184 (Rose 1988,
Nucleic Acids Res. 16, 355), orí pl5A, se obtuvo como un fragmento Sgrhl-Xbal y se trató con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli. Este origen de replicación se clonó en el sitio Smal del plásmido pUKA, obteniéndose así el plásmido pUO15A (Figura 5). pUKA es un derivado del plásmido pUK21 (Vieira et al. 1991, Gene 100, 189- 194) que contiene clonado en sus sitios de resticción Psü-Accl el gen de resistencia a apramicina obtenido del cósmido pKC505 (Richardson at al. 1987, Gene 61 , 231-241) como una banda Pstl-EcoRI.
Por medio de una digestión Bgϊíl-Xhόl sobre pUO15A se obtiene un fragmento de ADN que contiene el ori pl5A junto al gen de resistencia a apramicina aac(3)IV. Este fragmento se clonó, utilizando las mismas enzimas de restricción, en el plásmido pOJ436 (Bierman et al. 1992, Gene 1 16, 43-49), dando lugar a la construcción pOJ15A (Figura 5).
En el sitio de restricción Pvull de pOJ15A se clonó el fragmento Dr(A-BgRl (tratado con Klenow) procedente del plásmido pOJ260, y que contiene el origen de conjugación oriT. Se obtiene así finalmente el plásmido pARl 5AT (Figura 5).
Ejemplo 16. Construcción del plásmido integrativo de Streptomyces pARP
En el sitio de restricción £cZ136II de pSL1 180 (Amersham
Pharmacia) se clonó el gen de la glicosiltransferasa elmGT procedente de la ruta de biosíntesis de elloramicina, como un fragmento de ADN EcoRI-Hi'ndIII tratado con Klenow obtenido del plásmido pGB15 (Blanco et al. 2001 , Chem. Biol. 8, 253-263). Se obtuvo así la construcción pSLelmGTa (Figura 6), en la cual el gen elmGT se encuentra bajo el control del promotor constitutivo del gen de resistencia a eritromicina ermE (PeπnE).
Un fragmento Spél-Nhél obtenido de pSLelmGTa que contenía PermE-elmGT fue clonado en el sitio Xbal del plásmido pAR15AT descrito en el ejemplo 15, obteniéndose la construcción pAR15ATG* (Figura 6).
Mediante digestión Xbal sobre el plásmido pAR15ATG* y posterior religación se eliminó el gen elmGT, manteniéndose el promotor PermE, lo que dio origen al plásmido pARP (Figura 6).
Ejemplo 17. Clonación en el plásmido integrativo de Streptomyces pAR15AT de la región de ADN seleccionada, en ambas orientaciones
El fragmento de ADN Spel procedente de pFL1041 (Figura 4) que contiene la región comprendida entre las posiciones 1.393 (sitio de restricción Msel) y 54.301 (sitio de restricción AcR) de SEQ ID NO: 1 se clonó, en ambas orientaciones, en el sitio de restricción Xbal del plásmido pAR15AT (Figura 5). Se generaron así dos nuevos plásmidos, denominados pFL1048 y pFL1048r (Figura 7), con el gen de resistencia a apramicina, replicativos en E. coli e integrativos en Streptomyces mediante el sistema que utiliza la región attP del fago φC31.
Ejemplo 18. Clonación en el plásmido integrativo de Streptomyces pARP de la región de ADN seleccionada tras el promotor del gen ErmE
De una forma similar, el fragmento de ADN Spel procedente de pFL1041 (Figura 4) que contiene la región comprendida entre las posiciones 1.393 (sitio de restricción Msel) y 54.301 (sitio de restricción AcZI) de SEQ ID NO: 1 se clonó en el sitio de restricción Xbcá del plásmido pARP (Figura 6). Se generó así pFL1049 (Figura 7), en el cual la ORF correspondiente a tio3 (SEQ ID NO:4) se encuentra bajo control del promotor constitutivo Permε presente en pARP. Este plásmido posee el gen de resistencia a apramicina, es replicativo en E. coli e integrativo en Streptomyces mediante el sistema que utiliza la región attP del fago φC31.
Ejemplo 19. Expresión heteróloga de la ruta de biosíntesis de tiocoralina en distintos estreptomicetos
El plásmido pFL1048 (Figura 7) se introdujo por conjugación desde la cepa E. coli ET12567 (pUB307) (Kieser et al. 2000) en las especies Streptomyces lividans TK21 (Kieser et al. 2000) y Streptomyces albus J1074 (Chater et al. 1980, J. Gen. Microbiol. 1 16, 323-334) .
El plásmido pFL1049 (Figura 7) se introdujo por conjugación desde la cepa E. coli ET12567 (pUB307) en las especies Streptomyces coelicolor M145 (Redenbach et al., 1996, Mol. Microbiol., 21, 77-96), Streptomyces lividans TK21, Streptomyces albus J 1074 y Streptomyces avermitilis ATCC 31267.
Por último, el plásmido pFL1048r (Figura 7) se introdujo por conjugación desde la cepa E. coli ETl 2567 (pUB307) en la especie Streptomyces lividans TK21.
Los resultados del cultivo del clon Streptomyces albus (pFL1049) en medio de producción R5A (Fernández et al. 1998, J. Bacteriol. 180, 4929-4937) se muestran en la Figura 8A. En la Figura 8B se muestra el espectro de absorción del pico con tiempo de retención de 27 minutos en este cromatograma, y su espectro de masas (Figura 8C), siendo ambos idénticos a los de Tiocoralina purificada.

Claims

Reivindicaciones
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la totalidad de las proteínas de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o fragmentos biológicamente activos de las mismas.
3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2, que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o su cadena complementaria.
4. Una molécula de ácido nucleico que hibrida con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 y codifica al menos una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
5. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
6. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, seleccionada del grupo formado por: - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 2-
535 de la SEQ ID NO: 1 (or/J);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 993- 1130c de la SEQ ID NO: 1 [orf2); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1517-2131 de la SEQ ID NO: 1 {tio3);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 2154-2822c de la SEQ ID NO: 1 [tio4); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
2970-379 Ic de la SEQ ID NO: 1 {tio5);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 3794-4777c de la SEQ ID NO: 1 {tio6)\
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 4904-561 1 de la SEQ ID NO: 1 {tio7);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 5701-6426c de la SEQ ID NO: 1 (fιo8);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 6426-7688c de la SEQ ID NO: 1 [tio9)\ la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
7733-8524c de la SEQ ID NO: 1 {tiol O);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 8791-10002 de la SEQ ID NO: 1 {tiol J);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 10002-1159Oc de la SEQ ID NO: 1 {tiol2); la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 1847-13634 de la SEQ ID NO: 1 {tiol3);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 13734-15005c de la SEQ ID NO: 1 (tiol4); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
15005- 16354c de la SEQ ID NO: 1 [tiol S);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 16441-18744C de la SEQ ID NO: 1 [tiol β);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 18774- 19055c de la SEQ ID NO: 1 (tiol 7);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 19260-20036 de la SEQ ID NO: 1 {tiol8}; O-¿¡
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 20146-20880c de la SEQ ID NO: 1 {tiol 9);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 21188-28969 de la SEQ ID NO: 1 (tio20); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
28979-38398 de la SEQ ID NO: 1 {tio21);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 38449-38661 de la SEQ ID NO: 1 {tio22);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 38642-41263 de la SEQ ID NO: 1 {tio23);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 41835-42368 de la SEQ ID NO: 1 (tio24);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 42395-43255c de la SEQ ID NO: 1 {tio25); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
43340-4374 Ic de la SEQ ID NO: 1 (tio26);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 44152-49563 de la SEQ ID NO: 1 {tio27);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 49635-53669 de la SEQ ID NO: 1 (tio28); la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 53749-55305c de la SEQ ID NO: 1 (orf29);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 55384-57222c de la SEQ ID NO: 1 (orf30); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
57895-58467c de la SEQ ID NO: 1 {orf31);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 58535-59206c de la SEQ ID NO: 1 {orf32);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 59298-59564c de la SEQ ID NO: 1 [orf33);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 59611-601 14c de la SEQ ID NO: 1 [orf34); JO
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 60202-60888 de la SEQ ID NO: 1 {orf35);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 60960-62240 de la SEQ ID NO: 1 [orf36); - la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos
62300-62833 de la SEQ ID NO: 1 [orf37);
- la molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 62925-64650 de la SEQ ID NO: 1 (orf38); o fragmentos de las mismas que codifican fragmentos biológicamente activos de proteínas de la ruta biosintética de producción de tiocoralina.
7. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dos o más proteínas de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o fragmentos biológicamente activos de las mismas.
8. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, que comprende dos o más genes seleccionados entre los genes identificados como orfl, orf2, tio3, tio4, tio5, tioδ, tio7, tio8, tio9, tiol O, tiol l, tiol2, tiol3, tiol4, tiol5, tiol β, tiol 7, tiol 8, tiol θ, tio20, tio21, tio22, tio23, tio24, tio25, tio26, tio27, tio28, orf29, orf30, orf31, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, orf37, orf38 y fragmentos de los mismos que codifican fragmentos biológicamente activos de proteínas de la ruta biosintética de producción de tiocoralina.
9. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 , que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína de la ruta biosintética de producción de tiocoralina, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un mutante o variante de la misma, en donde dicha pro teína se selecciona del grupo formado por las proteínas identificadas como ORFl (SEQ ID NO: 2), ORF2 (SEQ ID NO: 3), Tio3 (SEQ ID NO: 4), Tio4 (SEQ ID NO: 5), Tio5 (SEQ ID NO: 6), Tioδ (SEQ ID NO: 7), Tio7 (SEQ ID NO: 8), Tio8 (SEQ ID NO: 9), Tio9 (SEQ ID NO: 10), TiolO (SEQ ID NO: 11), Tiol l (SEQ ID NO: 12), Tiol2 (SEQ ID NO: 13), Tiol3 (SEQ ID NO: 14), Tiol4 (SEQ ID NO: 15), Tiol5 (SEQ ID NO: 16), Tio lδ (SEQ ID NO: 17), Tio l7 (SEQ ID NO: 18), Tiolδ (SEQ ID NO: 19), Tiol9 (SEQ ID NO: 20), Tio20 (SEQ ID NO: 21), Tio21 (SEQ ID NO: 22), Tio22 (SEQ ID NO: 23), Tio23 (SEQ ID NO: 24), Tio24 (SEQ ID NO: 25), Tio25 (SEQ ID NO: 26), Tio26 (SEQ ID NO: 27), Tio27 (SEQ ID NO: 28), Tio28 (SEQ ID NO: 29), ORF29 (SEQ ID NO: 30), ORF30 (SEQ ID NO: 31), ORF31 (SEQ ID NO: 32), ORF32 (SEQ ID NO: 33), ORF33 (SEQ ID NO: 34), ORF34 (SEQ ID NO: 35), ORF35 (SEQ ID NO: 36), ORF36 (SEQ ID NO: 37), ORF37 (SEQ ID NO: 38), ORF38 (SEQ ID NO: 39) y combinaciones de las mismas.
10. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende un orfs seleccionado del grupo formado por orfl, orf2, tio3, tio4, tío 5, tioβ, tio7, tio8, tio9, tiol O, tiol l, tiol2, tiol3, tiol4, tiol 5, tiol δ, tio! 7, tiol8, tio! 9, tio20, tio21, tio22, tio23, tio24, tio25, tio26, tio27, tio28, orf29, orf30, orf31, orf32, orf33, orf34, orf35, oτf36, orf37, orf38 y combinaciones de los mismos, o de las correspondientes regiones, mutantes o variantes de los mismos.
11. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 , aislada de Micromonospora sp.
12. Una composición que comprende, al menos, una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1.
13. Una sonda que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o un fragmento de la misma. OO
14. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición según la reivindicación 12.
15. Una célula hospedadora trasformada o transfectada con un vector de la invención.
16. Célula hospedadora según la reivindicación 15, en la que dicha célula hospedadora es un microorganismo, preferentemente una bacteria.
17. Célula hospedadora según la reivindicación 16, en la que dicha bacteria es una bacteria Gram-positiva, preferentemente un actinomiceto o un estreptomiceto.
18. Una pro teína codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención.
19. Pro teína según la reivindicación 18, seleccionada del grupo formado por las proteínas identificadas como ORFl (SEQ ID NO: 2),
ORF2 (SEQ ID NO: 3), Tio3 (SEQ ID NO: 4), Tio4 (SEQ ID NO: 5), Tio5 (SEQ ID NO: 6), Tio6 (SEQ ID NO: 7), Tio7 (SEQ ID NO: 8), Tio8 (SEQ ID NO: 9), Tio9 (SEQ ID NO: 10), TiolO (SEQ ID NO: 11), Tiol l (SEQ ID NO: 12), Tiol2 (SEQ ID NO: 13), Tiol3 (SEQ ID NO: 14), Tiol4 (SEQ ID NO: 15), Tiol5 (SEQ ID NO: 16), Tiolδ (SEQ ID NO: 17), Tiol7 (SEQ ID NO: 18), Tiolδ (SEQ ID NO: 19), Tiol9 (SEQ ID NO: 20), Tio20 (SEQ ID NO: 21), Tio21 (SEQ ID NO: 22), Tio22 (SEQ ID NO: 23), Tio23 (SEQ ID NO: 24), Tio24 (SEQ ID NO: 25), Tio25 (SEQ ID NO: 26), Tio26 (SEQ ID NO: 27), Tio27 (SEQ ID NO: 28), Tio28 (SEQ ID NO: 29), ORF29 (SEQ ID NO: 30), ORF30 (SEQ ID NO: 31), ORF31 (SEQ ID NO: 32), ORF32 (SEQ ID NO: 33), ORF33 (SEQ ID NO: 34), ORF34 (SEQ ID NO: 35), ORF35 (SEQ ID NO: 36), ORF36 (SEQ ID NO: 37), ORF37 (SEQ ID NO: 38), ORF38 (SEQ ID NO: 39), y combinaciones de las mismas, o fragmentos biológicamente activos de las mismas.
20. Un procedimiento para producir una proteína implicada en la biosíntesis de tiocoralina según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó
19, que comprende crecer, bajo condiciones apropiadas, un organismo productor de tiocoralina, y, si se desea, aislar una o más de dichas proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina.
21. Un método para producir tiocoralina que comprende crecer, bajo condiciones apropiadas para producir dicho compuesto, un organismo productor de tiocoralina en el que se ha aumentado el número de copias de genes que codifican proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina, y, si se desea, aislar la tiocoralina.
22. Un método para producir tiocoralina que comprende crecer, bajo condiciones apropiadas para producir dicho compuesto, un organismo productor de tiocoralina en el que la expresión de los genes que codifican las proteínas responsables de la biosíntesis de tiocoralina ha sido modulada mediante manipulación o reemplazo de uno o más genes que codifican proteínas implicadas en la biosíntesis de tiocoralina o bien mediante la manipulación de las secuencias responsables de regular la expresión de dichos genes, y, si se desea, aislar la tiocoralina.
23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que dicho organismo productor de tiocoralina es un actinomiceto, preferentemente Micromonospora sp.
24. Un método para producir tiocoralina que comprende crecer, bajo condiciones apropiadas para producir dicho compuesto, una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, y, si se desea, aislar la tiocoralina.
25. Método según la reivindicación 24, en el que dicha célula hospedadora es un actinomiceto o un estreptomiceto.
26. Un procedimiento, basado en la utilización de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina de Micromonospora sp.
MLl 7 para la producción de dicho compuesto en otro actinomiceto, que comprende:
(1) la obtención de mutantes afectados en genes específicos de la ruta de biosíntesis de tiocoralina;
(2) el aislamiento de la región del cromosoma de Micromonospora sp. MLl que contiene el cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina;
(3) la obtención y análisis de la secuencia de nucleótidos del cluster de genes responsables de la biosíntesis de tiocoralina; y
(4) la producción heteróloga de tiocoralina en otros actinomicetos.
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