ES2334755B2 - Procedimiento para aislar genes implicados en la biosintesis de estreptolidigina, moleculas de adn, manipulacion genetica de la ruta y sus usos. - Google Patents

Procedimiento para aislar genes implicados en la biosintesis de estreptolidigina, moleculas de adn, manipulacion genetica de la ruta y sus usos. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para aislar genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina, moléculas de ADN, manipulación genética de la ruta y sus usos. La invención proporciona un procedimiento de aislamiento y purificación de un fragmento de ácido nucleico que contiene la agrupación de genes de la ruta de biosíntesis de estreptolidigina. También proporciona moléculas de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico recombinante, polipéptidos codificados por estas moléculas, células hospedadoras que contienen estas moléculas y sus usos. También proporciona un proceso para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos en un hospedador bacteriano, un proceso para generar derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina y sus usos. También es objeto de la invención una cepa recombinante de Streptomyces lydicus y los derivados de estreptolidigina producidos por ella. De aplicación en la obtención de cepas superproductoras de estreptolidigina o derivados de estreptolidiginapara su aislamiento y utilización, entre otros, en el sector farmaceútico o químico.

Description

Procedimiento para aislar genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina, moléculas de ADN, manipulación genética de la ruta y sus usos.
Es objeto de la presente invención un procedimiento de aislamiento y purificación de un fragmento de ácido nucleico que contiene la agrupación de genes de la ruta de biosíntesis de estreptolidigina. La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico recombinante, polipéptidos codificados por estas moléculas, células hospedadoras que contienen estas moléculas y sus usos. La invención también proporciona un proceso para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos en un hospedador bacteriano, un proceso para generar derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina y sus usos. También es objeto de la invención una cepa recombinante de Streptomyces lydicus y los derivados de estreptolidigina producidos por ella.
La invención resulta de aplicación en la obtención de cepas superproductoras de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina para su aislamiento y utilización, entre otros, en el sector farmacéutico o químico para, por ejemplo, su uso como antibiótico en clínica o como reactivo para la investigación, o para el desarrollo de metabolitos tetrámicos o derivados de metabolitos tetrámicos por síntesis química.
Estado de la técnica
La estreptolidigina (Fig. 1), producida por Streptomyces lydicus NRRL 2433 (Deboer et al., Antibiotic. Annual. 3, 886-892,1955) forma parte de la familia de los ácidos tetrámicos que incluye compuestos con un amplio rango de actividades biológicas incluida la actividad antibiótica, antiviral, citotóxica y micotóxica (Royles, Chem. Rev. 95, 1981-2001, 1995). Otros miembros de esta familia son la tirandamicina, ikarugamicina, capsimicina, malonomicina, tirandalidigina, lidicamicina, altiomicina, oleficina, \alpha-lipomicina y tiomicina, todos ellos producidos por diferentes microorganismos del género Streptomyces (Royles, Chem. Rev. 95, 1981-2001,1995). De todos ellos solamente se conoce el agrupamiento génico para la biosínteis \alpha-lipomycin (Bihlmaier et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 50, 2113-2121, 2006).
La estreptolidigina es un potente antibiótico inhibidor de la ARN polimerasa bacteriana, interfiriendo con el proceso de elongación de la cadena de ARN naciente, en particular frente a microorganismos Gram-positivos (Deboer et al., Antibiotic. Annual. 3, 886-892,1955; Siddhikol et al., J. Bacteriol. 99, 151-155, 1969; von Meyenburg et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 13, 234-243, 1978). Esta actividad ha centrado recientemente nuevos esfuerzos para desentrañar las bases estructurales de la inhibición de la ARN polimerasa bacteriana puesto que la estreptolidigina no inhibe la ARN polimerasa de organismos eucariotas (Tuske et al., Cell 122, 541-552, 2005; Temiakov et al., Mol. Cell. 19, 655-666, 2005). Además de su actividad inhibitoria de la ARN polimerasa bacteriana, se ha mostrado que la estreptolidigina y sus análogos estructurales son potentes inhibidores del enzima desoxi-nucleotidil transferasa terminal (TdT), enzima que se expresa en grandes cantidades en leucocitos de pacientes con leucemia linfoblástica aguda y leucemia mielocítica crónica y que se ha asociado a malos pronósticos en el tratamiento con agentes quimoterápicos y niveles bajos de supervivencia (Dicioccio y Srivastava, Biochem. Biophys. Res. Commun. 72, 1343-1349, 1976; Dicioccio et al., Biochem. Pharmacol. 29, 2001-2008, 1980). Esta actividad ha llevado a considerar a la estreptolidigina y otros compuestos relacionados, tales como la tirandamicina, como potenciales. tratamientos para leucemias con una actividad TDT anormal (TdT^{+}). Este efecto positivo ha sido mostrado para el antimetabolito cordicipina (análogo de nucleósidos) que inhibe la actividad del enzima TdT y además muestra actividad citotóxica in vitro frente a células de leucemia TdT^{+} y no sobre aquellas TdT (Kodama et al., Biochem. Pharmacol. 59, 273-281, 2000; Foss, Oncology, 14, 31-35, 2000). Además de lo anterior, datos de actividad antitumoral procedentes del National Cancer Institute (Maryland, USA) muestran que la tirandamicina (un análogo estructural de estreptolidigina), presenta actividad antitumoral frente a líneas celulares humanas de cáncer de riñón (RXF 393) y leucemia (CCRF-CEM [TdT+]) a concentraciones inferiores, en dos órdenes de magnitud, a la estreptolidigina. Las principales diferencias estructurales entre estreptolidigina y tirandamicina consisten en la ausencia de un radical L-rodinosa y de una cadena lateral derivada de ácido glutámico en tirandamicina que si están presentes en estreptolidigina. Estas diferencias estructurales hacen de la estreptolidigina un candidato apropiado para la obtención de derivados no glicosilados que puedan presentar una potencial actividad antitumoral.
El desarrollo de la tecnología de ADN recombinante se está convirtiendo en una poderosa herramienta a la hora de incrementar nuestro conocimiento sobre los genes que participan en la biosíntesis de antibióticos. Esta tecnología puede hoy en día ser aplicada a la mejora en los niveles de producción de distintos antibióticos y a la obtención de nuevos compuestos con mejores propiedades farmacocinéticas a través de la combinación de genes de distintas rutas de biosíntesis de antibióticos y su expresión en microorganismos productores de antibióticos, en lo que se ha denominado biosíntesis combinatoria. La tecnología de ADN recombinante ha hecho posible el aislamiento de agrupaciones de genes completas para la biosíntesis de distintos antibióticos utilizando, entre otras estrategias de clonación y selección, el análisis de genotecas de los microorganismos productores de antibióticos mediante sondas de ADN. Esta estrategia se basa en la existencia de información genética previa sobre la ruta de biosíntesis o rutas relacionadas biosintéticamente, lo que permite utilizar o diseñar sondas genéticas a partir de la secuencia total o parcial de un enzima de biosíntesis.
Diferentes estudios sobre la biosíntesis de la estreptolidigina han mostrado la incorporación de propionato, acetato, metionina y ácido glutámico en forma de ácido \beta-metilaspártico en la estructura de este compuesto (Chen et al., Org. Left. 8, 5329-5332, 2006; Chen and Harrison, Org. Lett. 6, 4033-4036, 2004; Pearce and Rinehart, J. Antibiot. 36, 1536-1538, 1993; Pearce et al., J. Am. Chem. Soc. 102, 2510-2512, 1980). Estos estudios ya mencionan la posible implicación en la biosíntesis de estreptolidigina de un sistema híbrido que incluiría la participación de una policetido sintasa (PCS) y una sintetasa de péptidos no ribosomales (NRPS), implicación que ha sido demostrada para la biosíntesis de otros ácidos tetrámicos como la a-lipomicina (Bihlmaier et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 50, 2113-2121, 2006). En el caso de la estreptolidigina, la especulación sobre la participación de un sistema híbrido PCS-NRPS en su biosíntesis ha sido parcialmente confirmado por la identificación del gen leuTE (número de acceso: DQ115803) que codifica para una tioesterasa tipo II, enzima generalmente asociados a PCSs tipo I (Rawlings, Nat. Prod. Rep. 18, 231-281, 2001), a partir del productor de estreptolidigina Streptomyces lydicus AS 42501. Esta tioesterasa tipo II se ha demostrado, por inactivación génica, implicada en la biosíntesis de estreptolidigina (Yu et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 135, 145-158, 2006). Además, la biosíntesis de estreptolidigina ha sido recientemente relacionada con la biosíntesis de ácidos grasos por inactivación de los genes fabCF de Streptomyces lydicus que codifican para una proteína portadora de grupos acilo (ACP) y una \beta-cetoacil-ACP sintasa II, respectivamente, implicadas en la síntesis de ácidos grasos. La inactivación de los genes mencionados generó un mutante no productor de estreptolidigina (Zhao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 83, 305-313, 2009). En la patente "Streptolydigin and production thereof" (U.S. Patent No. 3,160,560) se describe la producción de estreptolidigina a partir de Streptomyces lydicus NRRL 2433. Por otro lado, no se ha encontrado ninguna patente referida a la identificación de los genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina.
Descripción de la invención
Esta invención proporciona una secuencia de genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina y sus precursores. El agrupamiento génico incluye por ejemplo genes estructurales implicados en la biosíntesis de la estructura central del antibiótico y del azúcar, y genes implicados en la regulación del agrupamiento génico.
Un aspecto de esta invención es un procedimiento de aislamiento y purificación de un fragmento de ácido nucleico que contiene la agrupación de genes de la ruta de biosíntesis de estreptolidigina que comprende las siguientes
etapas:
a.
Obtención de una genoteca de ácido nucleico genómico del microorganismo productor de estreptolidigina Streptomyces lydicus.
b.
Transfección de clones de dicha genoteca en células hospedadoras.
c.
Diseño de oligonucleótidos para el aislamiento de la agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina.
d.
Construcción de una sonda que comprende una secuencia nucleotídica de una agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina.
e.
Utilización de sondas heterólogas para el aislamiento de la agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina.
f.
Hibridación de dichas sondas frente a la genoteca de ácido nucleico genómico obtenida de dicho microorganismo.
g.
Aislamiento de dicha agrupación génica a partir de los clones con hibridación positiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la invención es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico contiene una parte de la secuencia de nucleótidos con al menos 15 nucleótidos de longitud.
En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico codifica uno o más polipéptidos, o incluye uno o más elementos genéticos, que poseen una actividad funcional en la síntesis de un antibiótico dienoil-tetrámico o un precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico. En una realización más preferida, dicho antibiótico dienoil-tetrámico o precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico es estreptolidigina o un precursor de estreptolidigina.
En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico codifica uno o más polipéptidos, o incluye uno o más genes y/o una o más secuencias reguladoras y/o uno o más elementos genéticos codificadores o no codificadores, que tienen actividad funcional en la síntesis de un antibiótico dienoil-tetrámico o un precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico. En una realización más preferida, dicho antibiótico dienoil-tetrámico o precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico es estreptolidigina o un precursor de estreptolidigina.
En una realización específica, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39.
Otro aspecto de la invención es una molécula de ácido nucleico obtenida según el procedimiento anterior de aislamiento y purificación de un fragmento de ácido nucleico que contiene la agrupación de genes de la ruta de biosíntesis de estreptolidigina, que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: l o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él.
Otro objeto de la invención es un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él; y que además incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39, que comprende una o más secuencias aminoacídicas completas, o partes de las mismas, descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39 o una o más secuencias aminoacídicas completas, o partes de las mismas, que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39.
En una realización preferida, el polipéptido posee una actividad funcional en la síntesis de un antibiótico dienoil-tetrámico o un tetrámico.
Otro aspecto de la invención es una molécula de ácido nucleico recombinante que incluye un fragmento de ácido nucleico, o una parte con similares características, clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli, de la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él; y que además incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39.
A efectos de la presente invención y su descripción una parte de ácido nucleico con similares características es cualquier porción de la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 que se haya sido modificada genéticamente in vitro o in vivo.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico recombinante es el cósmido Slg6E5 que contiene los nucleótidos 1 al 6980 de la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1.
En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico recombinante es el cósmido Slg4A8 que contiene los nucleótidos 6000 al 45000 de la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1.
En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico recombinante es el cósmido Slg9C7 que contiene los nucleótidos 36000 al 73100 de la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1.
En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico recombinante es el cósmido Slg6G6 que contiene los nucleótidos 70200 al 80894 de la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1.
Otro aspecto de la invención es una célula hospedadora u organismo transgénico que contiene cualquier molécula de ácido nucleico recombinante anterior.
Otro objeto de la invención es el uso de las células anteriores u organismos transgénicos de las mismas, en la producción de metabolitos tetrámicos.
\newpage
Otro objeto de la invención es el uso de las células anteriores u organismos transgénicos de las mismas, en la producción de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina.
Otro objeto de la invención es la utilización de los genes codificados por el fragmento de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él; y que además incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39, o la molécula de ácido nucleico recombinante clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli, que incluye el fragmento de ácido nucleico anterior o una parte con similares características, en la producción de metabolitos tetrámicos.
Otro objeto de la invención es la utilización de los genes) codificados por el fragmento de una molécula de ácido nucleico que comprende; una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al Menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él; y que además incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39; o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que. poseen. al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39, o la molécula de ácido nucleico recombinante clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli, que incluye el fragmento de ácido nucleico anterior o una parte con similares características, en la producción de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina.
Otro objeto de la invención es la utilización de los genes codificados por el fragmento de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él; y que además incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39, o la molécula de ácido nucleico recombinante clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli, que incluye el fragmento de ácido nucleico anterior o una parte con similares características, para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos o precursores de metabolitos tetrámicos.
Otro objeto de la invención es la utilización de los genes codificados por el fragmento de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él; y que además incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39, o la molécula de ácido nucleico recombinante clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli, que incluye el fragmento de ácido nucleico anterior o una parte con similares características, para incrementar la producción de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina.
A efectos de la presente invención y su descripción el incrementar la producción de metabolitos tetrámicos o precursores de metabolitos tetrámicos se refiere a la utilización de los genes estructurales o de regulación de la ruta para su clonación en Streptomyces lydicus o en cualquier otro Streptomyces productor de metabolitos tetrámicos o precursores de metabolitos tetrámicos de forma que aumentando la dosis génica se incremente la cantidad de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina, precursores de estreptolidigina o cualquier otro metabolito tetrámico o precursor de metabolitos tetrámicos, producidos por estos microorganismos con respecto a los microorganismos no modificados.
Otro objeto de la invención es la utilización de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él; y que además incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39, o la molécula de ácido nucleico recombinante clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli, que incluye el fragmento de ácido nucleico anterior o una parte con similares características, en la inactivación de genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina.
Otro objeto de la invención es la utilización de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 o de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él; y que además incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39, o la molécula de ácido nucleico recombinante clonada en un vector que se replica en
Streptomyces o en E. coli, que incluye el fragmento de ácido nucleico anterior o una parte con similares características, en técnicas de amplificación por PCR encaminadas al aislamiento y/o utilización de genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina.
Otro aspecto de la invención es el uso de los intermediarios de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina anteriores como compuestos de partida en la síntesis química de metabolitos tetrámicos.
Otro objeto de la invención es un proceso para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos en un hospedador bacteriano, que comprende las siguientes etapas:
a.
Transferencia del fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 a un hospedador del género Streptomyces.
b.
Cultivo de la cepa recombinante obtenida.
c.
Aislamiento del metabolito tetrámico producido.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, el hospedador del género Streptomyces es Streptomyces lydicus. En una realización más preferida, el hospedador Streptomyces lydicus es un mutante derivado de S. lydicus NRRL 2433. En una realización aún más preferida, el metabolito tetrámico es estreptolidigina, un derivado de estreptolidigina o un precursor de estreptolidigina.
Otro objeto de la invención es el uso de los intermediarios de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina obtenidos del proceso anterior como compuestos de partida en la síntesis química de productos tetrámicos.
Otro aspecto de la invención es un proceso para generar derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina con la inactivación de genes codificados por el fragmento de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 6 de su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina o una parte de él; y que además incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39, o la molécula de ácido nucleico recombinante clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli, que incluye el fragmento de ácido nucleico anterior o una parte con similares características.
Otro objeto de la invención es el uso de los intermediarios de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina obtenidos del proceso anterior como compuestos de partida en la síntesis química de productos tetrámicos.
Otro aspecto de la invención es una cepa recombinante de Streptomyces lydicus que carece de los genes que codifican para las proteínas descritas como SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 y 12.
En una realización específica, la cepa recombinante de Streptomyces lydicus contiene el plásmido pFL844T.
En otra realización específica, la cepa recombinante de Streptomyces lydicus contiene el plásmido pFL845T.
En otra realización específica, la cepa recombinante de Streptomyces lydicus contiene el plásmido pLNBIVT.
Otro objeto de la invención son los derivados de estreptolidigina producidos cualquiera de las cepas recombinantes de Streptomyces lydicus anteriores.
La cepa recombinante de Streptomyces lydicus que carece de los genes que codifican para las proteínas descritas como SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 y 12 y denominada S. lydicus 7H13 y las cepas derivadas de ella conteniendo los plásmidos pFL844T, pFL845T o pLNBIVT y denominadas S. lydicus 7H13/p844T, S. lydicus 7H13/p845T y S. lydicus 7H13/pLNBIV fueron depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con números de depósito CECT-7539, CECT-7540, CECT-7541 y CECT-7542, respectivamente.
La invención resulta de aplicación en la obtención de cepas superproductoras de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina para su aislamiento y utilización en, entre otros, el sector farmacéutico o químico para, por ejemplo, su utilización como antibiótico en clínica o como reactivo para la investigación y el desarrollo de metabolitos tetrámicos o derivados de metabolitos tetrámicos por síntesis química.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1. Estructura del antibiótico dienoil-tetrámico estreptolidigina (I).
Fig. 2. Diagrama en el que se muestra una representación esquemática del mapa de restricción, utilizando el enzima de restricción BamHI (posiciones numeradas en el esquema), de la agrupación génica para la biosíntesis de estreptolidigina en Streptomyces lydicus NRRL 2433 contenida en la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1. La escala se muestra en kilobases (kb). Slg6E5, Slg4A8, Slg9C7 y Slg6G6 representan los cósmidos en los cuales se ha aislado la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1. Los genes presentes en la agrupación génica se representan por letras y números en cursiva sobre flechas. Los genes que se han inactivado dentro del agrupamiento génico se muestran como flechas grises y el resto como flechas negras. Los genes no implicados en la biosíntesis de estreptolidigina se muestran como flechas blancas.
Fig. 3. Análisis por cromatografía líquida de muy alta resolución (UPLC) y cromatografía liquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (HPLC/MS). La Fig. 3A muestra la producción de estreptolidigina (I) en la cepa silvestre Streptomyces lydicus analizado por UPLC. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). La Fig. 3B muestra el espectro de absorción de estreptolidigina (I). En las ordenadas se representa la longitud de onda en nanómetros (nm) y en las abscisas como unidades arbitrarias. La Fig. 3C muestra la producción de estreptolidigina en la cepa silvestre Streptomyces lydicus analizado por HPLC/MS. En En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). La Fig. 3D muestra el espectro de masas de la estreptolidigina marcándose en cada pico el valor de mascas (sin unidades).
Fig. 4. El análisis por UPLC de la cepa silvestre Streptomyces lydicus productora de estreptoligina se muestra en la Fig. 4A. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 4B se muestra el análisis por UPLC del mutante SLM961 obtenido por disrupción génica, no productor de estreptolidigina. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 4C se muestra el análisis por UPLC del mutante SLM4C1, obtenido por disrupción génica, no productor de estreptolidigina. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU).
Fig. 5. Análisis por UPLC de la producción de estreptolidigina. En la Fig. 5A se muestra el análisis en la cepa silvestre Streptomyces lydicus. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 5B se muestra el análisis del mutante SLM2A obtenido por disrupción génica. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 5C se muestra el análisis del mutante SLM3A obtenido por disrupción génica. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU).
Fig. 6. Diagrama en el que se muestra una representación esquemática del mapa de restricción, utilizando el enzima de restricción EcoRV, de la agrupación génica para la biosíntesis de estreptolidigina en Streptomyces lydicus NRRL 2433 contenida en la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1. Los tamaños esperados de los fragmentos EcoRV y la sonda (cósmido Slg4A8) usada para confirmar por hibridación Southern la delección de los genes slgS3 a slgS7 (en gris) se muestran en la Fig. 6A. La escala se muestra en kilobases (kb). En la Fig. 6B se muestran los tamaños esperados de los fragmentos EcoRV mediante el análisis por hibridación Southern de la cepa mutante SLM7H13 con la sonda Slg4A8. El óvalo representa el promotor ermE*. En la Fig. 6C se muestra la hibridación Southern de los ADNs cromosómicos de Streptomyces lydicus NRRL 2433 (I) y de la cepa mutante SLM7H13 (II), utilizando como sonda el cósmido Slg4A8.
Fig. 7. Análisis de la producción de estreptolidiginas no glicosiladas, compuestos (II) y (III) por la cepa mutante SLM7H13. En la Fig. 7A se muestra el análisis por UPLC. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 7B se muestra el análisis por HPLC/MS. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 7C se muestra el perfil de MS correspondiente al pico (II) marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades). En la Fig. 7D se muestra el perfil de MS correspondiente al pico (III) marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades).
Fig. 8. Estructura de los compuestos (II), desmetil-estreptolidiginona, y (III), estreptolidiginona, caracterizados por resonancia magnética nuclear (RMN).
Fig. 9. Análisis de la producción de la estreptolidigina modificada, compuesto (IV), por la cepa SLM7HI3/
pFL844T. En la Fig. 9A se muestra el análisis por UPLC. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 9B se muestra el análisis por HPLC/MS. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 9C se muestra el perfil de MS correspondiente al pico (IV) marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades). En la Fig.9D se muestra la estructura del compuesto (IV), estreptolidigina LA, resuelta por (RMN).
Fig. 10. Análisis de la producción de las estreptolidiginas modificada, compuestos (V) y (VI), por la cepa
SLM7H13/pFL845T. En la Fig. l0A se muestra el análisis por UPLC. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 10B se muestra el análisis por HPLC/MS. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 10C se muestra el perfil de MS correspondiente al pico (V) marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades). En la Fig. 10D se muestra el perfil de MS correspondiente al pico (VI) marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades). En la Fig. 10E se muestra la estructura propuesta del compuesto (V), estreptolidigina DA. En la Fig. 10F se muestra la estructura propuesta del compuesto (VI), estreptolidigina DO.
Fig. 11. Análisis de la producción de la estreptolidiginas modificada, compuesto (VII), por la cepa SLM7H13/
pLNBIVT. En la Fig. 11A se muestra el análisis por UPLC. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 11B se muestra el análisis por HPLCIMS. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU). En la Fig. 11C se muestra el perfil de MS correspondiente al pico (VII) marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades). En la Fig. 10D se muestra la estructura propuesta del compuesto (VII), estreptolidigina LD.
Fig. 12. Análisis de la actividad antibiótica de estreptolidigina (I), estreptolidiginona compuesto (III) y estreptolidigina LA compuesto (IV) frente a S. albus. Cada disco de papel contiene 2 \mug del antibiótico correspondiente disuelto en 15 \mul de metanol. El control negativo (C) contiene 15 \mul de metanol sin antibiótico.
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Explicación de una forma de realización preferida
Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos de realización preferente, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la invención.
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Ejemplo 1 Clonación de la agrupación génica implicada en la biosíntesis de estreptolidigina 1.1. Microorganismos, plásmidos y condiciones de cultivo
Los microorganismos y plásmidos utilizados se describen en la Tabla 1. Streptomyces lydicus NRRL 2433 y los mutantes generados a partir de él se cultivaron para su esporulación en medio A (Fernández et al., J. Bacteriol., 180, 4929-4937, 1998); para la producción de antibiótico se cultivó en medio líquido R5A (Fernández et al., J. Bacteriol., 180, 4929-4937, 1998); utilizando un inoculo previamente cultivado en medio líquido TSB. La conjugación intergenérica desde E. coli ET12567 (pUB307) (Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics. The John Iones Foundation. Norwich, 2000) a S. lydicus se realizó según Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbour, NY: Cold Spring Harbour Laboratory press (1989). Las cepas de E. coli se cultivaron y transformaron como se describe por Sambrook et al., (1989). Los medios de cultivo fueron suplementados con los antibióticos apropiados a cada marcador de resistencia en las concentraciones siguientes: 100 \mug/ml ampicilina, 20 \mug/ml tobramicina, 25 \mug/ml apramicina, 50 \mug/ml tiostreptona, 50 \mug/ml higromicina, 10 \mum/ml tetraciclina, 25 \mug/ml cloramfenicol y 50 \mug/ml ácido nalidíxico.
TABLA 1 Cepas bacterianas y plásmidos usados en este ejemplo
1 
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1.2. Análisis de la producción de estreptolidigina
La producción de estreptolidigina se realizó de forma rutinaria en 1,5 ml de medio R5A sólido (Fernández et al., J. Bacteriol., 180, 4929-4937, 1998) en placas de 25 pocillos. Para su inoculo se utilizaron esporas de S. lydicus y los cultivos se mantuvieron durante 7 días a 30ºC, extrayéndose tras ese tiempo con 1 ml de acetato de etilo. La producción de estreptolidigina se realizó también en cultivos líquidos de 5 a 7 días crecidos en un agitador orbital a 30ºC y 250 rpm. Para ello se utilizaron matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 50 ml de medio R5A líquido (Fernández et al., J Bacteriol, 180: 4929-4937, 1998). Para su inoculo se utilizó un volumen del 2% de un preinoculo de S. lydicus realizado en medio TSB (50 ml en matraces de 250 ml) que se recogió después de dos días de incubación en un agitador orbital a 30ºC y 250 rpm. La estreptolidigina presente en los cultivos líquidos se extrajo con volúmenes variables de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo se evaporaron utilizando una centrifuga acoplada a vacío y una vez evaporadas las muestras se resuspendieron en metanol para su análisis.
\newpage
La identificación y análisis cuantitativo de estreptolidigina se llevó a cabo mediante cromatografía en fase reversa en un equipo UPLC utilizando una columna BEH C18 (2.1 x 100 mm) y utilizando acetonitrilo y 0.05% TFA como solventes. Las muestras fueron eluidas con acetronitrilo al 10% durante 1 min seguido por un gradiente lineal de acetonitrilo desde el 10% al 80% durante 7 min. El flujo utilizado fue de 0,5 ml/min y la temperatura de la columna de 30ºC. Para el análisis de masas acoplado a HPLC (HPLC/MS) se uso un sistema cromatográfico acoplado a un espectrómetro de masas y a una columna C18 (2.1 x 150 mm). Los solventes utilizados fueron los mismos que los descritos anteriormente y la elución se realizó con un gradiente isocrático inicial de acetonitrilo al 10% mantenido durante 4 min y seguido por un gradiente lineal de acetonitrilo desde el 10% al 88% durante 26 min, utilizando para ello un flujo de 0,25 ml/min. El análisis de masas se realizó por ionización electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y un voltaje de cono de 20 V. La detección de los picos y la caracterización de su espectro de absorción se realizaron en ambos casos con un sistema de fotodiodos en línea extrayéndose cromatogramas bidimensionales a una longitud de onda de 360 nm.
La estreptolidigina analizada en UPLC presenta una retención de 6,48 min y un máximo en el espectro de absorción de 600 nm. La estreptolidigina analizada en HPLCIMS presenta una movilidad de 25,87 min y muestra dos iones en modo positivo con masas de 487 m/z [M+H]^{+}, correspondiente al aglicón y 601 m/z [M+H]^{+} correspondiente al compuesto sin fragmentar (Fig. 3C).
Para la caracterización estructural de los derivados de estreptolidigina mencionados en esta patente se realizaron cultivos de las cepas de S. lydicus correspondientes y los extractos fueron disueltos en 5 ml de una mezcla de DMSO y metanol a partes iguales. Posteriormente se centrifugaron y se eliminó la capa superior correspondiente a la fracción lipídica. El primer paso de purificación se realizó por cromatografía en una columna XTerra PrepRP18 (19 x 300 mm) usando como solventes acetonitrilo y ácido trifluoroacético (TFA) al 0,05% disuelto en agua. Se utilizó un gradiente lineal desde el 30% al 100% de acetonitrilio durante 7 min seguido por 3 min de acetonitrilo al 100%. El flujo utilizado fue de 15 ml/min. Los picos de interés fueron recolectados sobre tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0. Las soluciones obtenidas fueron parcialmente evaporadas en un rotavapor para reducir la concentración de acetonitrilo y posteriormente se aplicaron a un cartucho de extracción en fase sólida (Sep-Pak C18), se lavaron posteriormente con agua para eliminar las sales y se eluyeron con metanol. Las purificaciones posteriores se realizaron en condiciones isocráticas, optimizadas para cada pico, utilizando una columna Symmetry C18 (7,8 x 300 mm) y mezclas de acetonitrilo y TFA al 0,05% disuelto en agua, usando un flujo de 7 ml/min. Tal como se menciono anteriormente, los picos se recogieron siempre sobre tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, se desalaron utilizando extracción en fase sólida y finalmente se
liofilizaron.
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1.3. Manipulación de ADN
La preparación de plásmidos, ADN total, digestiones con enzimas de restricción, ligaciones de ADN, etc., se llevó a cabo siguiendo métodos estandarizados previamente descritos (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbour, NY: Cold Spring Harbour Laboratory press, 1989; Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics. The John limes Foundation. Norwich, 2000). Los fragmentos de ADN fueron aislados de geles de agarosa, marcados usando nucleótidos marcados con dioxigenina y utilizados para el análisis por hibridación Southern. La secuenciación fue realizada sobre ADN de doble cadena utilizando el método de descrito por Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467 (1977). Las secuencias obtenidas se analizaron usando los programas descritos por Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12, 387-395, 1984 y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990. El análisis de las regiones transmembrana de posibles proteínas transmembranales se realizó utilizando el programa descrito por Krogh et al., J. Mol. Biol. 305, 567-580, 2001. El análisis de PCS y NRPS se realizó utilizando los programas descritos por Tae et al., BMC Bioinformatics. 8, 327-335, 2007 y Rausch et al., Nucleic Acids Res. 33, 5799-5808, 2005.
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1.4. Amplificación de fragmentos de ADN por PCR y donación de un fragmento de ADN que codifica parte de una tioesterasa tipo II del genoma de Streptomyces lydicus NRRL 2433
La estrategia utilizada para la donación de la agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina fue la utilización de la homología genética con algunas proteínas codificadas por genes previamente caracterizados y que participan en la biosíntesis de estreptolidigina, borrelidina y urdamicina A.
La información disponible sobre el enzima biosintético tioesterasa II procedente de Streptomyces lydicus AS 42501 (Yu et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 135, 145-158, 2006) codificado por el gen leuTE (número de acceso: DQ115803), ha sido usada para diseñar oligonucleótidos y construir una sonda genética homóloga. Los oligonucleótidos sintéticos utilizados fueron SLTEIII (5'-AGAATTCGGACGTCAGGAGCGGTACG-3'; SEQ ID NO:40) que incluía un sitio de restricción EcoRI para facilitar la subclonación (subrayado) y SLTEII2 (5'-AAAAAGCTTGTGTGGT
CGGACCAGGCC-3'; SEQ ID NO:41) que incluía un sitio de restricción HindIII para facilitar la subclonación (subrayado) y fueron utilizados como cebadores para la amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y usando como ADN molde el ADN cromosómico de Streptomyces lydicus.
Se utilizaron además dos sondas heterólogas. La primera de ellas contiene los genes que codifican el enzima PCS de Streptomyces parvulus Tú4055 implicado en la biosíntesis del macrólido borrelidina (Olano et al., Chem. Biol. 11, 87-97. 2004). La segunda contiene los genes que codifican para los enzimas UrdZ3 y UrdQ de Streptomyces fradiae implicados en la biosíntesis del deoxiazúcar L-rodinosa en la anguciclina urdamicina A (Hoffineister et al., Chem. Biol. 7, 821-831, 2000).
Para la obtención del ADN total de S. lydicus NRRL 2433 el microorganismo se cultivó en medio líquido TSB (Tryptone Soya Broth) y el ADN total se aisló como ha sido descrito por Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics. The John limes Foundation. Norwich, 2000. El ADN total de S. lydicus NRRL 2433 fue utilizado como molde para la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los cebadores SLTEII1 y SLTEII2. Se asumió que, como consecuencia de la amplificación se obtendría un fragmento de ADN de aproximadamente 0,5 kb que contendría la parte interna del gen leuTE. La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo en un volumen total de 50 \mul y la mezcla de reacción contenía 0,1 \mug de ADN total de S. lydicus NRRL 2433, 2.5% de dimetilsulfóxido (DMSO), 200 pmoles de cada cebador, dNTPs (concentración final 200 \muM), 1xPCR del enzima DNA polimerasa. La reacción en cadena se realizó con el siguiente programa: 1 ciclo de desnaturalización a 98ºC (5 min), 30 ciclos de desnaturalización/anillamiento/síntesis a 94ºC (1 min)/50ºC (1 min)/72ºC (1 min) y 1 ciclo de extensión final a 72ºC (5 min). El fragmento de ADN obtenido con este procedimiento fue clonado en el vector de Escherichia coli pOJ260 (utilizando los sitios de restricción EcoRI y HindIII presentes en los cebadores) y fue sometido a secuenciación utilizando técnicas estandarizadas. El análisis de la secuencia del fragmento amplificado por PCR reveló que contenía parte de una proteína idéntica a leuTE (número de acceso: DQ115803). Una vez confirmado que el fragmento amplificado formaba parte de la región codificadora de la tioesterasa II implicada en la biosíntesis de estreptolidigina (Yu et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 135, 145-158, 2006) este fragmento se utilizó como sonda genética para el análisis de una genoteca de ADN cromosómico de S. lydicus NRRL 2433.
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1.5. Construcción y análisis de la genoteca de ADN cromosómico de S. lydicus NRRL 2433
La genoteca de ADN cromosómico de S. lydicus NRRL 2433 fue construida en el cósmido pWE15 que es capaz de replicarse en Escherichia coli. El ADN genómico de S. lydicus NRRL 2433 aislado como se ha descrito anteriormente, fue digerido parcialmente con MboI y los fragmentos obtenidos, de un tamaño aproximado de 35 kb, fueron defosforilados por tratamiento con fosfatasa alcalina. El cósmido pWE15, utilizado como vector, fue linearizado con BamHI. Los fragmentos de ADN y el vector fueron ligados y empaquetados in vitro. Las partículas de ADN recombinante fueron utilizadas para infectar células de E. coli XLI Blue MR y los transductantes fueron seleccionados en placas con medio LA (Luria agar) conteniendo como antibiótico de selección ampicilina. Aproximadamente 1000 colonias transductantes fueron cultivadas en placas de microtitulación conteniendo medio LB (Luria broth) y el antibiótico de selección. Después de su incubación a 37ºC durante 24 h, fueron mantenidas en presencia de glicerol al 25% a -70ºC para su preservación.
Con objeto de clonar la agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina se llevó a cabo el análisis de la genoteca de S. lydicus NRRL 2433 mediante hibridación in situ de colonias con las sondas mencionadas anteriormente. Los transductantes fueron transferidos de las placas de microtitulación a placas de medio LA conteniendo como antibiótico de selección ampicilina y tras una noche de crecimiento a 37ºC las colonias fueron transferidas a filtros de nylon para su hibridación in situ siguiendo los protocolos descritos por Sambrook et al., (1989). Los filtros fueron analizados con las sondas marcadas. De este modo se aislaron los cósmidos Slg6E5, Slg4A8, Slg9C7 y Slg6G6
(Fig. 2).
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Ejemplo 2 Obtención y análisis de la secuencia nucleotídica del agrupamiento génico responsable de la biosíntesis de estreptolidigina y deducción de las funciones de los genes
Los cósmidos Slg4A8 y Slg9C7 fueron secuenciados en su totalidad. Del cósmido Slg6E5 se secuenció un fragmento BamHI de 6980 bp y del cósmido Slg6G6 un fragmento EcoRI-BgIII de 10720 bp, ambos identificados por secuenciación parcial como conteniendo genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina. La secuenciación fue realizada sobre ADN de doble cadena utilizando el método de descrito por Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467 (1977). Los datos de secuencia obtenidos se analizaron usando los programas informáticos descritos por Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12, 387-395, 1984) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990. El análisis de las regiones transmembrana de posibles proteínas transmembranales se realizó utilizando el programa descrito por Krogh et al., J. Mol. Biol. 305, 567-580, 2001. El análisis de PCS y NRPS se realizó utilizando los programas descritos por Tae et al., BMC Bioinformatics. 8, 327-335, 2007 y Rausch et al., Nucleic Acids Res. 33, 5799-5808, 2005.
El análisis informático de la secuencia de ADN de 80894 bp (SEQ ID NO: 1) mostró la presencia de 38 pautas de lectura abierta (ORFs) (Fig. 2 y Tabla 1) con un alto contenido en G+C característico del ADN de Streptomyces. Además se muestra un contenido especialmente alto en G+C alto en la tercera posición de los codones característico de genes de Streptomyces. Las funciones de los genes fueron deducidas por comparación de las secuencias aminoacídicas, traducidas conceptualmente a partir de la secuencia nucleotídica, con secuencias conocidas disponibles en bases de datos. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2 referidos a los datos de secuencia que se incluyen en la solicitud. De las 38 ORFS encontradas 29 de ellas, que ocupan una región de 74,5 kb, están probablemente implicadas en la biosíntesis de estreptolidigina. Esta región esta flanqueada por 9 ORFS probablemente implicadas en el metabolismo primario (en blanco en la Fig. 2). De estas ORFs, orf1, orf2 y orf3-6 mostraron gran similitud con proteínas de S. coelicolor A3(2) (SCO1090, SCO1092 y SCO1100-SCO1103) y S. avermitilis MA-4680 (SAV1492, SAV1494 y SAV 1499-SAV 1502), mostrando además la misma organización en los tres microorganismos. Los productos deducidos de orf7, orf8 y orf9 no mostraron similitudes significativas con proteínas depositadas en las bases de datos lo cual sugiere que pueden no estar implicadas en la biosíntesis de estreptolidigina. De las 29 ORFs que se proponen implicadas en la biosíntesis de estreptolidigina: 7 de ellas (slgA1 a slgA3, slgB, slgN1, slgL y slgN2) codifican para enzimas tipo PKS y NRPS, implicadas en la biosíntesis del aglicón de estreptolidigina, 8 ORFs (slgS1, slgS2, slgG, y slgS3-slgS7) codifican enzimas implicados en la biosíntesis del desoxiazúcar L-rodinosa y su unión al aglicón de estreptolidigina, 3 ORFs (slgE1, slgE2 y slgE3) están implicadas en el aporte del precursor aminoacídico necesario para la biosíntesis de estreptolidigina, 4 ORFs (slgO1, slgO2, slgZ y slgM) están implicadas en diferentes modificaciones de la estructura foral del antibiótico o de su precursor aminoacídico, 2 ORFs (slgR1 y slgR2) están implicadas en procesos de regulación, 1 ORF (slgT) está implicada en el transporte de estreptolidigina y por último hay 4 ORFs (slgC1, slgC2, slgX, y slgY) sin una función claramente definida en la biosíntesis de estreptolidigina.
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TABLA 2 Genes identificados en la región del cromosoma de S. lydicus NRRI 2433 implicada en la biosíntesis de estreptolidigina
3
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5 
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Ejemplo 3 Inactivación de la agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina mediante disrupción génica
Con objeto de demostrar la implicación de la agrupación de genes clonados en la biosíntesis de estreptolidigina se llevó a cabo la inactivación de los genes slgA1 y slgA3 utilizando para ello fragmentos BamHI aislados de dos cósmidos. El primero de estos fragmentos, de 1191 bp, procede del cósmido Slg9C7 y está presente también en el cósmido Slg6G6. Este fragmento es interno a slgA1 (sitios BamHI 30-31, Fig. 2) y fue clonado en el plásmido pOJ260 digerido con BamHI. La construcción resultante, pOJ961, fue usada para la disrupción génica en S. lydicus generando el mutante SLM961. El segundo fragmento utilizado, de 627 bp, procede del cósmido Slg4A8 y está presente también en el cósmido Slg9C7. Este fragmento es interno a slgA3 (sitios BamHI 30-31, Fig. 2) y fue clonado en el plásmido pOJ260 digerido con BamHI. La construcción resultante pOJ4C1 fue usada para la disrupción génica en S. lydicus generando el mutante SLM4C1.
Los mutantes SLM961 y SLM4C1 fueron seleccionados por su resistencia a apramicina. La disrupción de cada uno de los genes fue comprobada mediante análisis por Southern utilizando en cada caso el fragmento BamHI marcado. Ambos mutantes se demostraron no productores de estreptolidigina mediante análisis por UPLC de muestras de cultivos de S. lydicus NRRL 2433, SLM961 y SLM4C1 extraídas con acetato de etilo (Fig. 4A, Fig. 4B y Fig. 4C), confirmando de este modo la implicación de la agrupación de genes en la biosíntesis de estreptolidigina.
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Ejemplo 4 Establecimiento de los limites de la agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina mediante reemplazamiento génico
Para establecer los límites del agrupamiento génico implicado en la biosíntesis de estreptolidigina se realizaron dos mutantes por disrupción génica en las ORFs orf2 (mutante SLM2A) y orf3 (mutante SLM3A). En ambos casos la ORF se interrumpe por introducción de un gen de resistencia a apramicina.
Para la obtención del mutante SLM2A se clon un fragmento BamHI-PstI de 1580 bp, procedente del cósmido Slg6E5 y que contiene la orf2, en el vector pHyg digerido BamHI-PstI. La construcción resultante se digirió con el enzima BglII (interno a la orf2) y se obtuvieron extremos romos, clonándose posteriormente un fragmento SmaI-EcoRV de 1600pb que contiene el gen de resistencia a apramicina procedente del plásmido pEFBA. De este modo en la construcción resultante, pHyg2A, el gen se ha interrumpido con el gen de resistencia, estando éste en la misma orientación de lectura que la orf2.
Para la obtención del mutante SLM3A se clonó un fragmento StuI-PstI de 1915 bp, procedente del cósmido Slg6G6 y que contiene la orf3, en el vector pHyg digerido EcoRV-PstI. La construcción resultante se digirió con el enzima BamHI (interno a la orf3) y se obtuvieron extremos romos, clonándose posteriormente un fragmento SmaI-EcoRV de 1600 pb que contiene el gen de resistencia a apramicina procedente del plásmido pEFBA. De este modo en la construcción resultante, pHyg3A, el gen se ha interrumpido con el gen de resistencia, estando éste en la misma orientación de lectura que la orf3.
Los plásmidos pHyg2A y pHyg3A se digirieron con el enzima XbaI y en ellos se clonó un fragmento XbaI-SpeI de 1kb procedente del plásmido pOJ260 y que contiene el origen de transferencia oriT. De este modo se obtuvieron las construcciones pHyg2AT y pHyg3AT que fueron introducidas en S. lydicus por conjugación intergenérica desde E. coli ET12567 (pUB307). Para obtener el reemplazamiento de la copia silvestre del gen por la versión mutada es necesario un doble sobrecruzamiento. Los transconjugantes en los que había ocurrido un acontecimiento de doble sobrecruzamiento fueron seleccionados por su resistencia a apramicina y su sensibilidad a higromicina. El reemplazamiento en el cromosoma de la copia silvestre del gen por la mutada fue confirmado en los transconjugantes mediante análisis por Southern utilizando en cada caso el fragmento inicial marcado.
Cada uno de los mutantes fue analizado para conocer la producción de estreptolidigina, en paralelo con la cepa parental S. lydicus NRRL 2433 mediante UPLC. Ambos mutantes, SLM2A y SLM3A, se mostraron como productores de estreptolidigina (Fig. 5), indicando que los genes mutados no participan en la biosíntesis de estreptolidigina y confirmando de este modo los límites del agrupamiento génico implicado en la biosíntesis de estreptolidigina.
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Ejemplo 5 Generación de mutantes productores de estreptolidiginas no glicosiladas mediante reemplazamiento génico
Para generar mutantes de S. lydicus NRRL 2433 capaces de producir estreptolidiginas no glicosiladas se deleccionaron los genes slgS3 a slgS7 (Fig. 2), todos ellos posiblemente implicados en la biosíntesis del desoxiazúcar L-rodinosa. Para ello se construyó el plásmido pOJ7H 13. En primer lugar se amplificó por PCR el gen slgO2 en un fragmento de 1240 bp usando los oligonucleótidos sintéticos CRIS 13 (5'-AAG GAT CCG GCT CCG CGA TGA GCG AG-3', SEQ ID NO: 42) que incluía un sitio de restricción BamHI para facilitar la subclonación (subrayado) y CRIS14 (5'-AGA ATT CAT GCA TGG TGG TCA TCC GCC GCC-3', SEQ ID NO: 43) que incluía un sitio de restricción EcoRI para facilitar la subclonación (subrayado). Después se amplificó por PCR el gen slgM en un fragmento de 1279 bp usando los oligonucleótidos CRIS17 (5'-AAG GAT CCA CCG AAC CCG GAG GGT CG-3', SEQ ID NO: 44) que incluía un sitio de restricción BamHI para facilitar la subclonación (subrayado) y CRIS18 (5'-AGA ATT C AC TAG TTC CTC GCC GGG CGT CAC-3' SEQ ID NO: 45) que incluía un sitio de restricción EcoRI para facilitar la subclonación (subrayado) y un sitio SpeI (negrilla). Las condiciones de PCR para ambas amplificaciones fueron las mismas descritas con anterioridad. Ambos fragmentos amplificados fueron clonados en pCR-BLUNT y secuenciados para comprobar su correcta amplificación.
El fragmento conteniendo el gen slgM fue posteriormente clonado como un fragmento BamHI-EcoRI en el vector pOJ260P digerido con los mismos enzimas de restricción para generar el plásmido pOJPM. En este plásmido el gen slgM queda situado bajo el control del promotor constitutivo ennE*. El gene slgO2 fue clonado como un fragmento BamHI-NsiI en el vector pLHyg digerido con los enzimas BamHI-PstI, obteniéndose de este modo el plásmido pL7H. El plásmido pL7H fue digerido HindIII-SpeI para clonar en él un fragmento HindIII-SpeI de 1479 bp obtenido a partir del plásmido pOJPM y que contiene al gen slgM bajo el control del promotor ermE*. De este modo se obtuvo la construcción pL7H13, en la cual el gen de resistencia a higromicina está flanqueado por los genes slgO y slgM, estando slgM bajo el control del promotor ermE* para evitar efectos polares en el mutante. Finalmente el plásmido pL7H13 fue digerido NheI-SpeI liberando un fragmento de 4319 bp que se clonó en el vector pOJ260 digerido XbaI generándose la construcción pOJ7HI3 que fue introducida en S. lydicus por conjugación intergenérica desde E. coli ET12567 (pUB307) para generar la cepa mutante SLM7H13. Para obtener el reemplazamiento los genes slgS3 a slgS7 de la copia silvestre por el gen de resistencia a higromicina es necesario un doble sobrecruzamiento. Los transconjugantes en los que había ocurrido un acontecimiento de doble sobrecruzamiento fueron seleccionados por su resistencia a higromicina y su sensibilidad a apramicina. El reemplazamiento en el cromosoma fue confirmado en los transconjugantes mediante análisis por Southern utilizando como sonda el cósmido S14A8 marcado (Fig. 6).
El análisis de cultivos de la cepa SLM7H13 por UPLC mostró dos picos con absorbancia característica de estreptolidigina pero con movilidades de 5,68 min y 5,88 min que fueron denominados compuestos (II) y (III) (Fig. 7). El análisis posterior por HPLC/MS determinó que el compuesto (II) presenta una movilidad de 24,18 min y un ión de 473 m/z [M+H]^{+}. El compuesto (III) presenta una movilidad de 24,96 min y un ión de 487 m/z [M+H]^{+}. El compuesto (III), una vez caracterizada su estructura por NMR, se corresponde con un derivado de estreptolidigina no glicosilado, de fórmula C_{26}H_{34}N_{2}O_{7}, que se denominó estreptolidiginona (compuesto (III), Fig. 8 y Tabla 3). La caracterización estructural del compuesto (II) mostró que éste presenta la misma estructura que el compuesto (III) a nivel de la región policetídica pero carece de las señales de resonancia correspondientes al grupo metilo localizado en la cadena lateral de la unidad de ácido tetrámico. Estos datos permiten determinar que el compuesto (II) se corresponde con desmetil-estreptolidiginona de fórmula C_{25}H_{32}N_{2}O_{7} (compuesto (II), Fig. 8 y Tabla 4).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3 Datos de espectros de RMN de estreptolidiginona (III) en DMSO-d6 a 300 K (^{1}H a 600 MHz, ^{13}C a 150 MHz)
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TABLA 4 Datos de espectros de RMN de desmetil-estreptolidiginona (II) en DMSO-d6 a 300 K (^{1}H a 600 MHz, ^{13}C a 150 MHz)
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Para comprobar que efectivamente la producción de estreptolidiginona y epoxi-estreptolidiginona se debe a la delección de los genes slgS3 a slgS7, la cepa SLM7H13 fue complementada con los genes slgS3 a slgS7 en trans expresados bajo el control del promotor constitutivo ermE*. Para ello se construyó el plásmido pEM4T8-12, clonando un fragmento NruI-MfeI de 6928 bp, procedente del cósmido Slg4A8 y que contiene los genes slgS3 a slgS7, en el plásmido pSL1180 digerido con SmaI-MfeI. La construcción resultante (pSL8-12) se digirió EcoRI-MfeI para rescatar el fragmento original y se clonó en la orientación adecuada en el plásmido pEM4T digerido EcoRI.
El plásmido pEM4T8-12 se introdujo en S. lydicus SLM7H13 por conjugación intergenérica desde E. coli ET12567 (pUB307) y los transconjugantes se seleccionaron por su resistencia a tioestreptona. En estos transconjugantes se analizó la capacidad de producción de estreptolidigina y se comprobó que se había recuperado, lo cual demuestra que la producción de los derivados no glicosilados de estreptolidigina se debe a la ausencia de los genes slgS3 a slgS7.
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Ejemplo 6 Generación de nuevas estreptolidiginas con diferentes desoxiazúcares
La cepa SLM7H13 se utilizó para obtener derivados de estreptolidigina conteniendo diferentes desoxiazúcares. Para ello se generaron los plásmidos pFL844T, pFL845T y pLNBIVT que son las versiones integrativas de los plásmidos pFL844 (Pérez et al., Chem. Comm. 12, 1604-1606, 2005), pFL845 (Pérez et al., Chem. Comm. 12, 1604-1606, 2005) y pLNBIV (Fischer et al., J. Nat. Prod. 65, 1685-1689, 2002) que dirigen la biosíntesis de los desoxiazúcares L-amicetosa, D-amicetosa y L-digitoxosa, respectivamente.
Las versiones integrativas de los plásmidos arriba mencionados se obtuvieron donando en un sitio XbaI, único en cada uno de ellos, un fragmento SpeI de 6200 procedente del plásmido pAR15AT (Lombó et al., ChemBioChem. 7, 366-376, 2006) que contiene el gen de resistencia a apramicina aac3 (IV), el gen de la integrasa int, el sitio de integración attB y el origen de conjugación oriT. Previamente a la digestión SpeI, la región conteniendo el origen de replicación oripI5A del plásmido pAR15AT fue deleccionada eliminando un fragmento PstI-BglII de 700 bp seguido de religación del vector tras un tratamiento para obtener extremos romos.
Los plásmidos pFL844T, pFL845T y pLNBIVT se introdujeron en S. lydicus SLM7H13 por conjugación intergenérica desde E. coli ET12567 (pUB307) y los transconjugantes se seleccionaron por su resistencia a apramicina, obteniéndose las cepas SLM7H13/pFL844T, SLM7H13/pFL845T, SLM7H13/pLNBIVT.
El análisis de los productos acumulados por la cepa SLM7H13/pFL844T mostró la presencia de los picos (II)2 y 3(III) anteriormente mencionados y correspondientes a derivados no glicosilados de la estreptolidigina, y un nuevo pico con retenciones de 6,48 min en UPLC y 26,98 min en HPLC/MS (Fig. 9A y Fig. 9B). El análisis de MS del pico (IV) muestra dos iones en modo positivo con masas de 487 m/z [M+H]^{+}, correspondiente al aglicón y 601 m/z [M+H]^{+}
correspondiente al compuesto sin fragmentar (Fig. 9C). Este compuesto fue caracterizado por NMR y su estructura corresponde a una estreptolidigina, de fórmula C_{32}H_{44}N_{2}O_{9}, conteniendo L-amicetosa en lugar de L-rodinosa. A este compuesto se le denominó estreptolidigina LA (Fig. 9D y Tabla 5).
TABLA 5 Datos de espectros de RMN de estreptolidigina LA (IV) en DMSO-d6 a 300 K (^{1}H a 600 MHz, ^{13}C a 150 MHz)
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El análisis de los productos acumulados por la cepa SLM7H13/pFL845T mostró la presencia de los picos (II) y (III) anteriormente mencionados y correspondientes a derivados no glicosilados de la estreptolidigina, y dos nuevos picos con retenciones de 5,73 y 6,48 min en UPLC y 24,50 y 26,98 min en HPLC/MS (Fig. 10A y Fig. 10B). El análisis de MS del pico (V) muestra dos iones en modo positivo con masas de 487 m/z [M+H]^{+}, correspondiente al aglicón y 601 m/z [M+H]^{+} correspondiente al compuesto sin fragmentar (Fig. 10C). Este compuesto se presume corresponde a una estreptolidigina, de fórmula C_{32}H_{44}N_{2}O_{9}, conteniendo D-amicetosa en lugar de L-rodinosa, puesto que el plásmido pFL845T dirige la biosíntesis de este deoxiazúcar. A este compuesto se le denominó estreptolidigina DA (Fig. 10E). El análisis de MS del pico 6 (VI) muestra dos iones en modo positivo con masas de 487 m/z [M+H]^{+}, correspondiente al aglicón y 617 m/z [M+H]^{+} correspondiente al compuesto sin fragmentar (Fig. 10D). Este compuesto se presume corresponde a una estreptolidigina, de fórmula C_{32}H_{44}N_{2}O_{10}, conteniendo D-olivosa en lugar de L-rodinosa, puesto que el plásmido pFL845T que dirige la biosíntesis del 2,3,6-tridesoxiazúcar genera como intermediario el 2,6-didesoxiazúcar D-olivosa que puede ser utilizado por la glicosiltransferasa SlgG para su introducción en el aglicón de estreptolidigina. A este compuesto se le denominó estreptolidigina DO (Fig. 10F).
El análisis de los productos acumulados por la cepa SLM7H13/pLNBIVT mostró la presencia de los picos (II) y (III) anteriormente mencionados tanto en los análisis por UPLC como por HPLCIMS (Fig. 11A y Fig. 11B). No obstante el análisis de MS del pico (II) reveló la presencia de un compuesto adicional, (VII), que presenta el mismo tiempo de retención que el pico (II) y que presenta dos iones en modo positivo con masas de 487 m/z [M+H]^{+}, correspondiente al aglicón y 617 m/z [M+H]^{+} correspondiente al compuesto sin fragmentar (Fig. 11C). El ion de 473 m/z [M+H]^{+} corresponde al compuesto del pico (II) (Fig. 11C). El compuesto 7 (VII) se presume corresponde a una estreptolidigina, de fórmula y C_{32}H_{44}N_{2}O_{10}, conteniendo L-digitoxosa en lugar de L-rodinosa, puesto que el plásmido pLNBIVT dirige la biosíntesis del 2,6-didesoxiazúcar L-digitoxosa. A este compuesto se le denominó estreptolidigina LD (Fig. 11D).
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Ejemplo 7 Actividad antibiótica de los nuevos compuestos generados
Después de la caracterización estructural de estreptolidiginona (compuesto (III)) y estreptolidigina LA (compuesto (IV)) se analizó su actividad antibiótica utilizando como compuesto de referencia estreptolidigina (I) que se usó como control positivo. Este análisis se realizó por el método de difusión sobre discos de papel. Para ello se inoculó una placa Petri conteniendo medio TSA (Tryptone Soy Agar) con una suspensión de esporas de S. albus. Sobre esta placa se colocaron discos de papel de 5 mm de diámetro. En cada disco se añadió una solución conteniendo 2 \mug de cada compuesto disuelto en 15 \mul de metanol. Como control negativo se utilizó un disco conteniendo 15 \mul de metanol sin antibiótico. La placa se mantuvo durante 2 horas a 4ºC para permitir la difusión de los antibióticos y después se incubó durante 24 h a 30ºC.
Tal como se puede observar en la Fig. 12, estreptolidiginona (compuesto (III)) mostró una actividad antibiótica moderada observándose un halo de inhibición de 14 mm de diámetro. Por el contrario la actividad antibiótica de estreptolidigina LA (compuesto (IV)) mostró un halo de inhibición de 30 mm de diámetro, similar al generado por estreptolidigina (I) de 32 mm. Por lo tanto se puede afirmar que la estreptolidigina y la estreptolidigina LA tienen actividades antibióticas equivalentes a pesar de presentar en sus estructuras dos azúcares diferentes (L-rodinosa y L-amicetosa, respectivamente) en los cuales el grupo hidroxilo presente en la posición C4 del azúcar muestra orientaciones divergentes (Fig. 1 y Fig. 9D). Claramente, la ausencia de azúcar en la estructura de estreptolidiginona (Fig. 8) tiene un efecto negativo sobre la actividad antibiótica de este compuesto.
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Texto libre de la lista de secuencias Traducción por orden alfabético
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Artificial Sequence: Secuencia artificial
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DNA: ADN
\bullet
Synthetic oligonucleotide: Oligonucleótido sintético
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<110> Universidad de Oviedo
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<120> Procedimiento para aislar genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina, moléculas de ADN, manipulación genética de la ruta y sus usos
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<130> PII-2009-0007
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<160> 45
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<210> 1
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<400> 42
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGGATCCGGCTCCGCGATGAGCGAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> synthetic oligonucleotide CRIS14
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAATTCATGCATGGTGGTCATCCGCCGCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> synthetic oligonucleotide CRIS17
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGGATCCACCGAACCCGGAGGGTCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> synthetic oligonucleotide CRIS18
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAATTCACTAGTTCCTCGCCGGGCGTCAC 
\hfill

Claims (36)

1. Procedimiento de aislamiento y purificación de un fragmento de ácido nucleico que contiene la agrupación de genes de la ruta de biosíntesis de estreptolidigina que comprende las siguientes etapas:
a.
obtención de una genoteca de ácido nucleico genómico del microorganismo productor de estreptolidigina Streptomyces lydicus;
b.
transfección de clones de dicha genoteca en células hospedadoras;
c.
diseño de oligonucleótidos para el aislamiento de la agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina;
d.
construcción de una sonda que comprende una secuencia nucleotídica de una agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina;
e.
utilización de sondas heterólogas para el aislamiento de la agrupación de genes de biosíntesis de estreptolidigina;
f.
hibridación de dichas sondas frente a la genoteca de ácido nucleico genómico obtenida de dicho microorganismo;
g.
aislamiento de dicha agrupación génica a partir de los clones con hibridación positiva.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una molécula de ácido nucleico que comprende:
una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1;
o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1;
o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1;
o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 ó de su hebra complementaria;
o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina;
o una parte de él.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, caracterizada porque contiene una parte de la secuencia de nucleótidos con al menos 15 nucleótidos de longitud.
4. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 que codifica uno o más polipéptidos, o que incluye uno o más elementos genéticos, que poseen una actividad funcional en la síntesis de un antibiótico dienoil-tetrámico o un precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico.
5. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 que codifica uno o más polipéptidos, o incluye uno o más genes y/o una o más secuencias reguladoras y/o uno o más elementos genéticos codificadores o no codificadores, que tienen actividad funcional en la síntesis de un antibiótico dienoil-tetrámico o un precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico.
6. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5, caracterizada porque dicho antibiótico dienoil-tetrámico o precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico es estreptolidigina o un precursor de estreptolidigina.
7. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 caracterizada por incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39.
8. Una molécula de ácido nucleico obtenida según el método de la reivindicación 1 que comprende:
una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1;
o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1;
o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1;
o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, o con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 6 de su hebra complementaria;
o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SED ID NO: 1 y que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de estreptolidigina;
o una parte de él.
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9. Un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7 que comprende:
una o más secuencias aminoacídicas completas, o partes de las mismas, descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39;
o una o más secuencias aminoacídicas completas, o partes de las mismas, que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39.
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10. Un polipéptido según la reivindicación 9 caracterizado porque posee una actividad funcional en la síntesis de un antibiótico dienoil-tetrámico o un tetrámico.
11. Una molécula de ácido nucleico recombinante caracterizada porque incluye el fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 7, o una parte con similares características, clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli.
12. Molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 11 caracterizada porque es el cósmido Slg6E5.
13. Molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 11 caracterizada porque es el cósmido Slg4A8.
14. Molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 11 caracterizada porque es el cósmido Slg9C7.
15. Molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 11 caracterizada porque es el cósmido Slg6G6.
16. Célula hospedadora u organismo transgénico caracterizado porque contiene una molécula de ácido nucleico recombinante de las reivindicaciones 11, 12, 13, 14 ó 15.
17. Utilización de los genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 en la producción de metabolitos tetrámicos.
18. Utilización de los genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 en la producción de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina.
19. Utilización de los genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos o precursores de metabolitos tetrámicos.
20. Utilización de los genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 para incrementar la producción de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina.
21. Utilización de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 11, en la inactivación de genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina.
22. Utilización de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 11, en técnicas de amplificación por PCR encaminadas al aislamiento y/o utilización de genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina.
23. Utilización de células hospedadoras u organismos transgénicos de la reivindicación 16, en la producción de metabolitos tetrámicos.
\newpage
24. Utilización de células hospedadoras u organismos transgénicos, de la reivindicación 16, en la producción de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina.
25. Uso de los intermediarios de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina de las reivindicaciones 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 como compuestos de partida en la síntesis química de metabolitos tetrámicos.
26. Proceso para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos en un hospedador bacteriano, que comprende las siguientes etapas:
a.
transferencia del fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 a un hospedador del género Streptomyces;
b.
cultivo de la cepa recombinante obtenida;
c.
aislamiento del metabolito tetrámico producido.
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27. Proceso según la reivindicación 26 caracterizado porque el hospedador del género Streptomyces es
Streptomyces lydicus.
28. Proceso según la reivindicación 27 caracterizado porque el hospedador Streptomyces lydicus es un mutante derivado de S. lydicus NRRL 2433.
29. Proceso según las reivindicaciones 28, caracterizado porque el metabolito tetrámico es estreptolidigina, un derivado de estreptolidigina o un precursor de estreptolidigina.
30. Proceso para generar derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina caracterizado por la inactivación de genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11.
31. Uso de los intermediarios de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina obtenidos de las reivindicaciones 26, 27, 28 29 6 30 como compuestos de partida en la síntesis química de productos tetrámicos.
32. Cepa recombinante de Streptomyces lydicus caracterizada porque carece de los genes que codifican para las proteínas descritas como SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 y 12.
33. Cepa recombinante de Streptomyces lydicus de la reivindicación 32 caracterizada porque contiene el plásmido pFL844T.
34. Cepa recombinante de Streptomyces lydicus de la reivindicación 32 caracterizada porque contiene el plásmido pFL845T.
35. Cepa recombinante de Streptomyces lydicus de la reivindicación 32 caracterizada porque contiene el plásmido pLNBIVT.
36. Derivados de estreptolidigina caracterizados porque se producen por la cepa de la reivindicación 32, 33, 34 ó 35.
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