WO2007017601A1 - Milieu de culture bacterienne dans un milieu inorganique minimum et comportant du gentisate et/ou un de ses precurseurs, et utilisation du 3-hydroxybenzoate dans un tel milieu - Google Patents

Milieu de culture bacterienne dans un milieu inorganique minimum et comportant du gentisate et/ou un de ses precurseurs, et utilisation du 3-hydroxybenzoate dans un tel milieu Download PDF

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WO2007017601A1
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strain
medium
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Patrick Alain Daniel Grimont
Chloé Stéphanie JANSEN
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to bacterial culture selective media comprising, in a minimum inorganic medium, gentisate or at least one gentisate precursor. It also relates to processes for enriching bacterial culture and / or isolating bacterial culture using such media, as well as the combination of at least one gentisate precursor and at least one inhibitor for the enrichment and / or isolation of bacterial culture, especially Salmonella, and the use of gentisate or one of its precursors, especially 3-hydroxybenzoate for this purpose.
  • Salmonella can be responsible for pathologies in humans, including foodborne illness, and are very common.
  • the ideal selective medium should allow a bacterial cell of the strain to grow or identify to give a colony and must inhibit other bacterial species. Moreover, if the inhibition of other bacteria is insufficient, a colored reaction in the medium can help distinguish colonies from the strain to be grown or identify other colonies.
  • a medium that is useful according to the invention allows both a recovery rate close to 1 for the strain to be cultivated or identified, in particular Salmonella; and a recovery rate close to 0 for the different species of the strain to be cultivated or identified.
  • Salmonella Bacteria of the genus Salmonella are gram-negative bacilli belonging to the family Enterobacteriaceae. This genus is phylogenetically close to Escherichia and Citrobacter. It comprises two species, S. enterica, a habitual species (over 2200 serotypes), and S. bongori, a rare species. S. enterica is subdivided into subspecies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, and indica, which are further subdivided into serotypes. The serotypes mentioned here refer to Salmonella enterica subsp.
  • Salmonella enterica subsp. enterica are intestinal parasites of warm-blooded animals and humans; the other subspecies preferentially contaminate cold-blooded animals (reptiles, amphibians).
  • enterica subspecies strictly human serotypes (Typhi), strictly animal serotypes (Gallinarum) are distinguished but most serotypes are ubiquitous (Typhimurium, Enteritidis .. " .) And contaminate humans, poultry, eggs, cattle ...
  • Salmonella are responsible for several types of human pathologies including fevers typhoid and paratyphoid (serotypes Typhi and Paratyphi A 1 B 1 C) which are, in France, mainly imported cases from endemic zone, minor salmonellosis: gastroenteritis, sporadic or collective food poisoning (TIAC), Salmonella being the most frequently isolated agent in food poisoning, or extra-digestive manifestations in high-risk individuals such as immunocompromised individuals.
  • fevers typhoid and paratyphoid serotypes Typhi and Paratyphi A 1 B 1 C
  • TIAC collective food poisoning
  • Salmonella being the most frequently isolated agent in food poisoning, or extra-digestive manifestations in high-risk individuals such as immunocompromised individuals.
  • Salmonellosis is acquired by ingestion of water and contaminated food.
  • the most commonly implicated foods are eggs and egg preparations, deli meats, poultry, dairy products and meats. This contamination may be related to defective hygienic practices: contaminated raw materials (intestinal carriage by warm-blooded animals), contaminating environment (equipment, personnel of collective restorations, manufacturing circuits), error in the manufacturing process, delay important between preparation and consumption or breaking the cold chain, for example.
  • Salmonella enterica is the main agent of collective food poisoning (JIAC) in France.
  • Salmonella are isolated from stool cultures (minor and major salmonellosis), blood cultures or other body fluids (typhoid fever, bacteremia, invasive salmonellosis), environmental samples and products intended for human or animal consumption.
  • Salmonella are prototrophic but some serotypes, adapted to a particular host (Typhi, Paratyphi A, Gallinarum) are auxotrophic for one or more growth factors.
  • the search for Salmonella as a polymicrobial mixture requires several steps, namely pre-enrichment in a non-selective medium (6 to 20 h), carried out in peptone water; enrichment in selective liquid medium (24h); broth M ⁇ ller-Kauffmann tetrathionate, or 'selenite broth (supplemented or otherwise with cystine or novobiocin) or Rappaport Vassiliadis broth; isolation on selective media agar plates from enriched broths (24-48h): Xylose-Lysine-Deoxycholate (XLD), Hektoen, for example, then confirmation by biochemical and antigenic identification, which generally requires at least 3 days of manipulation.
  • XLD Xylose-Lysine-Deoxycholate
  • agar media as Salmonella include the Hektoen circles DCA agar (SS), xylose lysine deoxycholate (XLD), xylose-lysine Tergitoj r '4 (XLT4) Novobiocin bright-green-glucose (NBG ) or Novobiocin-brilliant green-glycerol-lactose (NBGL) and Rambach.
  • SS Hektoen circles DCA agar
  • XLD xylose lysine deoxycholate
  • XLT4 xylose-lysine Tergitoj r '4
  • Bile salts or sodium deoxycholate affect the growth of gram positive germs. Bright green (antiseptic dye), novobiocin and cefsulodine (antibiotics), and Tergitol
  • Salmonella in the case of Salmonella, the absence of acid production from certain sugars such as lactose, sucrose, glycerol, or salicin, is used in Hektoen, SS, XLD, XLT4, NBG, NBGL. Salmonella does not acidify the medium, have a distinct coloration of other enterobacteria capable of cultivating (Citrobacter, E. coli, Enterobacter, Shigella ). In these same media, the combination of sodium thiosulfate and ammoniacal iron citrate gives a black color to the Salmonella colonies by production of hydrogen sulphide. Discrimination Sa // ⁇ ? One // a-flora associated is therefore good, except for Proteus sp., Which also produces H 2 S. The perception of Salmonella lactose or sucrose + is not correct.
  • XLD is the least inhibitor and allows a high recovery rate of Salmonella.
  • the Rambach medium interesting for the isolation and enumeration of Salmonella in crustaceans, makes it possible to highlight two specific properties of the genus Salmonella: the production of acid from propylene glycol and the absence of ⁇ -galactosidase ( revealed by a chromogenic substrate, X- ⁇ -Gal or 5-bromo-4-chloro-3- ⁇ -indolyl-D-galactopyranoside).
  • ⁇ -galactosidase revealed by a chromogenic substrate, X- ⁇ -Gal or 5-bromo-4-chloro-3- ⁇ -indolyl-D-galactopyranoside.
  • Typhi and Paratyphi A serotypes give colorless colonies that are difficult to detect, and some colonies of Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii may be red, with a close color, which may lead to difficulties of assessment in the identification.
  • Chromogenic media more recent, allow a better discrimination between Salmonella and the associated flora. They contain chromogenic substrates that demonstrate Salmonella-specific enzymatic activities, including Typhi and Paratyphi A serotypes.
  • SM-ID demonstrates the fermentation of glucuronate and the absence of ⁇ -galactosidase, giving colonies of Pink to red Salmonella.
  • CSE allows the detection of C8-esterase activity (by the use of SLPA-octanoate, chromogenic substrate), giving red-purplish colonies.
  • ABC detects the ⁇ -galactosidase activity of all Salmonella (blue colonies, X- ⁇ -Gal substrate) and the ⁇ -galactosidase activity of non-Salmonella (black colonies, 3,4-cyclohexeno-esculetin or CHE-GaI substrate). ). CHROMagar gives purple colonies of Salmonella (evidence of esterase activity), other enterobacteria appear blue or colorless ( ⁇ -galactosidase activity). Finally, SCM detects the caprylate-sterase activity of Salmonella, giving magenta colonies, thanks to Magenta-cap or 5-bromo-4-chloro-3-indolylcaprylate. Non-Salmonella colonies appear blue ( ⁇ -galactosidase activity, X- ⁇ -GAL).
  • These media can be used to search for certain bacteria, including Salmonella, in various clinical samples but also in foodstuffs, pharmaceuticals, environmental samples. They are most often recommended as isolation media after an enrichment phase, to improve the sensitivity of the method.
  • 3-HB is a non-nitrogen aromatic compound, cited as a carbon substrate in culture media, by Veron (1) among 146 substrates studied, without this 3-HB being used in the presence of inhibitor, the solutions described having 100 g / l of substrate.
  • US Pat. No. 5,824,552 describes a method for culturing animal cells, and in particular a medium stimulating the growth of cells whose carbon source is glucose.
  • the method described in this document implements a culture medium containing benzoic compounds, especially derivatives of hydrobenzylic acid, including 3-HB at concentrations of less than 50 ⁇ g / ml, cells cultured, exclusively animal. , not consuming this compound during their cultivation.
  • the derivative of hydrobenzylic acid is not a source of carbon and energy necessary for the maintenance of life and the multiplication of animal cells; in the examples, it is thus systematically added a carbon source, glucose.
  • the notions of carbon source and growth factor are usually distinguished.
  • the mass of bacteria obtained at the end of growth is proportional to the amount of available carbon source.
  • growth factors are substances that an organism can not synthesize, and the quantitative needs vary greatly from one strain to another.
  • amino acids there are amino acids, incorporated as such into proteins - if the amino acid were a source of carbon it would be catabolised and its carbons would be found anywhere - and the same goes for purines and pyrimidines incorporated in the nucleic acids and on the other hand the vitamins which enter into the constitution of coenzymes, and are recyclable, and of which very small quantities are necessary.
  • the present invention relates to a bacterial culture medium for a strain to be cultivated comprising, in a minimum inorganic medium, at least one gentisate precursor and / or gentisate, as a source of carbon and energy.
  • the precursors or derivatives and / or other precursors of gentisate or their derivative (s) constitute (s) a source of carbon and energy for bacteria to grow.
  • the precursor concentration of gentisate and / or gentisate and / or their derivative (s) is such that it (s) constitute a source of carbon and effective energy.
  • 3-HB is used at a minimum final concentration of 0.1 g / l, preferably about 0.5 g / l, and more preferably of 1 g / l.
  • g / l approximately, that is to say about 1000 ⁇ g / ml in the medium.
  • concentrations are therefore at least 2 times, preferably 10, and more preferably 20 times higher than the known concentration of the prior art.
  • the circles of the The present invention does not allow the culturing of animal cells.
  • the medium further comprises at least one inhibitor of the growth of bacteria different from the bacterial strain to be cultured and assimilated said carbon source.
  • the medium is in liquid form and / or for certain applications, it is not necessary to add an inhibitor so that the medium according to the invention is enriching.
  • invention 1 also relates, in one embodiment, to culture media in liquid form and without inhibitor.
  • It also relates to culture media in semi-solid or gelled form and under inhibiting conditions, that is to say that the inhibition can be caused both by the presence of a growth inhibitor of bacteria different from the strain to cultivate and assimilating said source of carbon and energy only by salinity conditions, aerobic conditions, pH conditions and / or temperature conditions.
  • the invention also relates to a process for enriching a bacterial strain in a medium according to the invention.
  • It also relates to a method of isolating a bacterial strain in a medium according to the invention.
  • inhibitory conditions may be chosen from the presence of a growth inhibitor of the bacteria different from the strain to be cultivated and assimilating said source of carbon and energy, the salinity conditions, the aerobic conditions, the pH control. and / or temperature control.
  • the invention relates to the combination of gentisate or its derivatives and / or at least one precursor of gentisate or their derivatives, as a source of carbon and energy, with at least one inhibitor, for the bacterial culture of at least one strain to be cultivated, the inhibitor acting on the growth of bacteria different from the bacterial strain to be cultivated and assimilating said source of carbon and energy.
  • It also relates to the use of gentisate or its derivatives and / or at least one precursor of gentisate or their derivatives, as a source of carbon and energy, under inhibiting conditions, for the bacterial culture of at least one strain to cultivate, said conditions acting on the growth of bacteria that are different from the bacterial strain to be cultivated and which assimilate said source of carbon and energy.
  • the media according to the invention allow the culture and also the isolation of bacterial strains, and in particular strains of Salmonella, including auxotrophic serotypes including Typhi, and Paratyphi, etc.
  • the selectivity of these media is comparable or improved compared to that of known media.
  • the media of the invention may allow a recovery rate of Salmonella often higher than that of the marketed environments, and this superiority is accentuated when the bacteria are stressed.
  • the media of the invention also have the advantage of requiring smaller amounts of inhibitor (s) compared to the usual media. In addition, they specifically allow the detection of strains of Salmonella subjected to stress.
  • the recovery rate of Salmonella subjected to stress has been found, with the medium of the invention, at least equivalent to. TCS agar.
  • the media of the invention are therefore of great interest in the search and enumeration of stressed Salmonella.
  • bacteria are subjected to various stresses in their environment and in the materials they contaminate: temperature variations (freezing, heating, - especially with food products), lack of nutrients, moisture content, oxidation stress, osmotic stress, for example, and, as for many Gram-negative bacteria, these unfavorable conditions can induce the passage of Salmonella especially to the state of non-culturable viable bacteria that makes them undetectable on standard culture media, except under certain favorable conditions that allow the bacteria to be revived.
  • Non-culturable viable bacteria are not detectable, but could retain and recover their infectivity under favorable conditions such as intestinal lumen.
  • the ability of the medium according to the invention to revitalize certain bacteria, including Salmonella, viable non-cultivable is of particular interest for the research of said bacteria in food and water, by avoiding the pre-enrichment phase recommended by the NF EN ISO 6579 standard.
  • any strain likely to use the source of carbon and energy according to the invention that is to say any strain assimilating 3-HB and / or gentisate and / or their precursors and derivatives.
  • Such strains include Citrobacter spp. including diversus and freundii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca, Salmonella sp. Salmonella enterica subsp indica, Salmonella enterica subsp. arizonae, Salmonella bongori, Escherichia coli, Salmonella enterica subsp. diarizonae, Salmonella enterica subsp., Salmonella enterica subsp.
  • the bacterium chosen from Salmonella sp. As bacterium to be cultured, is isolated or enriched.
  • Salmonella enterica subsp indica Salmonella enterica subsp arizonae, Salmonella bongori, Salmonella enterica subsp diarizonae, Salmonella enterica subsp enterica, Salmonella enterica subsp houtenae, Salmonella enterica subsp salamae, Eschrichia coli and other Enterobacteriaceae
  • the Salmonella strains are more particularly targeted. According to the invention, it is more preferably still all serotypes or serovars of Salmonella enterica, and in particular the serotypes Typhimurium, Enteriditis, Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B, Virchow, Hadar, Agona, for example, with the exception Gallinarum serotype.
  • Minimum inorganic medium means a medium containing no assimilable organic carbon feeds. In the absence of these foods, no bacteria can grow, and if a single source of carbon and energy is added, only the bacteria capable of assimilating it can grow.
  • the inorganic medium M70 used by Véron (1) to study the assimilation of various energy sources, is such a minimum medium. It consists of three inorganic solutions: a solution of trace elements, a Phosphorus-Calcium-Magnesium solution and the nitrogenous base and will be described below.
  • any other inorganic minimal medium, containing substantially no organic carbon feed assimilable by the strain to be cultivated, is used according to the invention.
  • Gentisate (2,5-dihydroxybenzoate), a compound resulting from the metabolism of 3-HB, is in fact also assimilable by certain bacterial strains such as Salmonella.
  • gentisate can also be used as a source of carbon and energy, or mixed with a precursor "gentisate.
  • gentisate include 3-HB and its derivatives.
  • the concentrations of gentisate and / or 3-HB are greater than 0.1 g / l, preferably about 0.5 g / l. Moreover, they are preferably less than 5 g / l, preferably about 2 g / l. Thus, preferably of the order of 0.1 to 5 g / l of 3-HB, preferably they are of the order of 0.5 g / l to 2 g / l, more preferably of the order of 0.8 to 1, 2 g / ⁇ .
  • the media of the invention may comprise one or more inhibitors. They make it possible to improve the selectivity of the medium.
  • a liquid medium (without agar) according to the invention may not comprise an inhibitor.
  • bile salts sodium deoxycholate
  • detergents include Tergitol 4 and Tween 20.
  • Antibiotics include novobiocin, cefsulodin and mixtures thereof.
  • dyes include dyes of the triphenylmethane type, especially diaminotriphenylmethane, and also in particular bright green and malachite green, gentian violet, acidic fuchsin, and mixtures thereof.
  • inhibitors may be suitable, which inhibit the growth of undesired bacterial strains, including those which assimilate the carbon and energy source of the invention.
  • the inhibitor can thus be chosen from inhibitors of gram-positive flora and / or gram-negative bacteria distinct from the bacterial strain to be cultured.
  • a particular advantage of the media according to the invention lies in the fact that, given the nature of the minimum inorganic base medium, the doses of inhibitors used can be very small in certain cases compared to the doses useful in known media, for example in Kristensen's medium, bright green medium (usually 12.5 mg) and miliu novobiocin-bright green-glycerol-lactose (usually 7 mg / l).
  • thallium sulphate is to inhibit severe aerobic Gram-negative bacteria, such as Pseudomonas and Burkholderia, and bright green Enterobacteriaceae such as E. coli.
  • the preferred doses are, for example, approximately. 1 to 3 mg / l glossy green, preferably about 1.5 to 2.5 mg / l, and 0.02 to 0.002 g / l thallous sulfate, preferably 0.008 to 0.015 g / l, preferably about 0.01 g / l.
  • At least one growth factor can be added to the minimal medium.
  • Growth factors accelerate revivification and are particularly useful for the growth of auxotrophic serotypes. This is particularly the case for certain auxotrophic bacterial strains, such as Salmonella Entendis 64K, or Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A or serotype Gallinarum.
  • auxotrophic bacterial strains such as Salmonella Entendis 64K, or Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A or serotype Gallinarum.
  • the optimal concentration of a growth factor or the combination of several factors must be sufficiently small for bacterial growth to be insignificant in the absence of another source of carbon and usable energy, such as 3-HB or any other precursor of gentisate.
  • the concentration is minimal to prevent it being a source of carbon, which would reduce the selectivity. It is according to the invention chosen to be less than the concentration allowing growth without other carbon source.
  • a growth factor it is possible to use, for example, a growth factor chosen from amino acids, vitamins, purines, protein hydrolysates and yeast extracts, and mixtures thereof. Any product capable of supplying the medium with the necessary amino acids can be used.
  • a casein hydrolyzate usually called casamino acid
  • other protein hydrolysates or amino acid mixtures may also be used, optionally supplemented with cysteine, particularly L-cysteine.
  • 0 to 200 mg / l of casamino acid medium can be used, preferably up to about 100 mg / l, more preferably about 50 mg / l, in the presence of 0 to 200 mg / l of L- cysteine HCl monohydrate, preferably up to about 100 mg / l, more preferably about 25 to 52 mg / l, or 18 to 36 mg / l of pure cysteine medium.
  • the media of the invention may comprise chromogenic substrates, which make it possible to demonstrate specific enzymatic activities of the cultivated or isolated strains.
  • chromogenic substrates which make it possible to demonstrate specific enzymatic activities of the cultivated or isolated strains.
  • the addition of such a substrate which demonstrates a specific activity of the strain to be studied makes it possible to improve the Salmonella / non-Salmonella discrimination.
  • chromogenic substrate mention may be made of the substrates of the 4- [2- (4-octonoyloxy-3,5-dimethoxyphenyl) -vinyl] quinolinium-1-propan-3-yl-carboxylic acid bromide type.
  • SLPA-octanoate 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-caprylate
  • X-caprylate 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-D-galactopyranoside
  • X-alpha-D -gal 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-D-galactopyranoside
  • ⁇ -bromo-chloro-S-indoxyl-beta-D-galactopyranoside X-beta-D-gal or X-gal
  • the 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl radical (X, blue color after hydrolysis) can be replaced by 3-indoxyl (Y, another blue color after hydrolysis) or 5-bromo-6-chloro-3- indoxyl (Magenta, - magenta color after hydrolysis) or 6-chloro-3-indoxyl (Salmon, pink color after hydrolysis) or 5-iodo-3-indoxyl (lodo, purple color after hydrolysis) or N-methylindoxyl (Green, green color after hydrolysis) or 4-methylumbelliferyl (4-MU 1 blue fluorescence after hydrolysis), indoxyl here being synonymous with indolyl.
  • a chromogenic substrate chosen from the X-caprylate, X-alpha-D-galactopyranoside, X-beta-D-galactopyranoside or X-galactopyranoside substrates, where X- represents the 5- bromo-4-chloro-3-indoxyl-, X- may be substituted for 3-indoxyl-, 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-, 6-chloro-3-indoxyl-, 5-iodo-3- indoxyl-, N-methylindoxyl- or 4-methylumbelliferyl-, and mixtures thereof.
  • the substrates can be added to the agar or before autoclaving. Their concentration depends on the medium and the intensity of the desired coloring, the products and uses and the color detection modes generated. It can be chosen on the order of 100 mg / l approximately. By way of example, for chromogens comprising the 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl group, the concentration may be of the order of 0.05 to 2 g / l of medium, preferably about 0.1 g / l.
  • the concentration can be chosen between approximately 0.1 and about 0.4 g / l.
  • the media of the invention are prepared in the usual manner by dissolution and / or addition to a base medium defined above of the additives above.
  • the way of incorporating additives into the medium or base is not restrictive.
  • the water-soluble additives are added in sterile aqueous solution, but the additives can also be added in solution in a suitable aqueous solvent.
  • a medium comprising, in Véron's medium, or any other minimal synthetic medium, requiring a source of carbon and energy, and in addition to 3 -HB at a rate of 0.2 to 2 g / 1, preferably 0.5 to 1.5 g / l, preferably about 1 g / l, casamino acids in a proportion of 0 to 100 mg / l, preferably 50 to 100 mg / l, preferably about 50 mg / l, L-cysteine in hydrochloride monohydrate form at a rate of 0 to 100 mg / l, preferably 26 to 52 mg / l, preferably about 26 mg / l, of the brilliant green AcBg-14 at a rate of 1 to 2.5 mg / l, preferably about 1.5 mg / l, and thallous sulfate at 0 to 0.025 g / l, preferably 0.01 to 0.025 g / l, preferably about 0.01 g
  • the culture media can be presented according to the invention in liquid form or in a solid form, in the case where a gelled vehicle is used, depending on their subsequent use.
  • the medium is usually in liquid form, whereas for isolation and identification, it is usually in solid or semi-solid form, usually on agar.
  • any other conventional gelled vehicle is usable according to the invention.
  • the media according to the invention can be used under the same conditions of pH and temperature as the usual media.
  • These culture media are particularly useful for the specific isolation of Salmonella and other Gram-negative bacteria, and can be used to search for germs in many samples.
  • By choosing the appropriate inhibitors one can consider the inhibition of strict aerobic Gram-negative bacteria and Enterobacteriaceae such as E. coli. Without inhibitors of this bacterium, they may also be useful for the enrichment of certain bacterial strains, in particular E. coli, in addition to that of Salmonella.
  • 55 bacterial strains were used: 34 Salmonella enterica subsp. enterica, 13 non-Salmonella enterobacteria, and 8 non-enterobacteriaceae, but which are similar in their habitat and certain cultural and biochemical characteristics. They come from the collections of the Biodiversity Unit of Emerging Pathogenic Bacteria of the Pasteur Institute (BBPE), the National Salmonella Reference Center (CNR), or the WHO Collaborating Center for Salmonella (WHO CCOMS). Some of these are typical strains or historical strains of Kauffmann.
  • BBPE Biodiversity Unit of Emerging Pathogenic Bacteria of the Pasteur Institute
  • CNR National Salmonella Reference Center
  • WHO CCOMS WHO Collaborating Center for Salmonella
  • the strains are stored in storage agar described below. After reseeding agar trypto-casein-soy "(TCS) or Drigalski, identity and purity of the strains was confirmed by appropriate tests. For the study, a stock culture of each of these strains is obtained on agar TCS sloping, kept at room temperature, and regular transplants are made.
  • TCS trypto-casein-soy
  • Table I Strains of Salmonella enterica subsp. enterica j ⁇ ssed 2
  • the inorganic medium M70 of Véron (1) was used as a base, the
  • 3-HB being added as the sole source of carbon and energy, and yeast extract as a growth factor for auxotrophic strains.
  • the solution obtained by dissolution was sterilized by sterilizing filtration (0.22 ⁇ filter). It was kept in a refrigerator at + 4 ° C. For practical reasons, it is also possible to prepare this ten times more concentrated solution of the same components.
  • This OE solution is included in the composition of solution A described below.
  • the pH of solution A was adjusted to 7.2. At this pH, 3-hydroxybenzoic acid is neutralized and is in the form of 3-hydroxybenzoate.
  • the solution was then sterilized by sterilizing filtration on a 0.22 ⁇ filter or by autoclaving it. minutes at 110 ° C. A turbid appearance of the solution at the outlet of the autoclave does not modify the quality of the medium.
  • the solutions A and B were maintained at a temperature of 50-60 0 C, avoiding a setting of mass of the agar solution B. They were then mixed aseptically, thus giving a liter of medium. After homogenization, it was poured into Petri dishes (20 ml in round dishes 9 mm in diameter, 70 or 80 ml in 12 ⁇ 12 cm square boxes). The boxes were stored at +4 ° C. until use.
  • the inhibitory activity of different products on bacteria listed above was tested in order to reduce the growth of non-Salmonella.
  • the inhibitory effect was tested for increasing concentrations of product. These are the following products used in the respective concentration ranges in the final medium.
  • the inhibitory power of the different products was determined by a gradient technique: the culture medium containing the inhibitor is poured into a square petri dish (12 * 12 cm) so as to create a concentration gradient within the agar.
  • Solutions A and B are prepared as described above.
  • stock solutions of the different inhibitors were prepared in distilled water and sterilized by filtration on a unit filter of 0.22 ⁇ (ex: 25 mg bright green in 10 ml of water).
  • the inhibitor was added at a minimum volume.
  • a solution A was thus prepared at the lowest concentration of inhibitor tested (eg 0.25 mg / l brilliant green, ie 0.1 ml of the stock solution per 1 liter of medium) and another at the highest concentration. concentration (eg 5 mg / l brilliant green or 2 ml for 1 liter of medium).
  • a first "concentrated” layer of agar 40 ml was sloped. After drying, a second "diluted” layer (40ml) was poured over. The agar obtained was dried in a hood for about 30 minutes and sown within one hour.
  • a bacterial suspension of each strain tested was prepared in 5 ml of sterile distilled water. This suspension was calibrated at 0.5 MacFarland, using a densitometer.
  • Inoculation was streaked using a 1 ⁇ l layer, from the most concentrated side to the most diluted. The dishes were then incubated at 37 ° C. for 48 hours to 4 days.
  • L-cysteine (as hydrochloride monohydrate, Prolabo): 18 and 36 mg / l of pure cysteine (ie 26 and 52 mg / l of cysteine, HCl, H 2 O) Casamino acids (Difco): 25, 50, 100, 200 and 300 mg / l (casein hydrolyzate).
  • Solutions A and B were prepared and sterilized as described above.
  • Concentrated stock solutions of the two amino acids were prepared and sterilized by filtration on a unit filter of 0.22 ⁇ . They were stored at + 4 ° C and protected from light. A small volume of these solutions was added to solution A (so as to obtain the desired final amount) then A was mixed with B.
  • the casamino acids were directly incorporated in the desired amount in solution A, before sterilization.
  • M70 media supplemented with growth factors (in the amounts tested) but lacking 3-HB were prepared.
  • concentrations of growth factor (s) for which growth remains insignificant in the absence of a carbon source were determined.
  • a bacterial suspension of each strain tested was prepared in 5 ml of sterile distilled water. This suspension was calibrated at 0.5 MacFarland, using a densitometer.
  • the dishes were incubated at 37 ° C. for 48h or even 4 days.
  • the reading was performed at 24, 48 or even 4 days, noting the culture density (0, absence, +++, very good), compared to the controls.
  • the inhibitor concentrations that can be used were determined by evaluating the recovery rate or "efficiency of plating" (eop) of the medium at the following concentrations: bright green: 1 - 1, 5 - 2 - 2.5 mg / l; thallous sulphate: 0.01 and 0.025 g / l; the two partners. This is a surface count method.
  • the media were prepared as described above, supplemented with growth factors and inhibitors. They were cast in a 9 cm round petri dish (20 ml per box). Controls without inhibitors were also prepared. The boxes were stored at + 40 ° C. until use and dried under a hood. 1.3.2 Inoculation method
  • a TCS broth was inoculated with a cese and incubated for 18 h at 30 or 37 ° C. This broth was then diluted ten to ten in 9 ml of sterile distilled water to the dilution 10 "7 For the 10 dilution.” 1, diluted 1 ml initial broth into 9 ml of distilled water; to obtain the dilution 10 '2 , 1 ml of the dilution 10 "1 is diluted in 9 ml of distilled water, etc. This dilution in the water is sufficient to avoid the supply of nutrients from the initial broth when the inoculation of the minimum medium.
  • the plates were incubated 48h at 37 ° C. The enumeration of the colonies was done after 24h and 48h. For each duplicate whose colony count was between 15 and 300, the average of the colonies was calculated and compared to the average obtained on TCS. The efficiency of plating (eop) was determined by calculating the ratio of the number of colonies counted on the tested medium to the number of colonies counted on TCS. In addition, the growth rate and the size of the colonies were noted.
  • This medium was prepared in round petri dishes (9 cm in diameter, ie 20 ml of medium) and stored at + 4 ° C. until use.
  • the optimized M70 / 3-HB medium comprises, in addition to the base medium described in paragraph IA, casamino acids (0.050 g / l), L-cysteine (as hydrochloride monohydrate, 26 mg / l), bright green AcBg-14 (1.5 mg / l), and thallous sulfate (0.01 g / l).
  • the casamino acids 50 mg of powder
  • L-cysteine 5 ml of a stock solution containing 5.2 mg / ml of L-Cys, HCl, H 2 O
  • Bright green 1.5 ml sterile 1 mg / ml stock solution
  • thallous sulfate (1 ml sterile 0.01 g / ml stock solution) are added to the sterile solution A.
  • the resulting agar is translucent and sky blue.
  • the inoculated medium should be incubated for 48 h at 37 ° C.
  • composition A of composition is prepared:
  • micronutrient solution * having the same composition as that described above in the base medium.
  • Solution B This solution is identical to that described above for the basic medium.
  • solution A Under magnetic stirring the constituents of solution A were dissolved except brilliant green and thallous sulfate; the pH was adjusted to 7.2 + 0.2 at 25 ° C.
  • the solution obtained was sterilized by filtration on a 0.22 ⁇ Stéricup ® filter.
  • 1.5 ml of a sterile green gloss stock solution at 1.5 mg / ml and 1 ml of sterile thallium sulfate stock solution at 0.01 g / ml were added, these stock solutions having been prepared. separately and sterilized by filtration on 0.22 ⁇ unit filters.
  • Solution B was prepared in a sterile 1 liter vial by dissolving the products with magnetic stirring and adjusting the pH to 7.2 ⁇ 0.2 at 25 ° C.
  • the resulting solution was heated on a hot plate until the agar was completely dissolved.
  • This solution was sterilized by autoclaving for 20 minutes at 110 ° C. Maintained at a temperature of 50 ° C. at 60 ° C., 500 ml of A were mixed with the 500 ml of B. Petri, the cast boxes obtained being blue and translucent.
  • the dishes were dried, by passing 15 to 30 minutes under a hood or in an oven. We have stored and stored in refrigerator (12h at room temperature).
  • Salmonella culture and the inhibition of other species were carried out by incubation of the inoculated medium for 48 hours at 37 ° C.
  • SS Merck marketed by (1.07667) Xylose-Lysine-Deoxycholate agar or XLD by Merck (1.05287) Xylose-Lysine-Tergitol 4 agar or XLT4 by Merck (1.13918) Rambach® agar marketed by Merck (1.07500) Tryptophan casein-soy (TCS) marketed by BioRad.
  • the evaluation of the M70 / 3-HB medium was performed by comparing the "efficiency of plating" of this medium with that of the other media, according to the enumeration method above. For a maximum of strains, from a broth of 18h, dilutions in sterile distilled water were carried out. Dilutions 10 "4-10" 7 are inoculated by spreading on the rake 7 circles in duplicate. After 24 to 48 hours of incubation at 37 ° C, the colonies on each of the plates were counted and the appearance and size of the colonies was recorded. The "efficiency of plating" was determined relative to TCS agar.
  • a TCS broth was inoculated and incubated for 18 h at 37 ° C. Under a hood, 50 .mu.l of this broth was deposited on two glass slides, defatted, sterile (50 .mu.l per slide). Both slides were dried under the flow of the hood until complete drying. The dried slides were put in 10 ml of sterile distilled water and the whole was then vortexed.
  • strains of serotype Enteritidis were found to be able to grow in the presence of bright green concentrations greater than 5 mg / l, whereas Escherichia coli 54.8T and HI8 were inhibited as early as 0.25. mg / l, Enterobacter aerogenes was inhibited above 3.8 mg / l.
  • the inhibitory concentration is approximately 2.5 to 3 mg / l, for Typhimurium and Typhi strains 1, 5 to 2 mg / l, for strains of Escherichia coli 0103 PMK1, PMK3, PM K4 3 to 3, 5 mg / l, for Citrobacter strains.
  • Thallium sulphate (thallous) has been studied to inhibit Pseudomonas spp. and Burkholderia cepacia. Its activity was tested on the following strains: S. enterica serotypes Typhi Ty2, Typhi 57K, Typhimurium LT2, Typhimurium 58.58T, Enteritidis 64K, Enteritidis 297/67; and Escherichia coli 0103 HI8, E. coli 0103 PMK1, E. coli 0103 PMK3, E. coli 0103 PMK4, Citrobacter freundii 57.32T, C.
  • Typhi Ty2 and Typhimurium LT2 cultivated very well at the concentration of 0.025 g / l and moderately well at 0.05 g / l (results obtained by inoculation in dials of M70 / 3-HB agars supplemented with thallium sulphate at 0.025 or 0.05 or 0.1 g / l). At these same concentrations, no culture was observable for Pseudomonas and Burkholderia.
  • the optimum concentration of thallium sulphate is less than 0.025 g / l, to inhibit Pseudomonas and Burkholderia and not affect the growth of Salmonella.
  • cysteine having been studied on Typhi Ty2, Typhi 57K, Enteritidis 64K and Enteritidis 297/67 (the latter is not auxotrophic), alone and in combination, at the following concentrations:
  • 3HB 3-hydroxybenzoate
  • CAA casamino acids
  • Cys L-cysteine, HCl, H 2 O Culture: 0 void; - very weak ; ⁇ weak; + average; ++ good; +++ very good.
  • Ufc colony forming unit
  • the recovery rate of Salmonella was evaluated according to the different concentrations of brilliant green, with or without sulphate sulfate. thallium, by counting culturable bacteria on the medium in comparison with TCS agar.
  • strains using 3-HB Typhimurium LT2, Typhi Ty2, Citrobacter freundii 57.32T, Escherichia coli 0103 PMK3, Enterobacter aerogenes 60.86T, and Burkholderia cepacia 103277 were used.
  • the effectiveness of the medium in detecting bacteria was compared with that of 5 commercialized media: Hektoen, Salmonella-Shigella, XLD, XLT4, and Rambach.
  • the results obtained at 48h for Salmonella are shown in Table X.
  • the averages of recovery rates on M70 / 3-HB varied between strains and serotypes from 0.46 (Typhi Ty2) to 1.30 (Heidelberg). with an average of 0.94 and a median of 0.96.
  • the diameter of the colonies after 48h ranged from 1 to 2.5 mm.
  • the mean and median (and maximum) coverage recoveries are 0.28 and 0.21 (0.02 to 0.87) on Hektoen BioRad, 0.92 and 0.98, respectively (0). , 21 to 1, 23) on Hektoen Merck, 0.72 and 0.84 (0 to 1.60) on SS, 0.97 and 0.98 (0.11 to 1.96) on XLD 0.44 and 0.36 (0.04-1.56) on XLT4 and 0.63 and 0.60 (0.01-1.52) on Rambach.
  • the diameter of the colonies on these different media varied from 2 to 5 mm after 48 hours of incubation.
  • X 1 the total number of bacteria counted on the medium 1 (sum of the bacteria counted on the two boxes of the duplicate)
  • M70 / 3-HB medium was the most effective for 22 trials out of 43 (18 strains out of 31): all strains of Typhimurium, 2 strains of Virchow, 2 strains of Hadar, 1 Typhi, 1 Newport, Infantis , Derby, and Napoli. Salmonella Gallinarum was not cultivable.
  • Salmonella colonies showed black staining on Hektoen, SS, XLD, XLT4 media (24h production of H 2 S) and rosé on Rambach (propylene glycol use). Both strains of Typhi and the Gallinarum strain appear colorless on all media. Hadar 173K and Napoli 473K also gave colorless colonies on Hektoen, SS, XLD, and XLT4 and roses on Rambach.
  • the other media are more or less inhibitory with respect to these strains, with low recovery rates (variable according to strains and media); they give 48h colonies whose diameter varies from 3 to 5 mm.
  • the colonies observed differ from colonies of Salmonella by their coloring. Indeed, Hektoen, SS, XLD, and XLT4 make it possible to differentiate black colonies from H 2 S producing bacteria (Salmonella, Proteus) from colonies of non-H 2 S producing strains that appear colorless to yellow.
  • H 2 S producing bacteria Salmonella, Proteus
  • a chromogenic medium the colonies of nor-Salmonella appear blue-violet by the presence of a beta-galactosidase, whereas the colonies of Salmonella are pink to red.
  • the efficacy of the M70 / 3-HB medium was also evaluated on two strains of Salmonella enterica previously stressed: Enteritidis 1299/04 and Typhimurium 1366/04. The results of this test are given in Table XII.
  • the recovery rate on M70 / 3-HB was slightly reduced after stress, and remains greater than or equal to 1, that is, at least equivalent to the TCS. Rates were down on Hektoen, SS and XLD, and remained equivalent on XLT4 and Rambach. Stunting on different media

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Abstract

La présente invention concerne un milieu de culture bactérienne pour au moins une souche à cultiver comportant, dans un milieu inorganique minimum, au moins un précurseur de gentisate et/ou du gentisate ou leurs dérivés, en tant que source de carbone et d'énergie. Elle concerne également des procédés d'enrichissement d'une souche bactérienne ou d'isolement d'une telle souche dans un tel milieu. Elle concerne aussi l'association du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, notamment du 3-hydroxybenzoate, en tant que source de carbone et d'énergie, avec au moins un inhibiteur, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, l'inhibiteur agissant sur la croissance des bactéries différentes de la souche bactérienne à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie, ainsi que l'utilisation du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, notamment du 3-hydroxybenzoate, en tant que source de carbone et d'énergie, dans des conditions inhibitrices, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, lesdites conditions agissant sur la croissance des bactéries qui sont différentes de la souche bactérienne à cultiver et qui assimilent ladite source de carbone et d'énergie.

Description

Milieu de culture bactérienne dans un milieu inorganique minimum et comportant du gentisate et/ou un de ses précurseurs, et utilisation du 3-hydroxybenzoate dans un tel milieu.
La présente invention concerne des milieux sélectifs de culture bactérienne comportant, dans un milieu inorganique minimum, du gentisate ou au moins un précurseur de gentisate. Elle concerne également des procédés d'enrichissement de culture bactérienne et/ou d'isolement de culture bactérienne mettant en œuvre de tels milieux, ainsi que l'association d'au moins un précurseur de gentisate et d'au moins un inhibiteur pour l'enrichissement et/ou l'isolement de culture bactérienne, notamment de Salmonella, et l'utilisation du gentisate ou l'un de ses précurseurs, notamment le 3-hydroxybenzoate à cet effet.
De nombreuses bactéries, notamment Salmonella, peuvent être responsables de pathologies chez l'homme, notamment de toxi-infections alimentaires, et sont très fréquemment rencontrées.
Il existe de nombreux milieux destinés à la recherche de ces bactéries dans divers échantillons (cliniques, alimentaires, environnementaux). Toutefois, leur isolement et identification reste un travail fastidieux qui nécessite enrichissement(s), isolement, tests biochimiques et antigéniques. Les milieux commercialisés sont généralement sensibles ou spécifiques, mais rarement les deux. De plus, aucun d'entre eux ne s'est montré efficace pour le dénombrement des Salmonella, en particulier.
Le milieu sélectif idéal doit permettre à une cellule de bactérie de la souche à cultiver ou identifier de donner une colonie et doit inhiber les autres espèces bactériennes. De plus, si l'inhibition des autres bactéries est insuffisante, une réaction colorée dans le milieu peut aider à distinguer les colonies de la souche à cultiver ou identifier des autres colonies.
Pour évaluer l'intérêt d'un milieu sélectif, on peut évaluer le taux de recouvrement (« efficiency of plating »), défini comme la proportion entre le nombre de colonies sur le milieu testé et le nombre de colonies sur un milieu riche de référence (4). Un milieu utile selon l'invention permet à la fois un taux de recouvrement proche de 1 pour la souche à cultiver ou identifier, notamment les Salmonella ; et un taux de recouvrement proche de 0 pour les espèces différentes de la souche à cultiver ou identifier.
La Demanderesse a maintenant mis en évidence qu'un tel milieu peut être proposé, sur la basé d'un milieu inorganique minimum, par l'entremise d'une nouvelle source de carbone et d'énergie : le gentisate ou l'un de ses précurseurs, notamment le 3-hydroxybenzoate (3-HB). D'autres avantages de ces milieux notamment par rapport aux milieux, connus, et pour des utilisations particulières apparaîtront à la lecture de la description et des exemples qui suivent.
Les bactéries du genre Salmonella sont des bacilles à Gram négatif, appartenant à la famille des Enterobacteriaceae. Ce genre est phylogénétiquement proche de Escherichia et Citrobacter. Il comprend deux espèces, S. enterica, espèce habituelle (plus de 2200 sérotypes), et S. bongori, espèce rare. S. enterica est subdivisée en plusieurs sous- espèces : enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, et indica, elles-mêmes subdivisées en sérotypes. Les sérotypes cités ici réfèrent à Salmonella enterica subsp enterica.
Les Salmonella enterica subsp. enterica sont des parasites intestinaux des animaux à sang chaud et de l'Homme ; les autres sous- espèces contaminent préférentiellement les animaux à sang froid (reptiles, batraciens). Au sein de la sous-espèce enterica, on distingue des sérotypes strictement humains (Typhi), des sérotypes strictement animaux (Gallinarum) mais la plupart des sérotypes sont ubiquistes (Typhimurium, Enteritidis..".) et contaminent l'homme, les volailles, les œufs, les bovins... On retrouve également ces bactéries dans les eaux de surface et eaux usées. Les Salmonella sont responsables de plusieurs types de pathologies humaines dont les fièvres typhoïde et paratyphoïde (sérotypes Typhi et Paratyphi A1B1C) qui sont, en France, essentiellement des cas importés de zone d'endémie ; les salmonelloses mineures : gastroentérites, toxi-infections alimentaires sporadiques ou collectives (TIAC), Salmonella étant l'agent le plus fréquemment isolé dans les toxi-infections alimentaires ; ou encore les manifestations extra-digestives chez des sujets à risques comme les sujets immunodéprimés.
L'acquisition d'une salmonellose se fait par ingestion d'eau et d'aliments contaminés. Les aliments le plus souvent mis en cause sont les œufs et préparations à base d'œufs, les produits de charcuterie, les volailles, les produits laitiers et les viandes. Cette contamination peut être liée à des pratiques hygiéniques défectueuses : matières premières contaminées (portage intestinal par les animaux à sang chaud), environnement contaminant (équipement, personnel des restaurations collectives, des circuits de fabrication), erreur dans le processus de ' fabrication, délai important entre préparation et consommation ou rupture de la chaîne du froid, par exemple.
A titre indicatif, en 2003, 10472 souches de Salmonella d'origine humaine ont été rapportées et enregistrées au Centre National de référence des Salmonella.
La recherche des germes, et notamment de ces germes de Salmonella dans les aliments et l'environnement (eau) est donc un enjeu de santé publique, car Salmonella enterica est le principal agent de toxi- infection alimentaire collective (JIAC) en France.
A titre d'exemple, les Salmonella sont isolées de coprocultures (salmonelloses mineures et majeures), hémocultures ou autres liquides biologiques (fièvres typhoïdes, bactériémies, salmonelloses invasives), échantillons environnementaux et produits destinés à la consommation humaine ou animale.
Par ailleurs, la plupart des Salmonella sont prototrophes mais quelques sérotypes, adaptés à un hôte particulier (Typhi, Paratyphi A, Gallinarum) sont auxotrophes pour un ou plusieurs facteurs de croissance.
Dans le cas de prélèvements monomicrobiens (sang), des géloses ordinaires telles que Trypto-caséine-soja (TCS2), Drigalski suffisent à l'isolement des Salmonella. Les coprocultures et échantillons alimentaires et environnementaux étant polymicrobiens (flore commensale du tube digestif, bactéries de l'environnement), leur isolement spécifique requiert l'utilisation de milieux sélectifs contenant des inhibiteurs et des substrats capables respectivement d'inhiber la flore environnante et différencier les Salmonella des autres germes, tout particulièrement de Citrobacter, Escherichia coli et Proteus.
Usuellement, la recherche de Salmonella en mélange polymicrobien nécessite plusieurs étapes, à savoir pré-enrichissement en milieu non- sélectif (6 à 2Oh), réalisé dans de l'eau peptonnée ; enrichissement en milieu sélectif liquide (24h) ; bouillon Mϋller-Kauffmann au tétrathionate, ou ' bouillon au sélénite (additionné ou non de cystine ou novobiocine), ou encore bouillon Rappaport-Vassiliadis ; isolement sur milieux sélectifs géloses à partir des bouillons enrichis (24-48h) : Xylose-Lysine- Désoxycholate (XLD), Hektoen, par exemple, puis confirmation par identification biochimique et antigénique, ce qui nécessite généralement au moins 3 jours de manipulation.
Parmi les milieux géloses sélectifs comme pour Salmonella on peut citer les milieux Hektoen, Salmonella-Shigella (SS), xylose-lysine- désoxycholate (XLD), xyloserlysine-Tergitoj' 4 (XLT4), Novobiocine-vert brillant-glucose (NBG) ou Novobiocine-vert brillant-glycérol-lactose (NBGL) et Rambach. De plus, plusieurs milieux chromogéniques ont été développés plus récemment : SM-ID (SalMonella-ldentification), CSE (Chromogenic Salmonella esterase), ABC, CHROMagar, SCM (Salmonella Chromogenic Médium).
Certains de ces milieux exercent un effet inhibiteur sur la flore commensale. Les sels biliaires ou le désoxycholate de sodium affectent la croissance des germes à Gram positif. Le vert brillant (colorant antiseptique), la novobiocine et la cefsulodine (antibiotiques), et le Tergitol
4 (détergent), inhibent la flore Gram positif, et certaines bactéries Gram négatif. Ces produits, éventuellement associés, s'opposent à l'envahissement de la gélose par Proteus spp et sont usuellement utilisés à des doses de l'ordre de 0,33 à 12,5 mg (vert brillant), 1 à 2 mg (Tergitol 4),
5 mg (cefsulodine), 20 mg (novobiocine), 1 g (désoxycholate) et 5 à 9 mg (sels biliaires) par litre de milieu.
Par ailleurs, dans le cas des Salmonella, l'absence de production d'acide à partir de certains sucres comme le lactose, saccharose, glycérol, ou salicine, est mise à profit dans les milieux Hektoen, SS, XLD, XLT4, NBG, NBGL. Les Salmonella n'acidifiant pas le milieu, présentent une coloration distincte des autres entérobactéries capables de cultiver (Citrobacter, E.coli, Enterobacter, Shigella...). Dans ces mêmes milieux, la combinaison du thiosulfate de sodium et du citrate de fer ammoniacal donne une coloration noire aux colonies de Salmonella par production de sulfure d'hydrogène. La discrimination Sa//τ?one//a-flore associée est de ce fait bonne, sauf pour Proteus sp., qui produit également du H2S. La perception des Salmonella lactose ou saccharose + n'est pas correcte.
Ces milieux ne permettent toutefois pas un bon isolement de Salmonella Typhi et Paratyphi A, produisant peu ou pas de H2S. XLD est le moins inhibiteur et permet un taux de recouvrement important des Salmonella.
Le milieu Rambach, intéressant pour l'isolement et le dénombrement des Salmonella dans les crustacés, permet de mettre en évidence deux propriétés spécifiques du genre Salmonella : la production d'acide à partir du propylène-glycol et l'absence de β-galactosidase (révélée par un substrat chromogène, le X-β-Gal ou 5-bromo-4-chloro-3-β-indolyl-D- galactopyranoside). Ainsi, les colonies de Salmonella enterica non- typhiques apparaissent de couleur rosé fuchsia, permettant un repérage rapide vis-à-vis de la flore associée.
Cependant, les sérotypes Typhi et Paratyphi A donnent des colonies incolores difficilement détectables et certaines colonies de Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii peuvent être rouges, couleur proche ce qui peut induire des difficultés d'appréciation dans le repérage.
Les milieux chromogéniques, plus récents, permettent une meilleure discrimination entre Salmonella et la flore associée. Ils contiennent des substrats chromogènes qui mettent en évidence des activités enzymatiques spécifiques de Salmonella, y compris des sérotypes Typhi et Paratyphi A. Ainsi, SM-ID met en évidence la fermentation du glucuronate et l'absence de β-galactosidase, donnant des colonies de Salmonella rosés à rouges. CSE permet la détection de l'activité C8-estérase (par l'utilisation du SLPA- octanoate, substrat chromogène), donnant des colonies rouge-violacé. ABC détecte l'activité α-galactosidase de toutes les Salmonella (colonies bleues ; substrat X-α-Gal) et l'activité β-galactosidase des non-Salmonella (colonies noires ; substrat 3,4-cyclohexeno-esculétine ou CHE-GaI). CHROMagar donne des colonies de Salmonella mauves (mise en évidence de l'activité estérase), les autres entérobactéries apparaissant bleues ou incolores (activité β-galactosidase). Enfin, SCM détecte l'activité caprylate- stérase des Salmonella, donnant des colonies magenta, grâce au Magenta- cap ou 5-bromo-4-chloro-3-indolylcaprylate. Les colonies de non- Salmonella apparaissent bleues (activité β-galactosidase ; X-β-GAL).
Ces milieux peuvent être utilisés pour la recherche de certaines bactéries, notamment Salmonella, dans divers prélèvements cliniques mais aussi dans les denrées alimentaires, les produits pharmaceutiques, les échantillons environnementaux. Ils sont le plus souvent conseillés comme milieux d'isolement après une phase d'enrichissement, pour améliorer la sensibilité de la méthode.
Jusqu'ici, aucun milieu de ces milieux connus n'a toutefois pu être utilisé comme milieu sélectif de façon satisfaisante, et il persiste un besoin pour un tel milieu. En effet, comme indiqué ci dessus, avec les techniques actuellement existantes, l'isolement de Salmonella requiert l'utilisation de plusieurs milieux sélectifs contenant des inhibiteurs et des substrats capables respectivement d'inhiber la flore environnante et différencier Salmonella des autres germes, tout particulièrement Citrobacter, Escherichia et Proteus. Au contraire, les milieux selon l'invention peuvent remplir les deux buts que sont ('utilisation d'un seul milieu sélectif et de rechercher notamment Salmonella sans multiplier les étapes.
De façon plus précise, les milieux de l'invention mettent en œuvre du 3-HB, ses dérivés et/ou d'autres précurseurs du gentisate. Le 3-HB est un composé aromatique non azoté, cité en tant que substrat carboné dans des milieux de culture, par Veron (1) parmi 146 substrats étudiés, sans que ce 3-HB soit utilisé en présence d'inhibiteur, les solutions décrites comportant 100 g/l de substrat.
De plus, la publication de Moscoso-Vizcarra (2) décrit les voies métaboliques d'assimilation du 3-HB par les entérobactéries.
Enfin, le brevet américain US 5,824,552 décrit une méthode de culture de cellules animales et notamment un milieu stimulant la croissance des cellules, dont la source de carbone est le glucose. La méthode décrite dans ce document met en œuvre un milieu de culture contenant des composés benzoïques, notamment des dérivés de l'acide hydrobenzylique parmi lesquels le 3-HB à des concentrations inférieures à 50 μg/ml, les cellules mises en culture, exclusivement animales, ne consommant pas ce composé durant leur culture. En effet, le dérivé de l'acide hydrobenzylique n'est pas une source de carbone et d'énergie nécessaire au maintien en vie et à la multiplication des cellules animales ; dans les exemples, il est ainsi systématiquement ajouté une source de carbone, le glucose. On distingue usuellement les notions de source de carbone et de facteur de croissance. Une source de carbone et d'énergie, dans un milieu de culture, est catabolisée par les bactéries, ou autre organisme vivant, ce qui donne l'énergie nécessaire aux synthèses ainsi que les matériaux moléculaires. La masse des bactéries obtenue à la fin de la croissance est proportionnelle à la quantité de source de carbone disponible. Par ailleurs, les facteurs de croissance sont des substances qu'un organisme ne peut synthétiser, et les besoins quantitatifs sont très variables d'une souche à l'autre. On distingue, d'une part les acides aminés, incorporés tels quels dans les protéines - si l'acide aminé était source de carbone il serait catabolisé et ses carbones se retrouveraient n'importe où - et il en est de même pour les purines et les pyrimidines incorporées dans les acides nucléiques et d'autre part les vitamines qui entrent dans la constitution des coenzymes, et sont recyclables, et dont de très petites quantités sont nécessaires.
La présente invention concerne un milieu de culture bactérienne pour une souche à cultiver comportant, dans un milieu inorganique minimum, au moins un précurseur de gentisate et/ou du gentisate, en tant que source de carbone et d'énergie.
Selon l'invention, au contraire de l'enseignement du brevet US 5,824,552, le 3-HB, ses précurseurs ou dérivés et/ou d'autres précurseurs du gentisate ou leur(s) dérivé(s) constitue(nt) une source de carbone et d'énergie pour les bactéries à cultiver. Ainsi, selon l'invention, la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate et/ou leur(s) dérivé(s) est telle qu'il(s) constituent une source de carbone et d'énergie effective. A ce titre, et selon une variante de la présente invention, le 3-HB est utilisé à une concentration -finale minimale de 0,1 g/l, de préférence 0,5 g/l environ, et de façon encore préférée de 1 g/l environ, c'est-à-dire environ 1000 μg/ml dans le milieu. De telles concentrations sont donc au moins 2 fois, de préférence 10, et de façon encore préférée 20 fois supérieure à la concentration connue de l'art antérieur. Les milieux de la présente invention ne permettent d'ailleurs pas la culture de cellules animales.
Dans une forme particulière de réalisation de l'invention, le milieu comporte en outre au moins un inhibiteur de la croissance des bactéries différentes de la souche bactérienne à cultiver et assimilant ladite source de carbone.
Selon une forme de l'invention, et notamment lorsque le milieu est sous forme liquide et/ou pour certaines applications, il n'est pas nécessaire d'adjoindre un inhibiteur pour que le milieu selon l'invention soit enrichissant.
C'est pourquoi l'invention1 concerne aussi, dans une forme de réalisation, des milieux de culture sous forme liquide et sans inhibiteur.
Elle concerne aussi des milieux de culture sous forme semi-solide ou gélifiée et dans des conditions inhibitrices, c'est-à-dire que l'inhibition peut être provoquée aussi bien par la présence d'un inhibiteur de croissance des bactéries différentes de la souche à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie que par les conditions de salinité, les conditions d'aérobiose, les conditions de pH et/ou les conditions de température.
L'invention concerne également un procédé d'enrichissement d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'invention.
Elle concerne aussi un procédé d'isolement d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'invention.
Elle concerne aussi un procédé de culture d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'invention mis en œuvre dans des conditions inhibitrices. Ces conditions inhibitrices peuvent être choisies parmi la présence d'un inhibiteur de croissance des bactéries différentes de la souche à cultiver et assimilant ladite source' de carbone et d'énergie, les conditions de salinité, les conditions d'aérobiose, le contrôle du pH et/ou le contrôle de la température.
Enfin, l'invention concerne l'association du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, en tant que source de carbone et d'énergie, avec au moins un inhibiteur, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, l'inhibiteur agissant sur la croissance des bactéries différentes de la souche bactérienne à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie.
Elle concerne aussi l'utilisation du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, en tant que source de carbone et d'énergie, dans des conditions inhibitrices, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, lesdites conditions agissant sur la croissance des bactéries qui sont différentes de la souche bactérienne à cultiver et qui assimilent ladite source de carbone et d'énergie.
Comme cela apparaît dans les exemples, de façon plus simple que par les procédés mis en œuvre avec les milieux connus, les milieux selon l'invention permettent la culture et aussi l'isolement des souches bactériennes, et notamment des souches de Salmonella, y compris des sérotypes auxotrophe dont Typhi, et Paratyphi, etc. La sélectivité de ces milieux est comparable ou améliorée par rapport à celle des milieux connus. Les milieux de l'invention peuvent permettre un taux de recouvrement des Salmonella souvent supérieur à celui des milieux commercialisés, et cette supériorité est accentuée lorsque les bactéries sont stressées. Les milieux de l'invention présentent en outre l'avantage de nécessiter des quantités moindres d'inhibiteur(s) par comparaison avec les milieux usuels. De plus, ils permettent, spécifiquement la détection de souches de Salmonella soumises à un stress.
En ce qui concerne la détection de bactéries stressées, le taux de recouvrement de Salmonella soumises à un stress s'est avéré, avec le milieu de l'invention, au moins équivalent à. la gélose TCS. Les milieux de l'invention présentent de ce fait un grand intérêt dans la recherche et le dénombrement des Salmonella ayant subi un stress. En effet, les bactéries sont soumises à divers stress dans leur environnement et dans les matières qu'elles contaminent : variations de température (congélation, chauffage,- notamment avec les produits alimentaires), manque de nutriments, taux d'humidité, stress oxydation, stress osmotique, par exemple, et, comme pour de nombreuses bactéries à Gram négatif, ces conditions défavorables peuvent induire le passage des Salmonella notamment à l'état de bactéries viables non cultivables qui les rend indétectables sur des milieux de culture standards, sauf à certaines conditions favorables qui permettent aux bactéries d'être revivifiées. Les bactéries viables non cultivables ne sont pas détectables, mais pourraient conserver et recouvrer leur pouvoir infectieux dans des conditions favorables telles que la lumière intestinale.
La capacité du milieu selon' l'invention à revivifier certaines bactéries, dont les Salmonella, viables non cultivables présente surtout un intérêt pour la recherche desdites bactéries dans les aliments et l'eau, en s'affranchissant de la phase de pré-enrichissement préconisée par la norme NF EN ISO 6579.
Comme souche bactérienne à cultiver on peut citer toute souche susceptible d'utiliser la source de carbone et d'énergie selon l'invention, c'est-à-dire toute souche assimilant le 3-HB et/ou le gentisate et/ou leurs précurseurs et dérivés. De telles souches sont notamment Citrobacter spp. dont diversus et freundii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca, Salmonella sp. dont Salmonella enterica subsp indica, Salmonella enterica subsp arizonae, Salmonella bongori, mais aussi, Escherichia coli, Salmonella enterica subsp diarizonae, Salmonella enterica subsp enterica, Salmonella enterica subsp houtenae, Salmonella enterica subsp salamae, Serratia marcescens ou Serratia fonticola. De plus, les entérobactéries et Pseudomonas spp et Burkholderia cepacia .peuvent être citées. Ainsi on cite particulièrement selon l'invention, à titre de bactérie à cultiver, isoler ou enrichir, les bactéries choisies parmi Salmonella sp. dont Salmonella enterica subsp indica, Salmonella enterica subsp arizonae, Salmonella bongori, Salmonella enterica subsp diarizonae, Salmonella enterica subsp enterica, Salmonella enterica subsp houtenae, Salmonella enterica subsp salamae, les Eschθrichia coli et autres entérobactéries
Selon l'invention, les souches Salmonella sont plus particulièrement visées. Il s'agit selon l'invention de façon encore préférée de tous les sérotypes ou sérovars de Salmonella enterica et notamment les sérotypes Typhimurium, Enteriditis, Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B, Virchow, Hadar, Agona, par exemple, à l'exception du sérotype Gallinarum.
Par milieu inorganique minimum selon l'invention, on entend un milieu ne contenant pas d'aliments organiques carbonés assimilables. En l'absence de ces aliments, aucune bactérie ne peut cultiver, et si une source de carbone et d'énergie unique y est rajoutée, seules les bactéries capables de l'assimiler peuvent cultiver.
Par exemple, le milieu inorganique M70, utilisé par Véron (1) pour étudier l'assimilation de diverses sources d'énergie, est un tel milieu minimum. Il est constitué de trois solutions inorganiques : une solution d'oligo-éléments, une solution Phosphore-Calcium-Magnésium et la base azotée et sera décrit ci-après.
Toutefois, tout autre milieu inorganique minimum, ne contenant sensiblement pas d'aliment organique carboné assimilable par la souche à cultiver, est utilisable selon l'invention.
Comme source de carbone ou d'énergie assimilable par la souche bactérienne à isoler, identifier ou dénombrer, on utilise selon l'invention principalement le 3-hydroxybenzoate, ses dérivés, ou tous autres précurseurs ou dérivés du gentisate ou ses dérivés tels qu'ils peuvent être mis en œuvre dans la voie de transformation suivante :
3-HB ou autre précurseur du gentisate -» gentisate -» méthylpyruvate →- -» furmarate et pyruvate de gentisate.
Le gentisate (2,5-dihydroxybenzoate), composé issu du métabolisme du 3-HB, est en effet lui aussi assimilable par certaines souches bactériennes telles que les Salmonella. Ainsi, on peut aussi utiliser le gentisate à titre de source de carbone et d'énergie, ou en mélange avec un précurseur "de gentisate. Et, à titre de précurseur du gentisate, on peut citer le 3-HB ainsi que ses dérivés.
Parmi les dérivés, on peut citer toute forme chimique ou substance susceptible de se trouver sous forme de gentisate, de 3-HB, au pH final du milieu, capable de se transformer spontanément ou par l'entremise d'un catalyseur ou d'une enzyme ou de conditions physicochimiques ou par transformation bactérienne, en gentisate ou en 3-HB. On peut envisager aussi tout produit naturel ou synthétique riche en 3-HB, par exemple un polymère synthétique se dégradant en 3-HB ou en gentisate.
Selon l'invention, les concentrations en gentisate et/ou en 3-HB sont supérieures à 0,1 g/l, de préférence environ 0,5 g/l. Par ailleurs, elles sont de préférence inférieures à 5 g/l, de préférence environ 2 g/l. Ainsi, de préférence de l'ordre de 0,1 à 5 g/l de 3-HB, de façon préférée, elles sont de l'ordre de 0,5 g/l à 2 g/l, de façon encore préférée de l'ordre de 0,8 à 1 ,2 g/ι.
En outre, les milieux de l'invention peuvent comporter un ou plusieurs inhibiteurs. Ils permettent d'améliorer la sélectivité du milieu. Toutefois, pour l'enrichissement, par exemple, un milieu liquide (sans gélose) selon l'invention peut ne pas comporter d'inhibiteur.
A titre d'inhibiteur, on peut citer les sels biliaires, le désoxycholate de sodium, les détergents, les antibiotiques, certains sels de thallium, dont le sulfate thalleux, ainsi que les colorants, et leurs mélanges. Comme détergent, on peut citer par exemple le Tergitol 4 et le Tween 20. Comme antibiotique, on peut citer la novobiocine, la cefsulodine et leurs mélanges. Comme exemple de colorants, on peut citer les colorants du type triphénylméthane, notamment le diaminotriphénylméthane, et aussi en particulier le vert brillant et le vert malachite, le violet de gentiane, la fuchsine acide, ainsi que leurs mélanges.
Toutefois, d'autres inhibiteurs peuvent convenir, qui inhibent la croissance des souches bactériennes non recherchées, notamment celles qui assimilent la source de carbone et d'énergie de l'invention. L'inhibiteur peut ainsi être choisi parmi les inhibiteurs de la flore Gram positif et/ou des bactéries Gram négatif distinctes de la souche bactérienne à cultiver.
Un avantage particulier des milieux selon l'invention réside dans le fait que, compte tenu de la nature du milieu de base inorganique minimum, les doses d'inhibiteurs utilisées peuvent être très réduites dans certains cas par rapport aux doses utiles dans les milieux connus, par exemple dans le milieu de Kristensen, le milieu au vert brillant (usuellement12,5mg) et le miliu novobiocine-vert brillant-glycérol-lactose (usuellement 7 mg/l).
Parmi les inhibiteurs préférés, on peut citer le vert brillant et le sulfate thalleux et leurs associations. Le sulfate de thallium a pour objet d'inhiber les bactéries à Gram négatifs aérobies strictes, comme Pseudomonas et les Burkholderia et le vert brillant des entérobactéries comme E. coll. Les doses préférées sont par exemple d'environ. 1 à 3 mg/l de vert brillant, de préférence environ 1 ,5 à 2,5 mg/l, et de 0,02 à 0,002 g/l de sulfate thalleux, de préférence 0,008 à 0,015 g/l, de préférence environ 0,01 g/l.
De plus, selon un aspect de l'invention, on peut ajouter au milieu minimal au moins un facteur de croissance. Les facteurs de croissance accélèrent la revivification et sont utiles notamment pour la croissance des sérotypes auxotrophes. C'est ainsi le cas notamment, pour certaines souches bactériennes auxotrophes, comme le sont Salmonella Entendis 64K, ou Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A ou encore le sérotype Gallinarum. Cependant, si l'on souhaite n'isoler que les souches transmises par les aliments, il n'est pas indispensable d'utiliser un tel facteur de croissance. On peut par exemple réaliser un simple préenrichissement, sans utiliser de facteur de croissance.
La concentration optimale d'un facteur de croissance ou de l'association de plusieurs facteurs doit être suffisamment faible pour que la croissance bactérienne soit insignifiante en l'absence d'une autre source de carbone et d'énergie utilisable, comme le 3-HB ou tout autre précurseur de gentisate. Ainsi, la concentration est minimale pour éviter qu'il constitue une source de carbone, ce qui diminuerait la sélectivité. Elle est selon l'invention choisie pour être inférieure à la concentration permettant la croissance sans autre source de carbone.
A titre de facteur de croissance, on peut utiliser par exemple un facteur de croissance choisi parmi les acides aminés, les vitamines, les purines, les hydrolysats de protéines et les extraits de levure, et leurs mélanges. On peut utiliser tout produit capable de fournir au milieu les aminoacides nécessaires. Par exemple, on peut utiliser un hydrolysat de caséine, usuellement appelé casaminoacide, mais d'autres hydrolysats de protéine ou mélanges d'aminoacides sont également utilisables, éventuellement supplémentés de cystéine, particulièrement de L-cystéine.
Par exemple, on peut utiliser de 0 à 200 mg/l de milieu de casaminoacide, de préférence jusqu'à environ 100 mg/l, de façon encore préférée environ 50mg/l, en présence de 0 à 200 mg/l de L-cystéine HCI monohydrate, de préférence jusqu'à environ 100 mg/l, de façon encore préférée environ 25 à 52 mg/l, soit 18 à 36mg/l de milieu de Cystéine pure.
De plus, les milieux de l'invention peuvent comporter des substrats chromogènes, qui permettent de mettre en évidence des activités enzymatiques spécifiques des souches cultivées ou isolées. L'ajout d'un tel substrat qui met en évidence une activité spécifique de la souche à étudier permet d'améliorer la discrimination Salmonella/non-Salmonella.
A titre de substrat chromogène, on peut citer les substrats du type du bromure de l'acide 4-[2-(4-octonoyloxy-3,5-diméthoxyphényl)-vinyl]- quinolinium-1-propan-3-yl-carboxylique (SLPA-octanoate), le 5-bromo-4- chloro-3-indoxyl-caprylate (X-caprylate), le 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl- alpha-D-galactopyranoside (X-alpha-D-gal) ou, pour colorer des espèces non-Salmonella , le δ-bromo^-chloro-S-indoxyl-beta-D-galactopyranoside (X-beta-D-gal ou X-gal), par exemple. Le radical 5-bromo-4-ch!oro-3- indoxyl (X, couleur bleue après hydrolyse) peut être remplacé par 3-indoxyl (Y, autre couleur bleue après hydrolyse) ou 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl (Magenta, - couleur magenta après hydrolyse) ou 6-chloro-3-indoxyl (Salmon, couleur rosé après hydrolyse) ou 5-iodo-3-indoxyl (lodo, couleur pourpre après hydrolyse) ou N-méthylindoxyl (Green, couleur verte après hydrolyse) ou 4-méthylumbelliféryl (4-MU1 fluorescence bleue après hydrolyse), indoxyl étant ici synonyme d'indolyl. Ainsi, selon l'invention, on peut utiliser notamment un substrat chromogène choisi parmi les substrats X-caprylate, X-alpha-D-galactopyranoside, X-beta-D- galactopyranoside ou X-galactopyranoside, où X- représente le groupe 5-bromo-4-chloro-3- indoxyl-, X- pouvant être remplacé par 3-indoxyl-, 5-bromo-6-chloro-3- indoxyl-, 6-chloro-3-indoxyl-, 5-iodo-3-indoxyl-, N-méthylindoxyl- ou 4- méthylumbelliféryl-, et leurs mélanges.
Les substrats peuvent être ajoutés à la gélose fondue ou avant stérilisation à l'autoclave. Leur concentration dépend du milieu et de l'intensité de la coloration souhaitée, des produits et des utilisations et des modes de détection des couleurs générées. Elle peut être choisie de l'ordre de 100mg/l environ. A titre d'exemple, pour les chromogènes comportant le groupe 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl- la concentration peut être de l'ordre de 0,05 à 2 g/l de milieu, de préférence environ 0,1 g/l.
Pour les substrats du type du 5-bromo-4-chloro-3-indolylcaprylate et du 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside, à titre d'exemple, la concentration peut être choisie entre environ 0,1 et environ 0,4 g/l.
Bien entendu, les concentrations dans les divers constituants cités ci-dessus dépendent des constituants spécifiques, des conditions d'utilisation et de mise en œuvre, et l'homme de l'art adaptera.
Les milieux de l'invention sont préparés de façon usuelle par dissolution et/ou addition à un milieu de base défini ci-dessus des additifs ci-dessus. La façon d'incorporer les additifs, 'au milieu ou base n'est pas restrictive. Les additifs solubles dans l'eau sont ajoutés en solution aqueuse stérile, mais les additifs peuvent aussi être ajoutés en solution dans un solvant aqueux adéquat. A titre d'exemple, on peut citer un milieu comprenant, dans le milieu de Véron, ou tout autre milieu synthétique minimum, nécessitant une source de carbone et d'énergie et outre du 3 -HB à raison de 0,2 à 2g/l, de préférence 0,5 à 1 ,5 g/l, de façon préférée environ 1 g/l, des casaminoacides à raison de 0 à 100mg/l, de préférence 50 à 100 mg/l, de façon préférée environ 50 mg/l, de la L-cystéine sous forme chlorhydrate monohydrate à raison de 0 à 100 mg/l, de préférence 26 à 52 mg/l, de façon préférée environ 26mg/l, du vert brillant AcBg-14 à raison de 1 à 2,5 mg/l, de préférence environ 1 ,5 mg/l, et du sulfate de thalleux à raison de 0 à 0,025g/I, de préférence 0,01 à 0,025 g/l, de façon préférée environ 0,01 g/l.
Les milieux de culture peuvent se présenter selon l'invention sous forme liquide ou encore sous une forme solide, dans le cas où un véhicule gélifié est utilisé, en fonction de leur utilisation ultérieure. Ainsi, pour l'enrichissement de culture, le milieu est usuellement sous forme liquide, alors que pour l'isolement et l'identification, celui-ci se présente usuellement sous forme solide ou semi-solide, usuellement sur gélose. Toutefois, tout autre véhicule gélifié usuel est utilisable selon l'invention.
Les milieux selon l'invention peuvent être utilisés dans les mêmes conditions de pH et température que les milieux usuels.
Ces milieux de culture sont notamment utile pour l'isolement spécifique des Salmonella et d'autres bactéries Gram négatif, et peuvent être utilisés à la recherche de germes dans de nombreux prélèvements. Par le choix des inhibiteurs appropriés, on peut envisager l'inhibition des bactéries Gram négatif aérobies strictes et des entérobactéries comme E. coli. Sans inhibiteurs de cette bactérie, ils peuvent en outre être utiles à l'enrichissement de certaines souches bactériennes, notamment E. coli, en plus de celui de Salmonella.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples ci dessous. EXEMPLES
I - Matériel et Méthodes
SOUCHES ETUDIEES
55 souches bactériennes ont été utilisées : 34 Salmonella enterica subsp. enterica, 13 entérobactéries non-Salmonella, et 8 non- entérobactéries, toutefois voisines par leur habitat et certaines caractéristiques culturales et biochimiques. Elles proviennent des collections de l'Unité de Biodiversité des Bactéries Pathogènes Emergentes de l'Institut Pasteur (BBPE), du Centre National de Référence des Salmonella (CNR), ou du Centre Collaborateur OMS pour les Salmonella (CCOMS). Il s'agit, pour certaines, de souches types ou de souches historiques de Kauffmann.
Les souches sont conservées en gélose de conservation décrite plus loin. Après réensemencement sur gélose Trypto-caséine-soja" (TCS) ou Drigalski, l'identité et la pureté des souches a été confirmée par les tests adéquats. Pour l'étude, une culture-mère de chacune de ces souches est obtenue sur gélose TCS en pente, conservée à température ambiante, et des repiquages réguliers sont réalisés.
De plus, pour une partie des souches, leur capacité à utiliser le 3- hydroxybenzoate (3-HB) comme substrat carboné a été étudiée en inoculant des galeries d'identification Biotype-100 (BioMérieux).
La liste des souches est détaillée dans les tableaux I, II et III ci- dessous où figurent également leur provenance, leur capacité à utiliser le 3-HB, et les essais pour lesquels elles ont été utilisées. Une-gélose de conservation de composition suivante a été utilisée :
Peptone de caséine de viande E2 10 g
Chlorure de sodium 3 g
Extrait de viande 4 g
Bacto agar 12 g NaOH pH = 7,2
Eau distillée Qsp 1 I
Tableau I : Souches de Salmonella entθrica subsp. enterica j≡ssÂis2
Utilisation
Sérotype Souche Source Mise au j du 3-HB1 Evaluapoint du tion milieu
Enteritidis 64K (ATCC 13076) CCOMS + + -
297/67 CCOMS + + +
1281/04 CNR + - +
1299/04 CNR + _ +
1384/04 CNR + - +
1397/04 CNR + - +
1538/04 CNR + - +
Typhimurium LT2 (ATCC 43971 ) BBPE + + +
58.58T (ATCC 13311) CCOMS + + +
1327/04 CNR + - +
1333/04 CNR + - +
1366/04 CNR + - +
1400/04 CNR + - +
1526/04 CNR + +
Virchow 41 K CCOMS + - + 1396/04 CNR + +
Hadar 473K CCOMS + - + 1368/04 CNR + +
Typhi Ty2 (ATCC 19430) CNR + + + 57K CCOMS + + 2963/03 CNR + +
Newport 5OK CCOMS + + 1363/04 CNR + - + 1534/04 CNR + +
Infantis 158K CCOMS , + - +
Brandenburg 24K CCOMS 1 + - +
Derby 2OK CCOMS + - +
Agona 1137/72 CCOMS + - +
Heidelberg 16K CCOMS + - +
Napoli 173K CCOMS + - +
Dublin 65K CCOMS + - +
Indiana 573K CCOMS + - + Paratyphi B ' 5K Java CCOMS
Gallinarum 9727/03 CNR
Symboles +, utilisation du 3-HB ; -, non-utilisation. 2 Symboles +, utilisation de la souche au cours de l'essai ; -, souche non testée.
Tableau II : Souches d'Entérobactéries
ESSAIS'
Utilisation Mise au
Souche Source du 3-HB1 point du Evaluation milieu
Escherichia coli 54.8T (ATCC
BBPE +
11775)
E. coli 0103 HI8 BBPE +
E. coli O103 PMK1 BBPE + +
E. coli 0103 PM K3 BBPE + +
E. coli O103 PMK4 BBPE + +
Citrobacter freundii 57.32T BBPE + + Citrobacter koseri (diversus) BBPE + + 82.94T
Enterobacter aerogenes
BBPE +
60.86T
Enterobacter cloacae 60.85T BBPE +
Klebsiella pneumoniae
BBPE
SB107
Klebsiella oxytoca SB136 BBPE
Proteus mirabilis PR14 BBPE
Serratia marcescens 103235 BBPE
1 Symboles : +, utilisation du 3-HB ; -, non utilisation.
2 Symboles : +, utilisation de la souche au cours de l'essai ; -, souche non testée.
Tableau III : Souches des non-Entérobactéries
ESSAIS^
Souche Utilisation Mise au -_ .
Source du 3-HB1 point du Ev t alua" milieu tlon
Staphylococcus aureus 65.8T BBPE ND* +
Enterococcus faecalis BBPE
ND + 103015T
Bacillus cereus 66.24T BBPE ND +
Pseudomonas aeruginosa BBPE - + LMG 1242 T Pseudomonas aeruginosa BBPE + 9310577
Burkholderia cepacia LMG BBPE + + 6889 Burkholderia cepacia 103277 BBPE + + +
1 Symboles : +, utilisation du 3-HB ; -, non utilisation.
2 Symboles : +, utilisation de la souche au cours de l'essai ; -, souche non testée.
3 ND : non déterminée
A) MILIEU DE BASE : COMPOSITION, PREPARATION
Le milieu inorganique M70 de Véron (1), a été utilisé comme base, le
3-HB y étant ajouté comme unique source de carbone et d'énergie, et de l'extrait de levure comme facteur de croissance, pour les souches auxotrophes.
Ce milieu d'étude a été préparé à partir de trois solutions distinctes suivantes : solution d'oligo-éléments (OE) :
- H3PO4 1 ,9600 g
FeSO4, 7H2O 0,0556 g
ZnSO4, 7H2O 0,0287 g
MnSO4, 4H2O 0,0223 g
CuSO4, 5H2O 0,0025 g
Co(NOs)2, 6H2O 0,0030 g
H3BO3 0,0062 g Eau distillée stérile Qsp 1000 ml
La solution obtenue par dissolution a été stérilisée par filtration stérilisante (filtre de 0,22μ). Elle a été conservée au réfrigérateur, à +4°C. Pour des raisons pratiques, il est également possible de préparer cette solution dix fois plus concentrée des mêmes composants. Cette solution OE rentre dans la composition de la solution A décrite ci-après.
Solution A :
CaCI2, 2H2O 0,0147 g
MgSO4, 7H2O 0,123 g
KH2PO4 0,680 g
K2HPO4 2,610 g
Solution d'oligo-éléments OE 10 ml
(ou 1 ml d'une solution dix fois concentrée)
Acide 3-hydroxybenzoïque (Fluka)* 1 ,0 g
Extrait de levure (Difco)* 0,1 g
Eau distillée stérile Qsp 500 ml
*Non présent dans le milieu M70 original.
Après dissolution complète des différents composés, le pH de la solution A a été ajusté à 7,2. A ce pH, l'acide 3-hydroxybenzoïque est neutralisé et se trouve sous forme de 3-hydroxybenzoate. La solution a alors été stérilisée par filtration stérilisante sur un filtre de 0,22 μ ou en l'autoclavant 20 minutes à 11O0C. Un aspect trouble de la solution à Ia sortie de l'autoclave ne modifie pas la qualité du milieu.
solution B :
NaCI 7 g
(NH4)2SO4 . 1 g
Agar (Difco) 15 g
Eau distillée Qsp 500 ml
Le pH de cette solution est ajusté à 7,2. Elle a ensuite été chauffée sur une plaque chauffante jusqu'à dissolution complète de l'agar. Elle a été autoclavée 20 minutes à 1100C. '>
Après stérilisation, les solutions A et B ont été maintenues à une température de 50-600C, en évitant une prise en masse de la solution de gélose B. Elles ont ensuite été mélangées aseptiquement, donnant ainsi un litre de milieu. Après homogénéisation, celui-ci a été coulé en boîtes de Pétri (20 ml dans des boîtes rondes de 9 mm de diamètre, 70 ou 80 ml dans des boîtes carrées 12*12 cm). Les boîtes ont été conservées à +40C - jusqu'à utilisation.
Pour obtenir la forme liquide, on mélange :
NaCI 7 g
(NH4)2SO4 1 g
CaCI2, 2H2O 0,0147 g
MgSO4, 7H2O 0,123 g
KH2PO4 0,680 g
K2HPO4 2,610 g
Solution OE 10 ml (ou 1 ml de concentré x 10)
3-hydroxybenzoate 1 g casaminoacides 0,05 g
L-cystéine HCI H2O 0,026 g
Vert brillant AcBg-14 0,0015 g Sulfate thalleux 0,01 g
Eau distillée qsp 1 litre pH 7,2
B) MILIEU SELECTIF DE SALMONELLA SELON L'INVENTION Les produits incorporés dans le milieu de culture ci-dessus sont ajoutés à la solution A sous un faible volume d'une solution concentrée stérile de ces produits.
1.1 Inhibiteurs
1.1.1 Produits
L'activité inhibitrice de différents produits sur des bactéries listées plus haut, a été testée dans le but de réduire la croissance des non- Salmonella. L'effet inhibiteur a été testé pour des concentrations croissantes de produit. Il s'agit des produits suivants utilisés dans les gammes de concentration respectives dans le milieu final.
Vert brillant AcBg-14 certifié commercialisé par Sigma (B-4014) :
0,25 à 5 mg/l (et 5 à 25 mg/l)
Sulfate thalleux comm. par Fluka (88290) : 0,05 à 1 g/l
1.1.2 Méthode d'étude
Le pouvoir inhibiteur des différents produits a été déterminé par une technique de gradient : le milieu de culture contenant l'inhibiteur est coulé en boîte de Pétri carrée (12*12 cm) de façon à créer un gradient de concentration au sein de la gélose.
1.1.2.1 Préparation des milieux
Les solutions A et B sont préparées comme décrit plus haut. Par ailleurs, des solutions stock des différents inhibiteurs ont été préparées en eau distillée et stérilisées par filtration sur filtre unitaire de 0,22μ (ex : 25 mg de vert brillant dans 10 ml d'eau) . A la solution A, a été ajouté l'inhibiteur sous un volume minimum. On a préparé ainsi une solution A à la plus faible concentration d'inhibiteur testée (ex : 0,25 mg/l de vert brillant soit 0,1 ml de la solution stock pour 1 litre de milieu) et une autre à la plus forte concentration (ex : 5 mg/l de vert brillant soit 2 ml pour 1 litre de milieu).
Pour reproduire le gradient, on a coulé en pente une première couche « concentrée » de gélose (40 ml). Après séchage, une deuxième couche « diluée » (40ml) a été coulée par-dessus. La gélose obtenue a été mise à sécher sous hotte pendant 30 minutes environ et ensemencée dans l'heure.
1.1.2.2 Méthode d'inoculation
A partir d'une culture de 24h sur gélose TCS en pente, une suspension bactérienne de chaque souche testée a été préparée dans 5 ml d'eau distillée stérile. Cette suspension a été calibrée à 0.5 MacFarland, à l'aide d'un densitomètre.
L'ensemencement a été réalisé en strie à l'aide d'une cese de 1 μl, du côté le plus concentré vers le plus dilué. Les boîtes ont alors été mises à - incuber à 370C pendant 48h à 4 jours.
En parallèle, deux témoins ont été ensemencés : un TCS, témoin de culture, et un milieu M70 dépourvu d'inhibiteur, pour différencier l'effet de l'inhibiteur de celui du milieu minimum. L'ensemencement et l'incubation ont été réalisés dans les mêmes conditions.
La lecture des résultats a été faite à 18, 24, 48h et 4 jours. On a noté : la densité de culture (0, absence, à +++, très bonne) et longueur de la strie à partir du bord dilué, de laquelle on a déduit la concentration inhibitrice pour chaque souche testée, par approximation.
Les résultats sont donnés ci-dessous (II) (1.1.)- 1.2 Facteurs de croissance
1.2.1 Produits
Trois facteurs de croissance ont été testés, en complément de l'extrait de levure, aux concentrations suivantes respectives :
L-cystéine (sous forme de chlorhydrate monohydrate ; Prolabo) : 18 et 36 mg/l de cystéine pure (soit 26 et 52 mg/l de cystéine, HCI, H2O) Casamino-acides (Difco) : 25, 50, 100, 200 et 300 mg/l (hydrolysat de caséine).
Ont été étudiés l'effet de la L-cystéine seule, et celui des casamino- acides seuls, ou associés à la cystéine.
1.2.2 Méthode d'étude
1.2.2.1 Préparation des milieux
Les solutions A et B ont été préparées et stérilisées comme décrit ci- dessus.
Des solutions stocks concentrées des deux acides aminés ont été préparées et stérilisées par filtration sur filtre unitaire de 0,22 μ. Elles ont été conservées à +4°C et à l'abri de la lumière. Un faible volume de ces solutions a été ajouté à la solution A (de façon à obtenir la quantité finale désirée) puis A est mélangée à B.
Les casamino-acides ont été directement incorporés à la quantité voulue dans la solution A, avant stérilisation.
Pour chaque facteur de croissance testé, 70 ml des milieux ainsi constitués (35 ml de A supplémenté + 35 ml de B) sont coulés dans des boîtes de Pétri carrées 12*12 cm, puis séchés sous hotte. Ces boîtes ont été conservées à +4°C jusqu'à'utilisation.
De plus, des milieux M70 supplémentés en facteurs de croissance (aux quantités testées) mais dépourvus de 3-HB ont été préparés. Par comparaison de ces cultures avec celles des milieux contenant de 3-HB, on a déterminé les concentrations de facteur(s) de croissance pour lesquelles la croissance reste insignifiante en l'absence de source carbonée.
1.2.2.2 Méthode d'inoculation
A partir d'une culture de 24h sur gélose TCS en pente, une suspension bactérienne de chaque souche testée a été préparée dans 5 ml d'eau distillée stérile. Cette suspension a été calibrée à 0.5 MacFarland, à l'aide d'un densitomètre.
Chaque suspension a été ensemencée en cadran à l'oese de 1 μl. Une boîte subdivisée en 6 cadrans permet l'étude de 6 souches par boîte. En parallèle, des témoins ont été inoculés : un TCS (témoin de culture), un témoin M70/3-HB sans facteur de croissance.
Les boîtes ont été mises à incuber à 370C pendant 48h voire 4 jours. La lecture a été réalisée à 24, 48h voire 4 jours, en notant la densité de culture (0, absence, à +++, très bonne), par comparaison aux témoins.
Les résultats sont donnés ci-dessous (II) (1.2.).
1.3 Concentrations d'inhibiteurs utiles
Pour des taux définis de facteurs de croissance, on a déterminé les concentrations en inhibiteur utilisables par l'évaluation du taux de recouvrement ou « efficiency of plating » (eop) du milieu aux concentrations suivantes : vert brillant : 1 - 1 ,5 - 2 - 2,5 mg/l ; sulfate thalleux : 0,01 et 0,025 g/l ; les deux associés. Il s'agit d'une méthode de dénombrement en surface.
1.3.1 Préparation des milieux
Les milieux ont été préparés comme décrits ci-dessus, supplémentés en facteurs de croissance et eri inhibiteurs. Ils ont été coulés en boîte de Pétri rondes de 9 cm (20 ml par boîte). Des témoins dépourvus d'inhibiteurs ont également été préparés. Les boîtes ont été conservées à +40C jusqu'à utilisation, et séchées sous hotte. 1.3.2 Méthode d'inoculation
A partir d'une culture de 24h sur gélose TCS en pente, un bouillon TCS a été ensemencé à l'aide d'une cese et mis à incuber 18h à 30 ou 37°C. Ce bouillon a été alors dilué de dix en dix dans 9 ml d'eau distillée stérile jusqu'à la dilution 10"7. Pour obtenir la dilution 10"1, on dilue 1 ml au bouillon initial dans 9 ml d'eau distillée ; pour obtenir la dilution 10'2, 1 ml de la dilution 10"1 est dilué dans 9 ml d'eau distillée, etc. Cette dilution dans l'eau est suffisante pour éviter l'apport de nutriments du bouillon initial lors de l'inoculation du milieu minimum.
Les dilutions 10"4 à 10"6 ou 10"5 à 10'7. Pour obtenir la dilution 10"1, on dilue 1 ml du bouillon initial dans 9 ml d'eau distillée ; pour obtenir la dilution 10'2, 1 ml de Ia dilution 10"1 selon les souches, ont été ensemencées, à raison de 100μl, sur les différents milieux et les témoins TCS et M70/3-HB sans inhibiteurs. Ces 100 μl ont été étalés au râteau stérile sur toute la surface de Ia boîte, jusqu'à absorption complète, pour un ensemencement homogène. L'opération a été effectuée en duplicat.
Les boîtes ont été mises à incuber 48h à 37°C. Le dénombrement des colonies a été fait après 24h et 48h. Pour chaque duplicat dont le ' nombre de colonies était compris entre 15 et 300, la moyenne des colonies a été calculée et comparée à la moyenne obtenue sur TCS. L' « efficiency of plating » (eop) a été déterminée en calculant le rapport du nombre des colonies dénombrées sur le milieu testé sur Ie nombre des colonies dénombrées sur TCS. Par ailleurs, ont été relevées la vitesse de culture et la taille des colonies.
Les résultats sont donnés ci-dessous (II) (1.3.). 1.4 Milieu sélectif de l'invention et comparaison avec d'autres milieux
1.4.1 Milieu M70 au 3-hydroxybenzoate (M70/3-HB) selon l'invention
II s'agit du milieu de base M70/3-HB ci-dessous auquel ont été ajoutés le ou les inhibiteurs, le ou les facteurs de croissance, aux concentrations suivantes. Ce milieu a été préparé en boîtes de Pétri rondes (9 cm de diamètre soit 20 ml de milieu) et conservé à +4°C jusqu'à utilisation.
Le milieu M70/3-HB optimisé comprend, en plus du milieu de base décrit au paragraphe I A, des casamino-acides (0,050 g/1), de la L-cystéine (sous forme de chlorhydrate monohydrate ; 26 mg/l), du vert brillant AcBg- 14 (1,5 mg/l), et du sulfate thalleux (0,01 g/l).
Les casamino-acides (50 mg de poudre) et la L-cystéine (5 ml d'une solution stock à 5,2 mg/ml de L-Cys, HCI, H2O) sont ajoutés à 500 ml de solution A non stérile (qsp 1 litre de milieu). Le vert brillant (1 ,5 ml d'une solution stock stérile à 1 mg/ml) et le sulfate thalleux (1 ml d'une solution stock stérile à 0,01 g/ml) sont additionnés à la solution A stérile.
La gélose coulée obtenue est translucide et bleu ciel.
1.4.2 Conditions de culture
Pour une croissance optimale en nombre et en taille des Salmonella, et une inhibition des autres espèces, le milieu inoculé doit être incubé pendant 48h à 37°C.
Préparation
On prépare une solution A de composition :
CaCI2, 2H2O 0,0147 g
MgSO4, 7H2O 0,123 g
KH2PO4 0,680 g K2HPO4 2,610 g
Solution d'oligoéléments * 10 ml
(ou 1 ml d'une solution dix fois concentrée) Acide 3-hydroxybenzoïque (Fluka) 1 ,0 g
Extrait de levure (Difco) 0,1 g
Casamino-acides (Difco) 0,050 g
L-cystéine, HCI, H2O (Prolabo) 0,026 g soit 5 ml d'une solution à 3,6 mg/ml
Vert brillant AcBg-14 (Sigma) 0,0015 g soit 1 ,5 ml d'une solution à 1 mg/ml
Sulfate thalleux (Fluka) 0,010 g soit 1 ml d'une solution à 0,01 g/ml
Eau distillée stérile Qsp 500 ml
la solution d'oligo-éléments* ayant la même composition que celle qui est décrite ci-dessus dans le milieu de base.
Solution B : cette solution est identique à celle qui est décrite plus haut pour le milieu de base.
Sous agitation magnétique on a dissous les constituants de la solution A, exceptés le vert brillant et le sulfate thalleux ; on a ajusté Ie pH à 7,2+0,2 à 250C. On a stérilisé la solution obtenue par filtration sur un filtre Stéricup® 0,22μ. On a ajouté 1 ,5 ml d'une solution stock stérile de vert brillant à 1 ,5 mg/ml et 1 ml d'une solution stock stérile de sulfate de thallium à 0,01 g/ml, ces solutions stocks ayant été préparées séparément et stérilisées par filtration sur filtres unitaires de 0,22μ. On a préparé la solution B dans un flacon stérile de 1 litre en dissolvant les produits sous agitation magnétique et en ajustant le pH à 7,2+0,2 à 25°C. La solution obtenue a été chauffée sur plaque chauffante, jusqu'à ce que la gélose soit complètement dissoute. On a stérilisé cette solution à l'autoclave, pendant 20 minutes à 1100C. Maintenus à une température de 50, à 60°C, 500 ml de A ont été mélangés aux 500 ml de B. On a alors coulé en boîtes de Pétri, les boîtes coulées obtenues étant bleues et translucides. Avant inoculation, les boîtes ont été séchées, par passage 15 à 30 minutes sous hotte ou à l'étuve. On a conservé et stocké les boîtes au réfrigérateur (12h à température ambiante).
On a réalisé la culture des Salmonella et l'inhibition des autres espèces par incubation du milieu inoculé pendant 48h à 370C.
1.4.3 Autres milieux
L'évaluation du milieu final a été réalisée par comparaison au TCS et aux milieux connus sélectifs des Salmonella suivants. Hektoen Enteric agar commercialisé par BioRad (64584) ou Merck (1.11681)
Salmonella-Shigella agar ou SS Merck commercialisé par (1.07667) Xylose-Lysine-Désoxycholate agar ou XLD par Merck (1.05287) Xylose-Lysine-Tergitol 4 agar ou XLT4 par Merck (1.13918) Rambach® agar commercialisé par Merck (1.07500) Trypto-caséine-soja (TCS) commercialisé par BioRad.
Ces milieux ont été préparés selon les instructions des fabricants. Ils ont été coulés en boîtes de Pétri rondes (20 ml par boîte) et conservés à +4°C jusqu'à utilisation, et la composition des différents milieux est la suivante :
Hektoen enteric agar
Peptones 15 g
Saccharose 14 g
Lactose 14 g
Salicine 2 g
Chlorure de sodium 5 g
Thiosulfate de sodium 5 g
Citrate ferrique ammoniacal (III) 1 ,5 g
Sels biliaires 2 g
Bleu de bromothymol 0,05 g
Fuschine acide 0,08 g Agar 13,5 g
Eau distillée Qsp 1 I
Salmonella Shigella agar (SS)
Peptones 10 g
Lactose 10 g
Bile de bœuf desséchée 8,5 g
Citrate de sodium 10 g
Thiosulfate de sodium 8,5 g
Citrate ferrique 1 g
Vert brillant 0,0003 g
Rouge neutre 0,025 g
Agar 12 g
Eau distillée Qsp 1 I
Xylose-Lysine-Désoxycholate (XLD)
D-xylose 3,5 g
L-lysine 5 g
Lactose 7,5 g
Saccharose 7,5 g
Chlorure de sodium 5 g
Extrait de levure 3 g
Désoxycholate de sodium 2,5 g
Thiosulfate de sodium 6,8 g
Citrate de fer ammoniacal 0,8 g
Rouge de phénol 0,08 g
Agar 13,5 g
Eau distillée Qsp 1 I Xylose-Lysine-Tergitol 4 (XLT4)
Protéose peptone 1 ,6 g
Extrait de levure 3 g
L-lysine 5 g
D-xylose 3,75 g
Lactose 7,5 g
Saccharose 7,5 g
Citrate de fer III ammoniacal 0,8 g
Thiosulfate de sodium 6,8 g
Chlorure de sodium 5 g
Rouge de phénol 0,08 g
Agar 18 g
Supplément Tergitol 4 4,6 ml
Eau distillée Qsp 1 I
Rambach agar
Peptone 8 g
Chlorure de sodium 5 g
Désoxycholate de sodium 1 g
Mélange chromogène 1 ,5 g
Propylène 10,5 g
Agar 15 g
Eau distillée Qsp 1 I Trypto-caséine-soja (TCS)
Hydrolysat trypsique de caséine 15 g
Peptone de soja 5 g
Chlorure de sodium 5 g
Agar 15g
Eau distillée Qsp 11
1.5 Méthode d'évaluation - Inoculation
L'évaluation du milieu M70/3-HB a été réalisée en comparant T « efficiency of plating » de ce milieu par rapport à celle des autres milieux, selon la méthode de dénombrement ci-dessus. Pour un maximum de souches, à partir d'un bouillon de 18h, des dilutions en eau distillée stérile ont été réalisées. Les dilutions 10"4 à 10"7 sont ensemencées par étalement au râteau sur les 7 milieux, en duplicat. Après 24 à 48h d'incubation à 37°C, les colonies sur chacune des boîtes ont été dénombrées et l'aspect et la taille des colonies a été relevée. L' « efficiency of plating » a été déterminée par rapport à la gélose TCS.
1.6 Essai sur des bactéries stressées
Deux souches de Salmonella enterica subsp. enterica ; de Sérotype Enteritidis 1299/04 et de Sérotype Typhimurium 1366/04 ont été soumises à un stress réalisé comme indiqué ci-dessous. L'efficacité du milieu M70/3-HB a été étudiée sur ces souches stressées en évaluant I' « efficiency of plating », comparée aux divers autres milieux.
1.6.1 Epreuve de stress
Un bouillon TCS a été ensemencé et incubé 18h à 37°C. Sous hotte, 50 μl de ce bouillon ont été déposés sur deux lamelles en verre, dégraissées, stériles (50 μl par lamelle). Les deux lamelles ont été séchées sous le flux de la hotte jusqu'au séchage complet. Les lamelles séchées ont été mises dans 10 ml d'eau distillée stérile et le tout a alors été vortexé.
1.6.2 Dénombrement
Un dénombrement de la suspension obtenue ci-dessus a été réalisé sur les différents milieux, à partir des dilutions 10"2 à 10"6 (réalisée avec la même technique que §3.3 et 4.3). L'« efficiency of plating » de chaque milieu par rapport au TCS a été calculée.
Les résultats sont présentés II (1.5)
Résultats des taux de recouyrement
Les tableaux suivants présentent le nombre total de colonies dénombrées sur les duplicats des différents milieux (nombre boîte 1 + nombre boîte 2), pour un même volume de suspension inoculé.
Figure imgf000038_0001
Tableau IV : Dénombrement des non-Salmonella (résultats à 48h)
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000039_0002
II Résultats
1. 1 Inhibiteurs
1.1.1 Vert brillant
L'activité du vert brillant a été étudiée sur les souches : S. enteήca sérotypes Typhi Ty2, Typhi 57K, Typhimurium LT2, Typhimurium 58.58T, Enteritidis 64K, Enteritidis 297/67 ; Escherichia coli 54.8T, E. co// 0103 HI8, E. coli O103 PMK1, E. coli 0103 PMK3, E. coli 0103 PMK4, Citrobacter freundii 57.32T, C.koseri 82.94T, Enterobacter aerogenes 60.86T1 Pseudomnas aeruginosa LMG 1242T, Staphylococcus aureus 65.8T1 Enterococcus faecalis 103015T, Bacillus cereus 66.24T.
Deux gradients de concentration ont été préparés et testés : de 0,25 à 5 mg/l et de 5 à 25 mg/l.
Après 48h à 4 jours d'incubation, on a constaté que les souches du sérotype Enteritidis sont capables de cultiver en présence de concentrations de vert brillant supérieures à 5 mg/l, que Escherichia coli 54.8T et HI8 ont été inhibées dès 0,25 mg/l, Enterobacter aerogenes a été inhibé au-delà de 3,8 mg/l. La souche de Pseudomonas aeruginosa, non- utilisatrice de 3-hydroxybenzoate, n'a donné que des microcolonies, non affectées par le vert brillant.
Enfin, la concentration inhibitrice avoisine : 2,5 à 3 mg/l, pour les souches de sérotypes Typhimurium et Typhi 1 ,5 à 2 mg/l, pour les souches de Escherichia coli 0103 PMK1 , PMK3, PM K4 3 à 3,5 mg/l, pour les souches de Citrobacter.
On a conclu que la concentration d& vert brillant optimale se situe entre 1 et 2,5 mg/l, pour permettre l'inhibition des E. coli sans affecter les Salmonella. 1.1.2 Sulfate de thallium
Le sulfate de thallium (thalleux) a été étudié en vue d'inhiber les Pseudomonas spp. et Burkholderia cepacia. Son activité a été testée sur les souches suivantes : S. enterica sérotypes Typhi Ty2, Typhi 57K, Typhimurium LT2, Typhimurium 58.58T, Enteritidis 64K, Enteritidis 297/67 ; et Eschθrichia coli 0103 HI8, E. coli 0103 PMK1 , E. coli 0103 PMK3, E. coli 0103 PMK4, Citrobacter freundii 57.32T, C. koseri 82.94T, Enterobacter aerogenes 60.86T, Pseudomonas aeruginosa LMG 1242T, P. aeruginosa 9310577, Burkholderia cepacia LMG 6889, β. cepacia 103277, Staphylococcus aureus 65.8T, Enterococcus faecalis 103015T, Bacillus cereus 66.24T.
Deux gradients ont été préparés et testés : 0,05 à 1 g/l et de 0 à 0,25 g/l.
On a constaté que les Pseudomonas et Burkholderia ont-été inhibés en présence de sulfate de thallium, quelle que soit la concentration et que toutes les autres bactéries sont inhibées pour des concentrations allant de 0,1 g/l (Typhi, Escherichia coli O103) à 0,5-0,6 g/l (Enterobacter aerogenes, Typhimurium et Enteritidis).
Par ailleurs, Typhi Ty2 et Typhimurium LT2 ont très bien cultivé à la concentration de 0,025 g/l et moyennement bien à 0,05 g/l (résultats obtenus par inoculation en cadran de géloses M70/3-HB supplémentées en sulfate de thallium à 0,025 ou 0,05 ou 0,1 g/l). A ces mêmes concentrations, aucune culture n'a été observable pour Pseudomonas et Burkholderia.
La concentration optimale de sulfate de thallium est inférieure à 0,025 g/l, pour inhiber Pseudomonas et Burkholderia et ne pas affecter la croissance des Salmonella.
1.2 Facteurs de croissance
On a testé l'influence d'une supplémentation en cystéine, et/ou casamino-acides, la cystéine ayant été étudiée sur Typhi Ty2, Typhi 57K, Enteritidis 64K et Enteritidis 297/67 (cette dernière n'est pas auxotrophe), seuls et associés, aux concentrations suivantes :
L-cystéine, HCI, H2O : 26 et 52 mg/l (soit 18 et 36 mg/l de cystéine) On a constaté que la cystéine favorise la croissance des Typhi, mais n'a pas d'influence sur Enteritidis 64K, et que l'effet est identique pour 18 et
36 mg/l (Tableau Vl).
Tableau Vl : Essai des acides aminés : résultats à 48h
Figure imgf000042_0001
Culture : - très faible ; ± faible ; + moyenne ; ++ bonne.
Par ailleurs, l'influence des casamino-acides a été testée pour des concentrations de 25, 50, 100, 200, 300 mg/l et en association à 26 mg/l de L-cystéine, HCI, H2O. Les souches utilisées étaient : S. enterica sérotypes Typhi Ty2, Typhi 57K, Enteritidis 64K et Enteritidis 297/67, Typhimurium LT2 ; et Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii 57.32T, C. koseri 82.94T, Escherichia coli 54.8T1 E. coli HI8, E. coli O103 PMK3, Klebsiella pneumoniae SB107. Cet essai a été réalisé sur le milieu M70 avec et sans 3-HB. Les résultats à 48h d'incubation sont présentés ci-dessous. (Tableau VIII)
Figure imgf000043_0001
3HB : 3-hydroxybenzoate ; CAA : casamino-acides; Cys : L-cystéine, HCI, H2O Culture : O nulle ; - très faible ; ± faible ; + moyenne ; ++ bonne ; +++ très bonne. *Ufc : unité formant colonie
On a conclu que l'addition de cystéine à 50 mg/l aux casamino- acides permet une bonne culture des souches, y compris les Typhi, sans favoriser celle des souches non-utilisatrices de 3-HB.
1.3 Milieu M70 au 3-hydroxybenzoate (M70/3-HB)
On a étudié le milieu M70 comportant deux inhibiteurs : le vert brillant et le sulfate de thallium, en présence des facteurs de croissance suivants : les casamino-acides à 50 mg/l associés à 26 mg/l chlorhydrate de L-cystéine monohydrate (18 mg/l de L-cystéine).
On a évalué le taux de recouvrement des Salmonella en fonction des différentes concentrations de vert brillant associé ou non au sulfate de thallium, par dénombrement des bactéries cultivables sur le milieu en comparaison avec une gélose TCS.
On a utilisé les souches suivantes, utilisatrices de 3-HB : Typhimurium LT2, Typhi Ty2, Citrobacter freundii 57.32T, Escherichia coli 0103 PMK3, Enterobacter aerogenes 60.86T, et Burkholderia cepacia 103277.
Le vert brillant a été étudié seul à différentes concentrations 1 ; 1 ,5 ; 2 et 2,5 mg/l. Cet essai confirme l'activité inhibitrice de ce colorant sur Escherichia coli, à partir de 1 ,5 mg/l. Les moyennes du nombre de colonies dénombrées (essai réalisé en dύplicat), I' « efficiency of plating » (rapport de la moyenne des colonies sur le milieu testé, sur la moyenne sur TCS) et la taille des colonies sont données dans le tableau ci-dessous (Tableau VIII).
Au-delà de 1,5 mg/l, le nombre et la taille des colonies dénombrées a diminué pour les Salmonella et Enterobacter aerogenes, attestant d'un effet inhibiteur. Citrobacter freundii a cultivé difficilement , donnant des microcolonies de diamètre très inférieur à 1 mm, et sa culture a été " considérée comme négative. Il en a été de même pour Burkholderia cepacia qui ne peut être dénombré que jusqu'à 1 ,5 mg/l.
Tableau VIlI : Taux de recouvrement pour des concentrations croissantes de vert brillant (VB) (résultats à 48h)
Figure imgf000045_0001
Taux de recouvrement par comparaison au TCS Moyenne du nombre de colonies dénombrées sur les duplicats Diamètre des colonies en mm Non déterminé : microcolonies
L'association de 0,01 ou 0,025 g/l de sulfate de thallium au vert brillant a été étudiée selon la même méthode (Tableau IX). L'ajout de sulfate de thallium à ces faibles concentrations n'affecte pas la culture des Salmonella testées. Les souches de Escherichia coli et Burkholderia cepacia ont été totalement inhibées en présence de 1 ,5 mg/l de vert brillant et 0,01 g/l -de sulfate de thallium. Les résultats observés pour Citrobacter freundii et C. koseri sont restés inchangés.
Une concentration de sulfate de thallium de 0,01 g/l, rajoutée à 1 ,5 mg/l de vert brillant, semble donc suffisante pour rendre le milieu M70/3-HB encore plus sélectif.
Tableau IX : Taux de recouvrement du milieu en présence d'une association vert-brillant (VB) et sulfate de thallium (ST) (résultats à 48h)
Figure imgf000046_0001
Taux de recouvrement par comparaison au TCS
Moyenne du nombre de colonies dénombrées sur les duplicats
Diamètre des colonies en mm
: Non déterminé
: microcolonies Remarque ": On n'a noté aucune différence d'aspect entre les colonies des différentes souches testées. Elles ont apparu toutes rondes, régulières, opaques, beiges à vertes.
1.4 Evaluation du milieu final - Comparaison avec des milieux connus
On a comparé l'efficacité du milieu à mettre en évidence les bactéries, avec celle de 5 milieux commercialisés : Hektoen, Salmonella- Shigella, XLD, XLT4, et Rambach.
Les résultats obtenus à 48h pour les Salmonella sont exposés dans le Tableau X. Les moyennes des taux de recouvrement sur M70/3-HB a varié selon les souches et les sérotypes de 0,46 (Typhi Ty2) à 1 ,30 (Heidelberg), avec une moyenne de 0,94 et une médiane de 0,96. Le diamètre des colonies après 48h s'est échelonné de 1 à 2,5 mm.
Pour les autres milieux, les moyennes et médianes (et écarts maxima) des taux de recouvrement sont respectivement de 0,28 et 0,21 (0,02 à 0,87) sur Hektoen BioRad, 0,92 et 0,98 (0,21 à 1 ,23) sur Hektoen Merck, 0,72 et 0,84 (0 à 1 ,60) sur SS, 0,97 et 0,98 (0,11 à 1 ,96) sur XLD 0,44 et 0,36 (0,04 à 1 ,56) sur XLT4 et 0,63 et 0,60 (0,01 à 1 ,52) sur Rambach.
Le diamètre des colonies sur ces différents milieux a varié de 2 à 5 mm après 48h d'incubation.
Dans le Tableau X, sont reportés les intervalles de confiance à 95 % (soit 5 % d'erreur) des taux de recouvrement de chaque souche testée, sur chacun des milieux. Ceux-ci ont été calculés, selon la formule mise au point par Williams en 1968 pour estimer l'intervalle de confiance de l'« efficiency of plating » (oep) (5). L'intervalle de confiance pour 5 % d'erreur est défini comme tel : eop±1 ,96σ, où σ est l'écart-type (erreur standard). L'erreur standard correspond à la racine carrée de la variance, définie par Ia formule suivante : σ2 ≈ X1 (X^X2) / X2 3
X1 : le nombre total de bactéries dénombrées sur le milieu 1 (somme des bactéries dénombrées sur les deux boîtes du duplicat)
X2 : le nombre total de bactéries dénombrées sur le milieu 2
En prenant toujours X-ι<X2 pour le calcul.
Les valeurs de X sont reportées en annexe (Tableau , Tableau IV, Tableau V).
Le milieu M70/3-HB a été le plus efficace pour 22 essais sur 43 (soit 18 souches sur 31) : toutes les souches de Typhimurium, les 2 souches de Virchow, les 2 souches de Hadar, 1 Typhi, 1 Newport, Infantis, Derby, et Napoli. Salmonella Gallinarum n'a pas été cultivable.
Par comparaison des moyennes des taux de recouvrement, la différence entre le milieu M70/3-HB et TCS n'est pas significative (loi Normale 5 % : u=1 ,86 ; p>0,05). De même, XLD permet de mettre en évidence un nombre équivalent de Salmonella (u=0,45 ; p>0,05 ; NS), ainsi qu'Hektoen Merck (test de Student 5 % : t=1 ,392 ; p>0,05 ; NS). Les autres milieux ont des taux de recouvrement significativement inférieurs au taux de M70/3-HB et TCS (p<0,05).
Les colonies de Salmonella ont présenté une coloration noire sur les milieux Hektoen, SS, XLD, XLT4 (production d'H2S en 24h) et rosés sur Rambach (utilisation du propylène glycol). Les deux souches de Typhi et la souche de Gallinarum apparaissent incolores sur tous les milieux. Hadar 173K et Napoli 473K, ont donné également des colonies incolores sur Hektoen, SS, XLD, et XLT4 et rosés sur Rambach.
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Intervalle de confiance (5 % d'erreur) de I' « efficiency of plating » b : Taux moyen de recouvrement ± écart de confiance à 95 %
*: Hektoen Merck
** : Microcolonies de Gallinarum sur M70/3-HB (diamètre <« 1 mm) : culture considérée nulle
- : non déterminable
Les essais sur les souches non-Salmonella (Tableau Xl) ont montré que le milieu M70/3-HB n'a pas permis la culture ni de Citrobacter freundii, Escherichia coli, Serratia marcescens et Proteus mirabilis (microcolonies), ni de Burkholderia cepacia (taux de recouvrement nul). Citrobacter koseri et Klebsiella oxytoca ont présenté un bon taux de recouvrement sur M70/3- HB, avec des colonies de 2 mm de diamètre. Par ailleurs, il n'y avait aucune différence d'aspect entre les colonies de Salmonella et les colonies de non-Salmonella.
Les autres milieux sont plus ou moins inhibiteurs vis-à-vis de ces souches, avec de faibles taux de recouvrement (variables selon les souches et les milieux) ; ils donnent à 48h des colonies dont le diamètre varie de 3 à 5 mm. Les colonies observées diffèrent des colonies de Salmonella par leur coloration. En effet, Hektoen, SS, XLD, et XLT4 permettent de différencier les colonies noires des bactéries productrices d'H2S (Salmonella, Proteus) des colonies de souches non productrices d'H2S qui apparaissent incolores à jaunes. Sur Rambach, milieu chromogénique, les colonies de nor\-Salmonella apparaissent bleu-violet par présence d'une béta-galactosidase, alors que les colonies de Salmonella sont rosés à rouges.
Tableau Xl : Taux de recouvrement des non-'Salmonella (résultats à 48h)
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
: Intervalle de confiance (5 % d'erreur) de I' « efficiency of plating » b : Taux moyen de recouvrement + écart de confiance à 95 % *: Hektoen BioRad
** : Microcolonies sur M70/3-HB (diamètre <« 1 mm) : culture considérée nulle - : non déteminable
1 .5
L'efficacité du milieu M70/3-HB a par ailleurs été évaluée sur deux souches de Salmonella enterica préalablement soumises à un stress : Enteritidis 1299/04 et Typhimurium 1366/04. Les résultats de cet essai sont donnés dans le Tableau XII. Le taux de recouvrement sur M70/3-HB a été légèrement diminué après stress, et reste supérieur ou égal à 1 , c'est-à- dire au moins équivalent au TCS. Les taux ont éténettement abaissés sur Hektoen, SS et XLD, et sont restés équivalents sur XLT4 et Rambach. Un retard de croissance sur les différents milieux.
Tableau XII : Taux de recouvrement de Salmonella préalablement soumises à un stress (résultats à 48h)
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000054_0001
Résultats précédents (Tableau X)
Intervalle de confiance (5 % d'erreur) de I' « efficiency of plating » Taux moyen de recouvrement + écart de confiance à 95 % Hektoen Merck
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Claims

REVENDICATIONS
1. Milieu de culture bactérienne pour au moins une souche à cultiver comportant, dans un milieu inorganique minimum, au moins un précurseur de gentisate et/ou du gentisate ou leurs dérivés, en tant que source de carbone et d'énergie.
2. Milieu de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que la souche bactérienne à cultiver est choisie parmi Salmonella sp. dont Salmonella enterica subsp indica, Salmonella enterica subsp arizonae, Salmonella bongori, Salmonella enterica subsp diaήzonae, Salmonella enterica subsp enterica, Salmonella enterica subsp houtenae, Salmonella enterica subsp salamae, les Escherichia coli et autres entérobactéries.
3. Milieu de culture selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la souche bactérienne à cultiver est choisie parmi les sérotypes ou sérovars de Salmonella enterica et notamment les sérotypes Typhimurium, Enteriditis, Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B, Virchow, Hadar et Agona.
4. Milieu selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la souche bactérienne est une souche de Salmonella, notamment une souche de Salmonella stressée.
5. Milieu selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le précurseur de gentisate est choisi parmi le 3-hydroxybenzoate et/ou leurs dérivés et leurs mélanges.
6. Milieu selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel le précurseur de gentisate est le 3-hydroxybenzoate.
7. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est supérieure à 0,1 g/l.
8. Milieu de culture selon l'une/ des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est supérieure à 0,5 g/l.
9. " Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est inférieure à 5 g/l.
10. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est inférieure à 2g/l.
11. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est comprise entre 0,8 et 1 ,2 g/l.
12. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce qu'il comporté en outre au moins un inhibiteur de la croissance des bactéries différentes de la souche bactérienne à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie.
13. Milieu selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel l'inhibiteur est choisi parmi les inhibiteurs de la flore Gram positif et/ou des bactéries Gram négatif distinctes de la souche bactérienne à cultiver.
14. Milieu selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel le ou les inhibiteurs sont choisis parmi les sels biliaires, le désoxycholate de
' sodium, les détergents, les antibiotiques, les colorants et leurs mélanges.
15. Milieu selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel le ou les inhibiteurs sont choisis parmi les colorants du type triphénylméthane, notamment diaminotriphénylméthane, le vert brillant, le vert malachite, le violet de gentiane, la fuchsine acide et leurs mélanges.
16. Milieu selon l'une des revendications 1 à 15, dans lequel le ou les inhibiteurs sont choisis parmi le sulfate thalleux et le vert brillant et leurs mélanges.
17. Milieu de culture..selon l'une de's revendications 1 à 16 sous forme gélifiée.
18. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 16 sous forme liquide.
19. " Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 11 sous forme liquide sans inhibiteur.
20. Milieu selon l'une des revendications 1 à 19 comportant de plus un facteur de croissance choisi parmi les acides aminés, les vitamines, les purines, les hydrolysats de protéines et les extraits de levure, et leurs mélanges.
21. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 20, dans lequel la souche à cultiver est auxotrophe et le milieu comporte un facteur de croissance distinct d'une souche de carbone.
22. Milieu selon l'une des revendications 1 à 21 comportant de plus un facteur de croissance est' un hydrolysat de protéine, notamment un hydrolysat de caséine, éventuellement supplémenté de L-cystéine.
23. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 22, dans lequel la concentration en facteur de croissance est inférieure à la concentration permettant la croissance de ladite souche sans autre source de carbone.
24. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 23, comprenant en outre au moins un substrat chromogène choisi parmi les
" substrats X-caprylate, X-alpha-D-galactopyranoside, X-beta-D- galactopyranoside ou X-galactopyranoside, où X- représente le groupe 5- bromo-4-chloro-3-indoxyl-, X- pouvant être remplacé par 3-indoxyl-, 5- bromo-6-chloro-3-indoxyl-, 6-chloro-3-indoxyl-, 5-iodo-3-indoxyl-, N- méthylindoxyl- ou 4-méthylumbelIiféryl-, et leurs mélanges.
25. Milieu selon l'une des revendications 1 à 24, dans lequel le substrat chromogène est choisi parmi le 5-bromo-4-chloro-3- indolylcaprylate et le 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside et leurs mélanges.
26. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 25, dans lequel la concentration en substrat chromogène est de 0,1 à 0,4 g/l.
27. Procédé d'enrichissement d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'une des revendications 1 à 26.
28. ' Procédé selon la revendication 27, dans lequel la souche est du type Salmonella ou E. coli.
29. Procédé d'isolement d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'une des revendications 1 à 26.
30. Procédé selon la revendication 29, dans lequel la souche est du type Salmonella, notamment une souche stressée de Salmonella.
31. Procédé de culture d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'une des revendications 1 à 26 mis en œuvre dans des conditions inhibitrices.
32. Procédé de culture d'une souche bactérienne selon la revendication 31 dans lequel les conditions inhibitrices sont choisies parmi la présence d'un inhibiteur de croissance des bactéries différentes de la souche à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie, les conditions de salinité, les conditions d'aérobiose, le contrôle du pH et/ou le contrôle de la température.
33. Association du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, notamment du 3- hydroxybenzoate, en tant que source de carbone et d'énergie, avec au moins un inhibiteur, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, l'inhibiteur agissant sur la croissance des bactéries différentes de la souche bactérienne à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie.
34. Utilisation du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, notamment du 3- hydroxybenzoate, en tant que source de carbone et d'énergie, dans des conditions inhibitrices, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, lesdites conditions agissant sur Ia1 'croissance des bactéries qui sont différentes de la souche bactérienne à cultiver et qui assimilent ladite source de carbone et d'énergie.
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