WO2007019945A2 - Verfahren und kit zur detektion von anteilen bovinen gewebes in unter zersetzenden bedingungen hergestellten produkten tierischen ursprungs - Google Patents

Verfahren und kit zur detektion von anteilen bovinen gewebes in unter zersetzenden bedingungen hergestellten produkten tierischen ursprungs Download PDF

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Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes

Definitions

  • the invention relates to a method and a kit for the detection of bovine tissue fractions in products of animal origin produced under decomposing conditions.
  • An essential application of the invention is the examination or certification of products for which it is to be ensured that they contain no bovine tissue components.
  • the invention relates to the study of gelatin.
  • the desire for a reliable certification of gelatin for the absence of bovine components is due to the BSE crisis.
  • the EU has issued a directive regarding the production of edible gelatine, which requires documentary evidence that the starting materials used to produce the gelatine are derived from animals suitable for human consumption.
  • This is relatively costly in the case of BSE, as bones and slaughterhouse waste from many different cattle are pooled during manufacture, which means that a corresponding number of BSE tests would need to be documented for each batch.
  • the object of the invention is to provide a detection method which also functions reliably in such products.
  • the object is achieved by a method according to claim 1 and a kit according to claim 23.
  • a DNA extract is obtained from a sample of the product.
  • the DNA extract is then processed by means of PCR, wherein the primers used in the PCR are designed so that they recognize as a target sequence a bovine-specific sequence with a length of less than 150 nucleotides. Finally, it is then checked whether an amplification has taken place during the PCR with the primers used.
  • a DNA extract is obtained from the sample to be investigated, which can be further processed by means of PCR.
  • the sample can be homogenized, for example, then incubated in the presence of a lysis buffer and / or a proteinase, in particular proteinase K, and then the DNA contained can be extracted and purified.
  • a lysis buffer and / or a proteinase in particular proteinase K
  • the DNA contained can be extracted and purified.
  • the DNA is then further extracted and purified by means of, in particular, alcoholic precipitation, if appropriate after prior precipitation of the proteins.
  • the lysate can also be applied to a DNA-binding column and the column subsequently eluted as prescribed in the kit "High Pure Template Preparation Kit Cat No. 1796 828" from Roche Diagnostics. The eluate is then further processed as a DNA extract in the PCR.
  • DNA extracts of e.g. preferably examined gelatin still contain species-specific by PCR detectable target sequences.
  • An essential aspect is that the invention uses very short target sequences, since it has been found that such short sequences are still intact after treatment under extreme conditions and are present in an amount sufficient for analysis.
  • the target sequence used is particularly preferably a boin-specific sequence which occurs several times in the genome or the mitochondrial DNA. Basically, it can be said that with the co- The number of statistical proofs increases, which can be an important argument, especially for the desired certification.
  • the work-up takes place in the presence of primers which specifically recognize the ATPase 8 subunit.
  • the ATPase 8 subunit is encoded by region 7766-7966 (SEQ ID NO 1) of bovine mitochondrial DNA.
  • SEQ ID NO 1 The entire mitochondrial genome is published under No. AF492351 in the database of EMBL-EBI.
  • primer pair having the following sequences:
  • the primer Fpc F2 corresponds to the section 7799-7823 in the mitochondrial DNA (34-58 in SEQ ID NO 1) and the region 4-24 of the primer Fpc R (SEQ ID NO 3) corresponds to Section 7898- 7918 in the mitochondrial DNA or in the section 133-154 in the ATPase 8 sequence (SEQ ID NO 1).
  • the first 3 nucleotides at the 5 'end are not complementary and have been inserted for reasons of melting behavior of the primer.
  • Target sequence primer sequence (5 ⁇ -30 position amplicon (oligonucleotides) (bp)
  • DNase 1 is added to the master mix in a particularly preferred embodiment in order to avoid potential Exclude contamination by bovine components not derived from the product. It could e.g. demonstrated that 0.2 UDNase I on 10 microliter of master mix was sufficient to exclude contaminating DNA without adversely affecting the PCR reaction.
  • a fundamental problem with PCR approaches is that, due to PCR inhibitors possibly contained in the samples examined, the reaction does not proceed or does not take place sufficiently.
  • the invention therefore provides that the PCR is carried out in the presence of an internal amplification control.
  • Suitable amplification controls may be any desired target DNA sequences (control DNA) that are appropriately designed with primers standardized and reproducible under similar conditions as the ATPase 8 subunit amplify sequences.
  • the internal amplification control is carried out in the same approach, in which the detection of the Linderspezifischen sequence is carried out.
  • the control DNA used in the invention preferably PuC 19 plasmid DNA. Details of this plasmid, in particular the sequence, are e.g. from “Yanish-Perron et al.” in “Gene 33 (1), 103-119 (1985)". PuC 19 can be obtained under No. ATCC 37254 / L09137 or from New England Biolabs (Cat. No. N3041S).
  • Suitable control primers which recognize PuC 19 may be e.g. have the following sequences:
  • Target sequence oligonucleotides sequence (5i-3 ⁇ ) position amplicon (bp)
  • PuC19 plasmid DNA PuC 19fw (SEQ ID CGG AGA CGG TCA CAG CT 49-65 400
  • the method according to the invention can use a conventional PCR by means of subsequent evaluation in the gel.
  • the work-up of the DNA extract takes place by means of real-time PCR.
  • Real-time PCR methods have been known for a long time and differ essentially from conventional PCR methods in that the PCR approach additionally contains probes which generate a changing signal correlated with the increase of amplified DNA. Furthermore, the PCR apparatus used (cycler) has a measuring device which detects the signals generated during the PCR in the approaches, so that directly, i. can still be determined during the measurement, whether an amplification of the target sequence has taken place.
  • Suitable for real-time PCR probe and cycler systems with appropriate measuring devices are offered by different manufacturers known in the art.
  • specific probes which specifically generate a signal only when amplifying bovine sequences and / or the internal control DNA sequence are particularly preferably used for detecting the amplicons generated during the PCR. It is understood that the signals generated while working up the amplification control must be differentiable in a common approach from the signals generated in amplification of the bovine sequence, which is not a problem by appropriate marker selection.
  • Specific probes typically have a portion of DNA chosen to specifically hybridize to a portion of the target DNA. The DNA segment is linked to a marker or a marker system which generates a different signal upon hybridization than in the non-hybridized state. Suitable probes have become known in the art, for example, under the term "TAQMAN probes".
  • This system uses 2 probes per target, both of which hybridize to adjacent regions of the target sequence.
  • One probe is labeled with fluorescein, the other with a fluorescent dye, e.g. LC-Red-705 or LC-Red-640 (Roche Diagnostics).
  • the fluorescein can activate the fluorescent dyes, which then generate a signal with the respective specified wavelengths 705 nm or 640 nm.
  • bovine probes with the following sequences have been found to be particularly suitable:
  • SEQ ID NO 7 (BovSP-5'LC Red 640): 5'TAT CAC AAT CCA GAA CTG ACA CCA AC 3 '
  • control DNA which can be worked up with the same primers as the ATPase 8 subunit.
  • a suitable control DNA in this context may, for example, have the following sequence:
  • SEQ ID NO 8 AT GATCTTATCA ATATTCTTGA CCCTTTTAT CATCTTTCAA CTAAAAGTTT CAAAACACAA CTTT CAGGGT
  • SEQ ID NO 8 corresponds to the region 34-153 of the bovine ATPase sequence (SEQ ID NO 1), wherein the section 67-90 in SEQ ID NO 8 was replaced by a 21 bp fragment, that of the region 355 -375 of the puC19 plasmid.
  • the main advantage of using the described control DNA according to SEQ ID NO 8 is that an amplification can be carried out with the same primers as for the bovine sequence, whereby not only a basic PCR control but also a primer control is given ,
  • control DNA according to SEQ ID 8 is used as the internal amplification control, then the further advantage is that only one control probe which binds to the PuC19 insert is required, which in turn reacts with the bovine probe according to SEQ ID NO. BovSP-3'Fluo).
  • this control probe has a sequence according to:
  • Target sequence probes oligonucleotide sequence (5-30 position de
  • the invention further relates to a kit in which the reagents required for carrying out the method are contained.
  • the kit according to the invention contains at least reagents for obtaining a DNA extract from sample material, and reagents for carrying out a PCR, in particular a real-time PCR, containing a specific for a bovine sequence primer pair, an internal amplification control and hybridizing with the bovine sequence and the internal amplification control probes each having different detectable markers.
  • Gelatin samples each weighing 500 mg, were homogenized in a Ryboly- ser (Hybaid, Ashford) in the presence of 1 ml of the lysis buffer contained in the kit and 60 ⁇ l proteinase K ( ⁇ .Smsec 1 for 45 s) and then for 30 min 70 ° C and incubated at 90 ° C for 15 minutes.
  • the genomic DNA was then treated with the appropriate column as prescribed in the kit protocol. nigt.
  • the DNA templates were then washed out with 100 ⁇ l of the elution buffer (Kit). 5 ⁇ l aliquots were then used in the PCR.
  • Real-time PCR was performed in 20 ⁇ l glass capillaries using Light Cycler 2.0 instrument (Roche Diagnostics).
  • the reaction mixture consists of QuantiTect PCR Master Mix (Qiagen), 0.5 ⁇ M of each primer (Fpc F2 / SEQ ID ID ID 1, Fpc R / SEQ NO ID 2), 0.2 ⁇ M of each probe (BovSP-3'Fluo, BovSP - 5'LC Red 640, ⁇ uC19-5'LC Red 705) and 0.008 atomol of the internal amplification control (SEQ ID NO 5).
  • Amplification started with an initial preincubation at 95 ° C for 20 minutes, followed by 55 cycles (95 ° C for 0s, 55 ° C for 30s, and 72 ° C for 30s).
  • the fluorescence was measured during the annealing phase at 55 ° C at 640 nm (channel 4) for the bovine sequence and at 705 nm (channel 6) for the amplification control.
  • the DNA was extracted and purified from mixtures (varying amounts of bovine gelatin in porcine gelatin) and the respective DNA extracts were processed by real-time PCR.
  • the results are shown in Table 4.

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Abstract

Verfahren und Kit zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs, bei dem ein DNA-Extrakt aus einer Probe des Produkts gewonnen wird, der DNA-Extrakt mittels PCR aufgearbeitet wird, wobei die bei der PCR eingesetzten Primer so designt sind, dass sie eine bovinspezifische Sequenz mit einer Länge von weniger als 150 Nukleotiden erkennen, und geprüft wird, ob während der PCR mit den eingesetzten Primern eine Amplifikation stattgefunden hat.

Description

Verfahren und Kit zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und einen Kit zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs.
Wesentlicher Anwendungsfall der Erfindung ist die Untersuchung bzw. Zertifizierung von Produkten, für die sichergestellt werden soll, dass sie keine Anteile bovinen Gewebes enthalten.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Untersuchung von Gelatine. Der Wunsch nach einer verläßlichen Zertifizierung von Gelatine bezüglich der Abwesenheit boviner Anteile geht auf die BSE-Krise zurück. In diesem Zusammenhang wurde z.B. von der EU eine Direktive bezüglich der Herstellung von eßbarer Gelatine erlassen, die einen dokumentarischen Nachweis vorschreibt, dass die zur Herstellung der Gelatine verwendeten Ausgangsmaterialien von Tieren stammen, die für den menschlichen Verzehr geeignet sind. Dies ist im Falle von BSE relativ aufwändig, da Knochen und Schlachtabfälle vieler unterschiedlicher Rinder bei der Herstellung gepoolt werden, was bedeutet, dass für jede Charge eine entsprechende Anzahl an BSE-Tests dokumentiert werden müsste. Hier wäre es ggf. einfacher, auf die Verwendung von Ausgangsmaterialien aus Rindern ganz zu verzichten und dies zu zertifizieren. Bislang gibt es keine verläßlichen Methoden, mit denen sich insbesondere z.B. in Gelatine die Herkunft bzw. Spezieszugehörigkeit der zur Herstellung verwendeten tierischen Gewebe bestimmen läßt. Dies ist im Wesentlichen darauf zurückzuführen, dass die extremen Temperatur- und pH-Bedingungen während der Herstellung von Gelatine die Ausgangsgewebe so weitgehend zersetzen, dass eine speziesspezifische Bestimmung nicht möglich ist.
Aufgabe der Erfindung ist, ein auch in solchen Produkten zuverlässig funktionierendes Nachweisverfahren bereitzustellen.
Gelöst wird die Aufgabe mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie einem Kit gemäß Anspruch 23.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst ein DNA-Extrakt aus einer Probe des Produkts gewonnen. Der DNA-Extrakt wird dann mittels PCR aufgearbeitet, wobei die bei der PCR eingesetzten Primer so designt sind, dass sie als Targetsequenz eine bovinspezifische Sequenz mit einer Länge von weniger als 150 Nukleotiden erkennen. Abschließend wird dann geprüft, ob während der PCR mit den eingesetzten Primern eine Amplifikation stattgefunden hat.
In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird wie erwähnt aus der zu untersuchenden Probe ein DNA-Extrakt gewonnen, der mittels PCR weiter aufgearbeitet werden kann.
Zur Gewinnung des DNA-Extrakts kann die Probe z.B. homogenisiert, dann in Gegenwart eines Lysis-Puffers und/oder einer Proteinase, insbesondere Proteinase K, inkubiert und dann die enthaltene DNA extrahiert und aufgereinigt werden. In einer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass dann mittels insbesondere alkoholischer Fällung die DNA weiter extrahiert und aufgereinigt wird, ggf. nach vorheriger Ausfällung der Proteine.
Als besonders geeignet hat sich in diesem Zusammenhang ein Kit und das entsprechende dazugehörige Aufarbeitungsprotokoll der Firma GEN-IAL (All-tissue DNA-extraction Kit Cat. No. D0502000) gezeigt.
Gemäß einer zweiten Ausgestaltung kann das Lysat auch auf eine DNA-bindende Säule gegeben und die Säule anschließend wie in dem Kit "High pure template preparation Kit Cat. No. 1796 828" der Firma Roche Diagnostics vorgeschrieben eluiert werden. Das Eluat wird dann als DNA-Extrakt in der PCR weiter verarbeitet.
Bezüglich der Details der bevorzugt eingesetzten Methoden wird auf die dem Fachmann zugänglichen Protokolle der erwähnten Kits verwiesen.
Im Rahmen der Erfindung konnte erstmals gezeigt werden, dass DNA-Extrakte der z.B. bevorzugt untersuchten Gelatine noch speziespezifische mittels PCR nachweisbare Targetsequenzen enthalten. Ein wesentlicher Aspekt ist, dass die Erfindung sehr kurze Targetsequenzen verwendet, da wie sich gezeigt hat, solche kurzen Sequenzen nach Behandlung unter Extrembedingungen noch intakt sind und in einer für eine Analyse ausreichenden Menge vorliegen.
Besonders bevorzugt wird im Rahmen der Erfindung als Targetsequenz eine bo- vinspezifische Sequenz ausgewählt, die mehrfach in dem Genom oder der mitochondrialen DNA vorkommt. Grundsätzlich lässt sich sagen, dass mit der Ko- pienzahl die statistische Nachweissicherheit steigt, was insbesondere bei der gewünschten Zertifizierung ein wesentliches Argument sein kann.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist vorgesehen, dass die Aufarbeitung in Gegenwart von Primern erfolgt, die spezifisch die ATPase 8 Untereinheit erkennen. Die ATPase 8 Untereinheit wird durch die Region 7766-7966 (SEQ ID NO 1) der bovinen mitochondrialen DNA kodiert. Das gesamte mitochondriale Genom ist unter der Nr. AF492351 in der Datenbank von EMBL-EBI veröffentlicht.
Besonders bevorzugt ist ein Primerpaar mit folgenden Sequenzen:
SEQ ID NO 2 (Fpc F2): 5'ATG ATC TTA TCA ATA TTC TTG ACC C 3' und SEQ ID NO 3 (Fpc R): 5'CCT TCA AGG GGT GTT TTG TTT TAA 3'
Der Primer Fpc F2 (SEQ ID NO 2) entspricht dem Abschnitt 7799-7823 in der mitochondrialen DNA (34-58 in SEQ ID NO 1) und der Bereich 4-24 des Primers Fpc R (SEQ ID NO 3) dem Abschnitt 7898-7918 in der mitochondrialen DNA bzw. dem Abschnitt 133-154 in der ATPase 8-Sequenz (SEQ ID NO 1). Die ersten 3 Nukleotide am 5' Ende sind nicht komplementär und wurden aus Gründen des Schmelzverhaltens des Primers eingefügt.
Einzelheiten der eingesetzten Primer sind in der Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1:
Zielsequenz Primer Sequenz (5ϊ- 30 Position Amplikon (Oligonucleotide) (bp)
ATPase 8 Un- Fpc F2 (SEQ ID NO 2) ATG ATC TTA TCA ATA TTC 34-58 126 tereinheit TTG ACC C
ATPase 8 Un- Fpc R (SEQ ID NO 3) CCT TCA AGG GGT GTT TTG 133-154 tereinheit TTT TAA Es konnte gezeigt werden, dass das beschriebene Primerpaar hochspezifisch und verläßlich Anteile bovinen Materials auch in geringsten Konzentrationen in Gelatine nachweisen konnte.
Im Hinblick auf die Tatsache, dass in den meisten PCR-Kits zur Stabilisierung der Enzyme BSA zugesetzt ist, die gegebenenfalls im Rahmen des erfindungsgemäßen Nachweises zu einem falsch positiven Nachweis führen könnte, wird in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung dem Mastermix DNase 1 zugesetzt, um eventuelle Verunreinigungen durch nicht aus dem Produkt stammende bovine Anteile auszuschließen. Es konnte z.B. gezeigt werden, dass 0,2 UDNase I auf 10 Mikroliter Mastermix ausreichend waren, um kontaminierende DNA auszuschließen, ohne dass dadurch die PCR-Reaktion nachteilig beeinflusst wurde.
Falsch positive Ergebnisse können also im Rahmen der Erfindung mit großer Sicherheit ausgeschlossen werden.
Ein weiteres Problem stellt sich jedoch mit eventuellen falsch negativen Ergebnissen.
Ein grundsätzliches Problem bei PCR- Ansätzen ist, dass auf Grund eventuell in den untersuchten Proben enthaltener PCR-Inhibitoren die Reaktion nicht oder nicht ausreichend abläuft. In einer bevorzugten weiteren Ausgestaltung sieht die Erfindung daher vor, dass die PCR in Gegenwart einer internen Amplifikations- kontrolle durchgeführt wird.
Geeignete Amplifikationskontrollen können dabei beliebige Target-DNA- Sequenzen (Kontroll-DNA) sein, die sich mit entsprechend designten Primern standardisiert und reproduzierbar unter ähnlichen Bedingungen wie die ATPase 8 Untereinheit Sequenzen amplifizieren lassen.
Besonders bevorzugt wird die interne Amplifikationskontrolle im gleichen Ansatz durchgeführt, in dem auch der Nachweis der linderspezifischen Sequenz erfolgt.
Als Kontroll-DNA wird im Rahmen der Erfindung bevorzugt PuC 19 Plasmid- DNA eingesetzt. Einzelheiten zu diesem Plasmid, insbesondere zu der Sequenz sind z.B. von "Yanisch-Perron et al." in "Gene 33(1), 103-119 (1985)" veröffentlicht worden. PuC 19 kann unter der Nr. ATCC 37254/L09137 oder bei New England Biolabs (Kat. Nr. N3041S) bezogen werden.
Geeignete Kontroll-Primer, die PuC 19 erkennen, können z.B. die folgenden Sequenzen aufweisen:
SEQIDNO4: 5' CGGAGA CGGTCA CAGCT 3' SEQIDNO 5: 5' TTGCAT GCC TGC AGGT 3'
Die genannten Primer hybridisieren mit den Abschnitten 49 -65 (SEQ ID NO 4) beziehungsweise 433-448 (SEQ ID NO 5) der genannten PuC19Plasmid-DNA. Einzelheiten der eingesetzten Primer sind in der folgenden Tabelle 2 zusammen- gefasst:
Tabelle 2:
Zielsequenz Oligonucleotide Sequenz (5i- 3ι) Position Amplikon (bp)
PuC19 plasmid DNA PuC 19fw (SEQ ID CGG AGA CGG TCA CAG CT 49-65 400
(accession: L09137) NO 4)
PuC19rv (SEQ ID TTG CAT GCC TGC AGG T 433-448
NO 5) Das erfindungsgemäße Verfahren kann eine konventionelle PCR mittels anschließender Auswertung im Gel verwenden.
Bevorzugt ist jedoch vorgesehen, dass die Aufarbeitung des DNA-Extrakts mittels Realtime PCR erfolgt.
Realtime-PCR- Verfahren sind seit längerem bekannt und unterscheiden sich im wesentlichen von konventionellen PCR- Verfahren dadurch, dass in dem PCR- Ansatz zusätzlich Sonden enthalten sind, die ein mit der Zunahme von amplifi- zierter DNA korreliertes, sich veränderndes Signal erzeugen. Weiterhin weist die eingesetzte PCR- Apparatur (Cycler) eine Messeinrichtung auf, die die erzeugten Signale während der PCR in den Ansätzen erfasst, so dass unmittelbar, d.h. noch während der Messung festgestellt werden kann, ob eine Amplifikation der Target-Sequenz stattgefunden hat.
Für Realtime-PCR geeignete Sonden- und Cyclersysteme mit entsprechenden Messeinrichtungen werden von unterschiedlichen, dem Fachmann bekannten Herstellern angeboten.
Besonders bevorzugt werden im Rahmen der Erfindung zum Nachweis der während der PCR erzeugten Amplifikate spezifische Sonden eingesetzt, die gezielt ein Signal nur bei Amplifikation von bovinen Sequenzen und/oder der internen Kontroll-DNA-Sequenz erzeugen. Es versteht sich, dass die erzeugten Signale bei gleichzeitiger Aufarbeitung der Amplifikationskontrolle in einem gemeinsamen Ansatz von den bei Amplifikation der bovinen Sequenz erzeugten Signalen differenzierbar sein müssen, was durch entsprechende Markerwahl kein Problem darstellt. Spezifische Sonden weisen in der Regel einen DNA-Abschnitt auf, der so gewählt ist, das er spezifisch mit einem Abschnitt der Target-DNA hybridisieren kann. An den DNA- Abschnitt ist ein Marker oder ein Markersystem gekoppelt, welche bei Hybridisierung ein anderes Signal erzeugen als im nichthybridisierten Zustand. Geeignete Sonden sind in der Fachwelt z.B. unter dem Begriff "TAQMAN-Sonden" bekannt geworden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird besonders bevorzugt ein anderes, das sogenannte "Light-Cycler System" von "Roche-Diagnostics" eingesetzt. Dieses System arbeitet mit 2 Sonden pro Target, die beide mit benachbarten Bereichen der Target-Sequenz hybridisieren. Die eine Sonde ist mit Fluorescein markiert, die andere mit einem Fluoreszenzfarbstoff, z.B. LC-Red-705 oder LC-Red-640 (Roche-Diagnostics). Bei räumlicher Nähe, die sich nach Hybridisierung der beiden Sonden an der Target-DNA einstellt, kann das Fluorescein die Fluoreszenzfarbstoffe aktivieren, die dann ein Signal mit den jeweils angegebenen Wellenlängen 705 nm oder 640 nm erzeugen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren haben sich bovine Sonden mit den folgenden Sequenzen als besonders geeignet gezeigt:
SEQ ID NO 6 (BovSP-3'Fluo): 5'CAT CTT TCA ACT AAA AGT TTC AAA ACA CAA CT 3'und
SEQ ID NO 7 (BovSP-5'LC Red 640): 5'TAT CAC AAT CCA GAA CTG ACA CCA AC 3'
Als interne Amplifikationskontrolle wird besonders bevorzugt eine Kontroll- DNA eingesetzt, die mit denselben Primern wie die ATPase 8 Untereinheit aufgearbeitet werden kann. Eine in diesem Zusammenhang geeignete Kontroll-DNA kann z.B. folgende Sequenz aufweisen:
SEQ ID NO 8: AT GATCTTATCA ATATTCTTGA CCCTTTTTAT CATCTTTCAA CTAAAAGTTT CAAAACACAA CTTT CAGGGT
TTTCCCAGTCACGAC CAAAAATATTA AAACAAAACA CCCCTTGA
Die gezeigte Sequenz (SEQ ID NO 8) entspricht der Region 34-153 der bovinen ATPase Sequenz (SEQ ID NO 1), wobei der Abschnitt 67-90 in SEQ ID NO 8 ersetzt wurde durch ein 21 bp großes Fragment, das der Region 355-375 des puC19 Plasmids entspricht.
Der wesentliche Vorteil bei der Verwendung der beschriebenen Kontroll-DNA gemäß SEQ ID NO 8 besteht darin, dass eine Amplifizierung mit denselben Primern erfolgen kann wie für die bovine Sequenz, wodurch nicht nur eine grundsätzliche PCR-Kontrolle sondern zusätzlich auch eine Primer-Kontrolle gegeben ist.
Wird als interne Amplifikationskontrolle die oben beschriebene Kontroll-DNA gemäß SEQ ID 8 eingesetzt, so ergibt sich als weiterer Vorteil, dass nur eine an das PuC19-Insert bindende Kontroll-Sonde erforderlich ist, die ihrerseits mit der bovinen Sonde gemäß SEQ ID NO 6 (BovSP-3'Fluo) zusammenwirkt.
Diese Kontroll-Sonde hat in einer bevorzugten Ausgestaltung eine Sequenz gemäß:
SEQ ID NO 9 (PuC 19-5'LC Red 705): 5' CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3'
Einzelheiten der erwähnten Sonden sind in Tabelle 3 zusammengefasst: Tabelle 3:
Zielsequenz Sonden Oligonucleoti- Sequenz (5i- 30 Position de
ATPase 8 Unterein- BovSp-3"Fluo (SEQ ID CATCTTTCAACTAAAAGTTTCAAAAC 7831- heit NO 6) ACAACT 7862
ATPase 8 Unterein- BovSp-5"LC Red 640 TATCACAATCCAGAACTGACACCAAC 7865- heit (SEQ ID NO 7) 7890
SEQ ID NO 5 PuClQ-S1LC Red 705 CAGGGTTTTCCCAGTCACGAC (SEQ ID NO 8)
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit, in dem die zur Durchführung des Verfahrens erforderlichen Reagenzien enthalten sind.
Der erfindungsgemäße Kit enthält mindestens Reagenzien zur Gewinnung eines DNA-Extrakts aus Probematerial, und Reagenzien zur Durchführung einer PCR, insbesondere einer Realtime PCR, enthaltend ein für eine bovine Sequenz spezifisches Primerpaar, eine interne Amplifikationskontrolle sowie mit der bovinen Sequenz und der internen Amplifikationskontrolle hybridisierende Sonden, die jeweils unterschiedliche detektierbare Marker aufweisen.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden.
Beispiel 1
Probenbehandlung und DNA-Extraktion unter Verwendung des "Qiagen tissue extraction kits" (Qiagen AG, Schweiz)
Gelatineproben mit jeweils einem Gewicht von 500 mg wurden in einem Ryboly- ser (Hybaid, Ashford) in Gegenwart von 1 ml des in dem Kit enthaltenen Lysis- Puffers und 60μl Proteinase K homogenisiert (ό.Smsec 1 für 45s) und dann 30 min bei 70C° und 15 min bei 90C° inkubiert. Die genomische DNA wurde dann wie in dem Kit-Protokoll vorgeschrieben mit der vorgesehenen Säule aufgerei- nigt. Die DNA Templates wurden dann mit lOOμl des Elutionspuffers (Kit) ausgewaschen. 5μl Aliquots wurden anschließend in die PCR eingesetzt.
Beispiel 2 PCR Konditionen:
Die Realtime PCR wurde in 20 μl Glaskapillaren mittels Light Cycler 2.0 Instrument (Roche Diagnostics) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch besteht aus QuantiTect PCR Master Mix (Qiagen), 0,5μM von jedem Primer (Fpc F2/SEQ NO ID 1, Fpc R/SEQ NO ID 2), 0,2μM von jeder Sonde (BovSP-3'Fluo, BovSP- 5'LC Red 640, ρuC19-5'LC Red 705) und 0,008 atomol der internen Amplifikati- onskontrolle (SEQ ID NO 5). Die Amplifikation startete mit einer initialen Vorinkubation bei 95°C für 20 Minuten, gefolgt von 55 Zyklen (95°C für 0s, 55°C für 30s und 72°C für 30s). Die Fluoreszenzmessung erfolgte während der Annea- ling-Phase bei 55C° bei 640nm (Kanal 4) für die bovine Sequenz und bei 705 nm (Kanal 6) für die Amplifikationskontrolle.
Beispiel 3
Gemäß obiger Beispiele wurde die DNA aus Gemischen (unterschiedliche mengenmäßige Anteile von Rindergelatine in Schweinegelatine) extrahiert und aufgereinigt und die jeweiligen DNA-Extrakte wurden mittels Realtime PCR aufgearbeitet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben.
Tabelle 4:
Hintergrund versetzt mit PCR LC-PCR
Gewebe Gelatine Gewebe Gelatine
Schwein Rind 0.01% 0.1% 0.0001% 0.001% Fisch Rind 0.01% 0.1% 0.0001% 0.001% Geflügel Rind 0.01% n/t1 0.0001% n/t2 n/t = nicht getestet Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich demzufolge mittels PCR bis zu 0,01% bovine Anteile in Geweben bzw. 0,1% in Gelatineproben nachweisen, die zusätzlich Schwein, Fisch oder Geflügel enthalten. Wird mittels LC-PCR gemessen, so steigt die Nachweisempfindlichkeit um einen Faktor 10.

Claims

Verfahren und Kit zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs.Patentansprüche:
1. Verfahren zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs, bei dem ein DNA-Extrakt aus einer Probe des Produkts gewonnen wird, der DNA-Extrakt mittels PCR aufgearbeitet wird, wobei die bei der PCR eingesetzten Primer so designt sind, dass sie eine bovinspezifische Sequenz mit einer Länge von weniger als 150 Nukleotiden erkennen, und geprüft wird, ob während der PCR mit den eingesetzten Primern eine Amplifikation stattgefunden hat.
2. Verfahren nach einem der Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Produkt um Gelatine handelt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Gewinnung des DNA-Extrakts die Probe homogenisiert, dann in Gegenwart eines Lysis-Puffers und/oder einer Proteinase, insbesondere Proteinase K, inkubiert und dann die enthaltene DNA extrahiert und aufgereinigt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion der DNA mittels alkoholischer Fällung erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion der DNA mittels einer DNA-bindenden Säule erfolgt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die von den Primern erkannte bovinspezifische Sequenz mehrfach in dem Genom oder der mitochondrialen DNA vorkommt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer Sequenzabschnitte erkennen, die spezifisch für ATPase 8 Untereinheit von Rindern sind.
8. Verfahren nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, dass die Primer- Sequenzen SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 2 entsprechen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR in Gegenwart einer internen Amplifikationskontrolle (Kontroll-DNA) durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid PuC 19 als Amplifikationskontrolle dient.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein in das Plasmid PuC 19 klonierter Sequenzabschnitt als Kontroll DNA dient.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontroll DNA so designt ist, dass sie von denselben Primern erkannt wird, die auch die bovine DNA erkennen
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontroll DNA eine Sequenz gemäß SEQ ID NO 5 aufweist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR in Gegenwart von Sonden durchgeführt wird, die Signale mit von der Menge an amplifizierter DNA abhängiger Stärke erzeugen, und die erzeugten Signale kontinuierlich oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der PCR gemessen werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Sonden eingesetzt werden, die einen mit bovinspezifische DNA-Sequenzabschnitte (bovine Sonden) und/oder Kontroll-DNA-Gensequenzen (Kontroll-Sonden) hybridisierenden DNA- Abschnitt aufweisen und einen mit dem DNA- Abschnitt gekoppelten Marker, der im hybridisierten Zustand des DNA-Abschnitts ein anderes Signal abgibt als im nicht hybridisierten Zustand.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass zwei bovine Sonden mit zusammenwirkenden Markern eingesetzt werden, die bei benachbarter Hybridisierung an der bovinspezifischen Sequenz ein Signal erzeugen.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA- Abschnitte der beiden bovinspezifischen Sonden Sequenzen gemäß SEQ ID NO 6 und SEQ ID NO 7 aufweisen.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Kontroll-Sonden mit zusammenwirkenden Markern eingesetzt werden, die bei benachbarter Hybridisierung an der Kontroll-DNA ein Signal erzeugen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine der Kontrollsonden mit einer der bovinen Sonden identisch ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der DNA- Abschnitt der anderen Kontrollsonde eine Sequenz gemäß SEQ ID NO 8 aufweist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15-20, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den DNA- Abschnitten gekoppelten Marker von bovinen Sonden und die von Kontroll-Sonden voneinander differenzierbare Signale erzeugen.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den DNA- Abschnitten gekoppelten Marker Fluoreszenzfarbstoffe sind.
23. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, mit
Reagenzien zur Gewinnung eines DNA-Extrakts aus Proben, und Reagenzien zur Durchführung einer PCR, insbesondere einer Realtime PCR, enthaltend ein für eine bovine Sequenz spezifisches Primerpaar, eine interne Amplifikationskontrolle sowie mit der bovinen Sequenz und der internen Amplifikationskontrolle hybridisierende Sonden, die jeweils unterschiedliche detektierbare Marker aufweisen.
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