WO2007034603A1 - 悪性脳腫瘍マーカー遺伝子およびその用途 - Google Patents

悪性脳腫瘍マーカー遺伝子およびその用途 Download PDF

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protein
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Ryuya Yamanaka
Kazuto Nishio
Masaru Sekijima
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a marker gene that serves as an index of malignant brain tumor and use thereof.
  • Tumor cells proliferate out of order due to their own genetic abnormalities and lose their order, and therapies are primarily selected based on the molecular biological characteristics of these cells. Ideal. Even though the pathological characteristics of tumor cells are the same, their developmental forms, treatment sensitivity, and prognosis are very different, which is a major problem often encountered in daily clinical practice.
  • genetic abnormalities in tumor cells are related to abnormalities in multiple genes. Is essential.
  • the microarray method is an approach that simultaneously captures a large amount of changes in the transcription level of tumor cells, and can be applied to the diagnosis of individual tumor cells, sensitivity to treatment, resistance to drugs, prediction of side effects, identification of new target molecules, etc. . So far, molecular expression profiles using microarrays have been used to obtain molecular markers useful for therapeutic selection in various human cancer types. Examination of gene expression profiles using microarray technology has confirmed that many genes are differentially expressed in tumor histological types and grades.
  • Non-Patent Document 1 Freije WA, Castro- Vargas FE, Fang Z, Horvath S, Loughesy T, Liau
  • Non-Patent Document 2 Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, Kuick R, Blaivas M, Kurnit DM,
  • Non-Patent Document 3 Sallinen SL, SallinenPK, Haapasalo HK, Helin HJ, Helen PT, Schraml P, KallioniemiOP, Kononen J. Cancer Res. 2000 Dec 1; 60 (23): 6617—22.
  • Non-Patent Document 4 Kim S, Dougherty ER, Shmulevich I, Hess KR, Hamilton SR, Trent J
  • Non-Patent Document 5 van den Boom J, Wolter M, Kuick R, Misek DE, Youkilis AS, Wechsle r DS, Sommer C, Reifenberger G, Hanash SM. Am J Pathol. 2003 Sep; 163 (3): 1033-
  • the search for new molecular targets for malignant brain tumors is expected to be developed by the microarray method, which is a systematic gene expression information analysis.
  • the results are expected to be applied to the development of new treatments and diagnostics for malignant brain tumors.
  • the present invention has been made in view of the circumstances as described above, and aims to provide a marker gene that serves as an index of malignant brain tumor for the development of a new therapeutic method and diagnostics, and its use. To do.
  • EAS guanyl releasing protein ⁇ (calcium 3 2 0 so-called -005825 and DAG-regul ated)
  • KIAA0537 gene product (AMP-auctivated 5 2 2 so-called —014840 protein kinase family member 5)
  • KIAA0449 protein (kinesin family member 1 2 2 9 ⁇ _371332 ⁇ 1 ⁇ )
  • sperm associated antigen 7 1 4 3 1 ⁇ _004890 spermine s nthase 1 5 3 2 ⁇ —004595
  • the present invention is as follows.
  • Claim 1 of the present invention is a brain tumor marker gene characterized by having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 17.
  • Claim 2 of the present invention is a probe for detecting a brain tumor marker gene, characterized in that it has a base sequence that is noblyzed under stringent conditions with any one of the brain tumor marker genes of claim 1. It is.
  • Claim 3 of the present invention is a primer for detecting a continuous brain tumor marker gene having a length of 15 to 30 bases for specifically amplifying any one of the brain tumor marker genes of claim 1. is there.
  • Claim 4 of the present invention is a DNA chip characterized in that at least one of the probe for detecting a brain tumor marker gene according to claim 2 is immobilized.
  • Claim 5 of the present invention is a method for diagnosing malignant brain tumor, comprising the following steps (a) and (b): (a) A biological sample prepared from a subject. A step of measuring the expression level of at least one brain tumor marker gene of the brain tumor marker single gene according to claim 1, in the RNA or complementary polynucleotide in which the RNA force is also transcribed, and (b) the expression level is healthy. A process of diagnosing a malignant brain tumor in a large number of subjects as compared to that of.
  • Claim 6 of the present invention comprises a substance that suppresses the expression of a brain tumor marker gene according to claim 1 characterized in that it comprises the following steps (a), (b), and (c): Screening method: (a) express at least one of the test substance and the brain tumor marker gene according to claim 1! (B) contacting the cells to be injured, (b) measuring the expression level of the brain tumor marker gene in the cells in contact with the test substance and not contacting the test substance! / Corresponding to the above in the control cells A step of comparing with the expression level of the brain tumor marker gene, (c) selecting a test substance that decreases the expression level of the brain tumor marker gene based on the comparison result of (b) above.
  • Claim 7 of the present invention is a diagnostic kit for a malignant brain tumor, comprising at least one or more selected from the group forces consisting of the following (a) to (c). (A) at least one probe for detecting a brain tumor marker gene according to claim 2, (b) at least one primer for detecting a brain tumor marker gene according to claim 3, (c) according to claim 4. DNA chip.
  • Claim 8 of the present invention is a brain tumor marker protein comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 18 to 34.
  • Claim 9 of the present invention is an antibody for detecting a brain tumor marker protein, characterized by specifically recognizing any one of the brain tumor marker proteins of claim 8.
  • Claim 10 of the present invention is a protein chip characterized in that at least one antibody for detecting a brain tumor marker protein selected also for the antibody for detecting a brain tumor marker protein according to claim 9 is immobilized. is there.
  • Claim 11 of the present invention is a method for diagnosing malignant brain tumor, comprising the following steps (a) and (b): (a) in a protein prepared from a biological sample of a subject. A step of measuring the expression level of at least one brain tumor marker protein of the brain tumor marker protein according to claim 8, and (b) diagnosing a subject having a higher expression level than that of a healthy subject as a malignant brain tumor.
  • Claim 12 of the present invention comprises the following steps (a), (b), and (c): A screen of a substance that suppresses the expression of a brain tumor marker protein according to claim 8 -A method of: (a) contacting the test substance with a cell expressing at least one of the brain tumor marker proteins according to claim 8, (b) the brain tumor in the cell contacted with the test substance Measuring the expression level of the marker protein and comparing it with the expression level of the brain tumor marker protein corresponding to the above in the control cells not contacted with the test substance, (c) based on the comparison result in (b) above, And selecting a test substance that reduces the expression level of the brain tumor marker protein.
  • Claim 13 of the present invention is a diagnostic kit for a malignant brain tumor, comprising at least one or more selected from the group forces consisting of the following (a) to (b): (a) The protein chip according to claim 10, wherein at least one of the antibodies for detecting a brain tumor marker protein according to claim 9, and (b).
  • the invention's effect is not limited to: (a) The protein chip according to claim 10, wherein at least one of the antibodies for detecting a brain tumor marker protein according to claim 9, and (b).
  • a brain tumor marker gene serving as a tumor marker for malignant brain tumor is provided.
  • various molecular biological materials related to this brain tumor marker gene are provided.
  • drug discovery such as a novel anticancer agent.
  • Detection for brain tumor marker gene For example, a brain tumor marker gene can be detected and a brain tumor can be diagnosed widely and reliably. It is also possible to screen for substances that suppress brain tumors and advance the development of new anticancer agents.
  • FIG. 1 shows the results of immunohistological analysis of protein level expression of selected genes in glioma tissue.
  • FIG. 2 is a graph showing a correlation between protein expression level and patient survival time.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of analysis of cell proliferation using Tetm cororone after introduction of siRNA for each gene into a Dario cell line.
  • FIG. 4 shows the results of introducing siRNA for each gene into a Dario cell line and analyzing the expression level of each gene by quantitative PCR.
  • the “brain tumor” of the present invention refers to all tumors that develop in the cranium.
  • a typical one with a high incidence is glioma, which further includes astrocytoma, glioblastoma and the like.
  • Other brain tumors include pituitary adenomas and schwannomas.
  • the “gene” in the present invention includes DNA and RNA.
  • DNA includes, for example, cDNA genomic DNA obtained by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof.
  • Single-stranded DNA which may be double-stranded or single-stranded, may be a coding DNA that is a sense strand or an anti-coding strand that is an antisense strand.
  • the "polynucleotide” in the present specification is used to include RNA and DNA!
  • the DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • the above RNA includes total RNA, mRNA, rRNA and synthetic RNA!
  • the brain tumor marker gene of the present invention refers to a gene that is hardly expressed at all in benign brain tumors or normal brain tissues and is highly expressed only in malignant brain tumors.
  • the brain tumor marker gene of the present invention is characterized by having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 17.
  • the gene accession numbers shown in Table 1 can be used in the NCBI gene database.
  • the brain tumor marker gene of the present invention can be obtained by a known genetic manipulation technique.
  • the probe for detecting a brain tumor marker gene of the present invention is any one of SEQ ID NOs: 1 to 17.
  • the selected partial sequence may be any portion, but is characterized in that it is a nucleotide sequence that is hybridized with or without stringent conditions with a brain tumor marker gene.
  • the brain tumor marker gene detection probe may be labeled with a radiolabel, a fluorescent label, or the like.
  • the probe for detecting a brain tumor marker gene can be DNA or RNA complementary to the selected sequence based on the selected partial sequence. For example, by preparing a DNA probe of an appropriate length from the nucleotide sequence of the brain tumor marker gene of the present invention, appropriately attaching a label such as a fluorescent label, and hybridizing it with a subject, the brain tumor marker gene To detect brain tumors.
  • the conditions for "nobbling with a brain tumor marker gene under stringent conditions" are, for example, 42 ° C. And 1 X SSC (0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate), wash at 42 ° C with a buffer containing 0.1% SDS. More preferably, a washing treatment at 65 ° C with a buffer solution containing hybridization at 65 ° C and 0.1 X SSC, 0.1% SDS can be mentioned.
  • the primer for detecting a brain tumor marker gene of the present invention specifically amplifies any one of the brain tumor marker genes having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 17. This is a primer for detecting a continuous brain tumor marker gene having a length of 15 to 30 nucleotides.
  • the target brain tumor marker gene can be amplified based on a known method such as PCR.
  • Primers can be easily designed and amplified by conventional methods such as using commercially available primer design software based on the nucleotide sequence (SEQ ID NOs: 1 to 17) of the brain tumor marker gene of the present invention.
  • the primer may be labeled with an appropriate label (for example, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, etc.), or may be modified with piotin, phosphate, amine, or the like.
  • the DNA chip of the present invention is capable of detecting a brain tumor marker gene having a nucleotide sequence that is hybridized under stringent conditions with any one of the brain tumor marker genes having any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 17. It is characterized in that at least one probe for use is immobilized.
  • a method for producing a DNA chip is known to those skilled in the art. By using a DNA chip, the expression level of the brain tumor marker gene of the present invention can be detected and measured.
  • the method for diagnosing malignant brain tumor of the present invention comprises the following steps (a) and (b): (a) RNA prepared from a biological sample of a subject or the RNA cartridge Measuring the expression level of at least one brain tumor marker gene of the brain tumor marker gene having the base sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 17 in a complementary polynucleotide transcribed from (b) the expression level The process of diagnosing malignant brain tumors in many subjects compared to that of healthy individuals.
  • a "subject” is a patient who has been diagnosed as suspected of having a brain tumor, for example, by MRI examination, and the "biological sample” is a patient. It is the excised tissue or blood from the brain.
  • the biological sample to be evaluated can be any sample containing a marker gene.
  • RNA can be prepared from a biological sample from a patient's brain according to a conventional method.
  • a complementary polynucleotide transcribed from the RNA can be prepared from a tissue excised from the patient's brain or blood according to a conventional method. For example, cDNA is synthesized and PCR amplified using mRNA isolated from the subject's cell strength as a cage.
  • the malignant brain tumor diagnosis method of the present invention is carried out by detecting and measuring the expression level of any of the brain tumor marker genes of the present invention in the biological sample.
  • the base according to any one of SEQ ID NOS: 1 to 17 in the biological sample of the subject based on the expression level of the brain tumor marker gene having the base sequence described in any one of SEQ ID NOS: 1 to 17 in the biological sample of a healthy person If the expression level of the brain tumor marker gene having the sequence is higher than the above criteria, a malignant brain tumor is determined.
  • the detection method of the present invention includes the expression level of the brain tumor marker gene by a known method such as RT-PCR, Northern blotting, DNA microarray analysis, in situ hybridization analysis, etc. Measure.
  • the probe for detecting a brain tumor marker gene or the primer for detecting a brain tumor marker gene of the present invention can be used as appropriate.
  • a screening method for a substance that suppresses the expression of a brain tumor marker gene having any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 17 of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c): (A) contacting a test substance with a cell expressing at least one of the brain tumor marker genes having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 17, (b) ) Measuring the expression level of the brain tumor marker gene in the cells contacted with the test substance, and comparing the expression level of the brain tumor marker gene corresponding to the above in the control cells without contact with the test substance; (C) A step of selecting a test substance that decreases the expression level of the brain tumor marker gene based on the comparison result of (b) above.
  • the screening method for a substance that suppresses the expression of a brain tumor marker gene of the present invention provides a candidate substance that suppresses a malignant brain tumor by searching for a substance that decreases the expression level of the brain tumor marker gene. .
  • Examples of cells used in the screening of the present invention include all cultured cells that express a brain tumor marker gene having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 17. Whether or not these brain tumor marker genes are expressed in cultured cells can be easily confirmed by detecting them by a known Western plot method or the like. Specifically, for example, a living tissue or blood cell-derived cell isolated or prepared from a cancer patient, or the brain tumor marker gene of the present invention was introduced as a cultured cell. A cell etc. can be mentioned.
  • the conditions for bringing the test substance into contact with the cells are not particularly limited, but the culture conditions (temperature, pH) in which the cells do not die and can express the brain tumor marker gene of the present invention. It is preferable to select a medium composition).
  • Cell force RNA expressing at least one of the brain tumor marker genes is prepared, and the brain tumor marker gene is measured.
  • a transcribed complementary polynucleotide transcribed from the RNA cartridge may be prepared to measure the brain tumor marker gene.
  • the expression level of the brain tumor marker gene is measured by a known method such as RT-PCR method, Northern blot method, DNA microarray analysis method, in situ hybridization analysis method.
  • the probe for detecting a brain tumor marker gene or the primer for detecting a brain tumor marker gene of the present invention can be used as appropriate. Use the DNA chip of the present invention.
  • the diagnostic kit for malignant brain tumor of the present invention is characterized by comprising at least one or more of the following (a) to (c) force group force: (a) SEQ ID NOs: 1 to 17 At least one of the probes for detecting a brain tumor marker gene having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with any one of the brain tumor marker genes having the base sequence described in any one of the above, (b) SEQ ID NOs: 1 to 17 Any one of the brain tumor marker genes having a nucleotide sequence according to any one of the above, wherein at least one of the primers for detecting a continuous brain tumor gene having a length of 15 to 30 bases, c) A probe for detecting a brain tumor marker gene having a nucleotide sequence that is hybridized under stringent conditions with any one of the brain tumor marker genes having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 17 A DNA chip with at least one of them immobilized.
  • the brain tumor marker protein of the present invention refers to a protein that is hardly or not expressed in benign brain tumors or normal brain tissues and is highly expressed only in malignant brain tumors.
  • the brain tumor marker protein of the present invention is characterized by having a polypeptide consisting of the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 18 to 34. Moreover, it can be approached by Gene Accession Number in Table 1 in NCBI gene database.
  • the antibody for detecting a brain tumor marker protein of the present invention specifically recognizes any one of the brain tumor marker proteins having a polypeptide having an amino acid sequence ability described in any one of SEQ ID NOs: 18 to 34, And Since the antibody for detecting brain tumor marker protein of the present invention has a property of specifically binding to the brain tumor marker protein, the brain tumor marker protein expressed in the tissue of a subject by using the antibody for detecting brain tumor marker protein is used. Can be detected specifically
  • the method for producing an antibody is known, and the antibody for detecting a brain tumor marker protein of the present invention can also be produced according to a conventional method.
  • the antibody for detecting a brain tumor marker protein of the present invention is a polyclonal antibody
  • the brain tumor marker protein of the present invention expressed and purified in Escherichia coli or the like according to a conventional method, or according to a conventional method.
  • the oligopeptide having the partial amino acid sequence of the brain tumor marker protein of the invention can be synthesized to immunize non-human animals such as rabbits and obtained from the sera of the immunized animals according to a conventional method.
  • a monoclonal antibody it is obtained by immunizing a non-human animal such as a mouse with the brain tumor marker protein of the present invention or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the protein expressed and purified in Escherichia coli according to a conventional method.
  • the obtained spleen cells and myeloma cells can be obtained from the cells prepared from cell fusion of the spleen cells and myeloma cells.
  • the antibody may be labeled with an appropriate label (for example, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, etc.), or may be appropriately modified with piotin or the like!
  • a brain tumor marker protein used as an immunizing antigen for producing an antibody for detecting a brain tumor marker protein is a DNA cloning based on the sequence information (SEQ ID NOs: 1 to 17) of the gene provided by the present invention, It can be obtained by constructing each plasmid, transfection into the host, culturing the transformant and recovering the protein from the culture. These operations can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • the protein chip of the present invention is an antibody for detecting a brain tumor marker protein that specifically recognizes any one of brain tumor marker proteins having a polypeptide having the amino acid sequence strength described in any one of SEQ ID NOs: 18 to 34. It is characterized by fixing at least one or more. Methods for producing protein chips are known to those skilled in the art. [0047]
  • the method for diagnosing malignant brain tumor of the present invention is characterized by comprising the following steps (a) and (b): (a) SEQ ID NOs: 18 to 34 in a protein whose biological sample force of a subject is also adjusted.
  • a step of measuring the expression level of at least one brain tumor marker protein of the brain tumor marker protein having a polypeptide having an amino acid sequence ability according to any one of (1), and (b) the expression level is higher than that of a healthy subject The process of diagnosing many subjects with malignant brain tumors.
  • a "subject” is a patient who is diagnosed as having a suspected brain tumor by, for example, MRI examination, and the "biological sample” is a patient. It is the excised tissue or blood from the brain. Proteins can also be prepared from biological specimens from excised tissues from the patient's brain or blood according to conventional methods.
  • the malignant brain tumor diagnosis method of the present invention is carried out by detecting and measuring the expression level of any of the brain tumor marker proteins in the biological sample. Based on the expression level of the brain tumor marker protein having the base sequence described in any one of SEQ ID NOS: 1 to 17 in a healthy subject's biological sample, the base sequence described in any one of SEQ ID NOS: 1 to 17 in the subject's biological sample is used. If the expression level of the brain tumor marker protein possessed is higher than the above criteria, a malignant brain tumor is determined. Specifically, a part of a patient's tissue is collected based on a known method, and the protein is prepared according to a conventional method.
  • the expression level of the brain tumor marker protein can be detected based on a known detection method such as Western blotting, ELISA, or fluorescent antibody method.
  • a known detection method such as Western blotting, ELISA, or fluorescent antibody method.
  • the above-mentioned antibody for detecting brain tumor protein can be appropriately used.
  • the expression level of the brain tumor marker protein may be detected by using the protein chip.
  • a screening method for a substance that suppresses the expression of a brain tumor marker protein having a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 to 34 of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c) comprising: (a) a test substance and a cell expressing at least one of brain tumor marker proteins having a polypeptide having an amino acid sequence ability according to any one of SEQ ID NOs: 18 to 34; (B) measuring the expression level of the brain tumor marker protein in the cell contacted with the test substance, and comparing it with the expression level of the corresponding brain tumor marker protein in the control cell not contacted with the test substance Step (c) Based on the comparison result of (b) above, brain tumor marker protein Selecting a test substance that reduces the expression level of the quality.
  • the screening method for a substance that suppresses the expression of a brain tumor marker protein of the present invention provides a candidate substance that suppresses a malignant brain tumor by searching for a substance that decreases the expression level of the brain tumor marker protein.
  • Examples of the cells used in the screening of the present invention include all cultured cells that express a brain tumor marker protein having a polypeptide having an amino acid sequence ability described in any one of SEQ ID NOs: 18 to 34. Whether or not these brain tumor marker proteins are expressed in cultured cells can be easily confirmed by detecting them by a known Western plot method or the like. Specific examples of the cultured cells include cells derived from living tissue or blood cells isolated and prepared from cancer patients, or cells into which the brain tumor marker gene of the present invention has been introduced.
  • the conditions for bringing the test substance into contact with the cells are not particularly limited, but the culture conditions (temperature, pH) in which the cells do not die and can express the brain tumor marker protein of the present invention. It is preferable to select a medium composition).
  • a cell force protein that expresses at least one of the brain tumor marker proteins is prepared and a brain tumor marker gene is measured.
  • the expression level of the brain tumor marker gene is measured by a known method such as a Western plot method, an ELISA method, or a protein microarray analysis method.
  • the above-mentioned antibody for detecting brain tumor marker protein can be appropriately used.
  • the expression level of brain tumor marker protein may be detected by using the protein chip.
  • the diagnostic kit for malignant brain tumor of the present invention comprises at least one or more of the following (a) to (b) selected group powers: (a) SEQ ID NOs: 18 to 34 At least one of the antibodies for detecting a brain tumor marker protein that specifically recognizes any one of the brain tumor marker proteins having a polypeptide comprising the amino acid sequence according to any one of the above, (b) any one of SEQ ID NOs: 18 to 34 A brain tumor marker protein detection antibody that specifically recognizes any one of the brain tumor marker proteins having a polypeptide having the amino acid sequence ability described in 1 was immobilized. Protein chip. Configure the diagnostic kit for malignant brain tumor (a)-(b) as above By using it, a malignant brain tumor can be diagnosed.
  • the subjects were 52 gliomas (WHO gra dell: 16 cases, ⁇ : 14 cases, IV: 22 cases) that were surgically removed at Niigata University Brain Research Institute.
  • High-grade patients were treated with radiation therapy (local tumor 40Gy, irradiation 20Gy) and physiologic therapy centered on Trosourea.
  • the survival period was defined as the patient's death date or the last visit date from the date of diagnosis. Histological diagnosis was based on WHO brain tumor histology.
  • the experiments described in this specification obtained informed consent from all target patients in accordance with the rules of the Niigata University Ethics Committee.
  • RNA quality was measured by rRNA ratio [28sZl8s] using Bioanalyzer 2100 (Agilent). The purified total RNA was stored in 70% ethanol at -80 ° C until use.
  • Each mRNA of eclampsia tissue was from clontech.
  • cDNA was synthesized using an agilent fluorescent direct label kit. Using 10 g of purified total RNA and oligo dT primer with ⁇ 7 promoter sequence, 1.25 ImM FluoroLink dCTP (Cy3-dCTP or Cy5-dCTP), 2 After reacting with 00 units of SuperScriptll reverse transcriptase for 1 hour at 42 ° C to synthesize the first strand cDNA, the second strand cDNA was synthesized, extracted with phenol Z chloroform, and purified with Phase Loc gel. Tumor RNA was labeled with Cy5, and normal brain tissue RNA was labeled with Cy3. The obtained cDNA was recovered by ethanol precipitation and stored at -80 ° C in 70% ethanol until use.
  • the gene expression of the primary cancer of brain tumor patients was tested using an agilent microarray. Hybridization is in 25 1 solution containing 2X Deposition Control Buffer 12.51, Cot-1 DNA 2.51, nuclease-free water 7.5; zl, cDNA 2.51. At 65 ° C for 17 hours. After washing the chip with 0.5% SSC / 0.1% SDS solution, the fluorescence intensity of each pixel is measured with an HP laser scanner, imaged, and further, each gene is detected in tumor tissue against normal brain tissue. Numerical values were calculated for the expression ratio. This experiment measured the expression of approximately 12729 genes in human brain tumor patients.
  • PTTGl pituitary tumor-transforming l
  • RAS guanylreleasing protein 2 calcium and DAG-
  • the target cases were examined. 5 micron sections were prepared, and after deparaffinization, they were heated in 121 mM sodium citrate (pH 6.0) at 121 ° C. for 10 minutes. 0. 3% H O
  • Washed Avidin-biotin-peroxidase system (Vectasm elite AB kit, VectorLabs, Burlingame, CA) reacted, 0.01% 3,3-Diamaminobenzidine (DAB) (Sigma) and PBS 0.1% Color was developed with hydrogen peroxide.
  • DAB 3,3-Diamaminobenzidine
  • siRNAs for each gene were from AMBION and QIAGEN.
  • KIF3C ID # 11118; PTTG, ID # 41900; ARK5, ID # 964; STAC, ID # 12720; RASGRP2, ID # 16857 (both AMBION), and s iRNA for KIF1C is YAMA-1 (sense: GGAGAAUCAGUACCGGAAA; Antisense: UU UCCGGUACUGAUUCUCC, QIAGEN) was used.
  • RNAiHuman / Mouse Control kit Qiagen was used for these transformations including non-silencing control, and experiments were performed according to the protocol.
  • PCR was performed at 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15 minutes, 55 ° C for 5 minutes, and 72 ° C for 10 minutes.
  • the reaction product passed through a post-PCR melting cycle, and the fluorescence intensity was measured at each cycle.
  • the following primers were used for PCR amplification.
  • KIFlC Hs01034140-gl.
  • KIF3C Hs00158482-ml: PTTGl, Hs00851754-gl,; ARK5, H s00934230— ml,
  • STAC Hs01070510— ml,
  • RASGRP2 Hs01057113— ml ,; (Applied Bio systems Japan Company).
  • the quantitative PCR method shows that by introducing siRNA, the expression of ARK5, RAS, PTTG1, STAC, KI F1C, and KIF3C mRNA can be suppressed to 20-30% compared to control siRNA. ( Figure 4).

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Abstract

悪性脳腫瘍の指標となるマーカー遺伝子およびその用途を提供する。配列番号１～１７のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子、配列番号１８～３４のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質、これらの発現を指標とする悪性脳腫瘍の診断方法、これらの発現を抑制する物質のスクリーニング方法、及びこれらを利用する悪性脳腫瘍の診断キット。

Description

悪性脳腫瘍マーカー遺伝子およびその用途
技術分野
[0001] 本発明は、悪性脳腫瘍の指標となるマーカー遺伝子およびその用途に関する。
背景技術
[0002] 腫瘍細胞は自己の遺伝子異常により厳密なプログラムが破綻し、秩序を失って増 殖するものであり、本来これらの細胞の分子生物学的特性に基づいて治療法が選択 されるのが理想である。腫瘍細胞の病理学的な特徴が同じでも、その進展形態、治 療に関する感受性、予後などが大きく異なることは、 日常臨床の場でしばしば遭遇す る大きな問題点である。一方、腫瘍細胞の遺伝子異常は複数の遺伝子の異常が関 与していることは言うまでもなぐそれぞれの腫瘍細胞の分子生物学的特長を把握す るには、多くの遺伝子の変化を同時に観察することが不可欠である。マイクロアレイ法 は腫瘍細胞の転写レベルでの変化を同時にかつ大量にとらえるアプローチであり、 腫瘍細胞の個性診断、治療に対する感受性、薬剤に対する耐性、副作用予測、新 規標的分子同定などに応用可能と考えられる。これまで、さまざまなヒト癌種において 、治療の選択を行うのに有用な分子マーカーを得るため、マイクロアレイを用いた分 子発現プロファイルが用いられてきた。マイクロアレイ技術を用いて遺伝子発現プロ ファイルを調べることにより、多くの遺伝子が腫瘍の組織学的な型およびグレードに お 、て、異なって発現されて 、ることが確認されて 、る。
[0003] 各癌種に対しては、このような包括的遺伝子発現情報をもとにした治療標的遺伝子 、マーカー遺伝子の選択は試みられているが、脳腫瘍に関して類似するような研究 はまだ少な ヽ (非特許文献 1〜5)。
非特許文献 1 : Freije WA, Castro- Vargas FE, Fang Z, Horvath S, し loughesy T, Liau
LM, Mischel PS, Nelson SF. Cancer Res. 2004 Sep 15;64(18):6503— 10.
非特許文献 2 : Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, Kuick R, Blaivas M, Kurnit DM,
Taylor J, Hanash SM. Cancer Res. 2001 Sep 15;61(18):6885— 91.
非特許文献 3 : Sallinen SL, SallinenPK, Haapasalo HK, Helin HJ, Helen PT, Schraml P, KallioniemiOP, Kononen J. Cancer Res. 2000 Dec 1;60(23):6617— 22.
非特許文献 4 : Kim S, Dougherty ER, Shmulevich I, Hess KR, Hamilton SR, Trent J
M, Fuller GN, Zhang W. Mol Cancer Ther. 2002 Nov; 1(13): 1229— 36.
非特許文献 5 : van den Boom J, Wolter M, Kuick R, Misek DE, Youkilis AS, Wechsle r DS, Sommer C, Reifenberger G, Hanash SM. Am J Pathol. 2003 Sep; 163(3): 1033-
43.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 治療法の未だに確立されて 、な 、悪性脳腫瘍に対する、新たなる分子標的の探索 は体系的遺伝子発現情報解析であるマイクロアレイ法により発展するものと期待され る。また、この成果は悪性脳腫瘍に対する新たな治療法、診断学の開発に応用され ることが期待される。本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、 新たな治療法、診断学の開発のために悪性脳腫瘍の指標となるマーカー遺伝子お よびその用途を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、良性神経膠腫と悪性神経膠腫の遺伝子プ 口ファイルを比較することにより、悪性神経膠腫のみに高発現する以下の表 1に示す
17の脳腫瘍遺伝子を同定して、本発明を完成するに至った。
[0006] [表 1]
遺伝子名 塩基 ァ ミ ノ Gene
m 配列 accession 番 番 num er
Hum soi mENA for stac, complete cds 1 1 8 謂—003149.1 pituitary tumor -transforming 1 (PTTGl) 2 1 9 ΝΜ_004Ξ19
EAS guanyl releasing protein Ξ (calcium 3 2 0 謂—005825 and DAG-regul ated)
LAA0561 protein ^microtubule 4 2 1 ΧΜ_038150 associated serine/ threonine kinase 3)
KIAA0537 gene product ( AMP-auctivated 5 2 2 謂—014840 protein kinase family member 5)
EphBS 6 2 3 謂—004445
EphA4 7 2 4 ΝΜ—004438
EphAS 8 2 5 匪—004439 kinesin fsonily member 1C (KIFIC) 9 2 ら 匪—006612 kinesin Ξ (60-7 OkD) 1 0 21 謂— 005552 kinesin fsonily member 30 (KIF3C) 1 1 28 謂—002254
KIAA0449 protein (kinesin family member 1 2 2 9 ΧΜ_371332 Ξ1Β)
serologically defined colon cancer antigen 1 3 3 〇 ΝΜ_006647 31
sperm associated antigen 7 1 4 3 1 ΝΜ_004890 spermine s nthase 1 5 3 2 匪—004595
Human mENA for endosialin protein 1 6 3 3 腿—020404
Hum soi EEGIG-53 mRNA 1 7 3 4 謂— 005570
[0007] 本発明は、以下の通りである。
[0008] 本発明の請求の範囲 1は、配列番号 1〜17のいずれ力 1記載の塩基配列を有する ことを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子である。 [0009] 本発明の請求の範囲 2は、請求の範囲 1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれ 力 1とストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズする塩基配列を有することを特徴とす る脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブである。
[0010] 本発明の請求の範囲 3は、請求の範囲 1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれ カゝ 1を特異的に増幅するための、 15〜30塩基長の連続した脳腫瘍マーカー遺伝子 検出用プライマーである。
[0011] 本発明の請求の範囲 4は、請求の範囲 2記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プロ ーブの少なくとも 1を固定ィ匕させたことを特徴とする DNAチップである。
[0012] 本発明の請求の範囲 5は、下記の工程 (a)及び (b)を含むことを特徴とする悪性脳 腫瘍の診断方法である：（a)被験者の生体試料カゝら調製された RNAまたは該 RNA 力も転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求の範囲 1記載の脳腫瘍マーカ 一遺伝子の少なくとも 1の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、（b)前 記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
[0013] 本発明の請求の範囲 6は、下記の工程 (a)、 （b)及び (c)を含むことを特徴とする請 求の範囲 1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方 法である：（a)被験物質と、請求の範囲 1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも 1 を発現して！/ヽる細胞とを接触させる工程、 (b)被験物質を接触させた細胞における前 記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させな!/ヽ対照細胞に おける上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、 (c)上記（ b)の比較結果に基づ!/、て、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質 を選択する工程。
[0014] 本発明の請求の範囲 7は、以下の（a)〜（c)からなる群力も選ばれる少なくとも 1以 上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キットである。： (a)請求の範囲 2記載の 脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも 1、 (b)請求の範囲 3記載の脳腫 瘍マーカー遺伝子検出用プライマーの少なくとも 1、 (c)請求の範囲 4記載の DNAチ ップ。
[0015] 本発明の請求の範囲 8は、配列番号 18〜34のいずれ力 1記載のアミノ酸配列から なるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質である。 [0016] 本発明の請求の範囲 9は、請求の範囲 8記載の脳腫瘍マーカータンパク質のいず れか 1を特異的に認識することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体 である。
[0017] 本発明の請求の範囲 10は、請求の範囲 9記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出 用抗体力も選択された少なくとも 1の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を固定 化させたことを特徴とするプロテインチップである。
[0018] 本発明の請求の範囲 11は、下記の工程 (a)及び (b)を含むことを特徴とする悪性 脳腫瘍の診断方法である：（a)被験者の生体試料から調製されるタンパク質における 、請求の範囲 8記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも 1の脳腫瘍マーカータ ンパク質の発現量を測定する工程、（b)前記発現量が健常者のそれと比較して多い 被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
[0019] 本発明の請求の範囲 12は、下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含むことを特徴とする 請求の範囲 8記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリー- ング方法である：（a)被験物質と、請求の範囲 8記載の脳腫瘍マーカータンパク質の 少なくとも 1を発現している細胞とを接触させる工程、（b)被験物質を接触させた細胞 における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させな い対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較す る工程、（c)上記 (b)の比較結果に基づ!、て、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を 減少させる被験物質を選択する工程。
[0020] 本発明の請求の範囲 13は、以下の（a)〜(b)からなる群力も選ばれる少なくとも 1 以上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キットである：（a)請求の範囲 9記載 の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも 1、（b)請求の範囲 10記載の プロテインチップ。 発明の効果
[0021] 本発明によれば、悪性脳腫瘍に対する腫瘍マーカーとなる脳腫瘍マーカー遺伝子 が提供される。また、この脳腫瘍マーカー遺伝子に関わる各種の分子生物学的材料 が提供され、これらを使用すること〖こよって、腫瘍マーカーとしての診断応用の他に、 新規抗癌剤など創薬への応用が可能となる。脳腫瘍マーカー遺伝子に対する検出 用プローブ等を作製することにより、脳腫瘍マーカー遺伝子を検出し、脳腫瘍の診断 を広範囲にかつ確実に行うことができる。また、脳腫瘍を抑制する物質のスクリーニン グを行い、新規抗癌剤の開発を進展させることができる。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]選択された遺伝子の神経膠腫組織におけるタンパク質レベルでの発現を免疫 組織学的に解析した結果を示した図である。
[図 2]タンパク質発現レベルと患者の生存期間との相関を示した図である。
[図 3]ダリオ一マ細胞株に各遺伝子に対する siRNAを導入し、細胞増殖を Tetm co lor oneを用いて分析した結果を示した図である。
[図 4]ダリオ一マ細胞株に各遺伝子に対する siRNAを導入し、各遺伝子の発現レべ ルを定量 PCR法で分析した結果を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 本発明の「脳腫瘍」は、頭蓋内に発生するすべての腫瘍をいう。このような脳腫瘍の 中でも、発生頻度の高い代表的なものが神経膠腫であり、これはさらに、星細胞腫、 神経膠芽腫等を含む。脳腫瘍には、この他、下垂体腺腫、神経鞘腫などがある。
[0024] 本発明における「遺伝子」は、 DNAおよび RNAが含まれる。 DNAには、例えば、 クロー-ング、化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるような cDNAゃゲ ノム DNAなどが含まれる。 DNAは二本鎖でも一本鎖でもよぐ一本鎖 DNAは、セン ス鎖となるコード DNAであっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよ い。
[0025] 本明細書における「ポリヌクレオチド」は、 RNAおよび DNAの!、ずれをも包含する 趣旨で用いられる。なお、上記 DNAには、 cDNA、ゲノム DNA、および合成 DNA のいずれもが含まれる。また上記 RNAには、トータル RNA、 mRNA、 rRNAおよび 合成の RNAの!、ずれもが含まれる。
[0026] 以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
[0027] 本発明者らは、良性神経膠腫と悪性神経膠腫の遺伝子プロファイルを比較すること により、悪性神経膠腫のみに高発現する上記の表 1に示す 17の脳腫瘍マーカー遺 伝子を同定した。 [0028] 本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子とは、良性脳腫瘍若しくは正常脳組織ではほとん ど又は全く発現せず、悪性脳腫瘍のみに高発現する遺伝子を言う。本発明の脳腫瘍 マーカー遺伝子は、配列番号 1〜17のいずれか 1記載の塩基配列を有することを特 徴とする。また、 NCBIの遺伝子データーベースにおいて、表 1の Gene Accession numberによりアプローチすることができる。本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子は、 公知の遺伝子操作の手法により、取得することができる。
[0029] 本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、配列番号 1〜17のいずれか
1記載の塩基配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか 1とストリンジェントな 条件下でノ、イブリダィズする塩基配列を有することを特徴とするものである。これらの 脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列の全 体又は部分配列を選択することによって、公知の方法を用いて適宜作製することが できる。選択される部分配列はどの部分であってもよいが、脳腫瘍マーカー遺伝子と ストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする塩基配列であることを特徴とする。また
、脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、放射標識、蛍光標識等で標識してもよ い。上記脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、選択された部分配列に基づい て、その配列に相補的な DNA又は RNAとすることができる。例えば、本発明の脳腫 瘍マーカー遺伝子の塩基配列から適宜の長さの DNAプローブを作成し、適宜蛍光 標識等の標識を付与しておき、これを被検体とハイブリダィズすることにより、脳腫瘍 マーカー遺伝子の発現の多寡を検出し、脳腫瘍の検出を行う。
[0030] なお、上記脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの作製に際して、本発明の塩基 配列にぉ 、て、「脳腫瘍マーカー遺伝子とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ する」条件としては、例えば、 42°Cでのハイブリダィゼーシヨン、及び 1 X SSC (0. 15 M NaCl、 0. 015M クェン酸ナトリウム）、 0. 1%の SDSを含む緩衝液による 42°C での洗浄処理を挙げることができ、 65°Cでのハイブリダィゼーシヨン、及び 0. 1 X SS C、 0. 1%の SDSを含む緩衝液による 65°Cでの洗浄処理をより好ましく挙げることが できる。
[0031] 本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーは、配列番号 1〜17のいずれ 力 1記載の塩基配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか 1を特異的に増幅 するための、 15〜30塩基長の連続した脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーで ある。脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを用いることにより、 PCR等の公知の 方法に基づいて目的の脳腫瘍マーカー遺伝子を増幅できる。プライマーは、本発明 の脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列 (配列番号 1〜17)に基づき、市販のプライマ 一設計ソフトを用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。また、ブラ イマ一は、適当な標識によりラベル (例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等） されていてもよぐまた、ピオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
[0032] 本発明の DNAチップは、配列番号 1〜17のいずれ力 1記載の塩基配列を有する 脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか 1とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする 塩基配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも 1を固定化さ せたことを特徴とする。 DNAチップの作製方法は、当業者には公知である。 DNAチ ップを用いることにより、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現レベルを検出、測定 することができる。
[0033] 本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、下記の工程 (a)及び (b)を含むことを特徴と する：（a)被験者の生体試料カゝら調製された RNAまたは該 RNAカゝら転写された相補 的ポリヌクレオチドにおける、配列番号 1〜 17のいずれか 1記載の塩基配列を有する 脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも 1の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する 工程、 (b)前記発現量が健常者のそれと比較して多!ヽ被験者を悪性脳腫瘍と診断す る工程。
[0034] 本発明の悪性脳腫瘍の診断方法にお!ヽて、「被験者」は、例えば MRI検査等によ つて脳腫瘍の疑いがあると診察されて患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの 切除組織あるいは血液等である。評価対象の生体試料は、マーカー遺伝子を含む 任意の試料であり得る。患者脳からの切除組織ある 、は血液等から常法に従って、 生体試料から RNAを調製することができる。また、患者脳からの切除組織あるいは 血液等から常法に従って、該 RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを調製す ることができる。例えば、被験者の細胞力ゝら単離した mRNAを铸型として、 cDNAを 合成し、 PCR増幅する。その際に、標識 dNTPを取り込ませて標識 cDNAとすること ができる。 [0035] 本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、前記生体試料における本発明の脳腫瘍マー カー遺伝子のいずれかの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。健 常者の生体試料における配列番号 1〜17のいずれか 1記載の塩基配列を有する脳 腫瘍マーカー遺伝子の発現量を基準とし、被験者の生体試料における配列番号 1 〜 17のいずれか 1記載の塩基配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量が前 記基準より高いと悪性脳腫瘍とする。具体的には、本発明の検出方法は、 RT-PC R法、ノーザンブロット法、 DNAマイクロアレイ解析法、 in situ ハイブリダィゼーショ ン解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。 このとき、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブや脳腫瘍マーカー遺伝 子検出用プライマーを適宜用いることができる。また、本発明の DNAチップを用いて ちょい。
[0036] 本発明の配列番号 1〜17のいずれ力 1記載の塩基配列を有する脳腫瘍マーカー 遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程 (a)、（b)及び (c )を含むことを特徴とする：（a)被験物質と、配列番号 1〜17のいずれか 1記載の塩基 配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも 1を発現している細胞とを接触させ る工程、 (b)被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現 量を測定し、被験物質を接触させな!/ヽ対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マ 一力一遺伝子の発現量と比較する工程、（c)上記 (b)の比較結果に基づいて、脳腫 瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
[0037] 本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、 脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を低下させる物質を探索することによって、悪性脳 腫瘍を抑制する候補物質を提供するものである。
[0038] 本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、配列番号 1〜17のいずれか 1 記載の塩基配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子を発現する培養細胞全般を挙げる ことができる。培養細胞においてこれら脳腫瘍マーカー遺伝子が発現している力否 かは、公知のウェスタンプロット法などにて検出することにより、容易に確認することが できる。培養細胞としては、具体的には、例えば癌患者より単離、調製した生体組織 や血球由来の細胞、または本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかを導入した 細胞等を挙げることができる。
[0039] また、本発明のスクリーニング方法に際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は 、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子を 発現できる培養条件 (温度、 pH、培地組成など)を選択するのが好ましい。
[0040] 脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも 1を発現している細胞力 RNAを調製して、脳 腫瘍マーカー遺伝子を測定する。また、該 RNAカゝら転写された相補的ポリヌクレオ チドを調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定してもよい。具体的には、 RT-PCR 法、ノーザンブロット法、 DNAマイクロアレイ解析法、 in situ ハイブリダィゼーショ ン解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。 このとき、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブや脳腫瘍マーカー遺伝 子検出用プライマーを適宜用いることができる。また、本発明の DNAチップを用いて ちょい。
[0041] 本発明の悪性脳腫瘍の診断キットは、以下の (a)〜 (c)力もなる群力も選ばれる少 なくとも 1以上を含むことを特徴とする：（a)配列番号 1〜17のいずれか 1記載の塩基 配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれ力 1とストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズする塩基配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくと も 1、（b)配列番号 1〜17のいずれか 1記載の塩基配列を有する脳腫瘍マーカー遺 伝子のいずれか 1を特異的に増幅するための、 15〜30塩基長の連続した脳腫瘍マ 一力一遺伝子検出用プライマーの少なくとも 1、（c)配列番号 1〜17のいずれか 1記 載の塩基配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか 1とストリンジェントな条件 下でノ、イブリダィズする塩基配列を有する脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの 少なくとも 1を固定化させた DNAチップ。悪性脳腫瘍の診断キットを構成する (a)〜（ c)を上記のように用いることにより、悪性脳腫瘍の診断が可能となる。
[0042] 本発明の脳腫瘍マーカータンパク質とは、良性脳腫瘍若しくは正常脳組織ではほ とんど又は全く発現せず、悪性脳腫瘍のみに高発現するタンパク質を言う。本発明の 脳腫瘍マーカータンパク質は、配列番号 18〜34のいずれ力 1記載のアミノ酸配列か らなるポリペプチドを有することを特徴とする。また、 NCBIの遺伝子データーベース において、表 1の Gene Accession Numberによりアプローチすることができる。 [0043] 本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体は、配列番号 18〜34のいずれか 1記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドを有する脳腫瘍マーカータンパク質のい ずれか 1を特異的に認識することを特徴とする。本発明の脳腫瘍マーカータンパク質 検出用抗体は前記脳腫瘍マーカータンパク質に特異的に結合する性質を有すること から、前記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を利用することによって、被験者の 組織内に発現した上記脳腫瘍マーカータンパク質を特異的に検出することができる
[0044] 抗体の製造方法は公知であり、本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体も 常法に従って製造することができる。具体的には、本発明の脳腫瘍マーカータンパク 質検出用抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精 製した本発明の脳腫瘍マーカータンパク質を用いて、あるいは常法に従ってこれら 本発明の脳腫瘍マーカータンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合 成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ること が可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発 現し精製した本発明の脳腫瘍マーカータンパク質またはこれらタンパク質の部分アミ ノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細 胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したノ、イブリドーマ細胞の中から得ることが できる。該抗体は、適当な標識によりラベル (例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光 標識等）されて 、てもよ 、し、ピオチン等により適当に修飾されて!、てもよ!/、。
[0045] 脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の作製に免疫抗原として使用される脳腫瘍 マーカータンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報 (配列番号 1〜1 7)に基づいて、 DNAクロー-ング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフエクショ ン、形質転換体の培養および培養物力ゝらのタンパク質の回収の操作により得ることが できる。これらの操作は、当業者に既知の方法に準じて行うことができる。
[0046] 本発明のプロテインチップは、配列番号 18〜34のいずれ力 1記載のアミノ酸配列 力もなるポリペプチドを有する脳腫瘍マーカータンパク質のいずれか 1を特異的に認 識する脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも 1つ以上を固定化させたこ とを特徴とする。プロテインチップの作製方法は、当業者には公知である。 [0047] 本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、下記の工程 (a)及び (b)を含むことを特徴と する：（a)被験者の生体試料力も調整されるタンパク質における、配列番号 18〜34 のいずれか 1記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドを有する脳腫瘍マーカータン ノ ク質の少なくとも 1の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、（b)前 記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
[0048] 本発明の悪性脳腫瘍の診断方法にお!ヽて、「被験者」は、例えば MRI検査等によ つて脳腫瘍の疑いがあると診察されて患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの 切除組織あるいは血液等である。患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に 従って、生体試料力もタンパク質を調製することができる。
[0049] 本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、前記生体試料における脳腫瘍マーカータン パク質のいずれかの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。健常者 の生体試料における配列番号 1〜17のいずれか 1記載の塩基配列を有する脳腫瘍 マーカータンパク質の発現量を基準とし、被験者の生体試料における配列番号 1〜 17のいずれか 1記載の塩基配列を有する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量が前 記基準より高いと悪性脳腫瘍とする。具体的には、公知の方法に基づいて、患者の 組織の一部を採取し、そこ力も常法に従ってタンパク質を調製する。その後、例えば 、ウェスタンブロット法、 ELISA法、蛍光抗体法など公知の検出方法に基づいて、脳 腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出することができる。このとき、上記脳腫瘍マ 一力一タンパク質検出用抗体を適宜用いることができる。また、上記プロテインチップ を用いることにより、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出してもよ 、。
[0050] 本発明の配列番号 18〜34のいずれ力 1記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド を有する脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含むことを特徴とする：（a)被験物質と、配列番号 18 〜34のいずれか 1記載のアミノ酸配列力 なるポリペプチドを有する脳腫瘍マーカー タンパク質の少なくとも 1を発現している細胞とを接触させる工程、（b)被験物質を接 触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質 を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発 現量と比較する工程、（c)上記 (b)の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク 質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
[0051] 本発明の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法 は、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を低下させる物質を探索することによって、 悪性脳腫瘍を抑制する候補物質を提供するものである。
[0052] 本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、配列番号 18〜34のいずれか 1 記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドを有する脳腫瘍マーカータンパク質を発現 する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞にぉ 、てこれら脳腫瘍マーカータ ンパク質が発現して 、るか否かは、公知のウェスタンプロット法などにて検出すること により、容易に確認することができる。培養細胞としては、具体的には、例えば癌患者 より単離、調製した生体組織や血球由来の細胞、または本発明の脳腫瘍マーカー遺 伝子のいずれかを導入した細胞等を挙げることができる。
[0053] また、本発明のスクリーニング方法に際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は 、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明の脳腫瘍マーカータンパク質 を発現できる培養条件 (温度、 pH、培地組成など)を選択するのが好ましい。
[0054] 脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも 1を発現して!/、る細胞力 タンパク質を調製 して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定する。具体的には、ウェスタンプロット法、 ELIS A法、タンパク質マイクロアレイ解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー 遺伝子の発現量を測定する。このとき、上記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体 を適宜用いることができる。また、上記プロテインチップを用いることにより、脳腫瘍マ 一力一タンパク質の発現量を検出してもよ 、。
[0055] 本発明の悪性脳腫瘍の診断キットは、以下の (a)〜 (b)力もなる群力も選ばれる少 なくとも 1以上を含むことを特徴とする：（a)配列番号 18〜34のいずれか 1記載のアミ ノ酸配列からなるポリペプチドを有する脳腫瘍マーカータンパク質のいずれか 1を特 異的に認識する脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも 1、（b)配列番号 18〜34のいずれか 1記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドを有する脳腫瘍マー カータンパク質のいずれか 1を特異的に認識する脳腫瘍マーカータンパク質検出用 抗体力も選択された少なくとも 1の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を固定化さ せたプロテインチップ。悪性脳腫瘍の診断キットを構成する（a)〜 (b)を上記のように 用いることにより、悪性脳腫瘍の診断が可能となる。
[0056] 以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定される ものではない。
実施例
[0057] 1.対象症例
新潟大学脳研究所脳神経外科にて手術摘出された神経膠腫 52例 （WHO gra dell : 16例、 ΠΙ : 14例、 IV： 22例）を対象とした。高悪性度のものは術後、放射線治 療 (腫瘍局所 40Gy、 照射 20Gy)ならびに-トロソゥレアを中心としたィ匕学療法 を施行した。生存期間は診断確定日より患者の死亡日、もしくは最終受診日とした。 組織診断は WHO脳腫瘍組織分類に基づいて行った。なお、本明細書に記載の実 験は、新潟大学倫理委員会の規定に則り、全ての対象患者からインフォームドコンセ ントを得ている。
[0058] 2. RNAの抽出
凍結組織片は ISOGEN (二ツボンジーン）中でポリトロンにより破砕された (最高速 度で 5秒間 X 2回）。クロ口ホルムを添カ卩後、 15, 000 X gで 10分間遠心し、 RNAを 含んだ水層を採取した。イソプロピルアルコールを用いトータル RNAを沈殿させ、 70 %エタノールで 1度洗浄し、それを DEPC処理 H Oに溶解した。トータル RNAは 1.
2
5ユニットの DNase Iで処理し、再度、クロ口ホルム抽出を行った後に、エタノール沈 殿し、 DEPC処理 H Oに懸濁した。その後、 Rneasy Mini Kitを使い、低分子の
2
核酸を除去した。トータル RNAの質は Bioanalyzer2100 (Agilent)にて rRNA ra tio [28sZl8s]を計測した。精製したトータル RNAは 70%エタノール中で— 80°C に使用まで保存した。また、ヒト正常脳、副腎、骨髄、大腸、胎児肝、心臓、腎臓、肝 臓、肺、乳腺、前立腺、だ液線、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、気管、 甲状腺、子宫組織の各 mRNAは clontech社のものを使用した。
[0059] 3. Cy 3—、 Cy 5—標識化 cDNAの合成
cDNAの合成は agilent fluorescent direct label kitを用いて行った。 10 gの精製したトータル RNAと Τ7プロモーター配列を有するオリゴ dTプライマーを用 いて、 1. 25 の ImMの FluoroLink dCTP (Cy3— dCTP又は Cy5— dCTP)、 2 00ユニットの SuperScriptll逆転写酵素で 42°C1時間反応させ、第一鎖 cDNAを合 成した後に第二鎖 cDNAを合成し、フエノール Zクロ口ホルムで抽出し、 Phase Loc k Gelにて精製した。尚、腫瘍の RNAは Cy5、正常脳組織の RNAは Cy3を用いて 標識した。得られた cDNAはエタノール沈殿により回収し、使用まで 70%エタノール 中で— 80°Cで保存した。
[0060] 4. agilentマイクロアレイ解析
脳腫瘍患者の原発癌の遺伝子発現は agilentマイクロアレイを用いて試験した。ハ イブリダィゼーシヨンは、 2 Xデポジションコントロールバッファー 12. 5 1、 Cot— 1 DNA 2. 5 1、ヌクレアーゼフリーの水 7. 5 ;z l、cDNA 2. 5 1を含む 25 1の 溶液中で 65°C、 17時間行った。チップを 0. 5%SSC/0. 1%SDS溶液で洗浄後、 各ピクセルの蛍光強度は HP社製レーザースキャナ一にて測定し、画像化、さらに各 遺伝子の正常脳組織に対する腫瘍組織での発現比に関して数値ィ匕を行った。この 実験により、ヒト脳腫瘍患者の約 12729遺伝子の発現を測定した。
[0061] 5.統計解析
悪性神経膠腫と良性神経膠腫にぉ ヽて異なる (発現をする)遺伝子群を同定する ため、 agilentマイクロアレイ解析を行った。遺伝子毎に 16検体の良性神経膠腫の av erage differenceの平均を求め、求めた平均の値と各々 36検体の悪性神経膠腫 の average differenceを比較し、 Student t—検定で p< 0. 01を示した遺伝子を 選び出した。さらに、ヒト正常副腎、骨髄、大腸、胎児肝、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳 腺、前立腺、だ液線、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、気管、甲状腺、子 宫組織でいずれも 1. 5以下の発現比の遺伝子を選択した。その結果、表 1に示すよ つ【こ、 Human mRNA for stac, complete cds、 pituitary tumor-transforming l(PTTGl) 、 RAS guanylreleasing protein 2 (calcium and DAG- regulated)、 KIAA0561 protein ( microtubule associated serine/threonine kinase 3)、 KIAA0537 gene product ( AMP- activated protein kinase family member 5)、 EphB6、 EphA4、 EphA5、 kinesin family m ember 1C (KIF1C)、 kinesin 2 (60— 70kD)ゝ kinesin family member 3C (KIF3C)、 KIAAO 449 protein (kinesin family member 21B)、 serologically defined colon cancer antigen 31、 sperm associated antigen 7、 spermine synthase ^ Human mRNA for endosialin pro tein、 Human ERGIC-53 mRNAの 17個の遺伝子を選び出した。
[0062] 6.免疫組織解析
対象症例について検討を行った。 5ミクロン切片を作成し、脱パラフィンィ匕の後に 10 mM クェン酸ナトリウム（pH 6. 0)中にて 121°C、 10分間加温した。 0. 3%H O
2 2 にて内因性ペルォキシダーゼ活性の阻害を行った。 10%ャギ又はゥサギ血清にて ブロッキング後、各抗体 (KIF1Cャギポリクローナル抗体、 1 : 20希釈; KIF3Cャギポ リクローナル抗体、 1 : 20希釈； PTTGャギポリクロール抗体、 1 : 20希釈； EphA4 ゥ サギポリクローナル抗体、 1 : 20希釈； EphB6ャギポリクローナル抗体、 1 : 20希釈） ( いずれも Santa Cruz Biotechnology社）と 4°C 12時間反応させた。洗浄後の Avi dine― biotin― peroxidase system (Vectasm elite ABし kit, VectorLab s, Burlingame, CA)を反応させ、 0. 01% 3, 3—ジァミノべンジジン（DAB) ( Sigma)と PBS0. 1%過酸化水素にて発色させた。
[0063] 図 1に示すようにこれらの遺伝子産物は症例によって様々な程度に染色された。任 意の 3視野での各タンパクの発現強度を 0— 3、および発現面積を 0、 0. 25、 0. 5、 0 . 75、 1. 0と表示し、それらの積の平均値を求め発現レベルとした（図 1)。各タンパク の発現レベルをネガティブ（negative)とポジティブ（positive)の 2群に分け、各群の 生存曲線を描き、ログランク検定にて 2群間の有為差を検討した（図 2)。 KIF1C, KIF 3C, PTTGl, EphA4, EphB6はいずれも各タンパクが高発現すると予後が悪い結果で めつに。
7. SiRNAの細胞導入
各遺伝子に対する特異的な siRNAは AMBION社および QIAGEN社のものを用 いた。 KIF3C、 ID # 11118 ; PTTG、 ID # 41900 ; ARK5、ID # 964 ; STAC、 ID # 12720 ; RASGRP2, ID # 16857 (いずれも AMBION社）、また KIF1Cに対する s iRNAは YAMA— 1 (センス： GGAGAAUCAGUACCGGAAA；アンチセンス： UU UCCGGUACUGAUUCUCC, QIAGEN社）を用いた。非サイレンシング コントロー ル（non— silencingcontrol)を含めたこれらトランスフエクシヨンには RNAiHuman /Mouse Control kit (Qiagen)を用い、プロトコールに従って実験を行った。細 胞株を 96ゥエルプレート（100 μ 1/well)に培養し 80%コンフレントに達した時点で 培地を交換（75 μ 1/well)し、 SiRNA100nM/25 μ 1を混和、トランスフエクシヨン させた。 48時間の培養後、 Tetm color one (Seikagaku社， Tokyo)を用いて発 色し、 MTTアツセィにより生存率 (viability)を評価した。これらの値は非サイレンシ ング siRNAによるネガティブコントロールと比較検討した。全て増殖試験は 3回以上 行い、結果は平均士標準偏差で表現した。
[0064] ARK5, RASGRP2, PTTG1, STAC, KIF1C, KIF3Cの SiRNAの細胞導入によりグリ ォーマ細胞株 U251の増殖がコントロール siRNAに比し 40— 60%に抑制される事 が示された（図 3)。
8. 定量 PCR法
RNAは凍結組織より Isogen (Nippongene, Toyama, Japan)を用いて抽出し た。第一鎖 cDNAは試料力 得られた mRNAから、オリゴ (dT)プライマー、逆転写 酵素（SuperScriptll RNaseH, Life Technologies, Grand Island, NY)を用 いて作成した。定量 PCRは Light Cycler (idahoTechnology, Salt Lake City, UT)によるリアルタイム PCRで行った。 PCR試薬の組成は 1 X LightCyclerDNA Master SYBR Green I (Rosche Moleculer Biochemicals, Mannheim, Ger many)、各プライマー 0. 5 M、 3mM MgCl 、 2 1 cDN Aテンプレートにて行つ
2
た。 PCRは 95°C10分間で denature後、 95°C15分、 55°C5分、 72°C10分の各サイ クルを 40サイクル行った。反応産物は post— PCR melting cycleを経て各サイク ルで蛍光強度を測定した。 PCR増幅の為のプライマーは以下のものを用いた。
KIFlC,Hs01034140-gl.;KIF3C,Hs00158482-ml: PTTGl,Hs00851754-gl,;ARK5,H s00934230— ml,;STAC,Hs01070510— ml,;RASGRP2,Hs01057113— ml,; (いずれも App lied Bio systems Japan社)。
[0065] 定量 PCR法による検討では siRNAの導入により、 ARK5, RAS, PTTG1, STAC, KI F1C, KIF3Cの各 mRNAの発現をコントロール siRNAに比し 20〜30%に抑制でき ることが定量 PCR法を用いて示された（図 4)。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1〜17のいずれか 1記載の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マー カー遺伝子。
[2] 請求の範囲 1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか 1とストリンジェントな条件下 でノ、イブリダィズする塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子検出 用プローブ。
[3] 請求の範囲 1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか 1を特異的に増幅するため の、 15〜30塩基長の連続した脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマー。
[4] 請求の範囲 2記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも 1を固定ィ匕 させたことを特徴とする DNAチップ。
[5] 下記の工程 (a)及び (b)を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法：
(a)被験者の生体試料カゝら調製された RNAまたは該 RNAから転写された相補的ポ リヌクレオチドにおける、請求の範囲 1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも 1の 脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
(b)前記発現量が健常者のそれと比較して多!ヽ被験者を悪性脳腫瘍と診断するェ 程。
[6] 下記の工程 (a)、 (b)及び (c)を含むことを特徴とする請求の範囲 1記載の脳腫瘍マ 一力一遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
(a)被験物質と、請求の範囲 1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも 1を発現し て ヽる細胞とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測 定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー 遺伝子の発現量と比較する工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づ!/、て、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる 被験物質を選択する工程。
[7] 以下の（a)〜 (c)力もなる群力も選ばれる少なくとも 1以上を含むことを特徴とする悪 性脳腫瘍の診断キット：
(a)請求の範囲 2記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも 1、 (b)請求の範囲 3記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーの少なくとも 1、
(c)請求の範囲 4記載の DNAチップ。
[8] 配列番号 18〜34のいずれか 1記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドを有すること を特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質。
[9] 請求の範囲 8記載の脳腫瘍マーカータンパク質のいずれか 1を特異的に認識するこ とを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体。
[10] 請求の範囲 9記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体力 選択された少なくと も 1の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を固定化させたことを特徴とするプロテ インチップ。
[11] 下記の工程 (a)及び (b)を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法：
(a)被験者の生体試料力も調製されるタンパク質における、請求の範囲 8記載の脳腫 瘍マーカータンパク質の少なくとも 1の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定す る工程、
(b)前記発現量が健常者のそれと比較して多!ヽ被験者を悪性脳腫瘍と診断するェ 程。
[12] 下記の工程 (a)、 (b)及び (c)を含むことを特徴とする請求の範囲 8記載の脳腫瘍マ 一力一タンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
(a)被験物質と、請求の範囲 8記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも 1を発 現して ヽる細胞とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を 測定し、被験物質を接触させな 、対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカ 一タンパク質の発現量と比較する工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づ!/、て、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少さ せる被験物質を選択する工程。
[13] 以下の（a)〜(b)からなる群力も選ばれる少なくとも 1以上を含むことを特徴とする悪 性脳腫瘍の診断キット：
(a)請求の範囲 9記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも 1、
(b)請求の範囲 10記載のプロテインチップ。
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