WO2007099227A2 - Utilisation de la proteine a homeodomaine engrailed comme anxiolytique - Google Patents

Utilisation de la proteine a homeodomaine engrailed comme anxiolytique Download PDF

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    • A61P25/22—Anxiolytics

Definitions

  • the present invention relates to the use of Engrailed transcription factors for increasing dopaminergic metabolism, and especially as anxiolytics.
  • Engrailed proteins are transcription factors of the homeodomain class of proteins. Mammals have two Engrailed genes: Engrailed-1 and Engrailed-2; the two corresponding proteins which have a similar biological activity will be collectively referred to hereinafter as the general term Engrailed (EN).
  • EN is expressed in dopaminergic (DA) neurons of the substantia nigra (which degenerate in Parkinson's disease), in cerebellar grain cells, and in mesencephalic dopaminergic nuclei that play a role in important role in the regulation of mood and the setting up of addictive behaviors.
  • DA dopaminergic
  • Engrailed protein for obtaining an anxiolytic drug.
  • Engrailed protein any of the Engrailed-1 or Engrailed-2 proteins of a vertebrate.
  • said drug is an injectable preparation, preferably intravenously.
  • injectable preparation preferably intravenously.
  • the present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples illustrating the anxiolytic properties of Engrailed, and its effect on dopaminergic metabolism.
  • EXAMPLE 1 The effects of a daily injection of EN2 at a dose of 3 or 300 ⁇ g / kg on the behavior of mice was evaluated as follows:
  • the chicken EN2 protein (UniProtKB accession number: Q05917) is produced in recombinant form in E. coli BL21RP-CodonPlus® (Stratagene) bacteria transformed with the plasmid pGEXSEn2, which results from the insertion of the coding sequence for the EN2 in a fusion plasmid pGEX-6P (Amersham-GE Healthcare) translational with the coding sequence for glutathione S-transferase (GST).
  • the expressed protein is a fusion protein containing the glutathione S-transferase sequence, followed by a cleavage site for the PreScission TM protease (recombinant protease resulting from the fusion between GST and human rhinovirus 3C protease; GE Healthcare), and the complete sequence of EN2.
  • This fusion protein is purified from a lysate of the transformed bacteria, by glutathione column affinity chromatography (GSTrap, Amersham-GE Healthcare); the EN2 protein is eluted from the column after cleavage using the PreScission TM protease.
  • Rotarod it measures the time during which the animal is able to stay on a rotating cylinder, which allows to evaluate the motor coordination and the balance.
  • Tail-pinch this test is used to measure the pain threshold.
  • Open-field The animal is placed in a loudly lit enclosure, for a session of 30 minutes. The distance traveled and the number of adjustments make it possible to evaluate the locomotor and exploratory activity; the evolution of this activity between the first and second half of the test makes it possible to evaluate the habituation type memory. Finally, the determination of the time spent, and the distance traveled, in the center of the enclosure (which constitutes an anxiety environment) makes it possible to evaluate the level of anxiety.
  • the center of the open-field is defined as a square in the center of the enclosure representing 25% of the total area. Anxious behavior index variables are the percentage of time spent and the percentage of distance traveled in the center. The anxiety of the center is indicated by an avoidance behavior towards the center, therefore by values lower than 25% for these two variables. An anxiolytic effect of a treatment is manifested by an increase in the percentages of time spent and distance traveled in the center.
  • Labyrinth raised cross it is a cross-shaped device with 2 open branches and 2 branches closed on the sides. The animal is placed in the labyrinth for a 5 minute session. We measure the total number of entries in the 2 types of branches (exploratory activity in anxious environment), as well as the percentage of entries in the open branches (the most anxiety-provoking), and the time spent in these branches. In the majority of cases, the mouse passes less than 50% of the time and achieves less than 50% of the entries in the open branches, which shows the anxiety of these. Anxious behavior is thus considered all the more pronounced as the percentages of time and entries in the open branches are low. The anxiolytic effect of treatment is manifested by increased percentages of time and inflow into open branches.
  • Type habituation memory Habituation to an environment is manifested by an exploratory activity that diminishes when this environment becomes known.
  • the index variables habituation are the horizontal and vertical activity, measured over the 2nd half of a session open field, and as a percentage of the activity of the entire session. Habituation is indicated by values for these two variables less than The percentage of distance to the center and adjustments to the 2 e ⁇ e half of the session is significantly lower than 50% in the three groups. En2 does not significantly modify these two variables. It can not be concluded that there is an effect of EN2 on the habituation-type memory under the experimental conditions used.
  • EN2 has no significant effect on the behavior of the animals; On the other hand, at the dose of 300 ⁇ g / kg, EN2 increases very significantly (p ⁇ 0.01) the percentage of time spent and the percentage of distance traveled in the center, which shows an anxiolytic effect.
  • EN2 has no significant effect on the behavior of animals.
  • EN2 increases the number of entries in the branches, open or closed, suggesting an increase in exploratory behavior and / or a decrease in anxiety, and also significantly increases the percentage of time spent in open branches.
  • the results of these experiments indicate that a treatment with the EN2 protein induces an anxiolytic effect.
  • EXAMPLE 2 EFFECT OF ENGRAILED-2 ON AMINES CEREBRZUI 1 ES.
  • mice and EN300 group received a 7 th i n j ec tion, respectively of 0.9% NaCl and EN2 at a dose of 300 mcg / kg .
  • the brains are rapidly removed and placed on a refrigerated stage (0-4 0 C).
  • the brain structures (cortex, striatum, and hippocampus) are dissected, weighed and placed in an Eppendorf tube at -30 ° C. before preparation of the chromatography samples.
  • the tissues are homogenized with a teflon potter in 500 ⁇ l of a 0.1 N perchloric acid solution containing 0.05% of sodium metabisulphite.
  • the samples are centrifuged (25,000 ⁇ g, 30 min, 40 ° C.).
  • the supernatants are removed and then frozen before chromatography.
  • Dopamine (DA) and one of its metabolites, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), and serotonin, are assayed in these supernatants by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS).
  • the compounds are separated by reverse phase partition chromatography on a C18 grafted silica column; elution is carried out with a methanol / water mixture: 15/85.
  • Detection is performed using a LCQ mass spectrometer (ThermoFinnigan). It is an ion trap equipped with an Electrospray type ionization source operating in positive ionization mode.

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Abstract

La présente invention est relative à l'utilisation d'un facteur de transcription Engrailed pour l'obtention d'un médicament à visée anxiolytique.

Description

UTILISATION DE LA PROTEINE A HOMEODOMAINE ENGRAILED COMME ANXIOLYTIQUE .
La présente invention concerne l'utilisation de facteurs de transcription Engrailed pour augmenter le métabolisme dopaminergique, et notamment comme anxiolytiques.
Les protéines Engrailed sont des facteurs de transcription de la classe des protéines à homéodomaine . Les mammifères possèdent deux gènes Engrailed : Engrailed-1 et Engrailed-2 ; -les deux protéines correspondantes qui ont une activité biologique similaire, seront collectivement désignées ci-après sous le terme général d' Engrailed (EN).
Chez le nouveau né et chez l'adulte, EN est exprimé dans les neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire (qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson) , dans les cellules des grains du cervelet et dans les noyaux dopaminergiques mésencéphaliques qui jouent un rôle important dans la régulation de l'humeur et la mise en place des comportements addictifs.
Il a été montré (SIMON et al. J Neurosci. 21
(9):3126-34, 2001) que la perte de EN au cours du développement est suivie assez rapidement par la dégénérescence des neurones dopaminergiques, et que l'une des cibles transcriptionnelles de EN est l' alpha-synucléine, dont la liaison génétique avec certaines formes familiales de la maladie de Parkinson a été montrée (POLYMEROPOULOS et al.,
Science. 276, 2045-7, 1997), et qui constituerait un régulateur négatif de la transmission dopaminergique
(ABELIOVICH et al., Neuron, 25, 239-52, 2000).
L' ensemble de ces observations suggère fortement l'implication d' EN dans des pathologies neurodégénératives, et notamment dans des pathologies affectant les neurones dopaminergiques, telles que la maladie de Parkinson. Il a été proposé de réguler l'activité d' EN pour prévenir ces pathologies ou ralentir leur évolution. Ainsi, la Demande PCT WO 2004/104030 décrit des peptides modulateurs de l'activité d'Engrailed, et propose leur utilisation pour prévenir ou traiter des pathologies neurodégénératives. Les Inventeurs ont maintenant découvert qu' outre son activité sur la survie neuronale, EN possédait également une action directe sur le métabolisme dopaminergique .
Ils ont observé que l'administration d'Engrailed à des souris induisait chez celles-ci un effet anxiolytique, qui s'accompagnait d'une augmentation importante du rapport DOPAC/DA, ce qui traduit un accroissement du métabolisme de la dopamine, dans le striatum, ainsi que d'une hausse de la sérotonine corticale. La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'une protéine Engrailed pour l'obtention d'un médicament anxiolytique.
Comme indiqué ci-dessus, on désigne ici par
« protéine Engrailed » une quelconque des protéines Engrailed- 1 ou Engrailed-2 d'un vertébré. De préférence, on choisira une protéine Engrailed de l'espèce à laquelle appartient le sujet à traiter.
Avantageusement, ledit médicament est une préparation injectable, de préférence par voie intra-veineuse . La présente invention sera mieux comprise à l' aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant les propriétés anxiolytiques d'Engrailed, et son effet sur le métabolisme dopaminergique.
EXEMPLE 1 : i Les effets d'une injection journalière d'EN2 à la dose de 3 ou 300 μg/kg sur le comportement des souris a été évalué comme suit :
Sujets :
Les expériences ont été effectuées sur des souris Swiss mâles, âgées de 6 mois.
Préparation d' Engrailed-2 injectée :
La protéine EN2 de poulet (Numéro d' accès UniProtKB: Q05917 ) est produite sous forme recombinante dans des bactéries E. coli BL21RP-CodonPlus® (Stratagene) transformées avec le plasmide pGEXSEn2, qui résulte de l'insertion de la séquence codant pour la totalité d' EN2 dans un plasmide pGEX-6P (Amersham-GE Healthcare) , en fusion traductionnelle avec la séquence codant pour la glutathion S- transférase (GST) .
La protéine exprimée est une protéine de fusion contenant la séquence de la glutathion S-transférase, suivie d'un site de clivage pour la protéase PreScission™ (protéase recombinante résultant de la fusion entre la GST et la protéase 3C du rhinovirus humain ; Amersham-GE Healthcare) , et de la séquence complète d'EN2.
Cette protéine de fusion est purifiée à partir d'un lysat des bactéries transformées, par chromatographie d'affinité sur colonne de glutathion (GSTrap, Amersham-GE Healthcare) ; la protéine EN2 est éluée de la colonne après clivage à l'aide de la protéase PreScission™. Tests effectués Labyrinthe en Y : dans ce test, l'animal est placé dans un labyrinthe en forme d'Y. Chaque visite de l'une des branches du labyrinthe est notée, et le nombre total des visites dans l'une ou l'autre des branches, ainsi que leur succession d'une branche à l'autre sont enregistrés. Le pourcentage d'alternance entre les branches permet d'évaluer la mémoire de travail, le nombre total de visites des branches permet d'évaluer l'activité, et l'évolution de cette activité permet d'évaluer l' habituation à court et à long terme.
Rotarod : on mesure le temps pendant lequel l'animal est capable de rester sur un cylindre en rotation, ce qui permet d'évaluer la coordination motrice et l'équilibre.
Tail-pinch (pincement de la queue) : ce test permet de mesurer le seuil de douleur.
Open-field : L'animal est placé dans une enceinte fortement éclairée, pour une séance de 30 minutes. La distance parcourue et le nombre de redressements permettent d'évaluer l'activité locomotrice et exploratoire ; l'évolution de cette activité entre la première et la seconde moitié du test permet d'évaluer la mémoire de type habituation. Enfin, la détermination du temps passé, et de la distance parcourue, au centre de l'enceinte (qui constitue un environnement anxiogène) permet d'évaluer le niveau d'anxiété. Le centre de l'open-field est défini comme un carré au centre de l'enceinte représentant 25% de la surface totale. Les variables index du comportement de type anxieux sont le pourcentage de temps passé et le pourcentage de distance parcourue au centre. Le caractère anxiogène du centre est indiqué par un comportement d'évitement vis-à-vis du centre, donc par des valeurs inférieures à 25% pour ces deux variables. Un effet de type anxiolytique d'un traitement se manifeste par une augmentation des pourcentages de temps passé et de distance parcourue au centre.
Labyrinthe en croix surélevé : il s'agit d'un dispositif en forme de croix comportant 2 branches ouvertes et 2 branches fermées sur les cotés. L'animal est placé dans le labyrinthe pour une séance de 5 minutes. On mesure le nombre total d'entrées dans les 2 types de branches (activité exploratoire en environnement anxiogène) , ainsi que le pourcentage d'entrées dans les branches ouvertes (les plus anxiogènes), et le temps passé dans ces branches. Dans la majorité des cas, la souris passe moins de 50% du temps et réalise moins de 50% des entrées dans les branches ouvertes, ce qui atteste du caractère anxiogène de celles-ci. Un comportement de type anxieux est donc considéré comme d'autant plus prononcé que les pourcentages de temps et d' entrées dans les branches ouvertes sont bas. L'effet de type anxiolytique d'un traitement se manifeste par une augmentation des pourcentages de temps et d'entrées dans les branches ouvertes.
Mode opératoire :
Les injections ont été faites selon le protocole suivant : Vingt et un animaux ont été répartis au hasard en
4 groupes, qui ont reçu des injections de :
NaCl 0,9% : groupe témoin (SaI) ; n= 10) ; EN2 3 μg/kg : groupe EN3 (n= 10) ; EN2 300 μg/kg : groupe EN300 (n= 10) . Les injections sont réalisées par voie intraveineuse au niveau de la queue. Le calendrier des injections et des tests est le suivant Jour 1 t= 0 : Injection 1 t= Ih Labyrinthe en Y - Séance 1
Jour 2 t= 0 : Injection 2 t= 1 h : Labyrinthe en Y - Séance 2 t= lh40 ; Rotarod - Séance 1 Jour 3 t= 0 : Injection 3 t= Ih : Labyrinthe en Y - Séance 3 t= lh40 ; Rotarod - Séance 2
Jour 4 : t= 0 : Injection 4 t= Ih : Labyrinthe en Y - Séance 4 t= lh40 ; Rotarod - Séance 3 t= Ih55 ; Tail-pinch - Séance 1
Jour 7 : t= 0 : Injection 5
1 h Open-Field t= lh40 ; Rotarod - Séance 4 t= Ih55 ; Tail Pinch - Séance 2 •
Jour 8 : t= 0 : Injection 6 t= Ih : Labyrinthe en croix surélevé
Résultats
Activité locomotrice :
On ne constate pas d'effet notable d'EN2 à 3 et 300 μg/kg. ni pour le labyrinthe, ni pour le rotarod, ni pour le test tail-pinch, ni en open-field. On ne peut donc pas conclure à la présence d'un effet d'En2 sur l'activité locomotrice et exploratoire dans les conditions expérimentales utilisées .
Mémoire de type habituation : L' habituation à un environnement se manifeste par une activité exploratoire qui diminue quand cet environnement devient connu. Les variables index d' habituation sont les activités horizontale et verticale, mesurées sur la 2eme moitié d'une séance en open-field, et exprimées en pourcentage de l'activité sur la totalité de la séance. L' habituation est indiquée par des valeurs pour ces deux variables inférieures à Le pourcentage de distance au centre et de redressements à la 2eπιe moitié de la séance est significativement inférieur à 50% chez les trois groupes. En2 ne modifie pas significativement ces deux variables. On ne peut pas conclure à la présence d'un effet d'EN2 sur la mémoire de type habituation dans les conditions expérimentales utilisées .
Activité anxiolytique : Open field Les résultats sont illustrés par la Figure 1, qui représente le pourcentage de temps passé au centre (A) , et le pourcentage de distance parcourue au centre (B) , pour les souris témoins (SaI ;G), les souris ayant reçu une injection de 3 μg/kg (D), et les souris ayant reçu une injection de 300 μg/kg ( H ) d'EN2. Différence vs . 25% : ## p<0,01 ; ### p<0,001.
Différence vs . groupe témoin (SaI) : * p<0,05 ; ** p<0,01.
On constate que, pour les 3 groupes d'animaux, les pourcentages de temps passé et de distance parcourue au centre sont inférieurs à 25%, ce qui montre un évitement du centre, indiquant le caractère anxiogène de celui-ci.
A la dose de 3μg/kg, EN2 n'a pas d'effet significatif sur le comportement des animaux ; en revanche, à la dose de 300 μg/kg, EN2 augmente de façon très significative (p<0,01) le pourcentage de temps passé et le pourcentage de distance parcourue au centre, ce qui montre un effet de type anxiolytique .
Labyrinthe en croix surélevé Les résultats sont illustrés par la Figure 2, qui représente le nombre total d'entrées dans les branches ouvertes ou fermées (A) , le pourcentage de temps dans les branches ouvertes (B) et le pourcentage d'entrées dans ces branches (C) , pour les souris témoins (SaI ; D) , les souris ayant reçu une injection de 3 μg/kg ( D ) d'EN2, et les souris ayant reçu une injection de 300 μg/kg ( Q ) d' EN2. Différence vs. 50% : ## p<0,01 ; ### p<0,001. Différence vs . groupe témoin (SaI) : * p<0,05.
Les trois groupes d'animaux présentent des pourcentages de temps et d' entrées dans les branches ouvertes inférieurs à 50%, ce qui dénote le caractère anxiogène des branches ouvertes.
A la dose de 3 μg/kg, EN2 n'a pas d'effet significatif sur le comportement des animaux.
A la dose de 300 μg/kg, EN2 augmente le nombre d'entrées dans les branches, ouvertes ou fermées, ce qui suggère une augmentation du comportement exploratoire et/ou une diminution de l'anxiété, et augmente également significativement le pourcentage de temps passé dans les branches ouvertes. Les résultats de ces expériences indiquent qu' un traitement avec la protéine EN2 induit un effet de type anxiolytique . EXEMPLE 2 : EFFET D'ENGRAILED-2 SUR LES AMINES CEREBRZUI1ES .
Le lendemain des essais décrits dans l'Exemple 1, les souris du groupe témoin et du groupe EN300 ont reçu une 7 ème injection, respectivement de NaCl 0,9% et d'EN2 à la dose de 300 μg/kg.
Une heure après l'injection, les animaux sont sacrifiés par décapitation. Les cerveaux sont rapidement prélevés et placés sur une platine réfrigérée (0-40C). Les structures cérébrales (cortex, striatum, et hippocampe) sont disséquées, pesées et placées dans un tube Eppendorf à -300C avant préparation des échantillons de chromatographie .
Les tissus sont homogénéisés avec un potter en teflon dans 500 μl d'une solution d'acide perchlorique 0,1 N contenant 0,05% de métabisulfite de sodium. Les échantillons sont centrifugés (25000 x g, 30 min, 40C). Les surnageants sont prélevés puis congelés avant le passage en chromatographie . La dopamine (DA) ainsi qu'un de ses métabolites, l'acide 3, 4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC), et la sérotonine, sont dosés dans ces surnageants par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (CPL-SM) .
Les composés sont séparés par chromatographie de partage en phase inverse, sur une colonne de silice greffée C18 ; l'élution est effectuée avec un mélange Méthanol/Eau : 15/85.
La détection est effectuée à l'aide d'un spectromètre de masse LCQ (ThermoFinnigan) . Il s'agit d'une trappe ionique équipée d'une source d'ionisation de type Electrospray fonctionnant en mode d'ionisation positif.
Les résultats sont illustrés dans les Tableaux I,
II, et III ci-dessous.
TABLEAU I
Figure imgf000009_0001
On observe une légère augmentation de la DOPAC et une forte augmentation (50% p<0,05) du rapport DOPAC/DA dans le striatum, ainsi qu'une légère augmentation de la 5HT dans le cortex.

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'une protéine Engrailed pour l'obtention d'un médicament anxiolytique.
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit médicament est sous forme de préparation injectable.
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