WO2007099896A1 - 核酸保護基の脱離方法 - Google Patents

Description

明 細 書

核酸保護基の脱離方法

技術分野

[0001] 本発明は、オリゴ核酸誘導体の各リボースの 2'位水酸基を保護している、中性条 件下において脱離可能なエーテル型保護基、例えば、 2—シァノエトキシメチル (以 下、「CEM基」という。）を再現性よぐまた効率よく脱離するための方法に関するもの である。

背景技術

[0002] オリゴリボ核酸 (オリゴ RNA)は、遺伝子解析の RNAプローブ、 RNA医薬品素材 ( アンチセンス RNA、リボザィム、 RNAiを利用した遺伝子発現制御）、人工酵素、ァ プタマ一として有用であることは周知である。

オリゴ RNAを製造するための試薬の 1つとして、リボースの 2 '位水酸基が中性条件 にお 、て脱離可能な CEM基で置換され保護されて 、るホスホロアミダイトイ匕合物が 知られている (非特許文献 1)。

上記ホスホロアミダイトイ匕合物を使用してオリゴ RNAを製造する場合、固相担体上 で所望の鎖長のオリゴ RNAを製造した後、該オリゴ RNAから固相担体及び各置換 基の保護基を除去する必要がある。力かる保護基を除去する工程の 1つとして、オリ ゴ RNAの各リボースの 2'位水酸基を保護している、中性条件下において脱離可能 なエーテル型保護基を脱離する工程があるが、該工程では、脱保護剤としてテトラブ チルアンモ -ゥムフロリド（以下、「TBAF」という。）を、溶媒としてテトラヒドロフラン（以 下、「THF」という。）を使用するのが一般的である（非特許文献 1)。

非特許文献 1 :大木ら， ORGANIC LETTERS, Vol. 7, 3477 (2005)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] 本発明の目的は、主として、オリゴ核酸誘導体の各リボースの 2'位水酸基を保護し ている、中性条件下において脱離可能なエーテル型保護基を再現性よぐまた効率 よく脱離する方法を提供することにある。 課題を解決するための手段

本発明者は、上記目的を達成するために、鋭意検討した結果、次の一般式（ 10)で 表されるオリゴ核酸誘導体に TBAFを作用させ、各リボースの 2'位水酸基を保護し て 、る中性条件下にお 、て脱離可能なエーテル型保護基を脱離する工程にぉ 、て 、 THFを含有していてもよい、スルホキシド系溶媒若しくはアミド系溶媒又はこれらの 混合溶媒を反応溶媒として用いることによって、次の一般式（11)で表されるオリゴ核 酸誘導体を効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

[化 1]

( 1 0 ) ¹ )

式（10)及び（11)中、各 Bは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表 す。 nは、 1〜200の範囲内にある整数を表す。 nは、 10〜100の範囲内にある整数 が好ましぐまた、より好ましくは、 15〜50の範囲内にある整数である。各 Qは、それ ぞれ独立して、 O又は Sを表す。各 Rは、それぞれ独立して、 H、水酸基、ハロゲン、 アルコキシ、アルキルチオ、アルキルァミノ、ジアルキルァミノ、アルケニルォキシ、ァ ルケ二ルチオ、アルケニルァミノ、ジアルケニルアミ入アルキニルォキシ、アルキニル チォ、アルキ-ルァミノ、ジアルキ -ルァミノ又はアルコキシアルキルォキシを表すが 、少なくとも 1つは水酸基を表す。 Zは、 H、リン酸基又はチォリン酸基を表す。

R¹は、次の一般式（3)で表される置換基を表す。

( 3 )

式（3)中、！^¹、 R'\ R"は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。 各 R⁴は、それぞれ独立して、 H、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルァ ミ入ジアルキルァミノ、アルケニルォキシ、アルケニルチオ、アルケニルァミノ、ジァ ルケニルァミノ、アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アルキニルァミノ、ジアルキニル アミ入アルコキシアルキルォキシ又は次の一般式 (4)で表される置換基を表す。

[化 3] 0^_0^^

( 4 )

式 (4)中、 WG¹は、電子吸引性基を表す。

Bで表される核酸塩基としては特に限定されるものではなぐ例えば、シトシン、ゥラ シル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グァニン等のプリン塩基を挙げることがで きる。

Bの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、かかる置 換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリールアルキル、アルコキシ、 アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジアルキルァミノ、カルボ キシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1 3個置換されてい る。

Bの修飾体に係る「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げる ことができる。

Bの修飾体に係る「ァシル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数 1 6 のアルカノィル、炭素数 7 13のァロイルを挙げることができる。具体的には、例えば 、ホルミル、ァセチル、 n—プロピオニル、イソプロピオニル、 n—ブチリル、イソブチリ ル、 tert—ブチリル、バレリル、へキサノィル、ベンゾィル、ナフトイル、レブリニル等を 挙げることができる。

Bの修飾体に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数 1〜 5のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピ ル、イソプロピル、 n—ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 tert—ブチル、 n ペンチ ル、イソペンチル、ネオペンチル、 tert ペンチル等を挙げることができる。当該アル キルは置換されていてもよぐ力かる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、ァ ルコキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1〜3個置換され ていてもよい。

Bの修飾体における「ァリールアルキル」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルァ ミノ」及び「ジアルキルァミノ」の「アルキル」部分は、上記の「アルキル」と同じものを挙 げることがでさる。

Bの修飾体に係る「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数 1 〜4のアルコキシを挙げることができる。具体的には、例えば、メトキシ、エトキシ、 n- プロポキシ、イソプロポキシ、 n ブトキシ、イソブトキシ、 sec ブトキシ、 tert—ブトキ シ等を挙げることができる。なかでも炭素数 1〜3のものが好ましぐとりわけメトキシが 好ましい。

Bの修飾体に係る「アルコキシアルキル」の「アルコキシ」部分は、上記の「アルコキ シ」と同じちのを挙げることがでさる。

Bの修飾体に係る「ァリールアルキル」の「ァリール」としては、例えば、炭素数 6〜1 2のァリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フエ-ル、 1 ナフチル、 2 —ナフチル、ビフエ二ル等を挙げることができる。当該ァリールは置換されていてもよ ぐ力かる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シァ入ニトロを 挙げることができ、これらが任意の位置に 1〜3個置換されていてもよい。

Bの修飾体に係る「アルキル」、「ァリール」の置換基である「ノヽロゲン」、「アルキル」 及び「アルコキシ」としては、各々上記と同じものを挙げることができる。

R及び R⁴に係る「ノヽロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルァミノ」又は「ジアルキルアミノ 」は、前記 Bの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。

R及び R⁴に係る「アルコキシアルキルォキシ」、「アルキルチオ」の「アルキル」部分と しては、前記 Bの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。

R及び R⁴に係る「アルコキシアルキルォキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記 B の修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。

R及び R⁴に係る「ァルケ-ルォキシ」、「ァルケ-ルチオ」、「ァルケ-ルァミノ」、「ジ ァルケ-ルァミノ」の「ァルケニル」部分としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭 素数 2〜6のァルケ-ルを挙げることができる。具体的には、例えば、ビュル、ァリル、 1—プロぺニノレ、イソプロぺニノレ、 1—ブテニノレ、 2—ブテニノレ、 1—ペンテ二ノレ、 1— へキセ-ル等を挙げることができる。

R及び R⁴に係る「アルキ-ルォキシ」、「アルキ-ルチオ」、「アルキ -ルァミノ」、「ジ アルキ-ルァミノ」の「アルキ -ル」部分としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭 素数 2〜4のアルキ-ルを挙げることができる。具体的には、例えば、ェチュル、 2— プロビュル、 1—ブチュル等を挙げることができる。

Ru、 R¹²、 R¹³に係る「アルコキシ」としては、前記 Bの「アルコキシ」と同じものを挙げ ることがでさる。

WG¹に係る「電子吸引性基」としては、例えば、シァ入ニトロ、アルキルスルホ-ル 、ァリールスルホ -ル、ハロゲンを挙げることができる。なかでも、シァノが好ましい。

WG¹に係る「アルキルスルホ -ル」の「アルキル」部分としては、前記 Bの「アルキル」 と同じものを挙げることができる。

WG¹に係る「ァリールスルホ -ル」の「ァリール」部分としては、前記 Bの「ァリール」と 同じものを挙げることができる。

「スルホキシド系溶媒」としては、例えば、下記一般式 (I)で表される化合物を挙げる ことができる。具体的には、ジメチルスルホキシド（以下、「DMSO」という。）、ェチル メチルスルホキシド等を挙げることができる。この中で、 DMSOが適当である。

「アミド系溶媒」としては、例えば、下記一般式 (Π)で表される化合物を挙げることが できる。具体的には、 N, N—ジメチルホルムアミド（以下、「DMF」という。）、 N, N— ジェチルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、 N, N—ジェチルァセトアミド、 N —メチルピロリドン等を挙げることができる。この中で、 DMFが適当である。

[化 4]

( I ) ( I I ) 式 (I)及び (Π)中、 R^a、 R^bは、同一又は異なって、アルキルを表す。 R^e、 R^dは、同一 若しくは異なって、アルキルを表し、 R^eは、水素若しくはアルキルを表す力、又は、 R^d は、アルキルを表し、 R^eと R^eが隣接する窒素原子及び炭素原子と一緒になつて形成 する、 5若しくは 6員の飽和環状アミド基を表す。

また、本発明として、次の一般式（10)で表されるオリゴ核酸誘導体に、 TBAFを作 用させ各リボースの 2 '位水酸基を保護して 、る中性条件下にお 、て脱離可能なェ 一テル型保護基を脱離する工程において、 THFを含有していてもよい、スルホキシ ド系溶媒若しくはアミド系溶媒又はこれらの混合溶媒を反応溶媒として用いることを 特徴とする、次の一般式（11)で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程を含む、 次の一般式 (A)で表されるオリゴ RNA (以下、「オリゴ RNA(A)」という。）の製造方 法を挙げることができる。

[化 5]

( 1 0 ) ( 1 1 )

式（10)及び（11)中、各 B、各 Q、各 R、各 R⁴は、それぞれ独立して、前記と同義で ある。 n、

Zは、前記と同義である。

式 (A)中、各 B、各 Q、各 Rは、それぞれ独立して、前記と同義である。 n、 Zは、前 記と同義である。

[0007] 以下、本発明を詳細に説明する。

[0008] I.ホスホロアミダイト化合物

上記オリゴ RNA (A)の製造に使用するリボ核酸誘導体として、次の一般式 (B)で 表されるホスホロアミダイトイ匕合物（以下、「ホスホロアミダイトイ匕合物（B)」と 、う。）を 挙げることができる。

[化 7]

WG²

( B )

式 (B)中、 Bzは、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。

WG¹は、前記と同義である。 WG²は、電子吸引性基を表す。 R^2a、 R^2bは、同一若 しくは異なって、アルキルを表す力、又は、 R^2a、 R^2bが隣接する窒素原子と一緒にな つて形成する、 5〜6員の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミノ環基は、窒素原子 の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を 1個有していてもよい。

[0009] Bzに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限さ れず、例えば、シトシン、ゥラシル等のピリミジン塩基、アデニン、グァニン等のプリン 塩基が挙げることができる。

Bzに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよぐなかでもアミノ基を有する核酸塩 基、例えば、アデニン、グァニン、シトシンは、ァミノ基が保護されているのが好ましい 。力かる「ァミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特 に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾィル、 4ーメトキシベンゾィル、ァセチル、 プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 t ert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、 （ジメチルアミ ノ)メチレン等を挙げることができる。

Bzの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されて 、る基であり、 Bzの「 修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリールアル キル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジァ ルキルァミノ、カルボキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1 〜3個置換されている。

Bzの修飾体に係る「ノヽロゲン」、 「ァシル」、 「アルキル」、 「ァリールアルキル」、 「アル コキシ」、 「アルコキシアルキル」、 「モノアルキルァミノ」、 「ジアルキルァミノ」としては、 前記 Bの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。

R^2a、 R^2bに係る「アルキル」としては、前記 Bの修飾体に係る「アルキル」と同じものを 挙げることができる。

R^2a、 R^2bに係る「5〜6員の飽和アミノ環基」としては、例えば、ピロリジン— 1—ィル、 ピぺリジン 1 ィル、モルホリン 1 ィル、チオモルホリン一 1 ィルを挙げること ができる。

WG²に係る「電子吸引性基」としては、前記 WG¹の電子吸引基と同じものを挙げる ことができる。

ホスホロアミダイト化合物 (B)は、 2'位の水酸基に中性条件下において脱離可能な エーテル型保護基を有するホスホロアミダイトイ匕合物である。また、 2'位の水酸基に 導入された基が直鎖状の置換基であり、 3'位の水酸基に結合するリン原子の周りに おける立体が混み合って 、な 、ため、従来から使用されて 、るホスホロアミダイトイ匕 合物と比較して、オリゴ RNAを合成する際、非常に短時間に縮合反応が進行し、縮 合収率がょ ヽと ヽぅ特徴を有する。ホスホロアミダイト化合物 (B)を使用することにより 、オリゴ DNAの製造と同様の手法を用いて、高純度のオリゴ RNA(A)の製造が可能 である。 ここで、「オリゴ DNA」とは、デォキシリボ核酸（DNA)のみ力もなるオリゴ核酸を！、う 。また、本発明において「オリゴ RNA」とは、リボ核酸 (RNA)及びデォキシリボ核酸（ DNA)カゝらなるオリゴ核酸であり、少なくとも 1つはリボ核酸 (RNA)を含有するオリゴ 核酸をいう。

発明を実施するための最良の形態

[0011] 以下に示す製法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基 (例えば、ヒドロキシ 、アミ入カルボキシ)を有する場合は、原料をあら力じめ公知の方法に従い、適当な 保護基で保護した後に反応を行う。保護基は、最終的に、接触還元、アルカリ処理、 酸処理などの公知の方法に従い保護基を脱離することができる。

[0012] II.ホスホロアミダイト化合物（B)の製法

ホスホロアミダイトイ匕合物（B)は、次のようにして製造することができる。

ホスホロアミダイトイ匕合物（B)は、公知化合物又は容易に製造可能な中間体から、 例えば、次の工程 a〜工程 hの操作を実施することにより製造することができる。

以下、詳細に説明する。

[0013] (1)工程 a :

次の一般式（ 12)で表されるリボ核酸誘導体にアルキル化試薬を作用させること〖こ よって、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入す る、次の一般式（13)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。

[化 8]

( 1 2 ) ( 1 3 ) ( 1 3 ' ) 式（12)、（13)及び（13' )中、 Bz、

WG¹は、前記と同義である。

「アルキル化試薬」として、例えば、次の一般式（14)で表されるエーテルィ匕合物を 挙げることができる。 しへ^^ ^WG

( 1 4 )

式（14)中、 Lは、ハロゲン、ァリールチオ基、アルキルスルホキシド基又はアルキル チォ基を表す。 WG¹は、前記と同義である。

Lに係る「ノヽロゲン」、「ァリールチオ基」の「ァリール」、「アルキルスルホキシド基」及 び「アルキルチオ基」の「アルキル」としては、前記 Bの修飾体に係る「ノヽロゲン」、「ァ リール」、「アルキル」と同じものを挙げることができる。

エーテル化合物（14)の具体例としては、次の 1〜2の化合物を挙げることができる

1.クロロメチル 2—シァノエチルエーテル

2. 2—シァノエチル メチルチオメチルエーテル

エーテル化合物（14)は、中性条件下において脱離可能なエーテル型置換基を、 2'位の水酸基に塩基性条件下において導入することができる新規なアルキルィ匕試 薬であり、ホスホロアミダイト化合物 (B)を製造するための試薬として有用である。 エーテル化合物（14)は、次に示す工程 1〜工程 4を実施することにより製造するこ とがでさる。

工程 1 :

次の一般式（15)で表されるアルコール化合物をアルキルチオメチル化し、次の一 般式（ 16)で表される化合物を製造する工程。

[化 10]

_HO〜WG1 R 八。〜

( 1 5 ) ( 1 6 ) 式（15)及び（16)中、 WG¹は、前記と同義である。 R³は、アルキル又はァリールを 表す。

化合物（16)は、 Lがアルキルチオ基であるエーテルィ匕合物（14)である。

R³に係る「アルキル」としては、前記 Bの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げ ることがでさる。 R³がメチルである場合、アルキルチオメチル化試薬としては、例えば、ジメチルスル ホキシド、無水酢酸及び酢酸の混合溶液を挙げることができる。「ジメチルスルホキシ ド」の使用量は、化合物（15)のモル量に対して、 10〜200倍モル量が適当であり、 好ましくは 20〜 100倍モル量である。「酢酸」の使用量は、化合物（15)のモル量に 対して、 10〜150倍モル量が適当であり、好ましくは 20〜100倍モル量である。「無 水酢酸」の使用量は、化合物（15)のモル量に対して、 10〜150倍モル量が適当で あり、好ましくは 20〜： L00倍モル量である。反応温度は、 0°C〜100°Cが適当である 。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常 1〜48時 間が適当である。

工程 2 :

化合物（16)をハロゲンィ匕し、次の一般式（17)で表される化合物を製造する工程。

[化 11]

_R3SA₀〜 . x^o—

( 1 6 ) ( _{1 7} ) 式（16)及び（17)中、

R³は、前記と同義である。 X²は、ハロゲンを表す。 化合物（17)は、エーテルィ匕合物（14)における Lがハロゲンである化合物である。 X²に係る「ノヽロゲン」としては、前記 Bの修飾体に係る「ノヽロゲン」と同じものを挙げる ことができる。

本工程は、公知の方法（例えば、 T. Bennecheら、 Synthesis 762 (1983) )によ り実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されない 1S 例えば、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロェタンなどの ハロゲン系炭化水素等を挙げることができる。ハロゲン化試薬としては、例えば、塩ィ匕 スルフリル、ォキシ塩化リンを挙げることができる。「ハロゲンィ匕試薬」の使用量は、化 合物（16)のモル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜10倍 モル量である。反応温度は、 0°C〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原 料の種類、反応温度等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。

工程 3 : 化合物（ 17)をァリ一ルチオィ匕し、次の一般式（18)で表される化合物を製造するェ 程。

[化 12]

_X2へ。〜 . R 。〜

( 1 7 ) ^{( 1 8 )}

式（17)及び（18)中、

X²は、前記と同義である。 R^3aは、ァリールを表す。 化合物（18)は、エーテルィヒ合物（14)における Lがァリールチオ基である化合物で ある。

R^3aに係る「ァリール」としては、前記 Bの修飾体に係る「ァリール」と同じものを挙げ ることがでさる。

本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与 しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、ァセトニトリルを挙げること ができる。ァリールチオ化試薬としては、例えば、チォフエノール、 4 メチルベンゼン チオールを挙げることができる。「ァリールチオィ匕試薬」の使用量は、化合物（17)の モル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜5倍モル量である o反応温度は、 0°C〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反 応温度等によって異なるが、通常 1〜48時間が適当である。

工程 4 :

化合物（16)を酸化し、次の一般式（19)で表される化合物を製造する工程。

[化 13] 〜 。〜

O

( 1 6 ) ( 1 9 ) 式（16)及び（19)中、

R³は、前記と同義である。

化合物（19)は、エーテルィ匕合物（14)における Lがアルキルスルホキシド基である 化合物である。

R³に係る「アルキル」としては、前記 Bの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げ ることがでさる。 本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与 しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、メタノールを 挙げることができる。酸化剤としては、例えば、メタクロ口過安息香酸、メタ過ヨウ素酸 塩、過酸ィ匕水素を挙げることができる。「酸化剤」の使用量は、化合物（16)モル量に 対して、 0. 8〜10倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜2倍モル量である。反応温 度は、 0°C〜100°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等 によって異なる力 通常 1〜48時間が適当である。

[0015] 「アルキル化試薬」として、化合物（17)を使用する場合、以下のように実施すること ができる。

本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能であるリボ核酸誘導体（12)にアルキル化試薬と塩基とを作用させること により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定され ないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロエタンな どのハロゲン系炭化水素を挙げることができる。「アルキル化試薬」の使用量は、リボ 核酸誘導体（12)のモル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1 〜： LO倍モル量である。本工程において、必要に応じて、リボ核酸誘導体（12)に金属 試薬と塩基を作用させ製造される中間体を経由した後、アルキル化試薬を作用させ ることもできる。力かる「金属試薬」として、例えば、二塩ィ匕ジブチルスズを挙げること 力 Sできる。「金属試薬」の使用量は、リボ核酸誘導体（12)のモル量に対して、 0. 8〜 20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。「塩基」としては、ピリジ ン、 2, 6—ジメチルビリジン、 2, 4, 6—トリメチルピリジン、 N—メチルイミダゾール、ト リエチルァミン、トリブチルァミン、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン、 1, 8—ジァザ ビシクロ [5. 4. 0]— 7—ゥンデセンなどの有機塩基等を挙げることができる。「塩基」 の使用量は、リボ核酸誘導体（12)のモル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当で あり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。反応温度は、 0°C〜120°Cが適当である。反 応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常 30分〜 24時 間が適当である。

[0016] 「アルキル化試薬」として、化合物（16)又は化合物（18)を使用する場合、以下のよ うに実施することができる。

本工程は、公知の方法（例えば、 M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 (1990) )に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合 成可能であるリボ核酸誘導体（12)に、アルキル化試薬と酸と硫黄原子に対するハロ ゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量 は、リボ核酸誘導体（12)のモル量に対して、 0. 8〜5倍モル量が適当であり、好まし くは 1〜3倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフ ルォロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルォロメタンスルホネートを挙げること 力 Sできる。「酸」の使用量は、リボ核酸誘導体（12)のモル量に対して、 0. 01〜20倍 モル量が適当であり、好ましくは 0. 02〜： L0倍モル量である。使用する溶媒は、反応 に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩 ィ匕炭素、 1, 2—ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、 THF、ァセトニトリル 又はこれらの任意の混合溶媒を挙げることができる。本工程において使用する「硫黄 原子に対するハロゲン化剤」として、例えば、 N—ブロモスクシンイミド（NBS)、 N—ョ 一ドスクシンイミド (NIS)を挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の 使用量は、リボ核酸誘導体（12)のモル量に対して、 0. 8〜10倍モル量が適当であ り、好ましくは 1〜5倍モル量である。反応温度は、— 78°C〜30°Cが適当である。反 応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常 5分〜 5時間 が適当である。

「アルキル化試薬」として、化合物（19)を使用する場合、以下のように実施すること ができる。

本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能であるリボ核酸誘導体（12)に、アルキルィ匕試薬と酸無水物と塩基とを作 用させること〖こより実施することができる。「アルキルィ匕試薬」の使用量は、リボ核酸誘 導体（12)のモル量に対して、 0. 8〜5倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜3倍モ ル量である。「酸無水物」としては、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸無水物、無 水酢酸を挙げることができる。「酸無水物」の使用量は、リボ核酸誘導体（12)のモル 量に対して、 0. 01〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 0. 02〜10倍モル量であ る。塩基としては、例えば、テトラメチルゥレア、コリジンを挙げることができる。「塩基」 の使用量は、リボ核酸誘導体（12)のモル量に対して、 0. 01〜20倍モル量が適当 であり、好ましくは 0. 02〜： LO倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなけ れば特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2 ージクロロェタン又はこれらの任意の混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、

— 78°C〜30°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によ つて異なるが、通常 5分〜 24時間が適当である。

[0018] (2)工程 b :

工程 aにおいて製造されるリボ核酸誘導体（13)を単離精製する工程。 本工程は、工程 aにおいて製造される混合物カゝら通常の分離精製手段、例えば、 薄層クロマトグラフィー、シリガゲルクロマトグラフィーなどの手段を用いることにより単 離精製することができる。

[0019] (3)工程 c :

工程 bとは別に、次の一般式（20)で表されるリボ核酸誘導体にアルキルィ匕試薬を 作用させることによって、中性条件下にお 、て脱離するエーテル型保護基を 2 '位の 水酸基に導入した、次の一般式 (21)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。

[化 14]

式（20)及び（21)中、 Bz、 WG¹は、前記と同義である。

Aは、次の一般式（22a)又は（22b)で表されるケィ素置換基を表す。

[化 15]

R⁶ R^{6 6}

■S卜 O- Sト — Si—

R⁶ R⁶ R⁶

式（22a)及び（22b)中、 R⁶は、アルキルを表わす。 R⁶に係る「アルキル」としては、前記 Bの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げ ることがでさる。

「アルキル化試薬」としては、前記と同じものを挙げることができる。

[0020] 「アルキル化試薬」として、化合物（17)を使用する場合、以下のように実施すること ができる。

本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能であるリボ核酸誘導体 (20)にアルキル化試薬と塩基とを作用させること により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定され ないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロエタンな どのハロゲン系炭化水素等を挙げることができる。「アルキル化試薬」の使用量は、リ ボ核酸誘導体（20)のモル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜： LO倍モル量である。本工程において、必要に応じて、リボ核酸誘導体（20)に金 属試薬と塩基を作用させ製造される中間体を経由した後、アルキル化試薬を作用さ せることもできる。力かる「金属試薬」として、例えば、二塩化ジブチルスズ、 tert—ブ チルマグネシウムクロリドを挙げることができる。「金属試薬」の使用量は、リボ核酸誘 導体（20)のモル量に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜10倍 モル量である。「塩基」としては、ピリジン、 2, 6—ジメチルビリジン、 2, 4, 6—トリメチ ルビリジン、 N—メチルイミダゾール、トリエチルァミン、トリブチルァミン、 N, N—ジィ ソプロピルェチルァミン、 1, 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0]— 7—ゥンデセンなどの有 機塩基等を挙げることができる。「塩基」の使用量は、リボ核酸誘導体 (20)のモル量 に対して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。反応 温度は、 0°C〜120°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度 等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。

[0021] 「アルキル化試薬」として、化合物（16)又は化合物（18)を使用する場合、以下のよ うに実施することができる。

本工程は、公知の方法（例えば、 M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31 , 2385 (1990) )に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合 成可能であるリボ核酸誘導体（20)に、アルキル化試薬と酸と硫黄原子に対するハロ ゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量 は、リボ核酸誘導体（20)のモル量に対して、 0. 8〜5倍モル量が適当であり、好まし くは 1〜3倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフ ルォロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルォロメタンスルホネートを挙げること 力 Sできる。「酸」の使用量は、リボ核酸誘導体（20)のモル量に対して、 0. 01〜20倍 モル量が適当であり、好ましくは 0. 02〜： L0倍モル量である。使用する溶媒は、反応 に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩 ィ匕炭素、 1, 2—ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、 THF、ァセトニトリル 又はこれらの任意の混合溶媒を挙げることができる。本工程において使用する「硫黄 原子に対するハロゲン化剤」として、例えば、 N—ブロモスクシンイミド（NBS)、 N—ョ 一ドスクシンイミド (NIS)を挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の 使用量は、リボ核酸誘導体（20)のモル量に対して、 0. 8〜10倍モル量が適当であ り、好ましくは 1〜5倍モル量である。反応温度は、— 78°C〜30°Cが適当である。反 応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常 5分〜 5時間 が適当である。

「アルキル化試薬」として、化合物（19)を使用する場合、以下のように実施すること ができる。

本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能であるリボ核酸誘導体 (20)に、アルキルィ匕試薬と酸無水物と塩基とを作 用させること〖こより実施することができる。「アルキルィ匕試薬」の使用量は、リボ核酸誘 導体（20)のモル量に対して、 0. 8〜5倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜3倍モ ル量である。「酸無水物」としては、例えば、トリフルォロメタンスルホン酸無水物、無 水酢酸を挙げることができる。「酸無水物」の使用量は、リボ核酸誘導体（20)のモル 量に対して、 0. 01〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 0. 02〜10倍モル量であ る。塩基としては、例えば、テトラメチルゥレア、コリジンを挙げることができる。「塩基」 の使用量は、リボ核酸誘導体（20)のモル量に対して、 0. 01〜20倍モル量が適当 であり、好ましくは 0. 02〜： L0倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなけ れば特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2 ージクロロェタン又はこれらの任意の混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、

— 78°C〜30°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によ つて異なるが、通常 5分〜 24時間が適当である。

[0023] (4)工程 d:

工程 a〜工程 cとは別に、リボ核酸誘導体（20)にジメチルスルホキシドと酢酸と無水 酢酸とを作用させることによって、次の一般式 (23)で表されるリボ核酸誘導体を製造 する工程。

[化 16]

式（20)及び（23)中、 A、 Bzは、前記と同義である。

本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従 い合成可能であるリボ核酸誘導体（20)に、ジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸と を作用させること〖こより実施することができる。

「ジメチルスルホキシド」の使用量は、リボ核酸誘導体（20)のモル量に対して、 10 〜200倍モル量が適当であり、好ましくは 20〜 100倍モル量である。「酢酸」の使用 量は、リボ核酸誘導体（20)のモル量に対して、 10〜150倍モル量が適当であり、好 ましくは 20〜： L00倍モル量である。「無水酢酸」の使用量は、リボ核酸誘導体（20)の モル量に対して、 10〜150倍モル量が適当であり、好ましくは 20〜 100倍モル量で ある。反応温度は、 10°C〜50°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、 反応温度等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。

[0024] (5)工程 e :

工程 dにお 、て製造されるリボ核酸誘導体（23)に次の一般式（24)で表されるアル コールィ匕合物と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることによって、中 性条件下において脱離するエーテル型保護基を 2'位の水酸基に導入した、次の一 般式 (21)で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。 [化 17]

式（21)、（23)及び（24)中、 Aゝ Bz、 WG¹は、前記と同義である。

本工程は、公知の方法に従い、リボ核酸誘導体（23)に、アルコール化合物（24)と 酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。 使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメ タン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン 、 THF、ァセトニトリル又はこれらの任意の混合溶媒を挙げることができる。「アルコー ルイ匕合物（24)」の使用量は、リボ核酸誘導体（23)のモル量に対して、 0. 8〜20倍 モル量が適当であり、好ましくは 1〜10倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフ ルォロメタンスルホン酸、トリフルォロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルォロ メタンスルホネートを挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」としては 、例えば、 N—ブロモスクシンイミド（NBS)、 N—ョードスクシンイミド（NIS)を挙げる ことができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、リボ核酸誘導体（23) のモル量に対して、 0. 1〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 0. 2〜10倍モル量 である。反応温度は、— 100°C〜20°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の 種類、反応温度等によって異なるが、通常 5分〜 12時間が適当である。

(6)工程 f :

工程 c又は工程 eにお ヽて製造されるリボ核酸誘導体（21)の 3 '位と 5，位の水酸基 の保護基を脱離する反応を行うことによって、次の一般式 (25)で表されるリボ核酸誘 導体を製造する工程。

[化 18]

〜 -

( 2 1 ) ( 2 5 ) 式（21)及び（25)中、 A、 Bz、 WG¹は、前記と同義である。

本工程は、リボ核酸誘導体 (21)を有機溶媒に溶解し、フッ素化剤単独又はフッ素 ィ匕剤と酸 (例えば、酢酸、塩酸、硫酸)とを任意の混合比の混合試薬として反応させ ることにより実施することができる。本工程に使用しうる「フッ素化剤」としては、例えば 、フッ化アンモ-ゥム、 TBAF、トリェチルァミントリヒドロフロリド、フッ化水素ピリジンを 挙げることができる。「フッ素化剤」の使用量としては、リボ核酸誘導体（21)のモル量 に対して、 0. 1〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 0. 2〜10倍モル量である。 反応温度は、 0°C〜120°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応 温度等によって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。

混合試薬におけるフッ素化剤と酸との混合比は、 1 : 2〜1 : 0. 1 (フッ素化剤:酸)が 適当であり、 1 : 1. 2〜1 : 1が好ましい。

(7)工程 g :

工程 fにおいて製造されるリボ核酸誘導体 (25)の 5'位の水酸基に酸性条件下に お!ヽて脱離する保護基 (R¹)を導入する、リボ核酸誘導体（13)を製造する工程。

[化 19]

式（13)及び（25)中、 Bz、 R\ WG¹は、前記と同義である。 X³は、ハロゲンを表す

X³に係る「ノヽロゲン」としては、前記 Bの修飾体に係る「ノヽロゲン」と同じものを挙げる ことができる。

本工程は、公知の方法に従い、リボ核酸誘導体（25)〖こ R ³を作用させることにより 実施することができる。 R ³の使用量は、リボ核酸誘導体（25)のモル量に対して、 0 . 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。使用する溶媒は 、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ァセトニトリル、 THFを挙げる ことができる。「塩基」としては、ピリジン、 2, 6—ジメチルビリジン、 2, 4, 6—トリメチル ピリジン、 N—メチルイミダゾール、トリエチルァミン、トリブチルァミン、 N, N—ジイソ プロピルェチルァミン、 1, 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0]— 7—ゥンデセンなどの有機 塩基を挙げることができる。「塩基」の使用量は、リボ核酸誘導体（25)のモル量に対 して、 0. 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。反応温度 は、 0°C〜120°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等に よって異なる力 通常 30分〜 24時間が適当である。 (8)工程 h:

工程 b又は工程 fにおいて製造されるリボ核酸誘導体（13)にホスホロアミダイト化試 薬と、必要に応じて活性化剤とを作用させることによって、 3'位の水酸基がホスホロ アミダイトイ匕されたホスホロアミダイト化合物（B)を製造する工程。

[化 20]

式（13)及び（B)中、 Bz、

WG²は、前記と同義である。

「ホスホロアミダイトイ匕試薬」としては、例えば、次の一般式（26a)、 （26b)で表され る化合物を挙げることがでさる。

[化 21] 2^b

式（26a)及び（26b)中、 R^2a、 R^2b、 WG²は、前記と同義である。 X¹は、ハロゲンを表

X¹に係る「ノヽロゲン」としては、前記 Βの修飾体に係る「ノヽロゲン」と同じものを挙げる 二とができる。 本工程は、リポ核酸誘導体（13)にホスホロアミダイト試薬を作用させて、 3'位の水 酸基をホスホロアミダイトイ匕する反応であり、公知の方法に従 、実施することができる 。必要に応じて、活性化剤を使用することもできる。使用する溶媒は、反応に関与し なければ特に限定されないが、例えば、ァセトニトリル、 THFを挙げることができる。

「ホスホロアミダイトイ匕試薬」の使用量は、リボ核酸誘導体（13)のモル量に対して、 0 . 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜10倍モル量である。「活性化剤」とし ては、例えば、 1H—テトラゾール、 5—ェチルチオテトラゾール、 5—べンジルメル力 プトー 1H—テトラゾール、 4, 5—ジクロロイミダゾール、 4, 5—ジシァノイミダゾール、 ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジ-ゥムトリフラート、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン、 2, 4, 6—コリジン ZN—メチルイミダゾールを挙げ ることができる。「活性化剤」の使用量は、リボ核酸誘導体（13)のモル量に対して、 0 . 8〜20倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。反応温度は、 0 °C〜120°Cが適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって 異なるが、通常 30分〜 24時間が適当である。

このようにして、製造されるホスホロアミダイトイ匕合物（B)は、それ自体公知の手段、 例えば、濃縮、液性変換、転溶、溶媒抽出、結晶化、再結晶、分留、クロマトグラフィ 一等により分離精製することができる。

III.オリゴ RNA (A)の製诰方法

オリゴ RNA (A)の製造方法について、以下に詳述する。

[化 22]

式 (A)中、各 B、各 Q、各 Rは、それぞれ独立して、前記と同義である。 n、 Zは、前 記と同義である。 オリゴ RNA (A)の製法は、公知の方法に従い行うことができる力 例えば、次に示 す工程 A〜工程 Hの操作を実施することにより、段階的に 3'から 5'の方向へ核酸モ ノマー化合物を縮合することにより行うことができる。

下記工程に使用されている化合物及び試薬のうち、ホスホロアミダイト化合物 (B) 以外については、オリゴ RNA又はオリゴ DNAの合成に一般的に使用されているも のであれば特に限定されない。また、既存の核酸合成試薬を用いた場合と同様、す ベての工程をマニュアル又は市販の DNA自動合成機を用いて製造することができ る。自動合成機で行うことにより操作法の簡便化、また合成の正確性の点カゝら自動合 成機を用いる方法が望ましい。また、下記工程 A〜工程 Hに記載されている化合物 及び試薬のうち、核酸モノマー化合物以外については、オリゴ DNA又はオリゴ RNA の合成に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。

また、オリゴ RNA(A)の製造方法において、核酸モノマー化合物として少なくとも 1 回はホスホロアミダイトイ匕合物（B)を使用すること〖こよって、各尺のうち少なくとも 1つが 水酸基であるオリゴ RNA(A)を製造することができる。また、例えば、後記する工程 B において、核酸モノマー化合物として、全てホスホロアミダイトイ匕合物（B)を使用する ことにより各 Rが全て水酸基であるオリゴ RNA(A)を製造することができる。

(1) X@A:

次の一般式（1)で表される (オリゴ)核酸誘導体に酸を作用させることによって、 5' 位の水酸基の保護基を脱離して、次の一般式 (2)で表される (オリゴ)核酸誘導体を 製造する工程。

[化 23]

( 1 ) ( 2 ) 式（1)及び（2)中、 n、 R¹は前記と同義である。各 Q、各 R⁴、各 WG²は、それぞれ独 立して、前記と同義である。各 Bxは、それぞれ独立して、保護基を有していてもよい 核酸塩基又はその修飾体を表す。

Eは、ァシル又は次の一般式（5)で表される置換基を表す。

[化 24]

4リンカート |ι相担体 ( 5 ) 式（5)中、 E¹は、単結合又は次の一般式 (6)で表される置換基を表す。

[化 25]

( 6 )

式 (6)中、 Q、 WG²は、前記と同義である。

Tは、 H、ァシルォキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルァミノ、ジァ ルキルァミノ、アルケニルォキシ、アルケニルチオ、アルケニルァミノ、ジァルケニルァ ミ入アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アルキニルァミノ、ジアルキニルアミ入ァ ルコキシアルキルォキシ、前記一般式 (4)で表される置換基又は上記一般式（5)で 表される置換基を表す。但し、 E又は Tのどちらか一方は、置換基 (5)を表す。

Bxに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限さ れず、例えば、シトシン、ゥラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グァニン等の プリン塩基を挙げることができる。

Bxに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよぐなかでもアミノ基を有する核酸塩 基、例えば、アデニン、グァニン、シトシンは、ァミノ基が保護されているのが好ましい かかる「ァミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特 に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾィル、 4ーメトキシベンゾィル、ァセチル、 プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 t ert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、（ジメチルアミ ノ)メチレンを挙げることができる。

Bxの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、 Bxの「 修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリールアル キル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジァ ルキルァミノ、カルボキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1 〜3個置換されている。

Bxの修飾体に係る「ノヽロゲン」、 「ァシル」、 「アルキル」、 「ァリールアルキル」、 「アル コキシ」、 「アルコキシアルキル」、 「モノアルキルァミノ」、 「ジアルキルァミノ」としては、 前記 Bの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。

Eに係る「ァシル」としては、前記 Bの修飾体に係る「ァシル」と同じものを挙げること ができる。

丁の「ァシルォキシ」に係る「ァシル」部分としては、前記 Bの修飾体に係る「ァシル」 と同じものを挙げることができる。

Tに係る「ノヽロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルァミノ」及び「ジアルキルァミノ」として は、前記 Bの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。 は、前記 Bの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。

Tに係る「アルコキシアルキルォキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記 Bの修飾 体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。

Tに係る「ァルケ-ルォキシ」、「ァルケ-ルチオ」、「ァルケ-ルァミノ」、「ジァルケ- ルァミノ」の「ァルケ-ル」部分としては、前記 Rに係る「ァルケ-ル」と同じものを挙げ ることがでさる。

Tに係る「アルキ-ルォキシ」、「アルキ-ルチオ」、「アルキ-ルァミノ」、「ジアルキ- ルァミノ」の「アルキニル」部分としては、前記 Rに係る「アルキ -ル」と同じものを挙げ ることがでさる。

Tに係る「アルキルァミノ」、 「ァルケニルァミノ」、 「アルキニルァミノ」は保護されて!ヽ てもよぐ力かる保護基はァミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限さ れず、例えば、トリフルォロアセチル、ベンゾィル、 4—メトキシベンゾィル、ァセチル、 プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 t ert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、（ジメチルアミ ノ)メチレンを挙げることができる。特に、トリフルォロアセチルが好ましい。

本工程は、固相担体に担持されている次の一般式（27a)、（27b)で表される核酸 誘導体 (n= lである核酸誘導体（1) )、又は、工程 A〜工程 Dの操作を行うことにより 製造される固相担体に担持されて 、るオリゴ RNA若しくはオリゴ DNA (n= 2-100 であるオリゴ核酸誘導体（1) ) (以下、「固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体 」という。 )に酸を作用させることにより実施することができる。

[化 26]

式（27a)及び（27b)中、 B は、置換基（5)を

表す。 R²は、ァシルォキシを表す。 R^4aは、 H、ァシルォキシ、ハロゲン、アルコキシ、 アルキルチオ、アルキルァミノ、ジアルキルァミノ、アルケニルォキシ、アルケニルチ ォ、アルケニルァミノ、ジァルケニルァミノ、アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アル キ-ルァミノ、ジアルキ-ルアミ入アルコキシアルキルォキシ又は置換基 (4)を表す

R²、 R^4aの「ァシルォキシ」に係る「ァシル」としては、前記 Bの修飾体に係る「ァシル 」と同じものを挙げることができる。

R^4aに係る「ノヽロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルァミノ」及び「ジアルキルァミノ」とし ては、前記 Bの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。 ては、前記 Bの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。

R^4aに係る「アルコキシアルキルォキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記 Bの修飾 体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。 R に係る「ァルケ-ルォキシ」、「ァルケ-ルチオ」、「ァルケ-ルァミノ」、「ジァルケ -ルァミノ」の「ァルケ-ル」部分としては、前記 Rに係る「ァルケニル」と同じものを挙 げることがでさる。

R^4aに係る「アルキ-ルォキシ」、「アルキ-ルチオ」、「アルキ -ルァミノ」、「ジアルキ -ルァミノ」の「アルキ -ル」部分としては、前記 Rに係る「アルキニル」と同じものを挙 げることがでさる。

R^4aに係る「アルキルァミノ」、「ァルケ-ルァミノ」、「アルキ -ルァミノ」は保護されて いてもよぐ力かる保護基はァミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限 されず、例えば、トリフルォロアセチル、ベンゾィル、 4—メトキシベンゾィル、ァセチル 、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 tert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、（ジメチルァ ミノ)メチレンを挙げることができる。特に、トリフルォロアセチルが好ましい。

「固相担体」としては、例えば、定孔ガラス（controlled pore glass ; CPG)、ォキ サリル化—定孔ガラス（例えば、 Alulら， Nucleic Acids Research, Vol. 19, 15 27 (1991)を参照）、 TentaGel支持体ーァミノポリエチレングリコール誘導体ィ匕支持 体（例えば、 Wrightら， Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)を参照）、

Poros ポリスチレン Zジビュルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。

「リンカ一」としては、例えば、 3 ァミノプロピル、スクシ-ル、 2, 2'ージエタノール スルホ -ル、ロングチェーンアルキルアミノ（LCAA)を挙げることができる。

核酸誘導体 (27a)、核酸誘導体 (27b)は、公知の方法に従い製造される又は市販 品として入手できる固相担体に担持されている核酸誘導体であり、好ましい態様とし ては、例えば、次の一般式（28)、（29)で表される核酸誘導体を挙げることができる。

[化 27]

式（28)及び（29)中、 B WG²は、前記と同義である。

R⁴が置換基 (4)である核酸誘導体（28)、 (29)は、ホスホロアミダイト化合物 (B)か ら公知の方法に従 、製造することができる。 本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルォロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロ 口酢酸を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、 1〜5%の濃度になるように適 当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特 に限定されないが、ジクロロメタン、ァセトニトリル、水又はこれらの任意の混合溶媒を 挙げることができる。上記反応における反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応 時間は、オリゴ核酸誘導体（1)の種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異 なるが、通常 1分〜 1時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持され ている（オリゴ)核酸誘導体に対して 0. 8〜： LOO倍モル量が適当であり、好ましくは 1 〜 10倍モル量である。

(2)工程 B :

工程 Aにおいて製造される (オリゴ)核酸誘導体 (2)に、活性化剤を用いて核酸モノ マー化合物を縮合させ、次の一般式 (7)で表されるオリゴ核酸誘導体を製造するェ

[化 28]

( 7 )

式（2)及び（7)中、各 B、各 Q、各 R⁴、各 WG²は、それぞれ独立して、前記と同義

X

である。 E、 n、 R\ Tは、前記と同義である。 本工程は、固相担体に担持されて！ヽるオリゴ核酸誘導体に核酸モノマー化合物と 活性化剤とを作用させることにより実施することができる。

「核酸モノマー化合物」としては、ホスホロアミダイト化合物 (B)又は次の一般式（30 )で表される核酸誘導体を挙げることができる。

[化 29]

( 3 0 )

式 (30)中、 R R^2a、 R^2b、 R^4a、 WG²は、前記と同義である。 B は、保護基を有して

Y

V、てもよ 、核酸塩基又はその修飾体を表す。

B に係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限さ

Y

れず、例えば、シトシン、ゥラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グァニン等の プリン塩基を挙げることができる。

B に係る「核酸塩基」は、保護されていてもよぐなかでもアミノ基を有する核酸塩基

Y

、例えば、アデニン、グァニン、シトシンは、ァミノ基が保護されているのが好ましい。 かかる「ァミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特 に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾィル、 4—メトキシベンゾィル、ァセチル、 プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フエ二ルァセチル、フエノキシァセチル、 4 t ert ブチルフエノキシァセチル、 4 イソプロピルフエノキシァセチル、 （ジメチルアミ ノ)メチレンを挙げることができる。

Bの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、 Bの「

Y Y

修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、ァシル、アルキル、ァリールアル キル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミ入モノアルキルアミ入ジァ ルキルァミノ、カルボキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に 1 〜3個置換されている。

B の修飾体に係る「ノヽロゲン」、 「ァシル」、 「アルキル」、 「ァリールアルキル」、 「アル コキシ」、 「アルコキシアルキル」、 「モノアルキルァミノ」、 「ジアルキルァミノ」としては、 前記 Bの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。

「活性化剤」としては、前記と同じものを挙げることができる。

反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ァセトニト リル、 THFを挙げることができる。上記反応における反応温度は、 20°C〜50°Cが好 ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体 (2)の種類、使用する活性化剤の種類、反応 温度等によって異なるが、通常 1分〜 1時間が適当である。使用する試薬の量は固 相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して 0. 8〜： LOO倍モル量が適当であ り、好ましくは 1〜 10倍モル量である。

(3)工程 C :

工程 Bにおいて未反応である (オリゴ)核酸誘導体（2)の 5，位の水酸基をキヤッピン グする工程。

[化 30]

( 2 ) ( 8 ) 式（2)及び (8)中、各 B、各 Q、各 R⁴、各 WG²は、それぞれ独立して、前記と同義

X

である。 E、 n、 Tは、前記と同義である。 R⁵は、メチル、フエノキシメチル、 tert—ブチ ルフエノキシメチルを表す。

本工程は、工程 Bにおいて未反応であった 5'位の水酸基を保護する反応であり、 固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体にキャップ化剤を作用することにより実 施することができる。

「キャップ化剤」としては、例えば、無水酢酸、フ ノキシ酢酸無水物又は tert—ブ チルフエノキシ酢酸無水物を挙げることができる。キャップ化剤は、 0. 05〜： LMの濃 度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関 与しなければ特に限定されないが、ピリジン、ジクロロメタン、ァセトニトリル、 THF又 はこれらの任意の混合溶媒を挙げることができる。また、本工程において必要に応じ て、「反応促進剤」として、例えば、 4—ジメチルァミノピリジン、 N—メチルイミダゾー ルを使用することができる。上記反応における反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい 。反応時間は、オリゴ核酸誘導体 (2)の種類、使用するキャップ化剤の種類、反応温 度等によって異なるが、通常 1分〜 30分が適当である。使用する試薬の量は固相担 体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して 0. 8〜： LOO倍モル量が適当であり、 好ましくは 1〜 10倍モル量である。

(4)工程 D :

工程 Bにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体 (7)に酸化剤を作用させることによつ て亜リン酸基をリン酸基又はチォリン酸基に変換する工程。

[化 31]

( 7 ) ( 9 ) 式（7)及び（9)中、各 B、各 Q、各 R⁴、各 WG²は、それぞれ独立して、前記と同義

X

である。 E、 n、 R\ Tは、前記と同義である。

本工程は、 3価のリンから 5価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相 担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施するこ とがでさる。

リンを酸素で酸化する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素、 tert—プチルヒ ドロペルォキシドを使用することができる。該酸化剤は、 0. 05〜2Mの濃度になるよう に適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応 に関与しなければ特に限定されないが、ピリジン、 THF、水又はこれらの任意の混合 溶媒を挙げることができる。例えば、ヨウ素 Z水 Zピリジン THFあるいはヨウ素 Zピ リジン 酢酸や過酸化剤（tert ブチルヒドロパーォキシド Zメチレンクロリドなど）を 用!/、ることができる。

また、リンを硫黄で酸ィ匕する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、 Beaucage 試薬（3H—1, 2 ベンゾジ オールー3 オン 1, 1 ジォキシド）、 3 アミノー 1 , 2, 4 ジチアゾール—5 チオン (ADTT)を使用することができる。該酸化剤は、 0. 01〜2Mの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に 使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロ ロメタン、ァセトニトリル、ピリジン又はこれらの任意の混合溶媒が挙げられる。

反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（7)の種類 、使用する酸化剤の種類、反応温度等によって異なるが、通常 1分〜 30分が適当で ある。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して 0. 8〜 100倍モル量が適当であり、好ましくは 10〜50倍モル量である。

(5) X@E :

工程 Dにお 、て製造されるオリゴ核酸誘導体 (9)を固相担体力 切り出し、各核酸 塩基部及び各リン酸基の保護基を脱離する工程。

[化 32]

( 9 ) ( 1 0 ) 式（9)及び（10)中、各 B、各 B、各 Q、各 R⁴、各 WG²は、それぞれ独立して、前記

X

と同義である。 E、 n、 R、 R T、 Zは、前記と同義である。 切り出し工程は、所望の鎖長のオリゴ RNAを切り出し剤によって、固相担体及びリ ンカーから外す反応であり、所望の鎖長のオリゴ核酸誘導体が担持された固体担体 に切り出し剤を添加することにより実施することができる。本工程において、核酸塩基 部の保護基を脱離することができる。

「切り出し剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルァミンを挙げることができる 。本工程に使用しうる「切り出し剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロ ピルアルコール、ァセトニトリル、 THF又はこれらの任意の混合溶媒で希釈して使用 することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。

反応温度は、 15°C〜75°Cが適当であり、好ましくは 15°C〜30°Cであり、より好まし くは 18°C〜25°Cである。脱保護反応時間は、オリゴ核酸誘導体 (9)の種類、反応温 度等によって異なる力 10分〜 30時間が適当であり、好ましくは 30分〜 24時間であ り、より好ましくは 1〜4時間である。脱保護に使用される溶液中の水酸ィ匕アンモニゥ ムの濃度は、 20〜30重量％が適当であり、好ましくは 25〜30重量％であり、より好 ましくは 28〜30重量％である。使用する試薬の量は、固相担体に担持されているォ リゴ核酸誘導体に対して 1〜： L 00倍モル量が適当であり、好ましくは 10〜 50倍モル 量である。

(6)工程 F :

次の一般式（10)で表されるオリゴ核酸誘導体に、 TBAFを作用させ、各リボースの 2'位水酸基の保護基を脱離する工程において、 THFを含有していてもよい、スルホ キシド系溶媒若しくはアミド系溶媒又はこれらの混合溶媒を反応溶媒として用いること によって、次の一般式（11)で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程。

[化 33]

式（10)及び（11)中、各 B、各 Q、各 R、各 R⁴は、それぞれ独立して、前記と同義で ある。 n、 R\ Zは、前記と同義である。

本工程は、オリゴ核酸誘導体（10)に TBAFを作用させることにより実施することが できる。使用する TBAFの量は除去される保護基に対して 1〜 500倍モル量が適当 であり、好ましくは 5〜 10倍モル量である。反応溶媒として、 THFを含有していてもよ い、スルホキシド系溶媒若しくはアミド系溶媒又はこれらの混合溶媒を使用することが できる。また、スルホキシド系溶媒若しくはアミド系溶媒又はこれらの混合溶媒を THF との混合溶媒として使用する場合、スルホキシド系溶媒若しくはアミド系溶媒又はこ れらの混合溶媒に対する THFの使用量は、 0〜95%が適当であり、好ましくは 0〜5 0%である。「THFを含有していてもよい、スルホキシド系溶媒若しくはアミド系溶媒 又はこれらの混合溶媒 (反応溶媒)」の使用量は、オリゴ核酸誘導体 (10)の種類や 使用する反応溶媒等によって異なるが、 TBAFに対して、 0. 8〜： L00倍モル量が適 当であり、好ましくは 1〜10倍モル量である。反応温度は、オリゴ核酸誘導体（10)の 種類や使用する反応溶媒等によって異なるが、 20°C〜80°Cが好ましい。反応時間 は、オリゴ核酸誘導体（10)、使用する反応溶媒や反応温度等によって異なるが、通 常 1時間〜 100時間が適当である。

また、必要であれば、本工程における副生成物であるアクリロニトリルを捕捉するた めに、アクリロニトリルの捕捉剤として、例えば、ニトロアルカン、アルキルァミン、アミ ジン、チオール、チオール誘導体又はこれらの任意の混合物を添加することができる 。「ニトロアルカン」としては、直鎖状の炭素数 1〜6の-トロアルカンを挙げることがで きる。具体的には、例えば、ニトロメタンを挙げることができる。例えば、「アルキルアミ ン」としては、例えば、直鎖状の炭素数 1〜6のアルキルアミンを挙げることができる。 具体的には、例えば、メチルァミン、ェチルァミン、 n プロピルァミン、 n—ブチルアミ ン、 n—ペンチルァミン、 n—へキシルァミンを挙げることができる。「アミジン」としては 、例えば、ベンズアミジン、ホルムアミジンを挙げることができる。「チオール」としては 、例えば、直鎖状の炭素数 1〜6のチオールを挙げることができる。具体的には、例え ば、メタンチオール、エタンチオール、 1 プロパンチオール、 1 ブタンチオール、 1 ペンタンチオール、 1一へキサンチオールを挙げることができる。「チオール誘導体 」としては、例えば、同一又は異なる直鎖状の炭素数 1〜6のアルキルチオール基を 有するアルコール又はエーテルを挙げることができる。具体的には、例えば、 2—メル カプトエタノール、 4 メルカプト 1ーブタノール、 6 メルカプト 1一へキサノール 、メルカプトメチルエーテル、 2 メルカプトェチルエーテル、 3 メルカプトプロピル エーテル、 4 メルカプトブチルエーテル、 5—メルカプトペンチルエーテル、 6—メル カプトへキシルエーテルを挙げることができる。

「アクリロニトリルの捕捉剤」の使用量としては、オリゴ核酸誘導体（10)の種類等によ つて異なる力 オリゴ核酸誘導体（10)の各リボースの 2'位水酸基を保護している 2 —シァノエトキシメチルに対して、 0. 1〜500倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜1 0倍モル量である。

(7)工程 G :

オリゴ核酸誘導体（ 11)の 5 '位の水酸基を脱離する工程。

[化 34]

式（11)及び (Α)中、各 B、各 Q、各 Rは、それぞれ独立して、前記と同義である。 n 、 Zは、前記と同義である。

本工程は、最終的にオリゴ RNAの 5'位水酸基の保護基を脱離する反応であり、固 体担体力 切り出されたオリゴ RNAに酸を作用させることにより実施することができる 本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロ口酢酸、ジクロロ酢酸、酢 酸を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、適当な溶媒で希釈して使用する こともできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタ ン、ァセトニトリル、水、 pHが 2〜5の緩衝液又はこれらの任意の混合溶媒を挙げるこ とができる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液を挙げることができる。上記反応に おける反応温度は、 20°C〜50°Cが好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（11) の種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異なるが、通常 1分〜 1時間が適 当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対し て 0. 8〜100倍モル量が適当であり、好ましくは 1〜 10倍モル量である。

[0036] (8)工程 H :

工程 Gにお 、て製造されるオリゴ RNA (A)を分離精製する工程。

「分離精製工程」とは、上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、 濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、 C力 C の逆相カラムクロマトグラフィー、 C

8 18

力も c 逆相カートリッジカラム、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交

8 18

換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトダラ フィ一、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより、所 望のオリゴ RNAを単離精製する工程である。

「溶出溶媒」としては、例えば、ァセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピル アルコール、水の単独溶媒もしくは任意の比率の混合溶媒を挙げることができる。こ の場合添加物として、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕 カリウム、酢酸アンモ-ゥム、酢酸トリェチルアンモ-ゥム、酢酸ナトリウム、酢酸力リウ ム、トリス塩酸、エチレンジァミン四酢酸を lmM〜2Mの濃度で添カ卩し、溶液の pHを 1〜9の範囲で調整することもできる。

[0037] 工程 A〜工程 Dの操作を繰り返すことにより、所望の鎖長のオリゴ RNA (A)を製造 することができる。なお、本製法においてオリゴ RNA (A)を製造するための出発原料 として、 R^4aが置換基 (4)である化合物（27a)、 R^4aが H若しくはァシルォキシである核 酸誘導体（27a)、又は R²がァシルである核酸誘導体（27b)等を使用することができ る。但し、出発原料として、 R^4aが H若しくはァシルォキシである核酸誘導体（27a)、 又は R²がァシルォキシである核酸誘導体（27b)を使用した場合、核酸モノマー化合 物として、少なくとも 1つは本発明ホスホロアミダイトイ匕合物を使用する必要がある。 実施例

[0038] 以下に参考例、実施例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら のみに限定されない。

[0039] 参考例 1 クロロメチル 2 シァノエチルエーテル

工程 1 メチルチオメチル 2—シァノエチルエーテルの製造

3 ヒドロキシプロピオ-トリル 32g (450mmol)をジメチルスルホキシド 450mlに溶 解し、無水酢酸 324mL、酢酸 23 lmLを加え室温で 24時間攪拌した。炭酸水素ナト リウム 990gを水 4. 5Lに溶解したものを調製し、これに反応液を一時間かけて滴下し た。そのまま一時間攪拌し、反応液を酢酸ェチルにて抽出し、無水硫酸マグネシウム にて乾燥、溶媒留去し得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製 し、無色油状物のメチルチオメチル 2 シァノエチルエーテルを 4 lg得た（収率 70 %)。

'H-NMR CCDCl )： 2. 18 (s, 3H) ; 2. 66 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ; 3. 77 (t, 2H,

3

J = 6. 3Hz) ;4. 69 (s, 2H)

工程 2 クロロメチル 2—シァノエチルエーテルの製诰

工程 1で得られたメチルチオメチル 2 シァノエチルエーテル 3. 3g (25mmol)を 70mLの塩化メチレンに溶解させ、氷冷下 2mL (25mmol)の塩化スルフリルを滴下 し、さらに室温にて一時間反応させた。反応後、溶媒を留去し真空中にて蒸留し、 目 的化合物を無色油状物として 2. 5g得た (収率 85%)。

沸点： 84— 85°C (0. 3Torr)

— NMR (CDC1 )： 2. 72 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ; 3. 92 (t, 2H, J = 6. 3Hz)； 5

3

. 52 (s, 2H)

[0040] 参考例 2 5， O (4. 4，—ジメトキシトリチル） 2， O (2 シァノエトキシメチ ル）ゥリジン 3，一 O— (2 シァノエチル N. N ジイソプロピルホスホロアミダイト） 工程 1 5' O— (4. 4'—ジメトキシトリチル） 2' O （2 シァノエトキシメチル) ゥリジンの製造

5，一 O— (4, 4，一ジメトキシトリチル）ゥリジン 546mg (lmmol)を 1, 2 ジクロロェ タン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mmol)をカ卩え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。そ の後 80°Cにしクロロメチル 2 シァノエチルエーテル 155. 4mg (l. 3mmol)を滴 下、そのまま 30分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応 液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し 、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 5'— O— ( 4, 4，—ジメトキシトリチル） 2，— O— (2 シァノエトキシメチル）ゥリジンを得た（19 7mg ;収率 34%)。

— NMR (CDC1 )： 2. 47 (d, IH, J = 7. 8Hz) ; 2. 69 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ; 3

3

. 55 (dd, IH, 11. 3, 2. 2Hz) ; 3. 62 (dd, IH, 11. 3, 2. 2Hz) ; 3. 83 (s, 6H)； 3. 87 (t, 2H, J = 6. 3Hz) ;4. 07—4. 08 (m, IH) ;4. 32 (dd, IH, J= 5. 3, 1. 9Hz) ;4. 54 (q, IH, J = 5. 3Hz) ;4. 94, 5. 11 (2d, 2H, J = 6. 9Hz) ; 5. 32 (d , IH, J = 8. 2Hz) ; 6. 00 (d, IH, J= l. 9Hz) ; 6. 85— 6. 88 (m, 4H) ; 7. 29— 7. 41 (m, 9H) ; 8. 02 (d, IH, J = 8. 2Hz) ; 8. 53 (br. s, IH)

ESI-Mass : 652[M + Na] ⁺

工程 2 5'—O—（4. 4'ージメトキシトリチル） 2' -0- (2 シァノエトキシメチル) ゥリジン 3，一 O— (2 シァノエチル N. N ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製 造

工程 1で得られた 5，— O— (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2，— O—（2 シァノエト キシメチル）ゥリジン 209mg (0. 332mmol)、テトラゾール 23mg (0. 332mmol)を ァセトニトリル 2mLに溶解し 150mgの（0. 498mmol)の 2 シァノエチル N, N, N ' , N' テトライソプロピルホスホロジアミダイトを滴下し、 45°Cで 1. 5時間反応させた 。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸ェチルにて抽出し、無水硫酸 マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し得られた混合物を 20gのシリカゲルカラムクロマト グラフィ一にて精製し、 目的化合物を得た（200mg ;収率 73%)。

ESI-Mass : 852[M + Na] ⁺

参考例 3 2，一 O （2 シァノエトキシメチノレ）ゥリジン

工程 1 3，. 5'—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1. 3 ジィル）ー2，ー0—（

3' , 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィノレ）ゥリジン 150mg (0. 3mmol)をアルゴン雰囲気下 THF7mLに溶解し、メチルチオメチル 2 シァノエチ ルエーテル 54mg(0.4mmol)、モレキュラーシーブス 4A100mgをカ卩え、 10分攪拌 した。 0°Cにしトリフルォロメタンスルホン酸 10mg(0.06mmol)の THF2mL溶液を 加え攪拌した後、 N ョードスクシンイミド 92mg(0.4mmol)を加え、 1時間攪拌した 。反応液をセライトろ過し、塩化メチレンにて洗浄した後、有機相を 1Mのチォ硫酸水 素ナトリウム水溶液にて洗浄、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸 マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣を薄層クロマトグラフィーにて精 製し、 3', 5，— O— (テトライソプロピルジシロキサン— 1, 3 ジィル）— 2，— O— (2 ーシァノエトキシメチル）ゥリジンを得た（150mg；収率 85%)。

— NMR(CDC1 )： 0.97-1.12(m, 28H) ;2.68— 2.73 (m, 2H) ;3.78

3

-3.86 (m, 1H) ;3.96—4.05 (m, 2H) ;4.12—4.30 (m, 4H) ;5.0— 5.04 (m, 2H) ;5.70 (d, 1H, J = 8.2Hz) ;5.75 (s, 1H) ;7.90 (d, 1H, J = 8.2Hz) ;9.62 (br. s, 1H)

ESI-Mass:570[M + H] ⁺

工程 2 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）ゥリジンの製诰

工程 1で得られた 3，， 5，—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1, 3 ジィル） 2， -0- (2 シァノエトキシメチル）ゥリジン 200mg(0.35mmol)をメタノール 2mL に溶解し、フッ化アンモ-ゥム 65mg(l.76mmol)をカ卩ぇ 50°Cにて 5時間加熱攪拌 した。放冷後ァセトニトリルを加え攪拌し、ろ過濃縮した。得られた残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（108mg;収率 94%)。

— NMR(CD OD)： 2.72— 2.76 (t, 2H, J = 6.2Hz) ;3.68— 3.92 (m, 4

3

H) ;4.00-4.03 (m, 1H) ;4.26—4.32 (m, 2H) ;4.81—4.95 (m, 2H) ;5. 71 (d, 1H, J = 8.1Hz) ;6.00 (d, 1H, J = 3.3Hz) ;8.10 (d, 1H, J = 8. 1Hz

)

ESI-Mass:350[M + Na] ⁺

参考例 4 5，— O— (4.4，—ジメトキシトリチル） 2，— O— (2 シァノエトキシメチ ル)ゥリジンの製造

2，— O—（2 シァノエトキシメチル）ゥリジン 14g(43mmol)をピリジンで共沸し真 空ポンプで 30分乾燥した。 THF300mLに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン 68g( 856mmol)、モレキュラーシーブス 4A20gをカロえ 10分攪拌した。これに 4, 4，一ジメ トキシトリチルクロリド 19. 6g (57. 8mmol)を 3回に分けて 1時間ごとに加え、さらに 1 時間攪拌した。メタノール 10mLを加え 2分攪拌した後、セライトろ過し酢酸ェチルに て洗浄した。ろ液を濃縮後、残渣を酢酸ェチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水 溶液と分液した。有機相を飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシゥ ムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し 、 目的化合物を得た（26. 5g ;収率 98%)。

参考例 5 ァセチル— 5， -0- (4. 4，—ジメトキシトリチル）—2，— O— (2—シ ァノエトキシメチノレ）シチジン 3 '— O—（2—シァノエチノレ N. N—ジイソプロピノレホ スホロアミダイト）

工程 1 ァセチル— 5， -0- (4. 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル)シチジンの製诰

N⁴—ァセチルー 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）シチジン 588mg (lmmol) を 1, 2—ジクロロェタン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mm ol)をカ卩え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で 一時間反応した。その後 80°Cにしクロロメチル 2—シァノエチルエーテル 155. 4m g (l. 3mmol)を滴下、そのまま 60分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液に反応液をカ卩ぇ塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて 乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて 精製し、 N⁴—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル）シチジンを得た（219mg；収率 35%)。

— NMR (CDC1 )： 2. 19 (s, 3H) ; 2. 56 (d, 1H, J = 8. 8Hz) ; 2. 65 (t, 2H,

3

J = 6. 2Hz) ; 3. 55 (dd, 1H, 10. 5, 2. 5Hz) ; 3. 63 (dd, 1H, 10. 5, 2. 5Hz)； 3. 82 (s, 6H) ; 3. 86 (t, 2H, J = 6. 2Hz) ;4. 09—4. 14 (m, 1H) ;4. 28 (d, 1H , J = 5. 1Hz) ;4. 44—4. 49 (m, 1H) ;4. 97, 5. 24 (2d, 2H, J = 6. 9Hz) ; 5. 9 6 (s, 1H) ; 6. 86 -6. 88 (m, 4H) ; 7. 09 (d, 1H, J = 6. 9Hz) ; 7. 26— 7. 42 (m , 9H) ; 8. 48 (d, 1H, J = 6. 9Hz) ; 8. 59 (br. s, 1H)

ESI-Mass : 693 [M + Na] ⁺ 工程 2 ァセチル— 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2' -0- (2 シァ ノエトキシメチル）シチジン 3'—O— (2 シァノエチル N. N—ジイソプロピルホス ホロアミダイト）の製造

工程 1で得られた N⁴—ァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2， -0 一（2 シァノエトキシメチル） シチジン 205mg (0. 306mmol)を塩化メチレン 2mL に溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 105mg (0. 812mmol)をカ卩ぇ 2 シァノエチ ル N, N ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 116mg (0. 49mmol)を滴下し、室 温で 1時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を 20gのシリカゲル力 ラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（242mg ;収率 91%)。

ESI-Mass : 871 [M + H] ⁺

参考例 6 N^A—ァセチノレー 2'— O—（2 シァノエトキシメチノレ）シチジン

工程 1 ァセチルー 3' . 5'— O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1. 3 ジィ ル） 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）シチジンの製诰

N⁴ ァセチノレ 3，， 5，一 O （テトライソプロピルジシロキサン 1 , 3 ジィル）シ チジン 1. OOg (l. 89mmol)とメチルチオメチル 2 シァノエチルエーテル 500mg (3. 79mmol)を混合し、トルエン 10mLと THFlOmLの混合溶媒に溶解した。つい でトリフルォロメタンスルホン酸銀 975mg (3. 79mmol)を加え、モレキュラーシーブ ス 4Aを加え、乾燥した。氷冷下、 N ブロモスクシンイミド 370mg (2. 08mmol)をカロ え、反応容器を遮光し、 10分間撹拌した。さらに N—プロモスクシンイミド 70mg (0. 3 9mmol)を追加し、 25分間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンを加えて希釈し、飽 和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留 去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 N⁴—ァセチ ルー 3，， 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィル）一 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル)シチジンを得た。 (936mg；収率 81 %)。

— NMR (CDC1 ) ： 0. 90- 1. 11 (m, 28H) ; 2. 28 (s, 3H) ; 2. 62— 2. 79 (

3

m, 2H) ; 3. 78- 3. 89 (m, 1H) ; 3. 96—4. 04 (m, 2H) ;4. 19—4. 23 (m, 3H ) ;4. 30 (d, 1H, J= 13. 6Hz) ; 5. 00 (d, 1H, J = 6. 8Hz) ; 5. 09 (d, 1H, J=6. 8Hz) ; 5. 77 (s, 1H) ; 7. 44 (d, 1H, J = 7. 5Hz) ; 8. 30 (d, 1H, J = 7. 5Hz) ; 10 . 13 (s, 1H)

ESI-Mass : 611 [M + H] ⁺

工程 2 N ァセチルー 2，—O—（2—シァノエトキシメチノレ)シチジンの製造

工程 1で得られた N⁴—ァセチノレー 3' , 5' O （テトライソプロピノレジシロキサン 1, 3 ジィル）— 2，— O— (2 シァノエトキシメチル）シチジン 500mg (0. 819mm ol)を THF2. 5mLとメタノール 2. 5mLの混合溶媒に溶解し、フッ化アンモ-ゥム 15 0mg (4. lOmmol)をカ卩え、 50°Cで 4時間反応させた。反応終了後、ァセトニトリルに て希釈、濾過し、溶媒を留去し得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー にて精製し、 目的化合物を得た（210mg ;収率 70%)。

— NMR (D O)： 2. 13 (s, 3H) ; 2. 66— 2. 71 (m, 2H) ; 3. 72— 3. 78 (m, 3

2

H) ; 3. 90 (dd, 1H, 13. 0, 2. 6Hz) ;4. 06—4. 11 (m, 1H) ;4. 20 (dd, 1H, J = 7. 1, 5. 2Hz) ;4. 29 (dd, 1H, J = 5. 1, 2. 9Hz) ;4. 83 (d, 1H, J = 7. 2Hz) ;4. 94 (d, 1H, J = 7. 2Hz) ; 5. 95 (d, 1H, J = 2. 9Hz) ; 7. 25 (d, 1H, J = 7. 6 Hz) ; 8. 25 (d, 1H, J = 7. 6Hz)

ESI— Mass : 391 [M + Na] +

[0045] 参考例 7 N^—ァセチル— 5' O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2' O— (2 シ ァノエトキシメチノレ)シチジンの製诰

2，—O— (2 シァノエトキシメチル）シチジン 9. 9g (26. 8mmol)をピリジンで共沸 し真空ポンプで 30分乾燥した。 THF190mLに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン 4 3g (538mmol)、モレキュラーシーブス 4A20gをカ卩ぇ 10分攪拌した。これに 4, 4， - ジメトキシトリチルクロリド 11. 8g (34. 9mmol)を 3回に分けて 1時間ごとに加え、さら に 1時間攪拌した。メタノール 2mLを加え 2分攪拌した後、セライトろ過し酢酸ェチル にて洗浄した。ろ液をエバポレーターで濃縮後残渣を酢酸ェチルに溶解し、飽和炭 酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄、 無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマト グラフィ一にて精製し、 目的化合物を得た（15g ;収率 83%)。

[0046] 参考例 8 N²—ァセチル— 5， -0- (4. 4，—ジメトキシトリチル）—2， O— (2 シ ァノエトキシメチル)グアノシン 3，一 O (2 シァノエチル N._N -ジイソプロピル ホスホロアミダイト）

工程 1 N²—ァセチルー 5，— O—（4.4，ージメトキシトリチル）ー 2' -0-し 2—シァ

N²—ァセチルー 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）グアノシン 627mg(lmmol) を 1, 2—ジクロロェタン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3.5mm ol)をカ卩え、ついで 365mg(l.2mmol)の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で 一時間反応した。その後 80°Cにしクロロメチル 2—シァノエチルエーテル 155.4m g(l.3mmol)を滴下、そのまま 60分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液に反応液をカ卩ぇ塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて 乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて 精製し、 N²—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル）グアノシンを得た (450mg；収率 63%)。

— NMR(CDC1 )： 1.92 (s, 3H);2.47— 2.51 (m, 2H) ;2.68 (br. s, 1H)

3

;3.30 (dd, 1H, 10.7, 3.8Hz) ;3.47 (dd, 1H, 10.7, 3.8Hz) ;3.55— 3.6 0(m, 1H) ;3.65-3.70 (m, 1H) ;3.74, 3.75 (2s, 6H) ;4.22—4.23 (m, 1 H) ;4.55-4.58 (m, 1H) ;4.78, 4.83 (2d, 2H, J = 7.0Hz) ;5.01 (t, 1H, J =5. 1Hz) ;5.99 (d, 1H, J = 5.1Hz) ;6.76— 6.79 (m, 4H) ;7.17— 7.44 ( m, 9H) ;7.88 (s, 1H) ;8.36 (br. s, 1H) ;12.06 (br. s, 1H)

工程 2 N²—ァセチル— 5，— O— (4.4，—ジメトキシトリチル）—2， -0- (2—シァ ノエトキシメチル）グアノシン 3 '— O— (2—シァノエチル N. N—ジイソプロピルホ スホロアミダイト）の製造

工程 1で得られた N²—ァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2， -0 - (2—シァノエトキシメチル）グアノシン 400mg(0.563mmol)を塩化メチレン 2mL に溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 181mg(l.4mmol)をカ卩ぇ 2—シァノエチル N, N—ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 161mg(0.68mmol)を滴下し、室温 で 1時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を 20gのシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た (471mg;収率 92%)。

参考例 9 N^s—ァセチノレ -5'-0-(4^4'-ジメ上キシ チノレ _)— 2，— O— 2—シ. ァノエトキシメチノレ）アデノシン 3，一O— (2—シァノエチノレ N. N—ジイソプロピノレ ホスホロアミダイト）

工程 1 N^s—ァセチル— 5，— O—（4. 4，ージメトキシトリチル）ー 2' -0-し 2—シァ

N⁶—ァセチル— 5，— O— (4, 4，—ジメトキシトリチル）アデノシン 22. Og (36. Om mol)を 1, 2—ジクロロェタン 170mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 16. 3g ( 126mmol)を加え、ついで 12. lg (39. 7mmol)の二塩化ジブチルスズをカ卩えた後 、室温で一時間反応した。その後 80°Cにし 15分間撹拌後、クロロメチル 2—シァノ ェチルエーテル 4. 30g (36. Ommol)を滴下、そのまま 30分間撹拌した。反応終了 後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無 水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロ マトグラフィ一にて精製し、 N⁶—ァセチル一 5， -0- (4, 4，一ジメトキシトリチル） - 2，—O—（2—シァノエトキシメチル）アデノシンを得た。（7. 47g ;収率 33%)

— NMR (CDC1 )： 2. 51 (t, 2H, J = 6. 2Hz) ; 2. 58 (d, 1H, J = 5. 5Hz)； 2

3

. 61 (s, 3H) ; 3. 45 (dd, 1H, J= 10. 7, 4. OHz) ; 3. 54 (dd, 1H, J= 10. 7, 3. 2Hz) ; 3. 62- 3. 79 (m, 2H) ; 3. 79 (s, 6H) ;4. 25 (br. q, 1H, J〜4. 6Hz) ;4 . 59 (q, 1H, J = 5. 2Hz) ;4. 87—4. 94 (m, 3H) ; 6. 23 (d, 1H, J=4. 4Hz) ; 6 . 80-6. 83 (m, 4H) ; 7. 22— 7. 32 (m, 7H) ; 7. 40— 7. 43 (m, 2H) ; 8. 20 (s , 1H) ; 8. 61 (br. s, 1H) ; 8. 62 (s, 1H)

ESI-Mass : 695 [M + H] ⁺

工程 2 N^a—ァセチル— 5'— O— (4. 4'—ジメトキシトリチル）—2' -0- (2—シァ ノエトキシメチル）アデノシン 3，一 O— (2—シァノエチル N. N—ジイソプロピルホ スホロアミダイト）の製造

工程 1で得られた N⁶—ァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2， -0 — (2—シァノエトキシメチル）アデノシン 10. 0g (14. 4mmol)を塩化メチレン 75mL に溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 4. 7g (36mmol)をカ卩ぇ 2—シァノエチル N, N—ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 4. 82g (20. 3mmol)を滴下し、室温で 1 時間反応させた。反応後、溶媒を 30mL程度残して留去し得られた反応混合物をシ リカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（12. Og;収率 93%

)o

ESI-Mass:895[M + H] ⁺

参考例 10 N^a ァセチルー 2， -0- (2 シァノエトキシメチル）アデノシン

工程 1 N^a ァセチルー 3，.5'—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1.3 ジィ ル） 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）アデノシンの製造

N—ョードスクシンイミド 245mg(l.09mmol)とトリフルォロメタンスルホン酸銀 280 mg(l.09mmol)を塩化メチレン 8mLに懸濁させ、モレキュラーシーブス 4Aをカロえ 、乾燥した。ここに、 N⁶ ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィル）アデノシン 400mg(0.73mmol)とメチルチオメチル 2 シァノエチ ルエーテル 145mg(l. llmmol)を塩化メチレン 4mLに溶解し、氷冷下で加えた。 そのまま 3時間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンを加えて希釈し、チォ硫酸ナトリ ゥム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行 、、無水硫酸マグネシウム にて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精 製し、 N⁶ ァセチルー 3，， 5，— O— (テトライソプロピルジシロキサン— 1, 3 ジィル ) -2' -0- (2 シァノエトキシメチル）アデノシンを得た。（201mg;収率 45%) — NMR(CDC1 )： 0.98-1.11 (m, 28H) ;2.62(s, 3H) ;2.69 (td, 2H,

3

6.5, J=l.5Hz) ;3.81-3.89 (m, 1H) ;4.02—4.09 (m, 2H) ;4.17(d, 1

H, J = 9.4Hz) ;4.28 (d, 1H, J=13.4Hz) ;4.50 (d, 1H, J=4.5Hz) ;4.67( dd, 1H, J = 8.8, 4.5Hz) ;5.02 (d, 1H, J = 7.0Hz) ;5.08 (d, 1H, J = 7. OH z) ;6. 10(s, 1H) ;8.34 (s, 1H);8.66 (s, 1H);8.67(s, 1H)

ESI-Mass:636[M + H] ⁺

工程 2 N^a—ァセチル一 2，一 O— (2—シァノエトキシメチル)アデノシンの製造

工程 1で得られた N⁶ ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサン

I, 3 ジィル）一 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）アデノシン 300mg(0.47mm ol)を、酢酸 0. lmLと 0.5M TBAFの THF溶液 2mLの混合溶液に溶解し、室温 で 2時間撹拌した。反応終了後、得られた反応混合物をシリカゲルカラムクロマトダラ フィ一にて精製し、 目的化合物を得た。（160mg;収率 86%)。 H-NMR (DMSO-d6)： 2. 25 (s, 3H) ; 2. 53— 2. 68 (m, 2H) ; 3. 41— 3. 46 (m, 1H) ; 3. 56— 3. 64 (m, 2H) ; 3. 69— 3. 73 (m, 1H) ;4. 00—4. 01 (m , 1H) ;4. 36-4. 37 (m, 1H) ;4. 72—4. 78 (m, 3H) ; 5. 20 (bt, 2H) ; 5. 41 ( d, 1H, J = 5. 2Hz) ; 6. 17 (d, 1H, J = 5. 7Hz) ; 8. 66 (s, 1H) ; 8. 72 (s, 1H) ; 1 0. 72 (s, 1H)

ESI-Mass :415 [M + Na] ⁺

[0049] 参考例 11 N^s ァセチルー 5，—O— (4. 4，ージメトキシトリチル）ー2，—O—（2—

N⁶ ァセチルー 2，— O— (2 シァノエトキシメチル）アデノシン 9. 50g (24. 2mm ol)を脱水ピリジン lOOmLに溶解し、濃縮して乾燥した後、アルゴン雰囲気下、脱水 ピリジン lOOmLに溶解した。氷冷下、 4, 4，—ジメトキシトリチルクロリド 10. 7g (31. 2mmol)を加え、室温で 1時間 20分反応した。反応終了後、塩化メチレンにて希釈し 、水にて洗浄を行い無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシ リカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た。 (13. 8g ;収率 82 %)

[0050] 参考例 12 N²—フエノキシァセチル一 5' -0- (4. 4'—ジメトキシトリチル） 2' - O—（2 シァノエトキシメチノレ）グアノシン 3，一 O—（2 シァノエチノレ N. N ジィ ソプロピルホスホロアミダイト）

工程 1 N²—フエノキシァセチルー 5' -0- (4. 4'ージメトキシトリチル） 2' -0-

N² フエノキシァセチルー 5'— O— (4, 4'—ジメトキシトリチル）グアノシン 720mg (lmmol)を 1, 2 ジクロロェタン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 452mg (3. 5mmol)を加え、ついで 365mg (l. 2mmol)の二塩化ジブチルスズをカ卩えた後 、室温で一時間反応した。その後 80°Cにしクロロメチル 2 シァノエチルエーテル 1 55. 4mg (l . 3mmol)を滴下、そのまま 60分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水 素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシ ゥムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を 30gのシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一にて精製し、 N²—フエノキシァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2 '-Ο- (2 シァノエトキシメチル）グアノシンを得た（384mg;収率 48%)。

— NMR(CDC1 )： 2.47-2.51 (m, 2H) ;2.58 (br. s, 1H) ;3.42 (dd, 1

3

H, 10.1, 3.8Hz) ;3.46 (dd, 1H, 10.1, 3.8Hz) ;3.53— 3.57 (m, 1H) ;3 .69-3.73 (m, 1H) ;3.77(s, 6H) ;4.24—4.26 (m, 1H) ;4.48—4.50 (m , 1H) ;4.61-4.65 (m, 2H) ;4.83, 4.87 (2d, 2H, J=7.0Hz) ;4.88 (t, 1 H, J = 5.7Hz) ;6.05 (d, 1H, J = 5.7Hz) ;6.80— 6.82 (m, 4H) ;6.92— 6. 96 (m, 3H) ;7.07— 7.11 (m, 2H) ;7.20— 7.42 (m, 9H) ;7.84 (s, 1H) ;8. 99 (s, 1H) ;11.81 (br. s, 1H)

ESI-Mass:825[M + Na] ⁺

工程 2 N²—フエノキシァセチルー 5'—O—（4.4'ージメトキシトリチル） 2' -0- (2—シァノエトキシメチル）グアノシン 3'— O— (2—シァノエチル N. N—ジイソプ 口ピルホスホロアミダイトの製诰

工程 1で得られた N²—フエノキシァセチルー 5， -0- (4, 4，ージメトキシトリチル） — 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 320mg(0.399mmol)を塩化メチ レン 4mLに溶解し、ジイソプロピルェチルァミン 128.8mg(0.996mmol)を加え 2 —シァノエチル N, N—ジイソプロピルクロ口ホスホロアミダイト 141.5mg(0.598m mol)を滴下し、室温で 1時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を 3 Ogのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（316mg;収 率 79%)。

ESI-Mass:1003[M + H] ⁺

参考例 13 N²—フエノキシァセチルー 2' -0- (2 シァノエトキシメチル）グアノシ 工程 1 N²—フエノキシァセチルー 3'.5' -0- (テトライソプロピルジシロキサン 1 .3 ジィル） 2'— O—（2 シァノエトキシメチル）グアノシンの製造

N² フエノキシァセチルー 3', 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3- ジィル）グアノシン 2.0g(3. Ommol)を THF16mLに溶解し、メチルチオメチル 2 —シァノエチルエーテル 0.99g(7.6mmol)、モレキュラーシーブス 4A1. Ogをカロ え、アルゴン雰囲気下— 45°Cで 10分攪拌した。トリフルォロメタンスルホン酸 0.68g (4.5mmol)の THF5mL溶液をカ卩ぇ攪拌した後、 N ョードスクシンイミド 1.02g(4 .5mmol)を加え、 15分攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、 ろ過後酢酸ェチルにて抽出、有機相を 1Mのチォ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗 浄、水、次いで飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾 燥、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、 N²—フ エノキシァセチノレ一 3，， 5，一 O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィル） -2'-0- (2 シァノエトキシメチル）グアノシンを得た（2. Og;収率 89%)。

— NMR(CDC1 )： 0.99-1.11 (m, 28H) ;2.59— 2.77 (m, 2H) ;3.82

3

—4.05 (m, 3H) ;4.15 (d, 1H, J = 9.3Hz) ;4.25—4.35 (m, 2H) ;4.52—4 .56 (dd, 1H, J = 9.3, 4.3Hz) ;5.00, 5.07 (2d, 2H, J=7.2Hz) ;5.95(s, 1H)6.99-7.12(m, 3H) ;7.35— 7.40 (m, 2H) ;8.09 (s, 1H) ;9.38 (br. s , 1H) ;11.85 (br. s, 1H)

ESI-Mass:766[M + Na] ⁺

工程 2 N²—フエノキシァセチルー 2'—O—（2—シァノエトキシメチル）グアノシンの 製诰

1M TBAFの THF溶液 2.83mL(2.83mmol)に酢酸 0.14mL(0. 14mmol) をカロえた溶液を調整する。工程 1で得られた N²—フエノキシァセチル— 3，， 5，— O - (テトライソプロピルジシロキサン一 1, 3 ジィル） 2， -0- (2 シァノエトキシメ チル）グアノシン 1.0g(l.35mmol)を THF2.83mLに溶解し、上で調整した溶液 を加えアルゴン雰囲気下室温で 1時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮後、塩化メチ レンに溶解しシリカゲルクロマトグラフィーにのせ精製し、 目的化合物を得た。 (0.67 g;収率 99%)。

— NMR(DMSO— d6)： 2.59— 2.66 (m, 2H) ;3.41— 3.63 (m, 4H) ;3. 98 (m, 1H) ;4.32 (m, 1H) ;4.58—4.62 (t, 1H, J = 5.3Hz) ;4.71—4.78 ( dd, 2H, J=13. 1, 6.8Hz) ;4.87(s, 2H) ;5.12(s, 1H)5.37 (s, 1H) ;5.97 (d, 1H, J = 6. lHz)6.96-6.99 (m, 3H) ;7.28— 7.34 (m, 2H) ;8.30 (s, 1 H) ;11.78 (br. s, 2H)

ESI-Mass:500[M-H]" [0052] 参考例 14 N²—フエノキシァセチル— 5，— O— ( 4，—ジメ キシト JJチル 1— 2，— ,

Ν² フエノキシァセチルー 2， -0- (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 660mg ( 1. 32mmol)をピリジンで共沸し真空ポンプで 30分乾燥した。 THF9mLに溶解し、 アルゴン雰囲気下ピリジン 2. lg (26. 4mmol)、モレキュラーシーブス 4A600mgを 加え 10分攪拌した。これに 4, 4，一ジメトキシトリチルクロリド 540mg (l. 58mmol)を 3回に分けて 1時間ごとに加え、さらに 1時間攪拌した。メタノール 2mLをカ卩ぇ 2分攪 拌した後、セライトろ過し酢酸ェチルにて洗浄した。ろ液をエバポレーターで濃縮後 残渣を酢酸ェチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽 和塩ィ匕ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。 得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た（800mg ；収率 75%)。

[0053] 参考例 15 N^s—ァセチル一 3' . 5'— O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1. 3— ジィル）— 2，— O— (2—シァノエトキシメチル）アデノシン

工程 1 N^a—ァセチル一 3' . 5'— O— (テトライソプロピルジシロキサン一 1. 3 ジィ ル） 2'— O メチルチオメチルアデノシンの製诰

N⁶ ァセチルー 3，， 5，— O— (テトライソプロピルジシロキサン— 1, 3 ジィル）ァ デノシン 2. 00g (3. 62mmol)をジメチルスルホキシド 25mLに溶解し、無水酢酸 17 . 5mL、酢酸 12. 5mLをカ卩ぇ室温で 14時間撹拌した。反応終了後、水 200mLに反 応液を加え、酢酸ェチルにて抽出を行い、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄 を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーにて精製し、 N⁶ ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジ シロキサン— 1, 3 ジィル）—2，—Ο—メチルチオメチルアデノシンを得た。 （1. 36g ；収率 61%)

— NMR (CDC1 )： 0. 96 - 1. 11 (m, 28H) ; 2. 20 (s, 3H) ; 2. 61 (s, 3H)；

3

4. 03 (dd, 1H, J= 13. 4, 2. 4Hz) ;4. 18 (d, 1H, J = 9. 1Hz) ;4. 27 (d, 1H, J = 13. 4Hz) ;4. 63-4. 71 (m, 2H) ; 5. 00 (d, 1H, J= l l. 5Hz) ; 5. 07 (d, 1H , J= l l. 5Hz) ; 6. 09 (s, 1H) ; 8. 31 (s, 1H) ; 8. 65 (s, 1H) ; 8. 69 (s, 1H) ESI-Mass : 635 [M + Na]

工程 2 N^a ァセチルー 3，. 5'—O—(テトライソプロピルジシロキサン 1. 3 ジィ ル） 2'— O—（2—シァノエトキシメチル）アデノシンの製造

工程 1で得られた N⁶ ァセチルー 3，， 5， -0- (テトライソプロピルジシロキサン 1, 3 ジィル）—2，—Ο—メチルチオメチルアデノシン 1. 00g (l. 63mmol)を、 TH F25mLに溶解した。 3 ヒドロキシプロピオ-トリル 5. 88g (82. 7mmol)をカ卩え、モ レキユラーシーブス 4Aをカ卩えて乾燥し、— 45°Cに冷却した。 N ョードスクシンイミド 440mg (l. 96mmol)を加え、ついでトリフルォロメタンスルホン酸 490mg (3. 26m mol)を加えた後、 45°Cで 15分間撹拌した。反応終了後、冷却したままトリェチル アミンを加えて中和し、塩化メチレンにて希釈、チォ硫酸ナトリウム水溶液と飽和炭酸 水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得 られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、 目的化合物を得た。 ( 722mg ;収率 71%)。

参考例 16 ゥリジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3 '→5 Ί ゥリジリ ルー「3 '→5 Ί ゥリジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3 ' →5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥリジリル一「3'→5Ί—ゥ リジリル 3，→5 Ί ゥリジリル 3，→5 Ί ゥリジリル 3，→5 Ί ゥリジリル 「3，→5 Ί—ゥリジリル 3，→5Ί—ゥリジリル 3，→5Ί—ゥリジリル 3，→5Ί ーゥリジン

市販の 2，/3，—Ο ベンゾィル—5，— Ο— (4, 4，—ジメトキシトリチル）ゥリジンが 担持されて ヽる CPG固相担体（37mg, 1 μ mol)をグラスフィルター付きカラムに入 れ、核酸自動合成機 (Expedite™：アプライドバイォシステムズ社)を使用して、標記 化合物のオリゴ RNAの合成を行った。

核酸モノマー化合物として、 5，— O— (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2，— O— (2— シァノエトキシメチル）ゥリジン 3，一 O— (2 シァノエチル N, N ジイソプロピル ホスホロアミダイト）を、縮合触媒としてテトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キ ャッビング溶液として無水酢酸と N メチルイミダゾール溶液を使用した。核酸モノマ 一化合物を 20回縮合させた後、切り出し剤として 10Mのメチルァミンのエタノール水 溶液を用いて、室温中 1〜2時間かけて CPG固相担体からの切り出し及び各リン酸 部位の保護基の脱離反応を行った。反応混合物を減圧下、濃縮後、逆相カラム (O DS)にて不要ピークを除去後、溶出溶媒 (ァセトニトリル— 50mM トリェチルァミン —酢酸緩衝液)を用いて精製した。残渣を減圧下濃縮後、 1M TBAFの THF溶液 を用いて室温 1時間反応し、 2'位の水酸基の保護基を脱離した。溶液を脱塩処理後 、 80%酢酸にて 5'末端の保護基を除去した (室温下 10分)。減圧下濃縮後、水層を エーテル洗浄し、精製をすることなぐ高純度の目的化合物を得た。

MALDI—TOF—MS :計算値 6367. 52 [Μ+ΗΓ

実測値 6366. 50 [Μ+Η] +

参考例 17 ホスホロチォエート結合を有するオリゴ RNAの製造

シチジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3 '→5 Ί アデニリ ルー「3'→5Ί—シチジリル 3'→5Ί—グァニリル 3'→5Ί—シチジリル 3 '→5 Ί ゥリジリル 3，→5 Ί グァニリル 3，→5 Ί アデ二リル 3，→5 Ί グァニリル 3，→5 Ί ゥリジリル 3，→5 Ί アデ二リル 3，→5 Ί—シチ ジリルー「3'→5Ί—ゥリジリル 3'→5Ί—ゥリジリル 3'→5Ί—シチジリル 3，→5，1一グァニリル一「3，→5Ί—アデ二リル一「3，→5Ί—チミジリルー「3，→5， ，一チミジン

市販の 5' -0- (4, 4'—ジメトキシトリチル）チミジンが担持されている CPG固相 担体（22mg, 1 μ mol)をグラスフィルター付きカラムに入れ、核酸自動合成機 (Exp edite™:アプライドバイォシステムズ社)を使用して、標記化合物のオリゴ RNAの合 成を行った。

核酸モノマー化合物として、 5，— O— (4, 4，ージメトキシトリチル）ー2，— O— (2— シァノエトキシメチル）ゥリジン 3，一 O— (2 シァノエチル N, N ジイソプロピル ホスホロアミダイト）、 N⁴—ァセチル— 5， -0- (4, 4，—ジメトキシトリチル）—2，— O 一（2 シァノエトキシメチル）シチジン 3，—O—（2 シァノエチノレ N, N ジイソ プロピルホスホロアミダイト）、 N⁶ ァセチル— 5，— O— (4, 4，—ジメトキシトリチル） — 2，— O— (2 シァノエトキシメチノレ）アデノシン 3，— O— (2 シァノエチノレ N, N ジイソプロピルホスホロアミダイト）、 N²—フエノキシァセチルー 5， -0- (4, 4， —ジメトキシトリチル） 2，一 O— (2 シァノエトキシメチル）グアノシン 3，一 O— (2 —シァノエチル N, N—ジイソプロピルホスホロアミダイト）、 5， -0- (4, 4，一ジメト キシトリチノレ）シチジン 3，一 O— (2 シァノエチノレ N, N ジイソプロピルホスホロ アミダイト）を、縮合剤としてべンジルメルカプトテトラゾールを、酸化剤として Beauca ge試薬（3H—1, 2 ベンゾジチオールー3 オン 1, 1 ジォキシド）を、キヤツビ ング溶液としてフエノキシ酢酸無水物と N—メチルイミダゾール溶液を使用した。核酸 モノマー化合物を 20回縮合させた後、切り出し剤として、濃アンモニア水 エタノー ル混合液（3 : 1)を用いて、 40°C、 4時間かけて CPG固相担体力 の切り出し及び各 リン酸部位の保護基の脱離反応及び塩基の保護基の除去を行った。反応混合物を 減圧下、濃縮後、 2.5 μ Lの-トロメタンを含む 0.5Μ TBAFの DMSO溶液 500 μ L を用いて室温 2時間反応し、 2'位の水酸基の保護基を脱離した。 250 /ζ Ι^ 1Μ Tr is— HC1緩衝液（pH7. 5)をカ卩えたのち、 8mLのエタノールに滴下し、反応生成物を 沈殿させた。終夜、冷蔵庫に保存した後、上澄みを除去し、 ODSカラム (LiChropre p RP— 18)にて精製した。 80%酢酸水溶液にて 4, 4'—ジメトキシトリチルを脱保 護し、酢酸ェチルと水にて分液操作を行い、水層を濃縮し、 目的化合物を得た (80 OD ；収率 40%)。

260

MALDI—TOF—MS :計算値 6928. 4 [Μ+ΗΓ

実測値 6930. 1 [Μ+Η] +

試験例 1 アミド系溶媒の脱保護効果

市販の 5'— Ο— (4, 4'—ジメトキシトリチル）チミジンが担持されている CPG固相 担体（333mg, 15 mol)をフィルター付きカラムに入れ、核酸自動合成機 (Expedi te^TM:アプライドバイオシステムズ社)を使用して、固相上でアデ-リル—〔3'→5'〕— シチジリル一〔3，→5 '〕一ゥリジリル一〔3，→5'〕一グァ-リル一〔3，→5 '〕一アデ-リ ルー〔3，→5'〕一シチジリル一〔3，→5'〕一ゥリジリル一〔3，→5'〕一グァ-リル一〔3， →5'〕一アデ-リル一〔3，→5'〕一シチジリル一〔3，→5'〕一ゥリジリル一〔3，→5'〕 一グァ-リル一〔3，→5'〕アデ-リル一〔3，→5'〕一シチジリル一〔3，→5'〕ーゥリジリ ルー〔3，→5'〕一グァ-リル一〔3，→5'〕一アデ-リル一〔3，→5'〕一シチジリル一〔3 ，→5，〕一ゥリジリル一〔3，→5，〕一グァ-リル一〔3，→5 '〕一チミジンの合成を行い、 固相上で、 4, 4，—ジメトキシトリチルを脱離した。オリゴ RNA2 μ mol分のレジンに対 し、切り出し剤として、濃アンモニア水一エタノール混合液（3 : l) 6mLを用いて、 40 °C、 4時間かけて CPG固相担体力 の切り出し及び各リン酸部位の保護基の脱離反 応及び塩基の保護基の除去を行った。反応混合物を 10等分し減圧下濃縮し、下記 表 1に記載の脱保護条件において、各リボースの 2'位水酸基の保護基を脱離する 反応を行った。但し、各反応において、 100 molの TBAFにっき、 1 Lの-トロメ タンを添カ卩した。反応溶液量と同量の 1Mの Tris— HC1緩衝液（pH7. 5)を加えたの ち、各オリゴ RNAを HPLCにて分析した。

HPLCにおける測定条件は、以下のとおりである。

測定条件：

HPLC 装置

送液ユニット： LC— 10AT (島津製作所社製）

検出器: SPD— 10A (島津製作所社製）

逆相 HPLCカラム

DNAPac PA100<4mm φ x250mm> (DIONEX社製;）

カラム温度 ：50°C

移動相

グラジェント：リニアグラジェント 20分 (B液： 5% - 25%)

A液： 10%ァセトニトリルを含む 25mMTris— HC1緩衝液

B液： 10%ァセトニトリルと 700mM過塩素酸ナトリウムを含む 25mMTris—HC 1緩衝液

移動相の流量 ：1. 5mlZ分

紫外線可視分光器検出波長： 260nm

[表 1] ァ の脱 効果

上記表 1に示すように、 TBAFの THF溶液に、 DMFを添加することにより、反応時 間の短縮又は TBAF試薬の量を低減できることが明らかである。 試験例 2 アミド系溶媒及びスルホキシド系溶媒の脱保護効果

市販の 5' -0- (4, 4'—ジメトキシトリチル）チミジンが担持されている CPG固相 担体（333mg, 15 mol)をフィルター付きカラムに入れ、核酸自動合成機 (Expedi te^TM:アプライドバイオシステムズ社)を使用して、固相上でアデ-リル—〔3'→5'〕— シチジリル一〔3，→5 '〕一ゥリジリル一〔3，→5'〕一グァ-リル一〔3，→5 '〕一アデ-リ ルー〔3，→5'〕一シチジリル一〔3，→5'〕一ゥリジリル一〔3，→5'〕一グァ-リル一〔3， →5'〕一アデ-リル一〔3，→5'〕一シチジリル一〔3，→5'〕一ゥリジリル一〔3，→5'〕 一グァ-リル一〔3，→5'〕アデ-リル一〔3，→5'〕一シチジリル一〔3，→5'〕ーゥリジリ ルー〔3，→5'〕一グァ-リル一〔3，→5'〕一アデ-リル一〔3，→5'〕一シチジリル一〔3 ，→5'〕一ゥリジリル一〔3，→5'〕一グァ-リル一〔3，→5 '〕一チミジンの合成を行い、 固相上で、 4, 4，—ジメトキシトリチルを脱離した。この内、オリゴ RNA1 μ mol分のレ ジンに対し、切り出し剤として、濃アンモニア水一エタノール混合液（3 : 1) 3mLを用 いて、 40°C、 4時間かけて CPG固相担体からの切り出し及び各リン酸部位の保護基 の脱離反応及び塩基の保護基の除去を行った。上記反応混合物を減圧下濃縮した 後、室温下、下記表 2に記載の脱保護条件において、各リボースの 2'位水酸基の保 護基を脱離する反応を行った。但し、各反応において、 100 molの TBAFにっき、 1 μ Lの-トロメタンを添カ卩した。また、 100 μ molの TBAFにっき、 100 Lの 1M T ris— HC1緩衝液（pH7. 5)をカ卩えたのち、 2mL (但し、エントリー 3については、 1. 5 mL)のエタノールに滴下し、反応生成物を沈殿させた。終夜、冷蔵庫に保存した後、 上澄みを除去し、反応生成物を HPLCにて分析し、本反応の終点を確認した。 HPL Cにおける測定条件は、試験例 1と同様である。 [0059] [表 2]

ア びスルホキシド系溶媒の脱保護効果

上記表 2に示すように、反応溶媒として THFのかわりに DMSO又は DMFを使用し た場合、格段に反応性が向上することが明らかである。

さらに、上記結果から明らかなように、反応溶媒として DMSOを使用した場合、 TB AFの使用量、反応溶媒の使用量を低減することができた。 TBAFの使用量は、反応 溶媒として THFを使用したときよりも、約 1Z5に減らすることができた。このことによつ て、高価な TBAFの使用量を低減するとともに、最終生成物を析出させるために使 用する、エタノールの使用量も低減できることが明らかである。

産業上の利用可能性

[0060] TBAFを作用させ各リボースの 2'位水酸基の保護基を脱離する工程において、ス ルホキシド系溶媒若しくはアミド系溶媒又はこれらの混合溶媒を反応溶媒として用い る、オリゴ核酸誘導体の各リボースの 2'位水酸基の保護基が除去されたオリゴ核酸 誘導体を製造する工程を経由することによって、大量にかつ高純度でのオリゴ RNA (A)の製造が可能となった。

Claims

請求の範囲 次の一般式（10)で表されるオリゴ核酸誘導体に、テトラプチルアンモ -ゥムフロリド ( TBAF)を作用させ、各リボースの 2'位水酸基の保護基を脱離する工程において、 テトラヒドロフランを含有して 、てもよ 、、スルホキシド系溶媒若しくはアミド系溶媒又 はこれらの混合溶媒を反応溶媒として用いることを特徴とする、次の一般式（ 11)で 表されるオリゴ核酸誘導体の製造方法。

[化 1]

1 0 ) "

式（10)及び（11)中、各 Bは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表す 。 nは、 1〜200の範囲内にある整数を表す。各 Qは、それぞれ独立して、 O又は Sを 表す。各 Rは、それぞれ独立して、 H、水酸基、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ 、アルキルァミノ、ジアルキルァミノ、アルケニルォキシ、アルケニルチオ、アルケニル アミ入ジアルケニルアミ入アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アルキニルァミノ、ジ アルキ-ルァミノ又はアルコキシアルキルォキシを表すが、少なくとも 1つは水酸基を 表す。 Zは、 H、リン酸基又はチォリン酸基を表す。

R¹は、次の一般式（3)で表される置換基を表す。

[化 2]

( 3 )

式（3)中、尺¹¹、 R¹²、 R¹³は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。 各 R⁴は、それぞれ独立して、 H、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミ 入ジアルキルァミノ、ァルケ-ルォキシ、ァルケ-ルチオ、ァルケ-ルァミノ、ジアル ケニルァミノ、アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アルキニルァミノ、ジアルキニルァ ミ入アルコキシアルキルォキシ又は次の一般式 (4)で表される置換基を表す。

[化 3]

( 4 )

式 (4)中、 WG¹は、電子吸引性基を表す。

[2] スルホキシド系溶媒が次の一般式 (I)で表される化合物である、請求項 1に記載のォ リゴ核酸誘導体の製造方法。

[化 4]

^RV^Rb

o

( I ) 式 (I)中、 R^a、 R^bは、同一又は異なって、アルキルを表す。

[3] 一般式 (I)で表される化合物がジメチルスルホキシドである、請求項 2に記載のオリゴ 核酸誘導体の製造方法。

[4] アミド系溶媒が次の一般式 (Π)で表される化合物である、請求項 1に記載のオリゴ核 酸誘導体の製造方法。

[化 5]

( I I ) 式 (Π)中、 R^e、 R^dは、同一若しくは異なって、アルキルを表し、 R^eは、水素若しくはァ ルキルを表すか、又は R^dはアルキルを表し、 R^eと R^eは隣接する窒素原子と炭素原子 とが一緒になつて形成する、 5若しくは 6員の飽和環状アミド基を表す。

[5] 一般式 (Π)で表される化合物が N, N—ジメチルホルムアミドである、請求項 4に記載 のオリゴ核酸誘導体の製造方法。

[6] WG¹がシァノである、請求項 1〜5のいずれかに記載のオリゴ核酸誘導体の製造方 法。

[7] さらに、ニトロアルカン、アルキルァミン、アミジン、チオール若しくはチオール誘導体 又はこれらの任意の混合物を含有する反応溶媒を用いることを特徴とする、請求項 1 〜6のいずれかに記載のオリゴ核酸誘導体の製造方法。

[8] 下記工程を含む、次の一般式 (A)で表されるオリゴ RNAの製造方法。

[化 6]

式 (A)中、各 Bは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表す。 nは、 1〜2 00の範囲内にある整数を表す。各 Qは、それぞれ独立して、 O又は Sを表す。各 Rは 、それぞれ独立して、 H、水酸基、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミ 入ジアルキルァミノ、ァルケ-ルォキシ、ァルケ-ルチオ、ァルケ-ルァミノ、ジアル ケニルァミノ、アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アルキニルァミノ、ジアルキニルァ ミノ又はアルコキシアルキルォキシを表す力 少なくとも 1つは水酸基を表す。 Zは、 H 、リン酸基又はチォリン酸基を表す。

工程：

次の一般式（10)で表されるオリゴ核酸誘導体に、テトラプチルアンモ -ゥムフロリド（ TBAF)を作用させ、各リボースの 2'位水酸基の保護基を脱離する工程において、 テトラヒドロフランを含有して 、てもよ 、、スルホキシド系溶媒若しくはアミド系溶媒又 はこれらの混合溶媒を反応溶媒として用いることを特徴とする、次の一般式（ 11)で 表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程。

[化 7]

(1 0) ( 1 1)

式（10)及び（11)中、各 B、各 Q、各 Rは、それぞれ独立して、前記と同義である。 n、 Zは、前記と同義である。

R¹は、次の一般式（3)で表される置換基を表す。

[化 8]

(3)

式（3)中、 R , R'\ は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。

各 R⁴は、それぞれ独立して、 H、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミ 入ジアルキルァミノ、ァルケ-ルォキシ、ァルケ-ルチオ、ァルケ-ルァミノ、ジアル ケニルァミノ、アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アルキニルァミノ、ジアルキニルァ ミ入アルコキシアルキルォキシ又は次の一般式 (4)で表される置換基を表す。

[化 9]

(4) 式 (4)中、 WG¹は、電子吸引性基を表す。

スルホキシド系溶媒が次の一般式 (I)で表される化合物である、請求項 8に記載のォ リゴ核酸誘導体の製造方法。

[化 10] R^aゝ _s R^b

O

( I )

式 (I)中、 R^a、 R^bは、同一又は異なって、アルキルを表す。

[10] 一般式 (I)で表される化合物がジメチルスルホキシドである、請求項 9に記載のオリゴ 核酸誘導体の製造方法。

[11] アミド系溶媒が次の一般式 (Π)で表される化合物である、請求項 8に記載のオリゴ核 酸誘導体の製造方法。

[化 11]

R^e

^RC、人

R^d

( I I ) 式 (Π)中、 、 R^dは、同一若しくは異なって、アルキルを表し、 R^eは、水素若しくはァ ルキルを表すか、又は R^dはアルキルを表し、 R^eと R^eは隣接する窒素原子と炭素原子 とが一緒になつて形成する、 5若しくは 6員の飽和環状アミド基を表す。

[12] 一般式 (Π)で表される化合物が N, N—ジメチルホルムアミドである、請求項 11に記 載のオリゴ RNAの製造方法。

[13] WG¹がシァノである、請求項 8〜 12のいずれかに記載のオリゴ RNAの製造方法。

[14] さらに、ニトロアルカン、アルキルァミン、アミジン、チオール若しくはチオール誘導体 又はこれらの任意の混合物を含有する反応溶媒を用いることを特徴とする、請求項 8

〜 13のいずれかに記載のオリゴ RN Aの製造方法。

[15] 下記工程 A〜Hを含む、次の一般式 (A)で表されるオリゴ RNAの製造方法。

[化 12]

式 (A)中、各 Bは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表す。 nは、 1〜2 00の範囲内にある整数を表す。各 Qは、それぞれ独立して、 O又は Sを表す。各 Rは 、それぞれ独立して、 H、水酸基、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミ ノ、ジアルキルァミノ、アルケニルォキシ、アルケニルチオ、アルケニルァミノ、ジアル ケニルァミノ、アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アルキニルァミノ、ジアルキニルァ ミノ又はアルコキシアルキルォキシを表す力 少なくとも 1つは水酸基を表す。 Zは、 H 、リン酸基又はチォリン酸基を表す。

工程 A:

次の一般式（1)で表される (オリゴ)核酸誘導体に酸を作用させることによって、 5'位 の水酸基の保護基を脱離して、次の一般式 (2)で表される (オリゴ)核酸誘導体を製 造する工程、

[化 13]

( 1 ) ( 2 )

式（1)及び（2)中、各 Qは、それぞれ独立して、前記と同義である。 nは前記と同義で ある。各 Bxは、それぞれ独立して、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修 飾体を表す。 R¹は、次の一般式 (3)で表される置換基を表す。

[化 14]

( 3 )

式（3)中、尺¹¹、 R¹²、 R¹³は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。 各 WG²は、電子吸引性基を表す。各 Rは、それぞれ独立して、 H、ハロゲン、アルコ キシ、アルキルチオ、アルキルァミノ、ジアルキルァミノ、アルケニルォキシ、アルケニ ルチオ、アルケニルァミノ、ジアルケニルアミ入アルキニルォキシ、アルキニルチオ、 アルキ-ルァミノ、ジアルキ-ルアミ入アルコキシアルキルォキシ又は次の一般式（4 )で表される置換基を表す。

[化 15] G¹

( 4 )

式 (4)中、 WG¹は、電子吸引性基を表す。

Eは、ァシル又は次の一般式（5)で表される置換基を表す。

[化 16]

-E¹-リンカ、 相担^ ( 5 ) 式（5)中、 E¹は、単結合又は次の一般式 (6)で表される置換基を表す。

[化 17]

( 6 )

式 (6)中、 Q、 WG²は、前記と同義である。

Tは、 H、ァシルォキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルァミノ、ジァ ルキルァミノ、ァルケ-ルォキシ、アルケニルチオ、アルケニルァミノ、ジァルケニルァ ミ入アルキニルォキシ、アルキニルチオ、アルキニルァミノ、ジアルキニルアミ入ァ ルコキシアルキルォキシ、上記一般式 (4)で表される置換基又は上記一般式（5)で 表される置換基を表す。但し、 E又は Tのどちらか一方は、置換基（5)である。

工程 B :

工程 Aにおいて製造される (オリゴ)核酸誘導体 (2)に、活性化剤を用いて核酸モノ マー化合物を縮合させ、次の一般式 (7)で表されるオリゴ核酸誘導体を製造するェ 程、

[化 18]

(7)

式 (2)及び (7)中、各 B、各 Q、各 R⁴、各 WG²は、それぞれ独立して、前記と同義で

X

ある。 E、 n、

Tは、前記と同義である。

工程 C:

工程 Bにお 、て未反応である (オリゴ)核酸誘導体（2)の 5 '位の水酸基をキヤッピン グする工程、

[化 19]

(2) (8) 式 (2)及び (8)中、各 B、各 Q、各 R⁴、各 WG²は、 Zそれぞれ独立して、前記と同義

X

である。 E、 n、 Tは、前記と同義である。 R⁵は、メチル、フエノキシメチル、 tert—ブチ ルフエノキシメチルを表す。

工程 D:

工程 Bにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体 (7)に酸ィ匕剤を作用させることによって 亜リン酸基をリン酸基又はチォリン酸基に変換する工程、

[化 20]

( 7 ) ( ⁹ )

式（7)及び（9)中、各 B、各 Q、各 R⁴、各 WG²は、それぞれ独立して、前記と同義で

X

ある。 E、 n、 R\ Tは、前記と同義である。

工程 E :

工程 Dにお 、て製造されるオリゴ核酸誘導体 (9)を固相担体力 切り出し、各核酸塩 基部及び各リン酸基の保護基を脱離する工程、

[化 21]

式（9)及び（10)中、各 B、各 B、各 Q、各 R⁴、各 WG²は、それぞれ独立して、前記と

X

同義である。 E、 n、 R、

T、 Zは、前記と同義である。

工程 F _:

次の一般式（10)で表されるオリゴ核酸誘導体に、テトラプチルアンモ -ゥムフロリド ( TBAF)を作用させ、各リボースの 2'位水酸基の保護基を脱離する工程において、 テトラヒドロフランを含有して 、てもよ 、、スルホキシド系溶媒若しくはアミド系溶媒又 はこれらの混合溶媒を反応溶媒として用いることを特徴とする、次の一般式（ 11)で 表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程、

[化 22]

( 1 0 ) ( 1 1：

式（10)及び（11)中、各 B、各 Q、各 R、各 R⁴は、それぞれ独立して、前記と同義であ る。 n、

Zは、前記と同義である。

工程 G :

工程 Fにお ヽて製造されるオリゴ核酸誘導体（11)の 5 '位の水酸基を脱離する工程

[化 23]

式（11)及び (A)中、各 B、各 Q、各 Rは、それぞれ独立して、前記と同義である。 n、 zは、前記と同義である。

工程 H :

工程 Gにお 、て製造されるオリゴ RNA (A)を分離精製する工程。

工程 A〜Dを繰り返すことにより所望の鎖長のオリゴ RNA (A)を製造する、請求項 1

5に記載のオリゴ RNAの製法。 [17] 工程 Bにおいて、少なくとも 1つは、核酸モノマー化合物として次の一般式 (B)で表さ れる化合物を用いることを特徴とする、請求項 15に記載のオリゴ RNAの製法。

[化 24]

( B )

式 (B)中、 Bzは、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。 R¹は、次の一般式（3)で表される置換基を表す。

[化 25]

( 3 )

式（3)中、尺¹¹、 R¹²、 R¹³は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。

R^2a、 R^2bは、同一若しくは異なって、アルキルを表すカゝ、又は、 R^2a、 R^2bが隣接する 窒素原子と一緒になつて形成する、 5〜6員の飽和アミノ環基を表す。力かる飽和アミ ノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を 1個有してい てもよい。

WG²は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。

[18] スルホキシド系溶媒が次の一般式 (I)で表される化合物である、請求項 15〜 17の 、 ずれかに記載のオリゴ核酸誘導体の製造方法。

[化 26]

0

( I )

式 (I)中、 R^a、 R^bは、同一又は異なって、アルキルを表す。

[19] 一般式 (I)で表される化合物がジメチルスルホキシドである、請求項 18に記載のオリ ゴ核酸誘導体の製造方法。

[20] アミド系溶媒が次の一般式 (Π)で表される化合物である、請求項 15〜17のいずれか に記載のオリゴ核酸誘導体の製造方法。

[化 27]

R^e

^RC、人

R^d

( I I )

式 (Π)中、 、 R^dは、同一若しくは異なって、アルキルを表し、 R^eは、水素若しくはァ ルキルを表すか、又は R^dはアルキルを表し、 R^eと R^eは隣接する窒素原子と炭素原子 とが一緒になつて形成する、 5若しくは 6員の飽和環状アミド基を表す。

[21] 一般式 (Π)で表される化合物が N, N—ジメチルホルムアミドである、請求項 20に記 載のオリゴ RNAの製造方法。

[22] WG¹がシァノである、請求項 15〜21のいずれかに記載のオリゴ RNAの製造方法。

[23] 工程 Fにおいて、さらに-トロアルカン、アルキルァミン、アミジン、チオール、チォー ル誘導体又はこれらの任意の混合物を含有する反応溶媒を用いることを特徴とする 、請求項 15〜22のいずれかに記載のオリゴ RNAの製造方法。