WO2007104825A1

WO2007104825A1 - Procedimiento para la extracción de gluten en alimentos procesados por calor basado en la utilización de detergentes iónicos y no iónicos.

Info

Publication number: WO2007104825A1
Application number: PCT/ES2007/070058
Authority: WO
Inventors: Enrique MÉNDEZ CORMÁN; Alberto HERNANDO ÁLVAREZ
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2008-09-16
Also published as: EP2003448A1; US20100009391A1

Abstract

Esta invención se relaciona, en general, con el análisis de alimentos para enfermos celiacos y, en particular, se refiere a un procedimiento para la extracción de gluten en alimentos tratados con calor, compatible con un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) y además compatible con la técnica de Western blot, a composiciones adecuadas para la puesta en práctica de dicho procedimiento, a kits que comprenden dichas composiciones y a un método para la cuantificación del gluten presente en un alimento.

Description

TITULO

Procedimiento para la extracción de gluten en alimentos procesados por calor basado en la utiliación de detergentes iónicos y no iónicos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se relaciona, en general, con el análisis de alimentos para enfermos celiacos y, en particular, se refiere a un procedimiento para la 0 extracción de gluten en alimentos, compatible con un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) y además compatible con la técnica de Western blot, a composiciones adecuadas para la puesta en práctica de dicho procedimiento, a kits que comprenden dichas composiciones y 5 a un método para la cuantificación del gluten presente en un alimento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La Enfermedad Celiaca (EC) es una enfermedad 0 caracterizada por una intolerancia a las prolaminas del gluten de trigo, cebada, centeno y avena, que provoca cambios en el intestino que conllevan a una malabsorción .

El gluten comprende una mezcla compleja de proteínas y, mientras no se conozca el componente o componentes 5 tóxicos del gluten causantes de la EC, la solución provisional consiste en la eliminación de todos los componentes del gluten en la dieta de estos enfermos. De hecho, el único tratamiento realmente eficaz para los pacientes celiacos consiste en seguir una dieta 0 estrictamente libre de gluten. Por este motivo, resulta esencial la cuantificación precisa del contenido en gluten de los alimentos destinados a ser ingeridos por los enfermos celiacos.

El protocolo rutinario de análisis de gluten en alimentos para celiacos consiste en una extracción del gluten con una solución de agentes reductores y el agente desnaturalizante guanidina [Garcia E. et al. Development of a general procedure for complete extraction of gliadins for heat processed and unheated foods. European Journal on Gastroenterology and Hepatology. Eur J Gastroenterol Hepatol 17. 5, 529-539 (2005)] seguido de su cuantificación por ELISA [Valdés I., et al. Innovative approach to low level gluten determination In foods using a novel sandwich ELISA protocol . European Journal of Gastroenterology and Hepatolog. 15 (5) 465-74. (2003)].

Sin embargo, uno de los problemas del sistema de extracción de gluten que utiliza guanidina como agente desnaturalizante radica en su aplicación en el análisis de gluten por la técnica de Western blot . Brevemente, esta técnica consiste en (i) una primera separación de los componentes del gluten por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico

(SDS); (ii) una electro transferencia de las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF] y (iii) una imnunodetección de las proteínas en la membrana mediante el empleo de anticuerpos.

El inconveniente de utilizar guanidina como agente desnaturalizante consiste en que interfiere con el sistema de análisis de geles de SDS, de forma que es necesario eliminarlo mediante varios lavados con agua en un proceso de unos 30-45 minutos de duración. Como consecuencia del lavado, se pierde parte de la fracción omega (ω) del gluten que representa entre el 20-35% del gluten y parte de las otras fracciones alfa (α) , beta (β) y gamma (γ) del gluten. La cuantificación de la concentración de las distintas fracciones del gluten contenidas en una muestra empleando esta técnica es, por tanto, menos precisa. Consecuentemente, un análisis cuantitativo por western blot del contenido de gluten en una muestra empleando guanidina como agente desnaturalizante resulta poco fiable.

Por tanto, existe la necesidad de encontrar procedimientos alternativos para la extracción del gluten contenido en alimentos que permita una cuantificación fiable del mismo por técnicas convencionales como la técnica de ELISA. Ventajosamente, dichos procedimientos deberían permitir el análisis de las distintas fracciones del gluten contenidas en dichos alimentos mediante Western blot.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La invención se enfrenta con el problema de desarrollar un procedimiento para la extracción cuantitativa del gluten contenido en alimentos, compatible no solo con la técnica de ELISA actualmente existente para la cuantificación de gluten en alimentos sino también con otras técnicas convencionales, como la técnica de Western blot. La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que el empleo de una composición que comprende un agente reductor de grupos disulfuro y un detergente seleccionado entre dodecil sulfato sódico (SDS) (detergente iónico) y cualquier ester de sorbitano polioxietilenado (detergente no iónico Tween) , como agentes desnaturalizantes en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8, permite analizar cuantitativamente el gluten contenido en alimentos mediante un inmunoensayo tal como ELISA, asi como el análisis de las fracciones del gluten contenidas en alimentos mediante Western blot.

Aunque el rendimiento de extracción de gluten en alimentos alcanzado mediante el procedimiento desarrollado por esta invención utilizando como agente desnaturalizante SDS o un éster de sorbitano polioxietilenado es similar al obtenido mediante el sistema convencional de extracción utilizando guanidina como agente desnaturalizante, es decir, ambos procedimientos permiten extraer prácticamente la misma cantidad de gluten, la concentración de las distintas fracciones del gluten α, β, γ y ω que se obtienen es diferente en cada caso, siendo superior cuando se utiliza el procedimiento de la invención ya que mediante el empleo del sistema convencional de extracción del gluten con guanidina durante el proceso de lavados se pierde parte de fracción omega (ω) del gluten así como parte de las otras fracciones α, β, γ del gluten. Por tanto, la cuantificación de las diferentes fracciones del gluten por Western blot, en particular de la fracción omega (ω) , es más precisa mediante el procedimiento desarrollado por esta invención.

Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye una composición que comprende un agente reductor de grupos disulfuro y uno ó varios agentes desnaturalizantes, en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8, en la que dicho agente desnaturalizante se selecciona entre SDS, un éster de sorbitano polioxietilenado y sus mezclas.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un procedimiento para la extracción de gluten en una muestra de un alimento que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra con una solución acuosa de etanol en presencia de una composición que contiene un agente reductor de grupos disulfuro y un agente desnaturalizante, en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8, en la que dicho agente desnaturalizante se selecciona entre SDS, un éster de sorbitano polioxietilenado y/o sus mezclas .

Un objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de dicha composición en la puesta en práctica de dicho procedimiento de extracción de gluten en alimentos. Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para la cuantificación del gluten presente en una muestra de un alimento que comprende la extracción previa del gluten contenido en dicha muestra mediante el procedimiento de extracción de gluten previamente mencionado y, a continuación, analizar el contenido de gluten extraído mediante métodos de inmunodetección como ELISA, Western Blot, o alternativamente inmunocromatografia, inmunoprecipitación, resonancia de plasmones de superficie (SPR), etc. Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un kit que comprende dicha composición útil para la puesta en práctica de dicho procedimiento de extracción de gluten en alimentos, o sus componentes por separado. Dicho kit puede ser utilizado para extraer el gluten contenido en un alimento como paso previo a la cuantificación por ELISA o análisis por Western blot del gluten contenido en un alimento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa curvas estándares a distintas concentraciones de gliadinas conocidas a las que se les han añadido diferentes cantidades de SDS para observar su efecto en una placa de ELISA recubierta con el anticuerpo monoclonal R5 suministrado y propiedad de la Unidad de Gluten del Centro Nacional de Biotecnología (CSIC) . Las concentraciones finales de SDS en la placa de ELISA son 0%, 0.05%, 0.1%, 1% y 2%.

La Figura 2 representa curvas estándares a distintas concentraciones de gliadinas conocidas a las que se les han añadido diferentes cantidades de Tween®-20 (P-1379 suministrado por SIGMA) para ver su efecto en la placa de ELISA recubierta con el anticuerpo monoclonal R5 suministrado y propiedad de la Unidad de Gluten del Centro Nacional de Biotecnología (CSIC) . Las concentraciones finales de Tween®-20 en la placa de ELISA son 0.05%, 1%, 5% y 10%.

La Figura 3 muestra un diagrama de barras que representa la recuperación de gliadinas de muestras (alimentos 1, 2 y 3) tratadas con calor y extraídas con soluciones que contienen 2-mercapto-etanol (2-ME) 250 mM y 2% o 6% de SDS. Como solución de extracción control se utilizó el cóctel guanidina/2-ME . Las muestras se incubaron con estas soluciones a 5O⁰C durante 40 minutos y posteriormente se sometieron a una extracción con etanol al 60% durante 60 minutos para extraer las gliadinas del gluten. La cuantificación del gluten en los extractos se llevó a cabo mediante ELISA. La Figura 4 muestra un diagrama de barras que representa la recuperación de gliadinas de muestras (alimentos 1, 2 y 3) tratadas con calor y extraídas con soluciones que contienen 2-mercapto- etanol (2-ME) 250 mM y 1% o 5% de Tween®-20 (P-1379 suministrado por SIGMA) . Como solución de extracción control se utilizó el cóctel guanidina/2-ME . Las muestras se incubaron con estas soluciones a 5O⁰C durante 40 minutos y posteriormente se sometieron a una extracción con etanol al 60% durante 60 minutos para extraer las gliadinas del gluten. La cuantificación del gluten en los extractos se llevó a cabo mediante ELISA. La Figura 5 muestra un análisis por Western blot de gliadinas de alimentos (1, 2 y 3) tratados con calor y extraídos con 2-ME 250 mM conteniendo 6% de SDS o guanidina 2 M.

La Figura 6 muestra un análisis por Western blot de gliadinas de alimentos (1, 2, 3 y 4) tratados con calor y extraídos con 2-ME 250 mM conteniendo 6% de SDS (A) ó 5% de Tween®-20 (P-1379 suministrado por SIGMA) (B) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere, en general, a una composición, en adelante composición de la invención, que comprende un agente reductor de grupos disulfuro y un agente desnaturalizante, en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8, en la que dicho agente desnaturalizante se selecciona entre SDS, un éster de sorbitano polioxietilenado y sus mezclas.

El agente reductor de grupos disulfuro puede ser cualquier compuesto capaz de reducir grupos disulfuro conocidos en el arte, por ejemplo, 2-mercaptoetanol (2-ME) , ditiotreitol, etc. La composición de la invención puede contener un único agente reductor de grupos disulfuro o una mezcla de dos o más agentes reductores de grupos disulfuro. En una realización particular, el agente reductor de grupos disulfuro de la composición de la invención se selecciona entre 2-mercapto-etanol (2-ME), ditiotreitol y sus mezclas. En una realización particular el agente reductor utilizado es 2-mercapto-etanol en una concentración entre 50-50OmM, preferentemente entre 150-40OmM. En una realización particular preferida la concentración de 2-mercapto-etanol

(2-ME) es de 25OmM. En otra realización particular el agente reductor utilizado es ditiotreitol (DTT) , este puede ser utilizado en una concentración entre 0.1-30 mM, preferiblemente entre 0.5-10 mM, por ejemplo 5.0 mM.

La concentración del agente reductor de grupos disulfuro en la composición de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otras cosas, del agente reductor de grupos disulfuro en cuestión. Un agente desnaturalizante es un compuesto con capacidad de abrir la conformación de las proteínas de forma que hace más accesible determinadas zonas de la cadena polipeptidica a reactivos externos y anticuerpos. La composición de la invención, comprende un agente desnaturalizante seleccionado del grupo formado por un éster de sorbitano polioxietilenado, dodecil sulfato sódico

(SDS), y sus mezclas. Aunque es posible usar varios agentes desnaturalizantes a la vez, no es una opción ventajosa, puesto que la presencia de tween distorsiona el gel de acrilamida. El SDS, a diferencia de los demás agentes desnaturalizantes, no distorsiona el gel de acrilamida y permite que se puedan observar en el gel todas las fracciones de prolaminas sin necesidad de practicar lavados, de manera que se evita la pérdida de fracciones de prolaminas causada por dichos lavados. La concentración del agente desnaturalizante en la composición de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otras cosas, del agente desnaturalizante en cuestión. En una realización particular, el agente desnaturalizante de la composición de la invención es dodecil sulfato sódico (SDS) y la concentración de dicho compuesto en la composición de la invención está comprendida entre 0.5-7% por ejemplo, 1-6%, preferentemente entre 2-6%, por ejemplo: 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5% o 6%. En una realización particular preferida la concentración de SDS en la composición de extracción de la invención es del 6%. El SDS a diferencia de los demás agentes desnaturalizantes no distorsiona el gel de acrilamida. En otra realización particular, el agente desnaturalizante es cualquier éster de sorbitano polioxietilenado, por ejemplo, pero sin limitarse a Tween^®- 20, Tween^®-40 y Tween^®-80; y sus mezclas. La concentración de dicho compuesto en la composición de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo. En una realización particular, está comprendida entre 1-5%, por ejemplo: 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% o 5%. En una realización más preferida, el éster de sorbitano polioxietilenado es Tween^®-20, que a diferencia de otros desnaturalizantes, como por ejemplo la guanidina, permite un análisis de prolaminas directo por western blot sin tener que realizar un paso de lavado con agua y evitar perder fracciones del gluten. En una realización particular preferida el éster de sorbitano polioxietilenado utilizado en la composición de extracción de la invención es Tween^®-20 a una concentración entre 1-5%, preferentemente al 1%. Como tampón puede utilizarse cualquier disolución reguladora del pH de una disolución que tampone a un valor de pH comprendido entre 7 y 8, por ejemplo, solución salina con fosfatos (PBS) con un pH comprendido entre 7 y 8, Tris con pH entre 7 y 8, etc.

La composición de la invención puede utilizarse como "cóctel" de extracción de gluten en alimentos, tanto procesados por calor como no procesados por calor. Ha resultado sorprendente comprobar que el empleo de la composición de la invención en la extracción de gluten no sólo permite una extracción prácticamente cuantitativa del gluten sino que además no afecta adversamente a la cuantificación por ELISA del gluten contenido en un alimento. El cóctel de extracción de la invención, muestra ser compatible con técnicas de inmunodetección, tales como ELISA, en las cuáles la detección se efectúa mediante el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales . El empleo de la composición de la invención presenta, además, la ventaja de que no se pierde ninguna de las fracciones del gluten (α, β, γ, ω) durante el proceso de extracción puesto que no requiere la realización de lavados que arrastran parte de las fracciones del gluten. De esta manera, la composición de la invención constituye una composición útil para cuantificar de forma precisa el gluten contenido en un alimento. Adicionalmente, aunque el rendimiento final, es decir, la concentración total de gluten extraído con el procedimiento de la invención es similar en comparación con el procedimiento rutinario que emplea como agente desnaturalizante guanidina, sin embargo, el procedimiento rutinario no permite realizar una cuantificación precisa del contenido del gluten en la muestra y tampoco un análisis fiable de las distintas fracciones del gluten contenidas en la muestra ya que, como se ha mencionado anteriormente, como consecuencia de los lavados se pierde buena parte la fracción ω, que representa entre el 20-35 % del gluten, y parte de las otras fracciones α, β y γ del gluten.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la extracción de gluten en una muestra de un alimento, en adelante procedimiento de la invención, que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra con una solución acuosa de etanol en presencia de la composición de la invención. El sobrenadante resultante, que contiene el gluten extraído, se retira para su análisis posterior .

La concentración de etanol en la solución acuosa de etanol puede variar dentro de un amplio intervalo. En una realización particular, dicha solución acuosa de etanol tiene un contenido en etanol comprendido entre el 50% y el 70%. En una realización particular preferida el contenido de etanol es del 60%. En otra realización particular, el procedimiento de la invención, que comprende extraer el gluten con una solución acuosa de etanol en presencia de la composición de la invención, y separar el sobrenadante que contiene el gluten extraído, se caracteriza porque antes de la extracción con dicha solución acuosa de etanol, la muestra a ensayar se mezcla con la composición de la invención, se incuba a una temperatura comprendida entre 24⁰C y 8O⁰C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 y 40 minutos, y se enfría hasta temperatura ambiente (entre 15⁰C y 25⁰C). En una realización preferida, la incubación de la muestra con la composición de la invención se efectúa a una temperatura comprendida entre 37⁰C y 5O⁰C durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 y 40 minutos.

A continuación, se añade una solución acuosa de etanol, preferiblemente una solución acuosa de etanol al 60%, a dicha mezcla y se incuba a una temperatura y durante un periodo de tiempo apropiado, por ejemplo, a temperatura ambiente durante un intervalo comprendido entre 10 y 60 minutos con agitación. En una realización preferida, la incubación de la mezcla que contiene la muestra a ensayar, la composición de la invención y la solución acuosa de etanol, se efectúa a temperatura ambiente durante en un intervalo entre 10 y 60 minutos.

Posteriormente, la mezcla de reacción se centrifuga, se retira el sobrenadante (que contiene el gluten extraído) y, finalmente, se analiza el contenido en gluten mediante métodos de inmunodetección como ELISA, Western Blot, o alternativamente inmunocromatografía, inmunoprecipitación, resonancia de plasmones de superficie (SPR), etc., que están basados en anticuerpos con especificidad frente a las proteínas del gluten, tal y como se conoce en el estado del arte y disponible por medios comerciales, por ejemplo, el anticuerpo "R5" (Eur J Gastroenterol Hepatol 13:1-5. 2001) o el anticuerpo de "Skerrit" (J Assoc Off Anal Chem., 74: 257-64, 1991) . La muestra de alimento a ensayar se prepara por los métodos convencionales, que incluyen, en su caso, la molienda de la muestra, que se deposita en un recipiente apropiado, por ejemplo, un tubo de propileno. A continuación, se añade la composición de la invención, se cierra el recipiente y la mezcla resultante se agita. Ventajosamente, el recipiente que contiene dicha mezcla se sella, por ejemplo, con papel de sellado, con el fin de evitar la evaporación de dicha mezcla por acción del calor.

Mediante el procedimiento de la invención se consigue solubilizar prácticamente la totalidad de las fracciones tóxicas del gluten contenido en alimentos, tanto procesados por calor como no procesados por calor. Aunque no se desea estar vinculado por ninguna teoria, se cree que la composición de la invención actúa abriendo la conformación de las proteínas constituyentes del gluten, en particular, de la fracción tóxica del mismo, y, como consecuencia de ello, se favorece su solubilidad en el medio de extracción. Efectivamente, durante el procesamiento térmico de los alimentos, las fracciones del gluten (α, β, γ y ω ) se desnaturalizan, se rompen los puentes disulfuro y, consecuentemente, se forman agregados insolubles que no pueden ser extraídos con 60% etanol/agua. El efecto combinado de los componentes de la composición de la invención produce (i) que el agregado insoluble pueda ser extraído con una solución acuosa de etanol (50-70% etanol/agua) y se analiza el contenido en gluten mediante métodos de inmunodetección como ELISA, Western Blot, o alternativamente inmunocromatografia, inmunoprecipitación, resonancia de plasmones de superficie (SPR), etc., (ii) que abra la conformación de las moléculas de gluten quedando los determinantes antigénicos más expuestos a los anticuerpos, lo que provoca un aumento en la señal de ELISA y permite la detección de todas las fracciones de prolaminas y (iii) que la determinación de la concentración del gluten en un alimento sea más precisa al tener en cuenta todas las fracciones del gluten contenido en el mismo.

El procedimiento de la invención constituye, por tanto, un procedimiento general de extracción de gluten de alimentos, especialmente destinados a los enfermos celiacos, tanto procesados por calor como no procesados por calor, que solubiliza las fracciones tóxicas del gluten permitiendo analizar de forma cuantitativa y fiable el gluten en este tipo de alimentos. La invención también proporciona un método para la cuantificación por ELISA del gluten presente en una muestra de un alimento que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra mediante el procedimiento de la invención y, a continuación, cuantificar por ELISA el gluten previamente extraído. Además, la invención proporciona un método para el análisis mediante Western blot de las fracciones del gluten contenido en una muestra de alimento que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra mediante el procedimiento de la invención y, a continuación, analizar y/o cuantificar por Western blot el gluten previamente extraído. Ambos métodos de cuantificación y análisis de gluten en una muestra por ELISA o Western blot pueden combinarse conjuntamente en cualquier orden para analizar una muestra de un alimento, ya sea primero por ELISA y posteriormente por Western blot, o viceversa.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende la composición de la invención, o los componentes de dicha composición parcialmente mezclados o separados. Este kit puede ser utilizado para extraer el gluten contenido en una muestra de un alimento, tanto procesado por calor como no procesado por calor, o bien, para extraer el gluten como paso previo a su (i) cuantificación por ELISA con el fin de determinar el contenido en gluten de la muestra de alimento ensayada, o a (ii) su análisis por otras técnicas convencionales de inmunodetección, tales como: Western blot, inmunocromatografia, inmunoprecipitación, resonancia de plasmón, etc.; preferiblemente mediante Western blot.

En una realización particular, el kit comprende, además, el resto de reactivos necesarios para la extracción del gluten, es decir, la solución acuosa de etanol o bien sus componentes por separado, y/o los reactivos necesarios para la realización de un ELISA para cuantificar el gluten contenido en un alimento, incluyendo anticuerpos con especificidad frente a las proteínas del gluten, tal y como se conoce en el estado del arte y disponible por medios comerciales, por ejemplo, el anticuerpo "R5" (Eur J Gastroenterol Hepatol 13:1-5. 2001) o el anticuerpo de "Skerrit" (J Assoc Off Anal Chem., 74: 257-64, 1991). Dichos reactivos para la realización del ELISA pueden estar mezclados total o parcialmente entre si o separados.

En otra realización particular, el kit comprende, además, los reactivos necesarios para la realización de un Western blot para analizar las fracciones del gluten contenidas en un alimento, mezclados total o parcialmente entre si o separados.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

EJEMPLO 1.- Recuperación de gluten en alimentos mediante el uso de SDS o éster de sorbitano polioxietilenado

Este ensayo se realizó para comparar la eficacia del procedimiento proporcionado por esta invención en la extracción de gluten en alimentos frente a la del método rutinario que utiliza guanidina como agente desnaturalizante.

1.1 Materiales

Para la realización de este ejemplo se utilizaron los siguientes alimentos y soluciones: - Alimentos: panes sin-gluten en base de maíz que han sido contaminados con cantidades conocidas de gliadinas (prolaminas de trigo) y sometidos a temperaturas elevadas durante el proceso de elaboración (180-220⁰C) y que se utilizan como controles.

- Solución acuosa de etanol al 80%: se prepara mezclando, por ejemplo en una probeta, 400 mi de etanol

(Scharlau Nv 121) y 100 mi de agua milli-Q (resistividad 18 MΩm) y se guarda en frasco de vidrio. - Composición o cóctel-SDS de extracción: está constituida por 2-mercaptoetanol (2-ME) 250 mM, SDS al 6% y 0,Ix de PBS, se prepara, por ejemplo, pesando 1,2 gramos de SDS Biochemical 44244 (Peso molecular = 288,38 g/mol y añadiendo 15-18 mi de una solución de PBS (0,Ix) . A continuación se añaden 349 μl de 2-ME 14,29 M (Sigma M- 6250), se enrasa hasta 20 mi con solución de PBS (0,Ix) y se mezcla hasta conseguir una disolución total.

- Composición o cóctel-Tween de extracción: está constituida por 2-ME 250 mM, Tween®-20 al 5% y 0,Ix de PBS; se prepara, por ejemplo, añadiendo 1,0 mi Tween®-20 (Sigma P-1379) Peso molecular = 14,29 g/mol y añadiendo 15-18 mi de una solución de PBS (0,Ix) . A continuación, se añaden 349 μl de 2-ME, 14,29 M (Sigma M-6250), se enrasa hasta 20 mi con solución de PBS (0,Ix) y se mezcla hasta conseguir una disolución total.

- Solución de PBS 0,Ix: se puede preparar diluyendo 1:100 una solución de PBS 1Ox. Para ello, se añade 1 mi de PBS 1Ox en una probeta y se enrasa hasta 100 mi con agua milli-Q (resistividad 18 MΩcm) . La solución resultante debe tener un pH comprendido entre 7 y 8. La solución de PBS 1Ox se puede preparar mezclando y disolviendo 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na₂HPO₄ y 2,4 g de KH₂PO₄ en 900-950 mi de agua destilada, en un vaso de precipitado de 1 1 con agitación magnética y enrasando la solución resultante con agua destilada hasta 1.000 mi en un matraz aforado. La solución obtenida se almacena a temperatura ambiente.

1.2 Métodos

1.2.1 Extracción de gluten

El procedimiento según la invención consiste en efectuar la extracción de gluten utilizando una solución acuosa de etanol al 60% en presencia de un agente reductor (2-ME) y de un agente desnaturalizante (SDS o Tween®-20) y en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8.

Para la realización de este procedimiento se llevan a cabo los siguientes pasos: a) se pesan 0,125 g de la muestra de alimento molida y se depositan en un tubo de propileno de 10 mi. b) a continuación, se añaden 1,25 mi de una composición (cóctel de extracción) constituida por 2-ME 250 mM, SDS al 6% y 0,Ix de PBS (cóctel SDS de extracción) o bien 1,25 mi de una composición (cóctel de extracción) constituida por 2-ME 250 mM, Tween®-20 al 5% y 0,Ix de PBS (cóctel Tween de extracción) o, alternativamente, una composición (cóctel de extracción) constituida por SDS al 6% y 0,Ix de PBS (cóctel SDS de extracción sin 2-ME) o bien 1,25 mi de una composición (cóctel de extracción) constituida Tween®-20 al 5% y 0,Ix de PBS (cóctel Tween de extracción sin 2-ME.,en este último caso se desea comprobar si el Tween o el SDS sin el agente reductos son capaces de extraer la totalidad del gluten. Los tubos se cierran con el tapón de rosca/presión y se sellan con papel de sellado para evitar la evaporación por el calor. La mezcla de reacción se mezcla vigorosamente y se incuba en una estufa a una temperatura comprendida entre 27 y 8O⁰C durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 y 40 minutos. c) finalizada la incubación, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta temperatura ambiente, y se añaden 3,75 mi de una solución acuosa al 80% de etanol a la mezcla de reacción y se incuba durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 y 40 minutos a temperatura ambiente en un agitador rotatorio [Modelo LABINCO BV (posición 2-3) ] ; d) posteriormente, las muestras se centrifugan durante 10 minutos a 3.500 rpm (2.500 g) a temperatura ambiente (Centrifuga 5810 Eppendorf) y el sobrenadante se pasa a tubos de propileno limpios de 10 mi; y e) a continuación, las muestras se analizan por ELISA o por Western blot .

1.2.2 Preparación de la muestra para el análisis de gliadinas extraídas con cóctel-SDS de extracción. a) Se ponen 100 μl del alimento extraído con cóctel- SDS de extracción en un tubo de 1500 μl; b) se seca en Speed-Vac modelo Uníjet II a 37⁰C durante el tiempo necesario (mínimo 40 minutos) ; c) al tubo con la muestra seca se añaden 20 μl de tampón de electroforesis y se cierra el tubo; d) se agita vigorosamente durante 1 minuto, después se hierve a 100⁰C en bloque térmico durante unos 20 minutos y se centrifuga 1 minuto a 5000 rpm; y e) se cargan los 20 μl de tampón de electroforesis que contienen la muestra en el gel.

1.2.3 Preparación de la muestra para el análisis de gliadinas extraídas con cóctel-Tween de extracción a) Se ponen 100 μl del alimento extraído con cóctel- Tween de extracción en un tubo de 1500 μl; b) se seca en Speed-Vac modelo Unijet II a 37⁰C durante el tiempo necesario (mínimo 40 minutos); c) al tubo con la muestra seca se añaden 20 μl de tampón de electroforesis y se cierra el tubo; d) se agita vigorosamente durante 1 minuto, después se hierve a 100⁰C en bloque térmico entre 2 y 5 minutos y se centrifuga 1 minuto a 5000 rpm; y e) se cargan los 20 μl de tampón de electroforesis que contienen la muestra en el gel.

1.2.4 Preparación de la muestra para el análisis de gliadinas extraídas con cóctel-guanidina/2-ME : Lavados para eliminar la guanidina.

En primer lugar, se extrae de la muestra el gluten según lo describe Enrique García et al. Development of a general procedure for complete extraction of gliadins for heat processed and unheated foods. European Journal on Gastroenterology and Hepatology. Eur J Gastroenterol Hepatol 17. 5, 529-539 (2005) utilizando un cóctel de extracción compuesto por 2-ME 25OmM, guanidina 2M y PBS 0,1X que contiene: NaCl 13mM, KCl 0,3mM, Na₂HPO₄ ImM y KH₂PO₄ 0,2mM. Una vez extraída la muestra se prepara para su análisis de la siguiente forma: a) se ponen 100 ó 200 μl del alimento extraído con cóctel-guanidina en un eppendorf de 1.500 μl; b) se seca en Speed-Vac modelo Unijet II a 37⁰C durante el tiempo necesario (mínimo 40 minutos); mientras se seca la muestra se ponen a enfriar unos 3 mi de agua milli-Q el un tubo de polipropileno dentro de una caja con hielo; c) a continuación se procede a realizar un primer lavado para lo cual (i) se añaden 100 μl de agua fría (O⁰C - 4⁰C) en el tubo eppendof sobre la muestra; (ii) se agita vigorosamente durante unos 5-10 segundos hasta disolver las sales; (iii) se centrifuga durante 1 minuto a 13.200 rpm

(es necesario fijarse en la orientación del tubo para después añadir el agua con las sales disueltas del lado contrario de donde se deposita el pellet) ; y (iv) se retira cuidadosamente el tubo de la centrifuga y se añade el agua con las sales disueltas del lado contrario de donde se deposita el pellet, con lo que concluye el primer lavado; d) a continuación, se procede a efectuar un segundo lavado, para lo cual, se repiten de nuevo los pasos (i)- (iv) del proceso de primer lavado; en el caso de que se sequen 200 μl es necesario hacer un tercer lavado; e) una vez concluido el segundo lavado (o el tercero en el caso correspondiente) , se seca el pellet en el Speed-

Vac modelo Unijet II a 37⁰C durante el tiempo necesario para que se seque la muestra (aproximadamente 15 minutos) ; f) al tubo con la muestra seca se añaden 20 μl de tampón de electroforesis; g) se agita vigorosamente durante 1 minuto, después se incuba a 100⁰C entre 2 y 5 minutos en un bloque térmico y se centrifuga durante 1 minuto a 5.000 rpm en la centrifuga Eppendorf (modelo 5415 D); y h) se cargan los 20 μl de tampón de electroforesis que contiene la muestra en el gel.

1.3 Resultados

1.3.1 Efecto de las concentraciones de los agentes desnaturalizantes SDS y Tween en ELISA

Los resultados de las curvas de gliadinas conteniendo diferentes concentraciones de SDS o Tween®-20 muestran que la curva de gliadinas conteniendo una concentración de 0,05% de SDS no afecta al ELISA y es igual a la curva de gliadinas sin SDS. Del mismo modo, la curva de gliadinas conteniendo una concentración de 0,05, 1, 5 ó 10% de Tween®-20 no afecta al ELISA y es igual a la curva de gliadinas sin Tween®-20 (ver Figuras 1 y 2) .

Por otro lado, los resultados de la recuperación de gliadinas de muestras tratadas con calor y extraídas con 2- ME 250 mM conteniendo 2 y 6% de SDS muestran que la recuperación con 6% de SDS es prácticamente cuantitativa y ligeramente superior a la obtenida con 2% de SDS. De igual modo, los resultados de la recuperación de gliadinas de muestras tratadas con calor y extraídas con 2-ME 250 mM conteniendo 1 y 5% de Tween muestran que la recuperación con 5% y con 1% es prácticamente cuantitativa. Estos resultados se ponen de manifiesto en las Figuras 3 y 4 y Tablas 1 y 2.

Tabla 1

Recuperación de gliadinas de muestras tratadas con calor y extraídas con detergentes SDS o Tween 20 en presencia o ausencia de 2-ME 250 mM

|250iiϊ\l 2\l¡:) Detergentes : («sin 2ML)

Uten 2(H5%) SS)S (f»%J ϊween B ^»i * SI⁾S (6%!

O ¡atutías ' Sl)H «ι°- ») ippO 1%) {%í (%)

I 290 104 46 51 SÍ

2 % 45 41

3 214 93 44 52 46

4 M 93 39 47 43

54 S£ 46 50 Sé é J32 W

7 54 m

8 70 91

9 280

JO 336 95 ü 70 103

U ISS 9? i 3 18 122

Muestras incubadas a 50 ⁰ C / 40 minutos seguido de una extracción con etanol al 60 % / 60 minutos

* Valores de gl iadinas conocidos

1- 13 muestras tratadas con calor ( 240 ⁰ C )

( % ) gl iadinas recuperadas

En la Tabla 1 se muestran los resultados de la recuperación de gliadinas de muestras tratadas con calor y extraídas con SDS o Tween®-20 en presencia o ausencia de 2- ME 250 mM . Los resultados muestran que la recuperación de gliadinas en ausencia de 2-ME con los agentes desnaturaliz antes SDS y Tween®-20 por separado o combinados es sólo del orden del 50 % .

En la Tabla 2 se muestran los resultados de la recuperación de gliadinas de muestras tratadas con calor y extraídas con 2-ME 250 mM/ SDS 6% ( cóctel SDS de extracción ) a distintos tiempos y temperaturas de incubación y a distintos tiempos de extracción con 60% de etanol.

Tabla 2

Recuperación de gliadinas de muestras tratadas con calor y extraídas con 2-ME 250 mM/6% SDS a distintos tiempos y temperaturas de incubación y a distintos tiempos de extracción con 60% etanol.

25 mM 2Λ1E/ 6% SDS

J ϊeiispe

40 niin i ck^> incubación S min

I I I

J empcrdlitnt W ( U" V i?° t 50° V C t de incubación tiempo «fe (Atracción

πtin Ht min 1(1 min Ui msrj í# rain (>l ffliH 1# n*iπ Mi min Il rain 6# min ron 60 <Í etenβl

Oiadinav * Muestra (ppai) (%5 {%> {%) <%} {%» (%) (%t {%» <%)

1 291 164 % 105 108 112 108 llβ 1»9 108

2 132 9i n m 95 89 m 92 88 m 3 312 % 80 m % 103 100 112 111

Muestras incubadas a 50⁰C/ 40 o 15 minutos seguido de una extracción con etanol al 60%/ 10 ó 60 minutos

* Valores de gliadinas conocidos

1-3 muestras tratadas con calor ( 240⁰C )

( % ) gliadinas recuperadas

Por tanto , los resultados de la recuperación de gliadinas de muestras tratadas con calor y extraídas con SDS o con Tween®-20 en presencia o ausencia de 2-ME 250 mM muestran que la recuperación de gliadinas en presencia de 2 -ME es cuantitativa con los dos agentes desnaturaliz antes ensayados SDS y Tween®-20 .

Asimismo , los resultados de la recuperación de gliadinas de muestras tratadas con calor y extraídas con 2- ME 250 mM/ 6% SDS ( cóctel SDS de extracción ) a distintos t iempos y temperaturas de incubación y a distintos tiempos de extracción con 60 % de etanol muestran que no hay diferencias significativas en la recuperación de gliadinas en las condiciones señaladas . 1.3.2 Efecto de los agentes desnaturalizantes SDS y Tween®- 20 en Western blot

A pesar del buen rendimiento del Tween®-20 para cuantificar el gluten, se ha comprobado que dicho agente puede producir interferencias en la detección de gluten por la técnica del Western blot (Figura 6B) .

La mayor desventaja del sistema con guanidina es que durante el proceso de preparación de la muestra para analizarla en geles de SDS hay que realizar un lavado con agua para eliminar la guanidina. En este proceso de lavado también se elimina la fracción de las ω gliadinas por lo que dicha fracción no se detecta en el Western blot (Figura 5) . En el procedimiento de la invención, se ha utilizado un cóctel de extracción de gluten que comprende SDS de forma que las muestras se aplican directamente al gel de SDS sin necesidad de lavados con agua evitando asi que se pierda la fracción de las ω gliadinas .

El empleo del cóctel de extracción con Tween®-20 tiene el inconveniente de que el reactivo Tween®-20 afecta a las condiciones de electroforesis en los geles de SDS distorsionando las bandas de las gliadinas (Figura 6B) lo que no ocurre cuando se usa SDS y que el reactivo SDS es el mismo que se utiliza en los geles de electroforesis de SDS- PAGE por lo que no afecta a las condiciones de electroforesis ni distorsiona las bandas de las gliadinas (Figuras 5 y 6A) .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un agente reductor de grupos disulfuro y un agente desnaturalizante, en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8, en la que dicho agente desnaturalizante se selecciona entre SDS, un éster de sorbitano polioxietilenado y sus mezclas.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho agente reductor de grupos disulfuro se selecciona entre 2-mercaptoetanol, ditiotreitol y sus mezclas.

3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde dicho agente reductor es seleccionado entre 2-mercaptoetanol a una concentración entre 150-35OmM y ditiotreitol a una concentración entre 0.5-1OmM y donde dicho agente desnaturalizante es seleccionado entre SDS a una concentración entre 2-6% y un éster de sorbitano polioxietilenado a una concentración entre 1-5%.

4. Un procedimiento para la extracción de gluten en una muestra de un alimento que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra con una solución acuosa de etanol en presencia de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha solución acuosa de etanol tiene un contenido en etanol comprendido entre 50% y 70%.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, que comprende mezclar la muestra a ensayar con una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, incubar la mezcla resultante a una temperatura comprendida entre 3O⁰C y 7O⁰C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 60 minutos, enfriar hasta temperatura ambiente, añadir una solución acuosa de etanol y separar el sobrenadante que contiene el gluten extraído.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la incubación de la muestra con dicha composición se efectúa a una temperatura comprendida entre 37⁰C y 5O⁰C durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 y 40 minutos .

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha solución acuosa de etanol es una solución acuosa de etanol al 60%.

9. Procedimiento según la reivindicación 6, que comprende, además, incubar la mezcla que contiene la muestra a ensayar, la composición de las reivindicaciones 1 a 3 y la solución acuosa de etanol.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la incubación de la mezcla que contiene la muestra a ensayar, la composición de las reivindicaciones 1 a 3 y la solución acuosa de etanol, se efectúa a temperatura ambiente durante 1 hora.

11. Un método para la cuantificación del gluten presente en una muestra de un alimento mediante una técnica de inmunodetección que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 y, a continuación, analizar el gluten extraído mediante dicha técnica de inmunodetección.

12. Un método para la cuantificación por ELISA del gluten presente en una muestra de un alimento que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 y, a continuación, cuantificar por ELISA el gluten extraído .

13. Un método para la cuantificación y análisis de las fracciones por Western blot del gluten presente en una muestra de un alimento que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 y, a continuación, cuantificar y analizar las fracciones del gluten extraído por Western blot.

14.- Método para la cuantificación y análisis de las fracciones que comprende la realización conjunta de los métodos según las reivindicaciones 12 y 13, ya sea primero por ELISA y posteriormente por Western blot, o viceversa.

15. Un kit que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o los componentes de dicha composición parcialmente mezclados o separados.

16. Kit según la reivindicación 15, que comprende, además, una solución acuosa de etanol o los componentes de dicha solución acuosa de etanol por separado.

17. Kit según la reivindicación 15, que comprende, además, los reactivos necesarios para la realización de un ensayo de inmunodetección para analizar el gluten contenido en un alimento, mezclados total o parcialmente entre si o separados .

18. Kit según la reivindicación 15, que comprende, además, los reactivos necesarios para la realización de un ELISA para cuantificar el gluten contenido en un alimento, mezclados total o parcialmente entre si o separados.

19. Kit según la reivindicación 15, que comprende, además, los reactivos necesarios para la realización de un Western blot para analizar las fracciones del gluten contenidas en un alimento, mezclados total o parcialmente entre si o separados.