ES2344941T3 - Metodo de prueba bacteriana para enzimas glicadas intracelulares. - Google Patents
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Abstract
Un método para medir el contenido bacteriano de fluidos que comprende: a. enlazar una cantidad efectiva de una glicoproteína con bacterias contenida en una muestra de fluido, dicha glicoproteína teniendo una funcionalidad enzimática generando una señal para indicar su presencia; b. separar glicoproteína en exceso no enlazada de dicha muestra fluida después de reaccionar dicha glicoproteína con bacterias en dicha muestra en el paso (a); c. medir la cantidad de dicho marcador que permanece después de separar dicha glicoproteína en exceso no enlazada de (b); y d. determinar el contenido bacteriano de dicha muestra como relacionada a la cantidad de dicho marcador medido en el paso (c); donde dicha glicoproteína es por lo menos un miembro del grupo que consiste de enzimas intracelulares y dichas enzimas inherentemente proveen una fracción de marcador que sirve como dicho marcador directamente enlazando dichas bacterias.
Description
Método de prueba bacteriana para enzimas
glicadas intracelulares.
Esta invención se relaciona en general con
métodos para detectar bacterias en fluidos, particularmente en
especímenes biológicos. Mas específicamente, la invención se
relaciona con métodos rápidos para la detección de bacterias en
orina y otros fluidos con mejorada precisión comparados con aquellos
actualmente disponibles. Aunque el análisis de orina es de
particular interés, otros fluidos, tales como sangre, suero, agua, y
similares pueden ser analizados usando los métodos de la
invención.
Es deseable una prueba rápida para bacterias,
por ejemplo usando tiras de prueba secas del tipo ahora usado para
diversos propósitos. En la actualidad, las tiras de prueba de orina
son usadas para explorar muestras y descartar aquellas que no
requieren evaluación de laboratorio. Sin embargo, las pruebas
actuales, tales como medición de nitritos y leucocitos, no son
capaces de proveer rápidamente resultados certeros. A menudo, se
obtienen muchos resultados falsos, haciendo innecesarios análisis de
seguimiento de laboratorio. Aproximadamente 50% de la carga de
trabajo del laboratorio de un hospital involucra especímenes de
orina y aproximadamente 90% de estos especímenes son cultivados y
analizados para bacterias totales y gran negativas. Sin embargo,
sólo aproximadamente 10% de las muestras de orina que son cultivadas
para detección de bacterias tienen en efecto una prueba positiva.
Claramente, una previa exploración correcta de la orina podría
reducir grandemente el número de muestras enviadas al laboratorio
para análisis.
La penetración de mercado de las tiras de prueba
disponibles actualmente no es grande, en parte porque las pruebas
producen resultados positivos falsos, tal como se determina después
por análisis de seguimiento en el laboratorio. Por consiguiente,
una tira de muestra que provee determinación rápida y certera de la
presencia de bacterias reduciría costos y haría posible tratar
bacterias en un paciente de inmediato, en lugar de esperar por
resultados de laboratorio.
Los presentes inventores estaban investigando
métodos por los cuales las bacterias pueden ser detectadas con
exactitud. Un acercamiento potencial involucraba encontrar
sustancias que podrían enlazarse a bacterias y después ser
detectadas y medidas para que la cantidad de bacterias presente
pudiera ser determinada. El problema puede ser planteado como
sigue: ¿Cómo se enlazan las sustancias a las bacterias y qué
sustancias exhiben las propiedades necesarias para que se realicen
medidas certeras? El enlace debería ser específico para bacterias.
Enlaces no específicos pueden oscurecer los resultados ya que puede
variar impredeciblemente y proveer resultados inexactos.
Los anticuerpos son reconocidos por tener la
habilidad de unirse a las bacterias y se pensó que si la ALP
(fosfatasa alcalina), que puede ser usada para detectar por
desarrollo de color los materiales a los cuales se enlaza, podría
ser unida a otra sustancia capaz de unirse por sí misma a las
bacterias, sería posible medir la cantidad de bacterias presente.
Al principio, los experimentos indicaban que la ALP estaba enlazada
a bacterias de una forma no específica y por lo tanto se
consideraba que presentaba un problema para el desarrollo de un
método confiable para medir la cantidad de bacterias presente en una
muestra. Posteriores investigaciones fueron dirigidas hacia la
eliminación de enlaces no específicos de ALP para que sólo el ALP
unido a las sustancias que puedan enlazarse a bacterias sea
medidas. Sorprendentemente, se encontró que la creencia que la ALP
se enlazaba no específicamente a las bacterias no era correcta y
que de hecho, esta sí se enlazaba a bacterias, llevando a la
presente invención. Como se verá más abajo, la ALP es una sustancia
preferida para medir la cantidad de bacteria, pero pueden usarse
otras sustancias, particularmente glicopéptidos y
glicoproteínas.
Se conocen métodos de pruebas rápidas para
bacterias, pero difieren del método de la presente invención. En un
método, un inmunoensayo para la detección de lipopolisacáridos de
bacterias Gram negativas tal como E. coli, Clamidia o
Salmonela usa una proteína de enlace lipopolisacárida o un
anticuerpo que tiene afinidad de enlace específica al analito
lipopolisacárido como un primero o segundo reactivo de enlace (véase
WO 00/60354 y US 5,620,845). En US 5,866,344 se describen otros
inmunoensayos para detectar polipéptidos de paredes celulares. Las
proteínas pueden ser purificadas en un método usando polipéptidos de
enlace polisacárido y sus conjugados (véase US 5,962,289; US
5,340,731; y US 5,928,917). En US 5,856,201 se revela la detección
de proteínas usando proteínas de enlace polisacárido y sus
conjugados. Los métodos descritos en lo anterior difieren de
aquellos de la presente invención, como se verá en la discusión de
la presente invención más abajo.
Los métodos que se basan en anticuerpos
liposacáridos o proteínas de enlace no proveen una medida de las
bacterias totales presentes. Estos tampoco usan un glicopéptido o
glicoproteína para enlazarse a la célula bacteriana. Los métodos
basados en polipéptidos requieren anticuerpos para enlazarse a la
pared celular bacteriana en lugar de usar glicopéptidos o
glicoproteínas. Los métodos basados en polipéptidos de enlace
polisacárido requieren la fusión de secuencias cortas de
polipéptidos en analitos de interés y usan polipéptidos
no-glicados para enlazarse a un polisacárido.
Se ha demostrado que las glicoproteínas se
enlazan a varias biomoléculas. Por ejemplo, se ha mostrado que las
glicoproteínas en la superficie celular de hongos se enlazan a las
proteínas del huésped. También, se ha demostrado que glicoproteínas
excretadas de células epiteliales se enlazan a lípidos y el enlace
de glicoproteínas a carbohidratos es bien conocido. Todas estas
interacciones de glicoproteínas son dependientes de muchos factores,
tales como fuerza iónica y pH, y la afinidad de las proteínas
individuales para las biomoléculas. Sin embargo, el uso de
glicoproteínas en ensayos para la medición de contenido bacteriano
no ha sido descrito hasta el momento.
Se han aislado receptores de glicoproteínas en
monocitos humanos. Se ha mostrado que dos proteínas de enlace
extraídas de las paredes celulares de monocitos humanos tienen una
afinidad de 9x10^{+6} para enlazar fructosilisina (lisil péptidos
glicados con glucosa) con 10,000 sitios de enlace activos por
célula. Se piensa que estos sitios receptores de proteína
pertenecen a la familia de proteínas de enlace ARN y que están
involucradas en el proceso de envejecimiento enlazando proteínas
relacionadas con la edad tales como albúmina glicada. Sin embargo,
la técnica previa en receptores de glicoproteína no enseña que los
receptores sobre las paredes celulares podrían ser usados para la
detección de células. No se provee ningún medio para la generación
de señal, por partículas de color o reacciones enzimáticas que
puedan ser usadas como una medida de la cuenta o detección de
células.
Las bacterias son conocidas por unirse al tejido
del huésped, usualmente por adhesión de la membrana celular
bacteriana a proteínas de matriz extracelulares del huésped. Se
conoce que este enlace ocurre a través de varias formas de
interacción, por glicoaminoglicanos, colágenos, proteínas e
integrinas en su superficie. Por lo tanto, la superficie celular,
incluyendo superficies bacterianas celulares, puede ser visualizada
como un mosaico de moléculas capaz de enlazarse a proteínas de los
tejidos del huésped como también a sitios receptores del
huésped.
La interacción entre células bacterianas y
glicoproteínas es generalmente conocida, pero el enlace de
glicopéptidos específicos a una célula bacteriana no ha sido
revelado. Ha sido descrita la adhesión celular bacteriana a
proteínas de matriz extra celulares tales como fibronectina y
lamina. Se mostró que este enlace ocurre entre las adhesiones
celulares y grupos glicados sobre las proteínas. Se han mostrado
resultados similares con proteínas de tejido conectivo y células
bacterianas. Estructuras de polipéptido y carbohidrato de
glicoproteínas pueden tener gran variación y las estructuras
químicas de glicopéptidos y glicoproteínas son usualmente
desconocidas, tales como aquellas que enlazan células
bacterianas.
Se han descrito métodos para medir el enlace de
glicoproteínas a células bacterianas; sin embargo, la medida de
bacterias por enlace de glicopéptido o glicoproteína no ha sido
descrita. Más particularmente, el enlace de glicopéptidos o
glicoproteínas que son enzimas o están unidas a marcas de detección
no ha sido revelado.
El enlace de paredes celulares a fosfatasa
alcalina (ALP) es conocido, pero en este momento, no es posible
asignar una función precisa a ninguna fosfatasa alcalina diferente
de la de catálisis de la hidrólisis de fosfomonoésteres. Es
conocido que daños al tejido causan una liberación de estas ALP
iso-enzimas proporcionando importancia clínica.
Ciertas ALP iso-enzimas son
conocidas por ser enlazadas a la membrana. Las isoenzimas fosfatasa
alcalina de intestino, de hígado, de hueso, de riñón y de placenta
son ejemplos de enzimas que son conocidas por tener enlace de
membrana a paredes celulares, incluyendo dipeptidilpeptidasa,
aminopeptidasas tales como alanina aminopeptidasa, endopeptidasa,
gama-glutamil transferasa, lactasa,
alfa-D-glucosidasas, hidrolasas
tales como glicosidasa y 5' nucleotidasa. Se sabe que el enlace de
membrana celular para ALP ocurre a través de un ancla
C-terminal
glican-fosfatidil-inositol en la
cual los triglicéridos de cadena larga del ancla son incorporados
en la membrana de lipoproteína. El ancla C-terminal
glican-fosfatidilinositol está ausente del ALP
producido por la bacterias E coli y el ALP de E coli
es considerado una enzima soluble. Por lo tanto, el enlace de ALP a
E coli en la presente invención tendría que ocurrir por otro
mecanismo.
Se ha usado ALP en algunas aplicaciones
diagnósticas. Por ejemplo, se ha usado ALP en una prueba diagnóstica
de inmunoensayo como una marca para el inmunoensayo; véase US
5,225,328. Sin embargo, no ha sido usada en una prueba de fase seca
sin un anticuerpo para la detección de bacterias.
Los presentes inventores han descubierto que
todas las células bacterianas tienen la habilidad de enlazar
ciertas glicoproteínas a través de múltiples sitios de enlace. Como
resultado de este descubrimiento, ellos han encontrado que tales
glicoproteínas pueden ser usadas en tiras de prueba que tienen la
habilidad de detectar todas las bacterias presentes con exactitud,
como será visto en la detallada discusión de la invención que
sigue.
La invención es definida por las
reivindicaciones 1-12.
La Fig. 1 ilustra los resultados del Ejemplo
1.
La Fig. 2 ilustra resultados adicionales del
Ejemplo 1.
La Fig. 3 ilustra los resultados del Ejemplo
4.
La Fig. 4 ilustra los resultados del Ejemplo
7.
La Fig. 5 ilustra los resultados del Ejemplo
7.
La Fig. 6 ilustra los resultados del Ejemplo
8.
La Fig. 7 ilustra los resultados del Ejemplo
8.
La Fig. 8 ilustra el efecto de pH en la
actividad de ALP.
La Fig. 9 ilustra el efecto de pH en la
actividad de ALP.
La Fig. 10 ilustra el efecto de diferentes
cationes en el enlace ALP.
La Fig. 11 ilustra el efecto de diferentes
cationes en el enlace ALP.
Las glicoproteínas son compuestas de amino
ácidos con enlaces peptídicos y carbohidratos. Las glicoproteínas
pueden ser unidas a bacterias a través de atracción de cargas y
formar moléculas sobre la pared celular. Como se verá en los
ejemplos más abajo, la cantidad de la glicoproteína enlazada a las
células bacterianas variará dependiendo de varios factores,
incluyendo la estructura molecular, presencia de metales, fuerza
iónica, y pH del ambiente.
Las glicoproteínas, en las que una o más
unidades de carbohidratos han sido unidas covalentemente a la
proteína, son enzimas intracelulares (por ejemplo glutamato
deshidrogenasa, ALP, lactato deshidrogenasa).
Las unidades de monómero de carbohidrato que se
unen comúnmente a proteínas incluyen galactosa (Gal), manosa (Man),
glucosa (Glu), N-acetilglucosamina (GlcNAc),
N-acetilgalactosamina (Gal NAc), ácidos siálicos
(SA), fucosa y xilosa. Las cadenas de carbohidratos ocurren con una
amplia variedad de longitudes y estructuras, pero algunas
estructuras típicas encontradas son Man-GlcNAc-,
GalNAc(Gal)(SA)-, Man(Man(Man)_{2})
(Man(Man))-GlcNAc -GlcNAc-,
Man((Man-GlcNAc-Gal-SA)_{2}-GlcNAc
-GlcNAc- y aquellas listadas en la Tabla 2 más abajo.
Las cadenas de carbohidratos se unen
generalmente a proteínas a través de grupos hidroxilo de residuos de
amino ácidos de serina (Ser) o treonina (Thr), cadenas laterales
del átomo de amida N de asparagina (Asn) o a través de residuos de
hidroxi-lisina (Hyl). Los residuos particulares de
Ser y Thr O-glicosilados no parecen presentarse en
secuencias únicas de amino ácidos, por lo tanto Ser o Thr pueden ser
conectados a cualquier amino ácido, tal como Ser-X,
Thr-X, donde X puede ser cualquier amino ácido. La
glicosilación de residuos de Hyl ocurre en una secuencia
característica
-Gly-Y-Hyl-Z-Arg-,
donde Y y Z son cualquier amino ácido. Los residuos de Asn
N-glicosilados se presentan en la secuencia de
-Asn-X-Ser- o
-Asn-X-Thr-, donde X puede ser
cualquiera de los amino ácidos normales, aparte de Pro.
Una glicoproteína particularmente efectiva es la
fosfatasa alcalina (ALP). La cantidad de la glicoproteína dependerá
de la cantidad de bacterias presente en la muestra; por ejemplo,
cuando hay bacterias presentes, una cierta cantidad de
glicoproteína va a depender del número de sitios de enlace y la
fuerza de la constante de enlace. Con una glicoproteína dada y tipo
de célula bacteriana se fijan los sitios de enlace y la cantidad de
glicoproteína enlazada es directamente proporcional a la cantidad de
bacterias presente.
El método de la invención puede ser aplicado a
tiras de prueba secas familiares para aquellos diestros en la
técnica, o en métodos de prueba húmeda tales como aquellos descritos
en los ejemplos de abajo. Dependiendo de la técnica especifica,
pueden estar presentes compuestos de amortiguación, sustratos para
los compuestos de amplificación de enzima de glicoproteína, y otros
aditivos tales como compuestos bloqueadores.
Se ha descubierto que agregar metales en estado
de transición específicos aumenta el enlace de proteína a las
paredes celulares bacterianas. Aunque no se requiere, el uso de
metales en estado de transición específicos aumenta la sensibilidad
de un ensayo basado en proteína glicada enlazada a bacterias.
En una modalidad particularmente preferida de la
invención, tales metales son usados para aumentar la respuesta de
la fracción de marcado. Varios metales han sido evaluados. De éstos,
se ha encontrado que el zinc,el cobre y el hierro tienen un efecto
beneficioso, particularmente el zinc, como será visto en los
ejemplos más abajo.
Sustratos para ALP incluyen los ésteres de
fosfato de los siguientes grupos orgánicos, alcoholes primarios y
alifáticos, azúcares, alcoholes de azúcar, fenoles, naftoles y
nucleósidos. Ejemplos de sustratos que forman color visual incluyen
naftol-AS-Bl-fosfato,
naftol-AS-MX-fosfato,
p-nitrofenol fosfato fenilfosfato (PPNP),
indoxilfosfato, por ejemplo,
bromo-cloro-indolil-fosfato
(BCIP), fosfato de fenolftaleína, monofosfato y difosfato de
timolftaleína, beta-naftilfosfato, sal de
diciclohexilamonio de PPNP para estabilidad, monofosfato de
timolftaleina, difosfato de fenolftaleína, fosfato de carboxifenil,
beta-glicerofosfato y
beta-glicerofosfato. Ejemplos de sustratos
fluorescentes para ALP incluyen metilfluoresceína
alfa-naftil fosfato. La fosfatasa alcalina puede
ser medida por un amplio rango de sustratos quimioluminiscentes y
bioluminiscentes. Ejemplos de sustratos quimioluminiscentes para
ALP incluyen adamantil 1,2-dioetano aril fosfato,
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato, fosfato de fenacilo, NADP, ácido ascórbico
2-O-fosfato, fosfato de
cortisol-21-O, NN'
dimetil-9,9' bisacridinio dinitrato, derivados de
indolil, por ejemplo
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato sal de disodio (BCIP-2Na),
D-luciferina-O-fosfato
y adamanil 1,2-dioxetano aril fosfato (AMPPD).
Varios amortiguadores, tanto
no-transfosforilantes como aquellos de variados
grados de propiedad transfosforiladora han sido usados para
determinaciones de ALP (es decir, Carbonato,
2-amino-2-metil-1-propanol
y dietanolamina). Amortiguadores comúnmente utilizados para ALP
incluyen etilaminoetanol (pKa 9.9), dietanolamina (pKa 8.7),
tris-(hiroximetil)aminometano (pKa 7.8),
2-amino-2-metil-1-propanol
MAP (pKa 9.3),
2-amino-2-metil-1,3-propanediol
(pKa 8.6), carbonato de sodio, bicarbonato de sodio (pKa 9.9),
glicil-glicina (pKa 8.2), glicina (pKa 9.6), y
barbital (pKa 7.44) con actividad medida a rangos de pH de 7 a
10.
Pueden usarse aditivos adicionales tales como
co-factores de enzimas para mejorar las condiciones
de reacción para enzimas. Pueden usarse manitol y otros alcoholes
para aumentar los índices de sustrato de ALP. En el caso de ALP,
por lo menos un equivalente de metal de Zn, Ca y Mg para cada
molécula de ALP estará presente para proveer actividad catalítica y
posiblemente también para mantenimiento de la estructura nativa de
la enzima. Los inhibidores de enzima incluyen cisteína, EDTA y
ácido tioglicólico, L-fenilalanina,
L-homoarginina, L-triptofano,
L-leucina, levamisol e imidazol. También es conocido
que sales tales como cloruro de sodio pueden usarse para controlar
enzimas. También es conocido que surfactantes tales como sulfato
dodecil de sodio y ácidos biliares modulan rangos de ensayos de
enzimas y sensibilidad.
También pueden usarse sistemas de amplificación
de enzimas para aumentar los límites de detección para ensayos de
enzimas. Se conocen varios métodos de amplificación de enzimas para
la detección de fosfatasa alcalina. Estos incluyen la formación de
formazan (INT-violeta colorimétricamente o
resazurina fluorimétricamente) a través de sistemas de enzimas (por
ejemplo, diaforasa y alcohol deshidrogenasa) que utilizan
co-factor de NAD y dependen de ALP para
desfosforilar la enzima NADP para producir NAD. Por ejemplo, se ha
usado la conversión de fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido
(NADP) a NAD^{+} por ALP para amplificación. El compuesto
NAD^{+} fue entonces reducido a NADH por alcohol deshidrogenasa en
la presencia de etanol incluido en el medio de reacción. A su vez,
se convirtió NADH en la presencia de diforasa de nuevo en NAD con
reducción simultánea de sal de tetrazolio también presente en el
medio. Esto resultó en una acumulación de tinción de color de
formazen soluble, proporcional a la concentración de NAD^{+}
generada por AP. El NAD^{+} recién formado es reciclado varias
veces, resultando en un aumento de 100 veces en sensibilidad.
Compuestos de bloqueo seleccionados del grupo
que consiste de polímeros, proteínas no-glicadas,
polipéptidos no-glicados, y polisacáridos pueden
ser incluidos para reducir interferencia o mejorar color. La
interferencia es mejorada previniendo el enlace no específico por
sustancias de interferencia a bacterias y en su lugar enlazar
sustancias de interferencia al compuesto de bloqueo. El color es
mejorado actuando como una capa en extensión que permite que el
color sea uniforme en reactivos secos.
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El uso de glicoproteínas para la detección de
bacterias puede ser aplicado a una variedad de métodos de prueba.
Los métodos requieren combinar una glicoproteína con la muestra que
va a ser ensayada, separando la glicoproteína enlazada a bacterias
de glicoproteína libre no enlazada y midiendo glicoproteínas
enlazadas o libres. Tales pasos pueden ser logrados a través de una
variedad de analizadores de manejo de fluidos tales como
centrifugación, aparatos microfluídicos, tiras de cromatografía,
lectores de filtración y microplacas, para nombrar algunos.
La efectividad de las glicoproteínas para la
detección de bacterias es medida de la misma forma para todos los
métodos de prueba. La efectividad se mide obteniendo una señal de
detección de bacterias que es tres desviaciones estándar de la
señal obtenida en la ausencia de bacteria.
Para que las glicoproteínas sean efectivas
detectando 1000 bacterias por célula/mL, la constante de asociación
debe ser por lo menos 10^{+6} y el número de sitios de enlace de
por lo menos 100. Estas medidas de la fuerza de enlace para
glicoproteína a bacterias y del número de sitios de enlace para
glicoproteína a bacterias permiten una señal suficiente de
detección de bacterias. El límite de detección de 1000 bacterias
célula/mL es el umbral mínimo clínicamente deseado. Una lectura de
fondo suficiente para el enlace de glicoproteína a otros componentes
del espécimen, por ejemplo, otras proteínas, debe ser una constante
de asociación de menos de 10^{+4}. Usando ALP como un ejemplo
representativo, una constante de enlace de 5x10^{+6} y el número
de sitios de enlace fue estimado en 590.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Células bacterianas (10^{6} a 10^{8}
células/mL) fueron lavadas dos veces con agua después de
centrifugación para separar las células en un gránulo empacado de
líquido sobrenadante. Las células lavadas en forma de gránulo
fueron suspendidas en 40 \muL de agua y se agregaron 10 \muL de
fosfatasa alcalina intestinal bovina (ALP) acuosa (2 \mug o
10,000 unidades). La mezcla fue dejada a temperatura ambiente por 30
minutos y después centrifugada, después de lo cual los gránulos
bacterianos fueron lavados con agua 4-5 veces (50
\muL). Todos los sobrenadantes de lavado fueron combinados. Una
muestra en blanco sin células fue diluida de la misma forma. Los
gránulos finales fueron suspendidos en 50 \mul de agua y ambos
sobrenadantes y suspensiones celulares fueron ensayadas para
detección de enlace de ALP usando 2.5 \mul de 0.005 M de fosfato
para-nitrofenol (PNPP) en Tris o amortiguador EPPS
a pH 7.5. La hidrólisis del sustrato resulta en color amarillo
(PNPP) o azul-verde (BCIP) que es directamente
proporcional a la cantidad de ALP enlazado a la bacteria. La
actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) fue probada usando
sustratos comunes tales como BCIP
(bromo-cloro-indolil-fosfato)
formando un color azul/verde en amortiguador Tris, pH 7.5. Después
de 10 minutos a temperatura ambiente las muestras fueron leídas en
un lector de placa (Biotek Powerwave Absorbance Reader) a una
longitud de onda de 405 nm. Un juego paralelo de bacterias fue
corrido sin agregar ALP como
control.
control.
Se observó el enlace de ALP intestinal a células
bacterianas. En la Figura 1, las barras a rayas muestran que
células suspendidas después del tratamiento con ALP y lavados tenían
más actividad ALP intestinal que las células no tratadas (barras
sólidas). Las barras sólidas muestran que las células suspendidas no
tratadas con ALP intestinal tenían alguna actividad ALP,
considerándose como ALP nativo en las bacterias. Como control, la
actividad ALP de las soluciones de tratamiento muestra la actividad
máxima esperada sin contribución de la ALP nativa.
La Figura 1 demuestra enlace ALP intestinal a
todas las cepas bacterianas muestreadas. Se encontró que tanto las
bacterias gram positivas como las cepas #3 y #6 de Staphylococcus
aureus (Sf) como para las bacterias gram negativas tales
como las cepas #9 y #14 de Escherichia coli (E. coli)
se enlazan al ALP. Nuevamente las barras a rayas que son
significativamente más grandes que las barras sólidas demuestran
esto. La Figura 2 muestra que la cantidad de ALP enlazado o la
actividad generada es directamente proporcional a la cantidad de
células bacterianas presentes. La actividad de ALP de las células
suspendidas aumentó con cantidades aumentadas de células.
El mecanismo del enlace de ALP a las células
bacterianas no es completamente entendido, pero se cree que péptidos
glicados en ALP u otras glicoproteínas se están enlazando a los
receptores de proteínas anclados en la pared celular o están
enlazando la membrana peptidoglicon. Se conoce que tanto las
bacterias gram positivas como las gram negativas tienen receptores
de proteína en sus membranas mas externas. Para bacterias gram
negativas, la membrana externa lipopolisacárida tiene receptores de
proteínas. Para las bacterias gram positivas la membrana externa
peptidoglicon tiene receptores de proteínas.
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Ejemplo Comparativo
2
Como control, una proteína enzimática sin
glicación, beta-galactosidasa, fue probada para
enlazarse a paredes celulares bacterianas. Las bacterias de
Staph. y E. coli fueron muestreadas en cuanto al
enlace de beta-galactosidasa. Las
beta-Galactosidasas (20 mU) fueron agregadas a
suspensiones salinas de 10^{8} células/mL de ambas bacterias y
fueron ensayadas al igual que los gránulos (células
re-suspendidas en agua) y sobrenadantes después de
centrifugar las bacterias usando dimetilacridinio
B-D-galactosa (DMAG) como sustrato.
El ensayo para determinar la cantidad de enzima fue agregar 10
\muL de DMAG acuosa (0.5 mM) y 5 \muL de amortiguador tris
acuoso (1M) ajustado para un pH 7.5 o bacterias de prueba (10^{7}
células) y H_{2}O a 100 \mul. El color amarillo brillante de
DMAG cambia a verde claro a azul oscuro en 5-30
minutos (con beta-galactosidasa en 5 min) lo cual
se lee a 634 nm en un lector de
placa.
placa.
La
beta-D-galactosidasa es una proteína
no-glicoproteína y no-membrana. En
estos experimentos, la
beta-D-galactosidasa no se enlazó a
bacterias y no fue posible la medición de bacterias.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Células bacterianas (1 a 4.5 x 10^{7}
células/mL) fueron lavadas dos veces con agua después de
centrifugación para separar las células en un gránulo empacado de
líquido sobrenadante. Las células lavadas en forma de gránulo
fueron suspendidas en 20 ul de
N-2-hidroxietil
piperazina-N'-[3-propano ácido
sulfónico] se agregaron amortiguador EPPS (50 mM a pH 8.0) y 30
\muL de agua. Proteína(s) glicadas (2-40
\mug). En algunos casos una proteína glicada
(2-40 \mug) y fosfatasa alcalina intestinal bovina
(ALP) (2 \mug o 10,000 unidades) fueron agregadas y el enlace de
las proteínas glicadas fue medido por la reducción del enlace de
ALP.
La mezcla de proteínas glicadas y células
bacterianas fue dejada a 25ºC por 15 minutos. La mezcla fue entonces
centrifugada a 30,000 rpm por 30 minutos después de lo cual las
células bacterianas formaron un gránulo en el fondo del tubo y
fueron lavadas con agua 4-5 veces (50 \muL). La
centrifugación permite la separación de glicoproteína enlazada a
las células bacterianas de proteína(s) glicadas no
enlazadas.
Después del lavado, los gránulos bacterianos
fueron suspendidos en 50 \muL de amortiguador de borato (25 mM a
pH 9.0). Una alícuota de 5 \muL de la suspensión fue ensayada en
cuanto a la detección de enlace ALP agregando 5 \muL de fosfato
para-nitrofenol (PNPP, 100 mM), 50 \muL de
amortiguador de borato de sodio (25 mM a pH 9.0) y 140 \muL de
agua. La hidrólisis del sustrato PNPP resultó en un color amarillo.
El color se lee a 405 nm usando un lector de placa ELISA durante
15-30 minutos. La absorbancia es directamente
proporcional a la cantidad de ALP enlazada a las adhesiones de
célula bacteriana para grupos glicados.
Por comparación, varias proteínas glicadas y
no-glicadas fueron probadas para enlazarse a
bacterias (véase Tabla 1). La albúmina, prealbúmina,
alfa-1-antitripsina,
alfa-1-microglobulina, proteína de
enlace de retinol, glicoproteína alfa-1-ácido,
alfa-2-glicoproteína, transferrina,
glicoproteína Tamm-Horsfall e inmunoglobulinas eran
todas proteínas glicadas conocidas tal como fueron recibidas de los
proveedores. La hemoglobina, lisozima, y mioglobina son todas
proteínas no-glicadas como fueron recibidas de los
proveedores. Se encontró que todas las proteínas se enlazaron a las
células bacterianas por medio de proteína enlazada usando azul de
comassie brillante.
Solamente una proteína que se enlaza a las
adhesiones celulares para grupos glicados causa la inhibición del
enlace de ALP por las bacterias. Una proteína que se enlaza a las
adhesiones celulares para grupos glicados provee un numero positivo
en la Tabla 1. Por ejemplo, la albúmina previno 50% de ALP de
enlazarse a la bacterias E. coli. Como se ve en la Tabla 1
todas las proteínas glicadas inhibieron el enlace de ALP por las
bacterias. Proteínas no-glicadas tales como
hemoglobina, mioglobina y lisozima no inhibieron el enlace de ALP.
Como un control, se probaron tres polipéptidos no glicados
(poliarginina, polilisina, polihistidina) y no se encontró que
inhibieran la actividad de ALP.
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ALP es un ejemplo de una proteína glicada que
tiene funcionalidad enzimática y genera una señal, como se demuestra
en el Ejemplo 1. Otros ejemplos de proteínas enzimáticas glicadas
incluyen fosfatasa ácida, fucosidasa, fosfolipasa,
glucocerebrosidasa, hidrolasa, arilsulfatasa A, amilasas,
celobiohidrolasa y peroxidasa.
Pueden usarse aditivos de bloqueo para bloquear
reacciones en competencia y reducir interferencia o actuar como
agentes de distribución. Ejemplos son las glicoproteínas no
enlazadoras del Ejemplo 3. Otros son polímeros tales como poli
(vinil pirrolidona) o polivinil alcohol y proteínas tales como
caseína, gelatina, albúmina, celulosa hidrófoba, y
polisacáridos.
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Ejemplo
4
Células bacterianas (1 a 4.5 x 10^{7}
células/mL) fueron lavadas dos veces con agua después de
centrifugación para separar células en un gránulo empacado del
líquido sobrenadante. Las células lavadas en forma de gránulo
fueron suspendidas en 20 \muL de amortiguador EPPS (50 mM a pH
8.0) y 30 \muL de agua. Se agregó hemoglobina (20 \mug) como
aditivo bloqueador. Se agregó fosfatasa alcalina (ALP) (100
mUnidades) de fuentes de intestino, placenta, y bacterias.
La mezcla de proteína glicada y células
bacterianas fue dejada a 25ºC por 15 minutos. La mezcla fue entonces
centrifugada a 30,000 rpm por 30 minutos después de lo cual las
células bacterianas formaron un gránulo en el fondo del tubo y
fueron lavadas con agua 4-5 veces (50 \muL). La
centrifugación permite la separación de glicoproteína enlazada a
las células bacterianas de proteína(s) glicadas no
enlazadas.
Después del lavado, los gránulos bacterianos
fueron suspendidos en 50 \muL de amortiguador tetraborato de
sodio (25 mM a pH 9.5). Una alícuota de 5 \muL de la suspensión
fue ensayada para detección de enlace de ALP agregando 5 \muL de
fosfato de para-nitrofenol (PNPP, 100 mM), 50 \muL
de amortiguador de borato de sodio (25 mM a pH 9.0) y 140 \muL de
agua. La hidrólisis del sustrato de PNPP resultó en un color
amarillo. El color se lee a 405 nm usando un lector de placa ELISA
entre 15-30 min y la absorbancia es directamente
proporcional a la cantidad de ALP enlazado a las adhesiones de
células bacterianas para los grupos glicados. Los resultados son
ilustrados en la
Figura 3.
Figura 3.
Una comparación de isoenzimas ALP de fuentes de
placenta, bacterianas y de intestino permite un entendimiento de
qué glicosilación es necesaria para el enlace. Las formas ISO de ALP
intestinal, de hígado, de hueso, y de placenta tienen diferencias
en estructuras de carbohidratos y cantidad de ácido siálico. La ALP
intestinal carece de ácidos siálicos terminales en sus cadenas de
carbohidrato mientras la de placenta y bacterias tienen residuos de
ácido siálico. El ALP bacteriano carece de porciones de
glicofosfolípido con enlace de membrana presente en el ALP
mamífero. La ALP de placenta contiene fucosa, manosa y galactosa
mientras la ALP intestinal tiene un alto contenido de hexosa y
hexoamina.
De acuerdo con la Figura 3, los
glicofosfolípidos no son requisito para el enlace de glicoproteína a
bacterias como la ALP bacteriana que enlaza bacterias pero carece
de glicofosfolípidos. Todo el ALP se enlazó a bacterias hasta
cierto punto aunque la ALP placentaria exhibió la actividad
enzimática más baja como también el enlace a bacterias más bajo.
Este resultado apoyó nuestra creencia de que ciertos grados de
glicosilación son mejores enlazadores para bacterias.
También se encontró que el ALP intestinal
polilisina-conjugada enlaza las bacterias. No se
encontró que la conjugación de ALP con un péptido no glicado
inhibiera el enlace a bacterias y podría proveer puentes de enlace
para marcadores.
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Ejemplo
5
Células bacterianas (1 a 4.5 x 10^{7}
células/mL) fueron lavadas dos veces con agua después de centrifugar
para separar las células en un gránulo empacado del líquido
sobrenadante. Las células lavadas en forma de gránulo fueron
suspendidas en 20 \mul de amortiguador EPPS (50 mM a pH 8.0) y 30
\muL de agua. Se agregó hemoglobina (20 \mug) como un aditivo
bloqueador. Se agregaron osfatasa alcalina (ALP) (100 mUnidades) de
intestino bovino y 15 \mug de carbohidratos simples o
proteoglicanos o lectinas.
La mezcla de proteína glicada y células
bacterianas fue dejada a 25ºC por 15 minutos. La mezcla fue entonces
centrifugada a 30,000 rpm por 30 minutos después de lo cual las
células bacterianas formaron un gránulo en el fondo del tubo y
fueron lavadas con agua 4-5 veces (50 \muL). La
centrifugación permite la separación de glicoproteína enlazada a
las células bacterianas de proteína(s) glicada no
enlazada.
Después del lavado, los gránulos bacterianos
fueron suspendidos en 50 \muL de amortiguador de tetraborato de
sodio (25 mM a pH 9.5). Una alícuota de 5 uL de las suspensión fue
ensayada para la detección de enlaces ALP agregando 5 \muL de
fosfato para-nitrofenol (PNPP, 100 mM), 50 \muL de
amortiguador borato de sodio (25 mM a pH 9.0) y 140 \muL de agua.
La hidrólisis del sustrato PNPP resultó en un color amarillo. El
color se lee a 405 nm usando un lector de placas de ELISA durante
15-30 minutos y la absorbancia es directamente
proporcional a la cantidad de ALP enlazada a las adhesiones de la
célula bacteriana para grupos glicados.
El enlace de ALP a bacterias fue demostrado por
una absorbancia de 1.8 a 2.0 en la Tabla 2 en la ausencia de
carbohidratos, proteoglicanos, y lectinas. Los monosacáridos
(carbohidratos simples) incluyendo Glucosa, Manosa, Galactosa y
Ácido Siálico no produjeron ningún efecto sobre el enlace a
bacterias de ALP (todas las fuentes). Por lo tanto los
carbohidratos simples no están involucrados en el enlace y no son
apropiados como enlazadores bacterianos para atarse a las marcas de
detección. Esto también respalda la necesidad de glicopéptidos o
glicoproteínas como enlazadores en lugar de simples
glico-unidades.
Los polisacáridos inhibieron débilmente el
enlace a bacterias de ALP a un grado dependiente de la unidad de
carbohidrato repetida. Estos resultados muestran que los
polisacáridos están involucrados en el enlace a bacterias con ALP.
Los polisacáridos con N-acetilgalactosamina fueron
más inhibidores y seguramente contenían unidades residuales de
péptido. Por contraste el lipopolisacárido (LPS) estuvo sin ningún
efecto para las fuentes probadas (B4 y B8 de 2 serotipos diferentes
de E. coli). El lipopolisacárido contiene Lípido Ay
O-antígeno en su estructura externa y no expone su
núcleo polisacárido.
El ácido lipoteicóico es un ejemplo de
polisacáridos con carbohidrato repetido y unidades (Hyl) de amino
ácido. La estructura del polisacárido varía con la fuente de LTA.
Se conocen estructuras con y sin
N-acetilgalactosamina. En nuestros resultados LTA
(S. sanguis) inhibe fuertemente la actividad ALP de enlace a
bacteria, mientras que, dependiendo de la fuente, se observó
variada inhibición o falta de inhibición. Se encontró que el ácido
teicóico en sí mismo con carbohidrato repetido y unidades (Hyl) de
amino ácido es igualmente inhibitorio. Esto apoya nuestra creencia
que el enlace de glicopéptidos a bacterias involucra componentes de
carbohidrato y aminoácidos.
Las lectinas son proteínas encontradas en
semillas de plantas que enlazan polisacáridos y monosacáridos atados
a péptidos. Como se ve en la Tabla 2 las lectinas inhibieron el
enlace de bacterias a ALP dependiendo de la unidad polisacárida que
la lectina enlazó. Estos resultados también respaldan la
involucración de glicopéptidos en el enlace de bacterias y el ALP.
La lectina enlaza el grupo glico de ALP y previene que ésta
reaccione con bacteria. Ya que varias de las lectinas son activas
pero solo enlazan un tipo de grupo glico, varios tipos de grupos
glico péptidos pueden causar el enlace de ALP a bacteria.
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Los datos en el Ejemplo 5 muestran que la
porción glicada pueden ser polisacáridos o un monosacárido atado a
por lo menos un péptido. Ejemplos de polisacáridos o monosacáridos
incluyen aquellos en la Tabla 2.
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Ejemplo
6
Bacterias enlazada a fosfatasa alcalina (ALP)
puede ser separada usando una membrana (Nylon 66 Loprodina de bajo
enlace de proteína) en placas respaldadas de microtítulo (Nunc Nalge
International).
Las placas de
Ioprodina-membrana-respaldadas
fueron tratadas con detergente al 1 o 2% (Tween 20 o TritonX305) en
agua o amortiguadores (TBS: Tris, 25 mM, pH 7.6 conteniendo 150 mM
NaCl o KCO3: 0.1M, pH 9.6) toda la noche a temperatura
ambiente.
Soluciones bloqueadoras fueron filtradas al
vacío. Suspensiones de bacterias (10^{7} células, 100 \mul) en
salina fueron combinados con 50 \mul de amortiguador EPPS (0.05M,
pH 8.1) y 50 \mul de H_{2}O que contienen 20 mU de ALP. La
solución combinada fue incubada por 15 minutos a 37ºC en un agitador
y después agregada a la placa de
Ioprodina-membrana- respaldada.
La solución fue filtrada al vacío dejando
bacterias adherida sobre la membrana y después lavada dos veces con
2% Tween20 en agua. A la membrana lavada, 200 \mul de H_{2}O con
50 \mul de Glicina (0.05M, pH 10.4) y conteniendo 1 mM se agregó
PNPP y el color se formó debido a la bacterias enlazada a ALP leída
a 405 nm.
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La separación de E. coli con ALP enlazada
de ALP sin enlazar es mostrada por una exclusión de tamaño en la
membrana en el Ejemplo 6 y por centrifugación en los Ejemplos
1-5. El tamaño de E. coli es 1 x 1 x 2 \mum
y cualquier membrana, filtro o aparato atrapando partículas de este
tamaño sería aceptable. Éstos incluyen aparatos microfluídicos,
filtros, cromatografía de columna y cromatografía de tiras. La masa
de E. coli es 1.6 x 10^{-12} gm/célula y cualquier
membrana, filtro o aparato atrapando una masa de este tamaño sería
también aceptable.
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Ejemplo
7
Células bacterianas (1 a 4.5 x 10^{7}
células/mL) fueron lavadas dos veces con agua después de
centrifugación para separar células en un gránulo empacado del
sobrenadante líquido. Las células lavadas en forma de gránulo
fueron suspendidas en 20 \muL de amortiguador EPPS (50 mM a pH
8.0) y 30 \muL de agua. Fosfatasa alcalina (ALP) intestinal
bovina (2 \mug o 10,000 Unidades) fue agregada y 0.2 mM de varios
cationes.
La mezcla de proteína glicada y células
bacterianas fue dejada a 25ºC por 15 minutos. La mezcla fue entonces
centrifugada a 30,000 rpm por 30 minutos después de lo cual las
células bacterianas formaron un gránulo en el fondo del tubo y
fueron lavadas con agua 4-5 veces (50 \muL). La
centrifugación permite la separación de glicoproteína enlazada a
las células bacterianas de proteína(s) glicada no
enlazada.
Después de lavar, los gránulos bacterianos
fueron suspendidos en 50 \muL de amortiguador borato (25 mM a pH
9.0). Una alícuota de 5 \muL de la suspensión fue ensayada para la
detección de enlace ALP agregando 5 \muL de fosfato
para-nitrofenol (PNPP, 100 mM), 50 \muL de
amortiguador borato de sodio (25 mM a pH 9.0) y 140 \muL de agua.
La hidrólisis del sustrato PNPP resultó en un color amarillo. El
color fue leído a 405 nm usando un lector de placa ELISA entre
15-30 minutos; la absorbancia es directamente
proporcional a la cantidad de ALP enlazada a la célula
bacteriana.
Como es visto en la Tabla 4, Zn^{2+} (0.2 mM)
resultó en enlace significativamente más alto de ALP a la bacteria.
Se ha realizado un estudio enlace dependiente de concentración en
la presencia de concentración aumentada de zinc con cepa de S.
faecalis como se muestra en la Figura 4. El resultado indicó que
enlazado óptimo ocurre a concentración de 1 mM zinc. Los estudios
han sido continuados con diferentes cepas de bacterias en la
presencia de 1 mM de Zn^{2+} y el enlace de ALP podría ser
monitoreado inclusive a una concentración de 5x10^{6} bacterias
(Fig. 5).
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Ejemplo
8
Células bacterianas (1 a 4.5 x 10^{7}
células/mL) fueron lavadas dos veces con agua después de
centrifugación para separar células en un gránulo empacado del
sobrenadante líquido. Las células lavadas en forma de gránulo
fueron suspendidas en 20 \muL de amortiguador EPPS (50 mM a pH
8.0) y 30 \muL de agua. Fosfatasa alcalina (ALP) intestinal
bovina (2 \mug o 10,000 Unidades) fue agregada y 0.2 mM de cada
catión.
La mezcla de proteína glicada y células
bacterianas fue dejada a 25ºC por 15 minutos. La mezcla fue entonces
centrifugada a 30,000 rpm por 30 minutos después de lo cual las
células bacterianas formaron un gránulo en el fondo del tubo y
fueron lavadas con agua 4-5 veces (50 \muL). La
centrifugación permite la separación de glicoproteína enlazada a
las células bacterianas de proteína(s) glicada no
enlazada.
Después de lavar, los gránulos bacterianos
fueron suspendidos en 50 \muL de amortiguador borato (25 mM a pH
9.0). Una alícuota de 5 \muL de la suspensión fue ensayada para la
detección de enlace ALP agregando 5 \muL de fosfato
para-nitrofenol (PNPP, 100 mM), 50 \muL de
amortiguador borato de sodio (25 mM a pH 9.0) y 140 \muL de agua.
La hidrólisis del sustrato PNPP resultó en un color amarillo. El
color fue leído a 405 nm usando un lector de placa ELISA entre
15-30 minutos; la absorbancia es directamente
proporcional a la cantidad de ALP enlazada a la célula
bacteriana.
Se había observado dependencia de zinc de toda
la proteína enlazada a la pared celular bacteriana como se mencionó
anteriormente. El efecto de varios cationes (2 mM) en el enlace de
ALP de mucosa intestinal bovina (Biozyme) a diferentes bacterias es
mostrado en la Figura 6. Adicionalmente al zinc, Cu^{2+,}
Fe^{2+} y Fe^{3+} también parecen estimular el enlace ALP- en
cepas Gram-positivas y
Gram-negativas de bacterias (Sf- Estaf. faec.; Ec:
E. coli). La Figura 6 también indica inhibición total de
actividad ALP en la presencia de EDTA (10 mM). Se ha seguido usando
para estudios continuados de enlace ALP. El enlace de la fosfatasa
alcalina a bacterias parece ser muy dependiente de la presencia de
cationes como es visto en la Figura 6. Los datos en la Figura 7
muestran el enlace de varias proteínas glicadas en ausencia y
presencia de zinc lo que demuestra claramente la dependencia de
catión de todas las proteínas probadas para enlace a la pared
celular bacteriana Gram-positiva y
Gram-negativa. La cantidad de ALP usada para este
estudio fue tan pequeña que solo puede ser detectada midiendo
actividad enzimática.
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Ejemplo
9
La actividad de la ALP humana placentaria es
comparable a ALP de otras fuentes cuando ensayadas en amortiguador
de glicina como es visto en las Figuras 8-9. Entre
tres cationes efectivos para el enlace de ALP a la bacteria, el
zinc fue el mejor metal cuando las bacterias enlazadas a ALP (ambas
Staph y E. coli) fueron ensayadas en amortiguador glicina,
pH 10.0 (Figs. 10-11). El enlace fue realizado a pH
8.0 en amortiguador EPPS.
En las Figuras 8-11, se usaron
las siguientes abreviaturas:
B1BZ = intestinal bovina del primer vendedor
B1Si = intestinal bovina del segundo
vendedor
HPL = placenta humana
Bact = bacterial
Claims (12)
1. Un método para medir el contenido bacteriano
de fluidos que comprende:
- a.
- enlazar una cantidad efectiva de una glicoproteína con bacterias contenida en una muestra de fluido, dicha glicoproteína teniendo una funcionalidad enzimática generando una señal para indicar su presencia;
- b.
- separar glicoproteína en exceso no enlazada de dicha muestra fluida después de reaccionar dicha glicoproteína con bacterias en dicha muestra en el paso (a);
- c.
- medir la cantidad de dicho marcador que permanece después de separar dicha glicoproteína en exceso no enlazada de (b); y
- d.
- determinar el contenido bacteriano de dicha muestra como relacionada a la cantidad de dicho marcador medido en el paso (c);
donde dicha glicoproteína es por lo menos un
miembro del grupo que consiste de enzimas intracelulares y dichas
enzimas inherentemente proveen una fracción de marcador que sirve
como dicho marcador directamente enlazando dichas bacterias.
2. Un método de la Reivindicación 1 donde dicha
glicoproteína tiene un enlace constante a bacterias de por lo menos
10^{6} y por lo menos 100 sitios de enlace.
3. Un método para la Reivindicación 1 donde
dichas enzimas intracelulares son seleccionadas del grupo que
consiste de glutamato hidrogenasa, ALP, y lactato
deshidrogenasa.
4. Un método para la Reivindicación 1 donde
dicha glicoproteína es una enzima intracelular seleccionada del
grupo que consiste de fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida,
fucosidasa, manosidasa, hexaminidasa,
alfa-galactosidasa, fosfolipasa, hialuronidasa,
glucocerebrosidasa, hidrolasa, arilsulfatasa A, amilasas,
celobiohidrolasa, y peroxidasa.
5. Un método de la Reivindicación 3 donde dicha
enzima es fosfatasa alcalina (ALP).
6. Un método de la Reivindicación 5 donde dicha
ALP es ALP intestinal.
7. Un método de la Reivindicación 5 donde ALP es
medida agregando como reactivo PNPP.
8. Un método de la Reivindicación 7 donde el
color desarrollado por dicho reactivo es leído a una longitud de
onda de 405 nm.
9. Un método de la Reivindicación 1 que
comprende adicionalmente agregar a dicha muestra compuestos de
bloqueo seleccionados del grupo que consiste de polímeros,
proteínas no glicadas, polipéptidos no glicados, y
polisacáridos.
10. Un método de la Reivindicación 1 que
comprende adicionalmente agregar por lo menos un catión capaz de
aumentar el enlace de dicha glicoproteína a bacteria.
11. Un método de la Reivindicación 10 donde
dicho catión es por lo menos un miembro del grupo que consiste de
zinc, cobre y hierro.
12. Un método de la Reivindicación 11 donde
dicho catión es zinc.
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