WO2007105565A1 - インフルエンザ感染阻害ペプチド、インフルエンザウイルス感染阻害剤、リポソーム、インフルエンザ予防・治療剤 - Google Patents

インフルエンザ感染阻害ペプチド、インフルエンザウイルス感染阻害剤、リポソーム、インフルエンザ予防・治療剤 Download PDF

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alanine
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Toshinori Sato
Teruhiko Matsubara
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Keio University
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    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • Influenza infection inhibitory peptide Influenza virus infection inhibitor, ribosome, influenza preventive / therapeutic agent
  • the present invention comprises an influenza infection inhibitory peptide that inhibits influenza virus infection, an influenza virus infection inhibitor that inhibits influenza virus infection, a ribosome containing an influenza infection inhibitory peptide, and an influenza virus infection inhibitory peptide It relates to preventive and therapeutic agents for influenza.
  • Influenza virus membranes have two types of spike glycoproteins, hemagglutin (HA) and neuraminidase (NA, sialidase), each of which plays an important role in the establishment of virus infection and the emergence of virus host cells. Plays.
  • the former hemaglucun recognizes sialic acid-containing sugar chains that are universally present on the cell membrane of hosts such as humans and other animals (mammals, birds, reptiles, fish, amphibians, etc.) as receptors. It binds specifically and leads to endocytosis of influenza virus into cells.
  • the latter neuraminidase is a receptor-disrupting enzyme and plays a role of cleaving sialic acid residues on its own or on the host cell membrane when virus particles budding or releasing from the host cell.
  • the hemaggluton involved in the first step of influenza virus infection has various subtypes based on the diversity of the amino acid sequence of the antigen-determining region (A to E), which is extremely mutated. .
  • Development of influenza vaccines based on antigenicity is very difficult because the homology of amino acid sequence between hemadalchunic subtypes is 25-75%.
  • the so-called receptor binding pocket region that binds to the host cell receptor is well conserved in its three-dimensional structure with relatively few mutations (Y. Suzuki, Prog ⁇ ipid.
  • the present invention provides a peptide having a higher affinity for hemadalchun or a peptide having a high inhibitory activity against influenza virus infection by screening a larger number of peptides.
  • the purpose of the present invention was to provide a pharmaceutical composition using a peptide having high sex and high peptide or influenza virus infection inhibitory activity.
  • the peptide according to the present invention has an amino acid sequence.
  • the X is preferably proline.
  • the peptide according to the present invention is the amino acid sequence in a part of SEQ ID NO: 3.
  • a peptide having 4 to 14 residues including: X-force alanine, glycine, isoleucine, Norin, or leucine, X-force arginine or lysine, X-force
  • the X is preferably proline.
  • the peptide according to the present invention has an amino acid sequence.
  • X force arginine or lysine.
  • X is proline.
  • the peptide according to the present invention includes an amino acid sequence XXXXX in a part of SEQ ID NO: 3.
  • a peptide having 5 to 14 residues which is X force alanine, glycine, isoleucine, Norin, or leucine, X force arginine or lysine, and X force alarm
  • X force arginine or lysine.
  • X is proline.
  • the peptide according to the present invention has an amino acid sequence.
  • a peptide having 5 to 14 residues which is X force alanine, glycine, isoleucine, Norin, or leucine, X force arginine or lysine, and X force alarm
  • X, X and X are preferably proline.
  • the peptide according to the present invention has any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 38, 42 to 44, 52!
  • the peptide according to the present invention has an amino acid sequence having substitution, deletion, and addition of 1 to several amino acid residues in SEQ ID NOs: 38, 42 to 44, 52, and has influenza virus infection inhibitory activity. Have.
  • the peptide is alkylated! /.
  • the peptide according to the present invention has an amino acid sequence.
  • the X is preferably proline.
  • the peptide according to the present invention has an amino acid sequence.
  • the peptide according to the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 56 and 57, or any of them.
  • the peptide according to the present invention has an amino acid sequence having a substitution “deletion” addition of 1 to several amino acid residues in SEQ ID NOs: 56 and 57, and has influenza virus infection inhibitory activity.
  • the peptide is alkylated! /.
  • the influenza virus infection inhibitor useful in the present invention contains any of the above peptides as an active ingredient.
  • the influenza virus infection inhibitor inhibits infection of both influenza virus having hemagglutin HI and influenza virus having hemagglutin H3.
  • influenza preventive / therapeutic agent contains any of the above peptides as an active ingredient.
  • the influenza preventive / therapeutic agent has an effect on both influenza virus having hemadaltine HI and influenza virus having hemagglutin H3.
  • the DNA according to the present invention encodes any of the above peptides.
  • An expression vector according to the present invention has the DNA. [0027] Furthermore, the cell according to the present invention is introduced with the expression vector and secretes any of the peptides.
  • the ribosome of the present invention contains any of the above peptides. It is preferable that the peptide is alkylated in the liposome! /.
  • the influenza virus infection inhibitor useful in the present invention is an influenza virus infection inhibitor containing any of the above peptides, wherein the peptide is modified to have amphipathic properties, and peptide aggregates It is characterized by forming.
  • the modification is preferably alkylation.
  • the peptide aggregate useful in the present invention is the peptide aggregate.
  • the peptide according to the present invention has an amino acid sequence.
  • X is alanine, glycine, isoleucine, noline, or leucine, and X is proline
  • X is arginine or lysine, and X is serine or lysine.
  • Leonine X-cationine or cystine
  • X is alanine, glycine, iso-oral
  • the X is preferably proline.
  • the peptide according to the present invention has an amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 49 has an amino acid sequence having a substitution 'deletion' addition of 1 to several amino acid residues and has influenza virus infection inhibitory activity. Note that X is
  • the peptide is alkylated! /.
  • the influenza virus infection inhibitor useful in the present invention contains any of the above peptides as an active ingredient.
  • the influenza virus infection inhibitor inhibits infection of influenza virus having hemagtinin H 1.
  • FIG. 1 is a graph comparing the binding activity of A-1 and H3G-1 to hemagglutinin using ELISA in the examples of the present invention.
  • FIG. 2 In the examples of the present invention, the binding activity to the hemagglutinin of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to 18 was compared with the binding activity of A-1 (SEQ ID NO: 1) using ELISA. It is a graph.
  • FIG. 3 (A) is a diagram showing the relationship between time (X axis) and resonance (y axis) at each concentration for s-2 peptide in the examples of the present invention, and (B).
  • X axis time
  • y axis resonance
  • X-axis concentration for s-2 peptide in the examples of the present invention
  • B concentration for s-2 peptide in the examples of the present invention
  • FIG. 4 (A) is a graph showing the change of resonance (y-axis) with respect to time (X-axis) at a peptide concentration of 100 M for each hemadaltun-binding peptide in the examples of the present invention. And (B) shows the relative resonance of the resonance of the hemadalchun-binding peptide when the binding amount of the A-1 peptide is 1 at a peptide concentration of 200 M of each hemadalun-binding peptide in the examples of the present invention. It is the figure which showed the value.
  • Table 1 shows the amino acid sequences of the hemadalchun-binding peptides used in this specification.
  • polypeptide A-1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has the highest binding activity among the hemadalchun-binding peptides identified so far (International Publication WOOO / 59932, JP 2002). —Refer to the description in the specification and examples), and the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 7, 9-10, and 12 18 has higher binding activity to hemadalchunes than A 1 as shown in the examples. Also, as shown in the examples These polypeptides having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2-7, 9-: LO, 12-18 bind to both hemagglutinins HI and H3.
  • the hemagglutinin-binding peptide that is useful in the present invention comprises substitution, deletion, and addition of 1 to several amino acid residues in SEQ ID NOs: 2 to 7, 9 to: L0 and 12-18. It may be a peptide having an amino acid sequence having a higher binding activity to hemadalchunic than A-1.
  • the binding activity of a hemadalchun-binding peptide to hemadalcun is, for example, the force that can be measured by ELISA, but is not limited to this, between RIA, EIA, Western blotting, etc. Any method that can quantitatively measure the interaction can be used.
  • Table 2 shows the amino acid sequences of the influenza virus infection-inhibiting peptides used in this specification.
  • influenza virus infection-inhibiting peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 42 to 44, 52, 56, and 57 strongly inhibit infection of influenza virus into host cells. be able to.
  • influenza virus infection-inhibiting peptide useful in the present invention is represented by SEQ ID NOs: 38, 42 to 44, 52, 56, and 57! 'Peptide peptide having amino acid sequence with attached calo and having influenza virus infection inhibitory activity It may be a peptide.
  • the inhibition of influenza virus host cell infection by the influenza virus infection-inhibiting peptide can be measured, for example, by the plaque assay method.
  • A is an amino acid having an aliphatic side chain (eg, G, V, L, or I)
  • R is a base.
  • L is replaced with an amino acid having an aliphatic side chain (e.g., G, V, A, or I) to an amino acid having a sexual side chain (e.g., K), No. 52)
  • proline can be replaced with alanine or glycine to have similar activity (Tatsuhiko Matsubara, dissertation, Tokyo Institute of Technology (2000)). Therefore, even if P is substituted with A or G, the substituted peptide is considered to have the same activity as the peptide having the ARLP (SEQ ID NO: 52) sequence. That is, such an array has the general formula:
  • X is alanine, glycine, isoleucine, Norin, or mouth isine
  • X is arginine or lysine
  • X is alanine, glycine, isoleucine
  • X is proline, alanine, or glycine.
  • X is preferably proline.
  • the peptide of the present invention is a peptide having 4 to 14 residues having this amino acid sequence (SEQ ID NO: 58).
  • a peptide having the ARLPR (SEQ ID NO: 44) sequence! / For example, A to an amino acid having an aliphatic side chain (for example, G, V, L, or I), R The peptide after substitution is substituted even if L is substituted with an amino acid having a basic side chain (for example, K) and L is substituted with an amino acid having an aliphatic side chain (for example, G, V, A, or I). Is considered to have the same activity as a peptide having the ARLPR (SEQ ID NO: 44) sequence. Even if P is replaced with A or G, The peptide is considered to have activity similar to a peptide having the ARLPR (SEQ ID NO: 44) sequence. That is, such an array has the general formula:
  • X is alanine, glycine, isoleucine, Norin, or mouth isine
  • X is arginine or lysine
  • X is alanine, glycine, isoleucine
  • X is proline, alanine, or glycine.
  • 4 5 is arginine or lysine.
  • X is preferably proline.
  • the peptide of the present invention is a peptide having this amino acid sequence (SEQ ID NO: 48) having 5 to 14 residues.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 has the general formula:
  • X is alanine, glycine, isoleucine, Norin, or mouth isine
  • X is arginine or lysine
  • X is alanine, glycine, isoleucine
  • X is proline, alanine, or glycine.
  • 45 is arginine or lysine, X is serine or threonine, X is cystine
  • X is alanine, glycine, isoleucine, Norin, or mouth
  • X is proline, alanine, or glycine, and X is arginine or lysine.
  • X is proline, alanine, or glycine, and X is alanine, glycine,
  • X is glutamine or asparagin
  • X is proline, alanine, or glycine.
  • X, X, X, and X are proline, alanine, or glycine.
  • the peptide of the present invention may be a peptide having 4 to 14 residues, including the amino acid sequence (SEQ ID NO: 58) in a part of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 50).
  • a part of SEQ ID NO: 3 is preferably a peptide comprising 4 amino acid residues and 14 residues or less including this amino acid sequence (SEQ ID NO: 58).
  • the peptide of the present invention may be a peptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 48) and having 5 to 14 residues.
  • the peptide of the present invention includes this amino acid sequence (SEQ ID NO: 48).
  • a peptide with at least 14 residues Preferably there is.
  • the peptide of the present invention may be a peptide having a sequence obtained by inverting the ARLPR (SEQ ID NO: 44) sequence or the ARLP (SEQ ID NO: 52) sequence.
  • a to an amino acid having an aliphatic side chain e.g., G, V, L or I
  • R to an amino acid having a basic side chain
  • L to an aliphatic side chain
  • the substituted peptide has the same activity as the peptide having the RPLRA (SEQ ID NO: 56) or PLRA (SEQ ID NO: 57) sequence. It is considered to have.
  • the substituted peptide is considered to have the same activity as the peptide having the RPLRA (SEQ ID NO: 56) sequence or the PLRA (SEQ ID NO: 57) sequence. That is, such an array has the general formula:
  • X is alanine, glycine, isoleucine, norline, or leucine, and X is anoleginine or lysine.
  • X is alanine, glycine, isoleucine, noline, or leucine, and X is
  • X is preferably proline.
  • hemagglutinin of the influenza virus When the influenza virus infects cells, hemagglutinin of the influenza virus specifically binds to a host cell receptor, and the virus infects the cell using the receptor as a scaffold.
  • the hemadaltun binding peptide of the present invention specifically binds to its hemadaltinin. This binding can prevent hemagglutinin from binding to host cell receptors, and thus can prevent influenza virus from infecting host cells.
  • the hemagglutin-binding peptide of the present invention can inhibit infection of host cells with influenza virus.
  • the influenza virus infection-inhibiting peptide of the invention was able to inhibit the influenza virus from infecting the host. Therefore, the hemadalchun-binding peptide and influenza virus infection-inhibiting peptide of the present invention can suppress the growth of influenza virus in the body by being administered to humans suffering from influenza or non-human vertebrates. it can.
  • pre-administration to a human or non-human vertebrate prior to influenza can prevent infection even if influenza virus enters the body.
  • the hemadalchun-binding peptide of the present invention is used as a tool for elucidating the infection of influenza virus that occurs through hemagglutinin and the various cell functions and life phenomena associated therewith. You can also.
  • influenza virus targeted by the present invention is not particularly limited in its type or origin as long as it has at least one of hemagglutinin HI or hemagglutinin H3. It may be a shift, such as C type, human separation type, other mammal separation type such as pig bear, or bird classification type!
  • influenza for inhibiting influenza virus from infecting host cells Viral infection inhibitors, influenza therapeutic agents for treating patients suffering from influenza, influenza preventive agents for prophylactic administration before suffering from influenza, etc. are conceivable.
  • These pharmaceutical compositions were infected with influenza virus as a preparation containing, as an active ingredient, a hemadalun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide and, if necessary, a pharmaceutically acceptable carrier. It can be administered to humans or non-human vertebrates, or can be administered prophylactically to humans or non-human vertebrates prior to infection.
  • the pharmaceutically acceptable carrier used here can be appropriately selected from commonly used carriers according to the form of the pharmaceutical composition to be prepared.
  • the carrier can be purified water (sterile water) or a physiological buffer, an injectable organic ester such as glycol, glycerol, olive oil. Etc. can be used.
  • the pharmaceutical composition can contain conventionally used stabilizers, excipients and the like.
  • compositions are not particularly limited, and may be appropriately determined according to the patient's age, sex, other conditions, severity of disease, etc.
  • injections, drops, sprays (aerosols), nasal drops and inhalants are preferred.
  • the administration route includes oral administration and parenteral administration, specifically, oral administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intratracheal administration, Examples include, but are not limited to, inhalation administration and sublingual administration.
  • human influenza virus is known to invade from the oral cavity and nasal cavity and proliferate mainly in mucosal epithelial cells of the upper respiratory tract. Therefore, this drug is infected with human influenza virus as a pharmaceutical composition. It is preferably used for administration routes such as oral, intratracheal, nasal, oropharynx, and inhalation to humans or non-human vertebrates. Specifically, if this drug is formulated as a spray, (atomized) aerosol or inhalant, it can be administered via the oral, intratracheal, nasal, oropharyngeal, inhalation, and other routes of administration. Influenza virus epithelial cell infection can be directly inhibited.
  • the daily dose of these pharmaceutical compositions may be appropriately changed depending on the symptoms, age, body weight, sex, treatment period, treatment effect, administration method, etc. Is not particularly limited as long as it can be inhibited and the side effects caused are within an acceptable range.
  • the preparation is not limited to once a day, but may be divided into several times.
  • compositions may be used alone or in combination with other drugs (for example, other antiviral drugs, anti-inflammatory drugs, drugs that relieve symptoms, etc.). It's good.
  • influenza vaccine cannot be used for this drug, for example, the effect of the vaccine such as a high-risk patient who may be affected before the effect of the influenza vaccine appears, or an immunodeficient patient, etc. is sufficiently exhibited. However, it can also be used for patients and patients who are contraindicated for vaccination.
  • the hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide of the present invention can be produced by chemical synthesis according to a conventional method.
  • the peptide can be synthesized by the usual liquid phase method and solid phase method. More specifically, based on the amino acid sequence information, a stepwise erosion method in which each amino acid is sequentially linked to extend the chain one by one, and a fragment having several amino acids is synthesized in advance. Fragment 'condensation method, etc. for coupling fragments can be used.
  • Condensation methods employed in the peptide synthesis can also follow various known methods. Specific examples include, for example, the azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, redox method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + additive (1 hydroxybenzotriazole) N hydroxysuccinamide, N hydroxy 5-norbornene 2,3 dicarboximide, etc.), Woodward method and the like. Solvents that can be used in each of these methods can be appropriately selected from general solvents that are well known to be used in this type of peptide condensation reaction.
  • Examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), hexaphosphoroamide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate and the like, and mixed solvents thereof.
  • DMF dimethylformamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • THF tetrahydrofuran
  • ethyl acetate examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), hexaphosphoroamide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate and the like, and mixed solvents thereof.
  • amino acids that are not involved in the reaction and carboxyl groups in the peptide are generally esterified, for example, lower alkyl esters such as methyl ester, ethyl ester, tertiary butyl ester, for example, It can be protected as benzyl ester, p-methoxybenzyl ester, p-nitrobenzyl ester aralkyl ester, and the like.
  • An amino acid having a functional group in the side chain for example, a hydroxyl group of Tyr may be protected with a acetyl group, a benzyl group, a benzyloxycarbonyl group, a tertiary peptide group, etc. There is no need to provide protection.
  • Ar g guazino group includes nitro group, tosyl group, 2-methoxybenzenesulfol group, methylene 2-sulfol group, benzyloxycarboro group, isobornoxycarboro group. It can be protected by a suitable protecting group such as a group, an adamantyl carboxy group.
  • the deprotection reaction of these protecting groups in the amino acids having the above-mentioned protecting groups, peptides and finally obtained peptides of the present invention is also carried out by conventional methods such as catalytic reduction, liquid ammonia Z sodium, hydrogen fluoride, It can be carried out according to a method using hydrogen bromide, hydrogen chloride, trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid, methanesulfonic acid or the like.
  • Peptides thus prepared can be produced, for example, by ion exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography.
  • the purification can be appropriately performed according to conventional methods widely used in the field of peptide chemistry such as (HPLC) and countercurrent distribution.
  • DNA encoding the above hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide is prepared and incorporated into an expression vector and introduced into eukaryotic cells such as cultured cells or prokaryotic cells such as Escherichia coli.
  • the expressed peptide may be purified.
  • the expression vector is appropriately selected according to the host cell to be introduced. Construction of vectors including the integration of peptide-encoding DNA, introduction into host cells, expression in host cells, and preparation of host cell extracts should be performed according to conventional methods using molecular biological techniques. Can do.
  • the target peptide can be purified from the extract by a conventional method widely used in the field of peptide chemistry described above.
  • a DNA encoding a peptide in which the above-described hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection inhibitory peptide is tagged with a tag for example, His tag, Flag tag, GST tag, etc.
  • a tag for example, His tag, Flag tag, GST tag, etc.
  • the expression vector can be designed so that only the peptide can be purified by cleaving only the tag.
  • the hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide may be purified by a conventional method widely used in the above-mentioned peptide chemistry field.
  • the hemadalchun-binding peptide and influenza virus infection-inhibiting peptide of the present invention can be appropriately chemically modified.
  • alkylation and lipidation phosphorus
  • lipidation phosphorus
  • the alkylation of the hemagglutinin-binding peptide and the influenza virus infection-inhibiting peptide can be performed according to a conventional method. For example, similar to the above peptide synthesis, it can be easily carried out by an amide bond forming reaction between a fatty acid and the N-terminal amino group of a hemadaltun-binding peptide.
  • a fatty acid any fatty acid, whether linear or branched, or saturated or unsaturated, can be widely used, but it is particularly preferable to use fatty acids that exist in the living body.
  • Saturated fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, araquinic acid; unsaturated fatty acids such as oleic acid, elaidic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, etc. Examples include about 20 fatty acids.
  • Alkylin can also be carried out by an amide bond-forming reaction between alkylamine and the C-terminal carboxyl group of a hemadaltine-binding peptide in the same manner as in the peptide synthesis.
  • alkylamine various alkylamines can be used in the same manner as the above fatty acids, but it is particularly preferable to use a fatty chain (having about 12 to 20 carbon atoms) existing in the living body.
  • Lipidation of hemagglutinin-binding peptides and influenza virus infection-inhibiting peptides can also be performed according to conventional methods (for example, New Current, 11 (3), 15-20 (2000); Biochemica et Biophysica Acta., 1128, 44-49 (1992); FEBSLetters, 413, 177-180 (1997); J. Biol. Chem., 257, 286-288 (1982) etc.).
  • the 2-hydroxyl group or 3-phosphate group of various phospholipids can be bound to hemadalchun-binding peptides or influenza virus infection-inhibiting peptides by a condensation method via any spacer. .
  • an amino acid sequence containing a cysteine of any length (usually several) is added to the N-terminus or C-terminus of a hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide and used for condensation.
  • Reactive SH groups can also be introduced by force.
  • the phospholipid used here is not particularly limited, for example, phosphatidic acid, phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylethanol consisting of the above fatty acids. Amamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol and the like can be used.
  • the alkylated or lipidated hemagglutinin-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide (lipopeptide) of the present invention can be used as a lipid component during ribosome preparation.
  • the hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide is presented on the ribosome, so that the hemadaltun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide can be effectively used as a ribosome preparation described later.
  • the hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide of the present invention can be prepared as a ribosome preparation.
  • the hemadalchun-binding peptide or the influenza virus infection-inhibiting peptide of the present invention is added to the ribosome having acidic phospholipid as a membrane constituent or neutral phospholipid and acidic phospholipid as membrane constituents. Is held.
  • acidic phospholipids as membrane constituents include dilauroyl phosphatidyl glycerol (DLPG), dimyristoyl phosphatidyl glycerol (DMPG), dipalmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG), distearoyl phosphatidyl glycerol (DSPG), Oleoylphosphatidylglycerol (DOPG), egg yolk phosphatidylglycerol (egg yolk PG), natural or synthetic phosphatidylglycerols (PG) such as hydrogenated egg yolk phosphatidylglycerol and dilauroylphosphatidylinositol (DLPI); dimyristoyl phosphatidylinositol ( DMPI), dipalmitoyl phosphatidylinositol (DPPI), distearoyl phosphatidylinositol (DSPI), diole
  • Neutral phospholipids include, for example, soybean phosphatidylcholine, egg yolk phosphatid Lucolin, hydrogenated soybean phosphatidylcholine, hydrogenated egg yolk phosphatidylcholine, dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dilauroylphosphatidylcholine (DLPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), myristoylpalmitoylphosphatidylcholine (MP) Natural or synthetic phosphatidylcholines (PC) such as irphosphatidylcholine (PSPC) and dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), soybean phosphatidylethanolamine, egg yolk phosphatidylethanolamine, hydrogenated soybean phosphatidylethanolamine , Hydrogenated egg yolk phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine
  • the ribosome membrane is formed according to a conventional method using the acidic phospholipid alone as a constituent component or using the neutral phospholipid and the acidic phospholipid in combination.
  • the combination ratio of acidic phosphorus lipid is from about 0. 1 to ribosomes membrane components in: L00 mol% approximately, preferably from about 1 to 90 mole 0/0, more preferably from about 10 to 50 mole 0/0 It is good to be about.
  • cholesterol or the like can be added.
  • cholesterol By adding cholesterol, the fluidity of phospholipids can be adjusted, and the preparation of ribosomes can be made easier.
  • This cholesterol is preferably added in an amount that can be added to phospholipids up to an equal amount, particularly 0.5 to 1 times.
  • the ratio of the number of molecules of the lipid-containing madalchun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide and acidic phospholipid is 0.5 for acidic phospholipid with respect to peptide 1: About L00, preferably about 1 to 60, more preferably about 1.5 to 20 is preferable.
  • multilayer ribosomes are prepared as follows. The First, the lipid is dissolved in an organic solvent (such as black mouth form and ether), then placed in a round bottom flask, the organic solvent is removed under a nitrogen stream or under reduced pressure, and a lipid thin film is formed at the bottom of the flask. In this case, the organic solvent can be completely removed by leaving it in a desiccator under reduced pressure. Then, an emulsion of ribosome suspension is obtained by adding an aqueous solution of the madalchun-binding peptide to the lipid layer and hydrating the lipid.
  • an organic solvent such as black mouth form and ether
  • a large single membrane ribosome (LUV) is added to Ca 2+ to a small single membrane liposome of phosphatidylserine, fused to form a cylindrical sheet, and then added with EDTA, which is a chelating agent.
  • LUV large single membrane ribosome
  • a peptide-incorporated ribosome can be produced by adding an aqueous peptide solution to the produced ribosome suspension.
  • ribosomes having a small particle size can also be prepared by the French press method (FEBS lett. 99, 210-214, 1979).
  • FEBS lett. 99, 210-214, 1979 French press method
  • lyophilization method Chem. Pharm. Bull. 32, 2442-2445, 1984
  • freeze-thawing method Chem. Pharm. Bull. 33, 2916-2923
  • the ratio of the madalchun-binding peptide or influenza virus infection inhibitory peptide contained in the ribosome prepared in this way is about several mol% to several tens mol% in the total lipid. Although preferably about 20 mol%, even typically about 5 molar 0/0.
  • the ribosome thus prepared can be obtained by dialysis (J. Pharm. Sci. 71, 806-812, 1982) or filtration using a polycarbonate membrane (Biochim. Biophys. Acta 557, 9-23, 1979). Bioc him. Biophys. Acta 601, 559-571, 1980), the particle diameter can be made constant.
  • the particle diameter can be made constant.
  • Dialysis, gel filtration, centrifugation can be used (ribosome. [The Biochemical Society of Japan, Biochemistry Experiment Course 3], Tokyo Kagaku Dojin, 1974) o It is also possible to concentrate ribosomes using a dialysis membrane.
  • additives such as preservatives, isotonic agents, buffers, stabilizers, solubilizers, absorption enhancers, etc.
  • additives necessary for formulation design can be appropriately blended, and can be diluted with a liquid containing these additives or water as necessary.
  • specific examples of the above-mentioned additives include antibacterial salts such as salt benzol-comb, benzethome chloride, black hexidine, parabens (such as methylparaben and ethylparaben), and thimerosal.
  • Antiseptics that are effective against bacteria, such as D-mannitol, D-sorbitol, D-xylitol, glycerin, glucose, maltose, sucrose, propylene glycol and other polyhydric alcohols and salt It is possible to use electrolytes such as sodium and tocopherol, butylhydroxyl-sol, butylhydroxytoluene, ethylenediammine tetraacetate (EDTA), cysteine, etc. as stabilizers.
  • electrolytes such as sodium and tocopherol, butylhydroxyl-sol, butylhydroxytoluene, ethylenediammine tetraacetate (EDTA), cysteine, etc.
  • another drug such as an antiviral agent can be further encapsulated in the ribosome comprising the hemadalchun-binding peptide of the present invention to prepare a ribosome preparation.
  • ribosome preparation is specifically performed by, for example, Woodle et al. (Long Circulating Liposomes: old drugs, New therapeutics., MC Woodle, G. Storm, Eds: springer—Verlag Berlin (1998)) or Nanno et al. Liposomal applications to cancer therapy, Y. Namba, N. Oku, J. Bioact. Compat. Polymers, 8, 158-177 (1993)).
  • the amount of the hemagglutinin-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide in the ribosome preparation is not particularly limited, and is generally selected from a wide range of force-usually compositions. wZv%), preferably about 0.001 to 0.1 (wZv%).
  • Hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection inhibitory peptide may be used as an influenza virus infection inhibitor as is, but peptide aggregates By forming it, it is possible to more efficiently inhibit infection of influenza virus into host cells.
  • the peptide aggregates in this specification are micelles (with hydrophobic groups facing inward and hydrophilic groups arranged outside to show the shape of a sphere) and self-peptide aggregates (number of diameters that naturally aggregate in solution). (100 nm to several ⁇ m peptide aggregates)
  • peptide aggregates are formed by modifying the hemadalchun-binding peptide or the influenza virus infection-inhibiting peptide to produce an amphiphilic compound having both hydrophilic and hydrophobic properties. It can be made easier.
  • an amphiphilic compound can be prepared by alkylating a hemadalchun-binding peptide or an influenza virus infection inhibitory peptide. Alkylation can be performed as described above.
  • the hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide, or the amphipathically modified hemadaltun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide aggregates when reaching a critical concentration in the liquid.
  • Form peptide aggregates That is, peptide aggregates can be formed by suspending a hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection-inhibiting peptide at a predetermined concentration or higher in a solution. The formation of peptide aggregates of these hemadaltun-binding peptides or influenza virus infection-inhibiting peptides sterically hinders the binding of hemadaltine to influenza virus receptors present in host cells. Therefore, it is considered effective.
  • the diameter of the peptide aggregate can be measured using, for example, a light intensity distribution (intensity PSD).
  • an expression vector capable of expressing these peptides in cells may be administered.
  • the vector may be a plasmid or a viral vector, but it must have a promoter capable of expressing the inserted gene in the cells used.
  • DNA may be administered as it is, a virus containing this DNA may be infected, or a cell containing this DNA may be transplanted.
  • Viruses are not particularly limited, such as adenoviruses and retroviruses. However, the virus infects cells in the body, causing hemadalchunic binding peptides or influenza viruses.
  • the vector is constructed so that hemadalchun-binding peptide or influenza virus infection inhibitory peptide can be expressed and secreted.
  • a vector may be constructed to express a fusion peptide in which a signal peptide is fused to the N-terminal side of a hemadalchun-binding peptide or an influenza virus infection inhibitory peptide.
  • the method to make it secrete is not necessarily limited to this!
  • the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 18 were prepared using the phage display system used in the report by Nishi, Saya et al. (Nishi T "Saya H” et al, FEBS Lett, 399, 237-240 (1996)). Filamentous phage fd displaying a peptide having a phenotype on the outer shell surface was prepared. That is, when DNAs encoding these amino acid sequences (see Table 1 above) were inserted into the region corresponding to the heel end of the outer shell protein pill gene using genetic recombination techniques, they were encoded by the inserted DNA.
  • Phage DNA can be constructed so that a peptide consisting of a 15-residue amino acid sequence is expressed on the outer surface of the phage shell. These phages were amplified by a conventional method using a K91Kan host bacterium to prepare a phage solution.
  • each imwell was washed 6 times with 50 mM TBS buffer ( ⁇ 7.6) to fix muggulchunes on the activation plate, and either H1N1 solution (70 lZml) or H3N2 solution (70 1 / ml) was added at 100 / zl. After standing for 2 hours, it was washed 6 times with 50 mM TBS buffer (pH 7.6), and ImM ethanolamine aqueous solution was added to 1001. After leaving for 10 minutes, it was again washed 6 times with 50 mM TBS buffer (pH 7.6).
  • each phage clone solution (containing lxl0 1G pfu) was added to a plate on which hemagglutin was fixed, and left at room temperature for 2 hours. After washing each well 5 times with TBST (TBSZ5% Tween20), add 100% anti-fd phage antibody (Sigma; used at 1000-fold dilution) diluted with 1% BSA-containing TBST and leave at room temperature for 1 hour did.
  • the absorbance at 492 nm was measured with a microplate reader to determine the binding activity.
  • FIG. 1 shows a comparison with the binding activity of H3G-1 measured in the same manner.
  • the binding activity of the peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 18 is expressed as A — All data were normalized and graphed with the binding activity of H1N1 and H3N2 of 1 as 1 (Fig. 2).
  • the polypeptides having SEQ ID NOs: 2 to 7, 9 to: L0, 12 to 18 have higher binding activity to hemadalchunes than the hemadalchunic binding peptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is considered that the peptide is useful as a pharmaceutical composition which is one object of the present invention.
  • the peptide having this consensus sequence is considered to have a higher binding activity to hemadaltun than the hemadalun binding peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Example 2 a peptide having the sequences of s-2 (SEQ ID NO: 3) and e-1 (SEQ ID NO: 5), which had particularly high binding to hemadalchun (HA), was synthesized. (Requested by Toray Industries, Inc.) We evaluated the binding to hemagglutinin with only the peptide.
  • Table 3 shows the peptides used in this Example and their amino acid sequences.
  • FIG. 3A shows the relationship between time (X axis) and resonance (y axis) at each concentration for the s-2 peptide.
  • the same experiment was performed with each hemadalchun-binding peptide, and the change in resonance (y-axis) with respect to concentration (X-axis) at a given time is shown in FIG. 3B.
  • any hemagglutinin-binding peptide increases the amount of hemagglutinin binding depending on its concentration.
  • FIG. 4A shows the change of resonance (y-axis) with respect to time (X-axis) over time at each peptide concentration of 100 / z M of hemadalun binding peptide.
  • FIG. 4B shows the relative value of the resonance of the hemagglutinin-binding peptide when the binding amount of the A-1 peptide is 1 at a peptide concentration of 200 M.
  • each peptide was strongly bound to hemagglutin in the order of the strength of s-2>e-1>A-1> pVIII (SEQ ID NO: 51).
  • This order of binding strength also corresponds to the order of binding measured with the phage expressing each hemagglutinin binding peptide.
  • the amount of binding is 228 RU, for example, the amount of binding at 200 M of s-2 is only about half, and the dissociation constant of these peptides is about 10 3 to 10 _4 M. It is thought that.
  • the inhibition constant of the peptide reported by Inoue is almost the same, and the result of this example is the same order or single digit as the inhibition constant of A-1 or the binding constant obtained with sialyllatatose.
  • the small size suggests that these hemadalchun-binding peptides can be excellent analogs of sugar chains, which are ligands of hemadalchun.
  • Example 1 revealed that polypeptides having SEQ ID NOs: 2-7, 9-10, 12-18 have high binding activity against hemagglutin. The following experiment was conducted to identify peptides with fewer residues that could prevent infection with viruses.
  • alkylated peptides were used in this experiment.
  • each peptide shown in Table 4 below was synthesized with an automatic peptide synthesizer PSSM-8 (Shimadzu Corporation) using the F moc method. did .
  • a peptide synthesis reaction was performed using Fmoc-SAL-Resin (code A00102, Watanabe Chemical) as a solid phase resin.
  • C18-COOH stearic acid, sigma
  • dichloromethane was reacted with the solid phase resin after the peptide synthesis to alkylate the N-terminal side of these peptides.
  • the C18 peptide was excised from the solid phase synthetic resin to obtain C18 peptide amide (C-terminal is —CONH).
  • the product was purified by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the molecular weight of the purified peptide was measured by matrix assisted laser desorption / ionization time flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).
  • MALDI-TOF MS matrix assisted laser desorption / ionization time flight mass spectrometry
  • MDCK Mardin-Darby canine kidney cells using MEM (minimum essential medium eagle) (GIBCO BRL) supplemented with 1 glutamine, 100 unit Zml penicillin G and 100 unit Zml streptomycin. C, 5% CO in MEM (minimum essential medium eagle) (GIBCO BRL) supplemented with 1 glutamine, 100 unit Zml penicillin G and 100 unit Zml streptomycin. C, 5% CO in
  • the MDCK cells and influenza AZ Puerto Rico Z8Z34 virus strain (H1N1) and influenza AZ Aichi Z2Z68 virus strain (H3N2) used in the following experiments were obtained from K. Nagata (University of Tsukuba (Japan)). MDCK cells are highly sensitive to influenza virus types A, B, and C. In addition, mutants of hemadalchun appear during cell growth. Little! Therefore, it has been widely used in influenza virus infection experiments.
  • an H1N1 influenza virus solution (a solution in which influenza A virus ZPRZ8Z34 was diluted to a concentration that forms around 100 plaques) and an H3N2 influenza virus solution (around 100 plaques of influenza A virus ZAichiZ2Z68) A solution diluted to a concentration capable of forming a liquid) and various peptide solutions (peptide concentration of 0.2 to 200 M) were mixed in an amount of 100 ⁇ L each to prepare a total sample of 200 ⁇ L.
  • M + BA is 9.4 g MEM in 474 mL MiliQ water, autoclaved and filter sterilized 1 OmL L-glutamine solution (X 100, 30 mgZmL) and 10 mL 1M Hepes (2.4 g Zl0mL), 6 mL 35 % bovine albumin (A-7409, Sigma) was prepared. ) Were mixed and injected in 2 mL Zwell portions. Let stand at room temperature for 30 minutes.
  • H1N1 influenza virus or H3N2 influenza virus using various peptides The results showing the virus infection rate are shown in Table 4.
  • C18-s2 (rl-8) was used as a negative control.
  • C18-s2 (rl-8) (SEQ ID NO: 41) refers to a peptide having the same amino acid structure as s2 (1-8) (SEQ ID NO: 38) but having a sequence different from SEQ ID NO: 38.
  • IC is defined as 100% infection rate when no peptide is added, and the infection is reduced to 50%.
  • the peptide having the A RLPR sequence with the C-terminal of SEQ ID NO: 3 truncated (C18—s2 (l—8) peptide (SEQ ID NO: 38), C 18—s 2 (1 7) Peptide (SEQ ID NO: 42), C18—s2 (1—6) Peptide (SEQ ID NO: 43), C18—s2 (l-5) Peptide (SEQ ID NO: 44)), C18-s2 (l-4 ) Peptide (SEQ ID NO: 52) It was shown that infection against HlNl influenza virus can be inhibited more strongly, and infection against H3N2 influenza virus can be inhibited more or less effectively.
  • 1818 (1-3) peptide (SEQ ID NO: 54) and 1852 (1-2) peptide (SEQ ID NO: 55) inhibit infection against H1N1 influenza virus and H3N2 influenza virus. It was shown that it was not possible.
  • a peptide having a sequence obtained by inverting the ARLPR sequence (C 18- s2 (1-5) peptide: SEQ ID NO: 44) obtained by cutting off the C-terminus of SEQ ID NO: 3 ( C18- s2 (rl 5) Peptide: SEQ ID NO: 56) and Peptide (C18— which has an inverted sequence of C-terminal ARLP sequence (C18 s2 (1-4) peptide: SEQ ID NO: 52) of SEQ ID NO: 3)
  • Table 5 shows the results of preparing s2 (rl 4) peptide: SEQ ID NO: 57) and showing the infection rate of H1N1 influenza virus or H3N2 influenza virus using these peptides using the above method.
  • the present invention it has become possible to provide a peptide having 4 to 8 residues capable of inhibiting infection of influenza virus into a host.
  • the 4 to 8 residue peptide thus obtained can be synthesized at a lower cost than the 15 residue peptide.
  • a peptide having a high affinity for hemadalchun and a peptide having a high inhibitory activity against influenza virus infection are provided. It becomes possible to provide a pharmaceutical composition using a peptide having a high inhibitory activity.

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Abstract

　ヘマグルチニンに対するより親和性の高いペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害活性の高いペプチド、並びにこのようなペプチドを用いた医薬組成物を提供するため、ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＰ（ペプチドＡ－１：配列番号１）に対し、変異を導入したペプチドを作製し、ヘマグルチニンに対するより親和性の高いペプチドをスクリーニングすることにより得られた配列番号２～７，９～１０，１２～１８を有するポリペプチドを用いる。また、配列番号３で示されるペプチドに対して、ＡＲＬＰＲ又はＡＲＬＰを残すように配列番号３のＣ末端側を削ることによって、このペプチドのインフルエンザウイルス感染阻害活性を増強することができる。また、これらのインフルエンザウイルス受容体結合性ペプチドを製剤化することにより、インフルエンザウイルス感染阻害剤及びインフルエンザ予防・治療剤を作製することができる。

Description

明 細 書
インフルエンザ感染阻害ペプチド、インフルエンザウイルス感染阻害剤、 リボソーム、インフルエンザ予防'治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、インフルエンザウイルスの感染を阻害するインフルエンザ感染阻害ぺプ チド、インフルエンザウイルスの感染を阻害するインフルエンザウイルス感染阻害剤、 インフルエンザ感染阻害ペプチドを含有するリボソーム、インフルエンザウイルス感染 阻害ペプチドを含有するインフルエンザの予防 ·治療剤に関する。
背景技術
[0002] インフルエンザウイルス膜にはへマグルチュン（HA)及びノィラミニダーゼ（NA、シ ァリダーゼ）といった 2種類のスパイク糖蛋白質が存在し、それぞれウィルスの感染成 立及びウィルスの宿主細胞力もの出芽に重要な役割を果たしている。前者のへマグ ルチュンは、ヒトやその他の動物（ほ乳類、鳥類、は虫類、魚類、両生類等）といった 宿主の細胞膜上に普遍的に存在するシアル酸含有糖鎖を受容体として認識してそ れに特異的に結合し、インフルエンザウイルスの細胞内へのエンドサイト一シスを導く 。一方、後者のノイラミニダーゼは、受容体破壊酵素であり、宿主細胞からウィルス粒 子が出芽又は遊離する際に、 自らの又は宿主細胞膜上のシアル酸残基を切断する 役割を担っている。
[0003] インフルエンザウイルス感染の第 1ステップに関与するへマグルチュンには、極めて 変異しやす 、抗原決定領域 (A〜E)のアミノ酸配列の多様性に基づ 、て、種々の亜 型が存在する。へマダルチュンの亜型間のアミノ酸配列の相同性は 25〜75%であ るため、抗原性を基にしたインフルエンザワクチンの開発は非常に困難である。一方 、宿主細胞の受容体と結合するいわゆる受容体結合ポケット領域は、比較的変異が 少なぐその三次元構造はよく保存されている（Y.Suzuki, Prog丄 ipid.Res., 33, 429 (1 994)) o従って、インフルエンザウイルスの感染を防止するために、感染成立に寄与 するへマダルチュンに特異的に結合することによってその働きを阻害すれば、広くィ ンフルェンザウィルスの感染防止に効果があることが期待され、そのような薬剤の開 発が求められている。
[0004] 例えば、へマダルチュンが宿主受容体のシアル酸含有糖鎖を認識して結合するこ とに基づいて、へマグルチニンのその結合部位に特異的に結合する糖アナログをス クリーニングするという手法により、現在までに種々のへマダルチュン結合性糖アナ口 グが取得されている（R.Roy, et al., J.Chem.Soc, Chem.Commun., 1869 (1993); M.M ammen, et al" J.Med.Chem., 38,4179 (1995); T.Sato, et al., Chem丄 ett., 145 (1999) ； T.Sato, et al., Chem丄 ett" 145 (1999); M.ltzstein, et al., Nature, 363, 418 (1993)
) o
[0005] そのほか、へマダルチュンの受容体糖鎖に対するモノクローナル抗体の抗原結合 部位のもつ抗原性 (イディォタイプ）に対する抗体 (抗イディォタイプ抗体)を作成する 手法もある。すなわち、これはへマダルチュンの受容体となるシアル酸及びシァロ糖 鎖の三次元構造に代えて、それと立体構造が類似する抗イディォタイプ抗体の超可 変部のアミノ酸配列を作成し、宿主細胞のへマダルチュン受容体に模擬させると 、う ものである（鈴木康夫「ウィルス感染と糖鎖」、別冊日経サイエンス「糖鎖と細胞」 ,89-1 01頁， 1994年 10月）。
[0006] しかし、受容体結合ポケット領域は、比較的変異が少なぐその三次元構造はよく 保存されているとは言え、これらのいずれもへマダルチュンの亜型に特異的であり、 また結合定数も高くない。従って、へマダルチュンの亜型に関わらずインフルエンザ ウィルス全般に働く薬剤の開発が待たれている。
[0007] そこで、ファージディスプレイ法を用いて、へマグルチュンに結合し、インフルェン ザウィルスの感染を防止する 15残基のオリゴペプチドがスクリーニングされ、 11種類 (国際公開 WO00/59932)及び 3種類（特開 2002— 284798明糸田書； T. Sato, et al., Peptide Science 2001, 329 (2002))のオリゴペプチドが同定された（国際公開 WO 00,59932)。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] し力しな力ら、国際公開 WO00/59932及び特開 2002— 284798明糸田書にお!ヽ てなされたスクリーニングに用いられたファージライブラリーのタイターは 2. 5 Χ 108で あり、アミノ酸 15残基の総配列数である 2015 ( = 3. 3 X 1019)には程遠ぐそれらのォ リゴペプチドより、へマダルチュンに対する親和性の高いペプチドが存在することと考 えられた。
[0009] そこで、本願発明は、より多くのペプチドをスクリーニングすることによって、さらにへ マダルチュンに対する親和性の高いペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害 活性の高いペプチドを提供し、さらに、このようなへマダルチュンに対する親和性の 高 、ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害活性の高 、ペプチドを用いた医 薬組成物を提供することを目的としてなされた。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
X X X X
1 2 3 4
を有する、 4残基以上 14残基以下のペプチドであって、 X力 ァラニン、グリシン、ィ ソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 アルギニン又はリジンであり、 X力 ァ
2 3 ラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 プロリン、ァラニン、
4
又はグリシンである。なお、前記 Xは、プロリンであることが好ましい。
4
[0011] また、本発明にかかるペプチドは、配列番号 3の一部において、アミノ酸配列
X X X X
1 2 3 4
を含む、 4残基以上 14残基以下のペプチドであって、 X力 ァラニン、グリシン、イソ ロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 アルギニン又はリジンであり、 X力 ァラ
2 3 ニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 プロリン、ァラニン、
4
又はグリシンある。なお、前記 Xは、プロリンであることが好ましい。
4
[0012] さらに、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
X X X X X
1 2 3 4 5
を有する、 5残基以上 14残基以下のペプチドであって、 X力 ァラニン、グリシン、ィ ソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 アルギニン又はリジンであり、 X力 ァ
2 3 ラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 プロリン、ァラニン、
4
又はグリシンであり、 X力 アルギニン又はリジンである。なお、前記 Xは、プロリンで
5 4
あることが好ましい。 [0013] また、本発明にかかるペプチドは、配列番号 3の一部において、アミノ酸配列 XXXXX
1 2 3 4 5
を含む、 5残基以上 14残基以下のペプチドであって、 X力 ァラニン、グリシン、イソ ロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 アルギニン又はリジンであり、 X力 ァラ
2 3 ニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 プロリン、ァラニン、
4
又はグリシンであり、 X力 アルギニン又はリジンである。なお、前記 Xは、プロリンで
5 4
あることが好ましい。
[0014] さらに、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
XXXXXXXXHXX X X X X
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
の一部において、アミノ酸配列
XXXXX
1 2 3 4 5
を含む、 5残基以上 14残基以下のペプチドであって、 X力 ァラニン、グリシン、イソ ロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 アルギニン又はリジンであり、 X力 ァラ
2 3 ニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 プロリン、ァラニン、
4
又はグリシンであり、 X力 アルギニン又はリジンであり、 X力 セリン又はスレオニン
5 6
であり、 X力 システィン又はメチォニンであり、 X力 ァラニン、グリシン、イソ口イシ
7 8
ン、ノ リン、又はロイシンであり、 X力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、 X 力 s
9 10
、アルギニン又はリジンであり、 X 力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、 X 力 s
11 12
、ァラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、 X 力 グルタミン又は
13
ァスバラギンであり、 X 力 プロリン、ァラニン、又はグリシンである。なお、前記 X、
14 4 前記 X、前記 X 、及び前記 X は、プロリンであることが好ましい。
9 11 14
[0015] また、本発明にかかるペプチドは、配列番号 38、 42〜44、 52の!、ずれかのアミノ 酸配列を有する。
[0016] さらに、本発明にかかるペプチドは、配列番号 38、 42〜44、 52において、 1から数 アミノ酸残基の置換 ·欠失 ·付加を有するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス 感染阻害活性を有する。
[0017] なお、前記ペプチドは、アルキル化されて!/、ることが好まし!/、。
[0018] さらに、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列 X X X X
4 3 2 1
を有する、 4残基以上 14残基以下のペプチドであって、 X力 プロリン、了ラニン、又
4
はグリシンであり、 X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり
3
、 X力 アルギニン又はリジンであり、 X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、
2 1
又はロイシンである。なお、前記 Xは、プロリンであることが好ましい。
4
[0019] また、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
X X X X X
5 4 3 2 1
を有する、 5残基以上 14残基以下のペプチドであって、 X力 アルギニン又はリジン
5
であり、 X力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、 X力 ァラニン、グリシン、イソ
4 3
ロイシン、バリン、又はロイシンであり、 X力 アルギニン又はリジンであり、 X力 ァラ
2 1 ニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンである。なお、前記 Xは、プロリン
4
であることが好ましい。
[0020] また、本発明にかかるペプチドは、配列番号 56、 57の!、ずれかのアミノ酸配列を有 する。
[0021] さらに、本発明にかかるペプチドは、配列番号 56、 57において、 1から数アミノ酸残 基の置換'欠失'付加を有するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害 活性を有する。
[0022] なお、前記ペプチドは、アルキル化されて!/、ることが好まし!/、。
[0023] 本発明に力かるインフルエンザウイルス感染阻害剤は、前記 、ずれかのペプチドを 有効成分として含有する。なお、前記インフルエンザウイルス感染阻害剤は、へマグ ルチュン HIを有するインフルエンザウイルス及びへマグルチュン H3を有するインフ ルェンザウィルスの両方の感染を阻害する。
[0024] また、本発明にかかるインフルエンザ予防'治療剤は、前記いずれかのペプチドを 有効成分として含有する。なお、前記インフルエンザ予防'治療剤は、へマダルチ- ン HIを有するインフルエンザウイルス及びへマグルチュン H3を有するインフルェン ザウィルスの両方に効果を有する。
[0025] 本発明に力かる DNAは、前記いずれかのペプチドをコードする。
[0026] また、本発明に力かる発現ベクターは、前記 DNAを有する。 [0027] さらに、本発明に力かる細胞は、前記発現ベクターが導入され、前記いずれかのぺ プチドを分泌する。
[0028] また、本発明のリボソームは、前記 、ずれかのペプチドを含有する。なお、前記リポ ソームにお 、て、前記ペプチドがアルキル化されて!/、ることが好まし!/、。
[0029] 本発明に力かるインフルエンザウイルス感染阻害剤は、前記 、ずれかのペプチドを 含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤であって、前記ペプチドが両親媒性を 有するように修飾されて、ペプチド凝集体を形成していることを特徴とする。なお、前 記インフルエンザウイルス感染阻害剤において、前記修飾は、アルキル化であること が好ましい。
[0030] また、本発明に力かるペプチド凝集体は、前記ペプチド凝集体を 、う。
[0031] 本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
X X X X X X X
2 3 4 5 6 7 8
(配列番号 49 : s2 (2— 8) (general formula) )を有し、 Xがアルギニン又はリジンで
2
あり、 Xがァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 Xがプロリン
3 4
、ァラニン、又はグリシンであり、 Xがアルギニン又はリジンであり、 Xがセリン又はス
5 6
レオニンであり、 Xカ^チォニン又はシスティンであり、 Xがァラニン、グリシン、イソ口
7 8
イシン、ノ リン、又はロイシンである。なお、前記 Xは、プロリンであることが好ましい。
4
[0032] また、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
X X X X X X X
2 3 4 5 6 7 8
(配列番号 49)において、 1から数アミノ酸残基の置換'欠失'付加を有するアミノ酸 配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有する。なお、前記 Xは、プロリ
4 ンであることが好ましい。
[0033] なお、前記ペプチドは、アルキル化されて!/、ることが好まし!/、。
[0034] 本発明に力かるインフルエンザウイルス感染阻害剤は、前記 、ずれかのペプチドを 有効成分として含有する。なお、前記インフルエンザウイルス感染阻害剤は、へマグ ルチニン H 1を有するインフルエンザウイルスの感染を阻害する。
[0035] <関連文献とのクロスリファレンス >
なお、本願は、 2006年 3月 13日付けで出願した日本国特願 2006-68020号に基づく 優先権を主張する。この文献を参照することにより、本明細書に援用する。
図面の簡単な説明
[0036] [図 1]本発明の実施例において、 ELISAを用いて、 A— 1と H3G— 1とのへマグルチ ニンに対する結合活性を比較したグラフである。
[図 2]本発明の実施例において、 ELISAを用いて、配列番号 2〜18のアミノ酸配列 を有するペプチドのへマグルチニンに対する結合活性を、 A— 1 (配列番号 1)の結 合活性と比較したグラフである。
[図 3] (A)は、本発明の実施例において、 s— 2ペプチドに関し、各濃度における時間 (X軸）とレゾナンス (y軸）との関係を示した図であり、 (B)は、本発明の実施例におい て、各へマダルチュン結合性ペプチドに関し、所定の時間における濃度 (X軸）に対 するレゾナンス (y軸）の変化を示した図である。
[図 4] (A)は、本発明の実施例において、各へマダルチュン結合性ペプチドのぺプ チド濃度 100 Mにおける、レゾナンス (y軸）の時間（X軸)経過に対する変化を示し た図であり、（B)は、本発明の実施例において、各へマダルチュン結合性ペプチドの ペプチド濃度 200 Mにおける、 A— 1ペプチドの結合量を 1としたときのへマダル チュン結合性ペプチドのレゾナンスの相対値を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
[0037] 実施の形態及び実施例に特に説明がな!、場合には、 J. Sambrook, E. F. Fritsch &
T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold bpnng Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Prot ocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に 記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬 キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコ ールを用いる。
[0038] なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、 当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を 再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発 明の好まし 、実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されて 、るので あって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発 明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは 、当業者にとって明らかである。
= =へマグルチニン結合性ペプチド = =
本明細書で用いられるへマダルチュン結合性ペプチドのアミノ酸配列を表 1に示す
[表 1]
Figure imgf000010_0001
この中で、配列番号 1のアミノ酸配列を有するポリペプチド A— 1は、これまで同定さ れたへマダルチュン結合性ペプチドのうち最も高 、結合活性を有するが（国際公開 WOOO/59932,特開 2002— 284798明細書及び実施例参照）、配列番号 2 7 , 9-10, 12 18のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、実施例に示すように、 A 1より、さらにへマダルチュンに対する結合活性が高い。また、実施例に示すように 、これら配列番号 2〜7, 9〜： LO, 12〜18のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、へ マグルチニン HI及び H3の両方に結合する。
[0041] また、本発明に力かるへマグルチニン結合性ペプチドは、配列番号 2〜7, 9〜： L0, 12-18にお 、て、 1〜数アミノ酸残基の置換 ·欠失 ·付加を有するアミノ酸配列を有 し、 A—1より、へマダルチュンに対し高い結合活性を有するペプチドであってもよい
[0042] ここで、へマダルチュンに対するへマダルチュン結合性ペプチドの結合活性は、例 えば、 ELISAによって測定することができる力 これに限らず、 RIA、 EIA、ゥエスタ ン-ブロッテイング、など、タンパク質間の相互作用を定量的に測定できる手法であれ ばどんなものを用いて測定してもよ 、。
[0043] = =インフルエンザウイルス感染阻害ペプチド = =
また、本明細書で用いられるインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのアミノ酸配 列を表 2に示す。
[表 2]
Figure imgf000011_0001
[0044] 以下の実施例に記載する通り、配列番号 38、 42〜44、 52、 56、及び 57のアミノ酸 配列を有するインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、インフルエンザウイルス の宿主細胞への感染を強く阻害することができる。
[0045] また、本発明に力かるインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、配列番号 38、 42〜44、 52、 56、及び 57にお!/ヽて、 1力ら数アミノ酸残基の置換'欠失 '付カロを有 するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有するペプチドぺ プチドであってもよい。
[0046] ここで、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドによるインフルエンザウイルスの 宿主細胞への感染阻害は、例えば、プラークアツセィ法によって測定することができ る。
[0047] 一般に、当業者において、同じ性質を有する側鎖 (例えば、脂肪族の側鎖等)を有 するアミノ酸は、ペプチド内で置換してもペプチドの機能は変わらないことが知られて いる。
[0048] 従って、 ARLP (配列番号 52)配列を有するペプチドにお!/、て、例えば、 Aを脂肪 族の側鎖を有するアミノ酸 (例えば、 G、 V、 L又は I)へ、 Rを塩基性の側鎖を有する アミノ酸 (例えば、 K)へ、 Lを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸 (例えば、 G、 V、 A又は I )へ置換しても、置換後のペプチドは、 ARLP (配列番号 52)配列を有するペプチドと 同様の活性を有すると考えられる。また、一般的な点変異の実験ではプロリンをァラ ニンやグリシンに変えても同程度の活性を有することも知られている (松原輝彦,学位 論文,東京工業大学 (2000年)）。従って、 Pを Aや Gへ置換しても、置換後のペプチド は、 ARLP (配列番号 52)配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考えられる 。すなわち、このような配列は、一般式として、
X X X X (配列番号 58： s2 (1— 4) (general formula) )
1 2 3 4
で表わすことができる。ここで、 Xは、ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又は口 イシンであり、 Xは、アルギニン又はリジンであり、 Xは、ァラニン、グリシン、イソロイ
2 3
シン、ノ リン、又はロイシンであり、 Xは、プロリン、ァラニン、又はグリシンである。な
4
お、 Xは、プロリンであることが好ましい。
4
[0049] 本発明のペプチドは、このアミノ酸配列（配列番号 58)を有する 4残基以上 14残基 以下のペプチドである。
[0050] 同様に、 ARLPR (配列番号 44)配列を有するペプチドにお!/、て、例えば、 Aを脂 肪族の側鎖を有するアミノ酸 (例えば、 G、 V、 L又は I)へ、 Rを塩基性の側鎖を有す るアミノ酸 (例えば、 K)へ、 Lを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸 (例えば、 G、 V、 A又 は I)へ置換しても、置換後のペプチドは、 ARLPR (配列番号 44)配列を有するぺプ チドと同様の活性を有すると考えられる。また、 Pを Aや Gへ置換しても、置換後のぺ プチドは、 ARLPR (配列番号 44)配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考 えられる。すなわち、このような配列は、一般式として、
X X X X X (配列番号 48： s2 ( 1— 5) (general formula) )
1 2 3 4 5
で表わすことができる。ここで、 Xは、ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又は口 イシンであり、 Xは、アルギニン又はリジンであり、 Xは、ァラニン、グリシン、イソロイ
2 3
シン、ノ リン、又はロイシンであり、 Xは、プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、 X
4 5 は、アルギニン又はリジンである。なお、 Xは、プロリンであることが好ましい。
4
[0051] 本発明のペプチドは、このアミノ酸配列（配列番号 48)を有する 5残基以上 14残基 以下のペプチドである。
[0052] 一方、配列番号 3のアミノ酸配列は、一般式として、
X X X X X X X X HX X X X X X (配列番号 50 : s2 (general formul
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
a) )
で表わすことができる。ここで、 Xは、ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又は口 イシンであり、 Xは、アルギニン又はリジンであり、 Xは、ァラニン、グリシン、イソロイ
2 3
シン、ノ リン、又はロイシンであり、 Xは、プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、 X
4 5 は、アルギニン又はリジンであり、 Xは、セリン又はスレオニンであり、 Xは、システィ
6 7
ン又はメチォニンであり、 Xは、ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又は口イシ
8
ンであり、 Xは、プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、 X は、アルギニン又はリジ
9 10
ンであり、 X は、プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、 X は、ァラニン、グリシン、
11 12
イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、 X は、グルタミン又はァスバラギンであり、
13
X は、プロリン、ァラニン、又はグリシンである。なお、 X、X、X 、及び X は、プロ
14 4 9 11 14 リンであることが好ましい。
[0053] 従って、本発明のペプチドは、上記アミノ酸配列（配列番号 50)の一部において、 アミノ酸配列（配列番号 58)を含む、 4残基以上 14残基以下のペプチドであってもよ ぐ特に、配列番号 3の一部において、このアミノ酸配列（配列番号 58)を含む、 4残 基以上 14残基以下のペプチドであることが好ましい。また、本発明のペプチドは、ァ ミノ酸配列（配列番号 48)を含む、 5残基以上 14残基以下のペプチドであってもよぐ 特に、このアミノ酸配列（配列番号 48)を含む、 5残基以上 14残基以下のペプチドで あることが好ましい。
[0054] さらに、本発明のペプチドは、 ARLPR (配列番号 44)配列又は ARLP (配列番号 5 2)配列を反転させた配列を有するペプチドであってもよ 、。このように ARLPR (配列 番号 44)配列を反転させた配列 RPLRA (配列番号 56)配列又は ARLP (配列番号 52)配列を反転させた配列 PLRA (配列番号 57)配列を有するペプチドにお!/、て、 例えば、 Aを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸 (例えば、 G、 V、 L又は I)へ、 Rを塩基性 の側鎖を有するアミノ酸 (例えば、 K)へ、 Lを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸 (例えば 、 G、 V、 A又は I)へ置換しても、置換後のペプチドは、 RPLRA (配列番号 56)配列 又は PLRA (配列番号 57)配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考えられる 。また、 Pを Aや Gへ置換しても、置換後のペプチドは、 RPLRA (配列番号 56)配列 又は PLRA (配列番号 57)配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考えられる 。すなわち、このような配列は、一般式として、
X X X X X (配列番号 59： s2 (rl 5) (general formula) )又は X X X X (配
5 4 3 2 1 4 3 2 1 列番号60 : 52 (1：1—4) (general formula) )で表わすことができる。ここで、 Xは、 ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 Xは、ァノレギニン又はリ
2
ジンであり、 Xは、ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、 Xは
3 4
、プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、 Xは、アルギニン又はリジンである。なお、
5
Xは、プロリンであることが好ましい。
4
[0055] = =へマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害べプチ ドを含有する医薬組成物 = =
インフルエンザウイルスが細胞に感染する際、インフルエンザウイルスの有するへマ グルチニンが、宿主細胞の受容体に特異的に結合し、その受容体を足場として、ウイ ルスが細胞に感染する。本発明のへマダルチュン結合性ペプチドは、そのへマダル チニンに特異的に結合する。この結合により、へマグルチニンが宿主細胞受容体に 結合することを妨げることができ、従って、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染 するのを阻害することができる。
[0056] このように、本発明のへマグルチュン結合性ペプチドは、インフルエンザウイルスが 宿主細胞に感染するのを阻害することができる。また、以下の実施例に示す通り、本 発明のインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、インフルエンザウイルスが宿主 に感染するのを阻害することができた。従って、本発明のへマダルチュン結合性ぺプ チド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、インフルエンザに罹患したヒト 又はヒト以外の脊椎動物に投与することにより、体内でのインフルエンザウイルスの増 殖を抑制することができる。また、インフルエンザ罹患前のヒト又はヒト以外の脊椎動 物に予め投与しておくことにより、インフルエンザウイルスが体内に侵入しても感染を 防止することができる。
[0057] こうした医療用以外にも、本発明のへマダルチュン結合性ペプチドは、へマグルチ ニンを介して生じるインフルエンザウイルスの感染、及びそれに伴う種々の細胞機能 や生命現象を解明するためのツールとして用いることもできる。
[0058] なお、本発明が対象とするインフルエンザウイルスは、へマグルチニン HI又はへマ グルチニン H3の少なくとも一方を有していれば、その型や由来を特に制限するもの ではなぐ A型、 B型もしくは C型、又はヒト分離型、ブタゃゥマ等の他の哺乳動物分 離型もしくは鳥類分類型等の 、ずれであってもよ!、。
[0059] 以上のように、本発明のへマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウィル ス感染阻害ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物として、インフルエンザゥ ィルスが宿主細胞に感染するのを阻害するためのインフルエンザウイルス感染阻害 剤、インフルエンザに罹患した患者を治療するためのインフルエンザ治療剤、インフ ルェンザに罹患する前に予防的に投与するためのインフルエンザ予防剤等が考えら れる。これらの医薬組成物は、有効成分としてへマダルチュン結合性ペプチド又はィ ンフルェンザウィルス感染阻害ペプチドと、必要に応じて薬学的に許容される担体と を含有する製剤として、インフルエンザウイルスに感染したヒト又はヒト以外の脊椎動 物に投与したり、感染前のヒト又はヒト以外の脊椎動物に予防的に投与したりすること ができる。
[0060] ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬組成物の形態に応じ て、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。例えば、医薬組 成物が溶液形態として調製される場合、担体として、精製水 (滅菌水)又は生理学的 緩衝液、グリコール、グリセロール、ォリーブ油のような注射投与可能な有機エステル などを使用することができる。また、この医薬組成物には、慣用的に用いられる安定 剤、賦形剤などを含むことができる。
[0061] これらの医薬組成物の投与方法には特に制限はなぐ各種製剤形態、患者の年齢 、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定すればよいが、製剤形態 としては、特に注射剤、点滴剤、噴霧剤 (エアゾール)、点鼻剤、吸入剤などが好まし い。
[0062] 投与経路としては、経口投与又は非経口投与があり、具体的には、経口投与、静 脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、気管内投与、吸入 投与、舌下投与等が挙げられるが、これらに限定されない。
[0063] 例えば、ヒトインフルエンザウイルスは、口腔や鼻腔から侵入し、主に上気道の粘膜 上皮細胞で増殖することが知られているので、本剤は、医薬組成物として、ヒトインフ ルェンザウィルスが感染するヒト又はヒト以外の脊椎動物に対し、経口、気管内、鼻、 口腔咽頭、吸入等の投与経路で使用されることが好ましい。具体的には、本剤をスプ レー、（噴霧式)エアゾール又は吸入剤として製剤化すれば、本剤を経口、気管内、 鼻、口腔咽頭、吸入等の投与経路を通じて投与することができ、インフルエンザウイ ルスの気道上皮細胞への感染を直接阻害することができる。
[0064] また、これらの医薬組成物の 1日当たりの投与量は、投与する者の症状、年齢、体 重、性別、治療期間、治療効果、投与方法などにより適宜変更しうるが、インフルェン ザ感染を阻害でき、かつ、生じる副作用が許容し得る範囲内であれば特に限定され ない。当該製剤は 1日 1回投与に限らず、数回に分けて投与してもよい。
[0065] これらの医薬組成物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の 抗ウィルス剤、抗炎症剤や、症状を緩和する薬剤など）と組み合わせて使用してもよ い。
[0066] また、本剤は、インフルエンザワクチンが使用できな 、場合、例えば、インフルェン ザワクチンの効果が現れるまでに罹患の可能性があるハイリスク患者や、免疫不全者 等ワクチンの効果が十分に現れな 、患者や、ワクチン接種が禁忌である患者に対し ても使用可能である。
[0067] なお、ヒト以外の脊椎動物に経口投与する場合、水や飼料に本剤を混合して摂取 させてちょい。
[0068] = =へマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチド の製造方法 = =
本発明のへマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害べ プチドは、常法に従って、化学合成することにより製造できる。例えば、通常の液相法 及び固相法によってペプチド合成することができる。より具体的には、上記アミノ酸配 列情報に基づいて、各アミノ酸を 1個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップ ワイズエロゲーシヨン法と、アミノ酸数個力もなるフラグメントを予め合成し、次いで各 フラグメントをカップリング反応させるフラグメント 'コンデンセーシヨン法などを利用で きる。
[0069] 上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。そ の具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステル法、 酸化還元法、 DPPA (ジフエ-ルホスホリルアジド）法、 DCC +添カ卩物（ 1 ヒドロキシ ベンゾトリァゾール、 N ヒドロキシサクシンアミド、 N ヒドロキシ 5—ノルボルネン 2, 3 ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用 できる溶媒もこの種のペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的 なものから適宜選択することができる。その例としては、例えば、ジメチルホルムアミド (DMF)、ジメチルスルホキシド（DMSO)、へキサホスホロアミド、ジォキサン、テトラ ヒドロフラン (THF)、酢酸ェチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
[0070] なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドに おけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、ェチ ルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルェ ステル、 p—メトキシベンジルエステル、 p 二トロべンジルエステルァラルキルエステ ル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えば Tyr の水酸基は、ァセチル基、ベンジル基、ベンジルォキシカルボ-ル基、第三級プチ ル基等で保護されてもよいが、必ずしもカゝかる保護を行う必要はない。更に例えば Ar gのグァ-ジノ基は、ニトロ基、トシル基、 2—メトキシベンゼンスルホ-ル基、メチレン 2—スルホ-ル基、ベンジルォキシカルボ-ル基、イソボル-ルォキシカルボ-ル 基、ァダマンチルォキシカルボ-ル基等の適当な保護基により保護することができる 。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドに おけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、 液体アンモニア Zナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルォロ酢酸、 酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って行うことができる。
[0071] このように作製されたペプチドは、例えばイオン交換榭脂、分配クロマトグラフィー、 ゲルクロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
(HPLC)、向流分配法等、ペプチド化学の分野で汎用されている常法に従って、適 宜その精製を行うことができる。
[0072] 別法として、上記へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染 阻害ペプチドをコードする DNAを作製して発現ベクターに組み込み、培養細胞など の真核細胞又は大腸菌などの原核細胞に導入し、そこで発現させたペプチドを精製 してもよい。発現ベクターは、導入する宿主細胞に従って、適宜選択する。ペプチド をコードする DNAの組み込みなどを含むベクターの構築、宿主細胞への導入、宿主 細胞での発現、宿主細胞の抽出物の調製は、分子生物学的手法を用いて、常法に 従って行うことができる。 目的のペプチドは、その抽出物から、上記したペプチド化学 の分野で汎用されている常法によって、精製することができる。
[0073] また、上記へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害べ プチドにタグ（例えば、 Hisタグ、 Flagタグ、 GSTタグなど）を付カ卩したペプチドをコー ドする DNAを作製し、上記と同様に宿主細胞で発現させ、このタグを利用して、ァフ ィ-ティカラム等で精製することもでき、その後タグのみを切断しペプチド部分のみを 精製できるように発現ベクターを設計することもできる。さらに、最終的に、上記したぺ プチド化学の分野で汎用されて 、る常法によって、へマダルチュン結合性ペプチド 又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを精製してもよい。
[0074] = =へマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチド の化学修飾 = =
上記本発明のへマダルチュン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻 害ペプチドは、適宜に化学修飾することができる。例えば、アルキル化や脂質化（リン 脂質化)等による化学修飾によって、へマダルチュン結合性ペプチド及びインフルェ ンザウィルス感染阻害ペプチドの細胞親和性や組織親和性を増大させたり、血中半 減期を延長させ薬理効果を増強をさせたりすることができる。
[0075] へマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのァ ルキル化は、常法に従って行うことができる。例えば、上記ペプチド合成と同様に、脂 肪酸とへマダルチュン結合性ペプチドの N末端アミノ基とのアミド結合形成反応によ り容易に行うことができる。脂肪酸としては、直鎖脂肪酸でも分枝鎖脂肪酸でもよぐ また飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよぐどんな脂肪酸でも広く使用できるが、特 に、生体内に存在する脂肪酸を用いるのが好ましぐ具体的にはラウリン酸、ミリスチ ン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ァラキン酸等の飽和脂肪酸;ォレイン酸、エライジ ン酸、リノール酸、リノレン酸、ァラキドン酸等の不飽和脂肪酸など、炭素数が 12〜2 0程度の脂肪酸が挙げられる。
[0076] またアルキルィ匕は、前記ペプチド合成と同様にして、アルキルァミンとへマダルチ- ン結合性ペプチドの C末端カルボキシル基とのアミド結合形成反応によっても行うこと ができる。アルキルァミンとしては、上記脂肪酸と同様に各種のアルキルアミンを用い ることができるが、特に生体内に存在する脂肪鎖 (炭素数が 12〜20程度)を用いる のが好ましい。
[0077] へマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの 脂質化も常法に従って実施できる（例えば、 New Current, 11(3), 15-20 (2000); Bioc hemica et Biophysica Acta., 1128, 44—49 (1992); FEBSLetters, 413, 177—180 (1997) ； J.Biol.Chem., 257, 286-288 (1982)等を参照）。例えば、各種リン脂質の 2位水酸基 或いは 3位のリン酸基に対し、任意のスぺーサーを介して、縮合法によってへマダル チュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドに結合させるこ とができる。必要によっては、へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイ ルス感染阻害ペプチドの N端或 、は C端に任意の長さ (通常数個）のシスティンを含 むアミノ酸配列を付加して、縮合に利用される反応性 SH基をあら力じめ導入すること もできる。ここで用いられるリン脂質には、特に制限はなぐ例えば、上記脂肪酸から なる、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノール ァミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロー ル等が使用できる。
[0078] なお、これらのアルキル化や脂質化された本発明のへマグルチニン結合性ぺプチ ド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチド（リポペプチド）は、リボソーム調製の 際の脂質成分として利用することができる。その際、へマダルチュン結合性ペプチド 又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドがリボソーム上に提示されることにより 、 へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは 後述するリボソーム製剤として有効に利用できる。
[0079] = =へマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチド を含有するリボソーム = =
本発明のへマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害べ プチドはリボソーム製剤として調製することができる。このリボソーム製剤においては、 酸性リン脂質を膜構成成分とするか或いは中性リン脂質と酸性リン脂質とを膜構成成 分とするリボソームに、本発明のへマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザ ウィルス感染阻害ペプチドが保持されて 、る。
[0080] 膜構成成分としての酸性リン脂質としては、例えば、ジラウロイルホスファチジルグリ セロール（DLPG)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG)、ジパルミトイ ルホスファチジルグリセロール（DPPG)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ DSPG)、ジォレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG)、卵黄ホスファチジルグ リセロール (卵黄 PG)、水添卵黄ホスファチジルグリセロール等の天然又は合成ホス ファチジルグリセロール類（PG)及びジラウロイルホスファチジルイノシトール（DLPI) ；ジミリストイルホスファチジルイノシトール（DMPI)、ジパルミトイルホスファチジルイノ シトール（DPPI)、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI)、ジォレオイル ホスファチジルイノシトール（DOPI)、大豆ホスファチジルイノシトール（大豆 PI)、水 添大豆ホスファチジルイノシトール等の天然又は合成ホスファチジルイノシトール類（ PI)などを用いることができる。これらの酸性リン脂質は一種単独で又は二種以上混 合して使用することができる。
[0081] また、中性リン脂質としては、例えば、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジ ルコリン、水添大豆ホスファチジルコリン、水添卵黄ホスファチジルコリン、ジミリストイ ルホスファチジルコリン（DMPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC)、ジラ ゥロイルホスファチジルコリン（DLPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC) 、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン（MPPC)、パルミトイルステアリイルホス ファチジルコリン（PSPC)、ジォレオイルホスファチジルコリン（DOPC)等の天然又は 合成ホスファチジルコリン類（PC)、大豆ホスファチジルエタノールァミン、卵黄ホスフ ァチジルエタノールァミン、水添大豆ホスファチジルエタノールァミン、水添卵黄ホス ファチジルエタノールァミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン（DMPE)、 ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DPPE)、ジラウロイルホスファチジル エタノールァミン（DLPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（DSPE)、 ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールァミン（MPPE)、パルミトイルステア ロイルホスファチジルエタノールァミン（PSPE)、ジォレオイルホスファチジルエタノー ルァミン（DOPE)等の天然又は合成ホスファチジルエタノールアミン類（PE)等を用 いることができる。これらの中性リン脂質は、一種単独で又は二種以上混合して使用 することができる。
[0082] 上記リボソーム膜は、上記酸性リン脂質を単独で構成成分として用いるか又は上記 中性リン脂質と酸性リン脂質とを併用して、常法に従い形成される。ここで酸性リン脂 質の併用割合は、リボソーム膜構成成分中に約 0. 1〜： L00モル％程度、好ましくは 約 1〜90モル0 /0、より好ましくは約 10〜50モル0 /0程度とするのがよい。
[0083] リボソームの調製に当たっては、さらに、例えばコレステロールなどを添加することが できる。このコレステロールの添カ卩によってリン脂質の流動性を調整し、リボソームの 調製をより簡便にすることができる。このコレステロールは、通常リン脂質に対して等 量まで添加できる力 特に 0. 5〜1倍量で添加されるのが好ましい。
[0084] リボソームを調製する際、脂質ィ匕へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルェン ザウィルス感染阻害ペプチドと酸性リン脂質との分子数の割合は、ペプチド 1に対し て酸性リン脂質が 0. 5〜： L00程度、好ましくは 1〜60程度、より好ましくは 1. 5〜20 程度とするのがよい。
[0085] このような脂質を用いて、例えば多重層リボソーム (MLV)を次のようにして調製す る。まず、脂質を有機溶媒 (クロ口ホルム、エーテル等）に溶解した後、丸底フラスコに 入れ、窒素気流下又は減圧下で有機溶媒を除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜をつ くる。この場合、さらに減圧下でデシケーター中に放置することによって有機溶媒を 完全に除去することもできる。次いで、脂質ィ匕へマダルチュン結合性ペプチドの水溶 液を脂質薄膜上に加えて脂質を水和させることによって乳濁色のリボソーム懸濁液 が得られる。
[0086] また、大きな一枚膜リボソーム (LUV)は、ホスファチジルセリンの小さな一枚膜リポ ノームに Ca2+を添加し、融合させてシリンダー状のシートとした後、キレート剤である EDTAを添カ卩し Ca2+を除去する方法（Biochim. Biophys. Acta394, 483-491, 1975) やエーテルに溶解した脂質を約 60°Cの水溶液中に注入し、エーテルを蒸発させる 方法（Biochim. Biophys. Acta 443, 629-634, 1976)により作ることができる。
[0087] また、作製されたリボソーム懸濁液にペプチドの水溶液をカ卩えることでペプチド組み 込みリボソームを作製できる。
[0088] これらの調製法のほかに、フレンチプレス法により粒子径の小さなリボソームを調製 することもできる（FEBS lett. 99, 210-214, 1979)。また大沢らによって報告されている リボソームへの保持効率の高い凍結乾燥法（Chem. Pharm. Bull. 32, 2442-2445, 19 84)と凍結融解法（Chem. Pharm. Bull. 33, 2916-2923,1985)を利用することもできる
[0089] このように調製されたリボソームに含まれる脂質ィ匕へマダルチュン結合性ペプチド 又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの割合は、全脂質中、数モル％から 数十モル％程度であればよぐ 5〜20モル％程度であるのが好ましいが、通常は 5モ ル0 /0程度であってもよ 、。
[0090] さらに、こうして調製されたリボソームは、透析法 (J. Pharm. Sci. 71, 806-812,1982) やポリカーボネート膜を用いたろ過法（Biochim. Biophys. Acta 557, 9-23, 1979 ; Bioc him. Biophys. Acta 601, 559-571, 1980)により、粒子径を一定にすることができる。ま た調製されたリボソーム溶液から、リボソーム内に保持されなカゝつた脂質ィ匕へマダル チュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを除くためには
、透析法、ゲルろ過法、遠心分離法を利用することができる（リボソーム. "脂質の化 学" [日本生化学会編、生化学実験講座 3]、東京化学同人、 1974) o更にまた透析膜 を用いてリボソームを濃縮することも可能である。
[0091] このようにして調製されるリボソーム分散液には、製剤設計上必要な添加剤として、 防腐剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、吸収促進剤等の各種の公知物 質を適宜配合することができ、また必要に応じてこれらの添加物を含む液又は水で 希釈することもできる。上記添加剤の具体例としては、防腐剤としては塩ィ匕べンザル コ-ゥム、塩化ベンゼト-ゥム、クロ口へキシジン、パラベン類（メチルパラベン、ェチ ルパラベン等)、チメロサール等の真菌及び細菌に有効な防腐剤を、等張化剤として は D—マン-トール、 D—ソルビトール、 D—キシリトール、グリセリン、ブドウ糖、マルト ース、庶糖、プロピレングリコール等の多価アルコール類や塩ィ匕ナトリウム等の電解 質類を、また安定化剤としてはトコフエロール、ブチルヒドロキシァ-ソール、ブチルヒ ドロキシトルエン、エチレンジァミン四酢酸塩 (EDTA)、システィン等をそれぞれ用い ることがでさる。
[0092] また、本発明のへマダルチュン結合性ペプチドからなる上記リボソームの内部には 、例えば抗ウィルス剤等の他の薬剤を更に封入させて、リボソーム製剤とすることも可 能である。
[0093] リボソーム製剤の製造は、具体的には例えばウッドレら（Long Circulating Liposome s: old drugs, New therapeutics., M.C. Woodle, G. Storm, Eds: springer— Verlag Berlin (1998))又はナンノ ら (Liposomal applications to cancer therapy, Y.Namba, N.Oku, J.Bioact.Compat.Polymers, 8, 158-177 (1993))の文献に記載される方法に従って調 製することができる。
[0094] 上記リボソーム製剤中のへマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウィル ス感染阻害ペプチドの量としては、特に限定されず、広範囲に適宜選択される力 通 常組成物中 0. 0002〜0. 2 (wZv%)程度、好ましくは 0. 001〜0. l (wZv%)程 度とするのがよい。
[0095] = =ペプチド凝集体 = =
へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、 インフルエンザウイルス感染阻害剤としてそのまま用いてもょ 、が、ペプチド凝集体を 形成させることによって、さらに効率よくインフルエンザウイルスの宿主細胞への感染 を阻害することができる。ここで、本明細書におけるペプチド凝集体は、ミセル (疎水 基を内側に向け、親水基を外側に並べて球の形状を示すもの）と自己ペプチド集合 体 (溶液中にて自然に凝集する直径数百 nm〜数 μ mのペプチド凝集体)を ヽぅ。
[0096] この際、へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ぺプ チドを修飾し、親水性と疎水性の性質を兼ね備える両親媒性の化合物を作製するこ とにより、ペプチド凝集体を形成しやすくすることができる。例えば、へマダルチュン 結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドをアルキルィ匕すること により、両親媒性の化合物を作製することができる。アルキル化は、前述の通りに行 われることができる。
[0097] へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチド、も しくは両親媒性に修飾されたへマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイ ルス感染阻害ペプチドは、液体中において臨界濃度に達すると凝集して、ペプチド 凝集体を形成する。すなわち、所定の濃度以上のへマダルチュン結合性ペプチド又 はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを溶液中で懸濁させることにより、ぺプチ ド凝集体を形成させることができる。このようなへマダルチュン結合性ペプチド又はィ ンフルェンザウィルス感染阻害ペプチドのペプチド凝集体の形成は、へマダルチ- ンと宿主細胞に存在するインフルエンザウイルス受容体との結合を立体的に障害す るためにも効果的であると考えられる。なお、ペプチド凝集体の直径は、例えば、光 強度分布 (intensity PSD)を用いて測定することができる。
[0098] = =他の形態を有する医薬組成物 = =
前述のへマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ぺプ チドを投与する代わりに、これらのペプチドを細胞で発現できる発現ベクターを投与 してもよい。ベクターは、プラスミドでもウィルスベクターでもよいが、用いた細胞で揷 入遺伝子を発現できるプロモーターを有する必要がある。投与形態としては、 DNA をそのまま投与しても、この DN Aを含むウィルスを感染させても、この DNAを含む細 胞を移植してもよい。ウィルスは、アデノウイルス、レトロウイルスなど、特に限定されな いが、体内で細胞に感染し、へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイ ルス感染阻害ペプチドを発現し、分泌できるようにするのが好ましい。また、細胞を移 植する場合も、へマダルチュン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害 ペプチドを発現し、分泌できるようにベクターが構築されているのが好ましい。発現し たペプチドを分泌させるためには、例えば、へマダルチュン結合性ペプチド又はイン フルェンザウィルス感染阻害ペプチドの N端側にシグナルペプチドが融合した融合 ペプチドを発現させるようにベクターを構築すればよいが、分泌させるための方法は 必ずしもこれに限定されな!、。
実施例
[0099] [実施例 1]
まず、西、佐谷らの報告（Nishi T" Saya H" et al, FEBS Lett, 399, 237-240 (1996 ))で使用されたファージディスプレイシステムを用い、配列番号 1〜18の各アミノ酸配 列を有するペプチドを外殻表面に提示する繊維状ファージ fdを作製した。即ち、これ らのアミノ酸配列をコードする DNA (上述の表 1参照）を外殻タンパク質 pill遺伝子の Ν末端部分に相当する領域に遺伝子組み換えの手法を用いて挿入すると、この挿入 DNAにコードされた 15残基のアミノ酸配列からなるペプチドをファージ外殻表面に 発現するように、ファージ DNAを構築することができる。 K91Kanの宿主菌を用い、 常法により、これらの各ファージを増幅し、ファージ溶液を作製した。
[0100] 次に、配列番号 2〜18の各アミノ酸配列を表面に提示するこれらのファージのへマ ダルチュン (HA)に対する結合性を ELISAで調べた。なお、プレートに固定するへ マグルチュンとして、 A型の HI亜型である AZPRZ8Z34 (H1N1)のエーテル抽 出物、及び A型の H3亜型である AZ武漠 Z359Z95 (H3N2)のエーテル抽出物 を用いた。以下、具体的な手順を述べる。
[0101] まず、 96穴カルボプレート（SUMILON社製）に結合したカルボキシル基を活性化 させるため、プレートの各ゥエルに、 EDC (1— ethyl— 3— ( 3 - dimethylaminopro pyl) carbodiimide)及び N—ヒドロキシスクシイミドの等量混合液 60 μ 1を添カ卩して、 10分放置した。
[0102] 次に、活性化プレートにへマグルチュンを固定するため、各ゥエルを 50mM TBS 緩衝液 (ρΗ7. 6)で 6回洗浄し、 H1N1溶液（70 lZml)又は H3N2溶液（70 1/ ml)を 100 /z l添加した。 2時間放置した後、 50mM TBS緩衝液 (pH7. 6)で 6回洗 浄し、 ImMエタノールァミン水溶液を 100 1添カ卩した。 10分放置した後、再度 50m M TBS緩衝液 (pH7. 6)で 6回洗浄した。
[0103] へマグルチュンを固定したプレートに各ファージクローン溶液を 50 l (lxl01Gpfu 含有）添加し、室温で 2時間放置した。各ゥエルを TBST(TBSZ5% Tween20)で 5回洗浄後、 1%BSA含有 TBSTで希釈した抗 fdファージ抗体 (シグマ社； 1000倍 希釈で使用）を 100 1添カ卩し、室温で 1時間放置した。各ゥエルを TBST(TBSZ5 % Tween20)で 5回洗浄後、 1%BSA含有 TBSTで希釈した HRP結合抗ゥサギ Ig G抗体 (シグマ社； 1000倍希釈）を 100 1添加し、室温で 1時間放置した。各ゥエル を TBST (TBS/5% Tween20)で 5回洗浄後、基質としてペルォキシダーゼ（PO D)溶液を 100 1添加し、 10〜15分放置した。 3NH SOを加えて反応を停止させ
2 4
、マイクロプレートリーダーで 492nmの吸収を測定し、結合活性とした。
[0104] なお、コントロールとして、上記記載の 1次ファージディスプレイ 'ライブラリー及び 2 次ファージディスプレイ 'ライブラリー、及び A— 1 (配列番号 1)の結合活性と比較した 。 A—1は、これまで同定されたへマダルチュン結合性ペプチド（国際公開 WO00Z 59932及び特開 2002— 284798明細書参照）に比べ、同等の結合活性を有する。 (一例として、図 1に、同様にして測定した H3G—1の結合活性との比較を示す。）そ こで、配列番号 2〜 18のアミノ酸配列を有するペプチドの結合活性を、ここでは、 A — 1の H1N1と H3N2各々に対する結合活性を 1として全データを標準化し、グラフ にした（図 2)。この図 2のグラフから、 e— 4と e— 7以外のペプチドは、両者のへマグ ルチュンに対し、 A—1より強い結合活性を示すことがわ力 た。特に s— 2は A— 1に 比べ約 3倍もの強い結合活性を示した。なお、上記各ライブラリ一は、 A—1の数分の 一の活性し力示さな力つた。
[0105] 以上より、配列番号 2〜7, 9〜： L0, 12〜18を有するポリペプチドは、配列番号 1の アミノ酸配列を有するへマダルチュン結合性ペプチドより、へマダルチュンに対し高 い結合活性を有するペプチドであって、本発明の一つの目的である医薬組成物とし て有用であると考えられる。
[0106] なお、これらの配列は、共通配列（コンセンサス配列）として xRL (S/P) xxMV (H/R) xxxxQx
(配列番号 37)を有するので、この共通配列をもつペプチドは、配列番号 1のアミノ酸 配列を有するへマダルチュン結合性ペプチドより、へマダルチュンに対し高!、結合 活性を有すると考えられる。
[0107] [実施例 2]
実施例 1で行った ELISAにおいて、特にへマダルチュン (HA)に対する結合性の 高かった s— 2 (配列番号 3)及び e— 1 (配列番号 5)の配列を持つペプチドをィ匕学合 成し (東レ株式会社に依頼）、ペプチドだけの状態でへマグルチニンに対する結合性 を評価した。
[0108] 本実施例で用いたペプチド及びそのアミノ酸配列を表 3に示す。
[表 3]
Figure imgf000027_0001
[0109] これらのへマグルチニン結合性ペプチドを用いて、以下のように、へマグルチニン 固定ィ匕膜に対する結合性を評価した。実施例 1のプレートと同様に Sensor Chip CM5 (Biacore, BR— 1000— 14)に H3N2を固定化し、これに対するペプチドの 結合性を Biacore装置（Biacore社）によって評価を行った。具体的には、各ぺプチ ドに対し、時間を追ってレゾナンスがどのように変化するかを、複数のペプチド濃度で 測定した。
[0110] まず、 s— 2ペプチドに関し、各濃度における時間（X軸）とレゾナンス (y軸）との関係 を図 3Aに示す。そして、同様の実験を各へマダルチュン結合性ペプチドで行い、所 定の時間における濃度 (X軸）に対するレゾナンス (y軸）の変化を図 3Bに示す。この ように、いずれのへマグルチニン結合性ペプチドも、その濃度に依存してへマグルチ ニンへの結合量が増えて 、くことがわかった。
[0111] 次に、上記の結果から、所定のペプチド濃度における各へマダルチュン結合性ぺ プチドの結合性を比較した。図 4Aに、各へマダルチュン結合性ペプチドのペプチド 濃度 100 /z Mにおける、レゾナンス (y軸）の時間（X軸)経過に対する変化を示す。ま た、図 4Bに、ペプチド濃度 200 Mにおいて、 A— 1ペプチドの結合量を 1 とした ときのへマグルチニン結合性ペプチドのレゾナンスの相対値を示す。このように、各 ペプチドは s— 2>e— 1 >A— 1 >pVIII (配列番号 51)の強さの順で、へマグルチ- ンに結合することがわ力つた。この結合の強さの順序は、各へマグルチニン結合性ぺ プチドを発現するファージで測定した結合性の順序とも対応している。
[0112] 以上の結果より、 e—l、 s— 2は A— 1よりそれぞれ 1. 2倍、 2. 1倍強くへマグルチ ニンに結合することが分かり、アミノ酸が置換されたことによって、ペプチドの機能が 向上したことが示唆された。へマダルチュンに対する結合量が少ないために、解離定 数 K を求めることはできないが、本実験で固体ィ匕したリガンド量力 理論的最大 d
結合量を求めると 228RUであるため、例えば s— 2の 200 Mのときの結合量がこれ のちようど半分程度であることから、これらのペプチドの解離定数は 10一3〜 10_4M程 度だと考えられる。
[0113] GM3キャスト膜を用いて GM3—へマダルチュン (HA)間相互作用の阻害評価を ELIS Aを用いて評価したところ (永田和宏 ·半田宏、「生体物質相互作用のリアルタ ィム解析実験法 - BIACOREを中心に」シュプリンガー ·フエアラーク東京株式会社、 1998年）、ペプチド A— 1は、 mMオーダーで GM3に対するへマグルチュンの結合 を阻害した（H3に対する A— 1の IC = 1. 9mM)。また、へマグルチニンと遊離のシ
50
ァリルラタトースとの結合定数は mMオーダーであることが NMRによる評価力 報告 されている（α (2, 3) -sialyllactose K = 3. 2mM)。従って、本実施例の結果は
0
、 Inoueによって報告されたペプチドの阻害定数とほぼ一致し、また、本実施例の結 果は、 A— 1の阻害定数あるいはシァリルラタトースで得られている結合定数と同じォ ーダーもしくは一桁小さいことから、これらのへマダルチュン結合性ペプチドは、へマ ダルチュンのリガンドである糖鎖の優れたアナログとなり得ることが示唆された。
[0114] [実施例 3]
実施例 1により、配列番号 2〜7、 9〜10、 12〜18を有するポリペプチドは、へマグ ルチュンに対して高い結合活性を有することが明らかになった力 インフルエンザゥ ィルスの感染を防止できる、より少ない残基のペプチドを同定すベぐ以下の実験を 行った。
[0115] (1)アルキル化ペプチドの作製
ペプチド凝集体を形成させるため、アルキル化させたペプチドを本実験に用いた。
[0116] まず、以下の表 4に示す各々のペプチド（配列番号 1、 3、 38〜47、 52〜55)を、 F moc法を用いて、自動ペプチドシンセサイザー PSSM— 8 (島津製作所)で合成した 。ここで、固相榭脂として Fmoc— SAL— Resin (code A00102,渡辺化学）を用い てペプチドの合成反応を行った。次に、ジクロロメタンに溶解させた C18— COOH ( ステアリン酸、シグマ）を上記ペプチド合成後の固相榭脂と反応させ、これらのぺプチ ドの N末端側をアルキル化させた。その後、 C18ペプチドを固相合成樹脂から切り出 して、 C18ペプチドアミド (C末端が— CONH )を得た。
2
[0117] 粗精製の後、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)で精製した。また、 matrix assi sted laser de sorption/ ionization time oi flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)で精製後のペプチドの分子量を測定した。なお、 MS測定 は、 autoflex (Bruker Daltonics)を用い、マトリックスには ― cyano— 4— hy droxy― cmnamic acis、 ― CHCA)を用いた。
[0118] (2)プラークアツセィを用いたインフルエンザウイルス感染阻害活性の評価
上記（1)の方法によって作製した各種ペプチド力 インフルエンザウイルスの宿主 細胞への感染をどの程度阻害するかを調べるために、以下の実験を行った。
[0119] まず、 6ウェルマイク口プレートに 10%ゥシ胎児血清、 0. l%NaHCO、 10 μ g/m
3
1グルタミン、 100ユニット Zmlのペニシリン G及び 100ユニット Zmlのストレプトマイシ ンを添カロした MEM (minimum essential medium eagle) (GIBCO BRL)を 用い、 MDCK (Mardin - Darby canine kidney)細胞を、 37。C、 5%COのイン
2 キュベータ一でコンフルェントになるまで単層培養した。なお、 MDCK細胞及び以 下の実験で使用するインフルエンザ AZプエルトリコ Z8Z34ウィルス株（H1N1)、 インフルエンザ AZ愛知 Z2Z68ウィルス株（H3N2)は、 K. Nagata (筑波大学（日 本））から入手した。 MDCK細胞は、インフルエンザウイルス A型、 B型、 C型全てに 対して高い感受性を示し、さらに、細胞増殖時に、へマダルチュンの変異株が出現し な！、ことから、インフルエンザウイルスの感染実験にぉ 、て広く用いられて 、る。
[0120] 次に、 H1N1インフルエンザウイルス溶液 (A型インフルエンザウイルス ZPRZ8Z 34を 100個前後のプラークを形成する濃度に希釈した溶液)及び H3N2インフルェ ンザウィルス溶液 (A型インフルエンザウイルス ZAichiZ2Z68を 100個前後のプラ ークを形成する濃度に希釈した溶液)と、各種ペプチド溶液 (ペプチド濃度 0. 2〜20 0 M)をそれぞれ 100 μ Lずつ混合し、合計 200 μ Lの検体を作製した。
[0121] 次に、 6ウェルマイク口プレート中の培地を除去し、 PBS (—）を l〜2mLZゥエル入 れて細胞表面を洗浄した。 PBS (—）を除去後、上記の方法によって作製した検体を 、 200 μ LZゥエルずつ入れ、 37°C、 5% COのインキュベーターで 30分間インキ
2
ュベー卜した。
[0122] 30分後、検体溶液を除去し、 PBS (—）を l〜2mLZゥエル入れて細胞を洗浄した 。次に、予め 50°Cに加温しておいた 2%の寒天 0. 625mlZゥエル（Oxoid, LTD . ,製品番号： L28)と 1. 475mlZゥエルの重層培地（6ゥヱル分では、 2 X MEM + BAを 6. 25ml、精製水を 2. 25ml, 1%DEAEデキストランを 0. 125ml, 7. 5% N aHCOを 0. 167ml、ァセチルトリプシン（lmgZml(PBS) )を 0. 125ml) (2 X ME
3
M + BAは、 9. 4g MEMを 474mL MiliQ水に加え、高圧滅菌し、濾過滅菌した 1 OmLの L—グルタミン溶液（X 100、 30mgZmL)及び 10mLの 1M Hepes (2. 4g Zl0mL)、6mL 35% bovine albumin (A— 7409, Sigma)をカ卩えて作製し た。）を混合し、これを 2mLZゥエルずつ分注入した。室温で 30分間静置し、寒天が 固まったら反転して、 37°C、 5% COのインキュベーターで 2日間インキュベートし
2
た。
[0123] インフルエンザウイルスを感染させてから 2日後、重層培地をはずし、プレートを乾 燥させた。次に、クリスタルバイオレット染色液（50mg Crystal Violet/50mL 2 0%エタノール)を 500 /z LZゥエル入れて、 5分程度染色を行った後、 5回精製水で 洗い、風乾させた。最後に、プラークの数をカウントし、コントロール (インフルエンザゥ ィルスのみをインキュベートしたもの）と比較し、各ペプチドに対するインフルエンザゥ ィルス感染阻害率を計算した。
[0124] 各種ペプチドを用いた H1N1インフルエンザウイルス又は H3N2インフルエンザゥ ィルス感染率を示した結果を表 4に示す。なお、 C18— s2(rl— 8)をネガティブコン トロールとした。ここで、 C18— s2(rl— 8) (配列番号 41)とは、 s2(l— 8) (配列番号 38)と同じアミノ酸構成だが、配列番号 38とは異なる配列を有するペプチドをいう。ま た、 IC とは、ペプチドを入れない場合の感染率を 100%とし、その感染を 50%まで
50
阻害するのに必要なペプチド濃度をいう。
[表 4]
Figure imgf000031_0001
その結果、 C18— S2ペプチド (配列番号 3)と比べ、配列番号 3の C末端を削った A RLPR配列を有するペプチド（C18— s2(l— 8)ペプチド（配列番号 38)、 C 18— s 2 (1 7)ペプチド（配列番号 42)、 C18— s2 (1— 6)ペプチド（配列番号 43)、 C18— s2(l-5)ペプチド（配列番号 44) ), C18-s2(l-4)ペプチド（配列番号 52)は、 HlNlインフルエンザウイルスに対する感染をより強く阻害できること、また、 H3N2ィ ンフルェンザウィルスに対する感染を、同等か、それ以上により強く阻害できることが 示された。
[0126] また、 C18— S2 (2— 8)ペプチドは、 C18— S2ペプチド（配列番号 3)と比べ、 HI N1インフルエンザウイルスに対する感染を、同等以上に阻害できることが示された。
[0127] 一方、じ18 52 (1—3)ぺプチド（配列番号54)とじ18 52 (1—2)ぺプチド（配列 番号 55)は、 H1N1インフルエンザウイルス及び H3N2インフルエンザウイルスに対 する感染を阻害できな 、ことが示された。
[0128] 以上の結果から、配列番号 3の C末端を削った ARLPR配列を有するペプチドは、 インフルエンザウイルスの MDCK細胞への感染を強く阻害することが明らかになった 。また、さらに N末端を 1残基削った RLPR配列を有するペプチドは、 H1N1インフル ェンザウィルスの MDCK細胞への感染を、強く阻害することが明らかになった。さら に、配列番号 3の C末端を削った ARLP配列を有するペプチドも、インフルエンザウイ ルスの MDCK細胞への感染を強く阻害することが明らかになった。
[0129] さらに、上記と同様の方法を用いて、配列番号 3の C末端を削った ARLPR配列（C 18— s2 (1— 5)ペプチド：配列番号 44)を反転させた配列を有するペプチド (C18- s2 (rl 5)ペプチド：配列番号 56)と配列番号 3の C末端を削った ARLP配列（C18 s2 (1— 4)ペプチド：配列番号 52)を反転させた配列を有するペプチド (C18— s2 (rl 4)ペプチド:配列番号 57)を作製し、上記の方法を用いて、これらのペプチド を用いた H1N1インフルエンザウイルス又は H3N2インフルエンザウイルス感染率を 示した結果を表 5に示す。
[表 5] 配列 IG50( jU M) 分類 ペプチド ペプチド配列 残基数
の種類 番号 H 1 H3
C18-s2(1 -8) C18-ARLPRT V 38 8 2.4 1 .4
#5
C18-s2(r1 -8) C18-VMTRPLRA 41 8 93 226
C18-s2(1 -5) C18-ARLPR 44 5 0.35 1.55
#6
C18-s2(r1 -5) C18-RPLRA 56 5 0.55 0.94
C18-s2(1 -4) C18-ARLP 52 4 0.9 21
#7
C18-s2(r1 -4) C18-PLRA 57 4 0.41 14
[0130] その結果、 C18— s2 (rl— 8) (配列番号 41)と比べ、じ18— 52 (1：1—5)ぺプチド（ 配列番号 56)と C18— s2 (rl -4)ペプチド（配列番号 57)は、 H1N1インフルエンザ ウィルス及び H3N2インフルエンザウイルスの MDCK細胞への感染を、より強く阻害 できることが示された。
[0131] 本発明によって、インフルエンザウイルスの宿主への感染を阻害できる、 4〜8残基 のペプチドを提供することが可能になった。このようにして得られた 4〜8残基のぺプ チドは、 15残基のペプチドより安価に合成できる。
産業上の利用の可能性
[0132] 本発明によると、へマダルチュンに対する親和性の高いペプチド及びインフルェン ザウィルス感染阻害活性の高いペプチドを提供し、さら〖こ、このようなへマダルチュン に対する親和性の高 、ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害活性の高 ヽぺ プチドを用いた医薬組成物を提供することができるようになる。

Claims

請求の範囲
[1] アミノ酸配列
X X X X
1 2 3 4
を有する、 4残基以上 14残基以下のペプチドであって、
X 1S ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
X力 アルギニン又はリジンであり、
2
X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
3
X力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであるペプチド。
4
[2] 配列番号 3の一部にお 、て、アミノ酸配列
X X X X
1 2 3 4
を含む、 4残基以上 14残基以下のペプチドであって、
X 1S ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
X力 アルギニン又はリジンであり、
2
X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
3
X力 プロリン、ァラニン、又はグリシンである請求項 1に記載のペプチド。
4
[3] 前記 X 1S プロリンであることを特徴とする請求項 1又は 2に記載のペプチド。
4
[4] 配列番号 52のアミノ酸配列を有する請求項 3に記載のペプチド。
[5] 配列番号 52において、 1から数アミノ酸残基の置換'欠失'付加を有するアミノ酸配 列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有するペプチド。
[6] アミノ酸配列
X X X X X
1 2 3 4 5
を有する、 5残基以上 14残基以下のペプチドであって、
X 1S ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
X力 アルギニン又はリジンであり、
2
X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
3
X力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、
4
X力 アルギニン又はリジンである請求項 1に記載のペプチド。
5
[7] 配列番号 3の一部において、アミノ酸配列 XXXXX
1 2 3 4 5
を含む、 5残基以上 14残基以下のペプチドであって、
X 1S ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
X力 アルギニン又はリジンであり、
2
X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
3
X力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、
4
X力 アルギニン又はリジンである請求項 6に記載のペプチド。
5
[8] 前記 X 1S プロリンであることを特徴とする請求項 6又は 7に記載のペプチド。
4
[9] アミノ酸配列
XXXXXXXXHXX X X X X
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
の一部において、アミノ酸配列
XXXXX
1 2 3 4 5
を含む、 5残基以上 14残基以下のペプチドであって、
X 1S ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
X力 アルギニン又はリジンであり、
2
X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
3
X力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、
4
X力 アルギニン又はリジンであり、
5
X力 セリン又はスレオニンであり、
6
X力 システィン又はメチォニンであり、
7
X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
8
X力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、
9
X 力 アルギニン又はリジンであり、
10
X 力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、
11
X 力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
12
X 力 グルタミン又はァスバラギンであり、
13
X 力 プロリン、ァラニン、又はグリシンである請求項 1に記載のペプチド。
14
[10] 前記 X、前記 X、前記 X 、及び前記 X 力 プロリンであることを特徴とする請求 項 9に記載のペプチド。
[11] 配列番号 38、 42〜44のいずれかのアミノ酸配列を有する請求項 10に記載のぺプ チド。
[12] 配列番号 38、 42〜44において、 1から数アミノ酸残基の置換'欠失'付加を有する アミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有するペプチド。
[13] アルキルィ匕されていることを特徴とする請求項 1〜12のいずれかに記載のペプチド
[14] 請求項 1〜13のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するインフルェ ンザウィルス感染阻害剤。
[15] へマグルチュン HIを有するインフルエンザウイルス及びへマグルチュン H3を有す るインフルエンザウイルスの両方の感染を阻害する請求項 14に記載のインフルェン ザウィルス感染阻害剤。
[16] 請求項 1〜13のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するインフルェ ンザ予防'治療剤。
[17] へマグルチュン HIを有するインフルエンザウイルス及びへマグルチュン H3を有す るインフルエンザウイルスの両方に効果を有することを特徴とする請求項 16に記載の インフルエンザ予防 ·治療剤。
[18] 請求項 1〜12のいずれかに記載のペプチドをコードする DNA。
[19] 請求項 18に記載の DNAを有する発現ベクター。
[20] 請求項 19に記載の発現ベクターが導入され、請求項 1〜12のいずれかに記載の ペプチドを分泌する細胞。
[21] 請求項 1〜12のいずれかに記載のペプチドを含有するリボソーム。
[22] 前記ペプチドがアルキルィ匕されて 、ることを特徴とする請求項 21に記載のリポソ一 ム。
[23] 請求項 1〜12の!、ずれかに記載のペプチドを含有するインフルエンザウイルス感 染阻害剤であって、
前記ペプチドが両親媒性を有するように修飾されて、ペプチド凝集体を形成してい ること、 を特徴とするインフルエンザウイルス感染阻害剤。
[24] 前記修飾がアルキルィ匕であることを特徴とする請求項 23に記載のインフルエンザゥ ィルス感染阻害剤。
[25] 請求項 23に記載のペプチド凝集体。
[26] アミノ酸配列
X X X X
4 3 2 1
を有する、 4残基以上 14残基以下のペプチドであって、
X力 プロリン、ァラニン、又はグリシンであり、
4
X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであり、
3
X力 アルギニン又はリジンであり、
2
X力 ァラニン、グリシン、イソロイシン、ノ リン、又はロイシンであるペプチド。
[27] アミノ酸配列
X X X X X
5 4 3 2 1
を有する、 5残基以上 14残基以下のペプチドであって、
X力 アルギニン又はリジンである請求項 26に記載のペプチド。
5
[28] 前記 X 1S プロリンであることを特徴とする請求項 26又は 27に記載のペプチド。
4
[29] 配列番号 56又は 57のアミノ酸配列を有する請求項 26に記載のペプチド。
[30] 配列番号 56又は 57において、 1から数アミノ酸残基の置換'欠失'付加を有するァ ミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有するペプチド。
[31] アルキル化されて 、ることを特徴とする請求項 26〜30の 、ずれか〖こ記載のぺプチ ド、。
[32] 請求項 26〜31のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するインフルェ ンザウィルス感染阻害剤。
[33] へマグルチュン HIを有するインフルエンザウイルス及びへマグルチュン H3を有す るインフルエンザウイルスの両方の感染を阻害する請求項 32に記載のインフルェン ザウィルス感染阻害剤。
[34] 請求項 26〜31のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するインフルェ ンザ予防'治療剤。
[35] へマグルチュン HIを有するインフルエンザウイルス及びへマグルチュン H3を有す るインフルエンザウイルスの両方に効果を有することを特徴とする請求項 34に記載の インフルエンザ予防 ·治療剤。
[36] 請求項 26〜30のいずれかに記載のペプチドをコードする DNA。
[37] 請求項 36に記載の DNAを有する発現ベクター。
[38] 請求項 37に記載の発現ベクターが導入され、請求項 26〜30のいずれかに記載の ペプチドを分泌する細胞。
[39] 請求項 26〜30の!、ずれかに記載のペプチドを含有するリボソーム。
[40] 前記ペプチドがアルキルィ匕されて 、ることを特徴とする請求項 39に記載のリポソ一 ム。
[41] 請求項 26〜30の!、ずれかに記載のペプチドを含有するインフルエンザウイルス感 染阻害剤であって、
前記ペプチドが両親媒性を有するように修飾されて、ペプチド凝集体を形成してい ること、
を特徴とするインフルエンザウイルス感染阻害剤。
[42] 前記修飾がアルキルィ匕であることを特徴とする請求項 41に記載のインフルエンザゥ ィルス感染阻害剤。
[43] 請求項 42に記載のペプチド凝集体。
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