JPH03103180A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードする核酸断片およびその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ・　　　　　　　　　１ 本発明は、Ａ型でもＢ型でもない血清型肝炎の原因ウィ
ルス（非Ａ　ＩＰＢ型肝炎ウィルス〉のウィルス抗原を
コードする遺伝子断片、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペ
プチド、およびこれら利用法に関する． ウィルス性肝炎にはＡ型肝炎（伝染性肝炎）とＢ型肝炎
（血清肝炎〉の２種類があることは古くから知られてい
た．これは主として感染経路の相違に基づいたもので、
Ａ型肝炎は経口感染で流行を起こし、Ｂ型肝炎は主とし
て血液を介して伝播されるものであることが確認されて
いた．これら二つの肝炎の起因ウィルスは既に分離同定
され、Ａ型肝炎ウィルスは、ビコルナウィルスに属する
、直径２７ｎｍのＲＮＡウィルスであり［　　Ｆｉｎｅ
ｓｔｏｎ　Ｓ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ
　１８２　ｐｌ０２６　（１９７３）］、一方Ｂ型肝炎
ウィルスは、ヘパドナウィルスに属する直径４２ｎＩ１
のエンベロープを持つＤＮＡウィルスであることが突き
止められた，　　［Ｄａｎｅ，０．Ｓ．，　ｅｔ　ａｔ
．，Ｌａｎｃｅｔ，　　Ｉ　ｐ６９５　（１９７０）］
また、現在では、これらの肝炎ウィルスの免疫血清学的
診断方法が確立されるに至っている． これら２つの肝炎ウィルスの確定診断方法が確立される
に従い、このいずれにも属さない非Ａ非Ｂ型肝炎の存在
が明らかになってきた［　Ｐｒｉｎｃｅ　Ａ．Ｍ．，ｅ
ｔ　ａｌ．，　Ｌａｎｃｅｔ．　　Ｉ　ｐ２４１　（１
９７４）］．輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原
（ＨＢｓＡｇ）のスクリーニング方法の導入により大幅
に減少したがゼロにはならず、しかも、発生した肝炎患
者からは、Ａ型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られなかっ
た．このことから、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型肝炎と
呼ばれている． この肝炎は、我国では散発性肝炎の約５０％、輸血後肝
炎の９０％以上にのぼり、更に慢性肝炎、肝硬変、肝癌
の５０％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に起因すると推定されて
おり、大きな社会問題となっている。

これとは別に、インド、ビルマ、アフガニスタン、また
は、北アフリカなどで経口感染で流行する、第二のウィ
ルス性非Ａ非Ｂ型肝炎があることが明らかになった［　
Ｋｈｕｒｏｏ，　Ｍ．　Ｓ．　　＾ｍ．　Ｊ．　Ｍｅｄ
．，６８　ｐ８１８−８２４，　　（１９８０）コ．こ
れは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型肝炎と呼
ばれている．我国では、この肝炎の流行は見られていな
いが、渡航者の流行地からの肝炎の輸入は若干見られる
ようである［ｆ！原ら、第２５回日本肝臓学会総会講演
要旨集１５１頁　（１９８９）］． 本発明は、上記で言う前者の、主に血液を介して感染す
る血清型非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに関するものであり、
本明細書中では、このウィルスを非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
スと言う． この非Ａ　非−　Ｂ型肝炎についてはウィルス本体の分
離同定はされておらず、このため、この肝炎の診断方法
、治療法、予防法は確立されていない．また、この肝炎
の診断は除外診断によるしかなかった．即ち、患者の血
清について、診断方法が確立されているＡ型、Ｂ型肝炎
の検査を行い、これらの肝炎であることを否定し、更に
、全身感染の一部の症状として肝炎症状を示す、ヘルペ
ス、サイトメガロ、エプスタインバーウィルス感染の可
能性を否定し、薬物性や、アルコール性肝炎、自己免疫
性肝炎を否定して非Ａ非Ｂ型肝炎として診断されていた
． この肝炎の原因ウィルスが感染性を持つことは、１９７
８年アメリカの研究グループにより、チンパンジーを用
いた感染実験で証明された［　Ｔａｂｏｒ，　Ｅ．　．
ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．Ｉ　ｐ４６３　（１９７
８）］．　　Ｌがし世界中の多くの努力にもかかわらず
、１０年以上経た今も、原因ウィルスの実態はわがって
いない．患者感染チンパンジーの血液や肝組織を材料と
して、寒天ゲル内沈降反応、免疫電気向流法、ラジオイ
ムノアッセイ、蛍光抗体法、電顕法などのＡ型およびＢ
型肝炎の研究で用いられたほとんどすべてのアプローチ
により、ウィルスや関連抗原抗体系捜しが行われたきた
が、いまだ確実といわれるものは得られていない． 非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス究明の歴史は、期待と失望の歴
史であったともいえる．数多くのウィルスあるいは抗原
抗体系の候補が浮かび上がってきたが、それらは次々に
否定されていった［　Ｐｒｉｎｃｅ，Ａ．Ｍ．，　Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．．　３７，　Ｐ２Ｌ
７．（１９８３）］．最近の例では、Ｓｅｔｏらのレト
ロウィルス説があり　　［Ｓｅｔｏ，Ｂ．　　　ｅｔ　
　ａｌ．　　：　　　Ｌａｎｃｅｔ．　　　Ｉ　　　ｐ
９４１−９４３　　　（１９８４）］、彼等によると、
チンパンジーに非Ａ非Ｂ型肝炎を起こすことが証明され
ている血清や血湾製剤に逆転写酵素活性が検出され、シ
ｇＩ！密度勾配遠心ではこの酵素は、１．　１４ｇ／ｍ
ｌの部分にくる、すなわちレトロウィルスと似た浮上密
度を持つというものであった．続いて、Ｐｒｉｎｃｅら
は、チンパンジー肝初代培養細胞に患者血清を接種して
、レトロウィルス様粒子が見られたと報告した［　Ｐｒ
ｉｎｃｅ，Ａ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｌａｎｃｅｔ．　
Ｉ：ｐｌ０７１−１０７５　（１９８４）］．　Ｌかし
ながら、逆転写酵素活性はＨｏｌｌｉｎｇｅｒらの追試
により否定された［Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ　ａｔ　ａｌ．
，　Ｌａｎｃｅｔ，Ｉ　ｐ４１　（１９８６）］．　　
更に、Ｐｒｉｎｃｅらの観察したウィルス粒子はミクソ
ウィルスの混入として否定された． 非Ａ非Ｂ型肝炎の研究を困難にしている問題点は、血清
中のウィルス濃度が１０２〜１０３と低いこと、同じ接
種材料で再感染を起こしたチンパンジーがあるなど、抗
体の存在が疑がわしいこと、感染実験モデルがチンパン
ジー、マーモセットしかいないことなどである． 最近になって米国のカイロン社が、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルスのｃＤＮ＾を捕らえたという報告があったが［Ｃｈ
ｏｏ，Ｑ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４４
，　Ｐ３５９−３６２（１９８９），　　Ｋｕｏ，Ｇ．
　　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，　　２４４．　　
ｐ３６２−３６４（１９８９）　］、ウィルスそのもの
の性状、シークエンス情報、ウィルス構或蛋白の性状な
どはまだ一切明らかにされていない。

一般に、ウィルスの違いは、その免疫血清学的性状の違
い、分子遺伝学的性状の違いより診断方法がまったく異
なってくる．また、株の違いは、免疫血清学的性状が一
部異なるため同一の診断方法では株間の違いにより検出
感度の違い、ワクチンでは免疫原性、感染防御能の違い
が出てくる．分子道伝学的診断方法、たとえばＤＮＡブ
ローブ診断においては、プローブとウィルス核酸の間の
ハイブリダイゼーションは核酸レベルでのホモロジーが
非常に高くないと実用的ではないことが一般に知られて
いる．すなわち、林間での核酸レベルでの差異により、
ＤＮＡのハイブリダイゼーションが起こらず、ＤＮＡプ
ローブ診断が効果的にできないケースが考えられる． 血清型の肝炎として、よく知られ、既によく解析されて
いるＢ型肝炎においては、欧米、東南アジア等の地域ご
とにメジャーなＢ型肝炎ウィルスのサブタイプ、すなわ
ちその地域に特徴的な流行株〈サブタイブ）が存在する
ことが知られていることから、本発明の対象となる非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルスにおいても地域に特有なウィルス種
、もしくはウィルス株等が存在することが考えられる。

したがって、特定の地域、例えば特に日本で流行してい
る非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの診断方法、予防方法を確立
するには、日本でメジャーな非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス株
を捕らえる必要がある．免見立旦１ このような状況のもとに、本発明者らは、非Ａ非Ｂ型肝
炎の原因ウィルスもしくはそのウィルス遺伝子のクロー
ニングを目的として研究を重ねた結果、肝炎患者血清よ
り非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗原ペプチド配列をコード
している遺伝子をクローニングすることに成功した． すなわち、本発明者らは、献血者のＧＰＴ高値血漿を用
いて、従来の免疫血清学的方法とは違った新しい分子遺
伝学的手法を取り入れたイムノスクリーニング法により
、ついに非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに特有なペプチドをコ
ードしている遺伝子をクローニングした．さらに、この
遺伝子断片を遺伝子組換え技術を用いて発現させ得られ
た発現産物が、非Ａ非Ｂ肝炎患者血清と蛋白レベルにお
いても特異的に反応することを確認し、本発明を完成す
るに至った． 日） 本発明の目的とするような核酸断片をクローニングする
に際しては、研究材料として非Ａ非Ｂ型肝炎に感染した
日本人の肝臓、並びに非Ａ非Ｂ型肝炎を感染させたチン
パンジーの肝臓を用い、ｍＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを合
成して、その中から、染色体ＤＮＡとのサブトラクショ
ンによりウィルス特異的ｃＤＮＡを選択してくることが
考えられる．しかしながら、これに必要な良い実験材料
を十分な量確保することはきわめて困難である．もう一
つの研究材料として非Ａ非Ｂ型肝炎感染者あるいは感染
チンパンジーのの血漿が考えられる．ヒトでは非Ａ非Ｂ
型肝炎のキャリアーの存在が確認されており、輸血にお
いて供血者のＧＰＴ値が高い程輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎の
発生頻度が高いことからＧＰＴ高値の血漿はキャリアー
の頻度が高いと推定されている．そこで我々は比較的多
量に入手可能である、日本の献血者のＧＰＴ高値血漿を
プールし、研究材料とした．このほか、日本人の非Ａ非
Ｂ型肝炎患者の血清を接種し非Ａ非Ｂ型肝炎を発症させ
たチンパンジーの血漿も用いることができるが、現在で
はチンパンジーの入手性から多少問題が残る． 血漿中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス濃度は先に述べたよう
に１０２〜１０３程度しかないと推定されていることか
ら、ウィルス核酸の抽出およびｃＤＮＡの合成には１０
００倍程度ウィルスを濃縮する必要がある．しかしなが
ら、ヒト血漿は７％前後の蛋白溶液であり、ただ単に濃
縮することは不可能であり、除蛋白をしながらウィルス
を′ｌ！４ｍする必要がある．我々が用いたポリエチレ
ングリコール（ＰＩＥＧ）などの沈澱剤による沈澱形或
は、比較的簡便に行うことができ、大量の血漿の処理に
も適しており、ウィルスの失活も少ないマイルドな方法
である．このほかには、超遠心によるベレッテイング、
硫安などの塩類の添加による塩析、限外濾過、ゲルクロ
マトグラフイーなどが用いられうる．このように１００
０倍程度に濃縮した血漿をグアニジウムチオシアネート
で処理し、フェノール／クロロホルムで抽出をおこない
、エタノール沈澱により濃縮血漿中の全核酸を精製する
．次にＤＮＡ分解酵素で混入しているヒト由来のＤＮＡ
を分解し、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール
沈澱によりＲＮＡを精製する． 精製したＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、λｇｔｌｌベク
ターに挿入しｃＤＮＡライブラリーを作成する． λファージを大腸菌に感染させ、細菌培養プレートにま
き、４２℃で数時間培養する．その後ニトロセルロース
フィルター（ＮＣフィルター》をかぶせ数時間培養し、
ＮＯフィルターをはがしレプリカをとる． このレプリカをプロキッング液で処理し、ＰＢＳなどで
洗浄した後イムノスクリーニングを行う．すなわち、レ
プリカを非Ａ非Ｂ型肝炎回復期あるいは急性期のヒトま
たはチンパンジー血清と反応させ、ＰＢＳなどで洗浄後
、酵素標識抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭと反応させ、洗浄
後、基質溶液と反応させて発色させる．発色したブラー
クに対応するファージを選び二次スクリーニングを行い
、再現性のあるクローンを得た． このクローンについて非Ａ非Ｂ型肝炎特異性を調べた， 非Ａｌｌ−Ｂ型肝炎回復期、キャリア一期、および正常
期のチンパンジーのＩｇＧを用いてプラークイムノアッ
セイを行った結果非Ａ非Ｂ型肝炎キャリア一期に特異性
の高いクローンを得ることができた．このクローンをサ
ブクローニングし、アガロースゲル電気泳動で０．　２
８Ｋｂｐの挿入断片〈Ｃ８２５）を確認した． チンパンジーの正常期及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期の肝臓
、並びに正常人の白血球より染色体ＤＮＡを精製し、ア
ガロース電気泳動を行った後、３２ｐ標識したＣ８２５
クローンを用いてサザンハイプリダイゼーションを行っ
た，Ｃ８２５はいずれのＤＮＡとも反応せず、したがっ
てＣ８２５は染色体由来ＤＮＡでないと判明した． また、日本人のＧＯＴ，ＧＰＴ高値血漿のプール（非Ａ
非Ｂ型肝炎感染性がチンパンジー感染実験で確認されて
いる）、アメリカＮＩＨ由来Ｆ株の非Ａ　ｌｌ−　Ｂ型
肝炎を継代したチンパンジー血漿および日本の正常人血
漿からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合戒し、Ｃ８２５ク
ローンの塩基配列の一部をプライマーとしてＰＣＲ反応
［ＳＡｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９．
　ｐ４８７−　（１９８８）］を行った．同様に正常ヒ
ト肝臓よりＤＮＡを抽出し同じプライマーを用いてＰＣ
Ｒ反応を行った．その結果、日本人のＧＯＴ，ＧＰＴ高
値血漿のプールのみからＣ８２５塩基配列が検出された
．このことは、我々が捕らえたＣ８２５の塩基配列を含
む非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスは、米国ＮＩＨ由来Ｆ株の非
Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスと核酸配列上かなり相違があるこ
とを示唆している． 本発明の０８２５クローンのＤＮＡ配列は、ジデオキシ
法により決定された．その結果Ｃ８２５クローンは非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子由来の計２６９ｂＰのｃＤＮ
Ａ断片であり、その塩基配列は第３図に示される通りで
あった．このＤＮＡ配列をアミノ酸に読み直すと、１フ
レームだけが途中でストップコドンが出す、これがオー
ブンリーディングフレームの一部であることがわがった
．この塩基配列とアミノ酸配列をデータベース（　Ｇｅ
ｎｅｔｙｘ−ＣＤソフトウェア開発　１９８９）で検索
したところ、現在まで知られているウィルス、細菌、そ
の他ホモロジーを示すものはなかった． このアミノ酸配列から、ＨＯＰＰ　＆　ＷＯＯＤらの手
法に基づき、Ｃ８２５がコードずるペプチドの親水性・
疎水性のパターンを解析した．その結果、第５図に示す
ような結果が得られ、このペプチド領域は、全体的に親
水性の強いペプチドであることが確認された．さらに、
この８９個のアミノ酸がらなるペプチドの中には、特に
親水性の強い４つの領域が存在することが確認された． このように、本発明で得られたＣＤＮＡＩＴ片が、非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルス抗原のうち親水性の強いペプチド領
域をコードするものであったことは、免疫学的見地から
も非常に意義深いものと思われた．また、このような親
水性のべブチドは取扱が容易になることから、実用性の
面からも非常に有用である． 本発明では、非Ａ　非　Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド
の好ましい一例として、第４図に示すような８９個のア
ミノ酸からなるペプチドを開示するのみならず、その中
でも特に非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原性と深い関連があ
ると考えられる上記で述べた親水性の強い４つの非Ａ非
Ｂ型肝炎ウィルス抗原エビトープをも開示するものであ
る．そのような抗原エビトーブは、下記の（Ａ）〜（Ｄ
）のアミノ酸配列である． （Ａ）　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａ
ｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ，（Ｂ）　Ｔｈ
ｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ
　Ａｓｐ　Ａｌａ，（Ｃ）　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　
Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖ
ａｌ，（Ｄ）　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ＾ｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ第５図の解析パターンにも示
されたとうり、上記のアミノ酸配列のペプチド領域は、
特に親水性の強いペプチドであることが確認される。

非Ａ　ＩＰＢ型肝炎との関連性をさらに確認するために
、多数の肝炎患者、正常人の血清を用いてＣ８２５に対
するプラークイムノアッセイ及びドットイムノアッセイ
を行った．その結果、正常人、Ｂ型肝炎、その他の肝炎
の群に比べ非Ａ非Ｂ型肝炎患者で高率に抗体陽性者が検
出され、イムノアッセイにより蛋白レベルでも非Ａ非Ｂ
型肝炎に対する特異性が証明された． 本発明の遺伝子配列は、これを適当な発現系を用いて発
現させ、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗体検査に使用する
ことができるし、また、発現した蛋白を動物に免疫して
抗体を作らせ、これを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎感染患者の
肝組織中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを検出することも可
能である．さらに、本発明で得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
ィルスは、感染予防のためのワクチンの作製に極めて有
用である． また、遺伝子配列そのものは、非Ａ非Ｂ型肝炎のＤＮＡ
プローブ診断キットの開発に極めて有用である． このような、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプ
チドをコードする核酸断片、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗
原ペプチドおよびこれらを利用した非Ａ　ｉｌＰ　Ｂ型
肝炎ウィルスの各種検出方法は、特に日本における非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルスの検出において極めて有用であると
考えられる．以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に
説明する． 日本赤十字社より供与された、ｔ｛Ｂｓ抗原陰性でＧＰ
Ｔ値１００以上のヒトブール血漿（約８．２１１１）を
以下の方法で１０００倍に濃縮した．まず、ヒトブール
血漿を粗遠心し、不溶物を除去した．これに　１７１０
量の５Ｍ塩化ナトリウム液、次いで、ｌ／１０量の４０
％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコール液（ＰＥＧ６００
０、和光純薬社製、平均分子量７５００）を４℃にて攪
拌しながら添加した．一時間静置したのち、７０００回
転、２０分間遠心分離して上清を除き、沈渣に元の血漿
の約１７２０量のＴＮＥ液（　１０＋ｏＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ．ｐＨ７．４、１＋＋＋ＭＥＤＴＡ，　　１４０
ｍＭ　ＮａＣＩ）を加え、再溶解した。この溶液を，庶
糖の２０％、１５％、１０％および５％ＴＮＨ液を段階
的に重層した遠心管の頂部に重層し、４℃、８００００
ｘ　Ｇで、１２時間超遠心分離した．分ｍ後、上清を除
去し、沈渣を８ｍｌのｐｕｓに溶解してＧｆｆｒ．ＧＰ
Ｔ高値ヒトプール血漿の１０００倍濃縮物とした．まず
、前記の１０００倍濃縮血漿８ｍｌに５倍量のグアニジ
ウムチオシアネート溶液（４Ｍグアニジウｌ１チオシア
ネート、５０＋＊Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ非ｌｌ７．６、
１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ２−メルカプトエタノー
ル、２％ザルコシル）を加え、攪拌した後フェノール／
クロロホルム抽出し、グリコーゲンをキャリアーとして
エタノール沈澱により濃縮血漿中の全核酸を精製した．
次に、この全核酸中に存在するヒト由来のＤＮＡを分解
するために、２ｍＭバナジルリボヌクレオチッドコンプ
レックス存在下、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ　１．１
５ＫＵ／ｍｌ（ヘ−ＩＪンガー／マンハイム社製）、５
０＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−■ＣＩ　ｐＨ７．４、１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ａの混液４００ＪＡ中にて、
３７℃、３０分間処理した．その後、２５ｈＭ　ＥＤＴ
Ａ液１６ＩＡ、１０％ＳＤＳ液８Ａを加え反応を停止し
、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱によ
りＲＮＡを精製した．さらに、このＲＮＡ中に存在する
多量のグリコーゲン及び微量に存在すると思われる不純
物を除くために、ＱＩＡＧＲＮ　ｐａｃｋ−１００　（
　ＤＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製操作を行った．ｃＤ
ＮＡ”−　　　　　−　１　　− 前記までの方法で精製したＲＮＡすべてを、ｃＤＮ＾合
成システムブラス（アマシャム社製〉を用いてｃＤＮＡ
合戒を行った．次に、合成したｃＤＮＡをｃＤＮＡクロ
ーニングλｇｔｌｌ　（アマシャム社製）にまり＾ｇｔ
ｌ　１ベクターにクローニングした，　　ｉｎ　ｖｌｔ
ｒｏパ・７ケージングの結果：　　ｔ．２ｘｔｏ６プラ
ークフオーミングユニット（ＰＦＵ）のライブラリーを
得た．（４〉非Ａ非ＢＷ肝炎（　ＮＡＮＩｌ［Ｉ　）回
復期及びキャリアパ′：”　−　　　　　ＮＡＮＢＨ　
　　スローゝのス　｝一二ゝ ｃＤＮ＾ライブラリーのスクリーニングに用いる一次抗
体はＮ　Ａ　Ｎ　ＢＩ１回復期及びキャリア一期のチン
パンジー血漿であることから、高い非特異反応が予想さ
れた．そこで、この非特異反応を抑えるためにスクリー
ニング用チンパンジー血漿の吸収操作に用いる大腸菌Ｙ
１０９０のライゼートを調製した。即ち、単一コロニー
からアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［１％
Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｔｏｎｅ　（ジフコ社製）、０６５
％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　（ジフコ
社製〉、１％ＮａＣｌ，ＰＨ７、５］中で３７℃、一夜
培養した大腸菌Ｙ１０９０培養液２０＋ａｌを２９のＬ
ＩＩ培地に加え、さらに３７℃で一夜培養した．この培
養液を遠心管に移し、９０００回転、１０分間、４℃で
遠心分離し、上清を除去して沈渣を得た．この沈渣１ｇ
当り４＋ｌのＲＩＰＡ液〈１％デオキシコール酸ナトリ
ウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、　０．３ＭＮａ
Ｃｌ，０．１％ＳＤＳ、０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
ｐ［｛７．５、１ｍＭ　ＰＭＳＦ）を加えて可溶化し、
これをさらに９０００回転、１０分間、４℃で遠心分離
してその上清を大腸菌ライゼートとした． Ｂ．　　ス　１−ニン 償襄 Ｇ面、ＧＰＴ高値ヒトプール血漿濃縮物中のＲＮＡより
構築したｃＤＮＡライブラリーから、一枚のＬＢプレー
｝［１．５％Ａｇａｒ　（日水製薬社製）、１％Ｂａｃ
ｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０、５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａ
ｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，１％ＮａＣｌ　ｐＨ７．５、５
０μｇ／＋ｏｌアンビシリンの入った細菌培養用プレー
ト（ヌンク社製；　　２３ｃ＋＊Ｘ　２３ｃｍ）　］当
りＩＯＯＯＯＰＦＵノファージをとり、大腸菌Ｙ１０９
０に３７℃で１５分間感染させて、Ｔｏｐ　Ａｇａｒ　
４０ｍｌ　（０．７％Ａｇａｒ、１％Ｂａｃ　ｔｏｔｒ
ｙｐｔｏｎｅ１０．　５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅ
ｘｔｒａｃｔ＋１％ＮａＣｌ，ｐ［１７．５、５０μ９
／ｍｌアンビシリン）と共にまき、４２℃で４〜５時間
培養した．その後、１０ｍＭ　ＩＰＴＧ　（シグマ社製
〉を染みこませたニトロセルロースフィルター（ＮＣフ
ィルター：　　Ｓ＆Ｓ社製、Ｃｏｄｅ　ＢＡ８５、　２
３ｃｍＸ２３ｃｍ）をかぶせ、さらに３７℃で培養を続
けた．３時間後ＮＣフィルターをプレートからはがし，
　ＰＢＳで洗い、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％スキムミル
ク、０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ溶液）に浸し、４
℃で一夜振とうしＣ　　　　　ス　　１　−二・ ブロッキンダ液中で一夜浸したレプリカフィルターをＰ
ＢＳで洗浄後、ＰＢＳでｌＯ倍に希釈したＮＡＮＢ［｛
回復期及びキャリア一期のチンパンジープール血漿（ス
クリーニング用血漿）　　［ＮＡＮＢＨ回復期及びキャ
リア一期のチンパンジープール血漿をＰＢＳで５倍希釈
し、ｌ／２０量の大腸菌ライゼートを加えて４℃で一夜
非特異反応の吸収操作を行い、さらにＰＢＳで２倍希釈
した．］に浸し、室温で振とうしながら反応させた．２
時間後、ＰＢＳ−Ｔ　（　０．　０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳ溶液）で、一回につき１５分間、計３回レ
プリカフィルターを洗浄の後、各々１０００倍希釈した
べルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧとＩｇＭヤギ抗体（
　ＭＢＬ社製、Ｆａｂ）の入ったインキュベーションバ
ッファ−（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ溶液）に
浸し、３７℃で振とうしながら反応させた．１時間後、
ＰＢＳ−Ｔで一回につき１５分間、計４回、その後ＰＢ
Ｓで５分間−，一洗浄後、発色液［　０．　０２％ＤＡ
Ｂ　（シグマ社製）、０．１％ＮｉＣｈ・６ｊ１２０、
０．００５％１１２０２］に浸し発色させた．ＮＣフィ
ルター上で発色したブラークに対応するフ゛アージを選
び、二次スクリーニングを行った．即ち、一次スクリー
ニングで選択した各ファージ２００ＰＦＵを別々に挿入
断片のないファージ２００ＰＦＵと共に大腸菌Ｙ１０９
０に感染させ、９０ＩＩＩ１シャーレ（ベクトンディッ
キンソン社製）のＬＢプレートにまき直し、レプリカフ
ィルターを作製した．これらを上述の方法で抗体スクリ
ーニングし、ＮＡＮＢＨ回復期及びキャリアー期のチン
パンジー血漿と再現性よく反応するファージを３クロー
ン（Ｃ８−２、ＣＩＯ−１，Ｃ１６−１）　得た． 体反応にチンパンジーのＩｇＧ分画を用いる場合には５
０μ９／巨１の濃度にＰＢＳで希釈し、１／２０量の大
腸菌ライゼートを加え、４’Ｃで一夜非特異反応の吸収
処理をして使用した． プラークアッセイの結果、２クローン（ＣＩＯ−１．Ｃ
１６−１　＞については正常チンパンジー血清中の抗体
とも反応し、ＮＡＮＩＩＩＩに対ずる特異性は低かった
．しかし、Ｃ８−２はＮＡＮＢＨキャリア一期のチンパ
ンジー血清あるいはＩｇＧ分画と高率に反応し、正常チ
ンパンジーの血清あるいはＩｇＧ分画とは全く反応しな
かった．その結果を６１に示す。

表　　１ （４〉で得た３種のクローンについて、（４）．Ｃの２
次スクリーニングと同様にレプリカフィルターを作製し
、ＮＡＮＢＨ回復期、キャリア一期及び正常のチンパン
ジー血清又は、硫安沈澱後ＤＥＡＥ−セルロファイン力
ラム（生化学工業社製）で精製したＩｇＧ分画を用いて
プラークアッセイを行った．その方法は抗体スクリーニ
ングの場合と同様であるが、一次抗正常 ０／８　　　　　　　　２／８ ＮＡＮＢＨ回復期　　　　　　ｌ／６４／６ＮＡＮＢ［
ｌキャリア一期　　３／４　　　　　　２／４この結果
から、Ｃ８−２は特にＮＡＮＩＩＩＩキャリア一期のチ
ンパンジー血清に特異性の高いクローンである？いえる
． このＣ８−２のファージＤＮＡを精製［実験医学臨時増
刊号、遺伝子工学総集編■（１１〉、Ｐ３１−３２　（
１９８７）参照コし、制限酵素ＥｃｏＲＩ　（東洋紡社
製）切断後ｐＵｃ１１８ベクターのＥｃｏＲ１部位に挿
入し、サブクローニングを行った［　Ｄｏｕｇｌａｓ　
ｌｌａｎａｈａｎ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．出，
　Ｐ５５７−５８０（１９８３）参照］．このサブクロ
ーニングしたブラスミドｐＣ８２５をＥｃｏＲｒ切断後
、電気泳動で２％アガロースゲルに展開したところ、約
０．２８Ｋｂｐの挿入断片（Ｃ８２５）が確認できた（
第１図）．Ｃ　　　いｔ・　　　　口 下記のとうり、Ｃ８２５を用いたサザンプロット分析を
行った．チンパンジーの正常及び米国ＮＩＨ由来Ｆ株感
染ＮＡＮＢ［｛急性期（ＮＡＮＢＨウィルス接種後８３
！１目〉の肝臓、さらに正常人の白血球より染色体ＤＮ
Ａを精製し、各々２０μ９をＥｃｏＲＩで切断後、電気
泳動で１％アガロースゲルに展開し、ＮＣフィルターに
転写した．このフィルターをマルチプライム法で［　９
２ｐ］標識したＣ８２５ブローブを用いサザンハイブリ
ダイゼーションを行った（第２図）．この図からわかる
ように、Ｃ８２５プローブは、一週間オートラジオグラ
フィーすると、サブクローニング前のｃ８−２クローン
とは反応するが、正常及びＮＡＮＩＩＨ急性期のチンパ
ンジーの染色体ＤＮＡあるいは正常なヒトの染色体ＤＮ
Ａとは反応しながった．このことがら、ｃ８２５はヒト
の染色体ＤＮＡ由来のクローンではなく、ウィルス等の
外来性の核酸由来のものであると考えられる． Ｃ８２５の遺伝子断片を組み込んだブラスミドＤＮＡを
鋳型とし、　［　ａ　−３２Ｐ］　ｄＣＴＰ　（８００
Ｃｉ／　ｍ　ｍｏｌ）を反応に用いた，　　Ｋｌｅｎｏ
ｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔによるポリメラーゼ反応は宝酒造
の７ＤＥＡＺＡシーケンシングキッ１〜によって行った
．８％のポリアクリルアミドー８Ｍウレアゲルを用いて
、４時間１８００Ｖ″Ｃ′電気泳動し１６時間感光した
． Ｂ　　　　ｆ−　　　　　　　　　　　≧ノ上記の結果
得られた塩基配列とそれがら予測されるアミノ酸配列の
解読の結果をそれぞれ第３図、第４図に示した． Ｃ８２５の予測されるアミノ酸配列の親水性／疎水性プ
ロフィールを第５図に示す． 得られた塩基配列及びアミノ酸配列をデータベース（前
述〉で検索した結果、ウィルス、細菌その他高いホモロ
ジーを示すものはなかった．Ｃ８２５クローンを取るた
めの材料となったＧｆｆｒ，　　ＧＰＴ高値ヒトプール
血漿、米国ＮＩＨ由来のＮＡＮＢＨのＦ株を接種し慢性
化したチンパンジーの血漿（感染性は確認ずみ〉、正常
ヒト血漿およびヒト肝臓由来の染色体ＤＮＡについて，
　　ＰＣＲ反応を用いてＣ８２５塩基配列の検出を行っ
た．まず、各血漿については、各々Ｌｓｌを　（１）項
と同様に、５Ｍ塩化ナトリウム液と４０％（Ｗ／Ｗ）ポ
リエチレングリコール液を用いて沈澱させ、この沈渣に
５００−のグアニジウムチオシアネート溶液を加え、フ
ェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱により全
核酸を精製した．これを、５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−■Ｃ
ｌ　　ｐ［（８．３、　　６ｍＭ　　ＭｇＣＩ２、　　
４０ｍＭ　　ＫＣＩ，　　　１ｍＭ　ＤＴｒ，　　１ｍ
Ｍ　ｄＮＴＰｓ、１．　３ＫＵ／ｍｌ　ＲＮａｓｉｎ、
３０ｍｇ／ｍｌランダムフライマ−　，　４ＫＵ／ｍｌ
逆転写酵素（　ＢＲＬ社製）の混液２０Ｊ中で、３７℃
、１時間３０分間反応させた．この反応液ＩＡをとり１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐｌｒ８．３、５０ｍＭＫ
ＣＩ．ｌ、５ｍＭ　ＭｇＣＩ２、０．０１％（ｗ／ｖ）
ゼラチン、１００ｎＭｄＮＴＰｓ、２５０ｎＭプライマ
−（第６図にその位置を示す）　２０Ｕ／ｇｚｌ　Ｔａ
ｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの混液５０Ａ中で、９４℃；
３０秒、５５℃；３０秒、７２℃；　１分をｌサイクル
として４０サイクル反応させたくバーキン・エルマー・
シータス社製のサーマルサイクラーを使用〉．またヒト
肝臓由来の染色体ＤＮＡについては、１０μ９を上記組
成の反応液中で、上記と同一条件下でＰＣＲ反応を行っ
た，　　ＰＣＢ反応後、各サンプル共５ＪＡを取り、電
気泳動により２％アガロースゲルに展開し、ＮＣフィル
ターに転写した。このフィルターを［　３２Ｐ］標識し
たＣ８２５内のオリゴブローブ〈第６図にその位置を示
す〉を用いてハイブリダイゼーションを行った．その結
果Ｃ８２５塩基配列は、材料となったＧｆｆｒ、ＧＰＴ
高値ヒトプール血漿がらは検出されたが、正常ヒト血漿
、米国ＮＩＨ由来Ｆ株のチンパンジー血漿及び染色体Ｄ
ＮＡ中には検出されなかった（第７図）．（４）と同様
にして日本の肝炎患者血清を用いて、Ｃ８２５クローン
の非Ａ非Ｂ型肝炎に対する特異性をブラークアッセイに
よって調べた．その結果を下記の表２に示す． 表　　２ 患者血清 急性非Ａ非Ｂ型肝炎 慢性非Ａ非Ｂ型肝炎 急性Ｂ型肝炎 慢性Ｂ型肝炎 急性Ａ型肝炎 陽性／検体 ５／３９ １　２／３　１ ０／２　０ １／２０ ０／２０ 陽性率（％） １２．８ ３８．７ ０，０ ５．０ ０．０ 大腸菌Ｙ１０８９をアンビシリン（Ａｐ）含有（５０μ
ｇ／■ｌ）ＬＢで培養し、λｇｔｌｌファージおよびＣ
８−２ファージを多重感染価（ｍｏｉ）１０で３７℃１
５分間吸着させる，ＬＢプレート（＾ｐ含有〉上にコロ
ニーを形成させ、爪楊枝でコロニーをつりあげ３０℃と
４２”ＣのＬＢプレートに移して培養する．３０℃で生
育するが４２℃では生育しないコロニーを選択した．λ
ｇ　ｔ　１１，　　λＣ８−２由来のライソゲンをおの
おのＬλ１１、ＬλＣ８−２とする． これらのライソゲンを１（１＋ａｌＬ　Ｂ培地（Ａｐ含
有）中で３０℃で培養し、１麿Ｍ　ＩＰＴＧを添加する
ことによりラクトースオベロンの発現を誘導した後、集
菌する．菌体をｌｍｌＲＩＰＡ液に溶解し、１ｇのガラ
スビーズを加え、ボルテックスミキサーで破砕し、その
上清を集め、ライソゲン抽出液としてドットアッセイに
用いた． 調製したライソゲン抽出液をニトロセルロースフィルタ
ーに５μ１スポットした．乾燥後、プロッキング反応か
ら発色反応までは（４）と同様に行った．その結果、Ｌ
λＣ８−２抽出液とは反応し、Ｌλｌ１抽出液とは反応
しない血清を陽性と判定したく第８図参照〉．この判定
結果を表３に示す．表　　３ 血　　清 陽性／検体 陽性率（％） 正常人　　　　　　　　０／１７　　　　０．０非Ａ非
Ｂ型肝炎患者　１５／２９　　　５１．７Ｂ型肝炎患者
　　　　　１／９　　　　１１．０その他の肝炎患者　
　　○／８　　　　０，○以上のように、非Ａ非Ｂ型肝
炎の患者群においては陽性率が５１．７％と非常に高率
であるのに対し、正常人、Ｂ型肝炎患者およびその他の
肝炎では陽性率０．０％、１１．　０％、０．０％と極
めて低く、本発明のＣ８２５クローンが非Ａ非Ｂ型肝炎
特異的である事が示された．

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明においてクローニングしたＰＣ８２５
のＥｃｏＲＩ挿入断片の２％アガロース電気泳動展開後
の模式図である． 第２図は、本発明においてクローニングしたＣ８２５と
ヒ１・及びチンパンジーの染色体ＤＮＡとのサザンハイ
ブリダイゼーションの模式図である．第３図は、本発明
でクローニングしたＣ８２５の塩基配列を示す． 第４図は、本発明でクローニングしたＣ８２５がコード
する全アミノ酸配列を示す． 第５図は、アミノ酸配列を基にした、Ｃ８２５がコード
するペプチドの親水性・疎水性プロフィールを示す． 第６図は、実施例（８）におけるＰＣＲ反応に使用した
Ｃ８２５塩基配列中のブライマー及びオリゴブローブの
位置を示したものである．

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドをコードす
   る核酸断片。
2. （２）前記非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスペプチドが、下記の
   （Ａ）から（Ｄ）のアミノ酸配列からなる群から選ばれ
   る少なくともひとつのアミノ酸配列を含むペプチドであ
   る前記第（１）項記載の核酸配列。 （Ａ）【遺伝子配列があります】 （Ｂ）【遺伝子配列があります】 （Ｃ）【遺伝子配列があります】 （Ｄ）【遺伝子配列があります】
3. （３）下記の（Ａ）〜（Ｄ）の核酸配列からなる群から
   選ばれる核酸配列を少なくともひとつ含む前記第（２）
   項記載の核酸配列。 （Ａ）【遺伝子配列があります】 （Ｂ）【遺伝子配列があります】 （Ｃ）【遺伝子配列があります】 （Ｄ）【遺伝子配列があります】
4. （４）前記非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドが、下
   記のアミノ酸配列を含むペプチドである前記第（２）項
   記載の核酸断片。 【遺伝子配列があります】
5. （５）下記の塩基配列を含む上記第（４）項記載の核酸
   断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
6. （６）下記の（Ａ）から（Ｄ）のアミノ酸配列からなる
   群から選ばれるアミノ酸配列を少なくともひとつ含む非
   Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 （Ａ）【遺伝子配列があります】 （Ｂ）【遺伝子配列があります】 （Ｃ）【遺伝子配列があります】 （Ｄ）【遺伝子配列があります】
7. （７）下記のアミノ酸配列を含む前記第（６）項記載の
   非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】
8. （８）該ペプチドが、化学的に合成されたペプチドであ
   る前記第（６）項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペ
   プチド。
9. （９）該ペプチドが、前記第（１）項の核酸断片を適当
   な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞内で発現さ
   せることにより得られるペプチドである前記第（６）項
   記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。
10. （１０）下記の塩基配列に含まれる少なくとも１０塩基
    以上の核酸断片からなることを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝
    炎ウィルス遺伝子検出用核酸プローブ。 【遺伝子配列があります】
11. （１１）上記第（１０）項の核酸プローブを用いて、対
    象となるサンプルのＤＮＡとハイブリダイゼーションさ
    せることを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの検出方
    法。
12. （１２）上記第（６）項記載のペプチドを抗原として調
    製される抗非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体。
13. （１３）該ペプチドが上記第（７）項記載のペプチドで
    ある前記第（１２）項記載の抗体。
14. （１４）上記第（１２）項記載の抗体を用いることを特
    徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの免疫学的検出方法。