WO2007125954A1 - Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 - Google Patents

Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007125954A1
WO2007125954A1 PCT/JP2007/058941 JP2007058941W WO2007125954A1 WO 2007125954 A1 WO2007125954 A1 WO 2007125954A1 JP 2007058941 W JP2007058941 W JP 2007058941W WO 2007125954 A1 WO2007125954 A1 WO 2007125954A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
amino acid
activity
strain
pyre
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/058941
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoko Asakura
Yuri Nagai
Takuji Ueda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Priority to DK07742376.2T priority Critical patent/DK2017332T3/da
Priority to AT07742376T priority patent/ATE554159T1/de
Priority to EP07742376A priority patent/EP2017332B1/en
Publication of WO2007125954A1 publication Critical patent/WO2007125954A1/ja
Priority to US12/258,630 priority patent/US8293505B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Definitions

  • Microorganism producing L-amino acid and method for producing L-amino acid are Microorganism producing L-amino acid and method for producing L-amino acid
  • the present invention relates to a method for producing an L amino acid using a microorganism, and more particularly, to a method for producing an L amino acid such as L lysine, L-threonine, L glutamic acid.
  • L-lysine and L-threonine are industrially useful L-amino acids as additives for animal feeds, health food ingredients, amino acid infusions, etc.
  • L-Daltamate is a seasoning.
  • L-amino acids are industrially produced by fermentation using microorganisms belonging to the genera Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia and the like.
  • a method for producing L-lysine for example, methods described in Patent Documents 1 to 8 can be mentioned.
  • strains isolated from natural forces or artificial mutants of these strains, and microorganisms modified to enhance the activity of basic L amino acid biosynthetic enzymes by recombinant DNA technology are used. Being
  • Fluororibosyltransferase [EC: 2.4.2.102.10] is an enzyme of the pyrimidine biosynthesis system and is encoded by the pyrE gene. PyrE has a rph (encoding RNase PH) upstream of it and an operon. In Escherichia coli MG1655 and W3110, there is a frameshift of 3 in the coding region of rph and 1 in the terminal region. It is thought that the expression level of is insufficient, resulting in pyrimidine starvation. (Non-Patent Document 1)
  • Patent Document 1 European Patent No. 0643135
  • Patent Document 2 European Patent No. 0733712
  • Patent Document 3 European Patent Application Publication No. 1477565
  • Patent Document 4 European Patent Application Publication No. 0796912
  • Patent Document 5 European Patent Application Publication No. 0837134
  • Patent Document 6 International Publication No. WO01 / 53459 Pamphlet
  • Patent Document 7 European Patent Application Publication No. 1170376
  • Patent Document 8 International Publication No. WO2005 / 010175 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401-3407 Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide a strain belonging to the family Enterobacteriaceae that can efficiently produce L-amino acids, and to provide a method for efficiently producing L-amino acids using the strain.
  • the present invention is as follows.
  • a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae which has an ability to produce L amino acid and has been modified so that phosphorate phosphoroyltransferase activity is enhanced.
  • the microorganism having enhanced activity of phosphoribosyltransferase activity.
  • Orotate phosphororiboribonucleic acid The microorganism having enhanced syltransferase activity.
  • microorganism which is a protein according to the following (A) or (B):
  • L-amino acid strength L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoleucine, L-parin, L-leucine, L-threonine, L-ferulanin, L-tyrosine, L-tritophan, L-cysteine and L-glutamic acid strength
  • a method for producing an L amino acid comprising culturing the microorganism in a medium, producing and accumulating the L amino acid in the medium or in the fungus body, and recovering the L amino acid from the medium or the fungus body.
  • L-amino acid power L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoorcinine, L-parin, L-leucine, L-threonine, L-ferulalanin, L-tyrosine, L-tributophane, L-cysteine and L
  • the said method which is 1 type, or 2 or more types of L-amino acids from which the group power which also becomes glutamate power is selected.
  • the microorganism of the present invention is a microorganism having an L-amino acid-producing ability and belonging to the family Enterobacteriaceae, which has been modified so that the activity of orthophosphate phosphoribosyltransferase is enhanced.
  • the L-amino acid-producing ability refers to the ability to produce and accumulate L-amino acids to the extent that the microorganisms of the present invention can be recovered in the medium or microbial strength when cultured in the medium.
  • the microorganism of the present invention may be capable of producing a plurality of L amino acids. Microorganisms capable of producing L amino acids may be inherently capable of producing L amino acids, but the following microorganisms can be obtained by utilizing mutation methods or recombinant DNA technology. It may be modified so as to have an amino acid-producing ability.
  • L-amino acid is not particularly limited, but basic amino acids such as L-lysine, L-ornithine, L-arginine, L-histidine, L-citrulline, L-isoleucine, L-alanine, Aliphatic amino acids such as L-parin, L leucine, and glycine, amino acids that are hydroxymonoaminocarboxylic acids such as L-threonine and L-serine, cyclic amino acids such as L-proline, L-ferulanin, L-tyrosine, L Aromatic amino acids such as tryptophan, sulfur-containing amino acids such as L-cysteine, L-cystine and L-methionine, and acidic amino acids such as L-glutamic acid, L-aspartic acid, L-glutamine and L-asparagine.
  • basic amino acids such as L-lysine, L-ornithine, L-arginine, L-histidine, L-
  • L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoleucine, L-parin, L-leucine, L-threonine, L-ferulanine, L-tryptophan, L-cysteine, and L-glutamic acid are preferred.
  • L-glutamic acid and L-threonine are particularly preferred.
  • microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae such as Escherichia bacteria and Pantoea bacteria can be used.
  • Other microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae include the genus Enterobacter, the genus Klebsiella, the genus Serratia, the genus Erwinia, the genus Salmonella and the Morganella.
  • microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae belonging to ⁇ -proteobacteria such as the genus.
  • Enteropakuta bacteria belonging to the genus Enterobakuta one 'agglomerans (Enterobac ter agglomerans), Enarono rather Kuta 1 ⁇ - /' Erokunesu (Enterobacter aerogenes) or the like, as the bread Toea bacteria belonging to the genus Pantoea. Ananatis (p antoea ananatis ).
  • Enteropactor agglomerans has been reclassified as Pantoea agglomerans, Panto ea ananatis, Pantoea stewartii, etc., by 16S rRNA sequence analysis, etc. There is something.
  • Pantoea As long as it is classified into the family Enterobacteriaceae, it may belong to the genus Enterobacter or Pantoea.
  • Pantoea Ananatis AJ 13355 (FERM BP-6614), AJ13356 (FERM BP-6615), AJ13601 (FERM BP-7207) and those Or a derivative thereof can be used.
  • These strains were identified as Enteropactor 'Agglomerans at the time of isolation, and the power deposited as Enteropactor agglomerans was reclassified as Pantoea's Ananatis by 16S rRNA sequence analysis as described above.
  • L-amino acid-producing ability In order to confer L-amino acid-producing ability, the acquisition of auxotrophic mutants, analog-resistant strains or metabolic control mutants, and gene sets with enhanced expression of L-amino acid biosynthetic enzymes It is possible to apply methods that have been adopted for breeding Escherichia bacteria, such as the creation of replacement strains (Amino Acid Fermentation, Academic Publishing Center, Inc., May 30, 1986, first edition published, 77- : See page LOO).
  • two or more kinds of properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic control mutation may be imparted.
  • the L amino acid biosynthesis enzymes whose expression is enhanced may be used alone or in combination of two or more. It may be combined with the addition of properties such as sardine, auxotrophy, analog tolerance, metabolic control mutations, and enhancement of biosynthetic enzymes.
  • An auxotrophic mutant strain capable of producing L amino acids, an analog resistant strain of L amino acids, or a metabolically controlled mutant strain is obtained by subjecting the parent strain or wild strain to normal mutation treatment, that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or —Methyl N'-tro-I N-trosoguanidine (NTG), treated with mutagen such as ethylmethan sulfonate (EMS), and so on.
  • NTG Metal N'-tro-I N-trosoguanidine
  • EMS ethylmethan sulfonate
  • it can be obtained by selecting those that show metabolic control mutations and have the ability to produce L-amino acids.
  • Examples of gene recombination include a method for enhancing the expression of a gene encoding an enzyme related to biosynthesis of a target L-amino acid, and a method for reducing the activity of a gene encoding an enzyme related to the degradation of a target L amino acid. Etc.
  • microorganisms having L amino acid-producing ability are given below, but microorganisms that can be used in the present invention are not limited to the following.
  • Examples of parent strains for inducing the L-threonine producing bacterium of the present invention include E. coli TDH-6 / pVIC40 (VKPM B-3996) (US Pat. No. 5,175,107, US Pat. ), E. coli 472T23 / pYN7 (ATCC 98081) (US Pat.No. 5,631,157), E. coli NRRL-21593 (US Pat.No. 5,939,307), E. coli FERM BP-3756 (US patent) No. 5,474,918), E. coli FERM BP-3519 and FERM BP-3520 (US Pat.No. 5,376,538), E.
  • coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978) Ability to include strains belonging to the genus Escherichia such as E. coli VL643 and VL2055 (EP 1149911 A), but is not limited thereto.
  • TDH-6 strain lacks the thrC gene, is sucrose-assimilating, and its ilvA gene Has a S-leaky mutation. This strain also has a mutation in the rhtA gene that confers resistance to high concentrations of threonine or homoserine.
  • This mutant thrA gene encodes aspartokinase homoserine dehydrogenase I which is substantially desensitized to feedback inhibition by threonine.
  • the B-3996 stock was deposited on 19 November 1987 in the all-union 'scientific' centre 'of'antibiotics' (Nagatinskaya Street 3- A, 117105 Moscow, Russia) with the deposit number RIA 1867. Yes. This strain was also transferred to Lucian 'National' Collection 'Ob'Industrial'Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) on April 7, 1987. Deposited at -3996.
  • VKPM Lucian 'National' Collection 'Ob'Industrial'Microorganisms
  • E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) can also be used as a parent strain for inducing the L-threon producing bacterium of the present invention.
  • the B-5318 strain is non-isoleucine-requiring and has been replaced by the control region force of the threonine operon in plasmid PVIC40, the temperature-sensitive lambda phage C1 repressor and the PR promoter.
  • VKPM B-5318 was assigned to Lucian National 'Collection' Ob 'Industrial Microorganisms (V KPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) on May 3, 1990. Deposited at -5318.
  • the bacterium of the present invention is further modified so that expression of one or more of the following genes is increased.
  • RhtA gene encoding a putative transmembrane protein
  • the thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I of E. coli is Revised (nucleotide numbers 337-2799, GenBank accession NC — 000913.2, gi: 49175990) o
  • the thrA gene is located between the thrL and thrB genes in the chromosome of E. coli K-12.
  • the thrB gene encoding E. coli homoserine kinase has been elucidated (nucleotide numbers 2801 to 3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990).
  • the thrB gene is located between the thrA gene and the thrC gene in the chromosome of E. coli K-12.
  • the thrC gene encoding threonine synthase from E. coli has been elucidated (nucleotide numbers 3734-5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990) o
  • the thrC gene is located in the chromosome of E. coli K-12 , Located between the thrB gene and the yaaX open reading frame. All three of these genes function as a single threonine operon.
  • the fat-weather region that affects transcription is preferably removed from the operon (W 02005/049808, WO2003 / 097839).
  • mutant thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I, which is resistant to feedback inhibition by threonine, and the thrB and thrC genes are well known in the threonine production strain E. coli VKPM B-3996. It can be obtained as one operon from the plasmid pVIC40. Details of plasmid P VIC40, are described in U.S. Patent No. 5,705,371.
  • the rhtA gene is present at 18 minutes of the E. coli chromosome close to the glnHPQ operon, which encodes an element of the glutamine transport system.
  • the rhtA gene is identical to ORF1 (ybiF gene, nucleotide number 764-16541, GenBank accession number AAA218541, gi: 440181), and is located between the pexB gene and the ompX gene.
  • the unit that expresses the protein encoded by ORF1 is called the rhtA gene (rht: resistant to homoserine and threonine).
  • the rhtA23 mutation was found to be a G ⁇ A substitution at position -1 relative to the ATG initiation codon (ABSTRACTS of the 17 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A;).
  • the asd gene of E. coli has already been clarified (nucleotide numbers 3572511 to 357140). 8, GenBank accession NC_000913.1, gi: 16131307) and can be obtained by PCR using primers prepared based on the nucleotide sequence of the gene (White, TJ et al, Tr ends Genet., 5, 185 ( 1989)).
  • GenBank accession NC_000913.1, gi: 16131307 GenBank accession NC_000913.1, gi: 16131307
  • the asd genes of other microorganisms can be obtained in the same way.
  • the aspC gene of E. coli has already been clarified (nucleotide numbers 983742 to 984932, GenBank accession NC-01003.1, gi: 16128895) and can be obtained by PCR.
  • the aspC gene of other microorganisms can be obtained similarly.
  • L-lysine-producing bacteria belonging to the genus Escherichia include mutants having resistance to L-lysine analogs.
  • L-lysine analogues inhibit the growth of bacteria belonging to the genus Escherichia, but this inhibition is completely or partially released when L-lysine is present in the medium.
  • L-lysine analogs include, but are not limited to, oxalidine, lysine hydroxamate, S- (2-aminoethyl) L-cysteine (AEC), ⁇ -methyllysine, oc-chlorocaprolatatam, and the like.
  • Mutants having resistance to these lysine analogs can be obtained by subjecting bacteria belonging to the genus Escherichia to normal artificial mutation treatment.
  • Specific examples of bacterial strains useful for the production of L-lysine include E. coli AJ 11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; see US Pat. No. 4,346,170) and E. coli VL611. In these microorganisms, feedback inhibition of aspartokinase by L-lysine is released.
  • the WC196 strain can be used as an L-lysine-producing bacterium of E. coli.
  • This strain was bred by conferring AEC resistance to the W3110 strain derived from E. coli K-12.
  • This strain was named Escheric hia coli AJ13069.December 6, 1994, Biotechnology Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (now National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biodeposition Center, T305-8566, Ibaraki, Japan Deposited as FERM P-14690 at Tsukuba 1-chome, 1-chome, 1-chome, Tsukuba Prefecture, and transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on 29 September 1995, with the accession number F ERM BP-5252 Granted! (US Pat. No. 5,827,698).
  • Examples of L-lysine-producing bacteria or parent strains for deriving the same also include strains in which expression of one or more genes encoding L-lysine biosynthetic enzymes are increased.
  • genes include dihydrodipicolinate synthase gene (dapA), aspartokinase gene (lysC), dihydrodipicolinate reductase gene (dapB), diaminopimelate decarboxylase gene (lysA), diaminopimelate dehydrogenase gene (ddh) (USA) Patent 6,040, 160), phosphonolpyruvate carboxylase gene (pp c), aspartate semialdehyde dehydrogenase gene (asd), and aspartase gene (aspA) (EP 1253195 A).
  • the parent strain is a gene involved in energy efficiency (cyo) (EP 1170376 A), a gene encoding nicotinamide nucleotide transhydrogenase (pntAB) (US Pat.No. 5,830,716), ybjE gene (WO2005 / 073390), The expression level of the gene encoding glutamate dehydrogenase (gdhA) (Gene23: 199-209 (1983) or a combination thereof may be increased.
  • Wild-type dihydrodipicolinate synthase derived from Escherichia coli is known to undergo feedback inhibition by lysine, and wild-type aspartokinase derived from Escherichia coli is inhibited by L-lysine and feedback inhibition. It is known to receive. Therefore, when using the dapA gene and the lysC gene, these genes are preferably mutant genes that are not subject to feedback inhibition by L-lysine.
  • DNA encoding a mutant dihydrodipicolinate synthase that is not subject to feedback inhibition by L-lysine includes DNA encoding a protein having a sequence in which the histidine residue at position 118 is substituted with a tyrosine residue. Can be mentioned.
  • the threonine residue at position 352 was replaced with an isoleucine residue
  • the glycine residue at position 323 was replaced with an asparagine residue.
  • Substitutions include DNA that encodes a spider having a sequence in which methionine at position 318 is replaced with isoleucine (see US Pat. Nos. 5661012 and 6040160 for these variants).
  • Mutant DNA can be obtained by site-specific mutagenesis such as PCR.
  • plasmids RSFD80, pCABl and pCABD2 are known as plasmids containing mutant dapA encoding mutant mutant dihydrodipicolinate synthase and mutant lysC encoding mutant aspartokinase.
  • Escherichia coli JM109 transformed with RSFD80 was named AJ12396, and this strain was established on October 28, 1993 at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry.
  • FERM P-13936 Deposited to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) as deposit number FERM P-13936, transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on November 1, 1994, with the deposit number of FERM BP-4859 It is deposited with.
  • RSFD80 can be obtained from AJ12396 strain by a known method.
  • L-lysine-producing bacteria or parent strains for deriving them include reduced or deficient activities of enzymes that catalyze reactions that branch off from the L-lysine biosynthesis pathway to produce compounds other than L-lysine. The stock which is doing is also mentioned.
  • Biosynthesis pathway power of L-lysine Examples of enzymes that catalyze a reaction that branches to produce compounds other than L-lysine include homoserine dehydrogenase, lysine decarboxylase (US Pat. No. 5,827,698), and malate enzyme (WO2005). / 010175).
  • Examples of parent strains for inducing the L-cysteine producing bacterium of the present invention include E. coli 15 (US Pat.No. 6,218,168) transformed with multiple cysE alleles encoding a feedback inhibition resistant serine acetyltransferase. , Russian Patent Application No. 2003121601), E. coli W3110 (U.S. Pat.No. 5,972,663), which has an overexpressed gene encoding a protein suitable for excretion of toxic substances to cells, and has cysteine desulphohydrase activity.
  • Ability to include strains belonging to the genus Escherichia such as reduced E. coli strain 0P1H55571A2), E. coli W3110 (WO0127307A1) with increased activity of the positive transcriptional regulator of the cysteine regulon encoded by the cysB gene.
  • E. coli 15 US Pat.No. 6,218,168 transformed with multiple cysE alleles encoding
  • parent strains for inducing the L-leucine-producing bacterium of the present invention include leucine-resistant E. coil strains (for example, 57 strains (VKPM B-7386, US Pat. No. 6,124,121) or j8-2-che- Lualanin, 3-hydroxyleucine, 4-azaleucine, 5,5,5-trifluoroleucine E. coli strains resistant to leucine analogs such as JP-B-62-34397 and JP-A-8-70879, E. coli strains obtained by the genetic engineering method described in WO96 / 06926, E. coli H -9068 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-70879) and the like, including but not limited to strains belonging to the genus Escherichia.
  • leucine-resistant E. coil strains for example, 57 strains (VKPM B-7386, US Pat. No. 6,124,121) or j8-2-che- Lualanin,
  • the bacterium of the present invention may be improved by increasing the expression of one or more genes involved in L-mouth isin biosynthesis.
  • An example of such a gene is the leuABCD operon gene represented by a mutated leuA gene (US Pat. No. 6,403,342) that preferably encodes isopropylmalate synthase, which is desensitized to feedback inhibition by L-leucine. Can be mentioned.
  • the bacterium of the present invention may be improved by increasing the expression of one or more genes encoding a protein that excretes bacterial cellular L-amino acids. Examples of such genes include b2682 gene and b2683 gene (ygaZH gene) (EP 1239041 A2).
  • Examples of parent strains for inducing the L-histidine producing bacterium of the present invention include E. coli 24 strain (V KPM B-5945, RU2003677), E. coli 80 strain (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli. coli NRR L B-12116-B12121 (US Pat.No. 4,388,405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) and H-9343 (FERM BP-6676) (US Pat.No. 6,344,347), E. coli H -Ability to include strains belonging to the genus Escherichia such as 9341 (FERM B P-6674) (EP1085087), E. coli AI80 / pFM201 (US Pat. No. 6,258,554), but not limited thereto.
  • Examples of parent strains for inducing the L-histidine-producing bacterium of the present invention include strains in which expression of one or more genes encoding L-histidine biosynthetic enzymes are increased.
  • Examples of such genes include the ATP phosphoribosyltransferase gene (hisG), the phosphorifosyl AMP cyclohydrolase gene (hisl), the phosphorifosyl-ATP pyrophosphohydrolase gene (hisIE), the phosphorifosylformimimino.
  • hisA amide transferase gene
  • hisC histidinol phosphate aminotransferase gene
  • hisB histidinol dehydrogenase gene
  • hisG L-histidine biosynthetic enzymes encoded by hisG and hisBHAFI are known to be inhibited by histidine, and therefore L-histidine-producing ability is fed back to the ATP phosphoribosyltransferase gene (hisG). It can be increased efficiently by introducing mutations that confer resistance to inhibition (Russian Patent Nos. 2003677 and 2119536).
  • strains having the ability to produce L histidine include E. coli FERM-P 5038 and 5048 into which a vector carrying a DNA encoding an L histidine biosynthetic enzyme has been introduced (Japanese Patent Laid-Open No. 56-005099). ), E. coli strain into which rht, an amino acid transport gene, was introduced (EP1016710A), E. coli 80 with resistance to sulfaguanidine, DL-1, 2,4-triazole-3-alanine and streptomycin Strain (VKPM B-7270, Russian Patent No. 2119536).
  • Examples of the parent strain for inducing the L-glutamic acid-producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia such as E. coli VL3 34thrC + (EP 1172433).
  • E. coli VL334 (VKPM B-1641) is an L-isoleucine and L-threonine auxotrophic strain having mutations in the thrC gene and the ilvA gene (US Pat. No. 4,278,765).
  • the wild type allele of the thrC gene was introduced by a general transduction method using pacteriophage P1 grown in cells of wild type E. coli K12 strain (VKPM B-7).
  • VKPM B-8961 L-isoleucine-requiring L glutamate-producing bacterium VL334thrC +
  • Examples of parent strains for inducing the L-glutamic acid-producing bacterium of the present invention include strains in which expression of one or more genes encoding L-dartamic acid biosynthetic enzyme is increased. It is not limited. Examples of such genes include glutamate dehydrogenase (gdhA), glutamine synthetase (glnA), glutamate synthetase (gltAB), isocitrate dehydrogenase (icdA), acetate hydratase (acnA, acnB), citrate synthase.
  • gdhA glutamate dehydrogenase
  • glnA glutamine synthetase
  • gltAB glutamate synthetase
  • icdA isocitrate dehydrogenase
  • acnA, acnB citrate synthase.
  • gltA phosphoenol pyruvate carbocilase
  • ppc pyruvate dehydrogenase
  • aceEF lpdA
  • pyruvate kinase pykA, pykF
  • phosphoenol pyruvate synthase ppsA
  • enolase eno
  • Phosphoglyceromutase pgmA, pgml
  • Phosphoglycerate kinase pgk
  • gapA glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • triphosphate isomerase tpiA
  • fructose bisphosphate aldolase lp
  • phosphofructokinase plkA, plkB
  • glucose phosphate isomerase pgi
  • strains modified to increase expression of the citrate synthetase gene, the phosphoenol pyruvate carboxylase gene, and the Z or glutamate dehydrogenase gene are disclosed in EP1078989A, EP955368A and EP952221A The ones that were made are listed.
  • Examples of a parent strain for inducing the L-glutamic acid-producing bacterium of the present invention include a decrease or deletion in the activity of an enzyme that branches off from the biosynthesis pathway of L-dalamic acid and catalyzes the synthesis of compounds other than L-glutamic acid. There are also stocks.
  • Such enzymes include isocitrate lyase (aceA), ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase (sucA), phosphoto lance acetylase (pta), acetate kinase (ack), acetohydroxy acid synthase (ilv G), acetate lactate synthase (ilvl), formate acetyl transferase (pfl), lactate dehydrogenase (ldh), glutamate decarboxylase (gadAB) and the like.
  • aceA isocitrate lyase
  • sucA ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase
  • pta phosphoto lance acetylase
  • ack acetate kinase
  • ack acetohydroxy acid synthase
  • ilvl acetate lactate synthase
  • pfl lactate dehydrogenase
  • glutamate decarboxylase gadAB
  • E. coli W3110sucA is a strain obtained by disrupting the ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase gene (hereinafter also referred to as "sucA gene") of E. coli W3110. This strain is completely deficient in a-ketoglutarate dehydrogenase.
  • L-glutamic acid-producing bacteria include those belonging to the genus Escherichia and having resistance to aspartic acid antagonists. These strains are a-ketoglutarate de For example, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (US Patent No. 5.908,768) and A-J12624 (FFRM P-12379) with reduced L-glutamate resolution (US Patent) No. 5,393,671); AJ13138 (FERM BP-5565) (US Pat. No. 6,110,714).
  • L glutamate-producing bacteria examples include bacteria belonging to the genus Pantoea that lack ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activity or have reduced ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activity, and are obtained as described above. be able to.
  • Pantoea ananatis AJ13356 US Pat. No. 6,331,419). Pantoea ananatis AJ133 56 was established on 19 February 1998 at the National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), T305-8566 Deposit number FERM P-16645 at Chome No.
  • Pantoea ananatis AJ13356 is deficient in ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activity due to disruption of a KGDH-El subunit gene (sucA). When isolated, this strain was called Enterobacter agglomerans and deposited as Enterobacter agglomerans A J13356. However, it was reclassified as Pantoea anana tis based on the base sequence of 16S rRNA. AJ13356 is the power deposited as Enterobacter agglomerans in the above depository organization. In this specification, it is described as Pantoea ananatis.
  • Examples of parent strains for inducing the L ferulanin-producing bacterium of the present invention include E. coli AJ12739 (tyrA :: Tnl0, tyrR) (VKPM B-8197), E. coli carrying a mutant pheA34 gene. HW1089 (ATCC 55371) (U.S. Pat.No. 5,354,672), E.coli MWEC101—b (KR8903 681), E.coli NRRL B-1241, NRRL B-12145, NRRL B-12146 and NRRL B-12147 Powers including strains belonging to the genus Escherichia such as Patent No. 4,407,952) are not limited thereto. In addition, E.
  • E. coli K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAB] (FERM BP-3 566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP— 12659), E. coli E. coli K-12 [W 3110 (tyrA) / pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579) named E. coli K-12 [W311 0 (tyrA) / pPHATerm] (FERM BP-12662) and AJ 12604 ) Can also be used (EP 488424 Bl).
  • L-fulalanin-producing bacteria belonging to the genus Escherichia with increased activity of the protein encoded by the yedA gene or yddG gene can also be used (US Patent Application Publications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 Al).
  • Examples of parent strains for inducing the L-tryptophan-producing bacterium of the present invention include E. coli JP4735 / PMU3028 (DSM10122) and JP6015 / pMU91 (deficient in the tryptophal-tRNA synthetase encoded by the mutant trpS gene. DSM10123) (U.S. Pat.No. 5,756,345), E. having a serA allele encoding phosphoglycerate dehydrogenase not subject to feedback inhibition by serine and a trpE allele encoding an anthra-rate synthase not subject to feedback inhibition by tryptophan.
  • coli SV164 pGH5 (US Pat.No.
  • E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) and AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) (US Pat. No. 4,371,614)
  • E. coli AGX17 / pGX50, pACKG4-pps (WO970833 3, U.S. Pat.No. 6,319,696) with increased phosphoenoylrubic acid production ability Force include strains belonging ⁇ such limitation.
  • L-trifutophan-producing bacteria belonging to the genus Escherichia with increased activity of the protein encoded by the yedA gene or the yddG gene can also be used (US Patent Application Publications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 Al).
  • parent strains for inducing the L-tribetophan producing bacterium of the present invention include an enzyme selected from anthra-late synthase (trpE), phosphoglycerate dehydrogenase (serA), and tryptophan synthase (trpAB). Also included are strains that have increased one or more of these activities. Since both anthra-late synthase and phosphoglycerate dehydrogenase are feedback-inhibited by L-tryptophan and L-serine, mutations that cancel the feedback inhibition may be introduced into these enzymes. Examples of strains with such mutations include E.
  • coli SV164 carrying a desensitized anthra-rate synthase and a mutant serA gene encoding phosphoglycerate dehydrogenase desensitized to feedback inhibition.
  • Examples thereof include a transformant obtained by introducing the plasmid pGH5 (WO 94/08031) into E. coli SV164.
  • Examples include strains into which a tributophan operon containing a gene encoding tolrate synthase has been introduced (JP 57-71397, JP 62-244382, US Pat. No. 4,371,614). Furthermore, L-trybutophane-producing ability may be imparted by increasing the expression of a gene encoding tryptophan synthase in the tryptophan operon (trpBA). Tryptophan synthase consists of ⁇ and ⁇ subunits encoded by trpA and trpB genes, respectively. Furthermore, L tribtophan production ability may be improved by increasing the expression of the isocitrate triase-malate synthase operon (WO2005 / 103275).
  • parent strains for inducing the L-tyrosine producing bacterium of the present invention include aromatic amino acid biosynthetic enzymes such as deoxyarabinohepturonic acid phosphate synthase (aroG), 3-dehydroquinate synthase. (AroB), shikimate dehydrogenase (aroE), shikimate quinase (aroL), 5-enolate pyruvine shikimate 3-phosphate synthase (aroA), and chorismate synthase (aroC).
  • aromatic amino acid biosynthetic enzymes such as deoxyarabinohepturonic acid phosphate synthase (aroG), 3-dehydroquinate synthase. (AroB), shikimate dehydrogenase (aroE), shikimate quinase (aroL), 5-enolate pyruvine shikimate 3-phosphate synthase (aroA), and chorismate synthase (aroC
  • parent strains for inducing the L-proline-producing bacterium of the present invention include those belonging to the genus Escherichia such as E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433) that lacks the ilvA gene and can produce L-proline. Examples include, but are not limited to!
  • the bacterium of the present invention may be improved by increasing the expression of one or more genes involved in L proline biosynthesis.
  • An example of a gene preferable for L-proline-producing bacteria includes a proB gene (German Patent No. 3127361) encoding glutamate kinase that is desensitized to feedback inhibition by L-proline.
  • the bacterium of the present invention may be improved by increasing the expression of one or more genes encoding proteins that excrete bacterial cell-force L-amino acids. Examples of such genes include b2682 gene and b2683 gene (ygaZH gene) (EP1239041 A2).
  • bacteria belonging to the genus Escherichia having L proline-producing ability include NRRL B-12 403 and NRRL B-12404 (British Patent No. 2075056), VKPM B-8012 (Russian Patent Application 2 000124295), Germany plasmid variants described in Japanese Patent No. 3127361, Bloom FR et al (T he 15 th Miami winter symposium, 1983, p.34) include strain of E. coli, such as a plasmid variants described.
  • Examples of parent strains for inducing the L-arginine-producing bacterium of the present invention include E. coli 237 strain (VKPM B-7925) (US Patent Application Publication 2002/058315 Al) and mutant N-acetyl daltamate synthase. Its derivatives ( Russian patent application No. 2001112869), E. coli 382 strain (VKPM B-7926) (EP1170358A1), and an arginine-producing strain into which an argA gene encoding N-acetylethyldartamate synthetase has been introduced Examples include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia such as (EP1170361A1).
  • Examples of parent strains for inducing the L-arginine-producing bacterium of the present invention include strains in which expression of one or more genes encoding L-arginine biosynthetic enzymes are increased.
  • Examples of such genes include the N-acetylyl amyl phosphatoreductase gene (argC), the o-tin acetyl transferase gene (argj), the N-acetyl dal tartate kinase gene (argB), and the acetyl ol-tin transaminase gene.
  • argD ol-tin rubamoyltransferase gene
  • arg F ol-tin rubamoyltransferase gene
  • argG arginosuccinate synthetase gene
  • argH arginosuccinate lyase gene
  • rubamoyl phosphate synthetase gene car AB
  • parent strains for inducing the L-parin producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains modified to overexpress the ilvGMEDA operation (US Pat. No. 5,998,178). Nah ... It is preferable to remove the region of the ilvGMEDA operon required for the fat-use, so that the operon expression is not attenuated by the L-phosphorus produced. Furthermore, it is preferable that the ilvA gene of the operon is disrupted and the threonine deaminase activity is reduced.
  • Examples of parent strains for inducing the L-parin-producing bacterium of the present invention include aminoacyl t-RNA Examples include mutants having a synthetase mutation (US Pat. No. 5,658,766).
  • E. coli VL1970 having a mutation in the ileS gene encoding isoleucine tRNA synthetase can be used.
  • E. coli VL1970 was issued on 24 June 1988 in Lucian 'National' Collection Y'ob 'Industrial' Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) with accession number VKPM B -Deposited at 4411.
  • VKPM Lucian 'National' Collection Y'ob 'Industrial' Microorganisms
  • a mutant strain (WO96 / 06926) that requires lipoic acid for growth and lacks Z or H + -ATPase can be used as a parent strain.
  • parent strains for inducing the L-isoleucine-producing bacterium of the present invention include mutant strains resistant to 6-dimethylaminobrin (Japanese Patent Laid-Open No. 5-304969), thiisoleucine, iso-orcinine hydroxamate, etc.
  • the mutants having resistance to isoleucine analogs, and mutants having resistance to DL-ethionine and Z or arginine hydroxamate Japanese Patent Laid-Open No. 5-130882 are not limited to these.
  • a recombinant strain transformed with a gene encoding a protein involved in L-isoleucine biosynthesis such as threonine deaminase and acetohydroxy acid synthase can also be used as a parent strain (JP-A-2-458, FR). 0356739, and US Pat. No. 5,998,178).
  • the bacterium used in the present invention has a weakened expression of glpR gene (EP1715056), glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK,
  • a glycerol metabolism gene EP1715055A
  • a gene may be enhanced in glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and ta.
  • the microorganism of the present invention is a modification of the microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae having the ability to produce L amino acid as described above so that the activity of phosphorate acylate (hereinafter referred to as “OPRTase”) is enhanced.
  • OPRTase phosphorate acylate
  • L amino acid-producing ability may be imparted after modification so that OPRTase activity is enhanced.
  • the enhancement of OPRTase activity can be achieved by modifying the gene so that the expression level (transcription amount) of the gene encoding OPRTase is increased, as described later.
  • endogenous genes such as by modifying expression regulatory regions such as It may be due to enhanced expression, or may be due to enhanced expression of an exogenous gene such as by introducing a plasmid containing the gene.
  • Increased activity of OPRTase can also be achieved by modifying the pyrE gene so as to increase the translation amount of OPRTase.
  • An increase in the activity of OPRTase can also be achieved by deleting the pyre gene categorized by a frame-shift mutation in the upstream region of OPRTase.
  • the increase in activity of OPRTase can also be achieved by modifying the pyrE gene so as to increase the translation amount of OPRTase. Further, these may be combined.
  • the OPRTase activity of the present invention means an activity of generating orotate and 5-phospho a D ribose monophosphate from orotidine 5'-phosphate and diphosphate (see the following formula), Also called horibosyltransferase (EC 2.4.2.10) o
  • Modified to enhance OPRTase activity means that the number of OPRTase molecules per cell is increased compared to the wild-type or non-modified strain, or the activity per molecule of OPRTase is increased. The case where it improves is applicable. It is preferable that the activity of OPRTase is modified so as to be improved to 150% or more per cell, preferably 200% or more, and more desirably 300% or more per cell compared to the wild type or non-modified strain. .
  • control microorganisms belonging to the wild strain Enterobacteriaceae include Escherichia coli MG1655 (ATCC No. 47076), W3110 (ATCC No. 27325), Pantoea Ananatis AJ13335 (FERM BP-6615) ) And the like.
  • Enhancement of OPRTase activity can be achieved by modification so as to enhance the expression level of a gene encoding OPRTase. Confirmation that expression is improved compared to the parent strain, for example, a wild strain or an unmodified strain, can be confirmed by comparing the amount of mRNA with that of a wild type or an unmodified strain.
  • Examples of the method for confirming the expression amount include Northern Nono Eve lida I See Chillon, eclipsed RT- PCR force (Molecular Cloning (and old spring Harbor Laboratory Press, Cola spring Harbor (USA), 2001)) for o expression of wild Compared to stocks or unmodified strains However, it is desirable that it be increased by 1.5 times or more, more preferably by 2 times or more, and even more preferably by 3 times or more compared to, for example, wild strains and unmodified strains.
  • the enhancement of OPRTase activity can be confirmed by the fact that the amount of OPRTase protein is increased compared to the unmodified strain and the wild strain. For example, the ability to detect by the Western plot using an antibody S is possible. (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold spring Harbor (USA), 2001)).
  • pyrE gene for example, the pyrE gene of Escherichia coli, specifically, the nucleotide sequence of nucleotide numbers 782 to 1423 of SEQ ID NO: 11 is used.
  • pyrE gene GenBank Accession No. NC_00913 VERSION NC_000913.2 GI: complementary chain of base numbers 3813150 to 3813791 of 49175990.
  • Examples of the pyrE gene derived from other microorganisms include, for example, the pyrE gene of Elsier's patice shown in the complementary strand of 577565..579529 of GenBank Accession No. NC_00408 8, 120832. of GenB ank Accession No. AL627282. Salmonella 'Phire gene PYRE shown in .122790 complementary strand, GenBank Accession No. NC-Vibrio' cholera pyrE gene shown in complementary strand 305121..307121 in 002505, 4513714..4515672 complementary strand shown in NC_003197 The Salmonella typhimurium OPRTase gene shown in
  • homologs of pyrE gene based on homology to the exemplified genes above, Eshierihia genus Enterobakuta, Klebsiella, Serratia, Enorebi two ⁇ genus, erucyl - ⁇ genus, etc.
  • coryneform bacteria such as Brevibacterum latatofamentum
  • shyudomonas genus bacteria such as shyudomonas eruginosa
  • mycobacterial genus bacteria such as mycobacteria
  • the homology between the amino acid sequence and the base sequence can be determined by, for example, the algorithm BLAST (Pr 0. Natl. Acad. Sci.
  • a homologue of the pyrE gene is a mutant gene derived from other microorganisms, or a natural or artificial mutant, which shows a high similarity in structure to the above-mentioned pyrE gene, and has OPRTase activity when introduced or amplified in a host.
  • the homologue of the pyrE gene has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the pyrE gene used in the present invention is not limited to the wild-type gene, and as long as the OPRTase activity of the encoded protein is not impaired, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is 1 or It may be a mutant or artificially modified variant encoding a protein having a sequence including substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids at a plurality of positions.
  • substitution site differs depending on the position and type of protein in the three-dimensional structure of amino acid residues, but specifically 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably Means 2-5.
  • the above-mentioned substitution is a conservative mutation in which conservative substitution is preferred.
  • substitution site is an aromatic amino acid, it is between Phe, Trp, and Tyr.
  • substitution site is a hydrophobic amino acid, Leu is used. , Ile, Val, polar amino acids, Gln, Asn, basic amino acids, Lys, Arg, His, acidic amino acids, Asp,
  • an amino acid having a hydroxyl group between Glu it is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • Conservative substitutions include Ala to Ser or Thr, Arg to Gln, His or Lys, Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or G In. Substitution, Cys to Ser or Ala, Gin to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp, Gly to Pro , His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, lie to Leu, Met, Val or Phe, Leu to Ile, Met, Val or Phe, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg substitution, Met to Ile, Leu, Val or Phe substitution, Phe to Trp, Tyr, Met, lie or Leu substitution, Ser to Thr or Ala substitution, Thr to Ser or Ala Replacement from Trp to Phe or Substitution to Tyr, substitution from Tyr to His, Phe or Trp, and substitution from Val to Met, lie or Leu.
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutant or variant) such as those based on individual differences and species differences of microorganisms that retain the OPRTase gene. ) Is also included.
  • the pyrE gene is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 or a probe that can be prepared from the sequence, and that encodes a protein having OPRTase activity.
  • the “stringent condition” means a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Specifically, washing of a normal Southern hybridization is performed.
  • the condition is 60. C, 1 X SSC, 0.1% SDS, preferably 60. C, 0.1 X SSC, 0.1% S DS, more preferably 68.
  • the conditions include washing at a salt concentration and temperature corresponding to C, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, more preferably 2 to 3 times.
  • the modification for enhancing the expression of the pyrE gene can be performed, for example, by increasing the copy number of these genes in a cell by using a gene recombination technique.
  • a DNA fragment containing these genes may be ligated with a vector that functions in the host microorganism, preferably a multi-copy type vector, to produce a recombinant DNA, which is introduced into the microorganism and transformed. ! ⁇ .
  • a primer prepared based on the base sequence of SEQ ID NO: 11, for example, the primers shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, is used for chromosomal DNA of Escherichia coli.
  • the pyrE gene can be obtained by the PCR method (PCR: polymerase chain reaction; see White. TJ et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)).
  • chromosomal DNA is obtained from microorganisms as DNA donors, for example, by Saito and Miura's method (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Biotechnological Experiments, Japan Biotechnology Society, 97-98, Bafukan, 1992).
  • a recombinant DNA is prepared by connecting the pyrE gene amplified by the PCR method to a vector DNA that can function in the cells of the host microorganism.
  • the vector capable of functioning in the host microorganism cell include a vector capable of autonomous replication in the host microorganism cell.
  • Vectors capable of autonomous replication in Escherichia coli cells include pUC19, pUCl 8, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184 (pHSG and pACYC are available from Takara Bio Inc.), RSF1010 (Gene vol.75 ( 2), p271-288, 1989), pBR322, pMW219, pMW119 (pMW is available from Tubon Gene), pSTV28, pSTV29 (Takara Bio Inc.), and the like.
  • phage DNA vectors can be used.
  • the vector is cleaved with a restriction enzyme that matches the ends of the DNA fragment containing the pyrE gene. Ligation is usually performed using a ligase such as T4 DNA ligase.
  • a ligase such as T4 DNA ligase.
  • T4 DNA ligase For methods such as DNA cleavage, ligation, chromosomal DNA preparation, PCR, plasmid DNA preparation, transformation, and setting of oligonucleotides used as primers, use ordinary methods well known to those skilled in the art. Can do. These methods are described in Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Ma niatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) and the like.
  • any transformation method reported so far may be used.
  • the electoral position method (Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997)) can be mentioned.
  • Escherichia coli K-12 a method for increasing the permeability of DNA by treating recipient cells with calcium chloride (Mandel, M. and Higa'AJ Mol). Biol, 53, 159 (1970)), and a method for preparing proliferative-stage cell-competent cells and introducing DNA as reported for Bacillus subtilis (Duncan, CH, Wilson, GA). and Young. FE, Gene, 1, 153 (1977)).
  • ORPTase activity can also be increased by the following method.
  • Escherichia coli the pyrE gene forms an operon with the upstream rph.
  • the nucleotide sequence of the rph-pyrE operon of Escherichia coli K12 strain is shown in SEQ ID NO: 11.
  • SEQ ID NO: 11 the coding region of pyrE is nucleotide numbers 782-1423.
  • the rph coding region becomes longer, and the rph translation end position It is thought that the ribosome is less likely to be released from the mRNA due to the close proximity of the high-affinity region of ribosome, and the enzyme activity of ORPTase can be increased.
  • the base sequence of the rph-pyrE operon including the upstream region of the pyrE gene in which such frame shift has been eliminated is exemplified in SEQ ID NO: 13.
  • the coding region of rph is base numbers 1 to 714.
  • the upstream region of the data-user is lost and the above-mentioned frame shift of -1 is combined.
  • the rph coding region is lengthened, and the translation end position of rph is close to the translation start position of pyrE, so that the enzyme activity of ORPTase can be increased.
  • this can be achieved by deleting the nucleotide sequence at positions 610-691 of SEQ ID NO: 11.
  • the nucleotide sequence of the rph-pyrE operon lacking such a region is exemplified in SEQ ID NO: 14.
  • the enhancement of the expression of the pyrE gene is not limited to the promoter of these genes on chromosomal DNA or plasmid as described in International Publication No. 00/18935 pamphlet.
  • Replacement of the expression regulatory sequences of these genes with strong ones, amplification of regulators that increase the expression of these genes, or deletion or weakening of regulators that reduce the expression of these genes Can also be achieved.
  • lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, etc. are known as strong promoters.
  • Mutations that increase OPR Tase activity include mutations in the promoter sequence that increase the amount of transcription of the pyrE gene and mutations in the code region of these genes that increase the specific activity of the OPRTase protein. .
  • the microorganism of the present invention is cultured in a medium, L-amino acid is produced and accumulated in the medium or in the fungus body, and the L-amino acid is recovered from the medium or the fungus body. It is characterized by doing.
  • a medium to be used a medium conventionally used in the fermentation production of L amino acids using microorganisms can be used. That is, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as necessary can be used.
  • the carbon sources include sugars such as glucose, sucrose, latatose, galactose, and fructose starch hydrolyzate, alcohols such as glycerol and sorbitol, fumaric acid, citrate, cono, and succinate.
  • Organic acids such as these can be used.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia, etc. I can do it.
  • organic trace nutrient source it is desirable to contain an appropriate amount of required substances such as vitamin Bl and L homoserine, or fermenter extract.
  • small amounts of phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions, etc. are added as necessary.
  • the medium used in the present invention may be either a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic trace components as required.
  • Glycerol may be glycerol as a reagent, but it is desirable to use glycerol containing impurities produced industrially. For example, it is desirable to use glycerol that is produced industrially by the esteri reaction for biodiesel production.
  • the glycerol contained in the medium of the present invention may be a single carbon source, or a mixed medium supplemented with other carbon sources in addition to glycerol.
  • Preferred are saccharides such as dalcose, fructose, sucrose, latatose, galactose, molasses, starch hydrolyzate and molasses obtained by hydrolysis of biomass, alcohols such as ethanol, fumaric acid, citrate, Organic acids such as succinic acid.
  • the ratio of glycerol in the medium is preferably 50% or more, 60% or more, desirably 70% or more, more desirably 80% or more, and particularly desirably 90% or more.
  • glycerol as a by-product of biodiesel! /.
  • Cultivation is preferably carried out for 1 to 7 days under aerobic conditions.
  • the culture temperature should be 24 ° C to 37 ° C, and the pH during culture should be 5 to 9.
  • inorganic or organic acidic or alkaline substances, ammonia gas, etc. can be used.
  • L-amino acid from the fermentation broth can be usually carried out by combining ion exchange coagulation method, precipitation method and other known methods.
  • L-amino acid accumulates in the microbial cells, for example, the microbial cells are crushed by ultrasonic waves, etc., and the microbial cells are removed by centrifugation. -Amino acids can be recovered.
  • the pH during culture is controlled to 6.5 to 9.0, and the pH of the medium at the end of the culture is controlled to 7.2 to 9.0.
  • Supply a cocoon that controls the pressure in the fermenter during fermentation to be positive, or carbon dioxide gas or a mixed gas containing carbon dioxide gas to the medium, and at least 2 gZL of bicarbonate ion and Z or carbonate ion in the medium
  • the target basic amino acid is recovered by fermenting the bicarbonate ion and Z or carbonate ion with a counter ion of a cation mainly composed of a basic amino acid so that there exists a culture period that exists above (See JP 2002-065287, US Patent Application Publication No. 2002025564).
  • sucA gene-deficient strain was prepared from Escherichia coli MG 1655. Primers were synthesized based on the reported nucleotide sequence of the sucA gene, and the N-terminal and C-terminal fragments of the sucA gene were amplified by PCR using the genomic DNA of the MG1655 strain as a cage.
  • Primers 1 and 2 are used as PCR primers for N-terminal fragment amplification
  • primers 3 and 4 are used as PCR primers for C-terminal fragment amplification PCR. It was. Primer 1 has a Hindlll site and Primer 4 has an Xbal site.
  • the temperature sensitive plasmid pMAN997 (WO 99/03988 international publication pamphlet) cut with Hindlll and Xbal and the DNA fragment were ligated using DN A ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo).
  • JM109 competent cells (Takara Shuzo) were transformed and applied to an LB agar plate (LB + ampicillin plate) containing 25 ⁇ g / mL of ampicillin (Sigma).
  • the grown colonies were cultured in LB medium containing 25 ⁇ g / mL ampicillin in a test tube at 30 ° C, and an automated plasmid extractor PI-50 (Kurabo) was used. Plasmid extraction was performed. The obtained plasmid was cleaved with Hindlll and Xbal and subjected to agarose gel electrophoresis, and the plasmid into which the target fragment had been inserted was designated as the plasmid pMAN_A sucA for sucA deletion.
  • the above-mentioned pMAN997 is obtained by connecting the Vspl-Hindlll fragments of pMAN031 (S. Matsuyama and S. Mizushima, J. BacterioL, 162, 1196 (198 5) and pUC19 (Takara Shuzo)).
  • Escherichia coli strain 10655 was transformed with the plasmid pMAN_A sucA by the method of CT Chung et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2172 (1989)), and LB + ampicillin Colonies were selected at 30 ° C. After overnight liquid culture the selected clones 30 ° C, the culture solution 10 3 diluted to plated on an LB + ampicillin plate, and colonies were selected at 42 ° C. Spread selected clones on LB + ampicillin plate and incubate at 30 ° C. Suspend 1/8 cells of the plate in 2 mL of LB medium and shake at 42 ° C for 4-5 hours. did.
  • sucA-deficient strain MG1655 A sucA derived from E. coli MG1655 was obtained.
  • synthetic oligonucleotide Perform PCR using primers 7 and 8 (SEQ ID NOs: 7 and 8) to obtain DNA fragment 2.
  • PCR is performed using the mixture of DNA fragment 1 and DNA fragment 2 as a cage and oligonucleotides 5 and 8 as primers.
  • a deletion-type rph-pyrE DNA fragment and insert it into the multiple cloning site of the temperature-sensitive plasmid pMAN997 (WO 99/03988 international publication pamphlet) to obtain the deletion plasmid pMAN. -get rph-pyre (m).
  • the MG 1655 ⁇ sucA ⁇ sucA rph- pyrE (m) strain was cultured with the sucA gene-deficient strain MG1655 ⁇ sucA as a control, Glutamic acid production was measured.
  • the medium, culture method and analysis method for this purpose are shown below.
  • Table 1 shows the yield of L-glutamic acid after 26.6 hours of culture. A total of 4 strains, each of 2 strains obtained by independent colony isolation of 2 clones obtained independently, were cultured, and the average glutamic acid yield was shown.
  • Refresh culture inoculate LB agar with stored bacteria and grow at 37 ° C for 24 hours
  • Seed tube culture the freshly cultured bacteria were inoculated into LB liquid medium (with drug added if necessary) and cultured at 37 ° C for 16 hours.
  • Seed culture liquid medium is inoculated with 10% MS liquid medium (with drug as required) 37.
  • C cultured in 20 ml / 500 ml volumetric flask.
  • Glucose and L-glutamic acid concentrations were determined by centrifuging the culture at 15,000 rpm for 5 minutes.
  • the supernatant was diluted with water at an appropriate magnification and measured with a biobiotech analyzer AS- 210 (Sakura Seiki).
  • the glucose concentration in the medium after 26.6 hours of culture was llg / 1.
  • Example 2 Evaluation of threonine-producing strain with amplified pyrE gene (1) Construction of pyrE amplified strains from Escherichia coli threonine producing strains B-3996 and B-5318 A plasmid for pyrE amplification was constructed as follows. PCR was performed using MG1655 chromosomal DNA as a cage and synthetic oligonucleotides 9 and 10 (SEQ ID NOs: 9 and 10) as primers to obtain a pyrE gene fragment.
  • the pyrE gene amplified strains from the threonine-producing bacteria B-3996 and B-5318 are introduced into B-3996 and B-5318 by introducing the electroporation into ⁇ 1 ⁇ ⁇ 219- and pSTV28-pyre. Can be obtained.
  • A, B, and D are adjusted to pH 7.0 with KOH, sterilized separately (at 115 ° C for 10 minutes, autoclaved), mixed, and filter sterilized (C) is added.
  • Ananatis AJ13601 strain can be used as a parent strain of L glutamate producing bacteria with increased OPRTase activity.
  • Pantoair 'Ananatis AJ1360 1 share was registered as the FERM P-17516 with the accession number FERM P-17516 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (Postal Code 305-8566, Tsukuba Rinto 1-3, Ibaraki Prefecture) 1999 8 It was deposited on the 18th of March and transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on 6th of July 2000. The deposit number is FE RM BP-7207. Construction of a pyrE gene amplified strain from an L-glutamic acid-producing bacterium can be obtained by introducing pMW219-pyrE and pSTV28-pyrE in the same manner as in Example 2.
  • the pyrE gene-amplified strain is cultured in an L-glutamic acid production medium and cultured in a reciprocating shake culture apparatus. After cultivation, the amount of L-glutamic acid accumulated in the medium is measured by a known method to confirm that the accumulation of L-glutamic acid is improved. By this method, a pyrE gene amplified strain with improved L-dalamic acid production ability can be obtained.
  • the sequence upstream of the pyrE gene on the chromosome of WC196 A cadA A ldc strain was modified so that the gene was controlled by the tac Ml promoter.
  • the nucleotide sequence of the modified pyrE gene is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the expression of the modified pyrE gene is not controlled by the attenuator, and the translation of the transcript into OPRTase is not affected by the frameshift mutation of the rph gene.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 was used to modify the pyrE gene.
  • the base number 1-172 is the phage attR sequence
  • SEQ ID NO: 324-983 is the chloramphee-coal metagene (cat)
  • the phage attL sequence, base numbers 1654 to 1733 are the tacMl promoter, and the remaining part is a sequence derived from pMWl18.
  • the tacMl promoter can be obtained by substituting the TTGACA sequence in the -35 region of the tac promoter (Gene 25 (2-3), 167-178 (1983)) with TTGGCA (base numbers 1669 to 1674 of SEQ ID NO: 15). Can be built.
  • the sequence of SEQ ID NO: 16 can be constructed with reference to pMWl 18-attL-Cm-attR described in WO2005 / 010175.
  • a DNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 15 is used as a saddle, amplified by PCR using primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, and this amplified product is obtained using the 13 ⁇ 40 method ( 02005/010175) Nyori 96 ⁇ & (1 ⁇ 1 (1 (; inserted on the chromosome of the strain, and obtained a strain in which the promoter sequence in the upstream of pyrE was modified.
  • glycerol stock After culturing these strains in L medium containing 20 mg / L streptomycin at 37 ° C to a final OD600 of 0.6, the same amount of 40% glycerol solution as the culture solution was added and stirred. Thereafter, an appropriate amount was dispensed and stored at -80 ° C. This is called glycerol stock.
  • the glycerol stock was thawed, 100 ⁇ L of each was uniformly applied to an L plate containing 20 mg / L of streptomycin, and cultured at 37 ° C for 24 hours. Approximately 1/8 amount of the cells on one plate was inoculated into 20 mL of a fermentation medium containing 20 mg / L of streptomycin in a 500 mL Sakaguchi flask. Incubate for hours. After cultivation, the amount of L-lysine accumulated in the medium was measured by a known method (Sakura Seiki Biotech Analyzer I AS210). The composition of the fermentation medium is shown below.
  • the above medium was supplemented with 20 mg / L streptomycin. Culturing was carried out for 24 hours under conditions of a temperature of 37 ° C. and stirring of 115 rpm.
  • basic amino acids such as L-lysine, L-ornithine, L-arginine, L-histidine, L-citrulline, L-isoleucine, L- Aliphatic amino acids such as alanine, L-parin, L-leucine and glycine, amino acids which are hydroxymonoaminocarboxylic acids such as L-threonine and L-serine, cyclic amino acids such as L-proline, L-phenolanine, L —Aromatic amino acids such as tyrosine, L-tryptophan, sulfur-containing amino acids such as L-cystine, L-cystine, L-methionine, acidic amino acids such as L-glutamic acid, L-aspartic acid, L-glutamine, L-asparagine Can be fermented.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Ｌ－アミノ酸生産能を有し、かつオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ－アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ－アミノ酸を回収することにより、Ｌ－アミノ酸を製造する。

Description

明 細 書
L一アミノ酸を生産する微生物及び L一アミノ酸の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、微生物を用いた L アミノ酸の製造法、特に L リジン、 L—スレオニン、 L グルタミン酸等の L アミノ酸の製造法に関する。例えば、 L リジン、 L—スレオ ニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、アミノ酸輸液等として、 L ダルタミ ン酸は調味料として、産業上有用な L アミノ酸である。
背景技術
[0002] L—アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ェシエリヒア属等に属 する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、 L リジンの製造法 としては、例えば、特許文献 1〜8に記載された方法を挙げることができる。これらの 製造法においては、自然界力 分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらに は、組換え DNA技術により塩基性 L アミノ酸生合成酵素の活性が増強するように 改変された微生物などが用いられて 、る。
[0003] ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ [EC:2.4.2.102.10]は、ピリミジン生合成系 の酵素であり、 pyrE遺伝子によってコードされている。 pyrEはその上流にある rph (RN ase PHをコードする）とオペロンを成す力 ェシエリヒア'コリ MG1655や W3110では、 rp hのコード領域の 3，末端領域に 1のフレームシフトがあり、その影響で pyrEの発現 量が不十分となり、ピリミジン飢餓になると考えられている。（非特許文献 1)
[0004] し力し、 rph-pyrEオペロンの発現量、 pyrE遺伝子産物の発現量、及びォロト酸ホス ホリボシルトランスフェラーゼ活性と、腸内細菌による物質生産との関連については 知られていなかった。
特許文献 1：欧州特許第 0643135号公報
特許文献 2：欧州特許第 0733712号公報
特許文献 3：欧州特許出願公開第 1477565号公報
特許文献 4:欧州特許出願公開第 0796912号公報
特許文献 5：欧州特許出願公開第 0837134号公報 特許文献 6：国際公開第 WO01/53459号パンフレット
特許文献 7：欧州特許出願公開第 1170376号公報
特許文献 8：国際公開第 WO2005/010175号パンフレット
非特許文献 1 : Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401- 3407 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、 L—アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する菌株を 提供すること、及び該菌株を用いて L アミノ酸を効率よく生産する方法を提供する ことを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ォロト酸ホスホ リボシルトランスフェラーゼ活性を増強させた微生物を用いることにより、 L アミノ酸 を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
[0007] すなわち、本発明は以下のとおりである。
( 1) L アミノ酸生産能を有し、かつォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が 増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
(2)ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする pyrE遺伝子の発現量を増 大させること、及び/または、ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの翻訳量を増 大させることによりォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微 生物
(3)ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする pyrE遺伝子のコピー数を 高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ォロト酸ホスホリボ シルトランスフェラーゼ活性が増強された、前記微生物。
(4) rph— pyrEオペロンを有し、 rph遺伝子のコード領域に 1のフレームシフト変異 を生来有する微生物を改変することによって得られる微生物であって、前記フレーム シフト変異を解消する変異が導入されたことにより、ォロト酸ホスホリボシルトランスフ エラーゼ活性が増強された前記微生物。
(5) pyrE遺伝子の上流のァテ-ユエ一ターを欠損したことにより、ォロト酸ホスホリボ シルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物。
(6)前記ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼカ 下記 (A)又は（B)に記載のタ ンパク質である、前記微生物：
(A)配列番号 12に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(B)配列番号 12に示すのアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸残基の 置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ォロト酸ホスホ リボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(7)前記 pyrE遺伝子が、下記 (a)又は (b)に記載の DNAである、前記微生物：
(a)配列番号 11の塩基番号 782〜1423の塩基配列を含む DNA、
(b)配列番号 11の塩基番号 782〜1423の塩基配列と相補的な塩基配列又は該 塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、か つ、ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする D
(8)前記 L アミノ酸力 L リジン、 L アルギニン、 L ヒスチジン、 L—イソロイシン 、 L—パリン、 L ロイシン、 L—スレオニン、 L フエ-ルァラニン、 L チロシン、 L— トリブトファン、 L システィン及び L グルタミン酸力もなる群力も選択される一種また は二種以上の L アミノ酸である前記微生物。
(9)前記腸内細菌科に属する微生物が、エシ リヒア属細菌、ェンテロパクター属細 菌またはパントエア属細菌である前記微生物。
(10)前記微生物を培地で培養して、 L アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄 積させ、該培地又は菌体より L アミノ酸を回収することを特徴とする L アミノ酸の製 造法。
(11)グリセロールを炭素源とすることを特徴とする前記方法。
(12)前記 L アミノ酸力 L リジン、 L アルギニン、 L ヒスチジン、 L—イソ口イシ ン、 L—パリン、 L ロイシン、 L—スレオニン、 L フエ-ルァラニン、 L チロシン、 L —トリブトファン、 L システィン及び L グルタミン酸力もなる群力も選択される一種 または二種以上の L—アミノ酸である、前記方法。
発明を実施するための最良の形態 [0008] 以下、本発明を詳細に説明する。
< 1 >本発明の微生物
本発明の微生物は、 L アミノ酸生産能を有する微生物であって、ォロト酸ホスホリ ボシルトランスフェラーゼの活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微 生物である。ここで、 L アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したと きに、培地中または菌体力 回収できる程度に L—アミノ酸を生成し、蓄積する能力 をいう。なお、本発明の微生物は複数の L アミノ酸の生産能を有するものであって もよい。 L アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的に L アミノ酸の生産 能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換え DNA技術 を利用して、 L—アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
[0009] L—アミノ酸の種類は特に制限されないが、 L—リジン、 L—オル二チン、 L—アルギ ニン、 L ヒスチジン、 L シトルリン等の塩基性アミノ酸、 L—イソロイシン、 L ァラ- ン、 L—パリン、 L ロイシン、グリシン等の脂肪族アミノ酸、 L—スレオニン、 L セリン 等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、 L—プロリン等の環式アミノ酸、 L —フエ-ルァラニン、 L チロシン、 L トリプトファン等の芳香族アミノ酸、 L システ イン、 L シスチン、 L—メチォニン等の含硫アミノ酸、 L グルタミン酸、 L ァスパラ ギン酸、 L グルタミン、 L ァスパラギン等の酸性アミノ酸が挙げられる。中でも L— リジン、 L アルギニン、 L ヒスチジン、 L—イソロイシン、 L—パリン、 L ロイシン、 L —スレオ-ン、 L フエ-ルァラニン、 L トリプトファン、 L システィン、及び L グ ルタミン酸が好ましぐ L リジン、 L グルタミン酸及び Lースレオニンが特に好まし い。
[0010] < 1 1 >L アミノ酸生産能の付与
本発明の微生物の親株としては、ェシエリヒア（Escherichia)属細菌、パントエア（Pa ntoea)属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物を用いることができる。その他 の腸内細菌科に属する微生物としては、ェンテロパクター（Enterobacter)属、クレブ シエラ（Klebsiella)属、セラチア（Serratia)属、ェルビ-ァ（Erwinia)属、サルモネラ（Sa lmonella)属、モルガネラ（Morganella)属などの γ—プロテオバクテリアに属する腸内 細菌科に属する微生物が挙げられる。 [0011] ェシエリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivati ons and uenotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K— 12, p. 2460—24 88. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washi ngton, D.C.)に挙げられるもの、例えばェシエリヒア'コリ等が利用できる。ェシエリヒア 'コリの野生株としては、例えば K12株又はその誘導体、ェシエリヒア'コリ MG1655株（ ATCC No.47076)、及び W3110株（ATCC No.27325)等が挙げられる。これらを入手 するには、例えばアメリカン'タイプ'カルチャー 'コレクション (ATCC)より分譲を受け ることができる（住所 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of Ame rica) o
[0012] また、ェンテロパクター属細菌としては、ェンテロバクタ一'アグロメランス（Enterobac ter agglomerans)、ェンァロノくクタ1 ~~ · /'エロクネス (Enterobacter aerogenes)等、パン トエア属細菌としてはパントエア.アナナティス（pantoea ananatis)が挙げられる。尚、 近年、ェンテロパクター.アグロメランスは、 16S rRNAの塩基配列解析などにより、 パントエア .アグロメランス (Pantoea agglomerans)又はパントエア ·アナナティス (Panto ea ananatis)、パントエア'スチューアルティ（Pantoea stewartii)等に再分類されている ものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、ェンテロバ クター属又はパントエア属の 、ずれに属するものであってもよ 、。パントエア ·ァナナ ティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア'アナナティス AJ 13355株（FERM BP— 6614)、 AJ13356株（FERM BP— 6615)、 AJ13601 株（FERM BP— 7207)及びそれらの誘導体などを用いることができる。これらの株 は、分離された当時はェンテロパクター 'アグロメランスと同定され、ェンテロパクター •アグロメランスとして寄託された力 上記のとおり、 16S rRNAの塩基配列解析などに より、パントエア'アナナティスに再分類されている。
[0013] 以下、上述したような親株に L アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの親株 にの L アミノ酸生産能を増強する方法につ!、て述べる。
L アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝 制御変異株の取得や、 L アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された遺伝子組 換え株の創製等、従来、エシ リヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用 することができる (アミノ酸発酵、（株)学会出版センター、 1986年 5月 30日初版発行、 第 77〜： LOO頁参照)。ここで、 L—アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養 要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよぐ 2種又は 3種以上 であってもよい。また、発現が増強される L アミノ酸生合成系酵素も、単独であって も、 2種又は 3種以上であってもよい。さら〖こ、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御 変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよ 、。
[0014] L アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、 L アミノ酸のアナログ耐性株、又 は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわち X線や紫外線 の照射、または N—メチル N' -トロ一 N -トロソグァ-ジン（NTG)、ェチルメタ ンスルフォネート（EMS)等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中か ら、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつ L—アミノ酸生産能 を有するものを選択することによって得ることができる。
[0015] 遺伝子組換えとしては、目的 L—アミノ酸の生合成に関する酵素をコードする遺伝 子の発現を増強する方法や、目的 L アミノ酸の分解に関する酵素をコードする遺 伝子の活性を低下させる方法などが挙げられる。
[0016] 以下、 L アミノ酸生産能を有する微生物の具体例を挙げるが、本発明において使 用することができる微生物は以下のものには限定されない。
[0017] (Lースレオニン生産菌）
本発明の Lースレオニン生産菌を誘導するための親株の例としては、 E. coli TDH- 6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第 5, 175, 107号、米国特許第 5, 705,371号)、 E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第 5, 631, 157号)、 E. coli NRRL- 21593 ( 米国特許第 5, 939,307号)、 E. coli FERM BP- 3756 (米国特許第 5,474,918号)、 E. coli FERM BP- 3519及び FERM BP- 3520 (米国特許第 5,376,538号)、 E. coli MG442 (Gu syatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978》、 E. coli VL643及び VL20 55 (EP 1149911 A)などのエシ リヒア属に属する株が挙げられる力 これらに限定さ れない。
[0018] TDH- 6株は thrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、その ilvA遺伝子 力 Sリーキー (leaky)変異を有する。この株はまた、 rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニン またはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。 B-3996株は、 RSF1010由 来ベクターに、変異 thrA遺伝子を含む thrA*BCオペロンを挿入したプラスミド pVIC40 を保持する。この変異 thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的 に解除されたァスバルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼ Iをコードする。 B-3996 株は、 1987年 11月 19日、オールユニオン 'サイエンティフィック 'センタ一'ォブ 'アン チビォテイクス (Nagatinskaya Street 3- A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号 RIA 1867で寄託されている。この株は、また、 1987年 4月 7日、ルシアン 'ナショナル'コレク シヨン'ォブ 'インダストリアル 'マイクロオルガ-ズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号 VKPM B-3996で寄託されている。
[0019] E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、本発明の Lースレオ-ン生産菌を誘導す るための親株として使用できる。 B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミド PVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域力 温度感受性ラムダファージ C1リプレ ッサー及び PRプロモーターにより置換されている。 VKPM B-5318は、 1990年 5月 3日 、ルシアン ·ナショナル 'コレクション'ォブ 'インダストリアル ·マイクロオルガ二ズムズ (V KPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号 VKPM B-5318 で寄託されている。
[0020] 好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の 1種以上の発現が増大する ように改変されたものである。
[0021] スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のァスバルトキナーゼホモセリンデヒドロゲ ナーゼ Iをコードする変異 thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードする thrB遺伝子
スレオ-ンシンターゼをコードする thrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードする rhtA遺伝子
ァスパルテート 13ーセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする asd遺伝子 ァスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ァスパルテートトランスアミナーゼ）をコードす る aspC遺 子
[0022] E. coliのァスバルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼ Iをコードする thrA遺伝子は 明らかにされている（ヌクレオチド番号 337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990) o thrA遺伝子は、 E. coli K- 12の染色体において、 thrL遺伝子と thrB 遺伝子との間に位置する。 E. coliのホモセリンキナーゼをコードする thrB遺伝子は明 らかにされている (ヌクレオチド番号 2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, g i: 49175990)。 thrB遺伝子は、 E. coli K-12の染色体において、 thrA遺伝子と thrC遺 伝子との間に位置する。 E. coliのスレオニンシンターゼをコードする thrC遺伝子は明 らかにされている（ヌクレオチド番号 3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990) o thrC遺伝子は、 E. coli K- 12の染色体において、 thrB遺伝子と yaaX オープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単 一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるに は、転写に影響するァテ-ユエ一ター領域を、好ましくは、オペロンから除去する (W 02005/049808, WO2003/097839)。
[0023] スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のァスバルトキナーゼホモセリンデヒドロ ゲナーゼ Iをコードする変異 thrA遺伝子、ならびに、 thrB遺伝子及び thrC遺伝子は、 スレオ-ン生産株 E. coli VKPM B- 3996に存在する周知のプラスミド pVIC40から一つ のオペロンとして取得できる。プラスミド PVIC40の詳細は、米国特許第 5,705,371号に 記載されている。
[0024] rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードする glnHPQオペロンに近い E. col i染色体の 18分に存在する。 rhtA遺伝子は、 ORF1 (ybiF遺伝子，ヌクレオチド番号 76 4〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、 pexB遺 伝子と ompX遺伝子との間に位置する。 ORF1によりコードされるタンパク質を発現す るユニットは、 rhtA遺伝子と呼ばれている（rht:ホモセリン及びスレオニンに耐性)。ま た、 rhtA23変異が、 ATG開始コドンに対して- 1位の G→A置換であることが判明して ヽる (ABSTRACTS of the 17 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemist ry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24—29, 1997, abstract N o. 457, EP 1013765 A；)。
[0025] E. coliの asd遺伝子は既に明らかにされており（ヌクレオチド番号 3572511〜357140 8, GenBank accession NC_000913.1 , gi: 16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づ いて作製されたプライマーを用いる PCRにより得ることができる（White, T.J. et al , Tr ends Genet. , 5, 185 (1989)参照）。他の微生物の asd遺伝子も同様に得ることができ る。
[0026] また、 E. coliの aspC遺伝子も既に明らかにされており（ヌクレオチド番号 983742〜98 4932, GenBank accession NC— 000913.1 , gi: 16128895)、 PCRにより得ることができる。 他の微生物の aspC遺伝子も同様に得ることができる。
[0027] (L リジン生産菌）
ェシエリヒア属に属する L—リジン生産菌の例としては、 L—リジンアナログに耐性を 有する変異株が挙げられる。 L—リジンアナログはェシエリヒア属に属する細菌の生 育を阻害するが、この阻害は、 L リジンが培地に共存するときには完全にまたは部 分的に解除される。 L リジンアナログの例としては、ォキサリジン、リジンヒドロキサメ ート、 S - (2—アミノエチル） L システィン (AEC)、 γ—メチルリジン、 oc—クロロカ プロラタタムなどが挙げられる力 これらに限定されない。これらのリジンアナログに対 して耐性を有する変異株は、ェシエリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に 付すことによって得ることができる。 L リジンの生産に有用な細菌株の具体例として は、 E. coli AJ 11442 (FERM BP- 1543, NRRL B- 12185;米国特許第 4,346, 170号参 照)及び E. coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、ァスバルトキナーゼの L— リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
[0028] WC196株は、 E. coliの L リジン生産菌として使用できる。この菌株は、 E. coli K-1 2に由来する W3110株に AEC耐性を付与することにより育種された。同株は、 Escheric hia coli AJ13069と命名され、 1994年 12月 6日、工業技術院生命工学工業技術研究 所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、 T 305-8566日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM P-14690として寄 託され、 1995年 9月 29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 F ERM BP-5252が付与されて!、る (米国特許第 5,827,698号)。
[0029] L リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 L リジン生合成 系酵素をコードする遺伝子の 1種以上の発現が増大している株も挙げられる。かかる 遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子 (dapA)、ァスパルトキナ ーゼ遺伝子 (lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子 (dapB)、ジアミノピメリン酸 デカルボキシラーゼ遺伝子 (lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 (ddh) ( 米国特許第 6,040, 160号)、フォスフォェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子 (pp c)、ァスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子 (asd)及びァスパルターゼ遺 伝子 (aspA) (EP 1253195 A)が挙げられる力 これらに限定されない。また、親株は、 エネルギー効率に関与する遺伝子 (cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチド トランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子 (pntAB) (米国特許第 5,830,716号)、 ybjE遺 伝子 (WO2005/073390)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子 (gdhA)(Ge ne23: 199-209(1983》または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよ い。なお、カツコ内は、その遺伝子の略記号である。
[0030] ェシエリヒア 'コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はし -リジンによるフィ ードバック阻害を受けることが知られており、ェシエリヒア'コリ由来の野生型ァスパル トキナーゼは L—リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られてい る。したがって、 dapA遺伝子及び lysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、 L— リジンによるフィードバック阻害を受けな 、変異型遺伝子であることが好ま 、。
[0031] L—リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素 をコードする DNAとしては、 118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配 列を有するタンパク質をコードする DNAが挙げられる。また、 L—リジンによるフィード バック阻害を受けな 、変異型ァスバルトキナーゼをコードする DNAとしては、 352位 のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、 323位のグリシン残基がァスパラギン残 基に置換、 318位のメチォニンがイソロイシンに置換された配列を有する ΑΚΠΙをコー ドする DNAが挙げられる（これらの変異体にっ 、ては米国特許第 5661012号及び第 6040160号明細書参照)。変異型 DNAは PCRなどによる部位特異的変異法により取 得することができる。
[0032] なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型 dapA及び変 異型ァスバルトキナーゼをコードする変異型 lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プ ラスミド RSFD80、 pCABl、 pCABD2が知られている（米国特許第 6040160号明細書）。 RSFD80で形質転換されたェシエリヒア'コリ JM109株（米国特許第 6040160号明細書 )は、 AJ12396と命名され、同株は 1993年 10月 28日に通産省工業技術院生命工学ェ 業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に 受託番号 FERM P-13936として寄託され、 1994年 11月 1日にブダペスト条約に基づく 国際寄託に移管され、 FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。 RSFD80 は、 AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
[0033] L リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 L リジンの生合 成経路から分岐して L リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性 が低下または欠損している株も挙げられる。 L—リジンの生合成経路力 分岐して L リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒ ドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ (米国特許第 5,827,698号)、及び、リンゴ酸 酵素 (WO2005/010175)が挙げられる。ここで、リジンデカルボキシラーゼ活性を低下 または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードする cadA遺伝子と ldc C遺伝子の両方の発現を低下させることが好ま ヽ。 （国際公開第 WO2006/038695 号パンフレット）
[0034] (L システィン生産菌）
本発明の L システィン生産菌を誘導するための親株の例としては、フィードバック 阻害耐性のセリンァセチルトランスフェラーゼをコードする複数種の cysEアレルで形 質転換された E. coli 15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第 2003121601 号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝 子を有する E. coli W3110 (米国特許第 5,972,663号)、システィンデスルフォヒドラーゼ 活性が低下した E. coli株 0P1H55571A2), cysB遺伝子によりコードされるシスティン レギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇した E. coli W3110 (WO0127307A1)な どのエシ リヒア属に属する株が挙げられる力 これらに限定されない。
[0035] (L一口イシン生産菌）
本発明の L ロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性の E . coil株（例えば、 57株（VKPM B-7386,米国特許第 6,124,121号》または j8— 2—チ ェ-ルァラニン、 3—ヒドロキシロイシン、 4—ァザロイシン、 5,5,5-トリフルォロロイシン などのロイシンアナログ耐性の E.coli株 (特公昭 62-34397号及び特開平 8-70879号)、 WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られた E. coli株、 E. coli H-9068 ( 特開平 8-70879号)などのエシ リヒア属に属する株が挙げられる力 これらに限定さ れない。
[0036] 本発明の細菌は、 L一口イシン生合成に関与する遺伝子の 1種以上の発現が増大 されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくは L— ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコ一 ドする変異 leuA遺伝子 (米国特許第 6,403,342号)に代表される、 leuABCDオペロンの 遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞力 L—アミノ酸を排出 するタンパク質をコードする遺伝子の 1種以上の発現が増大されることにより改良され ていてもよい。このような遺伝子の例としては、 b2682遺伝子及び b2683遺伝子 (ygaZH 遺伝子） (EP 1239041 A2)が挙げられる。
[0037] (L ヒスチジン生産菌）
本発明の L—ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、 E. coli 24株 (V KPM B-5945, RU2003677), E. coli 80株（VKPM B-7270, RU2119536)、 E. coli NRR L B- 12116 - B12121 (米国特許第 4,388,405号)、 E. coli H- 9342 (FERM BP- 6675) 及び H- 9343 (FERM BP- 6676) (米国特許第 6,344,347号)、 E. coli H- 9341 (FERM B P-6674) (EP1085087)、 E. coli AI80/pFM201 (米国特許第 6,258,554号)などのェシェ リヒア属に属する株が挙げられる力 これらに限定されない。
[0038] 本発明の L—ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、 L—ヒスチジン 生合成系酵素をコードする遺伝子の 1種以上の発現が増大した株も挙げられる。この ような遺伝子の例としては、 ATPフォスフオリボシルトランスフェラーゼ遺伝子 (hisG)、 フォスフオリボシル AMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子 (hisl)、フォスフオリボシル -ATPピロ フォスフォヒドロラーゼ遺伝子 (hisIE)、フォスフオリボシルフオルミミノ- 5-ァミノイミダゾ ールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子 (hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝 子 (hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子 (hisC)、ヒスチジ ノールフォスファターゼ遺伝子 (hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子 (hisD)な どが挙げられる。 [0039] hisG及び hisBHAFIにコードされる L ヒスチジン生合成系酵素はし ヒスチジンに より阻害されることが知られており、従って、 L ヒスチジン生産能は、 ATPフォスフオリ ボシルトランスフェラーゼ遺伝子 (hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異 を導入することにより効率的に増大させることができる (ロシア特許第 2003677号及び 第 2119536号)。
[0040] L ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、 L ヒスチジン生合成系酵素を コードする DNAを保持するベクターを導入した E. coli FERM-P 5038及び 5048 (特開 昭 56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子である rhtを導入した E.coli株 (EP1016710A)、 スルファグァ-ジン、 DL-1, 2,4-トリァゾール- 3-ァラニン及びストレプトマイシンに対す る耐性を付与した E. coli 80株 (VKPM B-7270,ロシア特許第 2119536号)などが挙げ られる。
[0041] (L グルタミン酸生産菌）
本発明の L—グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、 E. coli VL3 34thrC+ (EP 1172433)などのエシ リヒア属に属する株が挙げられる力 これらに限定 されない。 E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、 thrC遺伝子及び ilvA遺伝子に変異を 有する L—イソロイシン及び Lースレオニン要求性株である (米国特許第 4,278,765号） 。 thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型 E. coli K12株（VKPM B-7)の細胞で増殖し たパクテリオファージ P1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、 L イソロイシン要求性の L グルタミン酸生産菌 VL334thrC+ (VKPM B-8961)が得られ た。
[0042] 本発明の L—グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、 L ダルタミ ン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の 1種以上の発現が増大した株が挙げられる 力 これらに限定されない。このような遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナ ーゼ（gdhA)、グルタミンシンテターゼ (glnA)、グルタメートシンテターゼ (gltAB)、イソシ トレートデヒドロゲナーゼ (icdA)、アコ-テートヒドラターゼ (acnA, acnB)、シトレートシン ターゼ (gltA)、フォスフォェノールピルべートカルボシラーゼ (ppc)、ピルべ一トデヒドロ ゲナーゼ (aceEF, lpdA)、ピルべートキナーゼ (pykA, pykF)、フォスフォェノールピル ベートシンターゼ (ppsA)、エノラーゼ (eno)、フォスフォグリセロムターゼ (pgmA, pgml)、 フォスフォグリセレートキナーゼ (pgk)、グリセルアルデヒド- 3-フォスフェートデヒドロゲ ナーゼ (gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ (tpiA)、フルクトースビスフォスフエ ートアルドラーゼ (l p)、フォスフォフルクトキナーゼ（plkA, plkB)、グルコースフォスフ エートイソメラーゼ (pgi)などが挙げられる。
[0043] シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォェノールピルべ一トカルボキシラーゼ遺 伝子、及び Zまたはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改 変された株の例としては、 EP1078989A、 EP955368A及び EP952221Aに開示されたも のが挙げられる。
本発明の L—グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、 L ダルタミ ン酸の生合成経路から分岐して L グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵 素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、ィ ソシトレートリアーゼ (aceA)、 α -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ (sucA)、フォスフォト ランスァセチラーゼ (pta)、アセテートキナーゼ (ack)、ァセトヒドロキシ酸シンターゼ (ilv G)、ァセトラクテートシンターゼ (ilvl)、フオルメートァセチルトランスフェラーゼ (pfl)、ラタ テートデヒドロゲナーゼ (ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ (gadAB)などが挙げられ る。 α -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、 ひ -ケトグルタレ一 トデヒドロゲナーゼ活性が低下したェシエリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得 方法は米国特許第 5,378,616号及び第 5,573,945号に記載されて ヽる。
[0044] 具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ 12624 (FERM BP- 3853)
E. coli AJ 12628 (FERM BP- 3854)
E. coli AJ 12949 (FERM BP- 4881)
[0045] E. coli W3110sucA::Kmrは、 E. coli W3110の α -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ 遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株 は、 a -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損して 、る。
[0046] L—グルタミン酸生産菌の他の例としては、ェシエリヒア属に属し、ァスパラギン酸代 謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、 a -ケトグルタレートデ ヒドロゲナーゼを欠損していてもよぐ例えば、 E. coli AJ13199 (FERM BP- 5807) (米 国特許第 5.908,768号)、さらに L—グルタミン酸分解能が低下した AJ12624(FFRM P- 12379) (米国特許第 5,393,671号)； AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第 6,110,714 号)などが挙げられる。
[0047] L グルタミン酸生産菌の例としては、 α -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が 欠損した、または、 α -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属 に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株としては、 Pantoea ananatis AJ13356(米国特許第 6,331,419号)がある。 Pantoea ananatis AJ133 56は、 1998年 2月 19日に、工業技術院生命工学工業技術研究所 (現独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、 T 305-8566 日本国茨城県つくば巿 東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM P-16645として寄託され、 1999年 1月 1 1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP-6616が付 与されている。 Pantoea ananatis AJ13356は、 a KGDH- Elサブユニット遺伝子 (sucA) の破壊により α -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単 離 れた時には、 Enterobacter agglomeransと | 疋 れ、 Enterobacter agglomerans A J13356として寄託された。し力し、 16S rRNAの塩基配列などに基づき、 Pantoea anana tisに再分類された。 AJ13356は、上記寄託機関に Enterobacter agglomeransとして寄 託されている力 本明細書では、 Pantoea ananatisとして記載する。
[0048] (L フエ-ルァラニン生産菌）
本発明の L フエ-ルァラニン生産菌を誘導するための親株の例としては、 E.coli AJ12739 (tyrA::Tnl0, tyrR) (VKPM B- 8197)、変異型 pheA34遺伝子を保持する E.co li HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5, 354,672号)、 E.coli MWEC101— b (KR8903 681)、 E.coli NRRL B- 12141, NRRL B- 12145, NRRL B- 12146及び NRRL B- 12147 ( 米国特許第 4,407,952号)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力 これらに 限定されない。また、親株として、 E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP- 3 566)、 E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP— 12659)、 E. coli K-12 [W311 0 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP- 12662)及び AJ 12604と命名された E. coli K-12 [W 3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP- 3579)も使用できる (EP 488424 Bl)。 さらに、 yedA遺伝子または yddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大した エシ リヒア属に属する L フ -ルァラニン生産菌も使用できる (米国特許出願公開 2003/0148473 A1及び 2003/0157667 Al)。
[0049] (L トリブトファン生産菌）
本発明の L トリブトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、変異 trpS遺 伝子によりコードされるトリプトファ-ル -tRNAシンテターゼが欠損した E. coli JP4735/ PMU3028 (DSM10122)及び JP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第 5, 756,345号)、 セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼを コードする serAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラ- レートシンターゼをコードする trpEアレルを有する E. coli SV164 (pGH5) (米国特許第 6, 180,373号)、トリプトフアナーゼが欠損した E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B- 12263 )及び AGX6(pGX50)aroP (NRRL B- 12264) (米国特許第 4,371, 614号)、フォスフォエノ 一ルビルビン酸生産能が増大した E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO970833 3,米国特許第 6,319,696号)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力 これら に限定されな ヽ。 yedA遺伝子または yddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が 増大したェシエリヒア属に属する L トリブトファン生産菌も使用できる (米国特許出願 公開 2003/0148473 A1及び 2003/0157667 Al)。
[0050] 本発明の L トリブトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、アントラ-レ ートシンターゼ (trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ (serA)、及び、トリプトフ アンシンターゼ (trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられ る。アントラ-レートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共に L トリプトファン及び L セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻 害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具 体例としては、脱感作型アントラ-レートシンターゼを保持する E. coli SV164、及び、 フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする 変異 serA遺伝子を含むプラスミド pGH5 (WO 94/08031)を E. coli SV164に導入するこ とにより得られた形質転 ·が挙げられる。
[0051] 本発明の L トリブトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、解除型アン トラ-レートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリブトファンオペロンが導入された 株 (特開昭 57-71397号，特開昭 62-244382号，米国特許第 4,371,614号)も挙げられる 。さらに、トリプトファンオペロン (trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝 子の発現を増大させることにより L—トリブトファン生産能を付与してもよ 、。トリプトフ アンシンターゼは、それぞれ trpA及び trpB遺伝子によりコードされる α及び βサブュ ニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を 増大させることにより L トリブトファン生産能を改良してもよい (WO2005/103275)。
[0052] (Lーチロシン生産菌）
本発明の Lーチロシン生産菌を誘導するための親株の例としては、芳香族アミノ酸 の生合成系酵素、例えばデォキシァラビノーヘプッロン酸リン酸シンターゼ (aroG)、 3 —デヒドロキネートシンターゼ（aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE)、シキミ酸キナ ーゼ（aroL)、 5—ェノール酸ピルビンシキミ酸 3—リン酸シンターゼ（aroA)、コリスミ酸 シンターゼ (aroC)を増強した菌株が挙げられる。 （欧州出願公開 763127号明細書)ま た、これらの遺伝子はチロシンリブレッサーによって制御されることが知られており（ty rR)、 tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を増 強してもよい (欧州特許 763127号明細書参照)。これらの酵素活性増強は、 L—トリプ トフアン生産菌、 L—フエ-ルァラニン生産菌の誘導にも適用できる。
[0053] (L プロリン生産菌）
本発明の L—プロリン生産菌を誘導するための親株の例としては、 ilvA遺伝子が欠 損し、 L—プロリンを生産できる E. coli 702ilvA (VKPM B- 8012) (EP 1172433)などの ェシエリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されな!、。
[0054] 本発明の細菌は、 L プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大 することにより改良してもよい。 L プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、 L —プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードする pr oB遺伝子 (ドイツ特許第 3127361号)が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の 細胞力 L—アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が 増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、 b2682遺伝子及び b26 83遺伝子 (ygaZH遺伝子） (EP1239041 A2)が挙げられる。 [0055] L プロリン生産能を有するェシエリヒア属に属する細菌の例としては、 NRRL B-12 403及び NRRL B-12404 (英国特許第 2075056号)、 VKPM B- 8012 (ロシア特許出願 2 000124295)、ドイツ特許第 3127361号に記載のプラスミド変異体、 Bloom F.R. et al (T he 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などの E. coli 株が挙げられる。
[0056] (L アルギニン生産菌）
本発明の L アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、 E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開 2002/058315 Al)、及び、変異 N-ァセチルダ ルタメートシンターゼを保持するその誘導株 (ロシア特許出願第 2001112869号)、 E. c oli 382株（VKPM B-7926) (EP1170358A1)、 N-ァセチルダルタメートシンテターゼを コードする argA遺伝子が導入されたアルギニン生産株 (EP1170361A1)などのェシエリ ヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されな!、。
[0057] 本発明の L—アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、 L—アルギ- ン生合成系酵素をコードする遺伝子の 1種以上の発現が増大した株も挙げられる。こ のような遺伝子の例としては、 N-ァセチルダルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝 子 (argC)、オル-チンァセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (argj)、 N-ァセチルダルタメ ートキナーゼ遺伝子 (argB)、ァセチルオル-チントランスアミナーゼ遺伝子 (argD)、ォ ル-チン力ルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子 (argF)、アルギノコハク酸シンテター ゼ遺伝子 (argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子 (argH)、力ルバモイルフォスフエ一 トシンテターゼ遺伝子 (car AB)が挙げられる。
[0058] (L パリン生産菌）
本発明の L パリン生産菌を誘導するための親株の例としては、 ilvGMEDAオペ口 ンを過剰発現するように改変された株 (米国特許第 5,998,178号)が挙げられるが、こ れらに限定されな 、。ァテ-ユエーシヨンに必要な ilvGMEDAオペロンの領域を除去 し、生産される L—ノ《リンによりオペロンの発現が減衰しな 、ようにすることが好ま ヽ 。さらに、オペロンの ilvA遺伝子が破壊され、スレオ-ンデアミナーゼ活性が減少する ことが好ましい。
[0059] 本発明の L パリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシル t- RNA シンテターゼの変異を有する変異株 (米国特許第 5,658,766号)も挙げられる。例えば 、イソロイシン tRNAシンテターゼをコードする ileS遺伝子に変異を有する E. coli VL19 70が使用できる。 E. coli VL1970は、 1988年 6月 24日、ルシアン 'ナショナル'コレクシ ヨン'ォブ 'インダストリアル 'マイクロオルガ-ズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号 VKPM B- 4411で寄託されている。
[0060] さらに、生育にリポ酸を要求する、及び Zまたは、 H+-ATPaseを欠失している変異株 (WO96/06926)を親株として用いることができる。
[0061] (L イソロイシン生産菌）
本発明の L—イソロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、 6—ジメチル アミノブリンに耐性を有する変異株 (特開平 5-304969号)、チアイソロイシン、イソ口イシ ンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらに DL-ェチ ォニン及び Zまたはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株 (特開平 5-130 882号).が挙げられる力 これらに限定されない。さらに、スレオ-ンデァミナーゼ、ァ セトヒドロキシ酸シンターゼなどの L—イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコー ドする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる (特開平 2-458 号， FR 0356739,及び米国特許第 5, 998,178号)。
なお、本発明に用いる細菌は、グリセロールの資化性を高めるために、 glpR遺伝子（ EP1715056)の発現が弱化されている力、、 glpA、 glpB、 glpC、 glpD、 glpE、 glpF、 glpG、 glpK、 glpQ、 glpT、 glpX、 tpiA、 gldA、 dhaK、 dhaL、 dhaM、 dhaR、 fsa及び taに遺伝子 等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A)の発現が強化されていてもよい。
[0062] < 1 2 >活性の増強
本発明の微生物は、上述したような L アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科に属 する微生物を、ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下「OPRTase」と略す)活 性が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、 OPRTase活性が 増強するように改変を行った後に、 L アミノ酸の生産能を付与してもよい。
[0063] なお、 OPRTase活性の増強は、後述するように、 OPRTaseをコードする遺伝子の発 現量 (転写量)を増大させるように改変することによって達成でき、遺伝子の発現量の 増大はプロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性遺伝子の 発現増強によるものであってもよいし、遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因 性遺伝子の発現増強によるものであってもよい。 OPRTaseの活性上昇は、 OPRTase の翻訳量を増大させるように pyrE遺伝子を改変することによつても達成することかでき る。また OPRTaseの活性上昇は、 pyrE遺伝子のァテ-ユエ一ター領域を欠損させるこ と、また OPRTaseの上流領域にフレームシフト変異を導入することによつても、達成す ることができる。また、 OPRTaseの活性上昇は、 OPRTaseの翻訳量を増大させるように pyrE遺伝子を改変することによつても達成することかできる。さらに、これらを組み合 わせてもよい。
[0064] 本発明の OPRTase活性とは、ォロチジン 5 '-リン酸と二リン酸からォロト酸と 5-ホスホ a D リボース一リン酸を生成する活性を意味し（下記式参照）、ォロチン酸ホス ホリボシルトランスフェラーゼとも呼ばれる（EC 2.4.2.10 ) o
[0065] ォロチジン 5，-リン酸 +二リン酸→ォロト酸 + 5-ホスホー a—D リボース一リン酸 [0066] OPRTase活性の増強は、 Poulsenらの方法によって確認できる。（Eur.J.Biochem.13 5:223-229 1983)
[0067] 「OPRTase活性が増強するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対し て細胞あたりの OPRTaseの分子の数が増大した場合や、 OPRTaseの 1分子当たりの 活性が向上した場合が該当する。 OPRTaseの活性は野生株又は非改変株と比較し て、菌体当たり 150%以上、好ましくは 200%以上、さらに望ましくは菌体当たり 300%以 上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内 細菌科に属する微生物としては、ェシエリヒア'コリ MG1655株（ATCCNo.47076)、及 び W3110株（ATCCNo.27325)、パントエア ·アナナティス AJ13335株（FERM BP- 6615 )などが挙げられる。
[0068] OPRTase活性の増強は、 OPRTaseをコードする遺伝子の発現量を増強させるように 改変することによって達成できる。発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて 向上していることの確認は、 mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較すること によって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンノヽイブリダィゼーシヨン、 RT— PCR力 けられる (Molecular cloning (し old spring Harbor Laboratory Press, Cola spring Harbor(USA),2001) ) o発現量については、野生株あるいは非改変株と比較し て、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて 1. 5倍以 上、より好ましくは 2倍以上、さらに好ましくは 3倍以上上昇していることが望ましい。ま た、 OPRTase活性の増強は、 OPRTaseのタンパク質量が非改変株、野生株と比較し て上昇していることによって確認することができ、例えば抗体を用いたウェスタンプロ ットによって検出すること力 S出来る。 (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laborato ry Press.Cold spring Harbor(USA),2001) )。
[0069] OPRTase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 (pyrE遺伝子）としては、例え ば、エシ リヒア'コリの pyrE遺伝子、具体的には、配列番号 11の塩基番号 782〜14 23の塩基配列を有する pyrE遺伝子 (GenBank Accession No.NC_00913 VERSION N C_000913.2 GI:49175990の塩基番号 3813150〜3813791の相補鎖)が挙げられる。
[0070] 他の微生物由来 pyrE遺伝子としては、例えば、 GenBank Accession No. NC_00408 8の 577565..579529の相補鎖に示されるエルシ-ァ'ぺステイスの pyrE遺伝子、 GenB ank Accession No. AL627282の 120832..122790の相補鎖に示されるサルモネラ 'チ フィの PYRE遺伝子、 GenBank Accession No. NC— 002505の 305121..307121の相補鎖 に示されるビブリオ'コレラェの pyrE遺伝子、 NC_003197の 4513714..4515672の相補 鎖に示されるサルモネラ'チフィムリウムの OPRTase遺伝子などが挙げられる。
[0071] さらに、 pyrE遺伝子のホモログは、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて 、ェシエリヒア属、ェンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エノレビ二ァ属、 エルシ-ァ属等の Ύ—プロテオバクテリア、コリネバタテリゥム'ダルタミカム、ブレビバ クテリゥム ·ラタトフアーメンタム等のコリネ型細菌、シユードモナス ·ァエルジノーサ等 のシユードモナス属細菌、マイコバクテリゥム 'ッベルク口シス等のマイコバクテリゥム 属細菌等力 クローニングされるものであってもよぐ例えば配列番号 9、 10に示され る合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅出来るものであってもよい。アミノ酸配列およ び塩基配列の相同性は、例えば Karlinおよび Altschulによるアルゴリズム BLAST(Pr 0. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993》や Pearsonによる FASTA(Methods Enzymol. , 183, 63 (1990》を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて 、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている（www.ncbi.nlm.nih.gov 参照)。 [0072] pyrE遺伝子のホモログとは、他の微生物由来または天然もしくは人工の変異型遺 伝子で、上記の pyrE遺伝子と構造が高い類似性を示し、宿主に導入あるいは増幅し た際に OPRTase活性を向上させる機能を有する遺伝子を意味する。 pyrE遺伝子のホ モログは、配列番号 12のアミノ酸配列全体に対して、 80%以上、好ましくは 90%以 上、より好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の相同性を有し、かつ、 OPR Tase活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。なお、 OPRTase活性を有 することは、これらの遺伝子を宿主細胞で発現させ、 OPRTase活性を調べることによ つて確認することができる。
[0073] また、本発明に用いる pyrE遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるタ ンパク質の OPRTase活性が損なわれな ヽ限り、配列番号 12のアミノ酸配列にお 、て 、 1若しくは複数の位置での 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等 を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であっても よい。
[0074] ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類に よっても異なるが、具体的には 2〜20個、好ましくは 2〜10個、より好ましくは 2〜5個 を意味する。上記置換は保存的置換が好ましぐ保存的変異とは、置換部位が芳香 族アミノ酸である場合には、 Phe、 Trp、 Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場 合には、 Leu、 Ile、 Val間で、極性アミノ酸である場合には、 Gln、 Asn間で、塩基性アミ ノ酸である場合には、 Lys、 Arg、 His間で、酸性アミノ酸である場合には、 Asp、 Glu間 で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、 Ser、 Thr間でお互いに置換する変 異である。保存的置換としては、 Alaから Ser又は Thrへの置換、 Argから Gln、 His又は Lysへの置換、 Asnから Glu、 Gln、 Lys、 His又は Aspへの置換、 Aspから Asn、 Glu又は G Inへの置換、 Cysから Ser又は Alaへの置換、 Ginから Asn、 Glu、 Lys、 His, Asp又は Arg への置換、 Gluから Gly、 Asn、 Gln、 Lys又は Aspへの置換、 Glyから Proへの置換、 His から Asn、 Lys, Gln、 Arg又は Tyrへの置換、 lieから Leu、 Met, Val又は Pheへの置換、 Leuから Ile、 Met, Val又は Pheへの置換、 Lysから Asn、 Glu、 Gln、 His又は Argへの置 換、 Metから Ile、 Leu、 Val又は Pheへの置換、 Pheから Trp、 Tyr, Met, lie又は Leuへの 置換、 Serから Thr又は Alaへの置換、 Thrから Ser又は Alaへの置換、 Trpから Phe又は Tyrへの置換、 Tyrから His、 Phe又は Trpへの置換、及び、 Valから Met、 lie又は Leuへ の置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または 逆位等には、 OPRTase遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合 などの天然に生じる変異（mutant又は variant)によって生じるものも含まれる。
[0075] また pyrE遺伝子は、配列番号 12の塩基配列の相補配列又は該配列から調製され 得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、 OPRTas e活性を有するタンパク質をコードする DNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな 条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形 成されない条件をいい、具体的には、通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗いの 条件である 60。C、 1 X SSC, 0. 1%SDS、好ましくは、 60。C、 0. 1 X SSC、 0. 1%S DSさらに好ましくは、 68。C、0. 1 X SSC、0. 1%SDSに相当する塩濃度、温度で、 1回より好ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
[0076] 上記 pyrE遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利 用して、細胞中のこれらの遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。 例えば、これらの遺伝子を含む DNA断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ま しくはマルチコピー型のベクターと連結して組換え DNAを作製し、これを微生物に導 入して形質転換すればよ!ヽ。
[0077] pyrE遺伝子としてェシエリヒア'コリの pyrE遺伝子を用いる場合、配列番号 11の塩 基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号 9、 10に示すプライマーを 用いて、ェシエリヒア'コリの染色体 DNAを铸型とする PCR法（PCR:polymerase chain reaction; White.T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、 pyrE遺伝子 を取得することができる。他の微生物の pyrE遺伝子も、それぞれその微生物におい て公知の OPRTase遺伝子もしくは他種の微生物の pyrE遺伝子又は pyrEタンパク質の 配列情報に基づ 、て作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとする PCR法、又は、 前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダィゼ ーシヨン法によって、微生物の染色体 DNA又は染色体 DNAライブラリーから、取得 することができる。なお、染色体 DNAは、 DNA供与体である微生物から、例えば、 斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、 生物工学実験書、 日本生物工学会編、 97〜98頁、培風館、 1992年参照)等により 調製することができる。
[0078] 次に、 PCR法により増幅された pyrE遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能 することのできるベクター DNAに接続して組換え DNAを調製する。宿主微生物の細 胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において 自律複製可能なベクターを挙げることができる。
[0079] ェシエリヒア'コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、 pUC19、 pUCl 8、 pHSG299、 pHSG399、 pHSG398、 pACYC184 (pHSG、 pACYCは宝バイオ社より入 手可）、 RSF1010 (Gene vol.75 (2), p271- 288, 1989)、 pBR322、 pMW219、 pMW119 ( pMWは-ツボンジーン社より入手可）、 pSTV28、 pSTV29 (宝バイオ社製）等が挙げら れる。他にもファージ DNAのベクターも利用できる。
[0080] これらの遺伝子を上記ベクターに連結して組み換え DNAを調製するには、 pyrE遺 伝子を含む DNA断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、 T4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。 DNAの切断、連結、 その他、染色体 DNAの調製、 PCR、プラスミド DNAの調製、形質転換、プライマー として用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の 方法を採用することができる。これらの方法は、 Sambrook, J., Fritsch, E. F.， and Ma niatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
[0081] 上記のように調製した組換え DNAを微生物に導入するには、これまでに報告されて いる形質転換法に従って行えばよい。例えば、エレクト口ポレーシヨン法（Canadian Jo urnal of Microbiology, 43. 197(1997))が挙げられる。また、ェシエリヒア'コリ K— 12に つ!、て報告されて 、るような、受容菌細胞を塩ィ匕カルシウムで処理して DNAの透過 性を増す方法（Mandel,M.and Higa'A.J. Mol. Biol, 53, 159 (1970))があり、バチル ス'ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞力 コンビテントセル を調製して DNAを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young.F.E., Gene, 1, 153 (1977))を使用することもできる。
[0082] 一方、 pyrE遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を微生物の染色体 D NA上に多コピー存在させることによつても達成できる。微生物の染色体 DNA上にこ れらの遺伝子を多コピーで導入するには、染色体 DNA上に多コピー存在する配列を 標的に利用して相同組換えにより行う。染色体 DNA上に多コピー存在する配列として は、レペティティブ DNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド'リピートが利用 できる。あるいは、特開平 2-109985号公報に開示されているように、 OPRTase遺伝子 をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体 DNA上に多コピー導入すること も可能である。染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、これらの遺伝子 の一部をプローブとして、サザンノヽイブリダィゼーシヨンを行うことによって確認出来る
[0083] 宿主としてェシエリヒア'コリ K12株系統の菌株、例えば MG 1655株や W3110株を用 いる場合、以下の方法によっても ORPTase活性を上昇させることができる。ェシエリヒ ァ'コリでは、 pyrE遺伝子はその上流にある rphとオペロンを形成している。ェシエリヒ ァ 'コリ K12株の rph-pyrEオペロンの塩基配列を配列番号 11に示す。配列番号 11に おいて、 pyrEのコード領域は塩基番号 782〜 1423である。 K12株では、 rphのコード領 域の 3'末端側（配列番号 11の 667位と 671位の間）に- 1のフレームシフト変異があり、 その影響で ORPTaseの翻訳量が低減し、 OPRTaseの活性が低く抑えられている（Jou rnal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401- 3407)。従って、 OPRTaseの活'性を 上昇させるには、 rph遺伝子の 3'端領域より下流、かつ、 pyrE遺伝子の上流の領域に 前記- 1のフレームシフト変異を相補する変異、例えば +1変異又は- 2変異、または、 - 1変異もしくは +2変異を導入するすることにより、 ORPTaseの酵素活性を上昇させるこ とができる。具体的には、例えば、配列番号 11の 670位と 671位の間に 1塩基挿入し、 フレームシフトを相補する変異を導入することにより、 rphのコード領域が長くなり、 rph の翻訳終了位置とリボソームとの親和性の高いァテ-ユエータ領域が近くなることに よりリボソームが mRNAから遊離しにくなり、 ORPTaseの酵素活性を上昇させることが できると考えられる。このようなフレームシフトが解消された pyrE遺伝子上流域を含む rph-pyrEオペロンの塩基配列を、配列番号 13に例示する。配列番号 13において、 r phのコード領域は、塩基番号 1〜714である。
[0084] また、例えば，ァテ-ユエ一ター上流の領域を欠損し前記- 1のフレームシフトを相 補するような変異を導入することにより、 rphのコード領域が長くなり、 rphの翻訳終了 位置が pyrEの翻訳開始位置に近くなることにより、 ORPTaseの酵素活性を上昇させる ことができる。具体的には、配列番号 11の 610— 691位の塩基配列を欠失させること により達成できる。このような領域を欠損した rph-pyrEオペロンの塩基配列を、配列 番号 14に例示する。
[0085] さらに pyrE遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際 公開 00/18935号パンフレットに記載されたようにして、染色体 DNA上またはプラスミド 上のこれらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること や、これらの遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又はこ れらの遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させること によっても達成される。例えば、 lacプロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモーター、 tacプロモーター、ラムダファージの PRプロモーター、 PLプロモーター、 tetプロモータ 一等が強力なプロモーターとして知られて 、る。
[0086] プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、 Goldsteinらの論 文 (Prokaryotic promoters in Diotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-1 28)等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位 (RBS)と開始コドンとの間のス ぺーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換力 ¾iR NAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可 能である。これらのプロモーター置換または改変により OPRTase遺伝子の発現が強 化される。
[0087] さらに、 pyrE遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強するために、 OPR Tase活性が上昇するような変異をこれらの遺伝子に導入してもよ ヽ。 OPRTase活性が 上昇するような変異としては pyrE遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列 の変異、及び、 OPRTaseタンパク質の比活性が高くなるようなこれらの遺伝子のコー ド領域内の変異が挙げられる。
[0088] < 2 >L アミノ酸の製造法
本発明の L アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、 L ァミノ 酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体より L アミノ酸を回収 することを特徴とする。
[0089] 使用する培地は、微生物を用いた L アミノ酸の発酵生産において従来より用いら れてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必 要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭 素源としては、グルコース、シュクロース、ラタトース、ガラクトース、フラクトースゃでん ぶんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フ マール酸、クェン酸、コノ、ク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、 硫酸アンモ-ゥム、塩化アンモ-ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機アンモ-ゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることがで きる。有機微量栄養源としては、ビタミン Bl、 L ホモセリンなどの要求物質または酵 母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸力 リウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本 発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機 微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
特に本発明にお 、てはグリセロールを炭素源として用いることが好ま 、。グリセ口 ールは、試薬のグリセロールでもよいが、工業的に生産される不純物を含むグリセ口 ールを用いることが望ましい。たとえば、バイオディーゼル燃料生産のためのエステ ルイ匕反応によって、工業的に生産されるグリセロールを使用することが望ましい。
[0090] 本発明の培地に含まれるグリセロールは、単独の炭素源であってもよいし、グリセ口 ールに加え、他の炭素源を添カ卩した混合培地を用いてもよい。好ましいのは、ダルコ ース、フラクトース、スクロース、ラタトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物や バイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノールなどのアルコール 類、フマール酸、クェン酸、コハク酸等の有機酸類である。混合培地を用いる場合、 培地中のグリセロールの比率は 50%以上、 60%以上、望ましくは 70%以上、さらに望 ましくは 80%以上、特に望ましくは 90%以上含まれていることが望ましい。特にグリセ ロールは、バイオディーゼルの副生物として得られるものを利用することが好まし！/、。 (Mu Y, et al, Biotechnol Lett., 28, 1755-91759 (2006), Haas MJ,et al; Bioresour Te chnol. 97, 4, 671-8678 (2006)) [0091] 培養は好気的条件下で 1〜7日間実施するのがよぐ培養温度は 24°C〜37°C、培 養中の pHは 5〜9がよい。尚、 pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアル力 リ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からの L—アミノ酸 の回収は通常イオン交換榭脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることに より実施できる。なお、菌体内に L—アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超 音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清力 イオン交 換榭脂法などによって、 L—アミノ酸を回収することができる。
[0092] なお、塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中の pHが 6. 5〜9. 0、培養終了時 の培地の pHが 7. 2〜9. 0となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるよ うに制御するカゝ、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して 、培地中の重炭酸イオン及び Zまたは炭酸イオンが少なくとも 2gZL以上存在する 培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び Zまたは炭酸イオンを塩基性アミノ酸 を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、 目的の塩基性アミノ酸を回 収する方法で製造を行ってもよ!ヽ (特開 2002-065287号参照、米国特許出願公開第 2002025564号）。
実施例
[0093] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
[0094] 〔実施例 1〕 pyrE遺伝子の上流部分を欠失したグルタミン酸生産株の評価
(1)ェシエリヒア'コリの sucA遺伝子の欠損
ェシエリヒア'コリ MG 1655より sucA遺伝子欠損株を作製した。報告されている sucA 遺伝子の塩基配列に基づ 、てプライマーを合成し、 MG1655株のゲノム DNAを铸型 として、 sucA遺伝子の N末および C末断片を PCR法により増幅した。
[0095] N末端断片増幅用 PCR用プライマーにはプライマー 1、 2 (配列番号1、 2)を、 C末 端断片増幅用 PCR用プライマーにはプライマー 3、 4 (配列番号 3、 4)を用いた。ブラ イマ一 1には Hindlllサイトが、プライマー 4には Xbalサイトがそれぞれデザインされて いる。
[0096] PCR後の増幅 DNA断片は、それぞれ、 QIAquick PCR Purification Kit (キアゲン社 製）にて精製し、精製した N末端 DNA断片および C末端 DNA断片、及びプライマー 1 ゝ 4を用いて、クロスオーバー PCR法（A. J. Link, D. Phillips, G. M. Church, Journal o f Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997))〖こより、欠損型 sucA断片を得た。精製した DN A断片を、 Hindlll及び Xbal (宝酒造社製）にて切断した後、フエノール Zクロ口ホルム 処理、及びエタノール沈殿を行った。同様に Hindlll及び Xbalで切断した温度感受性 プラスミド pMAN997 (WO 99/03988号国際公開パンフレット）と前記 DNA断片とを DN A ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて連結した。この連結反応液にて、 JM109コ ンピテント細胞 (宝酒造社製)を形質転換し、アンピシリン (シグマ社製)を 25 μ g/mL 含む LB寒天プレート（LB +アンピシリンプレート）に塗布した。 30°Cで 1日培養後、生 育したコロニーを 25 μ g/mLのアンピシリンを含む LB培地で 30°Cにて試験管培養し、 自動プラスミド抽出機 PI-50 (クラボウ社製)を用いてプラスミド抽出を行った。得られた プラスミドを Hindlll及び Xbalで切断し、ァガロースゲル電気泳動を行って、 目的断片 が挿入されているプラスミドを sucA欠失用プラスミド pMAN_ A sucAとした。尚、前記 pM AN997は、 pMAN031(S. Matsuyama and S. Mizushima, J. BacterioL, 162, 1196 (198 5》と pUC19 (宝酒造社製)のそれぞれの Vspl- Hindlll断片を繋ぎ換えたものである。
[0097] プラスミド pMAN_ A sucAでェシエリヒア 'コリ\1〇1655株を C. T. Chungらの方法（Proc . Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2172 (1989))により形質転換し、 LB +アンピシリンプレ ートで 30°Cでコロニーを選択した。選択したクローンを 30°Cで一晩液体培養した後、 培養液を 10— 3希釈して LB +アンピシリンプレートにまき、 42°Cでコロニーを選択した。 選択したクローンを LB +アンピシリンプレートに塗り広げて 30°Cで培養した後、プレ ートの 1/8の菌体を LB培地 2 mLに懸濁し、 42°Cで 4〜5時間振とう培養した。 10— 5希 釈した培養液を LBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーを LBプレート と LB +アンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株 を選択した。アンピシリン感受性株の数株についてコロニー PCRを行い、 sucA遺伝子 の欠失を確認した。こうして E. coli MG1655由来の sucA欠損株 MG1655 A sucAを得 た。
[0098] (2)ェシエリヒア'コリの sucA遺伝子の欠損株 MG1655 A sucA株からの pyrE上流部分 が欠失した株 MG 1655 Δ sucA rph- pyrE(m)株の構築
MG1655 A sucA株の染色体上で、 遺伝子の上流（5 '側）にある rph遺伝子内の 82bp (E. coli MG1655 genomeの塩基配列 (GenBank ACCESSION :NC— 000913, VER SION :NC— 000913.2 GI:49175990の座標 3813882〜3813963、配列番号 11の塩基番 号 610〜691)は、以下のようにして欠失させることができる。まず、 MG1655染色体 DN Aを铸型とし、合成オリゴヌクレオチド 5、 6 (配列番号 5、 6)をプライマーとして PCRを 行い DNA断片 1を得る。同様にして合成オリゴヌクレオチド 7、 8 (配列番号 7、 8)をプ ライマーとして PCRを行い DNA断片 2を得る。次に、 DNA断片 1、 DNA断片 2の混合 物を铸型とし、オリゴヌクレオチド 5、 8をプライマーとして PCRを行うことにより、欠失型 rph-pyrE DNA断片を得、これを温度感受性プラスミド pMAN997 (WO 99/03988号国 際公開パンフレット)のマルチプルクローユングサイトに挿入することにより、欠失用プ ラスミド pMAN- rph- pyrE (m)を得る。このプラスミドで MG1655 A sucA株を C. T. Chu ngらの方法により形質転換し、 LB +アンピシリンプレートで 30°Cでコロニーを選択す る。選択したクローンを 30°Cで一晩液体培養した後、培養液を 10— 3希釈して LB +アン ピシリンプレートにまき、 42°Cでコロニーを選択する。選択したクローンを LB +アンピ シリンプレートに塗り広げて 30°Cで培養した後、プレートの 1/8の菌体を LB培地 2 mL に懸濁し、 42°Cで 4〜5時間振とう培養する。 10— 5希釈した培養液を LBプレートにまき 、得られたコロニーのうち数百コロニーを LBプレートと LB +アンピシリンプレートに植 菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株を選択する。アンピシリン感受性 株の数株についてコロニー PCRを行い、 pyrE遺伝子上流部分の目的の欠失を確認 する。こうして E. coli MG1655由来の sucA欠失株 MG1655 A sucAより pyrE上流部分が 欠失した株 MG1655 Δ sucA rph- pyrE(m)株を得ることができる。
[0099] (3) MG1655 Δ sucA rph- pyrE(m)株のグルタミン酸生成能の評価
pyrE遺伝子上流の欠失による L—グルタミン酸発酵への効果を検討するため、 MG 1655 Δ sucA Δ sucA rph- pyrE(m)株を、 sucA遺伝子欠損株 MG1655 Δ sucAを対照とし て培養し、 L—グルタミン酸生産量を測定した。そのための培地および培養方法なら びに分析方法を以下に示す。 26.6時間培養後の L グルタミン酸収率を表 1に示し た。独立に取得した 2クローンにつ!/、てシングルコロニーアイソレーションして得た株 各 2株づつ、計 4株を培養し、グルタミン酸収率の平均値を示した。
[0100] 〔MS培地〕 (最終濃度）
グルコース 40 g/L (別殺菌）
MgSO · 7Η O l g/L (別殺菌）
4 2
(NH ) SO 16 g/L
4 2 4
KH PO 1 g/L
2 4
Yeast Extract 2 g/L
FeSO 0.01 g/L
4
MnSO 0.01 g/L
4
CaCO 30 g/L (別殺菌）
3
[0101] 〔培養方法〕
リフレッシュ (refresh)培養;保存状態の菌を LB寒天培地に接種し、 37°C、 24時間培
^し/こ。
種 (seed)試験管培養；リフレッシュ培養した菌を LB液体培地 (必要に応じて薬剤添加 )に接種し、 37°C、 16時間培養した。
主 (main)培養;種培養液体培地から 10%MS液体培地 (必要に応じて薬剤添加）に接 種し、 37。C、 20ml/500ml容坂ロフラスコで培養した。
[0102] 〔分析方法〕
グルコース濃度、及び L—グルタミン酸濃度は、培養液を 15，000rpmで 5分間遠心し
、その上清液を適当倍率に水で希釈してバイオバイオテックアナライザー AS-210 (サ クラ精器)により測定した。尚、培養 26.6時間後の培地中のグルコース濃度は llg/1で あった。
[0103] [表 1] 表 1 MG1655 A SUGA 卬 h- pyrE (m)株のグルタミン酸生成能の評価
Figure imgf000032_0001
[0104] 〔実施例 2〕 pyrE遺伝子を増幅したスレオニン生産株の評価 (1)ェシエリヒア'コリのスレオニン生産株 B-3996、 B-5318からの pyrE増幅株の構築 pyrE増幅用のプラスミドを以下のようにして構築した。 MG1655染色体 DNAを铸型と し、合成オリゴヌクレオチド 9、 10 (配列番号 9、 10)をプライマーとして PCRを行い、 py rE遺伝子断片を得た。これをプラスミドベクター pMW219 (二ツボンジーン）または pST V28 (TaKaRa)の Smalサイトにクローユングし、それぞれ pMW219- pyrE、 pSTV28- pyr Eを得た。
[0105] スレオニン生産菌 B-3996株、 B- 5318株からの pyrE遺伝子増幅株は、 B-3996株、 B - 5318株に \1\^219- 、 pSTV28- pyrEをエレクト口ポレーシヨンにより導入すること によって得ることができる。
[0106] (2)ェシエリヒア'コリのスレオニン生産株 B- 3996、 B- 3996の pyrE増幅株の L—スレオ ニン生産能の評価
B-3996、 B-3996由来 pyrE増幅株を、下記のようにして培養した後、培養液の Lース レオニンを定量し、対照の非増幅株と比べてスレオニン収率が高 、ことを示すことが できる。
[0107] (培地）
グルコース 40.0 g/1 (A), K ΗΡΟ 0.7 g/1 (Β), Thiamine HC1 0.2mg/l (C), MgSO - 7
2 4 4 aql.0g/l(D),(NH ) SO 16.0 g/1 (D), FeSO · 7&¾0.01§/1(θ),Μη8Ο '5aq0.01g/l,ィー
4 2 4 4 4
ストエキストラタト 2.0 g/1 (D), L-イソロイシン 0.05 g/1 (D)。 A, B, Dは、それぞれ KOH で pH7.0にあわせ、別々に殺菌（115°C, 10分オートクレープ）した後混合し、フィルタ 一滅菌した (C)を添加する。
[0108] (培養方法）
LB培地でー晚培養した培養液 1 mlを、 20 mlの上記培地に植菌し、 500 ml坂ロフラ スコにて 37°Cで振とう培養する。
[0109] (分析方法）
培養液を 15,000rpmで 5分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈し、ァミノ 酸アナライザー L-8500で測定する。
[0110] 〔実施例 3〕pyrE遺伝子を増幅した L グルタミン酸生産株の評価
また、 OPRTase活性が上昇した L グルタミン酸生産菌の親株として、パントエア' アナナティス AJ13601株を用いることが出来る。なお、パントエア'アナナティス AJ1360 1株は経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 (郵便番号 305-8566 茨城 県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に受託番号 FERM P-17516として 1999年 8月 18日に寄 託され、 2000年 7月 6日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FE RM BP-7207が付与されている。 L—グルタミン酸生産菌からの pyrE遺伝子増幅株の 構築は、実施例 2と同様の方法で pMW219-pyrE, pSTV28-pyrEを導入することにより 得ることが出来る。
[0111] pyrE遺伝子増幅株は、 L—グルタミン酸生産培地で培養し、往復振とう培養装置で 培養する。培養後、培地中に蓄積した L グルタミン酸の量を公知の方法により測定 し、 L—グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法で L—ダル タミン酸生産能の向上した pyrE遺伝子増幅株を取得することが出来る。
[0112] 〔実施例 4〕 OPRTase活性を増強した L リジン生産菌の構築
< 1 > OPRTase活性向上株の構築
国際公開第 2006/078039号パンフレット記載のェシエリヒア'コリ WC196 A cadA A id c株の OPRTase活性を増強した。この菌株は、ェシエリヒア'コリ WC196のリジンデカル ボキシフーで ¾fc子 cadA及び ldc 、 Red-driven integration法 (Datsenko, K. A. and Wanner, B. L" 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640- 6645)とえファージ由来 の切り出しシステム（Cho, E. H" Gumport, R. I" Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 52 00-5203 (2002))とを組合わせた方法 (WO2005/010175号参照）により、破壊した株 である。
[0113] WC196 A cadA A ldc株の染色体上の pyrE遺伝子の上流の配列を、同遺伝子が tac Mlプロモーターにより制御されるように改変した。改変された pyrE遺伝子の塩基配列 を配列番号 16に示す。配列番号 16の塩基番号 1741〜2382力 ¾yrEコード領域である 。改変 pyrE遺伝子の発現は、ァテニユエ一ターによる制御を受けず、また、転写産物 の OPRTaseへの翻訳も、 rph遺伝子のフレームシフト変異による影響を受けない。
[0114] 上記の pyrE遺伝子の改変には、配列番号 15に示す塩基配列を用いた。配列番号 15に示される塩基配列において、塩基番号 1〜172がえファージの attR配列、配列 番号 324〜983がクロラムフエ-コール而性遺伝子（cat)、塩基配列 1540〜1653が λ ファージの attL配列、塩基番号 1654〜1733が tacMlプロモーターであり、残りの部分 は pMWl 18に由来する配列である。なお、 tacMlプロモーターは、 tacプロモーター（G ene 25 (2-3), 167-178 (1983))の- 35領域の TTGACA配列を TTGGCA (配列番号 15 の塩基番号 1669〜1674)に置換することで構築することができる。配列番号 16の配 列は、 WO2005/010175に記載の pMWl 18-attL- Cm- attRを参考に構築することが可 能である。
[0115] 配列番号 15の配列を有する DNA断片を铸型として、配列番号 17と配列番号 18 に示す塩基配列を有するプライマーを用いた PCRにより増幅し、この増幅産物をえ- 1¾0法(\^02005/010175)にょり\^ 96厶じ&(1 厶1(1(；株の染色体上に揷入し、 pyrE上 流のプロモーター配列が改変された株を取得した。これによつて、ォロト酸ホスホリボ シルトランスフェラーゼ活性が向上した株 WC196 Δ cadA Δ WcCPtacMlpyrE::Cm株を 得た。
[0116] < 2> OPRTase活性を増強した L-リジン生産菌の構築
WC196 Δ cadA Δ ldcC株、及び WC196 Δ cadA Δ WcCPtacMlpyrE::Cm株を dapAゝ d apB及び lysC遺伝子を搭載した Lys生産用プラスミド pCABD2 (国際公開第 WO01/53 459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、 WC196 A cadA A ldcC /pCABD2株、 WC196 Δ cadA Δ WcCPtacMlpyrE::Cm/pCABD2を得た。
[0117] これらの株を 20mg/Lのストレプトマイシンを含む L培地にて終 OD600 0.6となるよう に 37°Cにて培養した後、培養液と等量の 40%グリセロール溶液をカ卩えて攪拌した後 、適当量ずつ分注し- 80°Cに保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
[0118] 〔実施例 5〕 OPRTase活性を強化した L リジン生産菌の評価
[0119] 上記グリセロールストックを融解し、各 100 μ Lを、 20mg/Lのストレプトマイシンを含む Lプレートに均一に塗布し、 37°Cにて 24時間培養した。得られたプレート 1枚のおよそ 1/8量の菌体を、 500mL坂口フラスコ中の、 20mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培 地 20 mLに接種し、往復振とう培養装置で 37°Cにおいて 24時間培養した。培養後、 培地中に蓄積した L リジンの量を公知の方法 (サクラ精機 バイオテックアナライザ 一 AS210)により測定した。発酵培地の組成を以下に示す。
[0120] 〔発酵培地組成〕 グリセロールまたはダルコ
(NH ) SO 24g/L
4 2 4
K HPO l.Og/L
2 4
gSO · 7Η Ο l.Og/L
4 2
FeSO · 7Η Ο O.Olg/L
4 2
nSO ·5Η Ο O.Olg/L
4 2
イーストエキストラクト 2.0g/L
KOHで pH7.0に調整し、 115。Cで 10分オートクレープ (但しグリセロールまたはダル コース、及び MgS04 ' 7H20は別殺)した後、局方 CaC03 30g/L (180°Cで 2時間乾熱 滅菌したもの）を入れる。
上記培地に 20mg/Lのストレプトマイシンを添カ卩した。培養は、温度 37°C、攪拌 115r pmの条件下で 24時間行った。
[0121] 結果を表 2に示す (〇Dは吸光度 660nmで 26倍希釈した菌体量、 Lys(g/L)はフラスコ に蓄積した L一リジン蓄積量を示す)。炭素源としてグリセロール及びグルコースのい ずれを使用した場合も、 OPRTase活性を増強した株は、コントロールである非改変株 と比較して多量の L一リジンを蓄積した。
[0122] [表 2] 表 2
Figure imgf000036_0001
産業上の利用の可能性
[0123] 本発明の微生物を用いることにより、効率よぐ L一リジン、 L—オル二チン、 L—ァ ルギニン、 L一ヒスチジン、 L—シトルリンなどの塩基性アミノ酸、 L—イソロイシン、 L- ァラニン、 L—パリン、 L—ロイシン、グリシンなどの脂肪族アミノ酸、 L—スレオニン、 L ーセリンなどのヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、 L—プロリンなどの環式 アミノ酸、 L—フエ-ルァラニン、 L—チロシン、 L—トリプトファンなどの芳香族アミノ酸 、 L—システィン、 L—シスチン、 L—メチォニンなどの含硫アミノ酸、 L—グルタミン酸 、 L—ァスパラギン酸、 L—グルタミン、 L—ァスパラギンなどの酸性アミノ酸を発酵生 産することが出来る。

Claims

請求の範囲
[1] L—アミノ酸生産能を有し、かつォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増 強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
[2] ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする pyrE遺伝子の発現量を増大 させること、及び Zまたは、ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの翻訳量を増大 させることによりォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項 1 に記載の微生物。
[3] ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする pyrE遺伝子のコピー数を高 めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ォロト酸ホスホリボシ ルトランスフェラーゼ活性が増強された、請求項 1又は 2に記載の微生物。
[4] rph— pyrEオペロンを有し、 rph遺伝子のコード領域に 1のフレームシフト変異を 生来有する微生物を改変することによって得られる微生物であって、前記フレームシ フト変異を相補する変異が導入されたことにより、ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラ ーゼ活性が増強された請求項 1又は 2に記載の微生物。
[5] pyrE遺伝子の上流のァテ-ユエ一ターを欠損したことにより、ォロト酸ホスホリボシ ルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項 1又は 2に記載の微生物。
[6] 前記ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼカ 下記 (A)又は（B)に記載のタン パク質である、請求項 2〜5の 、ずれか一項に記載の微生物：
(A)配列番号 12に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(B)配列番号 12に示すのアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸残基の 置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ォロト酸ホスホ リボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
[7] 前記 pyrE遺伝子が、下記 (a)又は (b)に記載の DNAである、請求項 2〜6の 、ず れか一項に記載に記載の微生物：
(a)配列番号 11の塩基番号 782〜1423の塩基配列を含む DNA、
(b)配列番号 11の塩基番号 782〜1423の塩基配列と相補的な塩基配列又は該 塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、か つ、ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする D
[8] 前記 L アミノ酸が、 L リジン、 L アルギニン、 L ヒスチジン、 L—イソロイシン、
L—パリン、 L ロイシン、 L—スレオニン、 L フエ-ルァラニン、 L チロシン、 L ト リブトフアン、 L -システィン及び L -グルタミン酸力もなる群力も選択される一種また は二種以上の L アミノ酸である請求項 1〜7のいずれか一項に記載の微生物。
[9] 前記腸内細菌科に属する微生物が、ェシエリヒア属細菌、ェンテロパクター属細菌 またはパントエア属細菌である請求項 1〜8のいずれか一項に記載の微生物。
[10] 請求項 1〜9のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、 L アミノ酸を該 培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体より L アミノ酸を回収すること を特徴とする L アミノ酸の製造法。
[11] グリセロールを炭素源とすることを特徴とする請求項 10に記載の方法。
[12] 前記 L アミノ酸が、 L リジン、 L アルギニン、 L ヒスチジン、 L—イソロイシン、 L—パリン、 L ロイシン、 L—スレオニン、 L フエ-ルァラニン、 L チロシン、 L ト リブトフアン、 L -システィン及び L -グルタミン酸力もなる群力も選択される一種また は二種以上の L アミノ酸である、請求項 10または 11に記載の方法。
PCT/JP2007/058941 2006-04-28 2007-04-25 Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 Ceased WO2007125954A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK07742376.2T DK2017332T3 (da) 2006-04-28 2007-04-25 Mikroorganisme med evne til at danne L-aminosyre og fremgangsmåde til fremstilling af L-aminosyre
AT07742376T ATE554159T1 (de) 2006-04-28 2007-04-25 Zur produktion von l-aminosäure fähiger mikroorganismus und verfahren zur produktion von l-aminosäure
EP07742376A EP2017332B1 (en) 2006-04-28 2007-04-25 Microorganism capable of producing l-amino acid, and process for production of l-amino acid
US12/258,630 US8293505B2 (en) 2006-04-28 2008-10-27 L-amino acid-producing microorganism and a method for producing an L-amino acid

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006124692A JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2006-04-28 Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2006-124692 2006-04-28

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/258,630 Continuation US8293505B2 (en) 2006-04-28 2008-10-27 L-amino acid-producing microorganism and a method for producing an L-amino acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007125954A1 true WO2007125954A1 (ja) 2007-11-08

Family

ID=38655480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/058941 Ceased WO2007125954A1 (ja) 2006-04-28 2007-04-25 Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8293505B2 (ja)
EP (1) EP2017332B1 (ja)
JP (1) JP2009165355A (ja)
AT (1) ATE554159T1 (ja)
DK (1) DK2017332T3 (ja)
WO (1) WO2007125954A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009088049A1 (ja) 2008-01-10 2009-07-16 Ajinomoto Co., Inc. 発酵法による目的物質の製造法
WO2015005406A1 (ja) 2013-07-09 2015-01-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
CN112823165A (zh) * 2019-04-05 2021-05-18 Cj第一制糖株式会社 新型l-色氨酸输出蛋白变体及使用其生产l-色氨酸的方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7915018B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
EP2351830B1 (en) * 2006-03-23 2014-04-23 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
BRPI0703692B1 (pt) * 2006-12-25 2016-12-27 Ajinomoto Kk método para se obter os cristais de um hidrocloreto de aminoácido básico compreendendo gerar um aminoácido básico usando células microbianas por fermentação em um caldo de fermentação ou por um método enzimático em uma solução de reação de enzima usando as células como catalisadores
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110217A (ja) * 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP2010226957A (ja) 2007-10-17 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2010084995A2 (en) * 2009-01-23 2010-07-29 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid
CN103189517A (zh) * 2010-08-27 2013-07-03 代谢探索者公司 用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生
JP2014087259A (ja) * 2011-02-22 2014-05-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
EP2971023B1 (en) * 2013-03-15 2024-12-11 Kiverdi, Inc. Methods of using natural and engineered organisms to produce small molecules for industrial application
US9902965B2 (en) 2013-11-14 2018-02-27 Scarab Genomics, Llc Bacteria with improved metabolic capacity
AU2015225439B2 (en) * 2014-03-03 2020-12-17 Scarab Genomics, Llc Enhanced production of recombinant CRM197 in E. coli
US10174307B2 (en) 2014-07-15 2019-01-08 The Regents Of The University Of California Performance enhancing genetic variants of E. coli
TWI716841B (zh) * 2018-03-27 2021-01-21 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司 新穎啟動子及使用該啟動子製造l-胺基酸的方法

Citations (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR356739A (fr) 1904-09-20 1905-12-07 Charles Glauser Perrin Mécanisme de remontoir et de mise à l'heure
JPS565099A (en) 1979-06-25 1981-01-20 Ajinomoto Co Inc Production of l-histidine through fermentation process and microorganism used therefor
US4278765A (en) 1978-06-30 1981-07-14 Debabov Vladimir G Method for preparing strains which produce aminoacids
GB2075056A (en) 1980-04-14 1981-11-11 Ajinomoto Kk L-proline-producing Microorganisms
JPS5771397A (en) 1980-08-22 1982-05-04 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-tryptophan by fermentation method
US4346170A (en) 1979-07-23 1982-08-24 Ajinomoto Company, Incorporated Method for producing L-lysine by fermentation
DE3127361A1 (de) 1981-07-08 1983-02-03 Schering Ag, 1000 Berlin Und 4619 Bergkamen Herstellung und anwendung von plasmiden mit genen fuer die biosynthese von l-prolin
US4407952A (en) 1979-06-15 1983-10-04 Ajinomoto Company Incorporated Method for producing L-phenylalanine by fermentation
JPS6234397B2 (ja) 1979-11-15 1987-07-27 Ajinomoto Kk
JPS62244382A (ja) 1986-04-16 1987-10-24 Ajinomoto Co Inc 新規プロモーター及び該プロモーターを用いた遺伝子発現方法
JPH02458A (ja) 1987-10-12 1990-01-05 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ―イソロイシンの製造法
JPH02109985A (ja) 1988-02-22 1990-04-23 Eurolysine 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌
US5175107A (en) 1988-10-25 1992-12-29 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine
JPH05130882A (ja) 1991-11-11 1993-05-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
JPH05304969A (ja) 1992-02-25 1993-11-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるアミノ酸の製造法
RU2003677C1 (ru) 1992-03-30 1993-11-30 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм бактерий ESCHERICHIA COLI - продуцент L-гистидина
US5354672A (en) 1992-11-24 1994-10-11 Ian Fotheringham Materials and methods for hypersecretion of amino acids
US5376538A (en) 1991-09-04 1994-12-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing L-threonine with strains of E coli resistant to phenylalanine and leucine
US5378616A (en) 1991-08-07 1995-01-03 Ajinomoto Co., Inc. Mutant Escherichia coli capable of enhanced L-glutamic acid production by fermentation
EP0643135A1 (en) 1992-11-10 1995-03-15 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-threonine by fermentation
WO1996006926A1 (fr) 1994-08-30 1996-03-07 Ajinomoto Co., Inc. Procede pour produire de la l-valine et de la l-leucine
JPH0870879A (ja) 1994-06-30 1996-03-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法
EP0733712A1 (en) 1993-10-28 1996-09-25 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing substance
US5573945A (en) 1994-01-10 1996-11-12 Ajinomoto Co., Inc. Mutant and method for producing L-glutamic acid by fermentation
EP0488424B1 (en) 1990-11-30 1997-03-05 Ajinomoto Co., Inc. Recombinant DNA sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant DNA sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation
WO1997008333A1 (fr) 1995-08-30 1997-03-06 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production d'acides amines levogyres
EP0763127A1 (en) 1994-06-09 1997-03-19 Purdue Research Foundation Deblocking the common pathway of aromatic amino acid synthesis
EP0593792B1 (en) 1992-10-14 1997-05-14 Ajinomoto Co., Inc. Novel L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine
US5658766A (en) 1991-05-30 1997-08-19 Ajinomoto Co., Inc. Strains of Escherichia coli which produce isoleucine or valine and a method for their production
EP0796912A1 (en) 1994-12-09 1997-09-24 Ajinomoto Co., Inc. Novel lysine decarboxylase gene and process for producing l-lysine
US5705371A (en) 1990-06-12 1998-01-06 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
EP0837134A2 (en) 1996-10-15 1998-04-22 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing L-amino acid through fermentation
US5756345A (en) 1995-09-05 1998-05-26 Degussa Aktiengesellschaft Production of tryptophan by the bacterium Escherichia coli
RU2119536C1 (ru) 1997-01-21 1998-09-27 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм escherichia coli - продуцент l-гистидина
WO1999003988A1 (en) 1997-07-18 1999-01-28 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing purine nucleosides via fermentation
US5908768A (en) 1996-04-23 1999-06-01 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing L-glutamic acid by fermentation with E. coli resistant to aspartic acid antimetabolite
JPH11155571A (ja) 1997-11-25 1999-06-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システインの製造法
US5939307A (en) 1996-07-30 1999-08-17 The Archer-Daniels-Midland Company Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
US5972663A (en) 1997-06-19 1999-10-26 Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh Microorganisms and processes for the fermentative preparation of L-cysteine, L-cystine, N-acetylserine or thiazolidine derivatives
EP0952221A2 (en) 1998-03-18 1999-10-27 Ajinomoto Co., Ltd. L-Glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
EP0955368A2 (en) 1998-03-18 1999-11-10 Ajinomoto Co., Ltd. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing l-glutamic acid
US5998178A (en) 1994-05-30 1999-12-07 Ajinomoto Co., Ltd. L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation
US6040160A (en) 1993-12-08 2000-03-21 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine by fermentation
EP1013765A1 (en) 1998-12-23 2000-06-28 Ajinomoto Co., Ltd. Gene and method for producing L-amino acids
EP1016710A2 (en) 1998-12-30 2000-07-05 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
US6110714A (en) 1995-08-23 2000-08-29 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing L-glutamic acid by fermentation
US6124121A (en) 1997-10-29 2000-09-26 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-leucine
US6180373B1 (en) 1992-09-28 2001-01-30 Consortium f{umlaut over (u)}r elektrochemische Industrie GmbH Microorganisms for the production of tryptophan and process for the preparation thereof
EP1078989A2 (en) 1999-08-20 2001-02-28 Ajinomoto Co., Ltd. Method for producing L-glutamic acid by fermentation accompanied by precipitation
EP1085087A2 (en) 1999-09-20 2001-03-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for producing amino acids by fermentation using aminoquinoline resistant bacterial strains
US6218168B1 (en) 1995-10-26 2001-04-17 CONSORTIUM FüR ELEKTROCHEMISCHE INUDSTRIE GMBH Process for preparing O-acetylserine, L-cysteine and L-cysteine-related products
WO2001027307A1 (de) 1999-10-14 2001-04-19 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur fermentativen herstellung von l-cystein oder l-cystein-derivaten
US6258554B1 (en) 1998-07-03 2001-07-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for producing metabolites biologically synthesized via phosphoribosyl pyrophosphate
WO2001053459A1 (fr) 2000-01-21 2001-07-26 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
EP1149911A2 (en) 2000-04-26 2001-10-31 Ajinomoto Co., Ltd. Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing amino acid
EP1170358A1 (en) 2000-07-06 2002-01-09 Ajinomoto Co., Ltd. L-arginine producing Escherichia coli and method of producing L-arginine
EP1170361A2 (en) 2000-06-28 2002-01-09 Ajinomoto Co., Inc. New mutant N-Acetylglutamate synthase and method for L-Arginine production
EP1170376A1 (en) 2000-07-05 2002-01-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing substances utilizing microorganisms
EP1172433A1 (en) 2000-07-06 2002-01-16 Ajinomoto Co., Inc. Bacterium having ability to produce L-glutamic acid, L-proline or L-arginine and method for producing L-glutamic acid, L-proline or L-arginine
US6344347B1 (en) 1999-09-20 2002-02-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for producing L-amino acids by fermentation
US20020025564A1 (en) 2000-08-24 2002-02-28 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic amino acid
US20020058315A1 (en) 2000-09-26 2002-05-16 Ajinomoto Co., Inc. Bacterium having ability to produce L-glutamic acid, L-proline or L-arginine and method for producing L-glutamic acid, L-proline or L-arginine
US6403342B1 (en) 1999-07-09 2002-06-11 Anjinomoto Co., Inc. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine
EP1239041A2 (en) 2001-02-13 2002-09-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia
RU2000124295A (ru) 2000-09-26 2003-02-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Бактерия, обладающая способностью к продукции l-глутаминовой кислоты, l-пролина или l-аргинина, и способ получения l-глутаминовой кислоты, l-пролина или l-аргинина
US20030148473A1 (en) 2001-11-23 2003-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia
US20030157667A1 (en) 2001-11-23 2003-08-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria belonging to the genus escherichia
WO2003097839A1 (en) 2002-05-15 2003-11-27 Cj Corporation Nucleotide sequence of threonine operon irrepressible by isoleucine and method for producing l-threonine using transformed host cell containing the same
WO2005010175A1 (en) 2003-07-29 2005-02-03 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-lysine or l-threonine using escherichia bacteria having attnuated malic enzyme activity
RU2003121601A (ru) 2003-07-16 2005-02-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") (RU) Мутантная серинацетилтрансфераза
WO2005049808A1 (en) 2003-11-21 2005-06-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid by fermentation
WO2005073390A2 (en) 2004-01-30 2005-08-11 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing microorganism and method for producing l-amino acid
WO2005103275A1 (ja) 2004-04-26 2005-11-03 Ajinomoto Co., Ltd. 発酵法によるｌ－トリプトファンの製造法
WO2006038695A1 (ja) 2004-10-07 2006-04-13 Ajinomoto Co., Inc. 塩基性物質の製造法
WO2006078039A1 (en) 2005-01-18 2006-07-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing microorganism and a method for producing l-amino acid
EP1715055A2 (de) 2005-04-22 2006-10-25 Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae
EP1715056A1 (de) 2005-04-23 2006-10-25 Degussa AG Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4286060A (en) * 1979-04-20 1981-08-25 Gluschenko Nina V Process for production of an amino acid
DE3533198A1 (de) * 1985-09-18 1987-03-19 Kernforschungsanlage Juelich Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosaeuren aus (alpha)-ketocarbonsaeuren
US4772557A (en) * 1985-11-12 1988-09-20 Washington University DNA clone of human skin fibroblast collagenase enzyme
US5213972A (en) * 1989-12-08 1993-05-25 Chemgen Corporation Fermentation process for the production of pyrimidine deoxyribonucleosides
JP3473042B2 (ja) * 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
US6132999A (en) * 1992-09-21 2000-10-17 Ajinomoto Co., Inc. L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine
US5907768A (en) * 1996-08-16 1999-05-25 Kobe Steel Usa Inc. Methods for fabricating microelectronic structures including semiconductor islands
RU2144564C1 (ru) 1998-10-13 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ
RU2215783C2 (ru) 2001-05-15 2003-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото - Генетика" МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА
JP4265093B2 (ja) 2000-08-11 2009-05-20 味の素株式会社 スレオニン及びイソロイシンの製造法
RU2264459C2 (ru) * 2001-08-03 2005-11-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Новая мутантная карбамоилфосфатсинтетаза и способ продукции соединений - производных карбамоилфосфата
RU2244007C2 (ru) 2002-02-27 2005-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты)
US20050009151A1 (en) * 2003-07-10 2005-01-13 Pharmacia Corporation Methods for the stereospecific and enantiomeric enrichment of beta-amino acids
RU2275424C2 (ru) 2003-12-05 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia
US7915018B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
US20070004014A1 (en) 2005-06-29 2007-01-04 Yuichiro Tsuji Method for producing l-threonine

Patent Citations (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR356739A (fr) 1904-09-20 1905-12-07 Charles Glauser Perrin Mécanisme de remontoir et de mise à l'heure
US4278765A (en) 1978-06-30 1981-07-14 Debabov Vladimir G Method for preparing strains which produce aminoacids
US4407952A (en) 1979-06-15 1983-10-04 Ajinomoto Company Incorporated Method for producing L-phenylalanine by fermentation
US4388405A (en) 1979-06-25 1983-06-14 Ajinomoto Company Incorporated Method for producing L-histidine by fermentation
JPS565099A (en) 1979-06-25 1981-01-20 Ajinomoto Co Inc Production of l-histidine through fermentation process and microorganism used therefor
US4346170A (en) 1979-07-23 1982-08-24 Ajinomoto Company, Incorporated Method for producing L-lysine by fermentation
JPS6234397B2 (ja) 1979-11-15 1987-07-27 Ajinomoto Kk
GB2075056A (en) 1980-04-14 1981-11-11 Ajinomoto Kk L-proline-producing Microorganisms
JPS5771397A (en) 1980-08-22 1982-05-04 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-tryptophan by fermentation method
US4371614A (en) 1980-08-22 1983-02-01 Ajinomoto Co., Inc. E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan
DE3127361A1 (de) 1981-07-08 1983-02-03 Schering Ag, 1000 Berlin Und 4619 Bergkamen Herstellung und anwendung von plasmiden mit genen fuer die biosynthese von l-prolin
JPS62244382A (ja) 1986-04-16 1987-10-24 Ajinomoto Co Inc 新規プロモーター及び該プロモーターを用いた遺伝子発現方法
JPH02458A (ja) 1987-10-12 1990-01-05 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ―イソロイシンの製造法
JPH02109985A (ja) 1988-02-22 1990-04-23 Eurolysine 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌
US5175107A (en) 1988-10-25 1992-12-29 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine
US5631157A (en) 1988-10-25 1997-05-20 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of Escherichia coli VNII genetika 472T23 as the producer of L-threonine
US5705371A (en) 1990-06-12 1998-01-06 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
EP0488424B1 (en) 1990-11-30 1997-03-05 Ajinomoto Co., Inc. Recombinant DNA sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant DNA sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation
US5658766A (en) 1991-05-30 1997-08-19 Ajinomoto Co., Inc. Strains of Escherichia coli which produce isoleucine or valine and a method for their production
US5378616A (en) 1991-08-07 1995-01-03 Ajinomoto Co., Inc. Mutant Escherichia coli capable of enhanced L-glutamic acid production by fermentation
US5393671A (en) 1991-08-07 1995-02-28 Ajinomoto Co., Inc. Mutant Escherichia coli capable of enhanced L-glutamic acid production
US5376538A (en) 1991-09-04 1994-12-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing L-threonine with strains of E coli resistant to phenylalanine and leucine
JPH05130882A (ja) 1991-11-11 1993-05-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
US5474918A (en) 1992-02-25 1995-12-12 Kyowa Kakko Kogyo Co., Ltd. Process for the production of L-threonine and L-isoleucine by fermentation of Escherichia coli
JPH05304969A (ja) 1992-02-25 1993-11-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるアミノ酸の製造法
RU2003677C1 (ru) 1992-03-30 1993-11-30 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм бактерий ESCHERICHIA COLI - продуцент L-гистидина
US6180373B1 (en) 1992-09-28 2001-01-30 Consortium f{umlaut over (u)}r elektrochemische Industrie GmbH Microorganisms for the production of tryptophan and process for the preparation thereof
EP0593792B1 (en) 1992-10-14 1997-05-14 Ajinomoto Co., Inc. Novel L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine
EP0643135A1 (en) 1992-11-10 1995-03-15 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-threonine by fermentation
US5661012A (en) 1992-11-10 1997-08-26 Ajinomoto Co., Inc. Method for the production of L-threonine by fermentation, using mutated DNA encoding aspartokinase III
US5354672A (en) 1992-11-24 1994-10-11 Ian Fotheringham Materials and methods for hypersecretion of amino acids
EP0733712A1 (en) 1993-10-28 1996-09-25 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing substance
US5830716A (en) 1993-10-28 1998-11-03 Ajinomoto Co., Inc. Increased amounts of substances by modifying a microorganism to increase production of NADPH from NADH
US6040160A (en) 1993-12-08 2000-03-21 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine by fermentation
EP1477565A1 (en) 1993-12-08 2004-11-17 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine by fermentation
US5573945A (en) 1994-01-10 1996-11-12 Ajinomoto Co., Inc. Mutant and method for producing L-glutamic acid by fermentation
US5998178A (en) 1994-05-30 1999-12-07 Ajinomoto Co., Ltd. L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation
EP0763127A1 (en) 1994-06-09 1997-03-19 Purdue Research Foundation Deblocking the common pathway of aromatic amino acid synthesis
JPH0870879A (ja) 1994-06-30 1996-03-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法
WO1996006926A1 (fr) 1994-08-30 1996-03-07 Ajinomoto Co., Inc. Procede pour produire de la l-valine et de la l-leucine
US5827698A (en) 1994-12-09 1998-10-27 Ajinomoto Co., Inc. Lysine decarboxylase gene and method of producing l-lysine
EP0796912A1 (en) 1994-12-09 1997-09-24 Ajinomoto Co., Inc. Novel lysine decarboxylase gene and process for producing l-lysine
US6110714A (en) 1995-08-23 2000-08-29 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing L-glutamic acid by fermentation
US6319696B1 (en) 1995-08-30 2001-11-20 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing L-amino acids
WO1997008333A1 (fr) 1995-08-30 1997-03-06 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production d'acides amines levogyres
US5756345A (en) 1995-09-05 1998-05-26 Degussa Aktiengesellschaft Production of tryptophan by the bacterium Escherichia coli
US6218168B1 (en) 1995-10-26 2001-04-17 CONSORTIUM FüR ELEKTROCHEMISCHE INUDSTRIE GMBH Process for preparing O-acetylserine, L-cysteine and L-cysteine-related products
US5908768A (en) 1996-04-23 1999-06-01 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing L-glutamic acid by fermentation with E. coli resistant to aspartic acid antimetabolite
US5939307A (en) 1996-07-30 1999-08-17 The Archer-Daniels-Midland Company Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
EP0837134A2 (en) 1996-10-15 1998-04-22 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing L-amino acid through fermentation
RU2119536C1 (ru) 1997-01-21 1998-09-27 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм escherichia coli - продуцент l-гистидина
US5972663A (en) 1997-06-19 1999-10-26 Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh Microorganisms and processes for the fermentative preparation of L-cysteine, L-cystine, N-acetylserine or thiazolidine derivatives
WO1999003988A1 (en) 1997-07-18 1999-01-28 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing purine nucleosides via fermentation
US6124121A (en) 1997-10-29 2000-09-26 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-leucine
JPH11155571A (ja) 1997-11-25 1999-06-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システインの製造法
EP0955368A2 (en) 1998-03-18 1999-11-10 Ajinomoto Co., Ltd. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing l-glutamic acid
EP0952221A2 (en) 1998-03-18 1999-10-27 Ajinomoto Co., Ltd. L-Glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
US6331419B1 (en) 1998-03-18 2001-12-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
US6258554B1 (en) 1998-07-03 2001-07-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for producing metabolites biologically synthesized via phosphoribosyl pyrophosphate
EP1013765A1 (en) 1998-12-23 2000-06-28 Ajinomoto Co., Ltd. Gene and method for producing L-amino acids
EP1016710A2 (en) 1998-12-30 2000-07-05 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
US6403342B1 (en) 1999-07-09 2002-06-11 Anjinomoto Co., Inc. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine
EP1078989A2 (en) 1999-08-20 2001-02-28 Ajinomoto Co., Ltd. Method for producing L-glutamic acid by fermentation accompanied by precipitation
EP1085087A2 (en) 1999-09-20 2001-03-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for producing amino acids by fermentation using aminoquinoline resistant bacterial strains
US6344347B1 (en) 1999-09-20 2002-02-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for producing L-amino acids by fermentation
WO2001027307A1 (de) 1999-10-14 2001-04-19 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur fermentativen herstellung von l-cystein oder l-cystein-derivaten
WO2001053459A1 (fr) 2000-01-21 2001-07-26 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
EP1253195A1 (en) 2000-01-21 2002-10-30 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-lysine
EP1149911A2 (en) 2000-04-26 2001-10-31 Ajinomoto Co., Ltd. Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing amino acid
EP1170361A2 (en) 2000-06-28 2002-01-09 Ajinomoto Co., Inc. New mutant N-Acetylglutamate synthase and method for L-Arginine production
EP1170376A1 (en) 2000-07-05 2002-01-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing substances utilizing microorganisms
EP1170358A1 (en) 2000-07-06 2002-01-09 Ajinomoto Co., Ltd. L-arginine producing Escherichia coli and method of producing L-arginine
EP1172433A1 (en) 2000-07-06 2002-01-16 Ajinomoto Co., Inc. Bacterium having ability to produce L-glutamic acid, L-proline or L-arginine and method for producing L-glutamic acid, L-proline or L-arginine
JP2002065287A (ja) 2000-08-24 2002-03-05 Ajinomoto Co Inc 塩基性アミノ酸の製造方法
US20020025564A1 (en) 2000-08-24 2002-02-28 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic amino acid
US20020058315A1 (en) 2000-09-26 2002-05-16 Ajinomoto Co., Inc. Bacterium having ability to produce L-glutamic acid, L-proline or L-arginine and method for producing L-glutamic acid, L-proline or L-arginine
RU2000124295A (ru) 2000-09-26 2003-02-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Бактерия, обладающая способностью к продукции l-глутаминовой кислоты, l-пролина или l-аргинина, и способ получения l-глутаминовой кислоты, l-пролина или l-аргинина
EP1239041A2 (en) 2001-02-13 2002-09-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia
RU2001112869A (ru) 2001-05-15 2003-03-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Новая мутантная n-ацетилглутамат синтаза и способ получения l-аргинина
US20030148473A1 (en) 2001-11-23 2003-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia
US20030157667A1 (en) 2001-11-23 2003-08-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria belonging to the genus escherichia
WO2003097839A1 (en) 2002-05-15 2003-11-27 Cj Corporation Nucleotide sequence of threonine operon irrepressible by isoleucine and method for producing l-threonine using transformed host cell containing the same
RU2003121601A (ru) 2003-07-16 2005-02-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") (RU) Мутантная серинацетилтрансфераза
WO2005010175A1 (en) 2003-07-29 2005-02-03 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-lysine or l-threonine using escherichia bacteria having attnuated malic enzyme activity
WO2005049808A1 (en) 2003-11-21 2005-06-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid by fermentation
WO2005073390A2 (en) 2004-01-30 2005-08-11 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing microorganism and method for producing l-amino acid
WO2005103275A1 (ja) 2004-04-26 2005-11-03 Ajinomoto Co., Ltd. 発酵法によるｌ－トリプトファンの製造法
WO2006038695A1 (ja) 2004-10-07 2006-04-13 Ajinomoto Co., Inc. 塩基性物質の製造法
WO2006078039A1 (en) 2005-01-18 2006-07-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing microorganism and a method for producing l-amino acid
EP1715055A2 (de) 2005-04-22 2006-10-25 Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae
EP1715056A1 (de) 2005-04-23 2006-10-25 Degussa AG Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae

Non-Patent Citations (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Amino Acid Fermentation", 30 May 1986, GAKKAI SHUPPAN CENTER (LTD., pages: 77 - 100
"Experiment Manual for Biotechnology", 1992, BAIFUKAN CO., LTD., pages: 97 - 98
"Molecular Cloning", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
"Salmonella Cellular and Molecular Biology", AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY PRESS
A.J. LINK; D. PHILLIPS; G.M. CHURCH, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 179, 1997, pages 6228 - 6237
AN G. ET AL.: "Cloning the spoT Gene of Escherichia coli: Identification of the spoT Gene Product", J. BACTERIOL., vol. 137, no. 3, 1979, pages 1100 - 1110, XP003018969 *
ANDERSEN J.T. ET AL.: "Attenuation in the rph-pyrE Operon of Escherichia coli and Processing of the Dicistronic mRNA", EUR. J. BIOCHEM., vol. 206, no. 2, 1992, pages 381 - 390, XP003018967 *
BACKMANN B.J.: "Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12", 1996, pages: 2460 - 2488
BAYLES D.O. ET AL.: "Sequence and Phylogenetic Analysis of the Rhizobium leguminosarum biovartrifolii pyrE gene, overproduction, purification and characterization of orotate phosphoribosyltransferase", GENE, vol. 195, no. 2, 1997, pages 329 - 336, XP004086878 *
BLOOM F.R. ET AL., THE 15TH MIAMI WINTER SYMPOSIUM, 1983, pages 34
BUNNAK J. ET AL.: "Orotate Phosphoribosyltransferase from Thermus thermophilus: Overexpression in Escherichia coli, Purification and Characterization", J. BIOCHEM. (TOKYO), vol. 118, no. 6, 1995, pages 1261 - 1267, XP003018968 *
C.T. CHUNG ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 86, 1989, pages 2172
CAN. J. MICROBIOL., vol. 43, 1997, pages 197
CHO E.H.; GUMPORT R.I.; GARDNER J.F., J. BACTERIOL., vol. 184, 2002, pages 5200 - 5203
DATSENKO, K.A.; WANNER B.L., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 97, 2000, pages 6640 - 6645
DUNCAN, C.H.; WILSON, G.A; YOUNG, F.E, GENE, vol. 1, 1977, pages 153
GENE, vol. 23, 1983, pages 199 - 209
GENE, vol. 75, no. 2, 1989, pages 271 - 288
GOLDSTEIN ET AL.: "Prokaryotic promoters in biotechnology", BIOTECHNOL. ANNU. REV., vol. 1, 1995, pages 105 - 128
GUSYATINER ET AL., GENETIKA (IN RUSSIAN, vol. 14, 1978, pages 947 - 956
HAAS M.J. ET AL., BIORESOUR. TECHNOL., vol. 97, no. 4, 2006, pages 671 - 8678
JENSEN K.F. ET AL.: "Overexpression and Rapid Purification of the orfE/rph Gene Product, RNAse PH of Escherichia coli", J. BIOL. CHEM., vol. 267, no. 24, 1992, pages 17147 - 17152, XP003018966 *
JENSEN K.F.: "The Escherichia coli K-12 "Wild Types" W3110 and MG1655 Have an rph Frameshift Mutation That Leads to Pyrimidine Starvation Due to Low pyrE Expression Levels", J. BACTERIOL., vol. 175, no. 11, 1993, pages 3401 - 3407, XP003018965 *
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 175, June 1993 (1993-06-01), pages 3401 - 3407
KARLIN; ALTSCHUL, PRO. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873
MANDEL, M.; HIGA, A., J. MOL. BIOL., vol. 53, 1970, pages 159
MU Y ET AL., BIOTECHNOL LETT., vol. 28, 2006, pages 1755 - 91759
PEARSON, METHODS ENZYMOL., vol. 183, 1990, pages 63
POULSEN ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 135, 1983, pages 223 - 229
POULSEN P. ET AL.: "Nucleotide Sequence of Escherichia coli pyrE Gene and of the DNA in front of the Protein-coding Region", EUR. J. BIOCHEM., vol. 135, no. 2, 1983, pages 223 - 229, XP003018964 *
S. MATSUYAMA; S. MIZUSHIMA, J. BACTERIOL., vol. 162, 1985, pages 1196
SAITO H.; MIURA K., BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA, vol. 72, 1963, pages 619
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T.: "Molecular Cloning A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRIG HARBOR LABORATORY PRESS
WHITE, T.J. ET AL., TRENDS GENET., vol. 5, 1989, pages 185

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009088049A1 (ja) 2008-01-10 2009-07-16 Ajinomoto Co., Inc. 発酵法による目的物質の製造法
EP2749652A2 (en) 2008-01-10 2014-07-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing a target substance by fermentation
WO2015005406A1 (ja) 2013-07-09 2015-01-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
EP3521433A1 (en) 2013-07-09 2019-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-glutamic acid
CN112823165A (zh) * 2019-04-05 2021-05-18 Cj第一制糖株式会社 新型l-色氨酸输出蛋白变体及使用其生产l-色氨酸的方法
CN112823165B (zh) * 2019-04-05 2024-03-26 Cj第一制糖株式会社 新型l-色氨酸输出蛋白变体及使用其生产l-色氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE554159T1 (de) 2012-05-15
US20090104667A1 (en) 2009-04-23
EP2017332A1 (en) 2009-01-21
JP2009165355A (ja) 2009-07-30
EP2017332A4 (en) 2009-06-24
US8293505B2 (en) 2012-10-23
DK2017332T3 (da) 2012-06-11
EP2017332B1 (en) 2012-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8293505B2 (en) L-amino acid-producing microorganism and a method for producing an L-amino acid
EP1999266B1 (en) Method for producing l-amino acid
JP5540504B2 (ja) Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
US8765407B2 (en) L-amino acid producing bacterium and method of producing L-amino acid
JP2010110217A (ja) Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2290092A1 (en) Method for production of l-amino acid
JP2010226957A (ja) Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2007088977A1 (ja) Ｌ－アミノ酸の製造法
JP2007185184A (ja) Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2382320B1 (en) Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration
JP2010263789A (ja) Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2012002486A1 (ja) Ｌ－アミノ酸の製造法
JP6459962B2 (ja) Ｌ−アミノ酸の製造法
BR112015008608B1 (pt) Método para produzir um l-aminoácido
JP2010246483A (ja) Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2014061805A1 (ja) Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2010101053A1 (ja) Ｌ－アミノ酸の製造法
JP2008086305A (ja) Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07742376

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007742376

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP