WO2007131602A1 - Anordnung und verfahren zur konfokalen durchlicht-mikroskopie, insbesondere auch zur vermessung von bewegten phasenobjekten - Google Patents

Anordnung und verfahren zur konfokalen durchlicht-mikroskopie, insbesondere auch zur vermessung von bewegten phasenobjekten Download PDF

Info

Publication number
WO2007131602A1
WO2007131602A1 PCT/EP2007/003644 EP2007003644W WO2007131602A1 WO 2007131602 A1 WO2007131602 A1 WO 2007131602A1 EP 2007003644 W EP2007003644 W EP 2007003644W WO 2007131602 A1 WO2007131602 A1 WO 2007131602A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
beam path
phase
chromatic
light microscopy
optical
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2007/003644
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Klaus KÖRNER
Evangelos Papastathopoulos
Wolfgang Osten
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Stuttgart
Original Assignee
Universitaet Stuttgart
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Stuttgart filed Critical Universitaet Stuttgart
Publication of WO2007131602A1 publication Critical patent/WO2007131602A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0056—Optical details of the image generation based on optical coherence, e.g. phase-contrast arrangements, interference arrangements
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0068—Optical details of the image generation arrangements using polarisation

Definitions

  • No. 6,091,496 does not disclose any approach for spectral interferometric transmitted light microscopy, but there is a first indication of the same in WO2006 / 042696, page 118, using a Mach-Zehnder interferometer with longitudinal chromatic aberration and compensation thereof.
  • E. Papastathopoulos, K. Körner and W. Osten "Chromatically dispersed interferometry with wavelet analysis”, in OPTICS LETTERS, Vol. 31, No. 5, pp. 589-591, 2006 the spectral Interferometry with chromatic depth splitting of the detection field in the object space with the analysis of the resulting wavelet is shown, but this approach has not been described for transmitted light microscopy.
  • the invention for transmitted light microscopy can be used for a variety of tasks in medicine and biology, in particular for the analysis of individual, unstained, untreated, living animal or human cells and culture cells by determining their optical thickness and depth position.
  • the invention can also be used for the analysis of chromosomes in human and cytogenetics.
  • the quantitative determination of the distribution, the position in space and the lateral dimensions of opaque microparticles can be carried out in a transparent medium. This must be "introduced” between the condenser and the lens It is possible with the invention to determine the distribution and the lateral dimensions of microfibers in a transparent or even partially cloudy medium, such as special plastics, ie to use the invention for technical applications.
  • the analysis of Si structures in transmission can be carried out, whereby the structures should have an approximately constant thickness because of the spherical aberration.
  • the determination of refractive index changes can also be carried out in the inventive solution.
  • the above-mentioned applications can be carried out in the DUV, UV, VIS or even in the NIR range, whereby immersion techniques in oil, water or glycerine can also be used used tuned lenses become.
  • the inventive approach also makes it possible to read volume data memories that operate in transmission by detecting and evaluating changes in the refractive index in the irradiated medium.
  • the object of the present invention for transmitted-light microscopy, in particular for measuring the optical thicknesses of transparent and partially opaque objects, also known as phase objects, is to provide new items for commercial use.
  • the goal here is in particular the quantitative detection of thin phase objects, e.g. single, also undyed, living cells.
  • the technical aim of the invention is to increase the speed when measuring the optical thicknesses and increasing the usable depth measuring range, in particular when using an imaging system with a comparatively high numerical aperture, for example in the range from 0.4 to 1.25 (water immersion). or 1.5 (oil grade) to values equal to a multiple of the depth of field given by wave optics.
  • optical signals obtained with the inventive sensor during measurement should be detected by means of a radiation detector or a screened radiation detector, such as a line camera or an area camera.
  • Another goal is to provide a lesson for reading volumetric data memories that operate in transmission.
  • optical signals from these depths without the mechanical movement of components - in particular in the object space - are obtained, in particular the optical thickness or To be able to determine changes in the optical thickness of an object or its components or also of several objects.
  • an at least approximately diffraction-limited lateral imaging of the object is to be effected by an imaging system with a comparatively high numerical aperture, in particular also in immersion technology.
  • the inventive task is to be solved for the Nomarski phase contrast method, the differential interference contrast (D ⁇ C) method, the Hoffmann modulation contrast (HMC) method or by means of microscopes based on the two-beam interferometry, especially by means of a Mach-Zehnder interferometer, highly accurate, quantitative measurements of optical thickness or thicknesses, including variations same, of transparent objects with very high resolution.
  • this involves a resolution in the depth direction in the size of a few nanometers.
  • the inventive task is to be achieved that electromagnetic interference modulations are generated over time, which have a sufficiently small and therefore technically good evaluable frequency from this information in particular the optical To be able to determine the thickness or the change in the optical thickness.
  • This inventive task is intended in particular for a confocal differential interference microscope, in particular for the Normarski DIC microscope, that is to say on the basis of polarization-optically generated lateral shear, and also a confocal two-beam interference microscope, in particular also for a confocal Mach - Zehnder interference microscope, to be solved.
  • Main feature in a method for transmitted-light microscopy, in particular also for quantitative testing of one or more objects or a part or parts thereof or the same in the object space with a polychromatic light source in the illumination beam path and with a
  • these images are sequential in the light propagation direction separated, so that object points from different depths can be detected by means of the micro-apertures or the microlenses.
  • a value for the depth position of a sharply imaged object point of a very thin phase object as well as its change in the optical thickness in relation to the surrounding medium can be calculated. This can be done in a range z_c, which can be a multiple of the optical depth of field.
  • the wavelength of the shading can be determined, from which the contour of microparticles can be determined.
  • the source of electromagnetic radiation broadband for example, in the DUV UV, in the VIS or in the IR range, be formed and short-pulse, for example, a short pulse laser, and its pulses with a camera which serves as a detector, for example in the 100th Hz range, to be synchronized.
  • a wavelength-tunable laser can also be used.
  • a spectrally broadband source electromagnetic radiation can be used, for example, a fiber-coupled, broadband white light laser, in which case a controllable monochromator is arranged downstream to tune the wavelength.
  • the light is spatially structured in the object space, in which a focus pattern or a focus line pattern are formed in the object space predetermined by means of multiple micro-apertures or multiple by means of multiple microlenses macroblende, and in the illumination beam path a chromatic depth splitting of these foci or focus lines is performed by means of at least partially chromatic refractive power, so that these foci or focus lines in the light propagation direction, ie in depth, are separated.
  • the at least partially chromatic refractive power in the illumination and the at least partially chromatic refractive power in the detection beam path are predetermined so determined that in the object space the amount and the direction of the chromatic depth splitting of the foci or focus lines for illumination and in the detection beam path, the amount and the direction of the chromatic Depth splitting of the redrawn micro-apertures or the multiple mapped macro-aperture are at least approximately equalized.
  • the images A 'of the centers A of the apertures BA of the illumination beam path or the images A' of the foci A and the images B 'of the centers B of the apertures BB of the detection beam path which respectively correspond laterally and spectrally, namely for example, A'o_ ⁇ min-B'o_ ⁇ min and A'o_ ⁇ max-B'o_ ⁇ max, optically conjugated.
  • their planes of sharpness in object space at least approximately coincide.
  • the inventive method for increasing the depth measuring range over the wavelength optical depth of field also only two monochromatic sources of electromagnetic radiation of different wavelengths can be used with frequency modulation, so that the known heterodyne method can be used. With the radiation of each wavelength, the object is scanned at a slightly different depth.
  • the process of dark field microscopy is preferably used in the inventive method for transmitted-light microscopy.
  • the camera which also scatter or diffract the light and are also at least approximately in the focal plane of a reflected diaphragm for confocal discrimination, the focal plane being one of light of a predetermined wavelength of the spectrum polychromatic light source or the wavelength tunable light source.
  • Objects that do not scatter or diffract the light remain dark, since the directly transmitted light is not detected.
  • the position of an object point can be determined by determining the wavelength position of the maximum of the intensity and from this the depth position.
  • an object-related adaptation of the distance between the condenser and the objective that is to say an axial displacement of the same, can also remedy this problem, which compensates for the optical difference in thickness between the object and the surrounding medium and thus again enables sharp object matching.
  • phase objects here "thick" on the wave-optical depth of field of the microscopic image is assumed and this is usually a multiple of the same, the axial displacement of components to adapt to the optical thickness, only the scattered light from the thick Object overcome the confocal discrimination, so that the object brings a higher intensity than the object-free environment for imaging.
  • the method of phase microscopy based on the interference of electromagnetic waves is preferably used in the inventive method for transmitted-light microscopy. This allows a particularly high resolution and photometric sensitivity in the measurement of objects.
  • Feature 5 Furthermore, preferably in the inventive method for transmitted-light microscopy with chromatic depth splitting, the phase contrast method, in particular also that according to F. Zernike, the differential phase contrast method, especially according to G. Nomarski, as DIC method (DIC: differential interference contrast), ie methods based on polarization-optical shear interferometry, the Hoffmann HMC method (HMC: Hoffmann modulation contrast) or else a phase-microscopic method according to the two-beam interference method, in particular also based on a Mach-Zehnder interferometer.
  • DIC method DIC: differential interference contrast
  • HMC Hoffmann modulation contrast
  • a phase-microscopic method according to the two-beam interference method in particular also based on a Mach-Zehnder interferometer.
  • an optical path difference OPD OPD: optical path difference
  • Beam path of a phase microscope which is at least one wavelength of the maximum detected wavelength, but preferably up to 100 wavelengths of the maximum detected wavelength.
  • interference fringes in particular also in the form of a wavelet, are also known as Müllersche strips or Tolansky strips, ie intensity profiles over the wavelength ⁇ or the wavenumber k are formed in the detected spectral range in a predetermined manner.
  • a thin and laterally small phase object for example of the order of magnitude of the extension of the diffraction-limited point image of the microscope-produces a local phase change in the interference fringes, ie in particular also in a wavelet.
  • This local phase change is evaluated.
  • a laterally extended phase object which completely covers the measuring field, generates a change in the frequency in the interference pattern, ie in particular also in a wavelet, which leads to an altered rise of the phase, ie the phase gradient dtydk, over the wave number k.
  • an extremum can be determined if preferably a sufficiently large optical path difference in the DIC microscope is given with polarization-optical Shear.
  • a comparatively thick retardation plate in the DIC microscope can be used, which preferably has an optical path difference between the two polarization directions in the order of 100 wavelengths of the largest wavelength used in order to increase the accuracy of the Phasenaustician- strategies.
  • phase shifting LCD in the DIC microscope in order to vary the optical path difference in sublambda steps for the phase shift method predetermined.
  • the optical path difference can be adjusted in the interferometer so that the interference fringes over the wavelength, in particular in the form of a wavelet, can be detected by means of a spectrometer.
  • an optical path difference of several tens to several hundred wavelengths of the largest wavelength used can be set, in which case a wavelength range of approximately 150 nm is preferably evaluated in the case of application in the near infrared range.
  • a referencing of the wave number over the depth is necessary for accurate measurements.
  • in a microscope on the basis of the phase contrast method according to F.
  • a comparatively thick phase ring with respect to the light wavelength can be introduced, which thus introduces an optical path difference of several wavelengths, preferably of the order of 100 wavelengths of the largest wavelength used.
  • additional information can be obtained by using light-diffusing objects to evaluate a phase variation over the wavenumber-possibly also in conjunction with an intensity variation-in an interference pattern.
  • laterally small and thin phase objects are marked by local phase changes in the interference fringes over the wavelength ⁇ or the wavenumber k, in particular also in the form of a wavelet, depending on the optical thickness of the phase object (s) and also depending on their depth position also depending on their lateral extent.
  • the usable depth range ⁇ z_c is also given by the size of the chromatic depth splitting in the imaging beam path for the object bundles.
  • the acquisition of the measured variable for example the optical thickness of the object in a specific object depth, can take place by means of the evaluation of the interference fringes, which are also referred to as Müllersche strips.
  • the interference fringes which are also referred to as Müllersche strips.
  • the zero crossing of the first derivative d ⁇ / d & phase curve ⁇ ()) can be evaluated with high accuracy.
  • monochromatic radiation source electromagnetic interference modulations over time can be generated, which have a technically good evaluable frequency by the size of the set path difference in the interferometer and the speed of the wavelength scan.
  • the phase of the interference is preferably evaluated in the inventive method for transmitted-light microscopy.
  • a resolution in the axial direction in the size of a few nanometers can be achieved, and this strongly depends on the shape of the interference pattern, that is to say in particular also of a wavelet, and also on the evaluation strategy.
  • a multiple phase shift is performed in the interferometer in order to detect very small phase deviations even very small deviations from the at least approximately straight phase curve, in which case a small local deviations of the phase ⁇ - in the sense of a local disturbance of the phase curve ⁇ (£), preferably with a local extremum - yes indicates the existence of a phase object.
  • Feature 8 Furthermore, the optical path difference in the infinity beam path or in the chromatically weakly focused beam path of the microscopic image is preferably introduced in the inventive method for transmitted light microscopy. Thus aberrations such as spherical aberration are minimized or largely avoided.
  • the method of chromatic depth splitting and compensation thereof in conjunction with confocal discrimination is applicable to all interferometric methods, including digital microscopic scale holography.
  • Feature 9 In an inventive arrangement for transmitted-light microscopy, especially with condenser and lens and in particular for the quantitative examination of a micro-object in the object space, with a polychromatic light source in the illumination beam path and with a spectrometer in the detection beam path or a wavelength-tunable light source in the illumination beam path with means for confocal discrimination in the detection beam path, such as a plurality of micro-apertures, preferably a micro-aperture array, or a multi-microlenses multiply mapped macro-aperture and a camera in the detection beam means are arranged with at least partially chromatic power for chromatic depth splitting in the detection beam path.
  • a polychromatic light source in the illumination beam path and with a spectrometer in the detection beam path or a wavelength-tunable light source in the illumination beam path with means for confocal discrimination in the detection beam path, such as a plurality of micro-apertures, preferably a micro-aperture array, or a multi-
  • the confocal Discrimination greatly reduces the scattered light in optical imaging, which occurs in light scattering samples such as biological tissues or partially cloudy media.
  • the means are preferably arranged with at least partially chromatic refractive power for chromatic depth splitting in the Fourier plane, ie the rear focal plane of the objective, or in a plane optically conjugate to this. This ensures that the imaging scale in the detection is independent of the wavelength.
  • Feature 11 Furthermore, in the inventive arrangement for transmitted-light microscopy, means with at least partially chromatic refractive power for chromatic depth splitting in the illumination beam path are preferably arranged. Furthermore, means for structured illumination of the object space are preferably arranged. With these structured light, for example in the form of a Foki pattern with equidistant focal distances, ie an array of light spots generated, whereby the scattered light in the imaging of the object can significantly reduce, since only the area of the object is focused focused, the is detected. In this case, the array of light points can be flat, for example, as shown in DE 10 2006 007 172 Al, formed, with a harnesspixlige camera is used for spectral detection in this arrangement. For example, 64 x 64 object points can be spectrally analyzed simultaneously.
  • Feature 12 Furthermore, in the inventive arrangement for transmitted-light microscopy, means with at least partially chromatic refractive power for chromatic depth splitting in the Fourier plane, ie the rear focal plane of the condenser, or in an optically conjugate plane to the latter are preferably arranged. This ensures that the magnification of the illumination is independent of the wavelength.
  • Feature 13 Furthermore, preferably in the inventive arrangement for transmitted light microscopy when using a Nomarski DIC microscope with two Wollaston- prisms an optical, birefringent retarder (retarder) with an optical path difference between the two polarization directions to produce interference, ie Interference strip over the wavelength ⁇ or the wave number k, in particular with interference fringes in the form of a wavelet, arranged.
  • the optical path difference of the birefringent retarder is at least one wavelength of the maximum, detected wavelength, wherein the retarder is preferably arranged in the space between the two Wollaston prisms of the Nomarski DIC microscope.
  • the design of the optical retarder allows the spatial frequency of the interference fringes, especially in the form of a wavelet, to be adjusted so that it is optimally adapted to the spectral resolution of the spectrometer, so that an evaluation of the strip is still technically possible.
  • the optical, birefringent retarder is designed in the form of a calcite plate. This material has a particularly high birefringence.
  • the means with chromatic refractive power are preferably designed as diffractive-optical elements (DOEs). These have a high chromatic resolution.
  • DOEs diffractive-optical elements
  • the means for confocal discrimination in the detection beam path such as a micro-aperture array or else a microlens array, are preferably arranged with high precision laterally displaceable.
  • a gapless lateral scanning of an object which is at least partially transparent can take place.
  • Feature 17 Furthermore, preferably in the inventive arrangement for transmitted light microscopy, the means for structuring the light in the illumination beam path, such as a micro-aperture array or a microlens array, arranged with high accuracy laterally displaceable. These means are shifted synchronously with the means for confocal discrimination in the detection beam path, so that the lateral assignment of the images of the same in the object space in the displacement and in the image acquisition by means of a camera is always maintained.
  • the means for structuring the light in the illumination beam path such as a micro-aperture array or a microlens array, arranged with high accuracy laterally displaceable.
  • the means for structuring the light in the illumination beam path and the means for confocal discrimination in the detection beam path are rigidly coupled by a convolution of the optical beam path, wherein the magnification in the illumination and in the detection beam path is made equal, so that Only a single mechanical scanning system for lateral displacement of the same means is necessary.
  • the optical coupling of the inventive arrangement for transmitted light microscopy can be performed with an optical, computer-controlled tweezers.
  • living cells in the object space of a phase microscope can be predetermined and moved with high precision.
  • a cell can be measured in terms of their optical thickness or their optical thicknesses by means of phase microscopy.
  • the lateral variation of the optical thickness of a Cell to be determined.
  • a position determination and microforming of cells by means of optical tweezers is possible by, for example, selected cells are transported into the measuring volume for surveying.
  • a phase shift can be performed by mechanical scanning in the reference arm.
  • an improvement of the signal-to-noise ratio can be achieved due to a high and strongly light-weakening object density.
  • This phase shift can be performed by means of a mechanical scan on an angle mirror, but also by means of a phase-mostly-LCD.
  • This LCD is then preferably located in an intermediate image plane ZBE in the reference beam path.
  • phase objects to be measured should rather be arranged singly in the measuring volume in the inventive arrangement, but may also be superimposed if the partial transmission of a spherical wave to an object point in the measuring volume is still present without the illumination aperture being substantially reduced. Otherwise, the evaluation becomes much more difficult or even impossible.
  • a numerical aperture of over 1 can be realized. Even for technical objects in oil immersion technology, a numerical aperture of more than 1 can be realized in the optical system.
  • axial readjustment may be required on either of the two distance adjustment microscope objectives, so that the confocality in the optical system is maintained. It can already be one Opening error in the image occur, which can be remedied by an adaptive optical system.
  • the condenser is preferably formed by means of a GRIN lens.
  • the objective is preferably formed by means of a GRIN lens. This leads to a very compact arrangement.
  • a camera with a logarithmic characteristic is preferably used in a transmitted-light microscope according to the invention with chromatic depth splitting. With this usually a much larger range of brightness on the object compared to cameras with linear characteristic is detected.
  • a system of an electrically controllable, diffractive optical element and an electrically controllable Elektrowetting lens can be arranged, which at least partially compensates the average power of the diffractive optical element.
  • the degree of chromatic depth splitting can be changed by means of a diffractive optical element, wherein the readjustment of the refractive power of the electrowetting lens keeps the planes of sharpness and thus the position of the depth measuring range in the object space at the same depth.
  • the detector or the camera of the transmitted-light microscope according to the invention may preferably be preceded by a further two-beam interferometer with which a spectral analysis of the interfering radiation of the two-beam interferometer can take place by scanning the optical path difference therein.
  • FIG. 1 illustrates an application for a Quantitative 3D Transmitted Light Microscope for Thin Phase Objects based on a Mach-Zehnder Interferometer (MZI) to determine the optical thickness or variations of the optical thickness of an object in a spatially resolved and highly accurate manner.
  • MZI Mach-Zehnder Interferometer
  • the arrangement is constructed as a chromatic-confocal spectral interferometer.
  • the application can be used in biological research, for accurate determination of the optical thicknesses of cell components in cancer research, in medical diagnostics, but also for technical applications.
  • the light source Ia is designed as a fiber-coupled white light laser.
  • the light emerging from the fiber passes through a collimator 2 and illuminates a microlens array 3, which is followed by a micro-aperture array 4, wherein the micro-diaphragms are each arranged in the focus position of the microlenses.
  • FIG. 1a shows this situation for a micro-diaphragm BA with the diaphragm center A, which also corresponds to a focus and also represents the origin of a spherical wave K.
  • the microlens array 3 and the micro-aperture array 4 are fixedly connected to each other, this assembly is associated with a not shown here fast Rezisons xy scanner, which also has a highly accurate lateral start position.
  • the spherical wave K which is shown here representative of a plurality of spherical waves, is split at the beam splitter 5 into an object wave and a reference wave.
  • the spherical wave emitted by a micro diaphragm BA from the center A thereof is collimated by the objective 6, ie converted into a plane wave, ie the point A is imaged infinity, thereby passing a diffractive-optical element in the form of a Fresnel zone lens 7 with a focusing effect.
  • This zone lens 7 is at least approximately in a plane PE '10, which is optically conjugate to the pupil plane PElO and to the Fourier plane of a downstream condenser 10.
  • this Fresnel zone lens 7 There is a different focus by means of this Fresnel zone lens 7 as a function of the wavelength.
  • the refractive power of the Fresnel zone lens 7 is compensated by means of a directly downstream, weakly refractive diverging lens 8 to allow only slight deviations from the ideal collimation state, so that for the central wavelength ⁇ O only one plane or very weak one is always used curved wavefront arises.
  • the following first imaging stage 9 images the Fresnel zone lens 7 into the Fourier plane FlO of the condenser 10, which is identical to the pupil plane PE10, so that there are weakly diverging, at least approximately plane, as well as weakly converging waves as a function of the wavelength available.
  • the condenser 10 can be readjusted laterally in the depth and possibly also laterally in order to precisely ensure the confocality of the transmitted-light microscope.
  • a thin phase object 11 present in the object space alters the optical path difference, so the phase also shifts in the MZI.
  • the phase object 11 is usually optically so thin that the confocality of the transmitted-light microscope still exists, ie the object-caused optical path length change is still below the wavelength of the optical depth of field.
  • a water immersion objective 12 forms the object 11.
  • the spherical waves detected by the objective 12 are converted into approximately plane or weakly focused or divergent waves and strike the second imaging stage 13, which images the diffractive optical element in the form of a Fresnel Zone lens 14 with divergent effect allows.
  • This Fresnel zone lens 14 is at least approximately in a plane of the objective 12 conjugate to the plane of the pupil and Fourier plane F '12, ie in the plane F "12.
  • the amount of refractive power of this Fresnel zone lens 14 is at least approximately equal to the Fresnel zone lens for each wavelength
  • the chromatic splitting of the illumination beam path ie the depth splitting by the Fresnel zone lens 7
  • Subsequent angular mirrors 16 cause the diversion to the tube objective 17 with a wavefront inversion
  • the beam splitter 18 which here serves to combine the beam with the light from the reference beam path, the foci of all wavelengths are produced by the compensating effect of the Fresnel zonal lens 14 at least approximately again in a plane.
  • the second micro-aperture array 25 for confocal discrimination.
  • FIG. 1b shows the micro-aperture array 25 with the micro-aperture BB.
  • the imaging in the reference arm takes place via the long-focal-length objective 19, the angular mirror 20, which enables a setting of the optical path difference in the MZI which is suitable for the detection of Müller's stripes.
  • the angle mirror 20 an optical path difference of 80 ⁇ m is set for the MZI.
  • the image in the reference arm is still on the wedge plate pair 21, which is used for dispersion compensation, the wedge angle are chosen sufficiently small, and the lenses 22, 23 and 24, wherein an intermediate image in the plane ZBE takes place.
  • the picture A'r of BA as well as the redrawn image B'r of the center B of the corresponding micro-aperture BB.
  • an amplitude matching ie an adjustment of the intensity for the reference radiation, can be carried out for optically dense samples.
  • the plane ZBE represents a possible position for an LCD for amplitude matching and phase matching.
  • the coherent foci of the object and the reference beam A "o_l A" r_l coincide, for example, in the point B of the micro-aperture BB to the interfering focal point A 'Or I.
  • Confocal filtering takes place through the micro-aperture array 25, in this case, for example, in the micro-aperture BB with the center B.
  • the micro-aperture array 25 is likewise assigned a fast precision xy scanner, not shown here, which synchronously and with high precision with respect to the fast precision xy scanner is moved by the assembly microlens array 3 and micro-aperture array 4.
  • a micro-aperture of the micro-aperture array 4 is imaged onto one and the same, respectively corresponding micro-aperture of the micro-aperture array 25, for example the micro-aperture BA onto the corresponding micro-aperture BB.
  • the confocality of the system necessarily requires an axial readjustment on the condenser 10, which may also be accompanied by a lateral readjustment.
  • the interfering spherical waves emerging from the micro-apertures of the micro-aperture array 25 pass through a spectrometer, which consists of the refractive-diffractive assembly 27 and the imaging system with the lenses 26 and 28.
  • the spectrally split, interfering bundles reach a camera 29 and are detected there.
  • the spectrum of intensity over the wavelength the Müller interference fringes, in the form of a wavelet.
  • the evaluation can take place by means of the evaluation of the phase variation over the wavelength, since the intensity over the wavelength is dependent on the optical path difference in the MZI.
  • the evaluation of the interference fringes is not shown in this document.
  • An MZI in FIG. 1 has a second interferometer output at the beam splitter 18.
  • a visual observation can be made via a fixed micro-aperture array 30 and the microlens array 31 and a microscopic imaging system 32 with an optical narrow-band filter, not shown, when the fast precision xy scanner of FIG the microlens array 3 assembly and the micro-aperture array 4 are in the start position because the fixed micro-aperture array 30 is laterally aligned with this position.
  • the optical narrowband filter By changing the optical narrowband filter, another depth of the object space can be seen sharply. This possibility of visual observation can be used for research purposes as well as for object positioning.
  • the lateral scan is performed, so that integration takes place over all positions.
  • microlens array 3 and coupled micro-aperture array 4 and the micro-aperture array 25 are, for example, scanned together in 10 ⁇ 10 positions, since this should be the ratio of the focus spot diameter to the focal distance of 1:10.
  • a camera image is taken in each position by means of the camera 29, which is best designed as a high-speed camera.
  • the spectrometer is designed as a surface spectrometer, as shown in DE 10 2006 007 172 A1, with a 4 mega-pixel camera.
  • FIG. 2 shows the bundles in the transmitted-light microscope with chromatic splitting of the bundles during illumination on the basis of a Mach-Zehnder interferometer in the object beam path of the MZI of FIG. 1.
  • the object 11 is a thin phase object.
  • the range of the depth splitting z_ ⁇ and the range z_c in which thin phase objects can be detected are shown.
  • FIG. 3 illustrates the beam path in the reference arm of the MZI of FIG. 1. Since there are no chromatic components in the reference arm, the wavefronts of all fall Wavelengths together and the point A provides in the ZBE exactly one pixel A'r for all wavelengths.
  • FIG. 4 shows a calculated wavelet for three superimposed phase objects.
  • the associated spectral phase is indicated over the wavenumber, the optical thickness of the phase difference being determined from the deviation .DELTA..phi._o from the phase straight line, ie the spectral phase .phi Calculates phase object.
  • FIG. 6 shows the first derivative of the spectral phase ⁇ over the wavenumber k. From the zero crossing of the differentiated spectral phase d ⁇ / dA: the position k_o of the phase object can be determined with high precision.
  • FIG. 7 represents an economically and technically very interesting embodiment.
  • the light source Ib is designed as a fiber-coupled wavelength-tunable laser.
  • the light emerging from the fiber passes through a collimator 2 and illuminates a microlens array 3, which is followed by a micro-aperture array 4, the micro-diaphragms being arranged in each case in the focus position of the microlenses.
  • the microlens array 3 and the micro-aperture array 4 are fixedly connected to each other, this assembly is associated with a not shown here fast Rezisons x-y scanner, which also has a high-precision start position.
  • the spherical wave emanating from a micro-diaphragm from the center A thereof is collimated by the objective 6, that is to say converted into a plane wave, that is to say in FIG. H.
  • the point A is imaged to infinity and passes in the region of the Fourier plane of the long focal length lens 6, a polarizer 33, a Wollaston prism 34 and a diffractive-optical element in the form of a Fresnel zone lens 7 with focusing effect.
  • Wollaston prism 34 there is a splitting into ordinary and extraordinary bundles that are polarized perpendicular to each other and have a very small angle in the propagation to each other.
  • Fresnel zone lens 7 It is carried out by means of Fresnel zone lens 7 depending on the wavelength a different focus.
  • the refractive power of the Fresnel zone lens 7 is compensated by means of a directly downstream, low refractive diverging lens 8, to allow only slight deviations from the state of ideal collimation.
  • the following first imaging stage 9 images the Fresnel zone lens 7 into the Fourier plane of the condenser 10, so that there are weakly diverging as well as at least approximately plane as well as weakly converging waves as a function of the wavelength.
  • this imaging stage 9 is an optical retarder 35 with a thick Kalkspatplatte, so that a optical delay of about 80 microns between the vertical and the horizontal Poalarisationscardi, ie the ordinary and the extraordinary bundles.
  • a chromatic depth splitting in the object space whereby two groups of spherical waves of different focussing arise depending on the wavelength whose centers are shifted in depth, so that when imaging the point A here the foci A's_ ⁇ min until A's_ ⁇ min arise and A'p_ ⁇ min through A'p_ ⁇ min which have a lateral-shear 2 ⁇ q to each other. This is shown in FIGS. 8 and 9.
  • the water-immersion condenser 10 in Figure 7 can be readjusted in depth to ensure the confocality of the transmitted-light microscope.
  • An existing in the object space thin phase object 11 changes the optical path difference, so shifts the phase in the interferometer between the bundles with polarization-optical lateral shear.
  • the phase object 11 is usually optically so thin that the confocality of the transmitted-light microscope still exists, ie the object-induced optical path length change is still smaller than the range of the wavelength-optical depth of field.
  • a water immersion objective 12 images the object 11 as well as the light of the differently focused spherical waves, so that here a bright field arrangement is given.
  • the spherical waves detected by the lens are converted into approximately plane or weakly focused or divergent waves and meet the second imaging stage 13, which allows as an afocal stage an image on the diffractive-op table element in the form of a Fresnel zone lens 14 with divergent effect.
  • This Fresnel zone lens 14 is at least approximately in the pupil plane.
  • the amount of refractive power of this Fresnel zone lens 14 is at least approximately equal to the Fresnel zone lens 14 for each wavelength.
  • the subsequent, directly downstream, low refractive converging lens 15 compensates again for the average refractive power of the Fresnel zone lens 14.
  • the polarizer 33, the Wollaston prism 34 and the Wollaston prism 36 and the analyzer 37 form with the microscope components a polarization-optical shear interferometer.
  • FIG. 8 shows the beam path of the bundles in the object space in the case of the transmitted light microscope with differential interference contrast (DIC) according to Nomarski for thin phase objects.
  • the lateral shear here amounts to approximately 0.5 ⁇ m.
  • FIG. 9 illustrates the situation for a single wavelength ⁇ i, wherein the comparatively large optical path difference OPD is symbolically indicated here.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

Verfahren und Anordnung zur konfokalen Durchlicht-Mikroskopie mit einer polychromatischen Lichtquelle und Spektrometer oder mit einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle sowie einer Kamera, insbesondere auch für die phasenauswertende Interferenz-Mikroskopie, insbesondere auch zur dreidimensionalen Vermessung oder Lokalisierung von einem oder mehreren Phasenobjekten in der mikroskopischen Skala wie bewegte, ungefärbte, lebende Zellen oder auch zur Auslesung von optischen Durchlicht-Datenspeichern. Im Detektionsstrahlengang erfolgt erfÊndungsgemäß eine chromatische Tiefenaufspaltung durch eine chromatische Brechkraft. Durchlicht-Mikroskope können auf dem Zemike-Interferenz-Phasenkontrast-, dem Nomarski-DIC-, dem Hoffman-HMC- oder auch auf dem Mach-Zehnder-Interferometer-Prinzip basieren. Der optische Gangunterschied in einem Phasen-Durchlicht-Mikroskop ist hierbei so eingestellt, dass Interferenzstreifen, auch insbesondere in Form eines Wavelets, auswertbar sind, wobei sich dünne Phasenobjekte durch lokale Phasenänderungen im Wavelet in Abhängigkeit von der Tiefenposition markieren. Im Beleuchtungsstrahlengang besteht eine zweite chromatische, entgegen gesetzt wirkende Brechkraft, so dass für dünne Phasenobjekte im Objektraum des Durchlicht-Mikroskops Konfokalität (A'?i-B'?i) besteht.

Description

Anordnung und Verfahren zur konfokalen Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch zur Vermessung von bewegten Phasenobjekten
Stand der Technik
Die Durchfokussierung spielt bei der konfokalen Mikroskopie seit Marvin Minski, [Patentschrift US 3,013,467 vom 19. Dezember 1961] eine funktionstragende Rolle. Es wurden bereits viele Anstrengungen unternommen, die Durchfokussierung ohne mechanisch bewegte Teile zu realisieren.
Im Fachaufsatz von Christopher J. Mann, Lingfeng Yu, Chun-Min Lo, and Myung K. Kim: „High-resolution quantitative phase-contrast microscopy by digital holography" in OPTICS EXPRESS Vol. 13, No. 22, S. 8693-8698, 2005 wird ein holografisches, quantitatives Phasenkontrast-Mikroskopie- Verfahren beschrieben, bei dem die Objektinformationen außerhalb der Fokustiefe numerisch rekonstruiert werden. Deshalb ist für die dreidimensionale Erfassung eines Objekts vorteilhafterweise kein mechanisches Tiefen-Scannen erforderlich. Das Problem stellt hierbei jedoch das bei streuenden Proben nicht ganz vermeidbare Reststreulicht dar, dessen Einfluss hier durch die Nutzung der Informationen des Winkelspektrums zwar schon reduziert ist, bei sehr hohen Anforderungen aber dennoch etwas störend wirken kann. Außerdem ist die erreichbare Tiefenauflösung nicht in jedem Fall zufrieden stellend, beispielsweise, wenn eine Tiefenauflösung bzw. eine Auflösung der optischen Dicke von 10 nm und weniger gefordert ist.
Im Fachaufsatz von Christopher G. Rylander, Digant P. Dave, Taner Akkin, Thomas E. Milner, Kenneth R. Diller, and Ashley J. Welch: „Quantitative phase-contrast imaging of cells with phase-sensitive optical coherence microscopy", OPTICS LETTERS Vol. 29, No. 13, S. 1509-1511, 2004 wird ein faserbasiertes optisches Kohärenz-tomografisches System auf der Basis des differentiellen Interferenzkontrastes (OCT-DIC) beschrieben. Dieses System wird zur quantitativen Vermessung von Zellbestandteilen eingesetzt, indem Änderungen des optischen Gangunterschiedes hochaufgelöst bestimmt werden. Jedoch ist es nicht möglich, Objekte in deutlich unterschiedlicher Tiefe gleichzeitig mit hoher Lateralauflösung zu erfassen, da dies die Begrenzung durch die wellenoptische Schärfentiefe verhindert.
In der Schrift US 6,091,496 wird kein Ansatz für die spektral- interferometrische Durchlicht- Mikroskopie dargestellt, jedoch findet sich ein erster Hinweis zu derselben in WO2006/042696, Seite 118 unter Verwendung eines Mach-Zehnder-Interferometers mit chromatischer Längsaberration und Kompensation derselben. Hier ist jedoch keine Lehre gegeben, die Durchlicht-Mikroskopie für Phasenobjekte anzuwenden. In der Veröffentlichung von E. Papastathopoulos, K. Körner und W. Osten „Chromatically dispersed interferometry with wavelet analysis", in OPTICS LETTERS, Vol. 31, No. 5, S. 589-591, 2006, ist das Verfahren der Spektral-Interferometrie mit chromatischer Tiefenaufspaltung des Detektionsfeldes im Objektraum mit der Analyse der entstehenden Wavelet dargestellt. Dieser Ansatz wurde jedoch nicht für die Durchlicht-Mikroskopie beschrieben.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung zur Durchlicht-Mikroskopie kann für vielfältige Aufgaben in der Medizin und der Biologie, insbesondere zur Analyse von einzelnen, ungefärbten, unbehandelten, lebenden tierischen oder humanen Zellen sowie Kulturzellen eingesetzt werden, indem deren optische Dicke und Tiefenposition bestimmt wird. Insbesondere kann die Erfindung auch zur Analyse von Chromosomen in der Human- und Zytogenetik Anwendung finden. Beispielsweise sollen auch Bestandteile von Krebszellen hinsichtlich der optischen Dicken mit hoher Genauigkeit vermessen werden können.
Weiterhin kann die quantitative Bestimmung der Verteilung, der Position im Raum und der lateralen Abmessungen von opaken Mikropartikeln, beispielsweise auch von interstellarem Mikrostaub (star dust) in einem transparenten Medium erfolgen. Dieses muss zwischen Kondensor und Objektiv „eingebracht" werden. Es ist möglich, mit der Erfindung die Verteilung und die lateralen Abmessungen von Mikrofasern in einem transparenten oder auch partiell trüben Medium, wie spezielle Kunststoffe, zu bestimmen, also die Erfindung für technische Applikationen einzusetzen. Im NIR-Bereich ist die Analyse von Si-Strukturen in Transmission durchführbar, wobei wegen der sphärischen Aberration die Strukturen eine näherungsweise konstante Dicke aufweisen sollten. Es ist mit der erfinderischen Lösung auch eine Kristall-Analyse durchführbar. Erfindungsgemäß kann auch die Bestimmung von Brechzahlveränderungen in transparenten Medien in der mikroskopischen Skale lateral hochgenau und tiefenaufgelöst erfolgen. Die genannten Anwendungen können im DUV-, UV-, VIS- oder auch im NIR-Bereich erfolgen. Dabei kann auch mit Immersionstechniken in Öl, Wasser oder Glyzerin gearbeitet werden, wobei jeweils speziell abgestimmte Objektive eingesetzt werden.
Der erfinderische Ansatz ermöglicht auch die Auslesung von Volumen-Datenspeichern, die in Transmission arbeiten, indem Änderungen des Brechungsindexes im durchstrahlten Medium erfasst und ausgewertet werden. Ziele der Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere zur Vermessung der optischen Dicken von transparenten und partiell trüben Objekten, auch als Phasenobjekte bekannt, besteht darin, Neues für die gewerbliche Anwendung bereitzustellen.
•Das Ziel ist hierbei insbesondere auch die quantitative Erfassung von dünnen Phasenobjekten, z.B. einzelne, auch ungefärbte, lebende Zellen.
Das technische Ziel der Erfindung besteht in der Erhöhung der Geschwindigkeit beim Messen der optischen Dicken und der Vergrößerung des nutzbaren Tiefenmessbereiches, insbesondere bei Verwendung von einem Abbildungssystem mit einer vergleichsweise hohen numerischen Apertur, beispielsweise im Bereich von 0,4 bis 1,25 (Wasserimmersion) oder 1,5 (Ölimmer- sion) auf Werte, die einem Mehrfachen der wellenoptisch gegebenen Schärfentiefe entsprechen.
Die mit dem erfinderischen Sensor beim Messen gewonnenen optischen Signale sollen mittels Strahlungsdetektor oder gerastertem Strahlungsdetektor wie eine Zeilen- oder eine Flächenkamera, erfasst werden.
Ein weiteres Ziel ist, eine Lehre zur Auslesung von Volumen-Datenspeichern zu geben, die in Transmission arbeiten.
Aufgabe der Erfindung
Es sollen in der Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere zur Prüfung von Phasenobjekten beim optischen Antasten der Objekte in verschiedenen Tiefen des Objektraumes optische Signale aus diesen Tiefen ohne das mechanische Bewegen von Komponenten - insbesondere im Objektraum - gewonnen werden, um insbesondere auch die optische Dicke oder die Veränderung der optischen Dicke von einem Objekt oder dessen Bestandteilen oder auch von mehreren Objekten bestimmen zu können. Dabei soll eine zumindest näherungsweise beugungsbegrenzte laterale Abbildung des Objekts durch ein Abbildungssystem mit vergleichsweise hoher numerischer Apertur, insbesondere auch bei der Immersionstechnik, erfolgen.
Damit soll die erfinderische Aufgabe gelöst werden, für das Nomarski-Phasenkontrast- Verfahren, das Differenzielle Interferenzkontrast (DΙC)-Verfahren, das Hoffmann-Modu- lationskontrast (HMC)-Verfahren oder mittels Mikroskopen auf Basis der Zwei-Strahl-Inter- ferometrie, insbesondere auch mittels eines Mach-Zehnder-Interferometers, hochgenaue, quantitative Messungen der optischen Dicke oder der Dicken, einschließlich Variationen derselben, von transparenten Objekten mit sehr hoher Auflösung durchzuführen. Hierbei geht es also insbesondere um eine Auflösung in der Tiefenrichtung in der Größe von wenigen Nanometem.
Andererseits soll beim Wellenlängen-Scan mittels einer zeitlich Wellenlägen- durchstimmbaren, spektral schmalbandigen Strahlungsquelle die erfinderische Aufgabe gelöst werden, dass elektromagnetische Interferenzmodulationen über der Zeit erzeugt werden, die eine hinreichend kleine und damit technisch gut auswertbare Frequenz aufweisen, um aus diesen Informationen insbesondere die optische Dicke oder die Veränderung der optischen Dicke bestimmen zu können. Diese erfinderische Aufgabe soll insbesondere für ein konfokales differentielles Interferenz-Mikroskop, insbesondere für das Normarski-DIC- Mikroskop, also auf der Basis polarisationsoptisch generierter Lateral- Shear, sowie auch ein konfokales Zwei-Strahl-Interferenz-Mikroskop, insbesondere auch für ein konfokales Mach- Zehnder-Interferenz-Mikroskop, gelöst werden.
Beschreibung der Erfindung anhand der Merkmale
Das Ziel der Erfindung wird mit den nachstehenden erfinderischen Merkmalen erreicht:
Hauptmerkmal: Erfindungsgemäß wird bei einem Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch zur quantitativen Prüfung von einem oder mehreren Objekten oder eines Teils oder Teilen desselben oder derselben im Objektraum mit einer polychromatischen Lichtquelle im Beleuchtungsstrahlengang und mit einem
Spektrometer im Detektionsstrahlengang oder mit einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle im Beleuchtungsstrahlengang und mit Mitteln zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang wie mehrere Mikroblenden oder eine mittels mehrerer gerasterter Mikrooptiken, wie gerasterte Mikrolinsen, mehrfach abgebildete Blende sowie einer Kamera im Detektionsstrahlengang bei der Objektabbildung eine chromatische Tiefenaufspaltung mittels einer zumindest partiell chromatischen Brechkraft im Detektionsstrahlengang durchgeführt. So wird erreicht, dass Bilder der Mittelpunkte der Mikroblenden oder Bilder des Mittelpunktes der mehrfach abgebildeten Blende bei der Rückabbildung in den Objektraum dort eine chromatisch verursachte Tiefenaufspaltung erfahren. Damit sind diese Bilder bei einer polychromatischen Lichtquelle zu einem Zeitpunkt oder bei einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle sequentiell in der Lichtausbreitungsrichtung separiert, so dass Objektpunkte aus unterschiedlichen Tiefen mittels der Mikroblenden oder der Mikrolinsen erfasst werden können.
So kann ein Wert für die Tiefenposition eines scharf abgebildeten Objektpunktes eines sehr dünnen Phasenobjektes sowie dessen Änderung der optischen Dicke in Bezug zum umgebenden Medium errechnet werden. Dies kann in einem Bereich z_c erfolgen, der ein Mehrfaches der wellenoptischen Schärfentiefe betragen kann. Bei einem opaken dünnen Mikropartikel in einem transparenten Medium kann die Wellenlänge der Abschattung bestimmt werden, woraus die Kontur von Mikropartikeln bestimmt werden kann.
Dabei kann die Quelle elektromagnetischer Strahlung breitbandig, beispielsweise im DUV UV-, im VIS- oder auch im IR-Bereich, ausgebildet sein und auch kurzgepulst werden, beispielsweise ein Kurzpulslaser, und dessen Pulse mit einer Kamera, die als Detektor dient, beispielsweise im 100 Hz-Bereich, synchronisiert werden. Dies ist für bewegte Mikroszenen von Vorteil. Andererseits kann auch ein Wellenlängen-durchstimmbarer Laser eingesetzt werden. Weiterhin kann auch eine spektral breitbandige Quelle elektromagnetischer Strahlung eingesetzt werden, beispielsweise auch ein fasergekoppelter, breitbandiger Weißlichtlaser, wobei hier ein steuerbarer Monochromator nachgeordnet ist, um die Wellenlänge durchzustimmen.
Merkmal 2. Weiterhin wird vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren das Licht im Objektraum räumlich strukturiert, in dem mittels mehrerer Mikroblenden oder einer mittels mehrerer Mikrolinsen mehrfach abgebildete Makroblende ein Foki-Muster oder ein Fokuslinien-Muster im Objektraum vorbestimmt gebildet werden, und dabei im Beleuchtungsstrahlengang eine chromatische Tiefenaufspaltung dieser Foki oder Fokuslinien mittels zumindest partiell chromatischer Brechkraft durchgeführt wird, so dass diese Foki oder Fokuslinien in Lichtausbreitungsrichtung, also in der Tiefe, separiert sind. Dabei sind die zumindest partiell chromatische Brechkraft im Beleuchtungs- und die zumindest partiell chromatische Brechkraft im Detektionsstrahlengang so vorbestimmt eingebracht, dass im Objektraum der Betrag und die Richtung der chromatischen Tiefenaufspaltung der Foki oder der Fokuslinien zur Beleuchtung und im Detektionsstrahlengang der Betrag und die Richtung der chromatischen Tiefenaufspaltung der rückabgebildeten Mikroblenden oder der mehrfach abgebildeten Makroblende zumindest näherungsweise gleichgemacht sind. Dann sind im Objektraum die Bilder A' der Mittelpunkte A der Blenden BA des Beleuchtungsstrahlenganges oder die Bilder A' der Foki A und die Bilder B' der Mittelpunkte B der Blenden BB des Detektionsstrahlenganges, welche jeweils lateral und spektral korrespondieren, nämlich beispielsweise A'o_λmin-B'o_λmin und A'o_λmax-B'o_λmax, optisch konjugiert. So fallen deren Schärfeebenen im Objektraum zumindest näherungsweise zusammen. Demzufolge besteht Konfokalität von der Beleuchtung bis zur Detektion, da bei dünnen Phasenobjekten im Öbjektraum die Bilder A' und B' aller Wellenlängen zusammenfallen, beziehungsweise das Bild A" unabhängig von der Wellenlänge auch mit dem Mittelpunkt B einer Mikroblende BB im Detektionsstrahlengang zusammenfällt. Durch die konfokale Diskriminierung im Detek- tionsstrahlengang wird das im Objektraum gegebenenfalls auftretende, probenverursachte Streulicht auf dem Weg zur Kamera stark reduziert.
Weiterhin können bei dem erfinderischen Verfahren zur Vergrößerung des Tiefenmessbereiches über die wellenoptische Schärfentiefe hinaus auch nur zwei monochromatische Quellen elektromagnetischer Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge mit Frequenzmodulation eingesetzt werden, so dass das bekannte Heterodyn-Verfahren angewendet werden kann. Mit der Strahlung einer jeden Wellenlänge wird das Objekt in einer etwas anderen Tiefe abgetastet.
Merkmal 3. Weiterhin kommt vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht- Mikroskopie das Verfahren der Dunkelfeldmikroskopie zur Anwendung. Damit werden nur dünne durchscheinende Objekte oder Objektdetails von der Kamera erfasst, die das Licht auch streuen oder beugen und sich außerdem auch noch zumindest näherungsweise in der Schärfeebene einer rückabgebildeten Blende zur konfokalen Diskriminierung befinden, wobei die Schärfeebene eine von Licht einer vorbestimmten Wellenlänge des Spektrums der poly- chromatischen Lichtquelle oder der Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle ist. Objekte, die nicht das Licht streuen oder beugen, bleiben dunkel, da das direkt transmittierte Licht bekannterweise hierbei nicht erfasst wird. So kann in Abhängigkeit von der Intensität im Spektrum die Position eines Objektpunktes bestimmt werden, indem die Wellenlängenposition des Maximums der Intensität bestimmt wird und aus dieser die Tiefenposition. Dazu ist jedoch eine Wellenlängen-Tiefenpositions-Referenzierung des Dunkelfeldmikroskops erforderlich, wobei der Messbereich durch den Grad der chromatischen Tiefenaufspaltung vorgegeben ist, der aus dem Betrag der chromatischen Brechkraft resultiert. Die optische Dickendifferenz eines dünnen, durchscheinenden Objekts, welches sich aus der Differenz der Brechungsindizes zum umgebenden Medium ergibt, wobei das umgebende Medium beispielsweise bei biologischen Objekten Wasser sein kann, sollte dabei nur so groß sein, das sich dadurch keine wesentlich größere optische Weglängenänderung als die wellenoptische Schärfentiefe ergibt, da dies zu einer Kontrastverschlechterung bei der Abbildung streuender oder beugender Objekte fuhren kann. Anderenfalls kann hier vorzugsweise auch eine objektbezogene Anpassung des Abstandes von Kondensor und Objektiv, also eine axiale Verschiebung derselben, Abhilfe schaffen, welche die optische Dickendifferenz zwischen Objekt und Umgebungsmedium ausgleicht und somit wieder eine scharfe Objektanpassung ermöglicht. Es ist aber auch möglich, die Mikroblenden im Beleuchtungsstrahlengang oder Mikroblenden im Detektionsstrahlengang axial, also in der Tiefe, zu verschieben, um die bei dickeren Phasenobjekten gestörte Konfokalität wieder herzustellen. Bei vergleichsweise dicken Phasenobjekten, wobei hier „dick" auf die wellenoptische Schärfentiefe der mikroskopischen Abbildung bezogen ist und hierbei in der Regel ein Mehrfaches derselben vorausgesetzt ist, kann durch die axiale Verschiebung von Komponenten zur Anpassung an die optische Dicke, nur das Streulicht aus dem dicken Objekt die konfokale Diskriminierung überwinden, so dass das Objekt eine höhere Intensität als das objektfreie Umfeld zur Abbildung bringt.
Die Dunkelfeldmikroskopie wird zwar vor allem für die visuelle Beobachtung eingesetzt. Jedoch kann bei dem erfinderischen Verfahren über der Wellenzahl beispielsweise ein Extre- mum bestimmt werden, wodurch auch quantitative Aussagen über das Objekt möglich sind.
Merkmal 4. Weiterhin kommt vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht- Mikroskopie das Verfahren der Phasenmikroskopie auf der Basis der Interferenz von elektromagnetischen Wellen zur Anwendung. Dies ermöglicht eine besonders hohe Auflösung und fotometrische Sensitivität bei der Vermessung von Objekten.
Merkmal 5: Weiterhin kommt vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie mit chromatischer Tiefenaufspaltung das Phasenkontrast- Verfahren, insbesondere auch das nach F. Zernike, das differentielle Phasenkontrast- Verfahren, insbesondere auch das nach G. Nomarski, auch als DIC- Verfahren (DIC: Differential interference contrast) bezeichnet, also Verfahren auf der Basis polarisations-optischer Shear-Inter- ferometrie, das Hoffmann-HMC- V erfahren (HMC: Hoffmann modulation contrast) oder auch ein phasenmikroskopisches Verfahren nach dem Zweistrahl-Interferenz-Verfahren, insbesondere auch auf der Basis eines Mach-Zehnder-Interferometers, zur Anwendung. Dies sind eingeführte mikroskopische Verfahren, die durch die Anwendung der Erfindung für eine noch schnellere Objekterfassung, insbesondere auch zur hochgenauen Objektvermessung, genutzt werden können.
Merkmal 6: Weiterhin wird vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht- Mikroskopie ein optischer Gangunterschied OPD (OPD: optical path difference) im Strahlengang eines Phasen-Mikroskops eingeführt, der mindestens eine Wellenlänge der maximalen, detektierten Wellenlänge beträgt, vorzugsweise jedoch bis zu 100 Wellenlängen der maximalen, detektierten Wellenlänge. So werden Interferenzstreifen, insbesondere auch in Form eines Wavelets, auch als Müllersche Streifen oder Tolansky-Streifen bekannt, also Intensitätsverläufe über der Wellenlänge λ oder der Wellenzahl k, im detektierten Spektralbereich vorbestimmt gebildet. Dabei erzeugt ein dünnes und lateral kleines Phasenobjekt - beispielsweise in der Größenordnung der Ausdehnung des beugungsbegrenzten Punktbildes des Mikroskops - erfindungsgemäß eine lokale Phasenänderung in den Interferenzstreifen, also auch insbesondere in einem Wavelet. Diese lokale Phasenänderung wird ausgewertet. Ein lateral ausgedehntes Phasenobjekt, welches das Messfeld vollständig überdeckt, erzeugt eine Änderung der Frequenz im Interferenzmuster, also insbesondere auch in einem Wavelet, die über der Wellenzahl k zu einem veränderten Anstieg der Phase, also des Phasengradienten dtydk führt.
Insbesondere auch beim Nomarski-DIC -Verfahren können aufgrund der chromatischen Tiefenaufspaltung Zusatzinformationen gewonnen werden, indem beispielsweise über der Wellenzahl k ein Extremum bestimmt werden kann, wenn vorzugsweise ein hinreichend großer optischer Gangunterschied im DIC -Mikroskop mit polarisations-optischer Shear gegeben ist. Vorzugsweise kann dabei auch eine vergleichsweise dicke Verzögerungsplatte im DIC-Mikroskop verwendet werden, welche vorzugsweise einen optischen Gangunterschied zwischen den beiden Polarisationsrichtungen in der Größenordnung von 100 Wellenlängen der größten genutzten Wellenlänge aufweist, um die Genauigkeit der Phasenauswerte- strategien zu erhöhen.
Weiterhin ist es möglich, ein unterschiedlich in beiden Polarisations-Richtungen, die Phase schiebendes LCD im DIC-Mikroskop einzusetzen, um den optischen Gangunterschied in Sublambda-Schritten für das Phasenschiebeverfahren vorbestimmt variieren zu können.
Der optische Gangunterschied kann im Interferometer so eingestellt werden, dass die Interferenzstreifen über der Wellenlänge, insbesondere auch in Form eines Wavelet, mittels eines Spektrometers detektiert werden können. Vorzugsweise kann dabei also ein optischer Gangunterschied von mehreren zehn bis zu einigen Hundert Wellenlängen der größten verwendeten Wellenlänge eingestellt werden, wobei hier bei einer Applikation im nahen Infrarotbereich vorzugsweise ein Wellenlängenbereich von etwa 150 nm ausgewertet wird. Dabei ist für genaue Messungen eine Referenzierung der Wellenzahl über der Tiefe notwendig. Vorzugsweise kann in einem Mikroskop auf der Basis des Phasenkontrast- Verfahrens nach F. Zernike ein in Bezug auf die Lichtwellenlänge vergleichsweise dicker Phasenring eingebracht sein, der also einen optischen Gangunterschied von mehreren Wellenlängen einführt, vorzugsweise in der Größenordnung von 100 Wellenlängen der größten genutzten Wellenlänge. So können Zusatzinformationen gewonnen werden, indem bei lichtstreuenden Objekten eine Phasenvariation über der Wellenzahl - gegebenenfalls auch in Verbindung mit einer Intensitätsvariation - in einem Interferenzmuster ausgewertet werden kann.
Im erfinderischen Verfahren markieren sich lateral kleine und dünne Phasenobjekte durch lokale Phasenänderungen in den Interferenzstreifen über der Wellenlänge λ oder der Wellenzahl k, insbesondere auch in Form eines Wavelets, in Abhängigkeit von der optischen Dicke des oder der Phasenobjekte und auch in Abhängigkeit von deren Tiefenposition sowie also auch in Abhängigkeit von deren lateraler Ausdehnung. Der nutzbare Tiefenbereich Δz_c ist auch durch die Größe der chromatischen Tiefenaufspaltung im Abbildungsstrahlengang für die Objektbündel gegeben.
Die Gewinnung der Messgröße, beispielsweise die optische Dicke des Objekts in einer bestimmten Objekttiefe, kann mittels der Auswertung der Interferenzstreifen, die auch als Müllersche Streifen bezeichnet werden, erfolgen. Dazu kann beispielsweise der Nulldurchgang der ersten Ableitung dφ/d& der Phasenkurve φ(£) hochgenau ausgewertet werden.
Die Art und Weise der Auswertung der Intensität des Interferenzmusters über der Wellenlänge, beziehungsweise der Phase φ über der Wellenzahl k, um eine Messgröße - wie beispielsweise eine Information über eine Änderung der optischen Dicke oder der optischen Dicken des Objekts - zu erhalten, ist in dieser Schrift kein erfinderischer Gegenstand.
Weiterhin können bei einem Wellenlängen-Scan mittels einer Wellenlängen- durchstimmbaren, monochromatischen Strahlungsquelle elektromagnetische Interferenzmodulationen über der Zeit erzeugt werden, die durch die Größe des im Interferometer eingestellten Gangunterschiedes und die Geschwindigkeit des Wellenlängen-Scans eine technisch gut auswertbare Frequenz aufweisen.
Bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie ist es vorteilhaft, bei der mikroskopischen Objektabbildung die sphärische Aberration, also den Öffnungsfehler, hinreichend gut zu korrigieren, so dass eine zumindest näherungsweise beugungsbegrenzte Abbildung erfolgen kann. Merkmal 7: Weiterhin wird vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht- Mikroskopie die Phase der Interferenz, also insbesondere auch die in einem Wavelet gegebene Phase, ausgewertet. Dadurch kann eine Auflösung in axialer Richtung in der Größe von wenigen Nanometern erreicht werden, wobei dies stark von der Form des Interferenzmusters, also insbesondere auch eines Wavelets, sowie auch der Auswertestrategie abhängt. Dabei ist es auch möglich, dass eine mehrfache Phasenschiebung im Interferometer durchgeführt wird, um auch bei sehr dünnen Phasenobjekten noch sehr kleine Abweichungen von der zumindest näherungsweise geraden Phasenkurve detektieren zu können, wobei hier eine kleine lokale Abweichungen der Phase φ - im Sinne einer lokalen Störung des Phasenverlaufs φ(£), vorzugsweise mit einem lokalen Extremum - ja die Existenz eines Phasenobjektes anzeigt.
Merkmal 8: Weiterhin wird vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht- Mikroskopie der optische Gangunterschied im Unendlich-Strahlengang oder im chromatisch schwach fokussierten Strahlengang der mikroskopischen Abbildung eingebracht. So werden Abbildungsfehler wie die sphärische Aberration minimiert oder weitgehend vermieden.
Das Verfahren der chromatischen Tiefenaufspaltung und Kompensation derselben in Verbindung mit konfokaler Diskriminierung ist für alle interf erometrischen Verfahren einsetzbar, einschließlich in der digitalen Holografie in der mikroskopischen Skala.
Weiterhin kann es vorteilhaft kann sein, den Grad der Tiefenaufspaltung an das Messobjekt anzupassen, um dickere und auch dünnere Phasenobjekte jeweils optimal erfassen zu können.
Merkmal 9: Bei einer erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch mit Kondensor und Objektiv und insbesondere auch zur quantitativen Prüfung von einem Mikroobjekt im Objektraum, mit einer polychromatischen Lichtquelle im Beleuchtungsstrahlengang und mit einem Spektrometer im Detektionsstrahlengang oder einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle im Beleuchtungsstrahlengang, mit Mitteln zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang, wie mehrere Mikroblenden, vorzugsweise ein Mikroblenden-Array, oder eine mittels mehrerer Mikrolinsen mehrfach abgebildete Makroblende sowie einer Kamera im Detektionsstrahlengang sind Mittel mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung im Detektionsstrahlengang angeordnet. Diese Mittel ermöglichen eine scharfe Abbildung von Objekten oder Objektdetails aus unterschiedlichen Tiefen des Objektraumes gleichzeitig, wodurch mittels einer spektralen Analyse des Lichts mehr Informationen im Vergleich zu einem mechanisch durchgeführten Tiefen-Scan gewonnen werden sollen. Die konfokale Diskriminierung verringert sehr stark das Streulicht bei der optischen Abbildung, welches bei lichtstreuenden Proben wie biologischen Geweben oder partiell trüben Medien auftritt.
Merkmal 10: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht- Mikroskopie die Mittel mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung in der Fourier-Ebene, also der rückwärtigen Brennebene des Objektivs, oder in einer zu dieser optisch konjugierten Ebene angeordnet. Dadurch wird erreicht, dass der Abbildungsmaßstab bei der Detektion unabhängig von der Wellenlänge ist.
Merkmal 11 : Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht- Mikroskopie Mittel mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet. Weiterhin sind vorzugsweise Mittel zur strukturierten Beleuchtung des Objektraumes angeordnet. Mit diesen wird strukturiertes Licht, beispielsweise in Form einen Foki-Musters mit äquidistanten Fokusabständen, also eines Arrays von Lichtpunkten, erzeugt, wodurch sich das Streulicht bei der Abbildung des Objekts wesentlich reduzieren kann, da nur der Bereich des Objekts fokussiert beleuchtet wird, der auch detektiert wird. Dabei kann das Array von Lichtpunkten flächig, beispielsweise wie in DE 10 2006 007 172 Al dargestellt, ausgebildet sein, wobei zur spektralen Detektion in dieser Anordnung eine hochpixlige Kamera eingesetzt wird. Es können beispielsweise 64 x 64 Objektpunkte gleichzeitig spektral analysiert werden.
Merkmal 12: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht- Mikroskopie Mittel mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung in der Fourier-Ebene, also der rückwärtigen Brennebene des Kondensors, oder in einer zu dieser optisch konjugierten Ebene angeordnet. Dadurch wird erreicht, dass der Abbildungsmaßstab bei der Beleuchtung unabhängig von der Wellenlänge ist.
Merkmal 13: Weiterhin ist vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht- Mikroskopie bei der Anwendung eines Nomarski-DIC -Mikroskops mit zwei Wollaston- prismen ein optischer, doppelbrechender Verzögerer (Retarder) mit einem optischen Gangunterschied zwischen den beiden Polarisationsrichtungen zur Erzeugung von Interferenz, also Interferenzstreifen über der Wellenlänge λ oder der Wellenzahl k, insbesondere auch mit Interferenzstreifen in Form eines Wavelets, angeordnet. Dabei beträgt der optische Gangunterschied des doppelbrechenden Verzögerers mindestens eine Wellenlänge der maximalen, detektierten Wellenlänge, wobei der Verzögerer vorzugsweise im Raum zwischen den beiden Wollastonprismen des Nomarski-DIC-Mikroskops angeordnet ist. Die Auslegung des optischen Verzögerers ermöglicht es, die Ortsfrequenz der Interferenzstreifen, insbesondere auch in Form eines Wavelets, so einzustellen, dass diese optimal an die spektrale Auflösung des Spektrometers angepasst ist, so dass eine Auswertung der Streifen noch technisch möglich ist.
Merkmal 14: Weiterhin ist vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht- Mikroskopie der optische, doppelbrechende Verzögerer in Form einer Kalkspatplatte (calcite plate) ausgebildet. Dieses Material weist eine besonders hohe Doppelbrechung auf.
Merkmal 15: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht- Mikroskopie die Mittel mit chromatischer Brechkraft als diffraktiv-optische Elemente (DOEs) ausgebildet. Diese weisen eine hohe chromatische Aufspaltung auf.
Merkmal 16: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht- Mikroskopie die Mittel zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang, wie ein Mikroblenden-Array oder auch ein Mikrolinsen-Array, hochgenau lateral verschiebbar angeordnet. So kann mittels Lateral-Scan der Mittel zur konfokalen Diskriminierung eine lückenlose laterale Abtastung eines zumindest teilweise transparenten Objekts erfolgen.
Merkmal 17: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht- Mikroskopie die Mittel zur Strukturierung des Lichts im Beleuchtungsstrahlengang, wie ein Mikroblenden-Array oder auch ein Mikrolinsen-Array, hochgenau lateral verschiebbar angeordnet. Diese Mittel werden synchron mit den Mittel zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang verschoben, so dass die laterale Zuordnung der Bilder derselben im Objektraum bei der Verschiebung und bei der Bildaufnahme mittels Kamera stets erhalten bleibt. Dabei ist es vorzugsweise auch möglich, dass durch eine Faltung des optischen Strahlenganges die Mittel zur Strukturierung des Lichts im Beleuchtungsstrahlengang und die Mittel zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang starr gekoppelt werden, wobei auch der Abbildungsmaßstab im Beleuchtungs- und im Detektionsstrahlengang gleich gemacht ist, so dass nur ein einziges mechanisches Scan-System zur lateralen Verschiebung derselben Mittel notwendig ist.
Merkmal 18: Für Applikationen in der biologischen Forschung kann die optische Kopplung der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie, also vorzugsweise ein quantitatives Phasenmikroskop, mit einer optischen, rechnergesteuerten Pinzette durchgeführt werden. So können insbesondere auch lebende Zellen im Objektraum eines Phasenmikroskops vorbestimmt und hochpräzise bewegt werden. Dabei kann mittels Phasenmikroskops eine Zelle hinsichtlich ihrer optischen Dicke oder ihrer optischen Dicken vermessen werden. Insbesondere kann auch die laterale Variation der optischen Dicke einer Zelle bestimmt werden. Außerdem ist eine Positionsbestimmung und Mikroformbestimmung von Zellen mit Hilfe einer optischen Pinzette möglich, indem beispielsweise ausgewählte Zellen in das Messvolumen zum Vermessen transportiert werden.
Weitere erfinderische Merkmale:
Es kann beim Mach-Zehnder-Interferometer auf der Basis der erfinderischen Anordnung eine Phasen- Schiebung mittels mechanischem Scan im Referenzarm durchgeführt werden. Insbesondere ist bei sehr schwachen Signalen aufgrund einer hohen und stark lichtschwächenden Objektdichte dadurch eine Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses erreichbar. Diese Phasen-Schiebung kann mittels mechanischem Scan an einem Winkelspiegel, aber auch mittels eines Phase-mostly-LCDs durchgeführt werden. Dieses LCD befindet sich dann vorzugsweise in einer Zwischenbildebene ZBE im Referenzstrahlengang. Es ist aber auch möglich, durch Amplitudenteilung Interferenzen über der Wellenlänge λ in verschiedener Phasenlage gleichzeitig auf einem Detektor aufzunehmen. Dies kann vorzugsweise auch unter Nutzung des zweiten Ausganges des Mach-Zehnder-Interferometers erfolgen.
Die zu messenden Phasenobjekte sollten bei der erfinderischen Anordnung im Messvolumen eher vereinzelt angeordnet sein, können aber auch gegebenenfalls übereinander liegen, wenn die partielle Transmission einer Kugelwelle zu einem Objektpunkt im Messvolumen immer noch gegeben ist, ohne dass die Beleuchtungsapertur wesentlich verringert wird. Anderenfalls wird die Auswertung sehr viel schwieriger oder ist gar nicht mehr möglich.
Weiterhin ist es möglich, mittels der erfinderischen Anordnung zusätzlich auch noch spektrale Informationen, beispielsweise im IR-Fluoreszenzlicht zur Stoffwechsel-Analyse lebender Zellen zu gewinnen, wobei dazu ein zusätzlicher Auskoppelstrahlengang in der Anordnung verwendet wird. Außerdem kann die NIR-Fourier-Transform-Spektroskopie oder die dis- persive Spektroskopie zur Gewinnung weiterer Informationen mit der Durchlicht-Mikroskopie verbunden werden, indem dazu Licht aus dem Objektstrahlengang ausgekoppelt wird.
Es kann für biologische Objekte in Wasser- Immersions-Technik im optischen System eine Numerische Apertur von über 1 realisiert werden. Auch für technische Objekte in Öl-Immer- sions-Technik kann im optischen System eine Numerische Apertur von über 1 realisiert werden. Bei dicken Proben, wobei dick hier beschreibt, wenn die axiale Bildverschiebung die Größenordnung der mittleren Lichtwellenlänge oder mehr erreicht, muss deshalb wegen der wellenoptischen Schärfentiefe, die bei hoher Numerischer Apertur gering ist, gegebenenfalls eine axiale Nachjustierung an einem der beiden Mikroskopobjektive zur Abstandsanpassung erfolgen, damit die Konfokalität im optischen System erhalten bleibt. Es kann dann bereits ein Öffhungsfehler bei der Abbildung auftreten, der jedoch durch ein adaptives optisches System behoben werden kann.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bei einem erfindungsgemäßen Durchlichtmikroskop mit chromatischer Tiefenaufspaltung vorzugsweise der Kondensor mittels einer GRIN-Linse ausgebildet. Weiterhin ist erfindungsgemäß bei einem erfindungsgemäßen Durchlichtmikroskop mit chromatischer Tiefenaufspaltung vorzugsweise das Objektiv mittels einer GRIN-Linse ausgebildet. Dies führt jeweils zu einer sehr kompakten Anordnung.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bei einem erfmdungsgemäßen Durchlichtmikroskop mit chromatischer Tiefenaufspaltung vorzugsweise eine Kamera mit logarithmischer Kennlinie eingesetzt. Mit dieser ist in der Regel ein wesentlich größerer Helligkeitsbereich auf dem Objekt im Vergleich zu Kameras mit linearer Kennlinie erfassbar.
Weiterhin kann bei einem erfindungsgemäßen Durchlichtmikroskop im Objektstrahlengang vorzugsweise ein System aus einem elektrisch-steuerbaren, diffraktiv-optischen Element und einer elektrisch-steuerbaren Elektrowetting-Linse angeordnet sein, welche die mittlere Brechkraft des diffraktiv-optischen Elements zumindest teilweise kompensiert. Dabei kann der Grad der chromatischen Tiefenaufspaltung mittels diffraktiv-optischen Elements verändert werden, wobei die Nachregelung der Brechkraft der Elektrowetting-Linse die Schärfeebenen und damit die Lage des Tiefenmessbereiches im Objektraum in der gleichen Tiefe hält. So kann eine optimale Anpassung des optischen Systems erreicht werden. Dies ist kann bei einer Anordnung mit Immersionsflüssigkeit im Objektraum vorteilhaft sein.
Weiterhin kann dem Detektor oder der Kamera des erfindungsgemäßen Durchlicht- Mikroskops vorzugsweise ein weiteres Zweistrahl-Interferometer vorgeordnet sein, mit welchem durch einen Scan des optischen Gangunterschieds in demselben eine spektrale Analyse der interferierenden Strahlung des Zweistrahl-Interferometers erfolgen kann.
Es ist auch möglich, für die Anwendung der Erfindung insbesondere auch ein invertiertes Mikroskop einzusetzen.
Beschreibung der Figuren
Die Figur 1 stellt eine Anwendung für ein quantitatives 3D-Durchlicht-Mikroskop für dünne Phasenobjekte auf der Basis eines Mach-Zehnder-Interferometers (MZI) dar, um die optische Dicke oder die Variationen der optische Dicke eines Objekts ortsaufgelöst und hochgenau zu bestimmen. Hierbei ist die Anordnung als chromatisch-konfokales Spektral-Interferometer aufgebaut. Die Anwendung kann in der biologischen Forschung, beispielsweise zur hoch- genauen Bestimmung der optischen Dicken von Zellbestandteilen in der Krebsforschung, in der medizinischen Diagnostik, aber auch für technische Applikationen genutzt werden.
Die Lichtquelle Ia ist als fasergekoppelter Weißlichtlaser ausgebildet. Das aus der Faser austretende Licht passiert einen Kollimator 2 und beleuchtet ein Mikrolinsen-Array 3, welchem ein Mikroblenden-Array 4 nachgeordnet ist, wobei die Mikroblenden jeweils in der Fokusposition der Mikrolinsen angeordnet sind. Die Figur Ia zeigt diesen Sachverhalt für eine Mikroblende BA mit dem Blendenmittelpunkt A, welcher auch einem Fokus entspricht und auch den Ursprung einer Kugelwelle K darstellt. Das Mikrolinsen-Array 3 und das Mikroblenden-Array 4 sind miteinander fest verbunden, wobei dieser Baugruppe ein hier nicht dargestellter schneller Präzisons-x-y-Scanner zugeordnet ist, der auch eine hochgenaue laterale Startposition aufweist. Die Kugelwelle K, die hier stellvertretend für eine Vielzahl von Kugelwellen dargestellt ist, wird am Strahlteiler 5 in eine Objektwelle und eine Referenzwelle aufgeteilt. Die von einer Mikroblende BA vom Mittelpunkt A derselben ausgehende Kugelwelle wird vom Objektiv 6 kollimiert, also in eine Planwelle gewandelt, d. h. der Punkt A wird nach Unendlich abgebildet und passiert dabei ein diffraktiv-optisches Element in Form einer Fresnelschen Zonenlinse 7 mit fokussierender Wirkung. Diese Zonenlinse 7 steht zumindest näherungsweise in einer Ebene PE' 10, welche zur Pupillenebene PElO und zur Fourier-Ebene eines nachgeordneten Kondensors 10 optisch konjugiert ist. Es erfolgt mittels dieser Fresnelschen Zonenlinse 7 in Abhängigkeit von der Wellenlänge eine unterschiedliche Fokussierung. Für die mittlere Wellenlänge λO des Spektrums ist die Brechkraft der Fresnelschen Zonenlinse 7 mittels einer direkt nachgeordneten, schwach refraktiven Zerstreuungslinse 8 kompensiert, um nur geringe Abweichungen vom Zustand der idealen Kollimation zuzulassen, so dass für die mittlere Wellenlänge λO stets nur eine plane oder sehr schwach gekrümmte Wellenfront entsteht. Die nachfolgende erste Abbildungsstufe 9 bildet die Fresnelsche Zonenlinse 7 in die Fourier-Ebene FlO des Kondensors 10 ab, die mit der Pupillenebene PElO identisch ist, so dass dort sowohl schwach divergierende, zumindest näherungsweise plane, als auch schwach konvergierende Wellen in Abhängigkeit von der Wellenlänge vorhanden sind. So erfolgt mittels der Fresnelschen Zonenlinse 7 und des Wasser-Immersions-Kondensors 10 eine chromatische Tiefenaufspaltung im Objektraum, wodurch Kugelwellen unterschiedlicher Fokussierung je nach Wellenlänge entstehen, deren Zentren in der Tiefe verschoben sind, so dass bei der Abbildung des Punktes A hier die Foki A'o_λmin bis A'o_λmin entstehen. Die rückabgebildeten Bilder B'o_λmin bis B'o_λmin des korrespondieren Punktes B der den Mittelpunkt einer konfokalen Mikroblende BB darstellt, siehe auch Figur Ib, fallen mit den Foki A'o_λmin bis A'o_λmin zusammen. Der Kondensor 10 kann in der Tiefe und gegebenenfalls auch lateral nachjustiert werden, um die Konfokalität des Durchlicht-Mikroskops präzise sicherzustellen. Ein im Objektraum vorhandenes dünnes Phasenobjekt 11 verändert den optischen Gangunterschied, also verschiebt auch die Phase im MZI. Das Phasenobjekt 11 ist aber in der Regel optisch so dünn, dass die Konfokalität des Durchlicht-Mikroskops noch besteht, d. h. die objektverursachte optische Weglängenänderung noch unterhalb der wellenoptischen Schärfentiefe ist. Ein Wasser- Immersions-Objektiv 12 bildet das Objekt 11. Die vom Objektiv 12 erfassten Kugelwellen werden in näherungsweise plane oder schwach fokussiert oder divergierende Wellen gewandelt und treffen auf die zweite Abbildungsstufe 13, welche eine Abbildung auf das diffraktiv-optische Element in Form einer Fresnelschen Zonenlinse 14 mit divergierender Wirkung ermöglicht. Diese Fresnelsche Zonenlinse 14 steht zumindest näherungsweise in einer zur Pupillenebene und Fourier-Ebene F' 12 konjugierten Ebene des Objektivs 12, also in der Ebene F" 12. Der Betrag der Brechkraft dieser Fresnelschen Zonenlinse 14 ist für jede Wellenlänge zumindest näherungsweise gleich der Fresnelschen Zonenlinse 14. Die nachfolgende, direkt nach- geordnete, schwach refraktive Sammellinse 15 kompensiert wieder die mittlere Brechkraft der Fresnelschen Zonenlinse 14. Im Ergebnis des Passierens der Fresnelschen Zonenlinse 14 ist die chromatische Aufspaltung des Beleuchtungsstrahlenganges, also die Tiefenaufspaltung durch die Fresnelschen Zonenlinse 7 kompensiert. Der nachgeordnete Winkelspiegel 16 bewirkt die Umlenkung auf das Tubusobjektiv 17 mit einer Wellenfront- Inversion. Nach dem Passieren des Strahlteilers 18, der hier zur Strahlvereinigung mit den Licht aus dem Referenzstrahlengang dient, entstehen die Foki aller Wellenlängen durch die kompensierende Wirkung der Fresnelschen Zonenlinse 14 zumindest näherungsweise wieder in einer Ebene. In dieser Ebene befindet sich das zweite Mikroblenden-Array 25 zur konfokalen Diskriminierung. Die Figur Ib stellt das Mikroblenden-Array 25 mit der Mikroblende BB dar.
Die in Figur 1 am Strahlteiler 5 in den Referenzarm des MZI reflektierten Kugelwellen, bzw. das Referenzbündel, erfahren keine chromatische Aufspaltung. Die Abbildung im Referenzarm erfolgt über das langbrennweitige Objektiv 19, den Winkelspiegel 20, der eine für die Detektion der Müllerschen Streifen geeignete Einstellung des optischen Gangunterschieds im MZI ermöglicht. Beispielsweise ist mittels des Winkelspiegels 20 ein optischer Gangunterschied von 80 μm für das MZI eingestellt. Die Abbildung im Referenzarm erfolgt weiterhin über das Keilplatten-Paar 21, das zum Dispersionsausgleich dient, wobei die Keilwinkel hinreichend klein gewählt sind, sowie die Objektive 22, 23 und 24, wobei eine Zwischenabbildung in der Ebene ZBE erfolgt. Hier entsteht das Bild A'r von BA sowie auch das rückabgebildete Bild B'r des Mittelpunktes B der korrespondierenden Mikroblende BB. In der Zwischenbildebene ZBE kann für optisch dichte Proben ein Amplituden-Matching, also eine Anpassung der Intensität für die Referenzstrahlung durchgeführt werden. So stellt die Ebene ZBE also eine mögliche Position für ein LCD zwecks Amplituden-Matching und Phasen-Matching dar.
Die Einkopplung des Lichts aus dem Referenzarm in den Detektionsstrahlengang erfolgt über den Strahlteiler 18. In der Ebene des zweiten Mikroblenden- Arrays 25 fallen die kohärenten Foki des Objekt- und die des Referenzstrahlenganges A"o_l A"r_l zusammen, beispielsweise im Punkt B der Mikroblende BB zum interferierenden Fokuspunkt A' Or I . Durch das Mikroblenden-Array 25 erfolgt eine konfokale Filterung, hier beispielsweise in der Mikroblende BB mit dem Mittelpunkt B. Dem Mikroblenden-Array 25 ist ebenfalls ein hier nicht dargestellter, schneller Präzisons-x-y-Scanner zugeordnet, der synchron und hochgenau in Bezug auf den schnellen Präzisons-x-y-Scanner von der Baugruppe Mikrolinsen-Array 3 und Mikroblenden-Array 4 bewegt wird. So wird erreicht, dass in jeder Position eine Mikroblende des Mikroblenden-Arrays 4 auf eine und dieselbe, jeweils korrespondierende Mikroblende des Mikroblenden-Arrays 25 abgebildet wird, beispielsweise die Mikroblende BA auf die korrespondierende Mikroblende BB. So besteht im System Konfokalität, welche in der Regel auch durch dünne Phasenobjekte nicht wesentlich beeinflusst wird. Bei etwas dickeren Phasenobjekten erfolgt zum Herstellen der Konfokalität des Systems notwendigerweise eine axiale Nachjustierung am Kondensor 10, die auch von einer lateralen Nachjustierung begleitet sein kann. Die interferierenden Kugelwellen, die aus den Mikroblenden des Mikroblenden- Arrays 25 austreten passieren ein Spektrometer, welches aus der refraktiv-diffraktiven Baugruppe 27 und dem Abbildungssystem mit den Objektiven 26 und 28 besteht. Die spektral aufspalteten, interferierenden Bündel gelangen auf eine Kamera 29 und werden dort detektiert. Auf der Kamera 29 entsteht das Spektrum der Intensität über der Wellenlänge, die Müllerschen Interferenzstreifen, in Form eines Wavelets. Die Auswertung kann mittels der Auswertung der Phasen Variation über der Wellenlänge erfolgen, da die Intensität über der Wellenlänge vom optischen Gangunterschied im MZI abhängig ist. Die Auswertung der Interferenzstreifen wird in dieser Schrift nicht dargestellt.
Ein MZI in Figur 1 weist am Strahlteiler 18 einen zweiten Interferometer- Ausgang auf. So kann über ein feststehendes Mikroblenden-Array 30 und das Mikrolinsen-Array 31 und ein mikroskopisches Abbildungssystem 32 mit einem nicht dargestellten optischen Schmalbandfilter eine visuelle Beobachtung erfolgen, wenn der schnelle Präzisons-x-y-Scanner von der Baugruppe Mikrolinsen-Array 3 und das Mikroblenden-Array 4 sich in der Startposition befinden, da das feststehende Mikroblenden-Array 30 auf diese Position hin lateral ausgerichtet ist. Durch einen Wechsel des optischen Schmalbandfilters kann eine andere Tiefe des Objektraumes scharf gesehen werden. Diese Möglichkeit der visuellen Beobachtung kann zu Forschungszwecken, aber auch für die Objektpositionierung mitverwendet werden.
Wegen der Beleuchtung des Objekts 11 mit einem Fokus-Muster ergibt sich ein verringerter Füllgrad, also ein „optisches Nadelkissen" bei der optischen Abtastung. Dies kann jedoch mittels synchronisiertem Lateral-Scan von Mikroblenden-Array 3 und Mikroblenden-Array 4 sowie des Mikroblenden-Arrays 25 völlig ausgeglichen werden, so dass ein Vollbild des Objekts 11 gewonnen wird. Es gibt dabei zwei Modi:
1. Innerhalb der Zeit eines Kamera-Frames wird der Lateral-Scan ausgeführt, so dass eine Integration über alle Positionen erfolgt.
2. In jeder Position beim Lateral-Scan wird ein Bild aufgenommen, gespeichert und zu einem Datensatz verrechnet. Das ergibt gegenüber Modus 1 mehr laterale Informationen.
Die Komponenten Mikrolinsen-Array 3 und gekoppeltes Mikroblenden-Array 4 sowie das Mikroblenden-Array 25 werden beispielsweise gemeinsam in 10 x 10 Positionen gescannt, da das hierbei das Verhältnis des Fokusfleckdurchmessers zum Fokusabstand um 1 :10 liegen soll. Am Besten wird in jeder Position ein Kamerabild mittels der Kamera 29 aufgenommen, die am besten als High-Speed-Kamera ausgebildet ist.
Das Spektrometer ist als ein Flächenspektrometer, wie in DE 10 2006 007 172 Al dargestellt, mit einer 4 Mega-Pixel Kamera ausgebildet. Es werden beispielsweise 64 x 64 Objektpunkte gleichzeitig spektral, z.B. mittels 2048 Spektralelementen für jeden Objektpunkt des Objekts 11, analysiert, so dass beispielsweise 10 x 10 = 100 Scans mit je einer Detektion eines Bildes in jeder Scan-Position durch die Kamera 29 ausgeführt werden.
Die Figur 2 stellt die Bündel beim Durchlicht-Mikroskop mit chromatischer Aufspaltung der Bündel bei der Beleuchtung auf der Basis eines Mach-Zehnder-Interferometers im Objektstrahlengang des MZI von Figur 1 dar. Das Objekt 11 ist hierbei ein dünnes Phasenobjekt. Es ist der Bereich der Tiefenaufspaltung z_λ sowie der Bereich z_c, in welchem dünne Phasenobjekte erfasst werden können, dargestellt.
Die Figur 3 stellt den Strahlengang im Referenzarm des MZI von Figur 1 dar. Da es keine chromatischen Komponenten im Referenzarm gibt, fallen die Wellenfronten aller Wellenlängen zusammen und der Punkt A liefert in der ZBE genau einen Bildpunkt A'r für alle Wellenlängen.
Die Figur 4 stellt ein errechnetes Wavelet für drei übereinander liegende Phasenobjekte dar. In Figur 5 ist die zugehörige spektrale Phase über der Wellenzahl angegeben, wobei sich aus der Abweichung Δφ_o von der Phasengeraden, also der spektralen Phase φ(£), die optische Dicke des Phasenobjekts errechnen lässt. Figur 6 zeigt die erste Ableitung der spektralen Phase φ über der Wellenzahl k. Aus dem Nulldurchgang der differenzierten spektralen Phase dφ/dA: kann die Position k_o des Phasenobjektes hochgenau bestimmt werden.
Die Figur 7 stellt eine wirtschaftlich und technisch sehr interessante Ausführung dar. Die Lichtquelle Ib ist als fasergekoppelter Wellenlängen-durchstimmbarer Laser ausgebildet. Das aus der Faser austretende Licht passiert einen Kollimator 2 und beleuchtet ein Mikrolinsen- Array 3, welchem ein Mikroblenden- Array 4 nachgeordnet ist, wobei die Mikroblenden, jeweils in der Fokusposition der Mikrolinsen angeordnet sind. Das Mikrolinsen- Array 3 und das Mikroblenden-Array 4 sind miteinander fest verbunden, wobei dieser Baugruppe ein hier nicht dargestellter schneller Präzisons-x-y-Scanner zugeordnet ist, der auch eine hochgenaue Startposition aufweist.
Die von einer Mikroblende vom Mittelpunkt A derselben ausgehende Kugelwelle wird vom Objektiv 6 kollimiert, also in eine Planwelle gewandelt, d. h. der Punkt A wird nach Unendlich abgebildet und passiert dabei im Bereich der Fourier-Ebene des langbrennweitigen Objektivs 6 einen Polarisator 33, ein Wollastonprisma 34 und ein diffraktiv-optisches Element in Form einer Fresnelschen Zonenlinse 7 mit fokussierender Wirkung. Am Wollastonprisma 34 erfolgt eine Aufspaltung in ordentliche und außerordentliche Bündel, die senkrecht zueinander polarisiert sind und einen sehr kleinen Winkel bei der Ausbreitung zueinander aufweisen.
Es erfolgt mittels Fresnelscher Zonenlinse 7 in Abhängigkeit von der Wellenlänge eine unterschiedliche Fokussierung. Für die mittlere Wellenlänge des Spektrums ist die Brechkraft der Fresnelschen Zonenlinse 7 mittels einer direkt nachgeordneten, schwach refraktiven Zerstreuungslinse 8 kompensiert, um nur geringe Abweichungen vom Zustand der idealen Kollimation zuzulassen. Die nachfolgende erste Abbildungsstufe 9 bildet die Fresnelschen Zonenlinse 7 in die Fourier-Ebene des Kondensors 10 ab, so dass dort sowohl schwach divergierende sowie zumindest näherungsweise plane als auch schwach konvergierende Wellen in Abhängigkeit von der Wellenlänge vorhanden sind. In dieser Abbildungsstufe 9 befindet sich ein optischer Verzögerer 35 mit einer dicken Kalkspatplatte, so dass eine optische Verzögerung von etwa 80 μm zwischen der senkrechten und der waagerechten Poalarisationsrichtung, also den ordentlichen und den außerordentlichen Bündeln besteht. Anschließend erfolgt mittels des Wasser- Immersions-Kondensors 10 eine chromatische Tiefenaufspaltung im Objektraum, wodurch zwei Gruppen von Kugelwellen unterschiedlicher Fokussierung je nach Wellenlänge entstehen, deren Zentren in der Tiefe verschoben sind, so dass bei der Abbildung des Punktes A hier die Foki A's_λmin bis A's_λmin entstehen und A'p_λmin bis A'p_λmin die eine Lateral-Shear 2Δq zueinander aufweisen. Das ist in den Figuren 8 und 9 dargestellt. Der Wasser- Immersions-Kondensor 10 in Figur 7 kann in der Tiefe nachjustiert werden, um die Konfokalität des Durchlicht-Mikroskops sicherzustellen. Ein im Objektraum vorhandenes dünnes Phasenobjekt 11 verändert den optischen Gangunterschied, also verschiebt auch die Phase im Interferometer zwischen den Bündeln mit polarisationsoptischer Lateral-Shear. Das Phasenobjekt 11 ist aber in der Regel optisch so dünn, dass die Konfokalität des Durchlicht-Mikroskops noch besteht, d. h. die objektverursachte optische Weglängenänderung noch kleiner als der Bereich der wellenoptischen Schärfentiefe ist. Ein Wasser-Immersions-Objektiv 12 bildet das Objekt 11 ab sowie auch das Licht der unterschiedlich fokussierten Kugelwellen, so dass hier eine Hellfeldanordnung gegeben ist. Die vom Objektiv erfassten Kugelwellen werden in näherungsweise plane oder schwach fokussiert oder divergierende Wellen gewandelt und treffen auf die zweite Abbildungsstufe 13, welche als afokale Stufe eine Abbildung auf das diffraktiv-op tische Element in Form einer Fresnelschen Zonenlinse 14 mit divergierender Wirkung ermöglicht. Diese Fresnelsche Zonenlinse 14 steht zumindest näherungsweise in der Pupillenebene. Der Betrag der Brechkraft dieser Fresnelschen Zonenlinse 14 ist für jede Wellenlänge zumindest näherungsweise gleich der Fresnelschen Zonenlinse 14. Die nachfolgende, direkt nachgeordnete, schwach refraktive Sammellinse 15 kompensiert wieder die mittlere Brechkraft der Fresnelschen Zonenlinse 14. Im Ergebnis des Passierens der Fresnelschen Zonenlinse 14 ist die chromatische Aufspaltung des Beleuchtungsstrahlenganges, als die Tiefenaufspaltung durch die Fresnelschen Zonenlinse 7 kompensiert. Der Polarisator 33, das Wollastonprisma 34 sowie das Wollastonprisma 36 und der Analysator 37 bilden mit den Mikroskop-Komponenten ein polarisationsoptisches Shear- Interferometer.
Der weitere Strahlengang entspricht dem bereits in der Figur 1 beschriebenen. Die chromatischen Wavelets entstehen hier jedoch in Abhängigkeit von der Wellenlängen- Durchstimmung mittels der Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle Ib. Die Figur 8 stellt den Strahlengang der Bündel im Objektraum beim Durchlicht-Mikroskop mit differentiellem Interferenz-Kontrast (DIC) nach Nomarski für dünne Phasenobjekte dar. Die Lateral-Shear beträgt hierbei etwa 0,5 μm. Die Figur 9 stellt den Sachverhalt für eine einzelne Wellenlänge λi dar, wobei der vergleichsweise große optische Gangunterschied OPD hier symbolisch angedeutet ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch zur quantitativen Prüfung von einem oder mehreren Objekten (11) oder eines Teils oder Teilen desselben oder derselben im Objektraum,
- mit einer polychromatischen Lichtquelle (Ia) im Beleuchtungsstrahlengang und mit einem Spektrometer (26, 27, 28) im Detektionsstrahlengang
- oder einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle (Ib) im Beleuchtungsstrahlengang und mit Mitteln zur konfokalen Diskriminierung (25, 30) im Detektionsstrahlengang, wie mehrere Mikroblenden (B) oder eine mittels mehrerer gerasterter Mikrooptiken - wie gerasterte Mikrolinsen - mehrfach abgebildete Blende, sowie einer Kamera (29) im Detektionsstrahlengang gekennzeichnet dadurch, dass bei der Objektabbildung eine chromatische Tiefenaufspaltung mittels zumindest partiell chromatischer Brechkraft im Detektionsstrahlengang durchgeführt wird, so dass Bilder der Mittelpunkte der Mikroblenden (25, B)' oder Bilder des Mittelpunktes der mehrfach abgebildeten Blende bei der Rückabbildung in den Objektraum dort eine chromatisch verursachte Tiefenaufspaltung erfahren, so dass diese Bilder (B'o_λmin, B'o_λmax) bei einer polychromatischen Lichtquelle zu einem Zeitpunkt oder bei einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle sequentiell in der Lichtausbreitungsrichtung separiert sind.
2. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 1 , gekennzeichnet dadurch, dass das Licht im Objektraum räumlich strukturiert wird, in dem mittels mehrerer Mikroblenden (4, A) oder einer mittels mehrerer Mikrolinsen mehrfach abgebildete Makroblende
- ein Foki-Muster
- oder ein Fokuslinien-Muster im Objektraum vorbestimmt gebildet werden, und dabei im Beleuchtungsstrahlengang eine chromatische Tiefenaufspaltung dieser Foki oder Fokuslinien mittels zumindest partiell chromatischer Brechkraft durchgeführt wird, so dass die Bilder (A'o_λmin, A'o_λmax) in Lichtausbreitungsrichtung separiert sind und dass dabei die zumindest partiell chromatische Brechkraft im Beleuchtungs- und die im Detektionsstrahlengang so vorbestimmt eingebracht sind, dass im Objektraum der Betrag und die Richtung der chromatischen Tiefenaufspaltung der Foki oder der Fokuslinien zur Beleuchtung und im Detektionsstrahlengang der Betrag und die Richtung der chromatischen Tiefenaufspaltung der rückabgebildeten Mikroblenden (25, BB) oder der mehrfach abgebildeten Makroblende zumindest näherungsweise gleichgemacht sind, so dass im Objektraum die Bilder (A') der Mittelpunkte (A) der Blenden (4, AB) des Beleuchtungsstrahlenganges oder die Bilder (A') der Foki (A) und die Bilder (B') der Mittelpunkte (B) der Blenden (25, BB) des Detektionsstrahlenganges, welche lateral und spektral korrespondieren, nämlich A'o_λmin-B'o_λmin und A'o_λmax-B'o_λmax optisch konjugiert sind.
3. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren der Dunkelfeldmikroskopie zur Anwendung kommt.
4. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren der Phasenmikroskopie auf der Basis der Interferenz von elektromagnetischen Wellen zur Anwendung kommt.
5. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, dass das Phasenkontrast- Verfahren, insbesondere auch das nach F. Zernike, das differentielle Phasenkontrast- Verfahren, insbesondere auch das nach G. Nomarski, auch als DIC- Verfahren (DIC: Differential interference contrast) bezeichnet, das Hoffmann-HMC- Verfahren (HMC: Hoffmann modulation contrast) oder auch ein phasenmikroskopisches Verfahren nach dem Zweistrahl-Interferenz- Verfahren, insbesondere auch auf der Basis eines Mach-Zehnder-Interferometers, zur Anwendung kommen
6. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 4 und 5, gekennzeichnet dadurch, dass ein optischer Gangunterschied im Strahlengang eines Phasen-Mikroskops eingeführt wird, der mindestens eine Wellenlänge der maximalen, detektierten Wellenlänge beträgt, so dass Interferenzstreifen, insbesondere auch in Form eines Wavelets, also Intensitätsverläufe über der Wellenlänge λ oder der Wellenzahl k, im detektierten Spektralbereich vorbestimmt gebildet werden, wobei ein dünnes und lateral kleines Phasenobjekt (11) eine lokale Phasenänderung in den Interferenzstreifen, insbesondere auch in Form eines Wavelets, erzeugt.
7. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass die Phase der Interferenz ausgewertet wird.
8. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, gekennzeichnet dadurch, dass der optische Gangunterschied im Unendlich-Strahlengang oder im chromatisch schwach fokussierten Strahlengang der mikroskopischen Abbildung eingebracht wird.
9. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch mit Kondensor (10) und Objektiv (12) und insbesondere auch zur quantitativen Prüfung von einem Mikroobjekt im Objektraum,
- mit einer polychromatischen Lichtquelle (Ia) im Beleuchtungsstrahlengang und mit einem Spektrometer (26, 27, 28) im Detektionsstrahlengang
- oder einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle (Ib) im Beleuchtungsstrahlengang, mit Mitteln zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang, wie mehrere
Mikroblenden (25, B) oder eine mittels mehrerer Mikrolinsen mehrfach abgebildete
Makroblende, sowie einer Kamera (29) im Detektionsstrahlengang, gekennzeichnet dadurch, dass Mittel (14) mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung im Detektionsstrahlengang angeordnet sind.
10. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, dass die Mittel (14) mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung in der Fourier-Ebene (F' 12), also der rückwärtigen Brennebene des Objektivs (12), oder in einer zu dieser optisch konjugierten Ebene (F" 12) angeordnet sind.
11. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, dass Mittel (7) mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet sind.
12. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, dass Mittel (7) mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung in der Fourier-Ebene, also der rückwärtigen Brennebene (FlO), des Kondensors (10), oder in einer zu dieser optisch konjugierten Ebene (PE' 10) angeordnet sind.
13. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 12, gekennzeichnet dadurch, dass bei der Anwendung eines Nomarski-DIC-Mikroskops mit zwei Wollastonprismen (34) (36) ein optischer, doppelbrechender Verzögerer einen optischen Gangunterschied zwischen den beiden Polarisationsrichtungen von mindestens einer Wellenlänge der maximalen, detektierten Wellenlänge erzeugt, wobei der Verzögerer im Raum zwischen den beiden Wollastonprismen (34) (36) des Nomarski- DIC-Mikroskops angeordnet ist.
14. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, dass der optische, doppelbrechende Verzögerer in Form einer Kalkspatplatte (35) (calcite plate) ausgebildet ist.
15. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 14, gekennzeichnet dadurch, dass die Mittel mit chromatischer Brechkraft als diffraktiv- optische Elemente (7), (14) ausgebildet sind.
16. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 15, gekennzeichnet dadurch, dass die Mittel (25) zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang lateral verschiebbar angeordnet sind.
17. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 15, gekennzeichnet dadurch, dass die Mittel (4) zur Strukturierung des Lichts im Beleuchtungsstrahlengang lateral verschiebbar angeordnet sind und synchron mit den Mitteln (25) zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang verschoben werden, so dass die laterale Zuordnung der Bilder (A', B') derselben im Objektraum bei der Verschiebung und bei der Bildaufnahme mittels Kamera (29) stets erhalten bleibt.
18. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 17, gekennzeichnet dadurch, dass eine optische Kopplung der Anordnung zur Durchlicht- Mikroskopie mit einer optischen, rechnergesteuerten Pinzette durchgeführt wird.
PCT/EP2007/003644 2006-05-16 2007-04-25 Anordnung und verfahren zur konfokalen durchlicht-mikroskopie, insbesondere auch zur vermessung von bewegten phasenobjekten Ceased WO2007131602A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102006023887.7 2006-05-16
DE200610023887 DE102006023887B3 (de) 2006-05-16 2006-05-16 Anordnung und Verfahren zur konfokalen Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch zur Vermessung von bewegten Phasenobjekten

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007131602A1 true WO2007131602A1 (de) 2007-11-22

Family

ID=38181047

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2007/003644 Ceased WO2007131602A1 (de) 2006-05-16 2007-04-25 Anordnung und verfahren zur konfokalen durchlicht-mikroskopie, insbesondere auch zur vermessung von bewegten phasenobjekten

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102006023887B3 (de)
WO (1) WO2007131602A1 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7508721B2 (en) 2005-04-01 2009-03-24 Sandisk Corporation Use of data latches in multi-phase programming of non-volatile memories
GB2495537B (en) * 2011-10-14 2017-02-15 Solentim Ltd Method of and apparatus for analysis of a sample of biological tissue cells
GB2589327B (en) * 2019-11-26 2023-09-13 Andor Tech Limited Differential phase contrast microscope

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008011283B4 (de) * 2008-02-27 2012-03-29 Hochschule Reutlingen Markerfreies Chromosomenscreening

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19632594A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Johannes Prof Dr Schwider Konfokales Mikroskop unter Anwendung von refraktiven Mikrolinsen-Feldern
EP1359452A1 (de) * 2002-05-03 2003-11-05 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Konfokales Mikroskop mit zwei Mikrolinsenarrays und einem Lochblendenarray
US20060012872A1 (en) * 2002-09-30 2006-01-19 Terutake Hayashi Confocal microscope, fluorescence measuring method and polarized light measuring method using cofocal microscope

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3013467A (en) * 1957-11-07 1961-12-19 Minsky Marvin Microscopy apparatus
FR2626383B1 (fr) * 1988-01-27 1991-10-25 Commissariat Energie Atomique Procede de microscopie optique confocale a balayage et en profondeur de champ etendue et dispositifs pour la mise en oeuvre du procede
US5760901A (en) * 1997-01-28 1998-06-02 Zetetic Institute Method and apparatus for confocal interference microscopy with background amplitude reduction and compensation
DE19713362A1 (de) * 1997-03-29 1998-10-01 Zeiss Carl Jena Gmbh Konfokale mikroskopische Anordnung
DE10242374A1 (de) * 2002-09-12 2004-04-01 Siemens Ag Konfokaler Abstandssensor
DE10321895B4 (de) * 2003-05-07 2010-09-16 Universität Stuttgart Sensor zur Erfassung der Topografie mit einem Zweistrahl-Interferometer
WO2006042696A1 (de) * 2004-10-20 2006-04-27 Universität Stuttgart Interferometrisches verfahren und anordnung

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19632594A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Johannes Prof Dr Schwider Konfokales Mikroskop unter Anwendung von refraktiven Mikrolinsen-Feldern
EP1359452A1 (de) * 2002-05-03 2003-11-05 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Konfokales Mikroskop mit zwei Mikrolinsenarrays und einem Lochblendenarray
US20060012872A1 (en) * 2002-09-30 2006-01-19 Terutake Hayashi Confocal microscope, fluorescence measuring method and polarized light measuring method using cofocal microscope

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHA S ET AL: "NONTRANSLATIONAL THREE-DIMENSIONAL PROFILOMETRY BY CHROMATIC CONFOCAL MICROSCOPY WITH DYNAMICALLY CONFIGURABLE MICROMIRROR SCANNING", APPLIED OPTICS, OSA, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, WASHINGTON, DC, US, vol. 39, no. 16, 1 June 2000 (2000-06-01), pages 2605 - 2613, XP000951755, ISSN: 0003-6935 *
PAPASTATHOPOULOS E ET AL: "CHROMATICALLY DISPERSED INTERFEROMETRY WITH WAVELET ANALYSIS", OPTICS LETTERS, OSA, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, WASHINGTON, DC, US, vol. 31, no. 5, 1 March 2006 (2006-03-01), pages 589 - 591, XP001238939, ISSN: 0146-9592 *
TIZIANI H J ET AL: "THREE-DIMENSIONAL IMAGE SENSING BY CHROMATIC CONFOCAL MICROSCOPY", APPLIED OPTICS, OSA, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, WASHINGTON, DC, US, vol. 33, no. 10, 1 April 1994 (1994-04-01), pages 1838 - 1843, XP000434202, ISSN: 0003-6935 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7508721B2 (en) 2005-04-01 2009-03-24 Sandisk Corporation Use of data latches in multi-phase programming of non-volatile memories
GB2495537B (en) * 2011-10-14 2017-02-15 Solentim Ltd Method of and apparatus for analysis of a sample of biological tissue cells
US9600710B2 (en) 2011-10-14 2017-03-21 Solentim Limited Method of and apparatus for analysis of a sample of biological tissue cells
US10026024B2 (en) 2011-10-14 2018-07-17 Solentim Limited Method of and apparatus for analysis of a sample of biological tissue cells
US10025086B2 (en) 2011-10-14 2018-07-17 Solentim Limited Method of and apparatus for analysis of a sample of biological tissue cells
GB2589327B (en) * 2019-11-26 2023-09-13 Andor Tech Limited Differential phase contrast microscope

Also Published As

Publication number Publication date
DE102006023887B3 (de) 2007-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1248132B1 (de) Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe
DE602004005338T2 (de) Digitales holographisches mikroskop für dreidimensionale abbildung und verfahren zu dessen verwendung
DE102013015931B4 (de) Mikroskop und Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskope
EP1805477B1 (de) Interferometrisches verfahren und anordnung
EP2592462B1 (de) Verfahren und Anordnung zur Autofokussierung eines Mikroskops
WO2013171309A1 (de) Lichtmikroskop und verfahren zur bildaufnahme mit einem lichtmikroskop
DE112015002339T5 (de) Mikroskopvorrichtung und Bildaufnahmeverfahren
DE102006050834A1 (de) Grabenmesssystem mit einem chromatischen konfokalen Höhensensor und einem Mikroskop
DE10150934A1 (de) Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten Erfassung von Proben
EP3948392B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum erfassen von verlagerungen einer probe gegenüber einem objektiv
WO2016193037A1 (de) Verfahren zum ermitteln einer ortsaufgelösten höheninformation einer probe mit einem weitfeldmikroskop und weitfeldmikroskop
DE102013016367A1 (de) Lichtmikroskop und Verfahren zum Untersuchen einer Probe mit einem Lichtmikroskop
EP3867630B1 (de) Verfahren und mikroskop zur bestimmung des brechungsindex eines optischen mediums
EP1882970A1 (de) Laser-Scanning-Mikroskop zur Fluoreszenzuntersuchung
DE10155002A1 (de) Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe
EP2745158B1 (de) Messverfahren für höhenprofile von oberflächen
DE102012016318B4 (de) Anordnung für ein linsenloses, holografisches Inline-Auflichtmikroskop
DE102008049159A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur optischen Messung langer Krümmungsradien optischer Funktionsflächen
DE10118463A1 (de) Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe
DE102005006724A1 (de) Verfahren und Anordung zur konfokalen Spektral-Interferometrie, insbesondere auch zur optischen Kohärenz-Tomografie (OCT)und/oder optischen Kohärenz-Mikroskopie (OCM)von biologischen und technischen Objekten
DE10321885B4 (de) Anordnung und Verfahren zur hochdynamischen, konfokalen Technik
WO2007131602A1 (de) Anordnung und verfahren zur konfokalen durchlicht-mikroskopie, insbesondere auch zur vermessung von bewegten phasenobjekten
DE102010016462B4 (de) Schichtmessverfahren und Messvorrichtung
DE102005042733B3 (de) Verfahren und Anordnung zur Spektral-Interferometrie mit chromatischer Tiefenaufspaltung, insbesondere auch Mirau-Interferometer
WO2008019729A1 (de) Mikroskop mit interferometeranordnung zur durchlichtuntersuchung transparenter objekte mittels interferenzkontrast und polarisationskontrast

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07724574

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07724574

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1