WO2007132949A1 - タンパク質の高分泌生産方法 - Google Patents

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WO2007132949A1
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protein
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acid sequence
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Yasunori Chiba
Yoshifumi Jigami
Kosuke Kuroda
Kazuo Kobayashi
Kimihisa Ichikawa
Koichi Nonaka
Takeshi Suzuki
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Daiichi Sankyo Co Ltd
Kirin Pharma KK
Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Daiichi Sankyo Co Ltd
Kirin Pharma KK
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing highly secreted protein mainly in yeast.
  • E. coli can produce the target protein at low cost, but it cannot produce modifications such as glycosylation, and it is produced as an inactivated protein in the inclusion body. Therefore, a solubilization process is required and it is not suitable for the production of complex proteins.
  • Animal cells can produce the target protein as an activated protein, but they require time for cell breeding and culture, and are inevitably produced at a very high cost, including equipment and material costs.
  • antibodies have long been used as pharmaceuticals, but since they originated from sources other than humans, antibodies against the administered antibodies themselves were produced and could not be administered multiple times. Has been limited.
  • human-type antibodies in which amino acid sequences other than the antigen-binding site are replaced with human antibody-derived sequences have been produced, and human antibody-producing mice in which human antibody genes have been introduced into mice have been created.
  • these antibodies are produced by cultured cells such as hybridoma and CH0 cells into which a gene encoding the antibody is introduced, but there are many problems in terms of cost, productivity, and safety.
  • ScFv production can be achieved by co-expressing part of a molecular chaperone group that helps to form a three-dimensional protein structure on the endoplasmic reticulum such as BiP (KAR2) / PDI.
  • a molecular chaperone group that helps to form a three-dimensional protein structure on the endoplasmic reticulum such as BiP (KAR2) / PDI.
  • causes of endoplasmic reticulum stress include impaired modification (addition of sugar chains and disulfide bonds) occurring in the endoplasmic reticulum, and decreased transport from the endoplasmic reticulum.
  • Mammalian cells are the means to combat this endoplasmic reticulum stress
  • URR Unfold Protein Response
  • the genes that regulate this UPR are IREl a -XBPl, PERK-elF-2 ⁇ ,
  • ATF6 system is known.
  • yeast only the Irelp-Haclp system is known to exist, and Irelp-Haclp is involved in UPR by the following mechanism (see Fig. 1).
  • Irelp is usually bound to BiP (antibody heavy chain binding protein), but —If a 'fold protein (UFP) is generated, BiP binds to this UFP.
  • UFP body heavy chain binding protein
  • Irelp dissociated from BiP is activated by autophosphorylation and dimerization, and exhibits endonuclease activity.
  • the HAC1 gene is usually in an inactivated state, but Irelp having endonuclease activity splices mRNA transcribed from the HAC1 gene to generate active Haclp (Cell. 87: 405-413). (1996), Cell. 90: 1031-1039 (1997), The EMBO Jounrnal. 18: 3119-3132 (1999)) 0
  • This active Haclp translocates to the nucleus and acts as a transcription factor. Promotes expression of genes encoding various proteins related to reactions, related glycosylation, protein folding, ER-associated degradation (ERAD), protein sorting, lipid metabolism, etc. (Cell. 101: 249) -258 (2000)).
  • the gene encoding the activated Haclp of the filamentous fungus Trichoderma reesei was introduced into S. cerevisiae, ⁇ -amylase, which is a heterologous protein, and endogenous There is an example in which secretion of invertase, a protein, is improved (Appl. Environ. Microbiol. 69: 065-2072 (2003)).
  • ⁇ -amylase zymbertase which is a single protein, is originally known as a protein that is easily secreted, and its production amount is only improved by about 2 times.
  • BPTI Bovine pancreatic trypsin inhibitor
  • the RRBP1 gene was originally isolated from Inu as a gene encoding a protein that binds to the ribosome (Nature. 346: 540-544 (1990)).
  • 0 RRBP1 has a molecular weight of 180 kDa and a 10-amino acid residue at the N-terminus. Has a unique structure that repeats 54 times, and this region binds to the ribosome.
  • RRBP1 is known to be involved in membrane structure increase and mRNA stabilization (The Journal of Cell Biology. 130: 29-39 (1995), The Journal of Cell
  • BPTI BPTI
  • molecular weight 6500. It is a very small peptide, and is generally not applicable to other high molecular weight proteins, and also to aggregate proteins of different proteins such as light chains and heavy chains such as antibodies.
  • PMT Protein O-raannosyltransferase gene
  • This PMT gene product is localized in the ER membrane, and has an activity to add mannose to the hydroxylated residues of the secreted proteins serine (Ser) and threonine (Thr) (hereinafter referred to as PMT activity).
  • PMT activity Some of the proteins glycosylated with PMT are the main components of the cell wall of yeast as mannoproteins. When PMT activity is extremely reduced, the cell wall is weakened and affects the growth of the cell itself. Is known to give.
  • PMT remains, and Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) has been confirmed to have seven genes PMTl, 2, 3, 4, 5, 6, 7 (Biochim. Biophys. Acta., 1426: 297-307 (1999)).
  • PMT genes are classified into three types: PMTl family, PMT2 family, and PMT4 family.
  • PMTlp and PMT2p form heterodimers, and PMT4p forms homodimers and expresses activity.
  • PMT5p complements PMTlp and PMT3p complements PMT2p due to homology of amino acid sequences.
  • PMT6p is highly homologous to PMT2p and PMT3p, but it is not known what type of complex expresses the activity.
  • each PMT protein is known to have selectivity for the substrate protein.
  • Candida albicans has 5 genes (Mol. Microbiol., 55: 546-560 (2005)) that are highly homologous to PMTl, 2, 4, 5, 6 genes of S. cerevisiae. )
  • S. cerevisiae PMT4 gene is highly homologous (Eukaryot. Cell, 6: 222-234 (2007))
  • Schizosaccharomyces pombe of fission yeast the PMT1, 2, 4 gene 3 genes (omal, 2, 4) have been found (Mol. Microbiol., 57: 156-170 (2005)).
  • 0 gataea minuta (0. minuta)
  • the presence of 5 genes having high homology with S. cerevisiae PMTl, 2, 4, 5, 6 genes was confirmed.
  • the PMT gene has also been found in mold. Aspergillus lus nidulans has high homology with PmtA gene and 2 other genes, and Trichoderma reesei has high homology with S. cerevisiae PMT2 gene
  • PMT activity acts on the hydrophobic region of the peptide, increasing the hydrophilicity of the peptide and increasing the peptide in the ER lumen. It is said to have an effect of suppressing the aggregation of peptide.
  • PMT activity sometimes adds unnecessary type 0 sugar chains, which can cause protein complex formation failure and decreased activity.
  • multimeric proteins such as antibodies, there is a possibility of inhibiting the formation of aggregates (in the case of antibodies, the formation of aggregates of light and heavy chains).
  • Patent No. 3 6 3 0 4 2 4 and Tokuhei Hei 8 _ 5 0 9 8 6 7 propose a method for producing a recombinant protein by inhibiting 0-type glycosylation by PMT gene modification. There is no description of light chain / heavy chain association formation.
  • the HAC1 gene induces UPR, but it is known that the PMT gene that adds a type 0 sugar chain peculiar to yeast is also present in the gene group induced by UPR (Cell. 101: 249). -258 (2000)). Therefore, it is considered that high-quality, high-quality multimeric proteins such as antibodies cannot be produced simply by introducing the HAC1 gene.
  • an object of the present invention is to provide a means for producing a high secretion of a protein, particularly a protein having a complex structure such as an antibody, in a host cell such as yeast. Disclosure of the invention
  • HAC1 a gene involved in high-secretory production of proteins in the methanol-utilizing yeast Ogataea minuta, during endoplasmic reticulum stress.
  • Irelp By co-expressing Irelp, the mRNA is spliced and induced by the transcription factor Hacl protein) gene and RRBP1 (ribosome-binding protein 1, ribosome receptor, pl80 protein) gene. It was found that it can be improved nearly 10 times.
  • HAC1 0-mannosyltransferase
  • the present invention has been completed based on such findings (see FIG. 2).
  • the present invention includes the following inventions.
  • a transformed host cell having active HAC1 gene and RRBP1 gene having active HAC1 gene and RRBP1 gene.
  • Active HAC1 gene selected from (a) to (d) below:
  • HAC1 gene selected from the following (i) to (1):
  • RRBP1 gene selected from (e) to (h) below: (e) Gene encoding RRBP 1 derived from human or nu
  • a protein that hybridizes under stringent conditions with a gene comprising the nucleotide sequence of the RRBP 1 gene derived from human or nu or derived from the nucleotide sequence complementary thereto and having a liposome-binding activity is coded.
  • a method for producing a protein comprising culturing the transformed host cell according to any one of [9] to [12] in a medium, and collecting a target protein from the culture.
  • the expression vector according to [20] which is a gene encoding an active HAC1 protein of Naka, Saccharomyces cerevisiae, Trichoderraa reesei ⁇ or f Aspergillus nidulans, or a homologous gene thereof.
  • a method for producing a transformed host cell comprising the following steps.
  • HAC1 protein amino acid sequence consisting of an amino acid sequence with one or several amino acids deleted, substituted, and Z or added, and A gene encoding a protein having a function of activating UPR
  • transformant cells into which the active HAC1 gene and / or RRBP1 gene and a gene encoding an exogenous protein have been introduced are cultured in a medium, and the target is obtained from the culture.
  • a method for producing a protein comprising collecting the protein.
  • [4 2] The method for producing a protein according to [41], wherein the inhibition of type 0 sugar chain synthesis is carried out by disrupting the PMT gene.
  • [4 3] The method for producing a protein according to [4 1], wherein the inhibition of type 0 sugar chain synthesis is performed by adding a PMT activity inhibitor to the medium.
  • PMT activity inhibitor is 5-[[3,4--phenylraethoxy) phenyl] methylene] -4-oxo-2-thioxo-3-thiazolidmeacetic acid or ⁇ (5Z) -4_oxo-5- [3_ (1 phenyiethoxy) -4- (2-phenylethoxy) benzy ⁇ idene] — 2_thioxo-l, 3-thiazolidin-3-yl ⁇ acetic acid, [4 3] or [4 4] .
  • FIG. 1 is a diagram showing the method for obtaining the 0. minuta active HAC1 gene and the structure thereof.
  • FIG. 2 shows an overview of the technical content of this book.
  • Figure 3 shows the structure of 0. minuta active HAC1 gene expression vector (pOMexPGHy / Hacl), human RRBP1 gene expression vector (pOMexGPlA / pl80), and human antibody gene expression vector (pOMexGAT-G / Ab).
  • FIG. 1 shows the structure of 0. minuta active HAC1 gene expression vector (pOMexPGHy / Hacl), human RRBP1 gene expression vector (pOMexGPlA / pl80), and human antibody gene expression vector (pOMexGAT-G / Ab).
  • FIG. 4 shows the results of Western analysis of antibodies secreted into the culture supernatant of an antibody-producing yeast strain into which 0. minuta active HAC1 gene and human RRBP1 gene were introduced.
  • FIG. 5 is a graph showing the measurement results of antibody secretion of antibody-producing yeast strains into which 0. minuta active HAC1 gene and human RRBP1 gene were introduced.
  • Fig. 6 shows the Westin solution of the antibody secreted in the culture supernatant of an antibody-producing yeast strain into which 0. minuta active HAC1 gene and human RRBP1 gene were introduced. It is the figure which showed the analysis result.
  • HAC1 expression vector (YE P 351GAP - II-aHACl ), human RRBPl gene expression vector (YEp351GAP- II - pl80), the human antibody gene expression vectors (YEp352 GAP -
  • FIG. 8A shows the introduction of S. cerevisiae active HAC1 gene and human RRBP1 gene expression vector.
  • 2 is a graph comparing the antibody secretory production ability of the antibody-producing yeast strains.
  • Fig. 8B is a graph comparing the antibody secretory production ability of antibody-producing yeast strains into which S. cerevisiae active HAC1 gene and human RRBP1 gene expression vectors were introduced under the condition that type 0 sugar chain formation was suppressed. .
  • Fig. 8C compares the antibody secretion production capacity (absolute value) of antibody-producing yeast strains into which S. cerevisiae active HAC1 gene and human RRBP1 gene expression vector were introduced, with and without PMT inhibitor. It is a graph.
  • FIG. 9 shows the results of Western analysis of antibody production in an antibody production strain into which a synthetic antibody gene having a codon changed was introduced.
  • FIG. 10 shows the results of Western analysis of the culture supernatant of each yeast-derived activated HAC1 gene-introduced antibody-producing strain.
  • FIG. 11 shows the amount of secretory antibody produced by each yeast-derived activated HAC1 gene-introduced antibody-producing strain.
  • Fig. 12 shows the results of Western analysis of the culture supernatants of the PMT1 gene or PMT2 gene fragmented antibody producing strain and the activated HAC1 gene-introduced antibody producing strain.
  • FIG. 13 is a diagram showing the production amounts of secreted antibodies of the PMT1 gene or PMT2 gene-spun antibody producing strain and the activated HAC1 gene-introduced antibody producing strain.
  • Fig. 14 shows the results of Western analysis of culture supernatants of the PMT4 gene-spun antibody producing strain and the activated HAC1 gene-introduced antibody producing strain.
  • FIG. 15 is a graph showing the production of secretory antibodies in the PMT4 gene-spanning antibody producing strain and the activated HAC1 gene-introducing antibody producing strain.
  • FIG. 16A shows the results of Western analysis of the culture supernatant of the PMT5 gene or PMT6 gene disruption antibody producing strain.
  • Fig. 16B shows the amount of secretory antibody produced by the PMT5 gene or PMT6 gene disruption antibody-producing strain.
  • Fig. 17 shows the results of Western analysis of the culture supernatant of an antibody-producing strain that has been disrupted by the PMT2 gene or PMT4 gene and introduced with an activated HAC1 gene and added with a PMT inhibitor (lc). It is.
  • Figure 18 A shows an antibody-producing strain into which PMT2 gene has been disrupted and activated HAC1 gene has been introduced.
  • FIG. 8B shows the amount of secretory antibody produced in the culture supernatant of the PMT4 gene disrupted and activated HAC1 gene introduced and cultured with PMT inhibitor (1c) added .
  • FIG. 19 shows the results of Western analysis of culture supernatants cultured with various PMT inhibitors (rhodanine-3_acetic acid derivatives) added.
  • FIG. 20 shows the amount of secretory antibody produced by the culture supernatant cultured with various PMT inhibitors (mouth danin-3-acetic acid derivatives) added.
  • PMT inhibitors mouth danin-3-acetic acid derivatives
  • a gene used for high protein secretion production an expression vector containing the gene, a transformed host cell into which the expression vector has been introduced, and a method for producing a protein using the transformed host cell.
  • HAC1 gene one of the genes used for high protein production is the HAC1 gene.
  • the HAC1 gene exists as an inactive HAC1 gene on the genome, but the mRNA transcribed by the HAC1 gene during ER stress is spliced by Irelp and encodes the transcription factor HAC1 protein (Haclp).
  • Haclp which is converted to mRNA and translated, activates Unfolded Protein Response (UPR).
  • an active HAC1 gene is defined as a cDNA (complementary to mRNA) that encodes a HAC1 protein (Haclp).
  • an active HAC1 gene it is preferable to use an active HAC1 gene, but a certain degree of effect can also be obtained by introducing an inactive HAC1 gene.
  • HAC1 p The active HAC1 gene encoding Haclp that actually functions UPR is described below.
  • HAC1 p is composed of an unknown active region newly added from the N-terminus, a highly conserved DNA binding domain, leucine zipper region, and IRNAp on the C-terminal side.
  • the active HAC1 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding an active HAC1 protein.
  • SEQ ID NO: derived from Ogataea minuta (0. minuta) newly obtained in the present invention SEQ ID NO: derived from Ogataea minuta (0. minuta) newly obtained in the present invention.
  • the homologous DNA includes a protein having an amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 or 70 and having a function of activating Unfolded Protein Response (UPR).
  • UPR Unfolded Protein Response
  • a gene encoding a protein having a function a protein having a function of hybridizing with a DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 69 or a complementary nucleotide sequence thereof under stringent conditions and activating UPR The gene encoding is included.
  • amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 or 70 is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more. It is an amino acid sequence having the homology of A protein homology search can be performed using programs such as F A S T A and B L A S T for the DNA Databank of JAPAN (DDBJ), for example.
  • the number of “several” in the above-mentioned “one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 or 70” is not particularly limited, but the number is not particularly limited. It means 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and still more preferably 5 or less.
  • stringent condition refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • DNA having high homology that is, at least 80% or more, preferably the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 69,
  • a DNA sequence comprising a base sequence having a homology of Examples include conditions in which a complementary strand of DNA that is hybridized and less homologous does not hyper-hydidize. More specifically, it means a condition in which the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and the temperature is 60 to 68 ° C, preferably 65 ° C.
  • the above mutation can be introduced by a technique known in the art such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a similar method, for example, site-specific sudden Mutation-introducing kits using the mutagenesis method (for example, Mutant-K (Takara Paio) or Mutant-G (Takara Bio)), Takara Bio's LA PCR in vitro Mutagenesis series kit, etc. can be used.
  • a technique known in the art such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a similar method, for example, site-specific sudden Mutation-introducing kits using the mutagenesis method (for example, Mutant-K (Takara Paio) or Mutant-G (Takara Bio)), Takara Bio's LA PCR in vitro Mutagenesis series kit, etc.
  • the mutagenesis method for example, Mutant-K (Takara Paio) or Mutant-G (Takara Bio)
  • function to activate UPR refers to the endoplasmic reticulum (ER series of defense responses against unfolded protein accumulation (for example, transcriptional repression, folding promotion by induction of molecular chaperone, degradation of denatured protein, apoptosis) Cell death, etc.)
  • “Having a function of activating UPR” means that the function is substantially equivalent to the function of the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 or 70. Say.
  • the active HAC1 gene may be a methanol-utilizing yeast other than 0. minuta and P. pastoris. For example, it encodes active HAC1 protein derived from Hansenulla polymorpha (Pichia angusta), Pichia methanolica, and Candida boidinii. Gene. Further, it may be an active HAC1 gene derived from other species such as other yeasts and molds. For example, a gene encoding an active HAC1 protein from Saccharomyces cerevisiae (S.
  • S. cerevisiae The base sequences of the genes encoding active HAC1 protein derived from S. cerevisiae, Tricho erraa reesei, and Aspergillus nidulans from the above d are shown in SEQ ID NOs: 39, 41, and 43, and the corresponding amino acid sequences are also shown. They are shown in SEQ ID NOs: 40, 42, and 44, respectively.
  • the isolated active HAC1 gene derived from Ogataea minuta and Pichia pastoris was isolated for the first time in yeasts other than Saccharomyces cerevisiae. This strongly suggests the presence of the same gene in all yeasts, for example, methanol-utilizing yeasts in general. Therefore, these genes are also included in the active HAC1 gene used in the present invention.
  • any transcription factor that activates UPR can be used in place of the above-mentioned activated HAC1 gene.
  • XBP-1 gene which is a HAC1 homolog derived from animal cells or other species, can be used. Examples include a gene in which a child (a gene derived from human is described in GENBANK registration number: _005080) is spliced and activated by Irelp.
  • XBP-1 a gene derived from human is described in GENBANK registration number: _005080
  • the artificial activation of Irel accompanied by the activation of HAC1 (XBP-1) also corresponds to the activation of the UPR, it is considered to be equivalent to the introduction of the activated HAC1 gene.
  • forcibly expressing the HAC1 gene itself that is not activated may have the same effect as the introduction of active HAC1 as described above.
  • the active HAC1 gene can be obtained by any method as long as UPR is induced.
  • mRNA is obtained from cells that are highly expressed in genes encoding proteins that are difficult to fold, sugar chain modification inhibitors such as tunicamycin, cells treated with redox agents such as DTT and hydrogen peroxide, and UPR inducers. This can be obtained by synthesizing cDNA. Moreover, it can also be obtained by synthesizing a part or the full length of the sequence already disclosed using a DNA synthesizer.
  • RRBP1 gene another gene used for high protein secretion production includes RRBP1 gene.
  • the RRBP1 gene encodes a protein called ribosome-binding protein 1 and is also called the hES, ES130, ES / 130, or DKFZp586A1420 gene.
  • the mammalian RRBP1 gene consists of an N-terminal transmembrane region, followed by a region rich in basic amino acids, 54 rebeat regions composed of 10 amino acid residues, and a C-terminal region.
  • the RRBP1 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding ribosome binding protein 1.
  • RRBP1 gene derived from human encoding KIAA1398 protein, GENBANK registration number: AB037 8 19
  • the RRBP1 gene derived from Inu gene derived from Inu (genobank registration number: X87224 encoding the ribosome receptor pl80).
  • the homologous gene may be sufficient.
  • the nucleotide sequences of human-derived RRBP1 gene and Inu-derived RRBP1 gene are respectively shown in SEQ ID NOs: 4 5 and 4 7, and the corresponding amino acid sequences.
  • the columns are shown in SEQ ID NOs: 4 6 and 4 8 respectively.
  • homologous gene for example, a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having at least 70% homology with human-derived or Inu-derived RRBP 1 amino acid sequence and having a ribosome binding activity
  • a protein comprising a ribosome binding activity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and Z or added in the amino acid sequence of RRBP 1 derived from human or inu
  • Gene Gene Gene is included. The degree of homology, stringent conditions, and the method for mutagenesis are the same as described above.
  • homologous gene examples include, for example, mouse (Accession No. XM-I 622097, XM_91338, XM_991888), rat (Accession No. XM—230637), african megael (Xenopus) (Accession No. NM—001005671), An example is the RRBP 1 gene derived from zebra fish (Danio) (Accession No. NM_199431).
  • the RRBP 1 gene can also be obtained by a known general method. For example, it can be obtained by preparing mRNA from cells expressing the RRBP 1 gene and then synthesizing cDNA.
  • target genes are prepared by preparing mRNA and reversing It can be obtained by a general method of synthesizing cDNA with a transcriptase.
  • a cDNA library derived from a cell or tissue expressing the target gene is isolated by screening using a DNA probe synthesized based on the gene fragment. can do.
  • Preparation of m RNA can be carried out by methods used Oite normally art.
  • RNA oligo (dT) cellulose strength ramya Sepharose 2B is used as a carrier with poly U-Sepharose or the like
  • Poly (A) + RNA (mRNA) is obtained by the fifty column method or by the batch method.
  • poly (A +) RNA may be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
  • single-stranded cDNA is synthesized using an oligo dT primer and reverse transcriptase, and then synthesized from the single-stranded cDNA using DNA synthase I, DNA ligase, RnaseH, or the like. Synthesize double-stranded cDNA.
  • Composition After smoothing the double-stranded cDNA with T4DNA synthase, ligation of adapter (for example, EcoRI adapter), phosphorylation, etc.; L gtll etc .; Create a library.
  • a cDNA library can be prepared using a plasmid vector. Thereafter, a strain (positive clone) having the desired DNA may be selected from the cDNA library.
  • genomic DNA is extracted from the cell line of the source organism, and the target gene is selected. Extraction of genomic DNA is performed, for example, according to the method of Cryer et al. (Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975)) and the method of P. Philippsen et al. (Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991)) be able to.
  • the collection source is yeast
  • prepare protoplasts of yeast and use the commonly known DNA extraction method, alcohol precipitation method after removal of cell residues under high salt concentration, phenol or chloroform.
  • a conventional method such as an alcohol precipitation method after extraction may be used.
  • the target gene can also be obtained, for example, by PCR (PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)).
  • PCR PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)
  • genomic DNA is used as a cage.
  • a gene library is prepared by a conventional method
  • a desired clone is selected from the prepared gene library, and the clone is amplified.
  • a chromosomal DNA obtained from an organism cell line as a collection source is fragmented by partial digestion with an appropriate restriction enzyme, and the resulting fragment is ligated to an appropriate vector. It can be prepared by introducing the vector into a suitable host. It can also be prepared by extracting mRNA from cells, synthesizing cDNA therefrom, ligating it to an appropriate vector, and introducing the vector into an appropriate host.
  • a plasmid known as a vector for preparing a commonly known gene library can be used, and a phage vector or cosmid can also be widely used.
  • a host for transformation or transduction a host corresponding to the type of the vector may be used. Selection of clones that retain the target gene fragments can be done by colony hybridization using the labeled probe containing the sequence specific to the target gene from the above gene library, plaque 'hybridization method, etc. Do.
  • the target gene can be synthesized chemically. For example, two pairs of complementary oligonucleotides can be produced and annealed, several annealed DNAs can be ligated with DNA ligase, or several partially complementary oligonucleotides can be produced.
  • the gene can be synthesized by a method such as filling the gap by PCR.
  • Determination of the DNA sequence of a gene can be performed by a conventional method, for example, the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)). Furthermore, the above DNA base sequence can be easily determined by using a commercially available sequence kit or the like.
  • the vector of the present invention provides a vector containing the active HAC1 gene and the RRBP1 gene alone, or a vector containing both the active HAC1 gene and the RRBP1 gene.
  • each vector may be transformed with each gene alone, or one vector containing both genes may be used. It may be transformed.
  • the expression vector may contain a gene encoding a foreign protein.
  • an expression vector containing a gene encoding a foreign protein may be prepared separately, and if prepared separately, each vector is cotransfected (co-introduced) into the host cell.
  • the gene encoding the foreign protein is not particularly limited.
  • various enzyme genes such as ⁇ -amylase gene and ⁇ -galactosidase gene, and interferon and interferon ⁇ , which are pharmaceutically useful physiologically active proteins.
  • Various interferon genes such as IL1, IL2, various interleukin genes, erythropoietin (EP0) gene, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) gene and other site force-in genes, growth factor genes, etc.
  • E0 erythropoietin
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • the present invention is particularly effective for proteins having high hydrophobicity and proteins that are difficult to produce secretively, such as forming a complex.
  • a heteromultimer that is an antibody or a functional fragment thereof is included.
  • An expression vector may be constructed as a protein expression unit by appropriately adding an expression control region to the active HAC1 gene, RRBP1 gene, and a gene encoding a foreign protein.
  • the protein expression unit has at least a promoter region, the above gene, and a transcription terminator region in the direction of the transcription reading frame.
  • One promoter that can be used here may be an inducible expression promoter or a constitutive expression promoter. Examples of inducible expression promoters include alcohol oxidase (A0X) gene promoter, dihydroxyaceton synthase (DAS) gene promoter, formate dehydrogenase (FDH) gene promoter, etc. involved in methanol metabolism in methanol-assimilating yeast. It is done.
  • CUP copper inducible promoters and the like can also be used.
  • Constitutive expression promoters include, for example, dalyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TDH, GAP) gene, phosphoglyce mouth kinase (PGK) gene, triose phosphate isomerase (TPI) gene, enolase (EN0) gene, actin (ACT ) Promoter, cytochrome c (CYC) gene, trehalose synthase (TPS) gene, alcohol dehydrogenase (ADH) gene, and the like.
  • the transcription terminator may be a sequence having an activity that causes transcription termination with respect to transcription from the promoter, and may be of the same or different gene as the promoter gene.
  • heteromultimers are susceptible to the above-mentioned effects.Particularly, molecules such as antibodies are heavy tetramers and heterotetramers in which two light chains are associated. The degree of expression is an important factor for association. If the expression of the active HAC1 gene is too strong, Since the cells are overstressed and may inhibit growth, it is necessary to adjust and optimize the promoter activity as described above.
  • the expression vector of the present invention can include a selection marker for selecting a transformant.
  • yeast expression vectors include Hisl, His2, His3, His4, His5, His6, Leu2, Algl, Alg2, Alg3, Trpl, Lys2, Adel, Ade2, Ura3, and Ura5 genes. Marker genes can be used.
  • Selective markers include not only the above auxotrophic markers, but also cerulenin, oleobasidin, zeocin, force napanin, cycloheximide, hygromycin, blasticidin, tetracycline, kanamycin, ampicillin, tetracycline, neomycin It is also possible to select transformants by using drug resistance markers that impart resistance to such drugs. It is also possible to select transformants by using a gene that provides solvent resistance to ethanol, etc., osmotic pressure resistance to glyce mouth salt, etc., and resistance to metal ions such as copper. It is.
  • the transformed host cell of the present invention is a transformed host cell having the gene of 1. or a transformed host cell into which the expression vector is introduced.
  • the host cell to be transformed is a eukaryotic cell, preferably a yeast.
  • yeast include methanol-utilizing yeast strains such as Ogataea minuta, Pichia pastoirs, Hansenul ⁇ a polyraorpha (Pichia angusta), and Candida boidinii, and yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, and Yarowia lipolytica ⁇ Shizosaccharomyces pombe.
  • Ogataea minuta strain Ogataea minuta YK3 strain ⁇ ochl ⁇ pep4 ⁇ prbl ⁇ ypsl ⁇ ura3 ⁇ adel
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain MATa A his3 A leu2 A metl5 A ) Etc. can be used, but is not limited to these.
  • the present invention aims to obtain a host cell reinforced with ER, which is essential for secretion, it can also be applied to animal cells and other cells.
  • any method can be used for introducing an expression vector into a host cell as long as the transgene is stably present in the host and can be appropriately expressed.
  • Commonly used methods such as the calcium phosphate method (Ito et al., Agric. Biol. Chem., 48, 341 (1984)), the electrical mouth position method (Becker, DM et al. ( 1990) Methods. Enzyraol., 194, 182-187), Spheroplast method (Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)), Lithium acetate method (Itoh, H. (1983) J Bacteriol. 153, 163-168), the lipofusion method and the like.
  • the production of the protein in the present invention can be carried out by culturing the above transformed host cell by a known method, collecting it from the culture and purifying it.
  • “Culture” means not only culture supernatant but also cultured cells, cultured cells, or destructed cells or cells.
  • the method for culturing the transformed host cell in the medium can be carried out according to the usual method used for culturing the host cell.
  • the culture medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism, and the transformant can be cultured efficiently.
  • a carbon source may be used as long as the microorganism can assimilate, and carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, and other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, corn steep liquor, etc.
  • the As inorganic salts ferrous phosphate, ferric phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like are used.
  • antibiotics such as aureobasidin, ampicillin, and tetracycline can be added to the medium as appropriate, or they can be supplied with genes that complement auxotrophy (Leu, Ura, Trp, etc.) You can remove the amino acid.
  • Culture of transformed host cells for example, in the case of yeast, the medium of P H is suitably adjusted to 4-7.
  • the culture temperature is 15 to 32 ° C, preferably around 28 ° C.
  • the culture time is about 24 to 1000 hours, and the culture can be carried out by standing, shaking, stirring, batch culture under aeration or continuous culture.
  • Confirmation of the expression product of the foreign protein gene from the above culture can be performed by SDS-PAGE, Western analysis, ELISA, and the like.
  • a normal protein isolation and purification method may be used. If the target protein is produced in cells or cells after culture, collect the target protein by disrupting the cells or cells with an ultrasonic crusher, French press, Mantongaurin homogenizer, dynomill, etc. . When the target protein is produced outside the cells or cells, use the culture solution as it is, or remove the cells or cells by centrifugation or the like.
  • the target protein is collected by extraction with an organic solvent, etc., and if necessary, use various types of chromatography (hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, etc.), molecular sieve Isolation and purification may be performed using methods such as gel filtration, electrophoresis using polyacrylamide gel, etc. alone or in combination.
  • chromatography hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, etc.
  • molecular sieve Isolation and purification may be performed using methods such as gel filtration, electrophoresis using polyacrylamide gel, etc. alone or in combination.
  • the above culture method and purification method are examples, and are not limited thereto.
  • the amino acid sequence of the purified gene product can be confirmed by a known amino acid analysis, for example, an automatic amino acid sequencing method by Edman degradation method.
  • yeast when used as a host cell, it is more preferable to perform the above culture under conditions that inhibit protein 0-raannosyltransfase erase (PMT) activity.
  • PMT protein 0-raannosyltransfase erase
  • Type 0 sugar chains in mammals is performed by adding GalNAc mainly by Peptide 0-GalNAc transferase present in the Golgi apparatus. This glycosylation occurs after protein folding.
  • the formation of type 0 sugar chains in yeast and mold begins with the addition of mannose to the serine or threonine residues of proteins by Protein-0-mannosyltransferase (PMT) encoded by the PMT gene. . This addition reaction is called PMT activity.
  • PMT Protein-0-mannosyltransferase
  • This mannose addition is performed in parallel with protein folding in the endoplasmic reticulum (ER) in the cell, so it is unnecessary for sites that do not occur in mammalian protein expression.
  • Sugar chains may be added. As a result, the formation of aggregates due to unnecessary modification results in decreased activity.
  • the following two points can be considered as methods for suppressing the addition of type 0 sugar chain, which is peculiar to yeast and mold. These methods can also be combined.
  • the method for suppressing the protein O-mannosyltransferase (PMT) activity described in (1) above can be performed, for example, by adding a PMT activity inhibitor (PMT inhibitor) to the medium.
  • PMT activity inhibitors include rhodanine-3-acetic acid derivatives (Bioorganic & Medicinal Chemistry).
  • the PMT activity inhibitor (rhodanine-3_acetic acid derivative) was originally studied as an antibacterial agent, and was not studied for improving protein quality and productivity. The effect was found for the first time. PMT is important for the production of mannoprotein that constitutes the yeast cell wall, and if PMT activity is reduced too much, it affects the growth of the yeast. Therefore, when using an inducible expression system, it is more effective to add a PMT activity inhibitor at the time of expression of a foreign protein gene after cell growth, and high quality with suppressed type 0 glycosylation. Purpose Tampa It will be possible to produce the maximum quality.
  • PMT protein O-mannosyltransfase
  • PMTs acting on glycoproteins are different.
  • PMT protein has selectivity with respect to addition of type 0 sugar chain to an antibody. That is, as described in the Examples, the PMT5 or PMT6 gene disruption strain had no effect of inhibiting 0-type glycosylation.
  • PMT is an important gene for yeast growth, and if the activity is lost or extremely reduced, such as disruption of the PMT gene, the cell wall becomes weak, so the PMT gene disruption strain Be careful about using. It is not always effective to disrupt the PMT gene as shown in W02002 / 046437, and sometimes the growth of the foreign protein may be adversely affected by growth inhibition. It is required to disrupt or suppress the expression of PMT gene with optimal PMT activity that can be minimized. Examples of methods for suppressing the PMT gene include methods using antisense RNA and RNAi, methods for attenuating the promoter, and the like.
  • a DNA fragment is inserted into the PMT structural gene portion and the promoter region, and the gene is divided (hereinafter referred to as gene division.
  • a plasmid vector is called a gene disruption vector.
  • a PMT gene fragment that does not have PMT activity but is produced as a protein or a method in which a mutation is added to an amino acid residue involved in the activity to introduce PMT activity (dominant negative) can be used.
  • Plasmids, restriction enzymes, DNA modifying enzymes and the like used in the examples of the present invention are commercially available and can be used in accordance with conventional methods.
  • DNA The procedures used for cloning, sequencing, host cell transformation, culture of transformed host cells, collection of enzymes from the resulting culture, purification, etc. are well known to those skilled in the art. A certain force can be known from the literature.
  • pOMexGPlU 3 ⁇ 43 ⁇ 4 2 00 3/0914; according to 31 pOMex 3 G, and was used pOMexGPlU material.
  • p0Mex3G was cleaved with Xbal, and after blunt end treatment, a Spel linker was introduced.
  • the resulting vector was named p0Mex3GXS.
  • pOMexGPlU was cleaved with EcoT22I, treated with a blunt end, and an Apal linker was introduced.
  • the obtained vector was named pOMexGPlUTA.
  • the pOMexGPlUTA was digested with HindIII- ⁇ , GAP promoter isolated after blunt-ended, a fragment of about 2.
  • pOMexGAT-G is a Spel-BamHI site in the A0X1 expression cassette and Sall- in the GAP expression cassette.
  • a tandem vector with an Apal site is A tandem vector with an Apal site.
  • POMex4A described in W02003 / 091431 was used as a material.
  • the pOMexGPlU was treated with EcoT22I, treated with a smooth end, and a BamHI linker was introduced.
  • the resulting vector was named p (exGP2U.
  • the pOMexGP2U was treated with Sail, and after blunt end treatment, the Spel linker was introduced.
  • the resulting vector was named p0MexGP3U.
  • the p0MexGP3U was digested with Hindlll-Kpnl. An approximately 2.0 kb fragment containing the GAP expression cassette was isolated from pOMex4A treated with Hindlll-Kpnl
  • pOMexGPlA is an exogenous gene expression vector having a Spel-BamHI site in the GAP expression cassette.
  • PGK1 gene encoding phosphoglycerin kinase from Ogataea minuta IF010746 Acquisition and base sequencing were performed.
  • DNA degenerate primers having nucleotide sequences corresponding to the conserved amino acid sequences RVDFNVPLD and EGKELPGVA derived from Saccharomyces cerevisiae (GENBANK accession number; P00560) and Candida raaltosa (GENBANK accession number; P41757) were synthesized as follows.
  • PPG5 5'-GN GTN GAY TTY AAY GTN CCN TTR GA-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • PPG3 5 '-GY NAC DCC NGG YAA YTC YTT DCC YTC-3' (SEQ ID NO: 2)
  • Primer PPG5 (SEQ ID NO: 1) corresponds to the amino acid sequence RVDFNVPLD and primer PPG3
  • SEQ ID NO: 2 is the sequence of the phase chain of the base sequence corresponding to the amino acid sequence IJEGKELPGVA. 0.
  • Minuta IF010746 strain chromosomal DNA is used as a saddle, and PCR [94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute) X 25 cycles] using primers PPG5 and PPG3 It was.
  • the amplified DNA fragment of about 1.2 kb was recovered and cloned using the T0P0 TA Cloning Kit.
  • the plasmid DNA inserted has high homology with the amino acid sequence of the PGK1 gene derived from S. cerevisiae and C. maltosa.
  • a clone having a base sequence encoding an amino acid sequence was selected. 1.
  • the 2 kb inserted DNA fragment was recovered after digestion of the plasmid with EcoRI and electrophoresis on agarose.
  • Chromosomal DNA of 0. minuta IF010746 strain was cleaved with various restriction enzymes and subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. The separated DNA was transferred to Hybond N + nylon membrane (Amersham). The DNA fragment obtained in the above (1-3-1) was labeled with AlkPhos DIRECT (Amersham), and Southern hybridization was performed. Hybridization can be performed by conventional methods (Molecular cloning 2nd edn., Ed. Sambrook, J., et al., Cold Spring Harbor
  • nucleotide sequence between the BaraHI regions in the plasmid pOMPGKl was determined by the primer walking method, it had the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 has an open reading frame consisting of 1254 base pairs beginning at the 4766th position and ending at the 6016th position.
  • the homology between the amino acid Imi shown in SEQ ID NO: 4 deduced from this open reading frame and phosphoglycerin kinase from Saccharomyces cerevisiae and Candida maltosa was determined to be 74% and 81%, respectively. Met.
  • 0PGK-P-R 5
  • 0PGK-T-F 5'-GGATCCGTGGGATTTGCGTGATCTACGTAGTGGTTATTTT-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • 0PGK-T-R 5'-GGTACCGCAGTGAAAGGCGATGCCACCATGTGCAAGGAGTTC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • the amplified 1.5 kb and 1.0 kb DNA fragments were recovered and cloned using the T0P0 TA Cloning Kit.
  • the base sequence of the inserted DNA fragment was determined, and a clone having the correct base sequence was selected.
  • the inserted DNA fragments of 1.5 kb and 1.0 kb were isolated as Hindlll-BamHI fragment and BamHI-Kpnl fragment, respectively.
  • aMF secretion signal of MF alphal (GENBANK accession number; P01149) derived from S. cerevisiae, the following primer was synthesized.
  • Sp-aMFs-F 5,-ACTAGTATGAGATTTCCTTCAATTT-3, (SEQ ID NO: 9)
  • Sl-aMFs-F 5'-GTCGACATGAGATTTCCTTCAATTT-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • Xb-aMFs-R 5 '-AGCTTCAGCCTCTCTTTTATCTAGAGA-3' ( ⁇ S column number 11)
  • an anti-TRAIL receptor antibody gene (W02002 / 094880) was used.
  • the following primers were synthesized.
  • Xb-KREAEA-Hc-F 5, -TCTCTAGATAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGCTGCAGCTGCAGGAGTC-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • Hc-R-Bg 5, -CCAGATCTGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • Xb-KREAEA-Lc-F 5, -TCTCTAGATAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAAATTGTGTTGACACAGTC-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • Lc-R-Ap 5'-AAAGGGCCCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCT-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • pOMexGAT-G / Ab is an antibody expression vector carrying both antibody heavy chain and light chain expression units.
  • the active HAC1 gene was obtained by culturing cells (0. minuta YK2-3 strain) in YPD medium at 27 ° C for 12 hours, and then adding tunicamycin to the medium to induce 10 mg / ml to induce UPR. Added. Cultivation was further continued for 12 hours in the medium supplemented with mycin, and after harvesting, mRNA was prepared using Yeastar RNA kit (ZYMO research).
  • the obtained mRNA was DNase-treated with DNase I Amplification Grade (Invitrogen).
  • CDNA was synthesized from this mRNA using Superscript III First-Strand Synthesis for RT (Invitrogen).
  • This cDNA was subjected to PCR using the DNA primers HAC1-1 (SEQ ID NO: 16) and HAC1-12 (SEQ ID NO: 17) described below [94 ° C for 30 seconds, 52 ° C for 30 seconds, 72 ° C at (1 minute) X 30 cycles], cloned into PCR2.
  • 1-T0P0 Invitrogen
  • the nucleotide sequences derived from the two gene fragments amplified by PCR were confirmed (SEQ ID NOs: 18, 19).
  • HAC1-1 5, -ATGACTTCCTTTTCAGCACCGCATC-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • HAC1-12 5'-CAAAATTGCAAGCAAGTTAACCG-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • cDNA fragments obtained Of the two types of cDNA fragments obtained, one matched the genomic sequence, but the other was partially missing and shortened, and was a cDNA fragment spliced by Irelp activated by UPR. .
  • PCR [94 °] was performed using the following DNA primers speHACIF (SEQ ID NO: 20) and bglHAClR (SEQ ID NO: 21) and the cDNA pool considered to contain the activated HAC1 cDNA. 30 minutes at C, 1 minute at 55 ° C, 30 seconds at 72 ° C)).
  • speHACIF 5'-gactagtATGACTTCCTTTTCAGCACCG-3 '(SEQ ID NO: 20)
  • bglHAClR 5'-cagatctTCATGACAAGAAATCATCGAAT-3 '(SEQ ID NO: 21)
  • the obtained approximately 1 kb fragment contains the start codon to the start codon of the active HAC1 gene.
  • the human RRBP1 gene sold by Kazusa DNA Research Institute
  • the resulting approximately 4.5 kb fragment was introduced into pOMexGPlA treated with Spel-BamHI using BD In-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit (BD Science), and the start codon of the human RRBP1 gene was encoded from the Spel site.
  • the sequence was determined to be about 500 bp including the coding region, and about 500 bp containing the region coding for the entire human RRBP1 gene from the BamHI site.
  • the resulting vector was named pOMexGPlA / pl80PCR.
  • pOMexGPlA / pl80PCR was digested with Ndel-Ascl to remove a fragment from 110 bp to 4541 bp in human RRBP1 gene 0RF.
  • a fragment containing 110 bp to 4541 bp in 0RF was obtained by digesting the human RRBP1 gene received from Kazusa DNA Laboratory with Ndel-Ascl, and digested with the previous Ndel-Ascl.
  • P0MexGPlA / pl80PCR was introduced.
  • the resulting vector was named pOMexGPlA / pl80 (Fig. 3).
  • p0MexGPlA / P 180 is a human RRBP1 gene expression vector.
  • the vector pOMexGAT-G / Ab digested with Not I was transformed by electroporation with 0. minuta YK-3 strain ( ⁇ ochlApep4AprblAypslAura3 ⁇ adel: described in W02003 / 091431).
  • the electro volatilization conditions described in W02003 / 0 9 14 3 l were used.
  • Transformed cells are selected and cultured on YPD agar plate medium containing 50 ⁇ g / ml G418. Then, the genome was extracted, and the heavy chain was introduced by PCR using the above-mentioned DNA primers Xb-KREAEA-He (SEQ ID NO: 12) and Hc-R-Bg (SEQ ID NO: 13).
  • Xb-KREAEA-Lc-F The introduction of the light chain was confirmed by PCR using (SEQ ID NO: 14) and Lc-R-Ap (SEQ ID NO: 15). A strain in which introduction of both heavy chain and light chain genes was confirmed was designated as an antibody producing strain 0. minuta A01 strain.
  • P 0MexGPlA / pl80 digested with Sse8783I was introduced into the antibody producing strain 0. minuta A01 strain bred in Example 5 by the electroporation method described above.
  • Select the ADE + strain on the SD agar plate medium for transformation extract the genome after culturing, and introduce the RRBP1 gene into the pl80 MSp-F (SEQ ID NO: 24) and pl80 UBg-R (SEQ ID NO: 25). It was obtained by confirming by PCR using).
  • the obtained transformant was named 0. minuta AK2R strain.
  • transformation was performed using pOMexGPlA digested with Sse8783I as a control to obtain a 0. minuta AK2A strain.
  • pOMexPGHy-Hacl digested with Aor51HI was introduced into the 0. minuta AK2R strain and the 0. minuta AK2A strain by the electroporation method.
  • Activation of the transformant HAC1 gene was introduced by selecting Hygromycine on YPD agar plate medium supplemented with 50 ⁇ g / ml, culturing, extracting the genome, and using the DNA primer speHACIF ( This was confirmed by PCR using SEQ ID NO: 20) and bglHAClR (SEQ ID NO: 21).
  • the resulting strains were named 0. minuta AK3RH and 0. minuta AK3AH strains.
  • pOMexPGHy digested with Aor51HI was introduced as a control into 0. minuta AK2R strain and 0. minuta AK2A strain, respectively, to obtain 0. minuta AK3RHy strain and 0. minuta AK3AHy strain.
  • the cells were cultured at 28 ° C. for 4 days using 0.5% glycerol, 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). Prepare the culture supernatant from the culture medium, and subject it to SDS-PAGE. Then, blot the separated protein onto a PVDF membrane, and label it with anti-human antibodies (anti-human Fc antibody, anti-kappa antibody) As shown in Fig. 4, the RRBP1 gene and the activated HAC1 gene-transferred strain secreted a significant amount of antibody as compared to other strains. [Example 8] Productivity of secretory antibody by transformed yeast strain (0. minuta)
  • the amount of antibody produced in the 0.minuta AK3RH strain that co-expressed the active HAC1 gene and the RRBP1 gene was the control strain 0.In addition to the minuta AK3AHy strain, the active HAC1 gene or RRBP1 gene was introduced alone The antibody production was markedly higher than that. From the above, it was confirmed that the co-expression of the active HAC1 gene and the RRBP1 gene has an effect more than a synergistic effect on the antibody productivity.
  • Example 9 Production of an antibody using a transformed yeast strain (0. minuta) under conditions in which the formation of type 0 sugar chain is suppressed
  • aMF secretion signal of S. cerevisiae-derived MF alphal (GENBANK accession number; P01149) and the light chain and heavy chain of the anti-TRAIL receptor antibody as a fusion protein, linked by over l ap extension PCR method using the following oligonucleotide primers scratch anti-TRAIL receptor antibody gene (W02001 / 083560).
  • AlfH02 5'-CTCCACCAGCTGTACTTCTCTTTTCTCGAGAGATA-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • Alf thigh 5'-GGTCGACTCATTTACCCGGGGACAG-3 '(SEQ ID NO: 29)
  • AlfL02 5'-TGGGTCATCTGAATGTCTCTTTTCTCGAGAGATA-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • AlfL03 5'-TATCTCTCGAGAAAAGAGACATTCAGATGACCCA-3 '(SEQ ID NO: 31)
  • AlfL04 5'-GGTCGACCTAACACTCTCCCCTGT-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • the aMF secretion signal gene region was amplified using S. cerevisiae genomic DNA prepared by Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent (PIERCE) as a saddle. PCR with Primer EcoALF (SEQ ID NO: 26) and AlfH02 (SEQ ID NO: 27) for heavy chain (95 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 60 seconds) X 30 cycles ] For light chain, PCR using primers EcoALF (SEQ ID NO: 26) and AlfL02 (SEQ ID NO: 30) [95 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 60 seconds) X 30 Cycle], and each amplified DNA fragment of approximately 0.26 kb was recovered.
  • PIERCE Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent
  • the antibody gene region was amplified using the anti-TRAIL receptor antibody cDNA (W02001 / 083560) as a saddle type. PCR with primers AlfH03 (SEQ ID NO: 28) and AlfH04 (SEQ ID NO: 29) for heavy chain [ 95 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 90 seconds) X 30 cycles] PCR using primers AlfL03 (SEQ ID NO: 31) and AlfL04 (SEQ ID NO: 32) for light chain (95 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 90 seconds) X 30
  • the amplified DNA fragments of about 1.35 kb heavy chain region and about 0.65 kb light chain region amplified respectively were recovered.
  • the aMF secretion signal region for the heavy chain and the heavy chain region of about 1.35 kb are used as a saddle type primer.
  • Each recovered DNA fragment was cloned into pCR2.1-T0P0. From the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment, it was confirmed that the aMF secretion signal-antibody heavy chain and the aMF secretion signal-antibody light chain each had a gene fused in-frame.
  • the obtained plasmids were named TOPO-alfHc and TOPO-alfLc, respectively.
  • the aMF secretion signal collected by EcoRI-Sail digestion-the DNA fragment that codes the antibody heavy chain and aMF secretion signal-antibody light chain is taken into the large intestine.
  • the obtained plasmids were named YEp352GAP-II-alfHc and YEp352GAP-II-alfLc.
  • BamHI-GAP promoter 1 aMF secretion signal-antibody heavy chain from YEp352GAP_II-alfHc and YEp352GAP-II-alfLc using the BamHI restriction enzyme sites at both ends of GAP promoter ⁇ "-termine turcaset, respectively.
  • -Gene fragments encoding GAP terminator 1 "-BamHI (fragment 1) and BamHI-GAP promoter 1 aMF secretion signal-antibody light chain-GAP terminator 1-BamHI (fragment 2) were recovered.
  • Fragment 1 and fragment 2 were cut out fragment 1 or fragment 2, YE P 352GAP- II- alfHc or Ep352GAP_II - was introduced into the BamHI site of AlfLc 3 fragments Raigeshiyon.
  • the resulting vector was named YEp352 GAP-II-alfHc / alfLc (FIG. 7). From the restriction enzyme cleavage pattern, it was confirmed that fragment 1 and fragment 2 were introduced in tandem in the forward direction in YEp352 GAP-II-alfHc / alfLc, YEp352 GAP- ⁇ -alfHc / alfLc An antibody expression vector retaining both expression units of the chain and light chain.
  • Example 1 Construction of S. cerevisiae active HAC1 gene expression vector
  • the HACl precursor mRNA of S. cerevisiae has 252 nucleotides removed by the RNase activity of active IREl, and becomes HAC1 mature mRNA.
  • This mature HAC1 mRNA is translated into active HAC1 with 10 amino acid residues at the C-terminal removed and a new 18 amino acid residue added (PNAS 97, P4660-4665 (2000)). Therefore, a gene encoding active HACl was constructed by the overlap extension PCR method using the following oligonucleotide primers.
  • HAC-Sac-ATG 5'-GGAGCTCATGGAAATGACTGATTTTG-3 '(SEQ ID NO: 33)
  • HAC-internalR 5 '-GAATTCAAACCTGACTGCGCTTCTGGATTACGCCAATTGTCAAG-3' (SEQ ID NO: 34)
  • HAC-internalF 5 '-CTTGACAATTGGCGTAATCCAGAAGCGCAGTCAGGTTTGAATTC-3' (SEQ ID NO: 35)
  • HAC-Sma-STOP 5 '-GCCCGGGTGAGAGATGATGA
  • Genomic DNA of S. cerevisiae prepared by Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent (PIERCE) was used as a cage.
  • the amplified DNA fragments of about 0.66 kb (fragment A) and about 0.06 kb (fragment B) were recovered.
  • PCR was performed using primers HAC-Sac-ATG (SEQ ID NO: 33) and HAC-Sma-STOP (SEQ ID NO: 36) for 10 seconds at 95 ° C, using the amplified fragment A and fragment B as a saddle. 30 ° C at 60 ° C, 60 seconds at 68 ° C)), and the amplified DNA fragment of about 0.7 kb was obtained.
  • the recovered DNA fragment was cloned into pCR2.1-T0P0. From the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment, it was confirmed that it had a gene encoding 238 amino acid residues of active HAC1.
  • the resulting plasmid was named T0P0-aHacl.
  • the human RRBP1 gene sold by Kazusa DNA Research Institute
  • P180kpnatg 5'-GGGTACCATGGATATTTACGACACTC-3 '(SEQ ID NO: 37)
  • the obtained approximately 4.7 kb fragment was recovered and cloned into pCR2.1-T0P0. From the base sequence of the inserted DNA fragment, it was confirmed that about 600 bp at both ends of the inserted fragment contained the target base sequence correctly.
  • the resulting plasmid was named TOPO-P180. Then digested the TOPO-P180 by restriction enzyme Ndel and Hpal, and removing the fragment containing the region corresponding to 110bp_4524bp the KIAA139 8. An approximately 4.4 kb Ndel-Hpal fragment of KIAA1398 was introduced into this removed region to construct T0P0-P180N, and the restriction enzyme Xbal site was demethylated using Escherichia coli SCS110 strain (Stratagene).
  • the Kpnl-Xbal fragment containing the gene encoding RRBP1 was recovered using the Kpnl-Xbal restriction enzyme sites introduced into the primers -P180kpnatg (SEQ ID NO: 37) and P180xbastop (SEQ ID NO: 38).
  • YEp352GAP-II-pl80 was digested with the restriction enzyme Pvul, and a Pvul fragment containing the GAP promoter ⁇ "-RRBP1 gene-GAP terminator was recovered.
  • This Pvul fragment was recovered from the E. coli-yeast shuttle vector YE P 351 (Yeast 2, pl63-167 (1986)) ligated to the Pvul fragment containing the marker gene and the replication essential region, YEp351GAP-II-pl80 was constructed (Fig. 7) This vector carries the RRBP1 gene expression unit.
  • Example 11 YEp351GAP-II-aHACl constructed in 1 was digested with the restriction enzyme Hpal. Next, the BamHI fragment containing GAP promoter 1 to RRBP1 gene-GAP terminator 1 was recovered from YE P 352GAP-II-pl80 constructed in Example 12 and both ends were blunted with T4 DNA polymerase (Takara Bio). And introduced into the Hpal site of YEp351GAP-II-aHACl.
  • the resulting plasmid was named YEp351GAP-II-aHACl / pl80 (Fig. 7).
  • Fig. 7 By analyzing the nucleotide sequence, the insertion direction of the BamHI fragment containing the introduced GAP promoter-RRBP1 gene-GAP terminator was determined. This vector holds an expression habit of active HAC1 gene and RRBP1 gene.
  • Example 14 Construction of antibody-expressing yeast strain and antibody-expressing yeast strain (S. cerevisiae) expressing active HAC1 gene and RRBP1 gene
  • a competent cell of S. cerevisiae BY4741 strain (MATa Ahis3 A leu2 Ametl5 A ura3) was prepared by Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit (ZYMO RESARCH).
  • S. cerevisiae BY4741 strain was inoculated into 5 ml of YPAD medium [YPD medium containing 0.04% adenine (Sigma)], and the cells obtained by overnight culture (30 ° C., 310 rpm) were used.
  • the expression vector constructed in Example 10 to Example 13 was introduced into S.
  • YEp352 GAP-II-alfHc / alfLc which holds the expression units for antibody heavy and light chains, has a URA3 marker gene that complements the host uracil-requiring mutation.
  • YEp351 GAP-II (a control vector which gene is not introduced)
  • YEp351GAP_II-aHACl active HAC1 expression base Kuta one
  • YEp351GAP-II-pl80 RRBP1 expression vector
  • YEp351GAP- II_aHACl / P 180 active Type HAC1 gene and RRBP1 co-expression vector
  • the host was transformed so that it could grow only when both vectors were introduced in the following combinations, and four types of antibody-expressing yeast strains were constructed.
  • the S. cerevisiae T2K01, S. cerevisiae T2K02, S. cerevisiae T2K03 and S. cerevisiae T2K04 strains prepared in Example 14 were cultured at 30 ° C. for 3 days using ST medium. This culture solution was inoculated into YPAD medium to a final concentration of 5% and cultured at 30 ° C for 3 days. A culture supernatant was prepared from the culture solution and used as a sample containing the antibody secreted and produced by yeast. Quantitative analysis of the secreted antibody was performed by sandwich ELISA.
  • 96 well plates in the TRAIL receptor protein adsorbed is an antigen of an anti-TRAIL receptor primary antibody, was added yeast sample, Peruokishi Daze labeled human l g G-specific Fc antibody (Peroxidase-Labeled Affinity Purified Antibody To Human IgG (Fc) (KPL)) and ABTS peroxidase substrate (KPL).
  • yeast sample Peruokishi Daze labeled human l g G-specific Fc antibody (Peroxidase-Labeled Affinity Purified Antibody To Human IgG (Fc) (KPL)
  • KPL Peroxidase-Labeled Affinity Purified Antibody To Human IgG
  • KPL ABTS peroxidase substrate
  • the productivity of the S. cerevisiae T2K03 strain into which only the RRBP1 gene was introduced was almost the same as that of the control strain S. cerevisiae T2K01.
  • the S. cerevisiae T2K02 strain into which only the active HAC1 gene was introduced showed about twice the productivity of the control strain S. cerevisiae T2K01.
  • the S. cerevisiae T2K04 strain in which the active HAC1 gene and the RRBP1 gene were co-expressed was significantly higher than the S. cerevisiae T2K01 strain, which is the control strain, but also the one in which the active HAC1 gene or RRBP1 gene was introduced alone.
  • Antibody production was shown (approximately 7 times the control). It was confirmed that the co-expression of the active HAC1 gene and the RRBP1 gene has a synergistic effect on antibody productivity.
  • T2K03 S. cerevisiae T2K04 strain was cultured at 30 ° C. for 3 days using ST medium.
  • This culture broth was adjusted to a final concentration of 5% PMT inhibitor (rhodanine-3-acetic acid derivative: 5-[[3,4- (1-phenylraethoxyphenyl] methylene] -4-oxo-2- thioxo-3-thiazolidineacetic acid (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p3975, (2004) in Compound 1c)) was inoculated to the YPAD medium initially added and cultured at 30 ° C for 3 days.
  • PMT inhibitor rhodanine-3-acetic acid derivative: 5-[[3,4- (1-phenylraethoxyphenyl] methylene] -4-oxo-2- thioxo-3-thiazolidineacetic acid (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p3975, (2004) in Compound 1
  • a culture supernatant was prepared from the culture solution and used as a sample containing the antibody secreted and produced by yeast.
  • quantitative assay was performed by Sandwich ELISA method using an antibody produced from animal cells (NS0) as a standard.
  • the S. cerevisiae T2K02 strain into which the active HAC1 gene was introduced and the S. cerevisiae T2K03 strain into which the RRBP1 gene was introduced were clearly higher than the control strain S. cerevisiae T2K01. Productivity was shown. Furthermore, the S. cerevisiae T2K04 strain in which the active HAC gene and the RRBP1 gene were co-expressed was markedly different from the S. cerevisiae T2K01 strain, which is a control strain, as well as those that had only the active HAC1 gene or RRBP1 gene introduced. High antibody production (about 8 times the control). The synergistic effect on antibody production by co-expression of the activated HAC1 gene and the RRBP1 gene was further enhanced by suppression of type 0 sugar chain formation.
  • the YPS1 gene disruption vector pDOMYP1 described in W02003 / 091431 was cleaved with BaraHI and Clal, and transformed into the 0. minuta TK5-3 strain ( ⁇ ochl A ura3 ⁇ adel) described in W02003 / 091431 by the electric pulse method. Went. In order to confirm that the YPS1 gene of these strains was destroyed, the following primers were synthesized.
  • Chromosomal DNA isolated from the transformed strain is used as a cocoon-type, using primers DY5 and DY3,
  • YK4 strain ( ⁇ ochl A ura3 A adel ⁇ ypsl:: URA3). After 0. minuta YK4 strain was cultured in YPD medium until stationary, a strain resistant to 5-fluororotidine acid (5-F0A) was obtained. Five -
  • POMexGPlU described in W02003 / 091431 was ligated after Spel cutting and blunt end treatment. 'Changed the Sail site and EcoT22I site of the obtained plasmid to the Spel site and the BaraHI site respectively.
  • the obtained plasmid was named pOMexGPlUASp.
  • the antibody gene was designed from the amino acid sequence of the anti-TRAIL receptor antibody gene (W02002 / 094880) in consideration of the codon usage frequency of O. minuta and artificially synthesized (Takara Bio).
  • S. cerevisiae SUC2 signal or Chicken Lysozyrae signal is added to the N-terminus of light chain and heavy chain genes, and the restriction enzyme sites (Xbal site on the 5 'side and BamHI site on the 3' side) are added to both ends. (Base sequence numbers 51, 53, 55, 57; amino acid sequence numbers 52, 54, 56, 58).
  • Two types of light chain gene fragments with different signals digested with Xbal-BamHI were introduced into the vector pOMexGPlA prepared in Example 1 (2), and the obtained vector was called pOMexGPA / AbSUC and pOMexGPA / AbLys. Named.
  • Two heavy chain gene fragments with different signals digested with Xbal-BamH were introduced into the Spel-BaraHI site of the vector pOMexGPlUASp, and the resulting vector was named pOMexGPU ⁇ Sp / AbLys for pOMexGPUASp / AbSUC. .
  • PCR using pOMexPGHy (Example 1 (3-4)) as a saddle and DNA primers PGKHy-F (SEQ ID NO: 5 9) and PGKHy-R (SEQ ID NO: 60) for 30 seconds at 94 ° C, 55
  • the hygromycin B resistance gene was amplified at 30 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute).
  • the amplified gene fragment was introduced into pOMexPGHy digested with Spel-Bglll using an In-fusion kit (BD Bioscience), and the base sequence of the inserted fragment was determined.
  • the obtained plasmid was used as a saddle and PCR using DNA primers PGKpUC-p (SEQ ID NO: 6 1) and PGKpUC-1: (SEQ ID NO: 6 2) [94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, PGK promoter hygromycin B resistance gene-PGK terminator-containing gene fragment was amplified at 72 ° C for 2 minutes x 20 cycles].
  • PGKpUC-p 5'-AATTCGAGCTCGGTACAGGGATACATGGGATACCAAAG-3 '(SEQ ID NO: 6 1)
  • PGKpUC-t 5 '-GAGGATCCCCGGGTACCAGGGTCGATTTTCTTGGTCGA-3' (SEQ ID NO: 6 2)
  • the amplified gene fragment was introduced into pUC118 (Takara Bio) digested with Asp718I using In-fusion kit (BD Bioscience) and inserted The base sequence of the fragment was determined.
  • the resulting plasmid was named PGKHyg / P UC118.
  • pOMexGPlU A Sp was digested with HindIII_KpnI, a cassette containing GAP promoter 1 "-terminator was isolated, and inserted into Hindlll-Kpnl-digested PGKHyg / pUC118. The resulting plasmid was labeled with GAP / HyG / P UC118.
  • pUC19 Takara Bio was digested with Ndel-EcoRI, blunt-ended, and then ligated to remove the Ndel-EcoRI region present inside pUC19.
  • GAP / HyG / pUC118 was isolated by Hindlll-Sacl digestion, and the GAP promoter-terminator and PGK promoter-hygromycin B resistance gene-PGK terminator gene fragment were inserted. The resulting plasmid was named pOMexHy.
  • the antibody heavy chain gene fragment added with Chicken Lysozyme signal digested with Xbal-BamH was introduced into pOMexHy treated with Spel-BamHI, and the resulting vector was named pOMexHy / AbLys.
  • Antibody expression vectors digested with Not I, pOMexGPA / AbLys and pOMexGPU ⁇ Sp / AbLys were used to transform 0. minuta YK5 strain ( ⁇ ochl ⁇ ypsl ⁇ ura3 ⁇ adel) by eletroporation. .
  • the conditions for the elect port position were those described in W02003 / 091431.
  • Transformed cells were selected on SD agar plate medium [2% glucose, 0.67% yeast nitrogen base (Dif co)] Single colonies were selected from B2YP4G medium [1. 34% yeast nitrogen base ( Difco), 2 ° /.
  • Yeast extract (Difco), 4% polypeptone (Difco), 4% glycerol, 0.1M phosphate buffer (PH6.0)], 27 ° C Culture supernatant was prepared from the culture solution, Western analysis was performed by the method described in Example 7, and an antibody producing strain into which the antibody light chain and heavy chain genes were introduced was selected, and 0 As shown in Fig. 9, the 0. rainuta AA1 strain secreted a significant amount of antibody as compared to the 0. minuta A01 strain prepared in Example 5.
  • Antibody expression vectors pOMexGPA / AbSUC and pOMexGP.U ⁇ Sp / AbSUC digested with Notl were introduced into 0. rainuta TK5-3 strain ( ⁇ ochl A ura3 ⁇ adel) described in W02003 / 091431, and antibody expression strains 0 ⁇ I got rainuta YY1.
  • the electroporation method and the method for selecting strains were the same as described above. [Example 19] Acquisition of active HAC1 gene of P. pastoris and construction of expression vector
  • the P. pastoris active HAC1 gene was obtained from cells (P. pastoris GS115 strain) in the same manner as in Example 3.
  • CDNA was synthesized from P. pastoris GS115 strain by the method of Example 3.
  • This cDNA was subjected to PCR using the following DNA primers HACpl-1 (SEQ ID NO: 6 3) and HACpl-12 (SEQ ID NO: 6 4) [94 ° C for 30 seconds, 52 ° C for 30 seconds, 72 ° C 1 min) x 30 cycles], cloning to pCR2. 1-T0P0 (Invitrogen), and the nucleotide sequences derived from the two gene fragments amplified by PCR were confirmed (SEQ ID NOs: 65, 6). 6).
  • HACpl-1 5, -ATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAGACAGC-3 '(SEQ ID NO: 6 3)
  • HACpl-12 5'-CAAAGTCATTTAAATCAAATGCATTAGCGG-3 '(SEQ ID NO: 6 4)
  • one (SEQ ID NO: 6 5) has a force S that matches the genomic sequence, and the other (SEQ ID NO: 6 6) is partially missing and shortened, and is activated by UPR. It was a cDNA fragment spliced by Irelp.
  • PCR was performed using the following DNA primers speHACplF (SEQ ID NO: 6 7) and bglHACplR (SEQ ID NO: 6 8) and the cDNA pool considered to contain the activated HAC1 cDNA. [94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute) X 20 cycles].
  • speHACplF 5'-gactagtATGCCCGTAGATTCTTCTCATA-3 '(SEQ ID NO: 6 7)
  • bglHACplR 5'-cagatctCTATTCCTGGAAGAATACAAAGT-3 '(SEQ ID NO: 6 8)
  • the obtained about 1 kb fragment contains the start to end codons of the active HAC1 gene derived from P. pastoris (SEQ ID NO: 6 9), which corresponds to the amino acid sequence of active HAClp consisting of 304 amino acids. (SEQ ID NO: 70).
  • the resulting vector was named pOMexPGHy / PpHacl. This vector holds an active HAC1 gene expression unit derived from P. pastoris.
  • Example 1 Using T0P0-aHacl containing S, cerevisiae active HAC1 gene prepared in Example 1 as a template, DNA primer ScHAC-XbaF (SEQ ID NO: 7 1) and DNA primer ScHAC-BamR (SEQ ID NO: 7 2) was used to amplify the S. cerevisiae active HAC1 gene by PCR [94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute) X 20 cycles].
  • ScHAC-XbaF 5'-gtctagaATGGAAATGACTGATTTTGAACT-3 '(SEQ ID NO: 7 1)
  • Example 1 Antibody production strain bred in 8 0. Minuta AA1 strain digested with Aor51HI 0.
  • Minuta-derived active HAC1 gene expression vector p (MexPGHy / Hacl, P. pastoris-derived active HAC1 gene expression vector pOMexPGHy / PpHacl and the active HAC1 gene expression vector pOMexPGHy / ScHacl derived from S. cerevisiae were introduced by the electroporation method described above. Select on YPD agar plate medium added to 50 ⁇ g / ral, and after cultivation, extract the genome. 0. minuta-derived active HAC1 gene expression vector For pOMexPGHy / Hacl, see Example 3.
  • AA2ppH strain, 0. minuta AA2scH strain and 0. rainuta AA2Hy strain were cultured by the method shown in Example 18 (2), and Western analysis was performed under non-reducing conditions.
  • the 0. minuta AA2oraH strain, 0. rainuta AA2ppH strain, and 0. minuta AA2scH strain showed the addition of sugar chains to the antibody molecule compared to the control 0. minuta AA2Hy strain prepared in (1) above. Although no significant secretion promoting effect of the antibody H2L2 aggregate was observed, it was considered that the same production effect could be expected even if HAC1 gene derived from a species different from the host was introduced.
  • AA2Hy strain was inoculated into 5 ml of B2YP4G medium, inoculated with 1 platinum loop, cultured at 27 ° C for 1 day, diluted with B2YP4G medium so that OD600 was 10, and the PMT inhibitor (lc; The concentration of the stock solution (10 mM) was applied to 2 ⁇ [1. After further culturing at 27 ° C for 3 days, OD600 was measured every 24 hours, and PMT inhibitor (lc) was added in increments of 0D600 by 0.04 M. A culture supernatant was prepared from the culture solution, and Example 2
  • heterologous HAC1 gene As described above, even when heterologous HAC1 gene is used, it is recognized that it has an effect of promoting antibody secretion. I was cut off.
  • the acquisition of PMT1 gene derived from 0. minuta was carried out by using the chromosomal DNA of 0. minuta IF010746 strain as a saddle and using DNA primers PM1-5 (SEQ ID NO: 7 3) and PM1-3 (SEQ ID NO: 74) 30 cycles at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C, 2 minutes at 72 ° C).
  • the amplified DNA fragment of about 2.4 kb was recovered and cloned using the T0P0 TA Cloning Kit.
  • the plasmid insert DNA fragment is higher than the amino acid sequence of the PMT1 gene derived from S. cerevisiae.
  • a clone having a base sequence encoding a homologous amino acid sequence was selected.
  • the isolated plasmid was named pOmPMl.
  • DNA primers PM2-5 SEQ ID NO: 7 7) and PM2-3 (SEQ ID NO: 7 8) were used.
  • DNA primer PM4-5 SEQ ID NO: 7 9) was used.
  • PM4-3 SEQ ID NO: 80
  • DNA primer PM5-5 SEQ ID NO: 8 1
  • PM5-3 SEQ ID NO: 8 2
  • DNA primer for PMT6 gene PM6-5 SEQ ID NO: 8 3 and PM6-3 (SEQ ID NO: 8 4) were used to obtain the PMT2 gene (base sequence: SEQ ID NO: 85, amino acid sequence: SEQ ID NO: 8).
  • PMT4 gene base sequence: SEQ ID NO: 8 7, amino acid sequence: SEQ ID NO: 8 8
  • PMT5 gene base sequence: SEQ ID NO: 89, amino acid sequence: SEQ ID NO: 90
  • PMT6 gene Plasmids containing (base sequence: SEQ ID NO: 91, amino acid sequence: SEQ ID NO: 92) PM2, p0mPM4, p0mPM5 and p0mPM6 were named.
  • PM5--3 5'-CTACTCACTATAGACGGAGCAGTCGATCGA-3 '(SEQ ID NO: 8 2)
  • PM6-5 5'-ATGTCCGAGTCAGAGCTGAGAAACCGCAAA-3 '(SEQ ID NO: 8 3)
  • PCR [94] was performed using the following DNA primers PMTlhlll (SEQ ID NO: 93) and ⁇ (SEQ ID NO: 94). 30 ° C at 30 ° C, 30 seconds at 55 ° C, 2 minutes at 72 ° C)).
  • the amplified DNA fragment of about 1.6 kb was recovered by digestion with HindIII- ⁇ . Then pPICZ a
  • plasmid (Invitrogen) was digested with Bglll, treated with a blunt end, inserted with a Hindlll linker, further digested with BamHI, treated with a blunt end, and inserted with a Kpnl linker.
  • the obtained plasmid was named pZ-Hd-Kp.
  • P Z- HD- the Kp was digested with Hindlll- Kpnl, after isolation of DNA fragments of 2.
  • OKB including Zeoshin resistance gene was ⁇ the PMT1 gene partial sequence amplified by the PCR. After determining the base sequence of the partial sequence of the inserted ⁇ gene, the obtained plasmid was named pOmPMldZ.
  • pOmPMldZ disrupts the structural gene (CDS) part of the O. minuta PMTl gene and the promoter region, and can repress transcription of the PMT1 gene.
  • CDS structural gene
  • pOMexGPU ⁇ Sp prepared in Example 18 was digested with Hindlll-Kpnl, the gene fragment containing GAP promoter and terminator was recovered, and digested with Hindlll-Kpnl, containing the zeocin resistance gene. 2. Okb Inserted into the DNA fragment. The obtained plasmid was named GAP / Z.
  • DNA primer PMT2hIII (SEQ ID NO: 95, PT2Kp (SEQ ID NO: 96) was used, and PCR was performed at 94 ° C.
  • the amplified DNA fragment of about 1.5 kb was recovered, digested with Hindlll-Kpnl, and recovered. DNA obtained The fragment contains the zeocin resistance gene isolated by treating pZ-Hd-Kp with Hindlll-Kpnl. 2. After inserting into the Okb DNA fragment, the base sequence of the inserted PMT2 gene partial sequence was determined. . The obtained plasmid was named p0mPM2dZ. pOmPMMZ is the structural gene of 0. minuta ⁇ gene
  • CDS part and promoter region can be separated to suppress transcription of PMT2 gene.
  • PMT4FHdinf 5'-GTCATGAGATCCaagctGATCCCTCAATGGAGATCTACT-3 '(SEQ ID NO: 9 7)
  • PMT4RKpinf 5'-GGTGTGTGGGGGATCgGGATGCAAATGGATGGCTCGAAC-3 '(SEQ ID NO: 9 8)
  • the obtained approximately 1.5 kb DNA fragment was isolated from pZ-Hd-Kp by HindIII- ⁇ treatment and contained the zeocin If gene 2. Okb DNA fragment, In-fusion kit (BD Bioscience) ). After determining the base sequence of the partial sequence of the inserted PMT4 gene, the obtained plasmid was named p0raPM4dZ.
  • PROMUl containing a gene fragment having a repeat sequence of about 0.8 kb before and after the URA3 structural gene of 0. minuta described in W02003 / 091431 was digested with Hindlll, treated with a blunt end, and inserted with a BaraHI linker.
  • the obtained vector was digested with BaraHI-Bglll, and about 3.3 kb fragment containing 0. minuta URA3 gene was introduced into pBluescriptKS- (Stratagene) digested with BaraHI.
  • the resulting vector was named rURApBKS.
  • Minuta IF010746 strain chromosomal DNA is in a saddle shape, and PCR is performed using DNA primers PMT5raaeF2 (SEQ ID NO: 9 9) and PMT5maeR (SEQ ID NO: 100) for 30 seconds at 94 ° C and 1 minute at 55 ° C. , 72 minutes at 2 minutes) x 25 cycles].
  • the amplified DNA fragment of about 1.5 bk was recovered and introduced into rURApBKS digested with BamHI-Hindlll using the In-fusion kit (BD Bioscience), and the base sequence of the inserted gene fragment was determined.
  • the obtained vector was named PMT5K / 0 / rURA3pre.
  • PCR was performed using 1 0 1) and PMT5ushiroR (SEQ ID NO: 10 2) for 30 seconds at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C, 2 minutes at 72 ° C) X 25 cycles.
  • the amplified DNA fragment of about 1.5bk was recovered and digested with Notl. It was introduced into PMT5K / 0 / rURA3pre using an in-fusion kit (BD Bioscience), and the nucleotide sequence of the inserted gene fragment was determined.
  • the obtained vector was named PMT5K / 0 / rURA3.
  • PMT5maeF2 5'-GACGGTATCGATAAGCTTGATGCGCGGCCTTCCGACCTT-3 '(SEQ ID NO: 9 9)
  • PMT5maeR 5 '-CTGGGGAAGCTCGGATCCGGCTCGAGGTCTTCGTTCAGA-3' (SEQ ID NO: 1 0 0)
  • PMT5ushiroF 5 '-CTAGTTCTAGAGCGGCCCAGGTCGCTTTCAGGCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 1 0 1)
  • PMT5ushiroR 5 '-CACCGCGGTGGGGTCC
  • Minuta IF010746 strain chromosomal DNA is in a saddle shape and DNA primer PMT6inf5 'armF (SEQ ID NO:
  • PMT6inf 3 'armR2 (SEQ ID NO: 1 0 6) were used to perform PCR [94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 2 minutes, 72 ° C for 2 minutes) X 25 cycles] .
  • the amplified DNA fragment of about 2.5 kb is recovered, introduced into PMT6K / 0 / rURA3pre digested with Notl-SacII using the In-fusion kit (BD Bioscience), and the nucleotide sequence of the inserted gene fragment is determined. Were determined.
  • the obtained vector was named PMT6K / 0 / rURA3.
  • PMT6inf5 'armF 5' -GCAGCCCGGGGgatccACGAAACCACGTCCTACT-3 '(SEQ ID NO: 1 0 3)
  • PMT6inf5 'armR 5' -GGGGAAGCTcggatcGACTCATCTTGAAACGCA-3 '(SEQ ID NO: 1 0 4)
  • PMT6inf3 'armF 5' -AGTTCTAGAGCGGCCTTACCACCATTACATGCC-3 '(SEQ ID NO: 1 0 5)
  • PMT6inf3 'armR2 5' -AATTGGAGCTCCACCGCGGCCGCAACTTACTCGACGCTAA-3 '(SEQ ID NO: 1 0 6)
  • Example 1 Antibody-producing strains bred in 8 0. minuta YY1 strain, PMT gene disruption vector prepared in Example 23, PMT1 gene disruption vector Pstl, PMT2 gene disruption vector Xhol, PMT4 The gene division vector was digested with Hindi 11 and introduced by the electroporation method. Confirmation of PMT gene disruption in the transformant
  • PMTlzeo2 5 '-CGTTCAGACTCTTGTTGATTTTCCAC-3, (SEQ ID NO: 1 1 0)
  • PMT2zeo2 5'-CTTGTCCCTCTTGAATGGCGAGTG-3 '(SEQ ID NO: 1 1 2)
  • PMT4PCR3 'armF 5' -GGAACACGCCAAACATCATG -3 '(SEQ ID NO: 1 1 3)
  • PMT4PCR5 'arraR3 5, -CACAAGCAGAATCAGGCAC -3' (SEQ ID NO: 14)
  • the obtained strains were 0. minuta YY2P1 strain (PMT1 gene disruption) and 0. rainuta YY2P2 strain, respectively.
  • Each PMT gene fragmented antibody producing strain prepared in (1) above was cultured by the method shown in Example 18 (2) and subjected to Western analysis. As a result, as shown in Fig. 12 and Fig. 14, the PMT1 gene was disrupted. 0. rainuta YY2P1 strain, PMT2 gene was disrupted. 0. minuta YY2P2 strain, and PMT4 gene was disrupted. For 0. minuta YY2P4 stock, it was created in (1) above.
  • Example 21 1 The amount of antibody produced in the culture solution prepared in (2) above was measured by the method described in (3). As a standard, an antibody produced from animal cells (CH0) was used. As shown in Fig. 1 3 and Fig. 15, in the 0.minuta YY2P1 strain, PMT2 gene was disrupted 0.minuta YY2P2 strain, and the PMT4 gene was disrupted 0.minuta YY2P4 Compared with the 0. minuta YY2Z strain prepared in (1) above, a slight increase in the amount of antibody aggregate secretion was confirmed (Fig. 13: YY2PU YY2P2, Fig. 15: ⁇ 2-4).
  • gPMT5-5 5, -CGGTGACGACTTCGACTAGTCGAG-3 '(SEQ ID NO: 1 1 5)
  • gPMT5-2 5′-CGGTGCTGTTGGCGTCGTCATGGGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 1 1 6)
  • gPMT5-3 5'-GGCGCGTTCCAATTCCACTCTGCTG-3 '(SEQ ID NO: 1 1 7)
  • gPMT5-4 5'-CGACGAGTCCTCTCACCAGGAGGTTG-3 '(SEQ ID NO: 1 1 8)
  • Chromosomal DNA isolated from the transformed strain is used as a saddle, and PCR ((94 ° C for 30 seconds, 60 ° C) using primers gPMT5-5 (SEQ ID NO: 1 1 5) and gPMT5-2 (SEQ ID NO: 1 16). 1 minute at ° C, 2 minutes at 72 ° C)
  • PMT6 PCR3 'arraF 5'-TGTGGGTGCGATCCTGAG-3' (SEQ ID NO: 1 1 9)
  • PMT6 PCR5 'arraF 5'-GCATGTGCCACTGCTAAA-3' (SEQ ID NO: 1 2 1)
  • Antibody expression vector pOMexGPA / AbLys digested with Notl made in Example 18 (1)
  • minuta YK4 strain ( ⁇ ochl ⁇ ura3 ⁇ adel ⁇ ypsl:: rURA3) by electoporation as controls
  • An antibody expression strain was prepared and selected in the same manner as described above. The resulting strain is called 0. miuta Aeon strain. Named.
  • PMT5 gene disruption strain 0. minuta AP5 strain, PMT6 gene disruption strain 0. minuta AP6 strain, and 0. rainuta Aeon strain were cultured by the method shown in Example 1 8 (2), and non-reducing Western Analysis was performed.
  • the antibody production amount of the culture broth was measured by the method described in Example 21 (3).
  • an antibody produced from animal cells (CH0) was used.
  • CH0 animal cells
  • Example 2 4 0. minutaYY2P2 strain (PMT2 gene split strain), 0. minuta YY2P4 strain (PMT4 gene split strain), and 0. minuta YY2Z strain (control strain),
  • Example 3 The 0. minuta-derived active HAC1 gene expression vector pOMexPGHy / Hacl prepared in (1) was digested with Aor51HI and introduced by the above-mentioned electoral position method. Activation of transformant HAC1 gene is introduced by selecting on YPD agar plate medium supplemented with hygromycin B at 50 / g / ral, and after culturing, the genome is extracted, and the active HAC1 gene The introduction was confirmed by PCR according to the method of Example 6.
  • the resulting strains were named 0. rainuta YY3P2oraH strain (HAC1 gene-transferred PMT2 gene split strain), 0. minuta YY3P4omH strain (HAC1 gene-transferred PMT4 gene split strain), and 0. minuta YY3ZomH strain (HAC1 gene transfer control strain) did.
  • pOMexPGHy digested with Aor51HI was introduced into the 0. minuta YY2Z strain as a control to obtain a 0. minuta YY3ZHy strain (beta-introduced control strain).
  • PMT gene split antibody producing strain into which the HAC1 gene was introduced was cultured by the method shown in Example 18 (2), and Western analysis was performed. The results are shown in Fig. 12 and Fig. 14.
  • PMT2 gene-strained strain with HAC1 gene introduced 0.minuta YY3P2omH3 ⁇ 4 was secreted with a significant amount of antibody compared to the 0. rainuta YY3ZoraH strain, which is a HACl gene-introduced strain, compared to the 0 .. minuta YY2P2 strain, which is a PMT2 split strain ( Figure 12: Lane 7).
  • the PMT4 gene-divided strain into which the HAC1 gene has been introduced is 0.rainuta YY3P4omH strain is a HAC1 gene-introduced strain 0.rainuta YY3ZoraH strain is a PMT4-divided strain 0. minuta YY 2 P4
  • the antibody secreted a significant amount ( Figure 14: Lane 6).
  • the antibody production amount of the culture broth was measured by the method described in Example 8 and Example 21 (3).
  • an antibody produced from animal cells CH0
  • the results are shown in Fig. 13 and Fig. 15.
  • the 0. minuta YY3P2omH strain which is a ⁇ 2 gene-divided strain into which the HAC1 gene has been introduced, is the control 0. minuta YY3ZomH3 ⁇ 4 (HACl gene-introduced strain), 0. Compared with the strain (vector-introduced control strain), it secreted a significant amount of the associated antibody (Fig. 13: 0. rainuta YY3P2omH strain). In addition, 0.
  • minuta YY3P4omH strain which is a PMT4 gene-strained strain into which HAC1 gene has been introduced, is a control 0. rainuta YY3ZomH3 ⁇ 4 (HACl gene-introduced strain), 0, minuta YY2P4 strain (PMT4 gene-strained strain) and 0. Compared with the minuta YY3ZHy strain (vector-introduced control strain), a significant amount of the associated antibody was secreted (Fig. 15: 0. rainuta YY3P4oraH3 ⁇ 4).
  • Each PMT gene fragmented antibody-producing strain introduced with the HAC1 gene prepared in Example 25 (1) above was inoculated into 5 ml of B2YP4G medium, 1 platinum loop, inoculated at 27 ° C for 1 day, 0D600 To be 10
  • the antibody productivity is highest when the PMT inhibitor concentration is increased by about 0.008 3 ⁇ 41 (stock solution concentration 2.5 mM) as 0D600 increases by 1.
  • Minuta YY3P4oraH strain Increased PMT inhibitor by 1 to 0D600
  • the antibody productivity was highest when about 0.04 ⁇ was added (stock solution concentration: lOmM). It is considered that glycosylation is strongly suppressed by the combined use of PMT gene expression suppression and PMT inhibitors. In order to suppress the glycosylation of HAC1-introduced strains, it is expected that the production of the aggregate antibody will be further increased by inhibiting the expression of the PMT gene and inhibiting the PMT protein activity in combination with the PMT inhibitor.

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Abstract

本発明は、酵母などの宿主細胞において、タンパク質、特には抗体などの構造が複雑なタンパク質を高分泌生産する手段を提供することを課題とする。　本発明によれば、活性型HAC1遺伝子とRRBP1遺伝子を有する形質転換酵母、該形質転換宿主細胞を用い、かつ酵母などの宿主細胞に特有のＯ型糖鎖を抑制することによって外来タンパク質を高分泌生産する方法が提供される。

Description

明 細 書 タンパク質の高分泌生産方法 技術分野
本発明は、 主に酵母におけるタンパク質の高分泌生産方法に関する。 背景技術
医薬品用途のタンパク質の遺伝子組換え技術による生産には、 これまで宿主として主に 動物細胞、 大腸菌が用いられている。 大腸菌は、 目的タンパク質を低コストで生産するこ とが可能であるが、 糖鎖修飾に代表される修飾を行うことが出来ず、 封入体 （Inclusion body) 中に不活化状態のタンパク質として生成するため、 可溶化プロセスが必要で、 複雑 なタンパク質の生産には不向きである。 一方、 動物細胞は、 目的タンパク質を活性化タン パク質として生産することができるが、 細胞育種 ·培養に時間を要し、 設備、 材料費を含 め、 非常に高コストでの生産を余儀なくされる。
タンパク質の中でも特に抗体は古くから医薬品として利用されてきたが、 ヒト以外の他 起源由来のものであったため、 投与された抗体自身に対する抗体が産生され、 複数回の投 与ができず、 その利用が制限されてきた。 近年、 抗原結合部位以外のアミノ酸配列をヒト 抗体由来の配列に置換したヒ ト型抗体が作製されるようになったこと、 更にマウスにヒト 抗体遺伝子を導入したヒト抗体生産マウスが作出されるようになったことから、 抗体の医 薬としての利用が急速に広まってきた。 現在これらの抗体は、 ハイプリ ドーマや抗体をコ ードする遺伝子を導入した CH0細胞などの培養細胞によって生産されているが、 コスト、 生産性、 安全性などの点で問題が多い。
近年、 これらの欠点を補う意味で酵母を用いて医薬品用途のタンパク質生産を行うこと が検討されているが、 実用化された例はほとんどなレ、。 特に、 複雑な構造を有する抗体に ついては、 Fab、 単鎖抗体 （ScFv) 等を発現させた例（Biosci. Biotechnol. Biochera. 64: 2138- 2144 (2000) )はあるが、 抗体全長では生産性は非常に低い (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 : 8678-8682 (1988) )。 また最近、 哺乳類型の N結合型糖鎖を生産する酵母 (Pichia pastoris) を利用して抗体を生産させた例 （Nature Biotechnology. 24: 210- 215 (2006) ) が報告されるが、 収率.収量については言及がない。 このように、 酵母での 抗体の高生産は困難であるが、 原因としては、 酵母には十分な分泌能力がないこと、 プロ テアーゼによる分解などが挙げられる。
これらの問題を解決する手段の一つとして、 プロテア一ゼ破壌株を用いる方法が提案さ れており （Enzyme and Microbial Technology. 26 : 671-677 (2000)、 Protein Expr. Pur if. 20： 485-491 (2000)、 Biosci. Biotechnol. Biochera. 66 : 628-631 (2002) ) 、 発明 者らもまた、 プロテアーゼの一種である、 プロテア一ゼ A (PEP4)、 プロテアーゼ B (PRB1)、 ャプシン （YPS1) 遺伝子の破壊株を用いて抗体の分解を抑制させる方法を開発している
(W02003/091431 ) 。 一方、 遺伝子導入によるタンパク質生産性向上の例と して、 BiP (KAR2) /PDI等の小胞体上でタンパク質の 3次元構造形成を助ける分子シャペロン群の 一部を共発現させることによって ScFvの生産性を向上させる方法が報告されているが（Nat. Biotechnol. 16： 773-777 (1998) ) , 1本鎖の抗体断片を生産しているにすぎない。
また、 誘導型プロモーターまたは構成的プロモーターが多く開発され、 外来タンパク質 の生産に利用されている。 しかしながら、 細胞において外来タンパク質をコードする遺伝 子を強力なプロモーターを用いて高発現させた場合、 またはフォールディングしにくいタ ンパクを生産させた場合、 小胞体 （ER) 内でァグリゲーシヨンを起こし、 細胞内に蓄積さ れることがある。 さらに、 分泌タンパク質及び膜タンパク質は、 タンパク質へ翻訳される と直ちに小胞体へ取り込まれ、 一定の修飾を受けた後にゴルジ装置へ送られるが、 このと き、 何らかの理由で未熟な （unfoldな） タンパク質が小胞体へ蓄積してしまうことがある。 このような状態を 「小胞体ストレス」 と呼ぶ。 小胞体ストレスの原因としては、 小胞体内 で起こる修飾 （糖鎖、 ジスルフィド結合の付加） の障害、 小胞体からの輸送の低下などが 挙げられる。 哺乳類の細胞は、 このような小胞体ス トレスに対抗する手段として、
「Unfold Protein Response (UPR)」 という機構を備えており、 例えば、 転写抑制、 分午 シャペロンの誘導によるフォールデイング促進、 変性タンパクの分解、 アポトーシスによ る細胞死によつて、 小胞体に蓄積したタンパク質を保護する。
この UPRを制御する遺伝子として、 動物細胞では、 IREl a -XBPlの系、 PERK- elF- 2 α系、
ATF6系の系が知られている。 また、 酵母においては、 Irelp-Haclpの系のみが存在するこ とが知られており、 Irelp - Haclpは、 次のようなメカニズムで UPRに関与している （図 1参 照） 。 まず、 Irelpは、 通常、 BiP (抗体重鎖結合タンパク） と結合しているが、 アンフォ —ルド 'タンパク質 （Unfold Protein : UFP) が生成された場合、 BiPはこの UFPと結合す る。 BiPと解離した Irelpは自己リン酸化、 2量体化により活性化し、 エンドヌクレアーゼ 活性を発揮する。 一方、 HAC1遺伝子は、 通常、 不活化された状態にあるが、 エンドヌクレ ァーゼ活性を有する Irelpは、 HAC1遺伝子から転写された mRNAをスプライシングし、 活性 型 Haclpを生成する （Cell. 87 : 405-413 (1996)、 Cell. 90 : 1031-1039 (1997)、 The EMBO Jounrnal. 18： 3119-3132 (1999) ) 0 この活性型 Haclpは核に移行し、 転写因子として作用 し、 UPRと称する一連の反応、 関連した糖鎖付加、 タンパクフォールディング、 タンパク 分解 （ER- associated degradation: ERAD) 、 タンパクソーティング、 脂質代謝などに関 連した様々なタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進する （Cell. 101 ： 249- 258 (2000) ) 。
活性型 Haclpを利用した外来タンパク質生産性の向上についての取組みでは、 糸状菌 Trichoderma reeseiの活性型 Haclpをコードする遺伝子を S. cerevisiaeに導入することに より異種タンパク質である α -アミラーゼ、 及び内在性タンパク質であるインベルターゼ を分泌向上させた例がある （Appl. Environ. Microbiol. 69： 065-2072 (2003) ) 。 しかし ながら単一のタンパク質である α -アミラーゼゃィンベルターゼは、 元々分泌しやすいタ ンパク質として知られているものであり、 生産量も 2倍程度の向上しかみられない。 また 最近 Pichia pastoris (P. pastoris) を用いて、 活性型 HAC1遺伝子を単独で導入した株に おいて、 抗体断片である Fabを生産したという報告がある（Biotechnology and Bioengineering. 94: 353-361) 。 しかしながら活性型 HAC1遺伝子の導入のみでは、 1. 3倍 程度の生産性向上しか認められていない。
一方、 哺乳類由来の RRBP1 (リボソーム結合タンパク 1、 リボソームレセプター、 P180 タンパク） 遺伝子を単独で酵母に導入することにより、 タンパク質（Bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI)を約 5倍分泌させた例 （The Journal of Cell Biology.
146：273-284 (1999) ) が知られている。 RRBP1遺伝子は、 リボソームに結合するタンパクを コードする遺伝子として当初ィヌから単離された（Nature. 346： 540-544 (1990) ) 0 RRBP1 は分子量が 180kDaで N末側に 10ァミノ酸残基が 54回繰り返す特異な構造を持ち、 この領域 がリボソームと結合する。 RRBP1 は膜構造の増大、 mRNAの安定化に関与することが知られ ている （The Journal of Cell Biology. 130 : 29 - 39 (1995)、 The Journal of Cell
Biology. 156 : 993-1001 (2002) ) 0 しかしながら、 上記の BPTIでの成功例は分子量が 6500と 非常に小さいペプチドでのものであり、 一般的に他の高分子量のタンパク質、 更には抗体 のような軽鎖、 重鎖という異なったタンパク質の会合体タンパクに適応できるとは限らな い。
酵母ゃカビでは、 PMT (Protein O-raannosyltransferase) 遺伝子が酵母ゃカビ特有の 0 型糖鎖形成に関与することが知られている。 この PMT遺伝子産物は、 ER膜に局在し、 分泌 タンパク質のセリン （Ser) 、 スレオニン （Thr) のヒ ドロキシノレ残基にマンノースを付カロ する活性 （以下、 PMT活性と称する） を有する。 PMTにより糖鎖付加を受けたタンパクの一 部はマンノプロテインとして酵母の細胞壁の主構成成分となっており、 PMT活性を極度に 低減させた場合は、 細胞壁が減弱化し細胞自体の生育に影響を与えることが知られている。
PMT遺 is子 ίこ fc] し、 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) にお レヽて 、 PMTl, 2， 3, 4, 5, 6， 7の 7遺伝子の存在が認められている （Biochim. Biophys. Acta. , 1426 : 297-307 (1999) ) 。 PMT遺伝子は、 PMTlファミリー、 PMT2ファミリー、 PMT4ファミリ 一の 3種に分類され、 PMTlpと PMT2pはへテロ 2量体を形成し、 PMT4pはホモ 2量体を形成し 活性を発現していることが知られている。 ァミノ酸配列の相同性などから PMT5pは PMTlpを、 PMT3pは PMT2pを相補すると言われている。 PMT6pは PMT2pおよび PMT3pと相同性が高いが、 どのような複合体で活性を発現しているのかは知られていない。 また各々の PMTタンパク には基質となるタンパクに選択性があることが知られている。
また、 その他の出芽酵母の PMT遺伝子としては、 Candida albicansでは S. cerevisiaeの PMTl, 2, 4， 5, 6遺伝子と相同性の高い 5遺伝子 (Mol. Microbiol. , 55 : 546-560 (2005) ) 、 Cryptococcus neoformansでは少なくとも S. cerevisiaeの PMT4遺伝子と相同性の高い遺伝 子カ (Eukaryot. Cell, 6： 222-234 (2007) ) 、 分裂酵母の Schizosaccharomyces pombeで は、 同じく PMT1, 2, 4遺伝子と相同性の高レ、 3遺伝子（omal，2, 4)が見出されている （Mol. Microbiol. , 57： 156-170 (2005) ) 。 更に本発明においてメタノール資化性酵母である 0 gataea minuta (0. minuta)においては、 S. cerevisiaeの PMTl, 2, 4, 5, 6遺伝子と相同性の 高い 5遺伝子の存在が確認された。
またカビにおいても PMT遺伝子は見出されている。 Aspergil lus nidulansでは PmtA遺伝 子他 2遺伝子が、 また Trichoderma reeseiでは S. cerevisiaeの PMT2遺伝子と相同性の高い
Pmtl遺伝子が見出されている （Curr. Genet. , 43： 11-16 (2003) ) 。
PMT活性はペプチドの疎水的な領域に作用し、 ペプチドの親水性を上げ、 ER内腔でのぺ プチドの凝集を抑制する効果があると言われている。 ところが外来タンパク質を生産した 場合、 PMT活性は時として不要な 0型糖鎖を付加し、 タンパク複合体の形成不全、 活性の低 下等を引き起こす可能性がある。 特に抗体等の多量体タンパクにとっては、 その会合体形 成 （抗体の場合、 軽鎖と重鎖の会合体形成） を阻害する可能性がある。
特許第 3 6 3 0 4 2 4号、 および特表平 8 _ 5 0 9 8 6 7に、 PMT遺伝子改変による 0 型糖鎖付加抑制による組換えタンパクの製造法が提案されているが、 抗体の軽鎖 ·重鎖会 合体形成に関する記述はない。
また 0型糖鎖形成に関与する PMT1、 PMT2遺伝子破壊株を用いて、 0型糖鎖の付加を抑制 し、 抗体軽鎖、 重鎖分子の会合を 1 . 5倍程度、 促進する例が示されている (W02002/046437) 。 しかしながらこのデータは RIラベルしたアミノ酸を用いたパルス . ラベル実験の結果であり、 培養プロセス全体を見た結果ではない。 また、 糖鎖付加抑制の 程度は低く、 しかも抗体の生産性については逆に低下している。
上記、 HAC1遺伝子は UPRを誘導するが、 UPRで誘導される遺伝子群の中には、 酵母特有 の 0型糖鎖を付加する PMT遺伝子も存在することが知られている （Cell. 101 ： 249- 258 (2000) ) 。 従って HAC1遺伝子を導入したのみでは、 抗体などの多量体タンパクを高品 質で高生産することはできないと考えられる。
以上のように、 酵母におけるタンパク質の高分泌生産方法については、 様々な方法が提 示されているが、 未だに実用化レベルを達成する方法はほとんど存在しない。 特に抗体を はじめとする高分子量のタンパク質、 会合体タンパクを効率的に生産する方法は見出され ていない。 一般的に細胞に遺伝子導入 ·遺伝子破壊等で 1つの形質を導入した場合、 細胞 は何らかのス トレスを受けるため、 他の修飾が行われたり、 逆の作用が生まれる場合もあ る。 例えば、 タンパク質の高発現を行った場合、 UPRが活性化された状態になるが、 結果 的に糖鎖修飾、 プロテアソームや ERAD (ER associated Degradation) による分解などの 負の要素が働く。 よって抗体のような複雑な構造をとるタンパク質の高分泌生産は、 たと えば単独の遺伝子を導入するといったような、 ただ 1つの方法で達成されるものではなく、 また従来の方法をいくつか単に組み合わせることで、 必ずしも相乗的に効果が得られるも のではない。
従って、 本発明の課題は、 酵母などの宿主細胞において、 タンパク質、 特には抗体など の構造が複雑なタンパク質を高分泌生産する手段を提供することにある。 発明の開示
そこで本発明者らは、 上記課題を解決すベく鋭意研究を重ねた結果、 メタノ一ル資化性 酵母 Ogataea minutaにおいてタンパク質の高分泌生産に関わる遺伝子である、 活性型 HAC1 (小胞体ストレス時に Irelpにより mRNAがスプライシングを受け、 誘導される転写因子 である Haclタンパク質） 遺伝子、 及ぴ RRBP1 (リボソーム結合タンパク 1、 リボソームレ セプター、 pl80タンパク） 遺伝子を共発現させることにより、 抗体の分泌生産性を 10倍近 く向上できることを見出した。 更に抗体などのへテロ多量体の会合を阻害する、 酵母特有 のタンパク質への 0型糖鎖付加に関与する Protein O-mannosyltransf erase (PMT)の活性を 抑制することによって、 更なる生産性の向上が実現できることを見出した。
またタンパク質の高分泌生産に関わる遺伝子である、 活性型 HAC1遺伝子を発現させ、 更 に抗体などのへテロ多量体の会合を阻害する、 酵母特有のタンパク質への 0型糖鎖付加に 関与する Protein 0- mannosyltransferase (PMT)の活性を抑制することによって、 相乗的 な生産性の向上が実現できることを見出した。
本発明はかかる知見により完成されたものである （図 2参照） 。
即ち、 本発明は以下の発明を包含する。
〔 1〕 活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子を有する形質転換宿主細胞。
〔2〕 以下の （1 ) の活性型 HAC1遺伝子と （2 ) の RRBP1遺伝子を有する、 〔1〕 に記載 の形質転換宿主細胞。
( 1 ) 下記の （a)〜 （d) から選択される活性型 HAC1遺伝子：
(a) 配列番号 23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(b) 配列番号 23に示すアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ Unfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタン パク質をコードする遺伝子
(c) 配列番号 23に示すアミノ酸列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 22に示す塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる DNAとストリン ジヱントな条件下でハイプリダイズし、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質 をコードする遺伝子
( 2 ) 下記の （e) 〜 （h) から選択される RRBP1遺伝子：
(e) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1をコードする遺伝子
(f) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のァミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性 を有するァミノ酸配列からなり、 かつリポソーム結合活性を有するタンパク質をコードす 意 feナ
(g) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつリボソーム結 合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(h) ヒ ト由来またはィヌ由来の RRBP 1遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配 列がらなる遺伝子とストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、 かつリボソーム結合 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔3〕 以下の （1 ) の活性型 HAC1遺伝子と （2 ) の RRBP1遺伝子を有する、 〔1〕 に記載 の形質転換細胞。
( 1 ) 下記の （i) 〜 （1) から選択される活性化 HAC1遺伝子：
(1) Saccharomyces cerevisiae、 Trichoderraa reesei ^ まには Aspergillus nidulans の活性型 HAClタンパク質をコードする遺伝子
j ) Saccnaromyces cerevisiae Trichoderraa reesei、 ま 7こ f Aspergillus nidulans の活性型 HAClタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
( J Saccharomyces cerevisiae^ Trichoderma reesei、 まには Aspergillus nidulans の活性型 HAClタンパク質のァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコ一ドする遺伝子
、丄) Saccharomyces cerevisiae^ Trichoderma reesei、 ま 7こ f Aspergillus nidulans の活性型 HAClタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列か らなる遺伝子とストリンジヱントな条件下でハイプリダイズし、 かつ UPRを活性化させる 機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
( 2 ) 下記の （e) 〜 （h) から選択される RRBP1遺伝子： (e) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP lをコードする遺伝子
(f) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性 を有するァミノ酸配列からなり、 かつリポソーム結合活性を有するタンパク質をコードす る遺伝子
(g) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつリボソーム結 合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(h) ヒ ト由来またはィヌ由来の RRBP 1遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配 列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつリポソーム結合 活性を有するタンパク質をコ一ドする遺伝子
〔4〕 宿主細胞が真核細胞である、 〔1〕 から 〔3〕 のいずれかに記載の形質転換宿主細 胞。
〔5〕 真核細胞が酵母である、 〔4〕 に記載の形質転換宿主細胞。
〔6〕 酵母がメタノール資化性酵母である、 〔5〕 に記載の形質転換宿主細胞。
〔 7〕 メタノ一ル資化性酵母が Ogataea minutaである、 〔 6〕 に記載の形質転換宿主細胞。
〔8〕 酵母が Saccharomyces cerevisiaeである、 〔5〕 に記載の开質転換宿主細胞。
〔9〕 外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した、 〔1〕 から 〔8〕 のいずれかに記 載の形質転換宿主細胞。
〔1 0〕 外来タンパク質が多量体タンパク質である、 〔9〕 に記載の形質転換宿主細胞。 〔1 1〕 多量体タンパク質がヘテロ多量体である、 〔1 0〕 に記載の形質転換宿主細胞。 〔1 2〕 ヘテロ多量体が抗体またはその機能的断片である、 〔1 1〕 に記載の形質転換宿 主細胞。
〔1 3〕 〔9〕 から 〔1 2〕 のいずれかに記載の形質転換宿主細胞を培地に培養し、 培養 物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、 タンパク質の製造方法。
〔1 4〕 培養を Protein O-mannosyltransferase (PMT)活性を抑制する条件下で行うこと を特徴とする、 〔 1 3〕 に記載の製造方法。
〔1 5〕 Protein 0-mannosyltransferase (PMT)活性の抑制が、 培地に PMT活性阻害剤を添 加することにより行われる、 〔1 4〕 に記載の製造方法。
〔1 6〕 メタノ一ル資化性酵母の活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子。 〔1 7〕 下記の （a) から （d) のいずれかの遺伝子。
(a) 配列番号 23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(b) 配列番号 23に示すアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ Unfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタン パク質をコードする遺伝子
(c) 配列番号 23に示すアミノ酸列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 22に示す塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる DNAとストリン ジヱントな条件下でハイブリダィズし、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質 をコードする遺伝子
〔1 8〕 〔1 7〕 に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
〔1 9〕 pOMexPGHy/Haclである、 〔1 8〕 に記載の発現べクタ一。
〔2 0〕 活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子を含む発現ベクター。
〔2 1〕 活性型 HAC1遺伝子が、 〔1 7〕 に記載の遺伝子である、 〔2 0〕 に記載の発現べ クタ一。
し 2 2 j 活' 型 HACi遣 1 ナカ、 Saccharomyces cerevisiae、 Trichoderraa reesei^ また f Aspergillus nidulansの活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子、 またはそれらの相同 遺伝子である、 〔2 0〕 に記載の発現ベクター。
〔2 3〕 YEp351GAP-II- aHACl/pl80である、 〔2 0〕 に記載のベクター。
〔2 4〕 RRBP1遺伝子が、 ヒト若しくはィヌ由来の RRBP1遺伝子、 またはそれらの相同遺伝 子である、 〔2 0〕 に記載の発現ベクター。
〔2 5〕 〔1 8〕 から 〔2 4〕 のいずれかに記載の発現ベクターを導入した形質転換宿主 細胞。 '
〔2 6〕 活性型 HAC1遺伝子を含む発現べクタ一、及び RRBP1遺伝子を含む発現べクターを 導入した形質転換宿主細胞。
〔2 7〕 活性型 HAC1遺伝子を含む発現ベクターが 〔1 8〕 または 〔1 9〕 に記載の発現べ クタ一である、 〔 2 6〕 に記載の形質転換宿主細胞。
〔2 8〕 活性型 HAClig伝子力、 Saccharomyces cerevisiae、 Trichoderma reesei^ または Aspergillus nidulansの活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子、 またはそれらの相同 遺伝子である、 〔2 6〕 に記載の形質転換宿主細胞。
〔2 9〕 RRBP1遺伝子が、 ヒ ト若しくはィヌ由来の RRBP1遺伝子、 またはそれらの相同遺伝 子である、 〔2 6〕 に記載の形質転換細胞。
〔3 0〕 以下の行程を含む、 形質転換された宿主細胞の製造方法。
(A) 宿主細胞に対して、 活性型 HAC 1遺伝子を導入する行程
( B ) 宿主細胞に対して、 RRBP1遺伝子を導入する行程
〔3 1〕 活性型 HAC 1遺伝子が、 以下のいずれかの遺伝子である、 〔3 0〕 に記載の製造 方法：
(1) 〔1 7〕 に記載の遺伝子
(2) aaccharorayces cerevisiae^ Tricnoderma reesei、 まには Aspergillus nidulansの 活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子
) Saccharomyces cerevisiae、 Trichoderraa reesei ^ または Aspergi llus nidulansの 活性型 HAC1タンパク質のァミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するァミノ酸配 列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
K^:) Saccharomyces cerevi s iae、 Trichoderma reesei ^ または Aspergi llus nidulansの 活性型 HAC1タンパク質のァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコードする遺伝子
(o; Saccharomyces cerevisiae^ Trichoderraa reesei、 または Aspergi llus nidulansの 活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列から なる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ UPRを活性化させる機 能を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔3 2〕 RRBP 1遺伝子が以下のいずれかの遺伝子である、 〔3 0〕 に記載の製造方法：
(1) ヒ ト由来またはィヌ由来の RRBP 1をコードする遺伝子
(2) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を 有するアミノ酸配列で表され、 かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする 遺伝子
(3) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ 酸が欠失、 置換、 および/または付加されたアミノ酸配列で表され、 かつリボソーム結合 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(4) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列 からなる遺伝子とス トリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつリボソーム結合活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔3 3〕 宿主細胞が真核細胞である、 〔3 0〕 から 〔3 2〕 のいずれかに記載した製造方 法。
〔3 4〕 真核細胞が酵母である、 〔3 3〕 に記載の製造方法。
〔3 5〕 酵母がメタノ一ル資化性酵母である、 〔3 4〕 に記載の製造方法。
〔3 6〕 メタノ一ル資化性酵母が Ogataea minutaである、 〔3 5〕 に記載の製造方法。
〔3 7〕 酵母が Saccharorayces cerevisiaeである、 〔3 4〕 に記載の製造方法。
〔3 8〕 下記の （a) から （d) のいずれかの遺伝子。
(a) 配列番号 70に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(b) 配列番号 70に示すアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ Unfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタン パク質をコードする遺伝子
(c) 配列番号 70に示すアミノ酸列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 69に示す塩基配列またはそれと相捕的な塩基配列からなる DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質 をコードする遺伝子
〔3 9〕 〔3 8〕 に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
〔4 0〕 pOMexPGHy/PpHaclである、 〔3 9〕 に記載の発現ベクター。
〔4 1〕 0型糖鎖合成を抑制する条件下で、 活性型 HAC1遺伝子及び/又は RRBP1遺伝子と外 来タンパク質をコードする遺伝子とを導入した形質転換細胞を培地に培養し、 培養物から 目的タンパク質を採取することを特徴とする、 タンパク質の製造方法。
〔4 2〕 0型糖鎖合成の抑制が、 PMT遺伝子を分断することにより行われる、 〔4 1〕 に記 載のタンパク質の製造方法。 〔4 3〕 0型糖鎖合成の抑制が、 PMT活性阻害剤を培地に添加することにより行われる、 〔4 1〕 に記載のタンパク質の製造方法。
〔4 4〕 0型糖鎖合成の抑制が、 PMT遺伝子を分断し、 かつ、 PMT活性阻害剤を培地に添加 することにより行われる、 〔4 1〕 に記載のタンパク質の製造方法。
〔4 5〕 PMT活性阻害剤が、 5-[ [3，4- - phenylraethoxy) phenyl] methylene] -4-oxo-2- thioxo-3-thiazolidmeacetic acidまたは { (5Z) - 4_oxo - 5- [3_ (1 phenyiethoxy) - 4 - (2 - phenylethoxy) benzy丄 idene]— 2_thioxo—l， 3-thiazolidin-3-yl} acetic acidである、 [ 4 3〕 または 〔4 4〕 に記載のタンパク質の製造方法。
〔4 6〕 活性型 HAC1遺伝子を導入し、 PMT遺伝子を分断した形質転換宿主細胞。
〔4 7〕 宿主細胞が、 Ogataea minutaである、 〔4 6〕 に記載の形質転換細胞。 図面の簡単な説明
図 1は、 0. minuta活性型 HAC1遺伝子の取得法、 及び構造を示した図である。
図 2は、 本宪明の技術内容の概要を示した図である。
図 3は、 0. minuta活性型 HAC1遺伝子発現ベクター （pOMexPGHy/Hacl) 、 ヒト RRBP1遺 伝子発現ベクター （pOMexGPlA/pl80) 、 ヒ ト抗体遺伝子発現べクタ一 （pOMexGAT- G/Ab) の構造を示した図である。
図 4は、 0. minuta活性型 HAC1遺伝子、 ヒ ト RRBP1遺伝子を導入した抗体生産酵母株の 培養上清中に分泌された抗体のゥエスタン解析結果を示した図である。
図 5は、 0. minuta 活性型 HAC1遺伝子、 ヒ ト RRBP1遺伝子を導入した抗体生産酵母株の 抗体分泌量の測定結果を示したグラフである。
図 6は、 0型糖鎖形成が抑制された条件下で培養した 0. minuta 活性型 HAC1遺伝子、 ヒ ト RRBP1遺伝子を導入した抗体生産酵母株の培養上清中に分泌された抗体のゥエスタン解 析結果を示した図である。
図 7は、 S. cerevisiae活性型 HAC1発現ベクター （YEP351GAP - II-aHACl) 、 ヒト RRBPl 遺伝子発現ベクター （YEp351GAP- II - pl80) 、 ヒト抗体遺伝子発現ベクター （YEp352 GAP -
II-alfHc/alfLc ) 、 活性型 HAC1及び RRBP1遺伝子共発現ベクター （ YEp351GAP-II - aHACl/pl80) を示した図である。
図 8 Aは、 S. cerevisiae活性型 HAC1遺伝子、 ヒ ト RRBP1遺伝子発現ベクターを導入し た抗体生産酵母株の抗体分泌生産能を比較したグラフである。 図 8 Bは 0型糖鎖形成が抑 制された条件で、 S. cerevisiae活性型 HAC1遺伝子、 ヒ ト RRBP1遺伝子発現ベクターを導 入した抗体生産酵母株の抗体分泌生産能を比較したグラフである。 図 8 Cは、 PMT阻害剤 添加 ·無添加の条件で、 S. cerevisiae活性型 HAC1遺伝子、 ヒト RRBP1遺伝子発現べクタ 一を導入した抗体生産酵母株の抗体分泌生産能 （絶対値） を比較したグラフである。 図 9は、 コドンを変換した合成抗体遺伝子を導入した抗体生産株での抗体の生産につい てのウェスタン解析結果を示した図である。
図 1 0は、 各酵母由来の活性化 HAC1遺伝子導入抗体生産株の培養上清のウェスタン解析 結果を示した図である。
図 1 1は、 各酵母由来の活性化 HAC1遺伝子導入抗体生産株の分泌抗体の生産量を示した 図である。
図 1 2は、 PMT1遺伝子または PMT2遺伝子分断抗体生産株、 および活性化 HAC1遺伝子導入 抗体生産株の培養上清のゥエスタン解析結果を示した図である。
図 1 3は、 PMT1遺伝子または PMT2遺伝子分断抗体生産株、 および活性化 HAC1遺伝子導入 抗体生産株の分泌抗体の生産量を示した図である。
図 1 4は、 PMT4遺伝子分断抗体生産株および活性化 HAC1遺伝子導入抗体生産株の培養上 清のウェスタン解析結果を示した図である。
図 1 5は、 PMT4遺伝子分断抗体生産株および活性化 HAC1遺伝子導入抗体生産株の分泌抗 体の生産量を示した図である。
図 1 6 Aは、 PMT5遺伝子または PMT6遺伝子破壊抗体生産株の培養上清のウェスタン解析 結果を示した図である。 図 1 6 Bは、 PMT5遺伝子または PMT6遺伝子破壌抗体生産株の分泌 抗体の生産量を示した図である。
図 1 7は、 PMT2遺伝子または PMT4遺伝子を分断し、 かつ活性化 HAC1遺伝子導入した抗体 生産株を用い、 PMT阻害剤（lc)を添加して培養した培養上清のゥエスタン解析結果を示し た図である。
図 1 8 Aは、 PMT2遺伝子分断し、 かつ活性化 HAC1遺伝子導入した抗体生産株を用い、
PMT阻害剤（lc)を添加して培養した培養上清の分泌抗体の生産量を示した図である。 図 1
8 Bは、 PMT4遺伝子分断し、 かつ活性化 HAC1遺伝子導入した抗体生産株を用い、 PMT阻害 剤（ 1 c)を添加して培養した培養上清の分泌抗体の生産量を示した図である。 図 1 9は、 種々の PMT阻害剤 （ロダニン- 3_酢酸誘導体） を添加して培養した培養上清の ウェスタン解析結果を示した図である。
図 2 0は、 種々の PMT阻害剤 （口ダニン -3-酢酸誘導体） を添加して培養した培養上清の 分泌抗体の生産量を示した図である。 以下、 本発明を詳細に説明する。 本願は、 2006年 5月 16日に出願された日本国特許出願 2006- 136993号の優先権を主張するものであり、 該特許出願の明細書及び/又は図面に記 載される内容を包含する。 本発明は、 以下の 2つの構成要素より構成される。 すなわち
A. タンパク質高分泌生産に関する遺伝子の導入
B . 酵母 （およびカビ） に特有の 0型糖鎖付加の抑制
を組み合わせることにより、 タンパク質高分泌生産に関して相乗的な効果を得ることがで きる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明によれば、 タンパク質高分泌生産に用いる遺伝子、 該遺伝子を含む発現ベクター、 該発現べクタ一を導入した形質転換宿主細胞、 該形質転換宿主細胞を用いるタンパク質の 製造方法が提供される。
1 . タンパク質高分泌生産に用いる遺伝子
(1) HAC1遺伝子
本発明において、 タンパク質高分泌生産に用いる遺伝子の一つは、 HAC1遺伝子である。 HAC1遺伝子は、 ゲノム上では不活性型の HAC1遺伝子として存在するが、 小胞体ストレス時 に HAC1遺伝子により転写される mRNAが Irelpによりスプライシングを受け、 転写因子であ る HAC1タンパク質 （Haclp) をコードする mRNAに変換し、 翻訳される Haclpが Unfolded Protein Response (UPR)を活性化させる。 本発明においては、 活性型 HAC1遺伝子は HAC1タ ンパク質 (Haclp) をコードする （mRNAに相補的な） c DNAと定義する。
従って本発明の効果をより高めるためには、 活性型 HAC 1遺伝子を用いることが好ましい が、 不活性型 HAC1遺伝子の導入によっても、 ある程度の効果を得ることができる。
以下、 実際に UPRを機能させる Haclpをコードする活性型 HAC1遺伝子について述べる。 HAC1 pは N末端より、 各生物で高度に保存された DNA結合ドメイン、 ロイシン 'ジッパ —領域、 更に C末端側の Irelpにより raRNAがスプライシングされ、 新たに付加される未 知の活性領域により構成される。
本発明に用いる活性型 HAC1遺伝子としては、 活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子 であれば特に制限はされないが、 例えば、 本発明において新規に取得された Ogataea minuta (0. minuta)に由来する配列番号 23に示すアミノ酸配列、 または Pichia pastoris ( P. pastor is)に由来する配列番号 70に示すァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNAが挙げられる。 また、 当該 DNAと機能的に同等な相同 DNAであってもよい。
例えば、 相同 DNAとしては、 配列番号 23または配列番号 70に示すアミノ酸配列と少なく とも 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ Unfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；配列番号 23または配 列番号 70に示すアミノ酸列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および/ま たは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質 をコードする遺伝子；配列番号 22または配列番号 69に示す塩基配列またはそれと相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ UPRを活性化 させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
上記の 「配列番号 23または配列番号 70に示すァミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同 性を有するアミノ酸配列」 は、 好ましくは 80%以上、 より好ましくは 90%以上、 最も好ま しくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列である。 タンパク質のホモロジ一検索は、 例えば、 日本 DNAデータバンク （DNA Databank of JAPAN (DDBJ)等を対象に、 F A S T Aや B L A S Tなどのプログラムを用いて行うことができる。
上記の 「配列番号 23または配列番号 70に示すアミノ酸列において 1若しくは数個のアミ ノ酸」 における 「数個」 の数は特には限定されないが、 数個の数は特には限定されないが、 例えば 20個以下、 好ましくは 10個以下、 より好ましくは 7個以下、 さらに好ましくは 5個以 下程度を意味する。
また、 上記の 「ストリンジ工ントな条件」 とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが形成 され、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。 例えば、 相同性が高い DNA、 すなわち配列番号 22または配列番号 69に示す塩基配列と少なくとも 80%以上、 好ましくは
90%以上、 より好ましくは 95%以上の相同性を有する塩基配列からなる DNAの相捕鎖がハ イブリダイズし、 それより相同性が低い DNAの相補鎖がハイプリダイズしない条件が挙げ られる。 より具体的には、 ナトリゥム濃度が 150〜900mM、 好ましくは 600〜900mMであり、 温度が 60〜68°C、 好ましく 65°Cでの条件をいう。
上記の変異 （欠失、 置換、 および/または付加） の導入は、 Kunkel法若しくは Gapped duplex法等の当該技術分野で公知の手法、 またはこれに準ずる方法により行うことができ、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット （例えば Mutant- K (タカラ パイォ社製） 若しくは Mutant- G (タカラバイオ社製） ）、 タカラバイオ社の LA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットなどが利用できる。
上記の 「UPRを活性化させる機能」 とは、 unfolded proteinの蓄積に対する小胞体 （ER の一連の防御反応 （例えば、 転写抑制、 分子シャペロンの誘導によるフォールデイング促 進、 変性タンパクの分解、 アポトーシスによる細胞死など） を活性化させる機能をいい、
「UPRを活性化させる機能を有する」 とは、 該機能が、 配列番号 23または配列番号 70に示 すァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が有する機能と実質的に同等であ ることをいう。
また、 活性型 HAC1遺伝子は 0. minutaおよび P. pastoris以外のメタノ一ル資化性酵母でも よく、 たと ば、 Hansenulla polymorpha (Pichia angusta)、 Pichia methanolica、 Candida boidinii由来の活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。 また、 他の酵母、 カビなど他の生物種由来の活性型 HAC1遺伝子であってもよい。 たとえば、 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)由来の活性型 HAC1タンパク質 （GENBANK登録番 号： NP_116622) をコードする遺伝子 （YFL031W, 同登録番号： D26506から Irelpによりス プライシングを受けた DNA) 、 Trichoderma reesei由来の活性型 HAC1タンパク質 （同登録 番号： CAC88374) をコードする遺伝子（同登録番号： AJ413272)、 Aspergillus nidulans 由来の活性型 HacAタンパク質 （同登録番号： CAC88375) をコードする遺伝子 （同登録番 号： AJ413273) 等が挙げられる。
なお、 上 dの S. cerevisiae由来、 Tricho erraa reesei由来、 Aspergillus nidulans由来 の活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号 3 9、 4 1、 4 3に、 また対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 4 0、 4 2、 4 4に示す。
また、 今回単離された Ogataea minutaおよび Pichia pastoris由来の活性型 HAC1遺伝子 は、 Saccharomyces cerevisiae以外の酵母において初めて単離されたものであり、 このこ とから、 酵母全般、 例えばメタノール資化性酵母全般においても同種の遺伝子の存在が強 く示唆される。 従って、 これらの遺伝子もまた本発明において用いる活性型 HAC1遺伝子に 包含されるものとする。
さらに、 UPRを活性化する転写因子であれば、 上記の活性型 HAC1遺伝子に代替して用い ることが可能であり、 例えば、 動物細胞やその他の種由来の HAC1ホモログである XBP-1遺 伝子 （ヒ ト由来遺伝子は GENBANK登録番号：匪 _005080に記载） が Irelpによりスプライシ ング受け活性化された遺伝子等が挙げられる。 また、 HAC1 (XBP-1)の活性化をともなう Irelの人為的活性化も同 UPRの活性化に対応するものなので、 活性型 HAC1遺伝子の導入と 同等であると考えられる。 さらにまた、 活性化されていない HAC1遺伝子そのものを強制的 に発現させても前述のように活性型 HAC1の導入と同等の効果が得られる可能性を有すると 考えられる。
活性型 HAC1遺伝子の取得法については、 UPRを誘導した状態であれば、 いかなる方法で も取得可能である。 例えばフォールディングが困難なタンパク質をコードする遺伝子を高 発現させた細胞、 ッニカマイシン等の糖鎖修飾阻害剤、 DTT、 過酸化水素水等の酸化還元 剤や UPR誘導剤にて処理した細胞より mRNAを取得し、 これより cDNAを合成することで取得 することができる。 またすでに開示されている配列を元に、 DNA合成機を用いてその一部 または全長を合成することで取得することもできる。
(2) RRBP1遺伝子
本発明において、 タンパク質高分泌生産に用いるもう一つの遺伝子としては、 RRBP1遺 伝子が挙げられる。 RRBP1遺伝子は、 リボソーム結合タンパク 1と呼ばれるタンパク質を コードする遺伝子で、 別名、 hES、 ES130、 ES/130、 DKFZp586A1420遺伝子とも呼ばれる。 哺乳類の RRBP1遺伝子は N末の膜貫通領域、 それに引き続く塩基性ァミノ酸に富んだ領域、 10アミノ酸残基より構成される 54回のリビート領域、 C末側の領域より構成される。
本発明に用いる RRBP1遺伝子としては、 リボソーム結合タンパク 1をコードする遺伝子 であれば特に制限はされないが、 例えば、 ヒ ト由来の RRBP1遺伝子 （KIAA1398タンパクを コードする、 GENBANK登録番号： AB037819) 、 ィヌ由来の RRBP1遺伝子 （リボソーム受容体 pl80をコードする、 GENBANK登録番号： X87224) が挙げられる。 また、 上記遺伝子と機能 的に同等である限り、 その相同遺伝子であってもよい。 ヒ ト由来の RRBP1遺伝子、 ィヌ由 来の RRBP1遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号 4 5、 4 7に、 また対応するアミノ酸配 列をそれぞれ配列番号 4 6、 4 8にそれぞれ示す。
相同遺伝子としては、 例えば、 ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のァミノ酸配列と少な くとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつリボソーム結合活性を有す るタンパク質をコードする遺伝子； ヒ ト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列にお いて 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列か らなり、 かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；ヒ ト由来また はィヌ由来の RRBP 1遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる遺伝子とス トリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつリボソーム結合活性を有するタンパク 質をコードする遺伝子遺伝子が含まれる。 なお、 相同性の程度、 ストリンジェントな条件、 変異導入法は前記と同様である。
上記相同遺伝子具体的としては、 例えば、 マウス （Accession No. XM一 622097, XM_91338， XM_991888)、 ラ ッ ト （Accession No. XM— 230637 ) 、 アフ リカッメガエル (Xenopus) (Accession No. NM—001005671) 、 ゼブラフイツシュ (Danio) (Accession No. NM_199431) 由来の RRBP 1遺伝子が挙げられる。
RRBP 1遺伝子もまた、 公知の一般手法によって取得することが可能である。 例えば RRBP 1 遺伝子を発現している細胞から mRNAを調製し、 更に cDNAを合成することで得られる。
本発明において、 タンパク質高分泌生産に用いる上記遺伝子や後記の高分泌発現の対象 となる外来タンパク質をコードする遺伝子 （以下、 これらの遺伝子を 「目的遺伝子」 とい う） は、 mRNAを調製し、 逆転写酵素で cDNAを合成する一般的な方法により取得することが できる。 上記の一般的な手法としては、 例えば、 目的遺伝子が発現している細胞や組織に 由来する cDNAライブラリーを、 当該遺伝子断片をもとにして合成した DNAプローブを用い てスクリーニングすることにより単離することができる。 mRNAの調製は、 当該技術分野に おいて通常用いられる手法により行うことができる。 例えば、 上記細胞又は組織を、 グァ ジニン試薬、 フエノール試薬等で処理して全 RNAを得、 その後、 オリゴ（dT)セルロース力 ラムゃセファロース 2 Bを担体とするポリ U—セファロース等を用いたァフイエティーカラ ム法により、 あるいはバッチ法によりポリ（A) +RNA (mRNA) を得る。 さらに、 ショ糖密度 勾配遠心法等によりポリ （A+) RNAをさらに分画してもよい。 次いで、 得られた mRNAを鎳 型として、 オリゴ dTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖 cDNAを合成し、 該一本鎖 cDNAから DNA合成酵素 I、 DNAリガーゼ及ぴ RnaseH等を用いて二本鎖 cDNAを合成する。 合成 した二本鎖 cDNAを T4DNA合成酵素によって平滑化後、 アダプター （例えば、 EcoRIアダプタ 一） の連結、 リン酸化等を経て、 ； L gtll等の； Lファージに組み込んで in vivoパッケージ ングすることによって cDNAライブラリーを作製する。 また、 λファージ以外にもプラスミ ドベクターを用いて cDNAライブラリーを作製することもできる。 その後、 cDNAライブラリ 一から目的の DNAを有する株 （ポジティブクローン） を選択すればよい。
また、 また目的遺伝子をゲノム DNAから単離する場合、 あるいは、 プロモーター、 ター ミネーター領域を含む断片の単離は、 一般的手法 （Molecular Cloning (1989) , Methods in Enzymology 194 (1991) ) に従い、 採取源となる生物の細胞株よりゲノム DNAを抽出し、 目的遺伝子を選別することにより行う。 ゲノム DNAの抽出は、 例えば、 Cryer らの方法 ( Methods in Cell Biology, 12， 39 - 44 (1975) ) および P. Philippsenらの方法 (Methods Enzymol. , 194, 169-182 (1991) ) に従って行うことができる。 例えば、 採取 源が酵母の場合は、 酵母のプロトプラストを調製して、 当該プロトプラストから、 通常公 知の DNA抽出法、 高塩濃度下での細胞残さ除去後のアルコール沈殿法、 フヱノールやクロ 口ホルム抽出後のアルコール沈殿法等の常法を用いて行えばよい。
目的遺伝子の取得は、 例えば PCR法 （PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989) ) によって行うこともできる。 PCR法を用いた目的遺伝子の増幅には、 プライ マーとして 20〜30merの合成 1本鎖 DNAを、 鐃型としてゲノム DNAを用いる。 増幅された遺伝 子は塩基配列を確認した後、 用いる。
一方、 配列未知の目的遺伝子を含む断片の取得は、 （a)常法により遺伝子ライブラリー を作製し、 （b)作製された遺伝子ライブラリーから所望のクローンを選択し、 当該クロー ンを増幅する、 ことによって行うことができる。 遺伝子ライブラリ一は、 採取源となる生 物の細胞株から常法により得た染色体 DNAを適当な制限酵素によつて部分消化して断片化 し、 得られた断片を適当なベクターに連結し、 該ベクターを適当な宿主に導入することに よって調製することができる。 また、 細胞より mRNAを抽出し、 ここから cDNAを合成後、 適 当なべクターに連結し、 該べクターを適当な宿主に導入することによつても調製すること ができる。 この際用いられるベクターとしては、 通常公知の遺伝子ライブラリー調製用べ クタ一として知られるプラスミドを用いることができ、 またファージベクター又はコスミ ド等も広く用いることができる。 形質転換又は形質導入を行う宿主は、 上記ベクターの種 類に応じたものを用いればよい。 目的遺伝子断片を保持したクローンの選択は、 上記遺伝子ライブラリーから、 目的遺伝 子に特有の配列を含む標識プローブを用いるコロニー ·ハイブリダィゼーション法、 プラ ーク 'ハイブリダィゼーシヨン法等によって行う。
また目的遺伝子を化学的に全合成することもできる。 例えば相補的な 2対のオリゴヌク レオチドを作製しこれらをァニールさせる方法や、 数本のァニールされた DNAを DNAリガ一 ゼにより連結する方法、 または一部相捕的な数本のオリゴヌクレオチドを作製し PCRによ りギヤップを埋める方法等により、 遺伝子を合成することができる。
遺伝子の DNA配列の決定等は通常の方法、 例えばジデォキシ法 （Sanger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 74, 5463-5467 (1977) ) 等により行うことができる。 更に上記 DNA塩基配列の決定は、 市販のシークェンスキット等を用いることによつても容易に行い ネ る。
2 . 発現ベクター
本発明のベクターは、 上記の活性型 HAC1遺伝子、 RRBP1遺伝子をそれぞれ単独で含むベ クタ一、 あるいは、 活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子の両遺伝子を含むベクターが提供さ れる。 活性型 HAC1遺伝子、 RRBP1遺伝子を宿主細胞内で発現させるために、 各遺伝子を単 独で含むベクターをそれぞれ用いて形質転換してもよく、 また、 両遺伝子を含む一つのベ クタ一を用いて形質転換してもよい。 また、 同発現ベクターに外来タンパク質をコードす る遺伝子を含んでいてもよい。 あるいは、 外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現 ベクターを別に調製してもよく、 別に調製した場合は、 各ベクターを宿主細胞にコトラン スフェクト （共導入） する。
外来タンパク質をコードする遺伝子としては、 特に限定はされないが、 例えば、 α -ァ ミラーゼ遺伝子、 α -ガラクトシダーゼ遺伝子等の各種酵素遺伝子、 また医薬上有用な生 理活性タンパク質であるィンターフェロン 、 インターフェロン γ等の各種ィンターフェ ロン遺伝子、 IL1、 IL2等の各種インターロイキン遺伝子、 エリスロポエチン （EP0) 遺伝 子、 顆粒球コロニー刺激因子 （G- CSF) 遺伝子等の各種サイト力イン遺伝子、 成長因子遺 伝子等が挙げられる。 これらの遺伝子はいかなる手法によって得られるものでもよい。 本発明は特に疎水性の高いタンパク質、 複合体を形成するような分泌生産が困難なタン パク質に対して有効であり、 よって、 上記の外来タンパク質には、 多量体タンパク質、 例 えば、 抗体またはその機能的断片であるへテロ多量体が含まれる。
活性型 HAC1遺伝子、 RRBP1遺伝子、 及び外来タンパク質をコードする遺伝子は、 発現制 御領域を適宜付加してタンパク質発現ュニットとして発現ベクターを構築してもよい。 タ ンパク質発現ユニットは、 転写の読み枠の方向に、 少なくともプロモーター領域、 上記遺 伝子、 転写ターミネータ一領域を有するものである。 ここで使用し得るプロモータ一とし ては、 誘導発現プロモーターであっても、 構成発現プロモーターであってもよい。 誘導発 現プロモーターとしては、 例えばメタノール資化性酵母におけるメタノール代謝に関わる、 アルコールォキシダーゼ（A0X)遺伝子プロモーター、 ジヒ ドロキシァセトン · シンターゼ (DAS)遺伝子プロモーター、 ギ酸脱水素酵素 （FDH) 遺伝子プロモーター等が挙げられる。 また他の誘導プロモーターとしては銅誘導 （CUP) プロモーター等も用いることができる。 構成発現プロモーターとしては、 例えばダリセルアルデヒド - 3 -リン酸脱水素酵素 （TDH、 GAP) 遺伝子、 ホスホグリセ口キナーゼ （PGK) 遺伝子、 トリオースリン酸イソメラーゼ (TPI ) 遺伝子、 エノラーゼ （EN0) 遺伝子、 ァクチン （ACT) 遺伝子、 シトクロム c (CYC) 遺伝子、 トレハロース合成酵素 （TPS) 遺伝子、 アルコール脱水素酵素 （ADH) 遺 伝子等のプロモーターなどが挙げられる。 また転写ターミネータ一は、 プロモーターから の転写に対して転写終結を起こす活性を有する配列であればよく、 プロモーターの遺伝子 と同じまたは異なる遺伝子のものであってもよい。
外来タンパク質を高分泌生産させるためには強力なプロモーターを用いることが必要で あるが、 高活性なプロモーターを用いてフォールドしにくいタンパク質や、 分泌されにく いタンパク質の生産を試みた場合、 かえって分泌不全が起こることがある。 これは、 タン パク質の生産が、 翻訳が行われるリポソーム、 フォールディング ·分泌が行われる小胞体 のキャパシティを越えることにより、 過剰に生産されたタンパクが細胞内で変性し、 蓄積、 ュビキチン化され、 プロテオソームにて分解するような状況になるためである。 従って、 生成するタンパク質が変性しァグリゲーシヨンを起こさない、 または生産されたタンパク 質が分泌能のキャパシティを越えなレ、程度の発現量を達成できるプロモーターを適宜採択 するか、 あるいは活性を弱めるなどの調整を行って使用することが好ましい。 多量体タン パク質の中でも、 ヘテロ多量体を形成する分子は上記の影響を受けやすく、 特に抗体のよ うな分子は重鎮、 軽鎖が 2分子ずつ会合したヘテロ 4量体であるため、 適切に会合させる ためには発現度は重要な因子である。 また、 活性型 HAC1遺伝子の発現が強すぎる場合、 細 胞にストレスがかかりすぎてかえって増殖を阻害することもあるので上記と同様にプロモ 一ター活性の調整、 最適化が必要である。
また、 本発明の発現ベクターには、 形質転換体を選抜するための選択マーカーを含める ことができる。 例えば、 酵母用発現ベクターには、 Hisl、 His2、 His3、 His4、 His5、 His6、 Leu2、 Algl、 Alg2、 Alg3、 Trpl、 Lys2、 Adel、 Ade2、 Ura3、 Ura5遺伝子等から選ばれる栄. 養要求性マーカー遺伝子を用いることができる。
また、 選択マーカーとしては、 上記の栄養要求性マーカーのみならず、 .セルレニン、 ォ 一レオバシジン、 ゼォシン、 力ナパニン、 シクロへキシミ ド、 ハイグロマイシン、 ブラス トシジン、 テトラサイクリン、 カナマイシン、 アンピシリン、 テトラサイクリン、 ネオマ ィシンなどの薬剤に対して耐性を付与する薬剤耐性マーカーなどを使用することで、 形質 転換体の選抜を行うことも可能である。 また、 エタノール等に対する溶剤耐性や、 グリセ 口一ルゃ塩等に対する浸透圧耐性、 銅等の金属ィォン耐性等を付与する遺伝子をマーカ一 にすることで、 形質転換体の選抜を行うことも可能である。
3 . 形質転換宿主細胞
本発明の形質転換宿主細胞は、 前記 1 . の遺伝子を有する形質転換宿主細胞、 あるいは 前記 2 . 発現べクタ一を導入した形質転換宿主細胞である。
形質転換させる宿主細胞としては、 真核細胞、 好ましくは酵母である。 酵母としては、 Ogataea minuta、 Pichia pastoirs、 Hansenul丄 a polyraorpha ( Pichia angusta ) 、 Candida boidinii等のメタノール資化性酵母株、 あるいは Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis、 Yarowia lipolytica^ Shizosaccharomyces pombe等の酵母抹3 挙げられる。 よ り 具体的には、 Ogataea minuta株と して Ogataea minuta YK3株 Δ ochl Δ pep4 Δ prbl Δ ypsl Δ ura3 Δ adel ) 、 Saccharomyces cerevisiae と し て Saccharomyces cerevisiae BY4741株 （MATa A his3 A leu2 A metl5 A ura3) 等を用いる ことができるが、 これらに限定はされない。
さらに、 本発明は分泌に必須である ERを補強した宿主細胞を得ることを目的としている ため、 動物細胞やその他の細胞にも適用可能である。
本発明において、 宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、 導入遺伝子が宿主内 にて安定に存在し、 かつ適宜発現させることができる方法であればいかなる方法でもよく、 一般的に用いられている方法、 例えば、 リ ン酸カルシウム法 （Ito et al. , Agric. Biol. Chem. , 48, 341 (1984) ) 、 エレク ト口ポレーシヨン法（Becker, D. M. et al. (1990) Methods. Enzyraol. , 194, 182-187)、 スフエロプラス ト法 （Creggh et al. , Mol. Cell. Biol. , 5， 3376 (1985) ) 、 酢酸リチウム法（Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168)、 リポフエクシヨン法等が挙げられる。
4 . タンパク質の製造方法
本発明におけるタンパク質の製造は、 上記の形質転換宿主細胞を公知の方法により培養 し、 その培養物から採取し、 精製することにより行うことができる。 「培養物」 とは、 培 養上清のほか、 培養細胞、 培養菌体、 または細胞若しくは菌体の破碎物のいずれをも意味 するものである。
形質転換宿主細胞を培地に培養する方法は、 その宿主細胞の培養に用いられる通常の方 法に従って行うことができる。
形質転換宿主細胞が酵母などの微生物の場合は、 培養する培地としては、 微生物が資化 し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行うことがで きる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。 炭素源としては、 該微 生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクトース、 スクロース、 デンプン 等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール等のアルコー ル類が用いられる。 窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニゥム塩又は その他の含窒素化合物のほか、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスチープリカー等が用いられ る。 無機塩類としては、 リン酸第一力リウム、 リン酸第二力リウム、 リン酸マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシゥ ム等が用いられる。 また、 培地には、 選択マーカーの種類に応じ、 オーレォバシジン、 ァ ンピシリン、 テトラサイクリン等の抗生物質を適宜添加するか、 あるいは、 栄養要求性を 相補する遺伝子 （Leu、 Ura、 Trp等） によって供給可能となるアミノ酸を除いてもよレ、。 形質転換宿主細胞の培養は、 例えば酵母の場合、 培地の PHは 4〜7に調整するのが適当で ある。 また、 培養温度は 15〜32°C、 好ましくは 28°C前後である。 抗体のように立体構造が 複雑なタンパク質を発現する場合、 細胞内でそのフォールデイングをより効率的に行うた めに、 低温で培養することが好ましい場合もある。 培養時間は、 24〜1000時間程度であり、 培養は静置、 振とう、 攪拌、 通気下の回分培養または連続培養等により実施することがで きる。
上記の培養物 （培養液、 培養菌体） から外来タンパク質遺伝子の発現産物の確認は、 SDS-PAGE、 ゥエスタン解析、 ELISA等により行うことができる。
また生産されたタンパク質を単離精製するためには、 通常のタンパク質の単離、 精製法 を用いればよい。 培養後、 目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、 菌 体又は細胞を超音波破砕機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノ ミル等により破碎することにより、 目的タンパク質を採取する。 また、 目的タンパク質が 菌体外又は細胞外に生産される場合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等によ り菌体又は細胞を除去する。 その後、 有機溶媒による抽出等により目的タンパク質を採取 し、 必要に応じて各種クロマトグラフィー'（疎水性クロマトグラフィー、 逆相クロマトグ ラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一法、 イオン交換クロマトグラフィー等） 、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法などの手法を 単独あるいは組み合わせて用いて単離精製すればよい。
上記の培養法、 精製法は一例であって、 これらに限定されるものではない。 なお、 精製 された遺伝子産物が有するアミノ酸配列の確認は、 公知のァミノ酸分析、 例えばェドマン 分解法による自動アミノ酸配列決定法等により行うことができる。
5 . 0型糖鎖の抑制方法 （または PMT活性の抑制方法）
本発明において、 宿主細胞として酵母を用いる場合、 上記の培養を Protein 0- raannosyltransf erase (PMT)活性を抑制する条件下で行うことがより好ましい。
哺乳類での 0型糖鎖の形成は、 主にゴルジ体に存在する Peptide 0-GalNAc transferase によって GalNAcが付加されることにより行われる。 この糖鎖付加は、 タンパク質のフォー ルディング後に起こる。 これに対し、 酵母およぴカビでの 0型糖鎖の形成は、 PMT遺伝子が コードする Protein-0 - mannosyltransferase (PMT) によってタンパク質のセリンまたはト レオニン残基にマンノースが付加されることにより始まる。 この付加反応を PMT活性とい う。 このマンノース付加は、 細胞中の小胞体 （ER) においてタンパク質のフォールディン グと並行して行われるため、 哺乳類由来のタンパク質発現では本来起こらない部位に不要 な糖鎖が付加されることがある。 その結果、 不要な修飾に起因する、 会合体の形成不全、 活性の低下をもたらす。
従って、 培養を Protein O-mannosyltransf erase (PMT)活性を抑制する条件下で行うこ とによって、 不要な 0型糖鎖形成を抑制でき、 ひいては、 タンパク質同士の会合を促進し、 タンパク質が本来有する物性 ·活性を保持することが可能となる。 本発明における活性型 HAC1遺伝子及び/又は RRBP遺伝子の導入によるタンパク質の高分泌生産の効果は、 UPRに より増大する 0型糖鎖形成を PMT活性の抑制によって制御することによって、 更に相乗的な 効果を生むことができる。
酵母およぴカビに特有の 0型糖鎖付加を抑制する方法としては、 例えば以下の 2点が考え られる。 またこれらの方法を組み合わせることもできる。
( 1 ) 酵母および力ビに特有の 0型糖鎖付加反応を行う PMT活性を抑制する条件下で培 養及ぴ生産を行う。
( 2 ) 酵母および力ビに特有の 0型糖鎖付加反応を行う PMT活性が抑制された細胞を用 レ、る。
上記 （1 ) の Protein O-mannosyltransferase (PMT)活性の抑制方法は、 例えば、 培地 に PMT活性阻害剤 （PMT阻害剤） を添加することにより行うことができる。 PMT活性阻害剤 と しては、 例えば、 ロダニン- 3 -酢酸誘導体 （Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters 14, p3975- 3978 (2004)等を用いることができる。 より具体的には、 ロダニン- 3- 酢酸読辱体として、 5- [ [3, 4- (1-phenylraethoxy) phenyl] methylene] -4-oxo-2-thioxo-3- thiazolidineacetic acid ( Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p3975, (2004)中の化合物 （ lc ) または { (5Z) _4- oxo-5- [3- (l_phenylethoxy) - 4- (2- phenylethoxy) benzyl idene]-2-thioxo-l, 3-thiazolidin-3-yl} acetic acid ( Bioorganic
& Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p3975, (2004)中のィヒ合物 （5a)が挙げられる。 上記 PMT活性阻害剤 （ロダニン - 3_酢酸誘導体） は元々、 抗菌剤として検討されたものであ り、 タンパク質の品質および生産性の向上のために検討されたものではなく、 本発明にお いて初めてその効果が見出された。 PMTは酵母細胞壁を構成するマンノプロテインの生成 に重要であり、 PMT活性を低下させすぎた場合、 酵母の生育に影響を与える。 従って誘導 発現系を用いる場合には、 PMT活性阻害剤を、 細胞の増殖後、 外来タンパク質遺伝子の発 現時に添加することがより効果的であり、 0型糖鎖修飾が抑制された質の高い目的タンパ ク質を最大限に生産できるであろう。
また、 上記 ( 2 ) の Protein O-mannosyltransf erase (PMT)活性の抑制方法は、 PMT遺伝 子自体を破壌、 または遺伝子の発現を抑制することによつても可能である。 S. cerevisiae において PMTは、 PMT1遺伝子 (Genbank： L19169) 、 PMT2遺伝子 (Genbank： L05146) 、 PMT3遺伝子 ( Genbank： X83797 ) 、 PMT4遺伝子 （Genbank： X83798 ) 、 ΡΜΤδ遺伝子 (Genbank： X95644) 及ぴ PMT6遺伝子 （Genbank： Z72984) の少なくとも 6遺伝子によつ てコードされており、 それぞれがホモ二量体 （PMT4p) やへテロ二量体 （ΡΜΤ1ρ/ΡΜΤ2ρ) を 形成して活性を有する。 また糖タンパク質により作用する PMTが異なっていることが知ら れている。 本発明においては、 抗体への 0型糖鎖付加に関して、 PMTタンパクに選択性があ ることを見出した。 すなわち実施例に記載のように PMT5または PMT6遺伝子破壊株では 0型 糖鎖付加抑制の効果はなかつた。
上述のように PMTは酵母の生育にとって重要な遺伝子であり、 PMT遺伝子の破壊等、 活 性を消失、 または極度に低下させた場合は、 細胞壁が卑弱になるので、 PMT遺伝子の破壌 株の利用については注意を要する。 必ずしも、 W02002/046437に示されるように PMT遺伝子 を破壊することは有効でなく、 時として生育阻害により外来タンパク質の生産に悪影響を 与える場合があり、 目的のタンパクの 0型糖鎖の付加修飾を最低限に抑えるような、 最適 な PMT活性を有する PMT遺伝子の破壊あるいは発現抑制が求められる。 PMT遺伝子を抑制す る方法としては、 例えばアンチセンス RNAや RNAiを利用する方法、 プロモーターを減弱化 させる方法等が示される。 本発明の例では、 プロモーターを減弱化させる方法として、 PMT構造遺伝子部分とプロモーター領域に DNA断片を揷入し、 遺伝子を分断 （以下、 遺伝子 分断と称する場合がある。 また遺伝子分断を行うためのプラスミドベクターを遺伝子分断 ベクターと称する。 ) する方法を示している。 また PMT活性は有しないがタンパクとして 生成されるような PMT遺伝子断片や活性に関与するアミノ酸残基に変異を加えた遺伝子を 導入し、 PMT活性を抑制する方法 （ドミナント 'ネガティブ） も利用できる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を具体的に説明する。 ただし、 これらの実施例は本発明の技 術的範囲をなんら限定するものではない。 本発明の実施例で用いるプラスミド，制限酵 素, DNA修飾酵素等は市販のものであり、 常法に従って使用することができる。 また、 DNA のクローユング, 塩基配列の決定， 宿主細胞の形質転換， 形質転換宿主細胞の培養， 得ら れる培養物からの酵素の採取， 精製等に用いた操作についても当業者によく知られている ものである力 文献により知ることのできるものである。
〔実施例 1〕 外来遺伝子発現プラスミ ドの構築
( 1 ) G418而忖生遺伝子をマーカーとした A0X1遺伝子プロモーター、 ターミネータ一力セッ トと GAP遺伝子プロモーター、 ターミネータ一力セットからなる外来遺伝子発現タンデム ベクターの構築
¾¾2003/0914；31に記載の pOMex3G、 及び pOMexGPlUを材料に用いた。 p0Mex3Gを Xbalで切断 し、 平滑末端処理後、 Spelリンカ一を導入した。 得られたベクターを p0Mex3GXSと命名し た。 一方、 pOMexGPlUを EcoT22Iで切断し、 平滑末端処理後、 Apalリンカ一を導入した。 得 られたベクターを pOMexGPlUTAと命名した。 pOMexGPlUTA を HindIII-ΚρηΙで消化し、 平滑 末端処理後単離した GAPプロモーター、 ターミネータ一を含む約 2. 0 kbの断片を、 Apalで 消化し、 平滑末端処理した P0Mex3GXSに導入した。 得られたベクターを pOMexGAT - Gと命名 した。 pOMexGAT- Gは A0X1発現カセット内に Spel-BamHIサイト、 GAP発現カセット内に Sall-
Apalサイトを持つ、 タンデムベクターである。
( 2 ) ADE1遺伝子を選択マーカーとした GAP遺伝子プ口モータ一及びタ一ミネ一ターによ る外来遺伝子発現ベクターの構築
W02003/091431に記載の pOMex4Aを材料に用いた。 上記 pOMexGPlUを EcoT22Iで処理し、 平 滑末端処理後、 BamHIリンカ一を導入した。 得られたベクターを p( exGP2Uと命名した。 pOMexGP2Uを Sailで処理し、 平滑末端処理後、 Spelリンカ一を導入した。 得られたベクタ 一を p0MexGP3Uと命名した。 p0MexGP3Uを Hindlll - Kpnlで消化し、 GAP発現カセットを含む 約 2. 0 kbの断片を単離した。 この断片を、 pOMex4Aを Hindlll- Kpnlで処理し、 単離した
ADE1マ一カーを含む約 5. 0 kbの断片とライゲ一ションした。 得られたべクターを pOMexGPlAと命名した。 pOMexGPlAは GAP発現カセット内に Spel- BamHIサイトを持つ外来遺 伝子発現ベクターである。
( 3 ) ハイグロマイシン B耐性遺伝子を選択マーカーとしたホスホダリセリンキナーゼ
(PGK1) プロモーター及びターミネータ一による外来遺伝子発現べクタ一の構築
Ogataea minuta IF010746株よりホスホグリセリンキナーゼをコ一ドする PGK1遺伝子の 取得、 及びその塩基配列決定を行った。
( 3 - 1 ) プローブの作成
Saccharomyces cerevisiae (GENBANK登録番号； P00560)及ぴ Candida raaltosa (GENBANK 登録番号； P41757)由来の保存されているアミノ酸配列 RVDFNVPLD, EGKELPGVAに対応する 塩基配列の DNA縮重プライマーを以下のように合成した。
PPG5： 5' -GN GTN GAY TTY AAY GTN CCN TTR GA- 3' (配列番号 1 )
PPG3 : 5' -GY NAC DCC NGG YAA YTC YTT DCC YTC-3' (配列番号 2 )
プライマー PPG5 (配列番号 1 ) はァミノ酸配列 RVDFNVPLDに対応し、 プライマー PPG3
(配列番号 2 ) はアミノ酸配歹 IJEGKELPGVAに対応する塩基配列の相捕鎖の配列である。 0. minuta IF010746株の染色体 DNAを铸型とし、 プライマー PPG5、 PPG3を用いて、 PCR[94°Cで 30秒、 50°Cで 1分、 72°Cで 1分） X 25サイクル]を行った。 増幅された約 1. 2kbの DNA断片を 回収し、 T0P0 TA Cloning Kitを用いてクローニングした。 得られたクローンよりプラス ミ ド DNAを単離し、 塩基配列を決定することで、 プラスミ ドの揷入 DNA断片に、 S. cerevisiae及び C. maltosa由来の PGK1遺伝子のアミノ酸配列と高い相同性を持つアミノ酸 配列をコードする塩基配列を有するクローンを選抜した。 1. 2kbの挿入 DNA断片は、 プラス ミドを EcoRIで切断し、 ァガロース電気泳動後、 回収した。
( 3 - 2 ) ライブラリーの作成、 及びスクリーニング
0. minuta IF010746株の染色体 DNAを種々の制限酵素で切断し、 0. 8%ァガロースゲル電 気泳動を行った。 分離した DNAを Hybond N+ナイロンメンブレン（アマシャム社）にトランス ファーした。 上記 ( 1 - 3 - 1 ) で得られた DNA断片を AlkPhos DIRECT (アマシャム） を 用いて標識し、 サザンハイブリダィゼーシヨンを行った。 ハイブリダィゼーシヨンは、 常 法 ( Molecular cloning 2nd edn. , ed. Sambrook, J. , et al. , Cold Spring Harbor
Laboratory U. S. A. , 1989) に従って行った。 その結果、 約 9. 0 kbの BamHI断片に PGK1遺伝 子が存在すると考えられた。 そこでその DNA断片をクロ一ユングすべく、 ゲノムライブラ リーを作成した。 0. minutaの染色体 DNAを BamHIで切断し、 ァガロース電気泳動後、 約 9. 0 kb付近の DNA断片をゲルから回収した。 回収した DNA断片を BamHIで切断した pUC118とライ ゲーシヨンした後、 Hanahanの方法 （Gene, 10， 63 (1980) ) で大腸菌 DH5 α株に形質転換 して、 ライプラリーを作成した。 約 4000クローンを前述の DNA断片をプローブとしたコロ ニー ·ハイプリダイゼーションによりスクリ一ユングした。 得られた陽性クローンの中か ら、 PGK1遺伝子を保持したプラスミド pOMPGKlを選抜した。
( 3 - 3 ) 塩基配列決定
プラスミド pOMPGKl 内の BaraHI領域間塩基配列を、 プライマーウォーキング法によって 決定したところ、 配列番号 3に示す塩基配列を有していた。 配列番号 3の塩基配列には、 4766番目カゝら始まり、 6016番目で終わる 1254塩基対からなるオープンリーディングフレー ムが存在する。 このオープンリーディングフレームから推定される配列番号 4に示すァミ ノ酸酉己歹 Ijと Saccharomyces cerevisiae及ぴ Candida maltosa由来のホスホグリセリンキナ ーゼとの相同性を調べたところ、 それぞれ 74%、 81%であった。
( 3 - 4 ) PGK1遺伝子プロモーターとターミネ一ターとを使った外来遺伝子発現カセット の構築
0. minutaの PGK1遺伝子プロモーターを含む断片とターミネータ一を含む断片との間に 外来遺伝子を導入する発現カセットを作製した。 PGK1遺伝子プロモーターとターミネータ 一との間に Spel、 BglII、 BamHI部位を導入するために、 以下のプライマーを合成した。 0PGK-P-F： 5' -AAGCTTGACAATGTAGGAGATCATAAACACATCGTGCGCGTC-3' (配列番号 5 )
0PGK-P-R ： 5， -GGATCCAGATCTCATATGACTAGTTGCTAGTTCTATGCGGCGTTAGTGTTTACACTACGACAGCT- 3' (配列番号 6 )
0PGK-T-F： 5' -GGATCCGTGGGATTTGCGTGATCTACGTAGTGGTTATTTT-3' (配列番号 7 )
0PGK-T-R： 5' -GGTACCGCAGTGAAAGGCGATGCCACCATGTGCAAGGAGTTC-3' (配列番号 8 )
上記 pOMPGKlを鍚型とし、 プライマー 0PGK-P-F (配列番号 5 ) と 0PGK-P - R (配列番号 6 ) を用いた PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） X 20サイクル]、 プライマー 0PGK - T-F (配列番号 7 ) と 0PGK- T-R (配列番号 8 ) を用いた PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°C で 1分） X 20サイクル]を行った。 それぞれ増幅された 1. 5 kb、 1. 0 kbの DNA断片を回収し、 T0P0 TA Cloning Kitを用いてクローユングした。 揷入 DNA断片の塩基配列を決定し、 正し い塩基配列を有するクローンを選抜した。 1. 5 kb、 1. 0 kbの挿入 DNA断片はそれぞれ、 Hindlll - BamHI断片及び BamHI-Kpnl断片として単離した。
W02003/091431に記載の p0Mex5Hの BaraHI- Kpnl間に、 上記 1. 0 kbの BamHI-Kpnl断片を導入 した。 その後得られたプラスミドの Hindlll- BamHI間に、 上記 1. 5 kbの Hindlll- BamHI断片 を導入した。 得られたプラスミ ドを pOMexPGHyと命名した。 pOMexPGHyは PGK1遺伝子発現力 セット内に Spel、 BglII、 BamHI部位を持つ外来遺伝子発現ベクターである。 〔実施例 2〕 抗体遺伝子発現べクタ一の構築
S. cerevisiae由来の MF alphal (GENBANK登録番号； P01149)の分泌シグナル（以下 aMF分 泌シグナル）をクローニングするため下記のプライマ一合成した。
Sp-aMFs-F： 5， - ACTAGTATGAGATTTCCTTCAATTT- 3， （配列番号 9 )
Sl-aMFs-F： 5' -GTCGACATGAGATTTCCTTCAATTT-3' (配列番号 10)
Xb-aMFs-R： 5' -AGCTTCAGCCTCTCTTTTATCTAGAGA-3' (酉 S列番号 11)
前述と同じ方法で取得した S. cerevisiaeのゲノム DNAを鏡型とし、 プライマー Sp-aMFs_ F (配列番号 9) と Xb- aMFs- R (配列番号 11) を用いた PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 30秒） X 20サイクル]、 プライマー SI- aMFs- F (配列番号 10) と Xb- aMFs-R (配列番号 11) を用いた PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 30秒） X 20サイクル]を行った。 それぞれ増 幅された約 0. 3 kb の DNA断片を回収し、 T0P0 TA Cloning Kitを用いてクローユングした。 揷入 DNA断片の塩基配列を確認し、 得られたプラスミ ドを、 それぞれ TOPOaMFsSPと TOPOaMFsSLと命名した。
抗体遺伝子は、 抗 TRAILレセプター抗体遺伝子（W02002/094880)を用いた。 軽鎖、 及ぴ重 鎖遺伝子の両端に制限酵素サイトを導入するため、 下記のプライマーを合成した。
Xb-KREAEA-Hc-F： 5， -TCTCTAGATAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGCTGCAGCTGCAGGAGTC-3' (配列番号 12)
Hc-R-Bg： 5， -CCAGATCTGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3' (配列番号 13)
Xb-KREAEA-Lc-F： 5， -TCTCTAGATAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAAATTGTGTTGACACAGTC-3' (配列番号 14)
Lc-R-Ap： 5' -AAAGGGCCCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCT-3' (配列番号 15)
これら DNAプライマーを用いて PCRにて軽鎖 [94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） X 20 サイクル]、 重鎖 [94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分 30秒） X 20サイクル]を増幅し、 pCR2. 1- T0P0にクロ一ニングした。 揷入 DNA断片の塩基配列を確認し、 得られたプラスミド をそれぞれ TOPOHc-Trailと TOPOLc - Trailと命名した。 TOPOaMFsSL から Sall-Xbal消化で単 離した aMF分泌シグナルと、 TOPOLc- Trailより Xbal - Apal消化で単離した抗体軽鎖を、
Sail- Apalで消化した pOMexGAT- Gに 3点ライゲーションで導入した。 得られたプラスミドを pOMexGAT - G/Lと命名した。 次に TOPOaMFsSPから Spel - Xbal消化で単離した aMF分泌シグナ ルと、 TOPOHc- Trailより Xbal- Bglll消化で単離した抗体重鎖を、 Spel - BamHIで消化した pOMexGAT-G/Lに 3点ライゲーシヨンで導入した。 得られたベクターを pOMexGAT - G/Abと命名 した （図 3 ) 。 pOMexGAT-G/Abは抗体重鎖と軽鎖の両発現ユニット保持した抗体発現べク ターである。
〔実施例 3〕 0. mirnita活性型 HAC1遺伝子発現ベクターの構築
活性型 HAC1遺伝子の取得は、 細胞 （0. minuta YK2- 3株） を YPD培地で 27°Cにて 12時間培 養後、 UPRを誘導すべく培地中に 10 g/mlとなるようッニカマイシンを添加した。 ツユ力 マイシン添加培中にて更に 12時間培養を行い、 集菌後、 Yeastar RNA kit (ZYMO research)を用いて mRNAを調製した。
得られた mRNAを DNase I Amplification Grade (インビトロジェン）で DNase処理した。 この mRNAより Super script III First-Strand Synthesis for RT (インビトロジェン）を 用いて cDNAを合成した。 この cDNAを以下に記載の DNAプライマー HAC1-1 (配列番号 16) 及 び HAC1-12 (配列番号 17) を用いた PCR[94°Cで 30秒、 52°Cで 30秒、 72°Cで 1分） X 30サイク ル]にて増幅し、 PCR2. 1- T0P0 (インビトロジェン） にクローニング後、 PCRで増幅された 2 種類の遺伝子断片由来の塩基配列を確認した （配列番号 18、 19) 。
HAC1-1： 5， -ATGACTTCCTTTTCAGCACCGCATC-3' (配列番号 16)
HAC1-12： 5' -CAAAATTGCAAGCAAGTTAACCG-3' (配列番号 17)
取得された 2種類の cDNA断片のうち、 1つはゲノム配列と一致したが、 もう一方は一部 欠損し、 短くなつており、 UPRによって活性化した Irelpによりスプライシングを受けた cDNA断片であった。 活性化した HAC1の cDNAを取得するため、 下記の DNAプライマー speHACIF (配列番号 20) 及び bglHAClR (配列番号 21) と上記活性化した HAC1の cDNAが存在 すると考えられる cDNAプールを用いて PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 30秒） X 20サ ィクル]を行った。
speHACIF： 5' -gactagtATGACTTCCTTTTCAGCACCG-3' (配列番号 20)
bglHAClR： 5' -cagatctTCATGACAAGAAATCATCGAAT-3' (配列番号 21)
得られた約 lkb断片は活性型 HAC1遺伝子の開始コドンから終始コドンまでを含んでおり
(配列番号 22) 、 これは 320アミノ酸からなる活性型 HAClpのアミノ酸配列に相当する （配 列番号 23) 。 これを Spel-Bglll処理し、 単離後、 Spel-Bglll処理を施した pOMexPGHyに導 入した。 得られ'たベクターは pOMexPGHy/Haclと命名した （図 3 ) 。 このベクターは活性型 HAC1遺伝子発現ュニットを保持している。
〔実施例 4〕 ヒ ト RRBP1遺伝子発現ベクターの構築
RRBP1遺伝子については、 かずさ DNA研究所より分譲を受けたヒ ト RRBP1遺伝子
(KIAA1398, GENBANK Accession No. AB037819) を用いた。 この遺伝子に両端に制限酵素 サイトを導入するため、 下記の DNAプライマー pl80 MSp- F、 pl80 UBg-R (配列番号 24及ぴ 25) とヒト RRBP1遺伝子を用いて PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 5分 X 20サイクル]に て増幅した。
pl80 MSp-F： 5' -ATACAATACAAAGTCGAGACTAGTATGGATATTTACGACACTCAAACCTT-3' (配列番号 24)
pl80 UBg-R： 5' -TCTATCCACACGGATCAGATCTTCAGACAGAGGTGCCCTCCTTTGAGCTG-3' (配列番号 25)
得られた約 4. 5 kbの断片を Spel- BamHI処理した pOMexGPlAに BD In- Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit (BD サイエンス）を用いて導入し、 Spelサイトからヒト RRBP1遺伝子の開始コ ドンをコードする領域を含む約 500 bp、 また BamHIサイトからヒト RRBP1遺伝子の終始コド ンをコー ドする領域を含む約 500 bpの配列を決定した。 得られたベクターを pOMexGPlA/pl80PCRと命名した。 pOMexGPlA/pl80PCR を Ndel-Ascl で消化し、 ヒト RRBP1遺 伝子 0RF中 110 bpから 4541 bpまでを含む断片を除去した。 一方、 かずさ DNA研究所より分 譲を受けたヒト RRBP1遺伝子を Ndel - Asclで消化して得られた、 0RF中 110 bpから 4541 bpま でを含む断片を単離し、 先の Ndel-Asclで消化した p0MexGPlA/pl80PCRに導入した。 得られ たベクターを pOMexGPlA/pl80と命名した （図 3 ) 。 p0MexGPlA/P180はヒ ト RRBP1遺伝子発 現用ベクターである。
〔実施例 5〕 抗体発現酵母株 （0. minuta) の作成
Not Iで消化したベクター pOMexGAT- G/Abを用いて、 エレク トロポレーシヨンにより 0. minuta YK- 3株 （ Δ ochl A pep4 A prbl A ypsl A ura3 Δ adel : W02003/091431に記載） を形質 転換した。 なおエレクトロボレ一シヨンの条件は、 W02003/09143lに記載のものを採用し た。 形質転換された細胞は 50 ^ g/mlの G418を含む YPD寒天プレート培地にて選択し、 培養 後、 ゲノムを抽出し、 前述の DNAプライマー Xb-KREAEA - He (配列番号 12) と Hc-R- Bg (配列 番号 13) を用いた PCRによって重鎖の導入を、 Xb- KREAEA-Lc-F (配列番号 14) と Lc- R - Ap (配列番号 15) を用いた PCRによって軽鎖の導入を確認した。 重鎖、 軽鎖両遺伝子の導入 が確認された株を抗体生産株 0. minuta A01株と命名した。
〔実施例 6〕 活性型 HAC1遺伝子及び RRBP1遺伝子を発現する抗体生産酵母株 (0. minuta) の作成
実施例 5 にて育種した抗体生産株 0. minuta A01株に Sse8783Iで消化した P0MexGPlA/pl80を上記のエレクトロポレーション法にて導入した。 形質転換株は SD寒天プ レート培地にて ADE+株を選択し、 培養後、 ゲノムを抽出し、 RRBP1遺伝子の導入を上記の pl80 MSp-F (配列番号 24) と pl80 UBg - R (配列番号 25) を用いた PCRにて確認することで 取得した。 得られた形質転換体を 0. minuta AK2R株と命名した。 同時にコントロールとし て Sse8783Iで消化した pOMexGPlAを用いて形質転換し、 0. minuta AK2A株を得た。 更に 0. minuta AK2R株、 0. minuta AK2A株に Aor51HIで消化した pOMexPGHy- Haclを上記エレクトロ ポレーション法によつて導入した。 形質転換株の活性化 HAC1遺伝子の導入は、 Hygromycineを 50 μ g/mlとなるよう添カ卩した YPD寒天プレート培地にて選択し、 培養後、 ゲ ノムを抽出し、 上記の DNAプライマー speHACIF (配列番号 20) と bglHAClR (配列番号 21) を用いた PCRにて確認した。 得られた株を 0. minuta AK3RH及び 0. minuta AK3AH株と命名 した。 同時にコントロールとして Aor51HIで消化した pOMexPGHy をそれぞれ 0. minuta AK2R株、 0. minuta AK2A株に導入し、 0. minuta AK3RHy株、 0. minuta AK3AHy株を得た。
〔実施例 7〕 形質転換酵母株 （0. minuta) による抗体の分泌確認
0. minuta AK3RH、 0. minuta AK3AH、 0. minuta AK3RHy、 0. minuta AK3AHy株を BYPMG 培地 [1 %酵母エキス （Difco社） 、 2%ポリペプトン （Difco社） 、 1. 5%メタノール、
0. 5%グリセロール、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH6. 0) ]を用いて、 28°C、 4日間培養した。 培養液 より培養上清を調製し、 SDS - PAGEに供した後、 分離されたタンパク質を PVDF膜にブロッテ イングし、 ラベル化された抗ヒト抗体（anti -ヒト Fc抗体、 anti- tト κ抗体）を用いてゥェ スタン解析を行つたところ、 図 4に示す通り、 RRBP1遺伝子と活性型 HAC1遺伝子導入株は、 その他の株と比較して著量の抗体を分泌した。 〔実施例 8〕 形質転換酵母株 （0. minuta) による分泌抗体の生産性
実施例 7にて調製された培養液を ProteinAカラム （Poros A 50um 4. 6mmD/50脆 L、 ァプ ライ ドバイオシステムズ） を用いた HPLC [分離条件、 平衡化緩衝液： lOraMリン酸緩衝液
(pH6. 0) 、 溶出緩衝液： lOmMリン酸緩衝液 （PH3. 4) 、 流速 4ml/min、 検出：波長 210nm] により、 抗体生産量を測定した。 スタンダードとして、 動物細胞 （CH0) にて生産した抗 体を用いた。 0D600 = 1当たりの抗体生産性を図 5に示す。 RRBP1遺伝子のみが導入された 0. minuta AK3RHy株、 及び活性型 HAC1遺伝子のみ導入された 0. minuta AK3AH株の抗体分 泌量は、 コントロール株である 0. minuta AK3AHy株と比較して、 増加する傾向にあった。 しかしながら、 活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子を共発現させた 0. minuta AK3RH株の抗体 生産量は、 コントロール株である 0. minuta AK3AHy株はもとより、 活性型 HAC1遺伝子また は RRBP1遺伝子を単独で導入したものより顕著に高い抗体生産量を示した。 以上から、 活 性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子の共発現は抗体の生産性に相乗効果以上の効果をもたらす ことが確認できた。
〔実施例 9〕 形質転換酵母株 (0. minuta) を用いた 0型糖鎖形成が抑制された条件での抗 体の生産
0. minuta AK3RH及び 0. minuta AK3AHyを BYPG培地 [1 %酵母エキス （Difco社） 、 2 %ポ リペプトン （Difco社） 、 0. 5 %グリセロール、 0· 1Mリン酸緩衝液（pH6. 0) ]で 2日間培養後、 0 μ Μ、 Ι μ Μ 5 /i M、 10 μ Μ, 20 μ ^ 及ぴ 50 μ Μの ΡΜΤ阻害剤 （口ダニン- 3 -酢酸誘導体： 5- [ [3, 4- (l-phenylmethoxy) phenyl] methylene] -4-oxo-2~thioxo-3-thiazol idineacetic acid (Bioorganic & Medicinal Chemi stry Letters, Vol. 14, p3975， （2004)中のィ匕合物 l c ) ) を添加した BYPM培地 [1 %酵母エキス （Difco社） 、 2%ポリペプトン （Difco社） 、 1. 5%メタノール、 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 0) ]を用いて、 28°C、 2日間培養した。 培養液よ り培養上清を調製し、 SDS - PAGEに供した後、 分離されたタンパク質を PV.DF膜にプロッティ ングし、 ラベル化された抗ヒト抗体（anti -ヒ ト Fc抗体）を用いてウェスタン解析を行った。 その結果を、 図 6に示す。 PMT阻害剤添加濃度は 5 Mが適当で、 その場合、 抗体の分泌量、 会合体形成率が増大した。 〔実施例 1 0〕 抗体遺伝子発現ベクターの構築
S. cerevisiae由来の MF alphal (GENBANK登録番号； P01149)の分泌シグナル（以下 aMF分 泌シグナル）と抗 TRAILレセプター抗体の軽鎖、 及び重鎖を融合蛋白質として発現させるた め、 aMF分泌シグナル遺伝子と抗 TRAILレセプター抗体遺伝子 （W02001/083560) を以下の オリゴヌクレオチドプライマ一を用いた overlap extension PCR法によって連結した。 aMF分泌シグナル-抗 TRAILレセプター抗体の重鎖用
EcoALF： 5' -GGAATTCATGAGATTTCCTTCAAT-3 ' (配列番号 26)
AlfH02： 5' -CTCCACCAGCTGTACTTCTCTTTTCTCGAGAGATA-3' (配列番号 27)
AlfH03： 5' -TATCTCTCGAGAAAAGAGAAGTACAGCTGGTGGAG-3' (配列番号 28)
Alf腿： 5' -GGTCGACTCATTTACCCGGGGACAG-3 ' (配列番号 29)
aMF分泌シグナル-抗 TRAILレセプタ一抗体の軽鎖用
EcoALF： 5， -GGAATTCATGAGATTTCCTTCAAT-3' (配列番号 26)
AlfL02： 5' -TGGGTCATCTGAATGTCTCTTTTCTCGAGAGATA-3' (配列番号 30)
AlfL03： 5' -TATCTCTCGAGAAAAGAGACATTCAGATGACCCA-3' (配列番号 31)
AlfL04： 5' -GGTCGACCTAACACTCTCCCCTGT-3' (配列番号 32)
aMF分泌シグナル遺伝子領域は、 Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent (PIERCE社） に よって調製した S. cerevisiaeのゲノム DNAを鍚型として増幅した。 重鎖用として、 プラ イマ一 EcoALF (配列番号 26) と AlfH02 (配列番号 27) を用いた PCR[95°Cで 10秒、 55°Cで 30 秒、 68°Cで 60秒） X 30サイクル]を、 軽鎖用として、 プライマー EcoALF (配列番号 26) と AlfL02 (配列番号 30) を用いた PCR[95°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 60秒） X 30サイク ル]を行い、 それぞれ増幅された約 0. 26 kb の目的 DNA断片を回収した。
抗体遺伝子領域は、 抗 TRAILレセプター抗体 cDNA (W02001/083560) を铸型として増幅し た。 重鎖用としてプライマー AlfH03 (配列番号 28) と AlfH04 (配列番号 29) を用いた PCR[95°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 90秒） X 30サイクル]を、 軽鎖用として、 プライマ 一 AlfL03 (配列番号 31) と AlfL04 (配列番号 32) を用いた PCR[95°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 90秒） X 30サイクル]を行い、 それぞれ増幅された約 1. 35 kb の重鎖領域と約 0. 65 kb の軽鎖領域の目的 DNA断片を回収した。
次に、 重鎖用 aMF分泌シグナル領域と約 1. 35 kb の重鎖領域を鎳型として、 プライマー
EcoALF (配列番号 26) と AlfH04 (配列番号 29) を用いた PCR[95°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 90秒） X 30サイクル]を行い、 増幅された約 1. 6 kb の目的 DNA断片を回収した。 ま た、 軽鎖用 aMF分泌シグナル領域と約 0. 65 kb の軽鎖領域を鎳型として、 プライマー EcoALF (配列番号 26) と AlfL04 (配列番号 32) を用いた PCR[95°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 60秒） X 30サイクル]を行い、 増幅された約 0. 9 kb の目的 DNA断片を回収した。 そ れぞれ回収した DNA断片は、 pCR2. 1- T0P0にクローニングした。 挿入 DNA断片の塩基配列よ り、 それぞれ aMF分泌シグナル-抗体重鎖及び aMF分泌シグナル-抗体軽鎖が、 in-frameで融 合している遺伝子を有していることを確認した。 得られたプラスミドは、 それぞれ TOPO- alfHcと TOPO-alfLcと命名した。 プライマー EcoALF (配列番号 26) に導入した EcoRI制限酵 素部位とプライマー AlfH04 (配列番号 29) と AlfL04 (配列番号 32) に導入した Sail制限酵 素部位を利用して、 TOPO-alfHc と TOPO-alfLc から、 EcoRI-Sall消化で aMF分泌シグナル- 抗体重鎖と aMF分泌シグナル-抗体軽鎖をコードする DNA断片を回収した。
S. cerevisiaeにおいて抗体重鎖と抗体軽鎖を発現させるために、 EcoRI - Sail消化で回 収した aMF分泌シグナル-抗体重鎖と aMF分泌シグナル-抗体軽鎖をコ一ドする DNA断片を大 腸菌-酵母シャ トルベクター YEp352 (Yeast 2, pl63-167 (1986) ) に導入されたグリセル アルデヒド- 3-リン酸脱水素酵素遺伝子 （TDH3、 GAP) プロモータ一-ターミネータ一力セ ッ ト中の EcoRI-Sall部位にライゲーシヨンした。 それぞれ得られたプラスミ ドを YEp352GAP- II - alfHcと YEp352GAP - II- alfLcと命名した。 次に、 GAPプロモータ ^ "-ターミネ 一ターカセッ トの両末端にある BamHI制限酵素部位を利用し、 YEp352GAP_II - alfHcと YEp352GAP-II-alfLcから、 それぞれ、 BamHI-GAPプロモータ1 aMF分泌シグナル-抗体重 鎖 - GAPターミネータ1 "- BamHI (断片 1 )と BamHI- GAPプロモータ1 aMF分泌シグナル-抗体 軽鎖- GAPターミネータ一- BamHI (断片 2 )をコードする遺伝子断片を回収した。 断片 1と 断片 2は、 断片 1または断片 2を切り出した、 YEP352GAP- II- alfHcまたは Ep352GAP_II - alfLcの BamHI部位に 3断片ライゲーシヨンで導入した。 得られたベクターを YEp352 GAP- II-alfHc/alfLcと命名した （図 7 ) 。 制限酵素切断パターンよ り YEp352 GAP-II - alfHc/alfLcには、 断片 1と断片 2が順方向にタンデムに導入されてい.ることを確認した, YEp352 GAP - Π-alfHc/alfLcは、 抗体重鎖と軽鎖の両発現ュニット保持した抗体発現べク ターである。
〔実施例 1 1〕 S. cerevisiae活性型 HAC1遺伝子発現ベクターの構築 S. cerevisiaeの HACl 前駆体 mRNAは、 活性型 IRElの RNase活性によって 252ヌクレオチ ドが除去され、 HAC1 成熟体 mRNAとなる。 この HAC1 成熟体 mRNAは、 C末端の 10アミノ酸 残基が除去され、 新たに 18アミノ酸残基が付加された活性型 HAC1に翻訳される （PNAS 97， P4660-4665 (2000) ) 。 そこで、 以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた overlap extension PCR法によって活性型 HAClをコードする遺伝子を構築した。
HAC-Sac-ATG： 5' -GGAGCTCATGGAAATGACTGATTTTG-3' (配列番号 33)
HAC-internalR： 5' -GAATTCAAACCTGACTGCGCTTCTGGATTACGCCAATTGTCAAG-3' (配列番号 34) HAC-internalF： 5' -CTTGACAATTGGCGTAATCCAGAAGCGCAGTCAGGTTTGAATTC-3' (配列番号 35) HAC-Sma-STOP： 5' -GCCCGGGTCATGAAGTGATGAAGAAATC-3' (配列番号 36)
Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent (PIERCE社） によって調製した S. cerevisiaeの ゲノム DNAを铸型とした。 プライマー HAC-Sac-ATG (配列番号 33) と HAC - internalR (配列 番号 34) を用いた PCR[95°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 60秒） X 30サイクル]と、 プライ マ一 HAC-internalF (配列番号 35) と HAC- Sma- STOP (配列番号 36) を用いた PCR[95°Cで 10 秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 60秒） X 30サイクル]を行い、 増幅された約 0. 66 kb (断片 A) と約 0. 06 kb (断片 B ) の目的 DNA断片をそれぞれ回収した。
次に、 増幅した断片 Aと断片 Bを錡型として、 プライマー HAC-Sac-ATG (配列番号 33) と HAC- Sma- STOP (配列番号 36) を用いた PCR[95°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 6 0秒） X 30サイクノレ]を行い、 増幅された約 0. 7 kb の目的 DNA断片を取得した。 回収した DNA断片 は、 pCR2. 1-T0P0にクロー-ングした。 揷入 DNA断片の塩基配列より、 238アミノ酸残基の 活性型 HAC1をコードしている遺伝子を有していることを確認した。 得られたプラスミドは、 T0P0- aHaclと命名した。 プライマー HAC- Sac - ATG (配列番号 33) に導入した Sacl制限酵素 部位とプライマー HAC-Sma-STOP (配列番号 36) に導入した Smal制限酵素部位を利用して、 Sacl- Smal消化で活性型 HAClをコードしている遺伝子を回収した。
S. cerevisiaeにおいて活性型 HAC1を発現させるために、 Sacl- Smal消化で回収した活性 型 HAC1をコードしている遺伝子を大腸菌-酵母シャトルベクター YEp351 - (Yeast 2, pl63 - 167 (1986) ) に導入されたダリセルアルデヒ ド- 3-リン酸脱水素酵素遺伝子 （TDH3、 GAP) プロモータ^ ~-ターミネータ一力セット中の Sacl - Smal部位にライゲーシヨンした。 得られ たプラスミドを YEp351GAP- II - aHAClと命名した （図 7 ) 。 このべクターは活性型 HAC1遺伝 子発現ュ-ットを保持している。 〔実施例 1 2〕 ヒ ト RRBP1遺伝子発現べクタ一の構築
RRBP1遺伝子については、 かずさ DNA研究所より分譲を受けたヒ ト RRBP1遺伝子
(KIAA1398、 GENBANK Accession No. AB037819) を用いた。 この遺伝子の両端に制限酵素 サイ トを導入するため、 以下に記載のオリゴヌクレオチドプライマー P180kpnatg、 P180xbastop (配列番号 37及び 38) とヒト RRBP1遺伝子を用いた PCR[95°Cで 10秒、 55°Cで 30 秒、 68°Cで 6分 X 30サイクル]にて増幅した。
P180kpnatg： 5' -GGGTACCATGGATATTTACGACACTC-3' (配列番号 37)
P180xbastop： 5， - GTCTAGATCAGACAGAGGTGCCCTCC - 3' (配列番号 38)
得られた約 4· 7 kbの断片を回収し、 pCR2. 1- T0P0にクローニングした。 揷入 DNA断片の塩 基配列より、 揷入断片の両末端の約 600bpが目的の塩基配列を正しく含んでいることを確 認した。 得られたプラスミドは、 TOPO-P180と命名した。 次に、 TOPO-P180を制限酵素 Ndel と Hpalによって消化し、 KIAA1398の 110bp_4524bpに相当する領域を含む断片を除去した。 この除去領域に、 KIAA1398の約 4. 4kbの Ndel- Hpal断片を導入し、 T0P0- P180Nを構築し、 大 腸菌 SCS110株 （Stratagene社） を使用して制限酵素 Xbal部位を脱メチル化した。 プライマ -P180kpnatg (配列番号 37) と P180xbastop (配列番号 38) に導入した Kpnl- Xbal制限酵素 部位を利用して、 RRBP1をコードしている遺伝子を含む Kpnl- Xbal断片を回収した。
S. cerevisiaeにおいて RRBP1を発現させるために、 先に回収した Kpnl-Xbal断片を大腸 菌-酵母シャトルベクター YEp352 (Yeast 2, pl63-167 (1986) ) に導入されたグリセルァ ルデヒド -3-リン酸脱水素酵素遺伝子 （TDH3、 GAP) プロモータ^ ターミネータ一力セッ ト中の Kpnl- Xbal部位にライゲーションし、 得られたプラスミ ドを YEp352GAP_II - pl80と命 名した。 次に、 YEp352GAP- II- pl80を制限酵素 Pvulで消化し、 GAPプロモータ ^ "- RRBP1遺伝 子 - GAPターミネータ一を含む Pvul断片を回収した。 この Pvul断片を大腸菌-酵母シャトル ベクター YEP351 (Yeast 2， pl63-167 (1986) ) の複製必須領域、 マーカー遺伝子を含む Pvul断片と連結し、 YEp351GAP-II- pl80を構築した （図 7 ) 。 このベクターは RRBP1遺伝子 発現ュニットを保持している。
〔実施例 1 3〕 活性型 HAC1遺伝子及び RRBP1遺伝子共発現ベクターの構築
活性型 HAC1遺伝子及び RRBP1遺伝子を S. cerevisiaeに一つのベクターで導入するために. 活性型 HAC1遺伝子及ぴ RRBP1遺伝子共発現べクターを構築した。 実施例 1 1で構築した YEp351GAP-II- aHAClを制限酵素 Hpalで消化した。 次に、 実施例 1 2で構築した YEP352GAP - II - pl80から GAPプロモータ1 ~- RRBP1遺伝子- GAPターミネータ一を含む BamHI断片を回収し、 両末端を T4 DNA ポリメラーゼ （タカラバイオ社） で平滑化し、 YEp351GAP- II-aHAClの Hpal部位に導入した。 得られたプラスミ ドを YEp351GAP- II - aHACl/pl80と命名した （図 7 ) 。 塩基配列の解析によって、 導入した GAPプロモータ一- RRBP1遺伝子- GAPターミネ一 ターを含む BamHI断片の挿入方向を決定した。 このベクターは、 活性型 HAC1遺伝子及ぴ RRBP1遺伝子の発現ュ-ットを保持している。
〔実施例 1 4〕 抗体発現酵母株、 ならびに活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子を発現する抗 体発現酵母株 （S. cerevisiae) の構築
S. cerevisiae BY4741株 (MATa Ahis3 A leu2 Ametl5 A ura3) のコンビテントセルは、 Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit ( ZYMO RESARCH社） によって調製した。 S. cerevisiae BY4741株を、 5mlの YPAD培地 [0. 04%のアデニンを含む YPD培地 （Sigma社） ]に 接種し、 終夜培養 （30°C、 310rpm) によって得た菌体を使用した。 実施例 1 0から実施例 1 3によって構築した発現ベクターは、 Frozen - EZ Yeast Transformation II Kit (ZYMO RESARCH社） によって S. cerevisiae BY4741株に導入し、 2%の寒天を含む ST寒天培地 [2%の グルコース、 0. 04%のアデニン、 0. 3Mの KC 1を含みゥラシルとロイシンを欠失した Yeast Nitrogen Base and Ammonium sulfate培地 （Sigma社） ]上で増殖した开質転換体をそれぞ れ抗体発現酵母株として選抜した。
抗体重鎖と軽鎖の発現ュニットを保持する YEp352 GAP- II- alfHc/alfLcは、 宿主のゥラ シル要求変異を相補する URA3マーカー遺伝子を有している。 一方、 YEp351 GAP-II (遺伝 子が導入されていないコントロールベクター） 、 YEp351GAP_II-aHACl (活性型 HAC1発現べ クタ一） 、 YEp351GAP-II-pl80 (RRBP1発現ベクター） 、 YEp351GAP- II_aHACl/P180 (活性 型 HAC1遺伝子及び RRBP1共発現ベクター） は、 宿主のロイシン要求変異を相補する LEU2マ 一力一遺伝子を有している。 そこで、 以下のように組み合わせて両ベクターが導入された ときのみ増殖できるように宿主に形質転換し、 4種類の抗体発現酵母株を構築した。
S. cerevisiae T2K01 YEp352 GAP— II - alfHc/alfLc (URA3) YEp351 GAP— II (LEU2)
S. cerevisiae T2K02 YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (URA3) YEp351GAP-II-aHACl (LEU2) S. cerevisiae T2K03 YEp352 GAP—II- alfHc/alfLc (URA3) YEp351GAP— II- pl80 (LEU2) S. cerevisiae T2K04 YEp352 GAP- II-alfHc/alfLc ( URA3 ) YEp351GAP-II-aHACl/pl80 (LEU2)
〔実施例 1 5〕 形質転換酵母株 （S. cerevisiae) による抗体の生産性
実施例 1 4で作製した S. cerevisiae T2K01、 S. cerevisiae T2K02 , S. cerevisiae T2K03、 S. cerevisiae T2K04株を、 ST培地を用いて 30°C、 3日間培養した。 この培養液を 終濃度 5%になるように YPAD培地に接種し、 30°C、 3日間培養した。 培養液より培養上清を 調製し酵母によって分泌生産された抗体を含む試料とした。 分泌生産された抗体の定量的 アツセィは、 サンドイッチ ELISA法によって行った。 96 well プレートに抗 TRAILレセプタ 一抗体の抗原である TRAILレセプター蛋白質を吸着させ、 酵母試料を添加し、 ペルォキシ ダーゼ標識ヒト lgG特異的 Fc抗体 (Peroxidase-Labeled Affinity Purified Antibody To Human IgG (Fc) (KPL社）） と ABTSペルォキシダーゼ基質 （KPL社） を使用して検出した。 ス タンダードは、 動物細胞 （NS0) で生産した抗体を用いた。
図 8 Aに示すように、 RRBP1遺伝子のみが導入された S. cerevisiae T2K03株は、 コント ロール株である S. cerevisiae T2K01株とほとんど生産性は変わらなかった。 しかしなが ら、 活性型 HAC1遺伝子のみが導入された S. cerevisiae T2K02株では、 コントロール株で ある S. cerevisiae T2K01株の約 2倍の生産性を示した。 さらに、 活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子を共発現させた S. cerevisiae T2K04株では、 コントロール株である S. cerevisiae T2K01株はもとより、 活性型 HAC1遺伝子または RRBP1遺伝子を単独で導入した ものより顕著に高い抗体生産量を示した （コントロールの約 7倍） 。 活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子の共発現は抗体の生産性に相乗効果以上の効果をもたらすことが確認された。
〔実施例 1 6〕 形質転換酵母株 （S. cerevisiae) を用いた 0型糖鎖形成が抑制された条件 での抗体の生産性
実施例 1 4で作製した S. cerevisiae T2K01 , S. cerevisiae T2K02 , S. cerevisiae
T2K03、 S. cerevisiae T2K04株を、 ST培地を用いて 30°C、 3日間培養した。 この培養液を 終濃度 5%になるように ΙΟ μ Μの PMT阻害剤 （ロダニン- 3-酢酸誘導体： 5- [ [3，4- (1- phenylraethoxy phenyl] methylene] -4-oxo-2-thioxo-3-thiazolidineacetic acid (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p3975, (2004)中の化合物 1 c ) ) を初発添加した YPAD培地に接種し、 30°C、 3日間培養した。 培養液より培養上清を 調製し、 酵母によって分泌生産された抗体を含む試料とした。 実施例 1 5と同様に、 動物 細胞 （NS0) で生産した抗体をスタンダードとして使用したサンドィツチ ELISA法によって 定量的アツセィを行った。
図 8 Bに示すように、 活性型 HAC1遺伝子が導入された S. cerevisiae T2K02株と、 RRBP1 遺伝子が導入された S. cerevisiae T2K03株では、 明らかに、 コントロール株である S. cerevisiae T2K01株より高い生産性を示した。 さらに、 活性型 HAC遺伝子と RRBP1遺伝子を 共発現させた S. cerevisiae T2K04株では、 コントローノレ株である S. cerevisiae T2K01株 はもとより、 活性型 HAC1遺伝子または RRBP1遺伝子を単独で導入したものより顕著に高い 抗体生産量を示した （コントロールの約 8倍） 。 活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子の共発 現による抗体生産への相乗効果は、 0型糖鎖形成の抑制によってさらに効果が増大した。
〔実施例 1 7〕 Ogataea minutaプロテアーゼ YPS1遺伝子破壌株 （ Δ ochl Δ ypsl Δ ura3厶 adel) の作成
W02003/091431に記載の YPS1遺伝子破壊べクタ一 pDOMYPlを BaraHIと Clalで切断して、 W02003/091431に記載の 0. minuta TK5- 3株 （ Δ ochl A ura3 Δ adel) に電気パルス法で形質 転換を行った。 これらの株の YPS1遺伝子が破壊されたことを確認するために、 以下のブラ イマ一を合成した。
DY5 ; 5， -CTCAAGGGCCTGGAGACTACG-3 ' (配列番号 4 9 )
DY3 ; 5 ' -CGGGATTCCCGAGTCGCTCACC-3 ' (配列番号 5 0 )
形質転換株から単離した染色体 DNAを鍚型とし、 プライマー DY5、 DY3を用いて、
PCR ( (94°Cで 30秒、 60°Cで 1分、 72°Cで 2分) X 25サイクル) を行った。 プラスミドが YPS1 座に組み込まれた株からは、 3. 7kbの増幅 DNA断片が検出された。 選抜した株を 0. minuta
YK4株 （ Δ ochl A ura3 A adel Δ ypsl： : URA3) と命名した。 0. minuta YK4株を YPD培地で定 常期まで培養した後、 5-フルォロォロチジン酸 （5- F0A) に耐性を示す株を取得した。 5 -
F0A耐性株の染色体 DNAを鎳型とし、 プライマー DY5、 DY3を用いた PCR ( (94°Cで 30秒、
60°Cで 1分、 72°Cで3分） X 25サイクル） を行った。 URAI3遺伝子が欠落した株から、 1. 2Kb の増幅 DNA断片が検出された。 この 0(;111 1^33 3(161 7 31株を0. rainuta YK5株と命名 した。
〔実施例 1 8〕 合成抗体遺伝子生産株 （0. minuta) の作成と抗体の生産
(1) 合成抗体遺伝子発現ベクターの構築
W02003/091431記載の pOMexGPlUを Spel切断、 平滑末端処理後、 ライゲーシヨンさせた。 ' 得られたプラスミドの Sailサイトと EcoT22Iサイトを、 それぞれ Spelサイト、 BaraHIサイト ヘリンカーチェンジした。 得られたプラスミ ドを pOMexGPlUASpと命名した。
抗体遺伝子は、 抗 TRAILレセプタ一抗体遺伝子（W02002/094880)のァミノ酸配列より、 O.minutaのコドン使用頻度を考慮した遺伝子をデザインし、 人工合成を行った （タカラバ ィォ社） 。 軽鎖、 及び重鎖遺伝子の N末端には、 S. cerevisiae SUC2シグナルまたは Chicken Lysozyrae シグナルを付加し、 更に両端に制限酵素サイト （5'側に Xbalサイト、 3'側に BamHIサイト） の塩基配列を付加した （塩基配列番号 5 1、 5 3、 5 5、 5 7 ;アミ ノ酸配列番号 5 2、 54、 5 6、 5 8) 。 Xbal-BamHIで消化されたシグナルの異なる 2種 類の軽鎖遺伝子断片を実施例 1 (2) で作成されたベクター pOMexGPlAへ導入し、 得られ たべクタ一を pOMexGPA/AbSUC、 ならびに pOMexGPA/AbLysと命名した。 Xbal - BamHで消化さ れたシグナルの異なる 2種類の重鎖遺伝子断片をベクター pOMexGPlUASpの Spel - BaraHIサイ トへ導入し、 得られたベクターを pOMexGPUASp/AbSUCならぴに pOMexGPU Δ Sp/AbLysと命名 した。
pOMexPGHy (実施例 1 ( 3— 4) ) を鎳型とし、 DNAプライマー PGKHy-F (配列番号 5 9) と PGKHy- R (配列番号 6 0) を用いた PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分） X20 サイクル]にて、 ハイグロマイシン B耐性遺伝子を增幅した。
PGKHy-F; 5, -ATAGAACTAGCAACTAGATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3' (配列番号 5 9)
PGKHy-R; 5' -CAAATCCCACGGATCACTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3' (配列番号 6 0)
増幅した遺伝子断片を In- fusionキット（BD Bioscience)を用いて、 Spel- Bglll消化した pOMexPGHy導入し、 揷入断片の塩基配列を決定した。 得られたプラスミドを铸型とし、 DNA プライマー PGKpUC-p (配列番号 6 1) と PGKpUC- 1: (配列番号 6 2 ) を用いた PCR[94°Cで 30 秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 2分） X 20サイクル]にて、 PGKプロモータ ハイグロマイシン B 耐性遺伝子- PGKターミネーターを含む遺伝子断片を増幅した。
PGKpUC-p; 5' -AATTCGAGCTCGGTACAGGGATACATGGGATACCAAAG-3' (配列番号 6 1) PGKpUC-t ; 5 ' -GAGGATCCCCGGGTACCAGGGTCGATTTTCTTGGTCGA-3 ' (配列番号 6 2 ) 増幅した遺伝子断片を Asp718Iで消化した pUC118 (タカラバイオ社) へ、 In- fusionキッ ト（BD Bioscience)を用いて導入し、 挿入断片の塩基配列を決定した。 得られたプラスミ ドを、 PGKHyg/PUC118と命名した。 pOMexGPlU A Sp を HindIII_KpnIで消化し、 GAPプロモー タ1 "-ターミネータ一を含むカセットを単離し、 Hindlll- Kpnl消化した PGKHyg/pUC118へ揷 入した。 得られたプラスミ ドを GAP/HyG/PUC118と命名した。 次に、 pUC19 (タカラバイオ 社） を Ndel-EcoRI消化、 平滑末端処理後、 ライゲーションすることで、 pUC19内部に存在 する Ndel-EcoRIの領域を除去した。 このプラスミ ドを、 Hindlll- Saclで消化し、 GAP/HyG/pUC118から、 Hindlll- Sacl消化で単離した、 GAPプロモータ一-ターミネ一ターと、 PGKのプロモータ一-ハイグロマイシン B耐性遺伝子- PGKターミネーターを持つ遺伝子断片 を揷入した。 得られたプラスミドを、 pOMexHyと命名した。
Xbal- BamHで消化された Chicken Lysozymeシグナルが付加された抗体重鎖遺伝子断片を、 Spel- BamHI処理を施した pOMexHyへ導入し、 得られたべクターを pOMexHy/AbLysと命名した。 ( 2 ) 抗体遺伝子発現酵母株の作成
Not Iで消化した抗体発現べクタ一 pOMexGPA/AbLysと pOMexGPU Δ Sp/AbLysを用いて、 エレ タトロポレーシヨンにより 0. minuta YK5株 （ Δ ochl Δ ypsl Δ ura3 Δ adel) を开質転換し た。 なおエレクト口ポレーシヨンの条件は、 W02003/091431に記載のものを採用した。 形 質転換された細胞は SD寒天プレート培地 [2%グルコース、 0. 67%酵母二トロゲンベース (Dif co社]にて選択した。 単一コロニーを B2YP4G培地 [1. 34%酵母ニトロゲンベース （Difco 社） 、 2°/。酵母エキス （Dif co社） 、 4%ポリペプトン （Dif co社） 、 4%グリセロール、 0. 1Mリ ン酸緩衝液 (PH6. 0) ]を用いて、 27°C、 4日間培養した。 培養液より培養上清を調製し、 実 施例 7に記載の方法にてウェスタン解析を行い、 抗体軽鎖および重鎖遺伝子が導入された 抗体生産株を選択し、 0. minuta AA1株と命名した。 図 9に示す通り、 0. rainuta AA1株は、 実施例 5で作成した 0. minuta A01株と比較して、 著量の抗体を分泌していた。
Notlで消化した抗体発現べク ター pOMexGPA/AbSUCと pOMexGP.U Δ Sp/AbSUC を W02003/091431に記載の 0. rainuta TK5- 3株 （ Δ ochl A ura3 Δ adel) に導入し抗体発現株 0· rainuta YY1を得た。 エレクトロポレーシヨン法ならびに、 株の選択方法は上記と同様の方 法を用いた。 〔実施例 1 9〕 P. pastorisの活性型 HAC1遺伝子の取得と発現ベクターの構築
P. pastoris活性型 HAC1遺伝子の取得は、 細胞 （P. pastoris GS115株） より実施例 3と 同様の方法で取得した。 実施例 3の方法にて、 P. pastoris GS115株より cDNAを合成した。 この cDNAを以下に記載の DNAプライマー HACpl- 1 (配列番号 6 3 ) 及び HACpl- 12 (配列番号 6 4 ) を用いた PCR[94°Cで 30秒、 52°Cで 30秒、 72°Cで 1分） X 30サイクル]にて増幅し、 pCR2. 1-T0P0 (インビトロジェン） にクローユング後、 PCRで増幅された 2種類の遺伝子断 片由来の塩基配列を確認した （配列番号 6 5、 6 6 ) 。
HACpl-1： 5， -ATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAGACAGC-3' (配列番号 6 3 )
HACpl- 12： 5' -CAAAGTCATTTAAATCAAATGCATTAGCGG-3' (配列番号 6 4 )
取得された 2種類の cDNA断片のうち、 1つ （配列番号 6 5 ) はゲノム配列と一致した力 S、 もう一方 （配列番号 6 6 ) は一部欠損し、 短くなつており、 UPRによって活性化した Irelp によりスプライシングを受けた cDNA断片であった。 活性化した HAC1の cDNA全長を取得する ため、 下記の DNAプライマー speHACplF (配列番号 6 7 ) 及び bglHACplR (配列番号 6 8 ) と上記活性化した HAC1の cDNAが存在すると考えられる cDNAプールを用いて PCR [94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分） X 20サイクル]を行った。
speHACplF： 5' -gactagtATGCCCGTAGATTCTTCTCATA-3' (配列番号 6 7 )
bglHACplR： 5' -cagatctCTATTCCTGGAAGAATACAAAGT-3' (配列番号 6 8 )
得られた約 lkb断片は P. pastoris由来活性型 HAC1遺伝子の開始コドンから終始コドンま でを含んでおり （配列番号 6 9 ) 、 これは 304アミノ酸からなる活性型 HAClpのアミノ酸配 列に相当する （配列番号 7 0 ) 。 これを Spel- Bglll処理し、 単離後、 Spel-Bglll処理を施 した pOMexPGHy (実施例 1 ( 3 — 4 ) ) に導入した。 得られたベク ターは pOMexPGHy/PpHaclと命名した。 このべクタ一は P. pastoris由来活性型 HAC1遺伝子発現ュ ニットを保持している。
〔実施例 2 0〕 S. cerevisiae活性型 HAC1遺伝子発現ベクターの構築
実施例 1 1で作成された S, cerevisiae活性型 HAC1遺伝子を含む T0P0- aHaclをテンプレ ートとして、 DNAプライマー ScHAC - XbaF (配列番号 7 1 ) と DNAプライマー ScHAC-BamR (配 列番号 7 2 ) を用いて PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分） X 20サイクル]で S. cerevisiae活性型 HAC1遺伝子を増幅した。 ScHAC-XbaF： 5' -gtctagaATGGAAATGACTGATTTTGAACT-3' (配列番号 7 1 )
ScHAC-BamR： 5' -cggatccTCATGAAGTGATGAAGAAATCAT-3' (配列番号 7 2 )
これを Xbal-BamHI消化し、 S. cerevisiae由来活性型 HAC1をコードしている遺伝子を回 収した。 単離後、 Spel-Bglll処理を施した pOMexPGHy (実施例 1 ( 3— 4 ) ) に導入した。 得られたベクターは pOMexPGHy/ScHaclと命名した。 このベクターは S. cerevisiae由来活 性型 HAC1遣伝子発現ュニットを保持している。
〔実施例 2 1〕 0. minuta, P. pastoris, S. cerevisiae活性型 HAC1遺伝子が導入された 0. minuta株による抗体生産
( 1 ) 0. minuta, P. pastoris、 S. cerevisiae活性型 HAC1遺伝子が導入された 0. minuta 株の作成
実施例 1 8にて育種した抗体生産株 0. minuta AA1株に、 Aor51HIで消化した 0. minuta由 来活性型 HAC1遺伝子発現ベクター p(MexPGHy/Hacl、 P. pastoris由来活性型 HAC1遺伝子発 現ベクター pOMexPGHy/PpHacl、 および S. cerevisiae由来活性型 HAC1遺伝子発現ベクター pOMexPGHy/ScHaclを上記ェレクトロポレーション法によつて導入した。 各形質転換株の活 性型 HAC1遺伝子の導入は、 ハイグ口マイシン Bを 50 μ g/ralとなるよう添加した YPD寒天プレ ート培地にて選択し、 培養後、 ゲノムを抽出し、 0. minuta由来活性型 HAC1遺伝子発現べク ター pOMexPGHy/Haclについては、 実施例 3記載の DNAプライマー speHACIF (配列番号 2 0 ) と bglHAClR (配列番号 2 1 ) を用いた PCRにて確認した。 P. pastoris由来活性型 HAC1 遺伝子については、 上記の DNAプライマー speHACplF (配列番号 6 7 ) と bglHACplR (配列 番号 6 8 ) 、 S. cerevisiae由来活性型 HAC1遺伝子については、 DNAプライマー ScHAC-XbaF
(配列番号 7 1 ) と ScHAC-BaraR (配列番号 7 2 ) を用いた PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分） X 30サイクル]にて確認した。 得られた株を 0. minuta AA2omH株、 0. minuta AA2ppH株及び 0. minuta AA2scH株と命名した。 同時にコントロールとして Aor51HIで消化 した pOMexPGHy を 0. minuta AA1株に導入し、 0. minuta AA2Hy株を得た。
( 2 ) HAC1遺伝子導入抗体生産株による抗体の分泌確認
上記 （1 ) で作成された HAC1遺伝子導入抗体生産株、 0. minuta AA2omH¾ 0. minuta
AA2ppH株、 0. minuta AA2scH株ならびに 0. rainuta AA2Hy株を実施例 1 8 ( 2 ) に示した 方法で培養し、 非還元条件化でのウェスタン解析を行った。 その結果、 図 1 0に示す通り、 0. minuta AA2oraH株、 0. rainuta AA2ppH株、 0. minuta AA2scH株は、 上記 （1 ) で作成し たコントロールの 0. minuta AA2Hy株と比較して、 抗体分子への糖鎖の付加が見られ、 抗 体 H2L2会合体の顕著な分泌促進効果は認められなかったが、 宿主と異なる種由来の HAC1遺 伝子を導入しても同様の生産効果が期待できると考えられた。
( 3 ) HAC1遺伝子導入 0. minuta抗体生産株による分泌抗体の生産性 （TR- FRETを原理とし たホモジニァス分析による定量）
12 μ 1の 0. 97 μ g/ml LANCE Eu-W1024 labeled anti-human IgG (PerkinElmer社）、 8. 3ug/ml Biot in-conjugated mouse ant i -human IgG (BD Bioscience社)、 16. 7ug/ml Surelight APC streptavidin (PerkinElmer社）、 10%ブロックエース （大日本製薬社） を 含む 20mM トリス塩酸緩衝液（pH7. 2)を 96ゥエル .ハーフエリアプレート （CORNING社） に 加え、 上記 （2 ) にて調製された培養液を適宜、 10%ブロックエースを含む 20raM トリス 塩酸緩衝液 (PH7. 2)で希釈したサンプルを 2 μ 1入れ攪拌した。 室温、 暗所で 1時間反応後、 EnVision (PerkinElmer社）を用いて、 蛍光を測定した。 665nm/615nmの値より会合抗体生 産量を測定した。 スタンダードとして、 動物細胞 （CH0) にて生産した抗体を用いた。 図 1 1に示す通り、 活性化 HAC1遺伝子が導入された 0. minuta AA2oraH株、 0. rainuta AA2ppH 株、 0. minuta AA2scH株にて、 0. minuta AA2Hy株と比較して、 顕著な抗体の分泌促進は 認められなかったが、 宿主と異なる種由来の HAC1遺伝子を導入しても同様の生産効果が期 待できると考えられた。
( 4 ) PMT阻害剤 （lc) を用いた HAC1遺伝子が導入された O. minuta株による抗体生産
0. minuta AA2omHte、 0. minuta AA2ppH株、 0. rainuta AA2scH株、 およぴ 0. rainuta
AA2Hy株を 5mlの B2YP4G培地に 1白金耳、 植菌し 27°C、 1日間培養後、 OD600が 10になるよう に B2YP4G培地にて希釈し、 実施例 9に記載の PMT阻害剤 （lc；原液濃度 10mM) を 2 μ Μとな るように添力 [1した。 更に 27°C、 3日間培養し、 24時間毎に OD600を測定し、 0D600の 1増加 にっき 0. 04 Mづっ PMT阻害剤 （lc) を添加した。 培養液より培養上清を調製し、 実施例 2
1 ( 3 ) に記載の方法にて、 抗体生産量を測定した。 その結果を、 図 1. 1に示す。 活性化
HAC1遺伝子が導入された 0. minuta AA2oraH株、 0. minuta M2ppH株、 0. minuta AA2scH株 にて、 PMT阻害剤を添加して培養することで、 コントロールに当たる 0. minuta AA2Hy株と 比較して、 抗体の分泌促進効果を認めた。
以上のように、 異種の HAC1遺伝子を用いても、 抗体の分泌促進効果を有することが認 められた。
〔実施例 2 2〕 0. minuta由来 PMT遺伝子の単離
0. minuta 由来 PMT1遺伝子の取得は、 0. minuta IF010746株の染色体 DNAを铸型とし、 DNAプライマー PM1-5 (配列番号 7 3 ) 、 PM1-3 (配列番号 7 4 ) を用いて、 PCR [94°Cで 30 秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 2分） X 25サイクル]を行った。
PM1-5： 5' -ATGGCGGGCAAAAATCAGAAATCTAGCGCG-3' (配列番号 7 3 )
PM1-3： 5' -TTACAACTCGTCTTTGACTAGAGGCGGGGA-3' (配列番号 7 4 )
増幅された約 2. 4kbの DNA断片を回収し、 T0P0 TA Cloning Kitを用いてクローニングし た。 得られたクローンよりプラスミ ド DNAを単離し、 挿入断片の塩基配列 （配列番号 7 5 ) を決定することで、 プラスミ ドの挿入 DNA断片に、 S. cerevisiae由来の PMT1遺伝子の ァミノ酸配列と高い相同性を持つアミノ酸配列 （配列番号 7 6 ) をコードする塩基配列を 有するクローンを選抜した。 単離されたプラスミドを pOmPMlと命名した。
また 0. minuta 由来 PMT2遺伝子については、 DNAプライマー PM2- 5 (配列番号 7 7 ) 、 PM2-3 (配列番号 7 8 ) を用い、 PMT4遺伝子については、 DNAプライマー PM4- 5 (配列番号 7 9 ) 、 PM4-3 (配列番号 8 0 ) を用い、 PMT5遺伝子については、 DNAプライマー PM5- 5 (配列番号 8 1 ) 、 PM5-3 (配列番号 8 2 ) を用い、 PMT6遺伝子については、 DNAプライマ 一 PM6-5 (配列番号 8 3 ) 、 PM6-3 (配列番号 8 4 ) を用い、 PMT1遺伝子と同様の方法にて 取得し、 PMT2遺伝子 （塩基配列：配列番号 8 5、 アミノ酸配列：配列番号 8 6 ) 、 PMT4遺 伝子 （塩基配列：配列番号 8 7、 ァミノ酸配列：配列番号 8 8 ) 、 PMT5遺伝子 （塩基配 列：配列番号 8 9、 アミノ酸配列：配列番号 9 0 ) および、 PMT6遺伝子 （塩基配列：配列 番号 9 1、 アミノ酸配列：配列番号 9 2 ) を含むプラスミ ドを、 それぞれ p0raPM2、 p0mPM4 p0mPM5およぴ p0mPM6と命名した。
PM2- -5： ： 5' -ATGGGCGAACGTACGGGCAAAAGTGCGCTC-3' (配列番号 7 7 )
PM2- -3： ： 5' -CTAATCGGAAATTCTCCACGTGCTCAAGAG-3' (配列番号 7 8 )
PM4- -5： ： 5' -ATGGGGCCCAAAATAAAGACCGGCAAGAAA-3' (配列番号 7 9 )
PM4- -3： ： 5' -CTATTTAGCAAAATGCAGTTTGATGTTGAG-3' (配列番号 8 0 )
PM5- -5： ： 5， -ATGGACGAGAAAAACATCTCTGGCTTAGAA-3' (配列番号 8 1 )
PM5- -3 ： 5' -CTACTCACTATAGACGGAGCAGTCGATCGA-3' (配列番号 8 2 ) PM6-5： 5' -ATGTCCGAGTCAGAGCTGAGAAACCGCAAA-3' (配列番号 8 3 )
PM6-3： 5， -CTAAGCTATACGCCAGGTGGAAACCCAGTT-3' (配列番号 8 4 )
〔実施例 2 3〕 O. minutaの PMT遺伝子分断または破壊ベクターの作成
( 1 ) PMT遺伝子分断ベクターの作成
( 1 - 1 ) PMT1遺伝子分断ベクターの作成
実施例 2 2で得られた pOmPMlを用いて、 PMT1遺伝子の部分配列を単離するため、 以下の DNAプライマー PMTlhlll (配列番号 9 3 ) 、 ΡΜΤΙΚρ (配列番号 9 4 ) を用いて、 PCR [94°C で 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 2分) X 15サイクル]を行った。
PMTlhlll： 5' -caagcttGGACCTACAACACGTCCGAAGAA-3' (配列番号 9 3 )
ΡΜΤΙΚρ： 5' -cggtaccGGTTTGATACCTTGGGTGGCACA-3' (配列番号 9 4 )
増幅された約 1. 6kbの DNA断片を HindIII-ΚρηΙで消化し回収した。 次に pPICZ a
(Invitrogen) を Bglll消化し、 平滑末端処理後、 Hindlllリンカーを揷入、 さらに BamHI · 消化し、 平滑末端処理後、 Kpnlリンカ一を揷入した。 得られたプラスミ ドを pZ-Hd-Kpと命 名した。 PZ- Hd- Kpを Hindlll— Kpnlで消化し、 ゼォシン耐性遺伝子を含む 2. Okbの DNA断片 を単離後、 上記 PCRにて増幅された PMT1遺伝子部分配列を揷入した。 揷入された ΡΜΠ遺伝 子の部分配列の塩基配列を決定した後、 得られたプラスミ ドを pOmPMldZと命名した。 pOmPMldZは O. minuta PMTl遺伝子の構造遺伝子 （CDS) 部分とプロモーター領域を分断し、 PMT1遺伝子の転写を抑制することができる。 一方、 実施例 1 8にて作成した pOMexGPU厶 Sp を Hindlll—Kpnlで消化し、 GAPプロモーターとターミネータ一を含む遺伝子断片を回収後、 上記 Hindlll— Kpnlで消化した、 ゼォシン耐性遺伝子を含む 2. Okbの DNA断片へ揷入した。 得られたプラスミ ドを GAP/Zと命名した。
( 1 - 2 ) PMT2遺伝子分断べクターの作成
実施例 2 2で得られた P0raPM2を用いて、 PMT2遺伝子の部分配列を単離するため、 以下の
DNAプライマー PMT2hIII (配列番号 9 5、 P T2Kp (配列番号 9 6 ) を用.いて、 PCR [94°Cで
30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 2分) X 15サイクノレ]を行った。
PMT2hIII： 5' -gaagcttACTACATAATTCGTGTACGTGTTC -3' (配列番号 9 5 )
PMT2Kp： 5' -cggtaccGTCGCCGTATTGGTCAGCAATCTC -3' (配列番号 9 6 )
増幅された約 1. 5kbの DNA断片を回収し、 Hindlll - Kpnlで消化し回収した。 得られた DNA 断片は、 pZ- Hd - Kpを Hindlll— Kpnl処理することで単離されたゼォシン耐性遺伝子を含む 2. Okbの DNA断片に挿入後、 揷入された PMT2遺伝子の部分配列の塩基配列を決定した。 得ら れたプラスミ ドを p0mPM2dZと命名した。 pOmPMMZは 0. minuta ΡΜΊ 遺伝子の構造遺伝子
(CDS) 部分とプロモーター領域を分断し、 PMT2遺伝子の転写を抑制することができる。
( 1 - 3 ) PMT4遺伝子分断べクターの作成
実施例 2 2で得られた p0mPM4を用いて、 PMT4遺伝子の部分配列を単離するため、 以下の DNAプライマー PMT4FHdinf (配列番号 9 7、 PMT4RKpinf (配列番号 9 8 ) を用いて、 PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 2分） X 15サイクル]を行った。
PMT4FHdinf ： 5' -GTCATGAGATCCaagctGATCCCTCAATGGAGATCTACT-3' (配列番号 9 7 )
PMT4RKpinf ： 5' -GGTGTGTGGGGGATCgGGATGCAAATGGATGGCTCGAAC-3' (配列番号 9 8 )
得られた約 1. 5kbの DNA断片を、 pZ-Hd- Kp から HindIII-ΚρηΙ処理によって単離された、 ゼォシン If性遺伝子を含む 2. Okbの DNA断片へ、 In-fusionキット（BD Bioscience社）を用い て導入した。 挿入された PMT4遺伝子の部分配列の塩基配列を決定した後、 得られたプラス ミドを p0raPM4dZと命名した。
( 2 ) PMT遺伝子破壊ベクターの作成
( 2 - 1 ) PMT5遺伝子破壊べクタ一の作成
W02003/091431に記載の 0. minutaの URA3構造遺伝子の前後に約 0. 8kbの反復配列を有す る遺伝子断片を含む pROMUlを Hindlll消化、 平滑末端処理後、 BaraHIリンカーを揷入した。 得られたベクターを BaraHI- Bglll消化し、 反復配列ならぴに 0. minutaの URA3遺伝子を含む 約 3. 3kbの断片を、 BaraHIで消化した pBluescriptKS- (Stratagene)に導入した。 得られたベ クタ一を rURApBKSと命名した。
0. minuta IF010746株の染色体 DNAを铸型とし、 DNAプライマー PMT5raaeF2 (配列番号 9 9 ) と PMT5maeR (配列番号 1 0 0 ) を用いて、 PCR [94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 2分) X 25サイクル]を行った。 增幅された約 1. 5bkの DNA断片を回収し、 BamHI- Hindlllで消化し た rURApBKSへ In-fusionキット（BD Bioscience)を用いて導入し、 揷入された遺伝子断片の 塩基配列を決定した。 得られたベクターを PMT5K/0/rURA3preと命名した。
0. minuta IF010746株の染色体 DNAを錶型とし、 DNAプライマー PMT5ushiroF (配列番号
1 0 1 ) と PMT5ushiroR (配列番号 1 0 2 ) を用いて、 PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°C で 2分） X 25サイクル]を行った。 増幅された約 1. 5bkの DNA断片を回収し、 Notlで消化した PMT5K/0/rURA3preへ In- fusionキット（BD Bioscience)を用いて導入し、 挿入された遺伝子 断片の塩基配列を決定した。 得られたベクターを PMT5K/0/rURA3と命名した。
PMT5maeF2 ： 5' -GACGGTATCGATAAGCTTGATGCGCGGCCTTCCGACCTT-3' (配列番号 9 9 )
PMT5maeR ： 5' -CTGGGGAAGCTCGGATCCGGCTCGAGGTCTTCGTTCAGA-3' (配列番号 1 0 0 ) PMT5ushiroF： 5' -CTAGTTCTAGAGCGGCCCAGGTCGCTTTCAGGCAGCAG-3' (配列番号 1 0 1 ) PMT5ushiroR： 5' -CACCGCGGTGGCGGCCAAGCTTGGGTACCGGCTCGCGTAG-3' (配列番号 1 0 2 )
( 2 - 2 ) PMT6遺伝子破壌べクターの作成
0. minuta IF010746株の染色体 DNAを铸型とし、 DNAプライマー PMT6inf5' armF (配列番号
1 0 3 ) と PMT6inf5' armR (配列番号 1 0 4 ) を用いて、 PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 2分、 72°Cで 2分） X 25サイクル]を行った。 増幅された約 2. 8kbの DNA断片を回収し、 BamHIで消 化した 1~111^ 81«へ：¾-^5：1(^キット（BD Bioscience)を用いて導入し、 挿入された遺伝子 断片の塩基配列を決定した。 得られたベクターを PMT6K/0/rURA3preと命名した。
0. minuta IF010746株の染色体 DNAを铸型とし、 DNAプライマー PMT6inf3' armF (配列番号
1 0 5 ) と PMT6inf 3' armR2 (配列番号 1 0 6 ) を用いて、 PCR[94°Cで 30秒、 55°Cで 2分、 72°Cで 2分） X 25サイクル]を行った。 増幅された約 2. 5kbの DNA断片を回収し、 Notl - SacII で消化した PMT6K/0/rURA3preへ In-fusionキット（BD Bioscience)を用いて導入し、 揷入 された遺伝子断片の塩基配列を決定した。 得られたベクターを PMT6K/0/rURA3と命名した。 PMT6inf5' armF： 5' -GCAGCCCGGGGgatccACGAAACCACGTCCTACT-3' (配列番号 1 0 3 )
PMT6inf5' armR： 5' -GGGGAAGCTcggatcGACTCATCTTGAAACGCA-3' (配列番号 1 0 4 )
PMT6inf3' armF： 5' -AGTTCTAGAGCGGCCTTACCACCATTACATGCC-3' (配列番号 1 0 5 )
PMT6inf3' armR2： 5' -AATTGGAGCTCCACCGCGGCCGCAACTTACTCGACGCTAA-3' (配列番号 1 0 6 )
〔実施例 2 4〕 PMT遺伝子が分断または破壊された 0. minuta抗体生産株の作成と評価 ( 1 ) PMT遺伝子が分断された 0. minuta抗体生産株の作成
実施例 1 8にて育種した抗体生産株 0. minuta YY1株に、 実施例 2 3にて作成された PMT 遺伝子分断ベクターについて、 PMT1遺伝子分断ベクターについては Pstl、 PMT2遺伝子分断 ベクターについては Xhol、 PMT4遺伝子分断べクタ一については Hindi 11にて消化し、 上記 エレクトロポレーシヨン法によって導入した。 形質転換株の PMT遺伝子の分断の確認は、
Zeocineを 50 g/mlとなるよう添加した YPD寒天プレート培地にて選択し、 培養後、 ゲノム を抽出し、 PMT1遺伝子については、 Zeol (配列番号 1 0 7) と PMTlzeol (配列番号 1 0 9) の組み合わせと、 Zeo2 (配列番号 108) と PMTlzeo2 (配列番号 1 1◦ ) の組み合 わせの DNAプライマー、 PMT2遺伝子については、 Zeol (配列番号 1 07 ) と PMT2zeol (配 列番号 1 1 1) の組み合わせと、 Zeo2 (配列番号 1 08) と PMT2zeo2 (配列番号 1 1 2) の組み合わせの DNAプライマー、 PMT4遺伝子については、 Zeol (配列番号 1 0 7 ) と PMT4PCR3' armF (配列番号 1 1 3 ) の組み合わせと、 Zeo2 (配列番号 1 0 8 ) と PMT4PCR5' armR3 (配列番号 1 14) の組み合わせの DNAプライマー用いた PCR[94°Cで 30秒 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分） X 30サイクル]にて分断ベクター導入による各 PMT遺伝子の分断 を確認した。
Zeol： 5' -GAACGGCACTGGTCAACTTGGCCAT-3' (配列番号 1 07)
Zeo2： 5' -CTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGA-3' (配列番号 1 08)
PMTlzeol： 5' -GAATTCTAGCCGAGCATGAGCTA-3 ' (配列番号 1 09)
PMTlzeo2： 5' - CGTTCAGACTCTTGTTGATTTTCCAC - 3， （配列番号 1 1 0)
PMT2zeol： 5' -GCTGTGCCACTGCACGCCTCGACTC-3 ' (配列番号 1 1 1)
PMT2zeo2： 5' -CTTGTCCCTCTTGAATGGCGAGTG-3 ' (配列番号 1 1 2)
PMT4PCR3' armF： 5' -GGAACACGCCAAACATCATG -3' (配列番号 1 1 3)
PMT4PCR5' arraR3： 5， -CACAAGCAGAATCAGGCAC -3' (配列番号 1 14)
得られた株をそれぞれ、 0. minuta YY2P1株 （PMT1遺伝子分断） 、 0. rainuta YY2P2株
(PMT2遺伝子分断） 及ぴ 0. minuta YY2P4株 （PMT4遺伝子分断） と命名した。 同時にコン トロールとして Sse8387I消化した GAP/Z を 0. minuta YY1株に導入し、 Zeocine而; H生株を選 択することで 0. rainuta YY2Z株を得た。
( 2 ) PMT遺伝子が分断された 0. rainuta抗体生産株による分泌抗体の生産性
上記 （1) で作成された各 PMT遺伝子分断抗体生産株を実施例 1 8 (2) に示した方法 で培養し、 ウェスタン解析を行った。 その結果、 図 1 2およぴ図 14に示す通り、 PMT1遺 伝子が分断された 0. rainuta YY2P1株、 PMT2遺伝子が分断された 0. minuta YY2P2株、 およ ぴ PMT4遺伝子が分断された 0. minuta YY2P4株では、 上記 （1 ) で作成した 0. minuta
YY2Z株と比較して、 抗体会合体分泌量の若干の増加を確認した （図 1 2 ： レーン 3、 レー ン 6、 図 14 ： レーン 3) 。
( 3 ) PMT遺伝子が分断された 0. minuta抗体生産株による分泌抗体の生産性 （TR - FRETを原 理としたホモジニァス分析による定量）
実施例 2 1 (3) に記載の方法にて、 上記 （2) にて調製された培養液中の抗体生産量 を測定した。 スタンダードとして、 動物細胞 （CH0) にて生産した抗体を用いた。 図 1 3 および図 1 5に示す通り、 PMT1遺伝子が分断された 0. minuta YY2P1株、 PMT2遺伝子が分 断された 0. minuta YY2P2株、 および PMT4遺伝子が分断された 0. minuta YY2P4株では、 上 記 （1) で作成した 0. minuta YY2Z株と比較して、 抗体会合体分泌量の若干の增加を確骣 した （図 1 3 ： YY2PU YY2P2、 図 1 5 ： ΥΥ2Ρ4) 。
( 4 ) ΡΜΤ5ならぴに ΡΜΤ6破壊株の作成と評価
(4— 1) 0. minuta PMT5遺伝子破壊株 （ Δ ochl厶 ypsl Δ ura3 Aadel Apmt5) の作成 実施例 23 (2-1) にて作成した PMT5遺伝子破壊べクター？¾^515/0/1¾1^3を11 (1111で 消化後、 実施例 1 7にて作成した、 Ogataea minuta YK5株 （ Aochl Aura3 Δ adel Aypsl) へ、 電気パルス法にて形質転換を行った。 これらの株の PMT5遺伝子が破壊されたことを確 認するために、 以下のプライマーを合成した。
gPMT5-5： 5， -CGGTGACGACTTCGACTAGTCGAG-3 ' (配列番号 1 1 5)
gPMT5-2： 5' -CGGTGCTGTTGGCGTCGTCATGGGTG-3 ' (配列番号 1 1 6)
gPMT5-3： 5' -GGCGCGTTCCAATTCCACTCTGCTG-3' (配列番号 1 1 7)
gPMT5-4： 5' -CGACGAGTCCTCTCACCAGGAGGTTG-3' (配列番号 1 1 8)
形質転換株から単離した染色体 DNAを鎳型とし、 プライマー gPMT5-5 (配列番号 1 1 5 ) と gPMT5- 2 (配列番号 1 16) を用いて、 PCR ( (94°Cで 30秒、 60°Cで 1分、 72°Cで 2分） X
25サイクル） を行った。 プラスミ ドが PMT5座に組み込まれた株からは、 4.9kbの増幅 DNA断 片が検出された。 同様に、 形質転換株から単離した染色体 DNAを铸型とし、 プライマー gP T5-3 (配列番号 1 1 7) と gPMT5-4 (配列番号 1 18) を用いて、 PCR ( (94°Cで 30秒、
60°Cで 1分、 72°Cで 2分） X25サイクル） を行った。 プラスミドが PMT5座に組み込まれた株 からは、 4.9kbの増幅 DNA断片が検出された。 選抜した株を 0. minuta YK6株 （ Δ ochl Δ ura3AadelAypslApmt5: :URA3) と命名した。
(4-2) 0. minutaPMT6遺伝子破壊株 （ Δ ochl Δ ypsl Δ ura3△ adel Apmt6) の作成 実施例 23 (2- 2) にて作成した PMT6遺伝子破壌べクタ一 PMT6K/0/rURA3を BamHI-
Notlで消化後、 実施例 1 7にて作成した、 0. minuta YK5株 （ Δ ochl Δ ura3 Δ adel厶 ypsl) へ、 電気パルス法にて形質転換を行った。 これらの株の PMT6遺伝子が破壌されたこ とを確認するために、 以下のプライマーを合成した。
PMT6 PCR3' arraF： 5' -TGTGGGTGCGATCCTGAG-3' (配列番号 1 1 9 )
PMT6 PCR3' armR： 5' -GCCGTCGTTGGAGCAAAACT-3' (配列番号 1 2 0 )
PMT6 PCR5' arraF： 5' -GCATGTGCCACTGCTAAA - 3' (配列番号 1 2 1 )
PMT6 PCR5' armR： 5' - GACCAACTTTCCCGTGTAA- 3' (配列番号 1 2 2 )
形質転換株から単離した染色体 DNAを铸型とし、 プライマー PMT6 PCR3' arraF (配列番号
1 1 9 ) と PMT6 PCR3' armR (配列番号 1 2 0 ) を用いて、 PCR ( (94°Cで 30秒、 60°Cで 1分、
72°Cで 2分） X 25サイクル) を行った。 プラスミ ドが PMT6座に組み込まれた株からは、
5. 8kbの増幅 DNA断片が検出された。 同様に、 形質転換株から単離した染色体 DNAを鎳型と し、 プライマー PMT6 PCR5' armF (配列番号 1 2 1 ) と PMT6 PCR5' armR (配列番号 1 2 2 ) を用いて、 PCR ( (94°Cで 30秒、 60°Cで 1分、 72°Cで 2分） X 25サイクル) を行った。 プラ スミ ドが PMT6座に組み込まれた株からは、 6. 3kbの増幅 DNA断片が検出された。 選抜した株 を 0. minuta YK7株 （ Δ ochl A ura3 Δ adel A ypsl A pmt6 : :URA3) と命名した。
( 5 ) PMT5ならびに PMT6遺伝子が破壊された 0. minuta抗体生産株の作成
Notlで消化した抗体発現ベクター pOMexGPA/AbLys (実施例 1 8 ( 1 ) で作成） と
Sse8387I で消化した抗体発現ベクター pOMexHy/AbLys (実施例 1 8 ( 1 ) で作成） を用い て、 エレク ト口ポレーシヨ ンにより 0. minuta YK6株 ( Δ ochl Δ ypsl Δ ura3 Δ adel Δ prat 5：： rURA3) ならびに 0. minuta YK7株 ( Δ ochl Δ ypsl Δ ura3 Δ adel Δ pmt6：： rURA3) を 形質転換した。 形質転換された細胞はハイグロマイシン Bが 50 /i g/mlとなるよう添加され た SD寒天プレート培地 （2%グルコース、 0. 67°/。酵母ニトロゲンベース 〔Difco社〕 ) にて選 択した。 単一コロニーを B2YP4G培地 [1. 34%酵母ニトロゲンベース （D co社） 、 2%酵母ェ キス （Difco社） 、 4%ポリペプトン （Difco社） 、 4°/。グリセロール、 0. 1Mリン酸緩衝液
(PH6. 0) ]を用いて、 27°C、 4日間培養した。 培養液より培養上清を調製し、 実施例 7に記 載の方法にてゥエスタン解析を行い、 抗体軽鎖およぴ重鎖遺伝子が導入された抗体生産株 を選択した。 得られた株はそれぞれ、 0. minuta AP5株 （PMT5遺伝子破壊株） ならび 0. minuta AP6株 （PMT6遺伝子破壊株） と命名した。 一方、 コントロールとして、 Notlで消化 した抗体発現ベクター pOMexGPA/AbLysと Sse8387Iで消化した pOMexHy/AbLysをエレクト口 ポレーシヨンによって、 0. minuta YK4株 （ Δ ochl Δ ura3 Δ adel Δ ypsl： : rURA3) へ導入し、 上記の方法と同様に抗体発現株を作成、 選択した。 得られた株は、 0. miuta Aeon株と命 名した。
( 6 ) PMT5ならびに PMT6遺伝子が破壊された 0. minuta抗体生産株による分泌抗体の生産 性
PMT5遺伝子破壊株である 0. minuta AP5株、 PMT6遺伝子破壌株である 0. minuta AP6株、 ならびに 0. rainuta Aeon株を実施例 1 8 ( 2 ) に示した方法で培養し、 非還元ウェスタン 解析を行った。 また培養液を実施例 2 1 ( 3 ) に記載の方法にて、 抗体生産量を測定した。 スタンダードとして、 動物細胞 （CH0) にて生産した抗体を用いた。 その結果、 図 1 6に 示すとおり、 0. minuta AP5株、 ならびに 0. minuta AP6株とコントロールに当たる 0. rainuta Aeon株とで抗体の会合体の生産性に大差はなかった。
〔実施例 2 5〕 PMT遺伝子が分断され、 かつ HAC1遺伝子が導入された 0. rainuta株の作成と 評価
( 1 ) PMT遺伝子が分断され、 かつ HAC1遺伝子が導入された 0. minuta株の作成
実施例 2 4 ( 1 ) で作成された、 0. minutaYY2P2株 （PMT2遺伝子分断株） 、 0. minuta YY2P4株 （PMT4遺伝子分断株） 、 および 0. minuta YY2Z株 （コントロール株） に、 実施例 3にて作成された 0. minuta由来活性型 HAC1遺伝子発現ベクター pOMexPGHy/Haclを Aor51HI で消化し、 上記エレクト口ポレーシヨン法によって導入した。 形質転換株の活性化 HAC1遺 伝子の導入は、 ハイグロマイシン Bを 50 / g/ralとなるよう添加した YPD寒天プレート培地に て選択し、 培養後、 ゲノムを抽出し、 活性型 HAC1遺伝子の導入を、 実施例 6の方法に従い、 PCRにて確認した。 得られた株を 0. rainuta YY3P2oraH株 （HAC1遺伝子導入 PMT2遺伝子分断 株） 、 0. minuta YY3P4omH株 （HAC1遺伝子導入 PMT4遺伝子分断株） 、 および 0. minuta YY3ZomH株 （HAC1遺伝子導入コントロール株） と命名した。 同時にコントロールとして Aor51HIで消化した pOMexPGHy を 0. minuta YY2Z株に導入し、 0. minuta YY3ZHy株 （ベタ ター導入コントロール株） を得た。
( 2 ) PMT遺伝子が分断され、 かつ HAC1遺伝子が導入された 0. minuta株による分泌抗体の 生産性
上記 （1 ) で作成された、 HAC1遺伝子が導入された各 PMT遺伝子分断抗体生産株を実施 例 1 8 ( 2 ) に示した方法で培養し、 ウェスタン解析を行った。 その結果、 図 1 2および 図 1 4に示す。 HAC1遺伝子が導入された PMT2遺伝子分断株である、 0. minuta YY3P2omH¾ は、 HACl遺伝子単独導入株である 0. rainuta YY3ZoraH株ならぴに、 PMT2分断株である 0.. minuta YY2P2株と比較して、 著量の抗体を分泌していた （図 1 2 ： レーン 7 ) 。 また、 HAC1遺伝子が導入された PMT4遺伝子分断株である 0. rainuta YY3P4omH株は、 HAC1遺伝子単 独導入株である 0. rainuta YY3ZoraH株ならぴに、 PMT4分断株である 0. minuta YY2P4株と比 較して、 著量の抗体を分泌していた （図 1 4 ： レーン 6 ) 。
また培養液を実施例 8および実施例 2 1 ( 3 ) に記載の方法にて、 抗体生産量を測定し た。 スタンダードとして、 動物細胞 （CH0) にて生産した抗体を用いた。 その結果、 図 1 3およぴ図 1 5に示す。 HAC1遺伝子が導入された ΡΜΤ2遺伝子分断株である 0. minuta YY3P2omH株は、 コントロールにあたる 0. minuta YY3ZomH¾ (HACl遺伝子単独導入株） 、 0. minuta YY2P2株 （PMT2遺伝子分断株） および、 0. rainuta YY3ZHy株 （ベクター導入コント ロール株） と比較して、 著量の会合抗体を分泌していた （図 1 3 ： 0. rainuta YY3P2omH 株） 。 また、 HAC1遺伝子が導入された PMT4遺伝子分断株である 0. minuta YY3P4omH株は、 コントロールにあたる 0. rainuta YY3ZomH¾ (HACl遺伝子単独導入株） 、 0, minuta YY2P4 株 （PMT4遺伝子分断株） および、 0. minuta YY3ZHy株 （ベクター導入コントロール株） と 比較して、 著量の会合抗体を分泌していた （図 1 5 : 0. rainuta YY3P4oraH¾) 。
〔実施例 2 6〕 PMT阻害剤 （lc) を用いた PMT遺伝子が分断され、 かつ HAC1遺伝子が導入さ れた 0. minuta株による抗体生産
上記実施例 2 5 ( 1 ) で作成された、 HAC1遺伝子が導入された各 PMT遺伝子分断抗体生 産株を 5mlの B2YP4G培地に 1白金耳、 植菌し 27°C、 1日間培養後、 0D600が 10になるように
B2YP4G培地にて希釈し、 実施例 9に記載の PMT阻害剤 （lc ;原液濃度 0. 1、 0. 5、 2. 5、 lOmM)を 0. 016、 0. 08、 0. 4、 2. 0 μ Mとなるように添加した。 更に 27°C、 3日間培養し、 24 時間毎に OD600を測定し、 0D600の 1増加につき 0. 00032、 0. 0016、 0. 008、 0. 04μ Μづっ PMT 阻害剤 （lc) を添加した。 培養液より培養上清を調製し、 実施例 1 8 ( 2 ) に示した方法 でウェスタン解析を行った。 その結果を、 図 1 7に示す。 更に実施例 2 1 ( 3 ) に記載の 方法にて、 分泌抗体の生産性を定量した。 その結果を、 図 1 8に示す。 0. minuta
YY3P2omH株 （HACl遺伝子導入 PMT2遺伝子分断株） では、 PMT阻害剤濃度を 0D600の 1増加に つき、 0. 008 ¾1程度添加 （原液濃度 2. 5mM) した場合に最も抗体の生産性が高く、 0. minuta YY3P4oraH株 （HACl遺伝子導入 PMT4遺伝子分断株） では PMT阻害剤を 0D600の 1増加に つき 0. 04μ Μ程度添加 （原液濃度 lOmM) した場合が最も抗体の生産性が高かった。 PMT遺伝 子の発現抑制と PMT阻害剤の併用で、 糖鎖付加が強力に抑制されていると考えられる。 HAC1導入株の糖鎖付加を抑制するには、 PMT遺伝子の発現抑制と PMT阻害剤の併用による PMTタンパク質の活性阻害により、 会合体抗体のさらなる高生産が期待できる。
〔実施例 2 7〕 PMT阻害剤 （5a) の評価
抗体遺伝子導入株である 0. rainuta YY1株を 5ralの B2YP4G培地に 1白金耳、 植菌し 27°C、 1日間培養後、 0D600が 10になるように B2YP4G培地にて希釈し、 実施例 9に記載の PMT阻害 剤 (lc) と は異 な っ た PMT阻害剤 ( { (5Z) -4-0X0-5- [3- (1-phenylethoxy) -4- (2- phenylethoxy; benzylidene]-2-thioxo-l, 3-thiazolidin-3-yl| acetic acid ( Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14， p3975, (2004)中の化合 ¾5a) ) を Ι μ Μ とな るよう添加した。 更に 27°C、 3日間培養し、 24時間毎に 0D600を測定し、 0D600の 1増加に つき 0. 02 づっ添加した。 培養液より培養上清を調製し、 実施例 1 8 ( 2 ) に示した方 法でウェスタン解析、 及び実施例 2 1 ( 3 ) に記載の方法にて、 分泌抗体の生産性を定量 した。 その結果を図 1 9及び図 2 0に示す。 抗体会合体の生産性は、 新たに検討した ΡΜΤ 阻害剤（5a)を添加することによつても、 増加する傾向にあり、 実施例 9に記載の PMT阻害 剤 c)と同等の効果を持つと考えられた。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 通常のタンパク質のみならず、 抗体などの構造が複雑なタンパク質を も酵母において高分泌生産することが可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子を有する形質転換宿主細胞。
2 . 以下の （1 ) の活性型 HAC1遺伝子と （2 ) の RRBP1遺伝子を有する、 請求項 1に記載 の形質転換宿主細胞。
( 1 ) 下記の （a；)〜 （d) から選択される活性型 HAC1遺伝子：
(a) 配列番号 23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(b) 配列番号 23に示すアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ Unfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタン パク質をコードする遺伝子
(c) 配列番号 23に示すアミノ酸列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 22に示す塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる DNAとス トリン ジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質 をコードする遺伝子
( 2 ) 下記の （e) 〜 （h) から選択される RRBP1遺伝子：
(e) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1をコードする遺伝子
(f) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性 を有するァミノ酸配列からなり、 かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードす る遺伝子
(g) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつリボソーム結 合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(h) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1遺伝子の塩基配列またはそれと相捕的な塩基配 列からなる遗伝子とストリンジユントな条件下でハイブリダィズし、 かつリボソーム結合 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
3 . 以下の （1 ) の活性型 HAC1遺伝子と （2 ) の RRBP1遺伝子を有する、 請求項 1に記載 の形質転換宿主細胞。
( 1 ) 下記の （i) 〜 （1) から選択される活性型 HAC1遺伝子：
Saccharomyces cerevisiae Trichoderma reesei ま 7こ i Aspergillus nidu丄 ans の活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子
、 Saccharomyces cerevisiae Trichoderma reesei ^ 3； 7こは Aspergillus nidulans の活性型 HAC1タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
(kj Saccharomyces ce:revisiae、 Trichoderma reesei^ ま 7こは Aspergillus rudu丄 ans の活性型 HAC1タンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコードする遺伝子
( l ) Saccharomyces cerevisiae> Trichoderma reesei ^ 3； 7こは Aspergillus nidulans の活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列か ちなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ UPRを活性化させる 機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
( 2 ) 下記の （e) 〜 （h) から選択される RRBP1遺伝子：
(e) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1をコードする遺伝子
(f) ヒ ト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性 を有するアミノ酸配列からなり、 かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードす る遺伝子
(g) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつリボソーム結 合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(h) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配 列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつリポソ一ム結合 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
4 . 宿主細胞が真核細胞である、 請求項 1から 3のいずれかに記載の形質転換宿主細胞。
5 . 真核細胞が酵母である、 請求項 4に記載の形質転換宿主細胞。
6 . 酵母がメタノ一ル資化性酵母である、 請求項 5に記載の形質転換宿主細胞。
7 . メタノ一ル資化性酵母が Ogataea rainutaである、 請求項 6に記載の形質転換宿主細胞。
8 . 酵母が Saccharomyces cerevisiaeである、 請求項 5に記載の形質転換宿主細胞。
9 . 外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した、 請求項 1から 8のいずれかに記載の 形質転換宿主細胞。
1 0 . 外来タンパク質が多量体タンパク質である、 請求項 9に記載の形質転換宿主細胞。
1 1 . 多量体タンパク質がヘテロ多量体である、 請求項 1 0に記載の形質転換宿主細胞。
1 2 . ヘテロ多量体が抗体またはその機能的断片である、 請求項 1 1に記載の形質転換宿 主細胞。
1 3 . 請求項 9から 1 2のいずれかに記載の形質転換宿主細胞を培地に培養し、 培養物か ら目的タンパク質を採取することを特徴とする、 タンパク質の製造方法。
1 4 . 培養を Protein O-mannosyltransferase (PMT)活性を抑制する条件下で行うことを 特徴とする、 請求項 1 3に記載の製造方法。
1 5 . Protein O-mannosyltransferase (PMT)活性の抑制が、 培地に PMT活性阻害剤を添加 することにより行われる、 請求項 1 4に記載の製造方法。
1 6 . メタノ一ル資化性酵母の活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子。
1 7 . 下記の （a) から （d) のいずれかの遺伝子。
(a) 配列番号 23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(b) 配列番号 23に示すアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ Unfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタン パク質をコードする遺伝子
(c) 配列番号 23に示すアミノ酸列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 22に示す塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる DNAとストリン ジヱントな条件下でハイブリダィズし、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質 をコードする遺伝子
1 8 . 請求項 1 7に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
1 9 . pOMexPGHy/Haclである、 請求項 1 8に記載の発現ベクター。
2 0 . 活性型 HAC1遺伝子と RRBP1遺伝子を含む発現べクタ一。
2 1 . 活性型 HACl遺伝子が、 請求項 1 7に記載の遺伝子である、 請求項 2 0に記載の発現 ベクタ1 ~~
2 2 . 活个生型 HAC丄遺伝十力 S、 Saccharorayces cerevisiae Trichoderma reesei また Aspergillus nidulansの活性型 HAClタンパク質をコードする遺伝子、 またはそれらの相同 遺伝子である、 請求項 2 0に記載の発現ベクター。
2 3 . YEp351GAP- II- aHACl/pl80である、 請求項 2 0に記載のベクター。
2 4 . RRBP1遺伝子が、 ヒ ト若しくはィヌ由来の RRBP1遺伝子、 またはそれらの相同遺伝子 である、 請求項 2 0に記載の発現ベクター。
2 5 . 請求項 1 8から 2 4のいずれかに記載の発現ベクターを導入した形質転換宿主細胞。
2 6 . 活性型 HAC1遺伝子を含む発現ベクター、 及ぴ RRBP1遺伝子を含む発現ベクターを導 入した形質転換宿主細胞。
2 7 . 活性型 HAC1遺伝子を含む発現ベクターが請求項 1 8または 1 9に記載の発現べクタ —である、 請求項 2 6に記載の形質転換宿主細胞。
2 8 . 活个生型 HAC1遺 1 十力、 Saccharomyces cerevisiae^ Trichoderma reesei ま 7こ【ま Aspergillus nidulansの活性型 HAClタンパク質をコードする遺伝子、 またはそれらの相同 遺伝子である、 請求項 2 6に記載の形質転換宿主細胞。
2 9 . RRBP1遺伝子が、 ヒ ト若しくはィヌ由来の RRBP1遺伝子、 またはそれらの相同遺伝子 である、 請求項 2 6に記載の形質転換細胞。
3 0 . 以下の行程を含む、 形質転換された宿主細胞の製造方法。
(A) 宿主細胞に対して、 活性型 HAC 1遺伝子を導入する行程
( B ) 宿主細胞に対して、 RRBP1遺伝子を導入する行程
3 1 . 活性型 HAC 1遺伝子が、 以下のいずれかの遺伝子である、 請求項 3 0に記載の製造 方法：
(1) 請求項 1 7に記載の遺伝子
(2) Saccharomyces cerevisiae、 Trichoderma reesei、 7こは Aspergillus nidulansの 活性型 HAClタンパク質をコードする遺伝子
(3) Saccharomyces cerevisiae、 irichoderma reesei ^ ま Γこは Aspergillus nidulansの 活性型 HAClタンパク質のァミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸配 列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子 (4) Saccharorayces cerevisiae Trichoderma ： reesei、 または Aspergillus nidulansの 活性型 HAC1タンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および/または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコードする遺伝子
(5) Saccharomyces cerevisiae^ Trichoderma reesei、 まには Aspergillus nidulans © 活性型 HAC1タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列から なる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ UPRを活性化させる機 能を有するタンパク質をコードする遺伝子
3 2 . RRBP 1遺伝子が以下のいずれかの遺伝子である、 請求項 3 0に記載の製造方法：
(1) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1をコードする遺伝子
(2) ヒト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を 有するアミノ酸配列で表され、 かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする 遺伝子
(3) ヒ ト由来またはィヌ由来の RRBP 1のアミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ 酸が欠失、 置換、 および/または付加されたアミノ酸配列で表され、 かつリボソーム結合 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(4) ヒ ト由来またはィヌ由来の RRBP 1遺伝子の塩基配列またはそれと相捕的な塩基配列 からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつリボソーム結合活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子
3 3 . 宿主細胞が真核細胞である、 請求項 3 0から 3 2のいずれかに記載した製造方法。
3 4 . 真核細胞が酵母である、 請求項 3 3に記載の製造方法。
3 5 . 酵母がメタノ一ル資化性酵母である、 請求項 3 4に記載の製造方法。
3 6 . メタノ一ル資化性酵母が Ogataea minutaである、 請求項 3 5に記載の製造方法。
3 7 . 酵母が Saccharomyces cerevisiaeである、 請求項 3 4に記載の製造方法。
3 8 . 下記の （a) から （d) のいずれかの遺伝子。
(a) 配列番号 70に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(b) 配列番号 70に示すアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ Unfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタン パク質をコードする遺伝子 (c) 配列番号 70に示すアミノ酸列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ UPRを活性化させる機能を有する タンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 69に示す塩基配列またはそれと相捕的な塩基配列からなる DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ UPRを活性化させる機能を有するタンパク質 をコードする遺伝子
3 9 . 請求項 3 8に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
4 0 . pOMexPGHy/PpHaclである、 請求項 3 9に記載の発現ベクター。
4 1 . 0型糖鎖合成を抑制する条件下で、 活性型 HAC1遺伝子及び/又は RRBP1遺伝子と外来 タンパク質をコードする遺伝子とを導入した形質転換細胞を培地に培養し、 培養物から目 的タンパク質を採取することを特徴とする、 タンパク質の製造方法。
4 2 . 0型糖鎖合成の抑制が、 PMT遺伝子を分断することにより行われる、 請求項 4 1に記 載のタンパク質の製造方法。
4 3 . 0型糖鎖合成の抑制が、 PMT活性阻害剤を培地に添加することにより行われる、 請求 項 4 1に記載のタンパク質の製造方法。
4 4 . 0型糖鎖合成の抑制が、 PMT遺伝子を分断し、 かつ、 PMT活性阻害剤を培地に添加す ることにより行われる、 請求項 4 1に記載のタンパク質の製造方法。
4 5 . PMT活十生阻害剤力 5- [ [3, 4- (1- henylmethoxy) phenyl] methylene] -4-oxo-2- thioxo-3-thiazolidineacetic acidまたは ί (5Ζ) -4~οχο-5- [3- (1-phenylethoxy) -4- (2- phen iethoxy) benzy丄 idene]—2— thioxo— 1, 3— thiazo丄 ldin— 3— yl} acetic acidであ -a、 g盲求 項 4 3または 4 4に記載のタンパク質の製造方法。
4 6 . 活性型 HAC1遺伝子を導入し、 PMT遺伝子を分断した形質転換宿主細胞。
4 7 . 宿主細胞が、 Ogataea minutaである、 請求項 4 6に記載の形質転換細胞。
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