WO2007148733A1 - 標的核酸の検出方法及び該検出方法に用いる容器 - Google Patents

標的核酸の検出方法及び該検出方法に用いる容器 Download PDF

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Definitions

  • Target nucleic acid detection method and container used for the detection method
  • the present invention relates to a method for detecting the presence or absence or concentration of a nucleic acid to be detected, and a container used in the detection method.
  • Patent Document 1 As a typical technique for detecting a specific target nucleic acid present in a sample, a technique using a no-obtaining hybridization method is known (see Patent Document 1). This method is a technique that makes it possible to detect a target nucleic acid such as DNA or RNA, which is present in a very small amount, from a sample containing many types of nucleic acids.
  • Patent Document 1 JP-A-7-51099
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 63_60854
  • nucleic acids inherently have a problem that they may hybridize non-specifically.
  • the target nucleic acid has a base sequence similar to the non-target nucleic acid, it may be difficult to selectively detect only the target nucleic acid in the sample force. Therefore, the method described in Patent Document 1 has a problem that the target nucleic acid cannot always be detected with high accuracy.
  • Patent Document 2 The container described in Patent Document 2 is used for detecting red blood cells. Nucleic acids and erythrocytes have a large difference in molecular size and structure. Therefore, there is a problem that this container cannot be used for detection of target nucleic acids as they are.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and uses a hybridization method. It is an object of the present invention to provide a method for easily and accurately detecting a target nucleic acid, and a container used for the detection method.
  • the present invention has the following configuration.
  • the target nucleic acid detection method of the present invention is a target nucleic acid detection method in which different types of first ligands and second ligands are bound to the nucleic acid to be detected.
  • First microparticles in which a plurality of first receptors that specifically bind to Gand are bound, and second microparticles in which a plurality of second receptors that specifically bind to the second ligand are bound
  • a step of mixing the target fine acid-containing sample, the first fine particles, and the second fine particles in a container having a sediment capturing part on the bottom surface is a target nucleic acid detection method in which different types of first ligands and second ligands are bound to the nucleic acid to be detected.
  • a method for detecting a target nucleic acid comprising the step of observing the capture distribution of the sediment of the second fine particles on the bottom surface of the container.
  • the target nucleic acid detection method of the present invention is a target nucleic acid detection method in which different types of first ligand and second ligand are bound to the nucleic acid to be detected.
  • a method for detecting a target nucleic acid comprising the step of observing the distribution of magnetic fine particles on the bottom of the container by applying a magnetic force.
  • the target nucleic acid detection method of the present invention is a target nucleic acid detection method characterized by performing both the detection method described in (1) above and the detection method described in (2) above.
  • the target nucleic acid detection method of the present invention is the target nucleic acid detection method according to any one of (1) to (3) above, wherein the sample contains a target nucleic acid having a known concentration (1 ) And observation results when using the sample (2) containing the target nucleic acid. The presence or concentration of the target nucleic acid in the sample (3) is confirmed by comparing the observation result when using the sample (3) that may contain the target nucleic acid. This is a method for detecting a target nucleic acid.
  • the target nucleic acid detection method of the present invention is the target nucleic acid detection method according to any one of the above (1) to (3), wherein the sample contains a known different concentration of the target nucleic acid. Is compared with the observation result when using the sample (4) that may contain the target nucleic acid, the presence or absence of the target nucleic acid in the sample (4) This is a method for detecting a target nucleic acid, characterized in that the concentration is confirmed.
  • the ligand is a hydrophilic organic compound, digoxigen, fluorescein, alexa, fluorescein isothiocyanate (FITC), 2, 4-dinitrophenol ( DNP), tetramethylrhodamine (TAMRA), polypeptide with 6 or more amino acid residues, sugar chain with 2 or more monosaccharides linked, piotin, protein, polyhistidine, HA, dartathione S-transferase (GST), SEQ ID NO:
  • the target according to any one of (1) to (5) above, which is selected from the group consisting of a peptide comprising the amino acid sequence represented by 1 and a derivative thereof. This is a method for detecting a nucleic acid.
  • the target nucleic acid uses a first primer to which a first ligand is bound and a second primer to which a second ligand is bound.
  • the target nucleic acid further incorporates a second primer while incorporating at least one nucleotide bound to the first ligand using the first primer.
  • a second primer while incorporating at least one nucleotide bound to the first ligand using the first primer.
  • the target nucleic acid is of a plurality of different types, and at least one of the first and second ligands in the target nucleic acid is different for each type of target nucleic acid.
  • the target nucleic acid test according to any one of (1) to (8) above, It is a way out.
  • the target nucleic acid detection method of the present invention is the target nucleic acid detection method according to any one of (1) to (9) above, wherein the target nucleic acid is derived from a living body. .
  • the target nucleic acid detection method of the present invention is characterized in that the first and second microparticles have a particle size of 0.1 to 10 ⁇ m and are optically distinguishable from each other.
  • the sediment capturing part of the container has a conical shape on a bottom surface having a mortar shape, and a plurality of concavities and convexities having a sawtooth shape in a radial direction are arranged concentrically.
  • the length (h) of the first slope connecting the mountain to the valley from the center to the outside is 0.2 to 20 / im
  • the second slope connecting the valley to the mountain from the center to the outside The length (1) is 0.5 to 50 / im
  • the angle ( ⁇ ) between the straight line connecting the mountain and the center and the horizontal plane (15) is 15 to 45 °.
  • the sediment trapping part of the container is formed such that a plurality of recesses are independently provided on a bottom surface having a mortar shape, and the bottom surface and a horizontal plane are formed.
  • the angle ( ⁇ ) is 15 to 45 °
  • the opening has a diameter (L) of 0.05 to 100 ⁇ m and a depth (d) of 0.03 to 60 ⁇ m.
  • a method for detecting a target nucleic acid according to the present invention is a method for detecting a target nucleic acid comprising performing the detection method according to (13) above and the detection method according to (14) or (15) above. It is a method.
  • Targets listed in This is a method for detecting a nucleic acid.
  • the container may have a bottom surface of a substantially hemispherical surface or a substantially conical surface, and an angle ( ⁇ ) formed between the bottom surface and a horizontal surface is 15 to 45 °.
  • the target diffusion detection container of the present invention is a container used in the method for detecting a target nucleic acid according to any one of (1) and (3) to (12) above, A plurality of concavities and convexities with a sawtooth cross section in the radial direction are concentrically arranged on the bottom surface, and the length (h) of the first inclined surface connecting the mountain to the valley from the center to the outside is 0. 2 to 20 zm, the length (1) of the second slope connecting the valley to the mountain from the center to the outside is 0.5 to 50 zm, and the angle between the straight line connecting the mountain and the center with the horizontal plane A container for detecting a target nucleic acid, wherein ( ⁇ ) is 15 to 45 °.
  • the target nucleic acid detection container of the present invention is a container used in the target nucleic acid detection method according to any one of (1) and (3) to (12) above, and has a mortar shape.
  • a plurality of recesses are provided independently on the bottom, and the angle ( ⁇ ) between the bottom and the horizontal plane is 15-45 °.
  • a container for detecting a target nucleic acid which is characterized in that it exists.
  • the container for detecting a target nucleic acid of the present invention has a diameter (L) of the opening of the concave portion of 0.05 to 100 / im, depth (d) force SO. 03 to 60 ⁇ m.
  • the target nucleic acid detection container of the present invention is a container used in the target nucleic acid detection method according to any one of (2) to (10), (12) and (17),
  • the bottom is approximately hemispherical or conical, and the angle ( ⁇ ) between the bottom and the horizontal plane is 15 to 45 °.
  • a target nucleic acid detection container according to the present invention is provided with a plurality of containers according to any one of the above (19) to (22) on the same plate. This is a detection container.
  • the present invention by visually observing the sediment capture distribution on the bottom of the container, The presence or concentration of the target nucleic acid can be detected easily and with high accuracy.
  • FIG. 1A is a conceptual diagram showing a method for obtaining a target nucleic acid.
  • FIG. 1B is a conceptual diagram showing a method for obtaining a target nucleic acid.
  • FIG. 1C is a conceptual diagram showing a method for obtaining a target nucleic acid.
  • FIG. 1D is a conceptual diagram showing a method for obtaining a target nucleic acid.
  • FIG. 2A is a view showing fine particles to which a receptor is bound.
  • FIG. 2B is a diagram showing fine particles to which a receptor is bound.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing fine particles when aggregated with a target nucleic acid.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing an example of the container of the present invention.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing another example of the container of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of sediment trap distribution when the container shown in FIG. 4 is used.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of sediment trap distribution when the container shown in FIG. 5 is used.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view showing another example of the container of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing magnetic fine particles to which a receptor is bound.
  • FIG. 10A is a conceptual diagram showing a state in which the container shown in FIG. 8 and the magnetic fine particles shown in FIG. 9 are connected via a target nucleic acid.
  • FIG. 10B is a conceptual diagram showing a state where the container shown in FIG. 8 and the magnetic fine particles shown in FIG. 9 are connected via a target nucleic acid.
  • FIG. 10C is a conceptual diagram showing a state in which the container shown in FIG. 8 and the magnetic fine particles shown in FIG. 9 are connected via a target nucleic acid.
  • FIG. 11 is a diagram showing an example of a distribution pattern of magnetic fine particles in FIGS. 10A to 10C.
  • Target nucleic acid 31 ⁇ first ligand, 32 ⁇ second ligand, 33 ⁇ first microparticle, 331 ⁇ first receptor, 34 ⁇ ... second microparticle, 341 ... second receptor best mode for carrying out the invention
  • the target nucleic acid detection method of the present invention is roughly divided into a step of obtaining a target nucleic acid having a structure in which a ligand is bound to a nucleic acid to be detected, and a step of detecting the target nucleic acid via the ligand.
  • each step will be described in detail.
  • the nucleic acid to be detected is not particularly limited, and is any nucleic acid or nucleic acid analog including cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, total RNA, hnRNA, synthetic RNA, etc., and is derived from a living body. Or it may be artificially synthesized.
  • ligand bound to the nucleic acid to be detected a conventionally known ligand can be used, and preferable examples thereof include hydrophilic organic compounds, haptens, digoxigen, fluorescein, alexa, fluorescein isothiocyanate.
  • FITC Ocynate
  • DNP 2, 4-Dinitrophenol
  • TAMRA Tetramethylrhodamine
  • histidine, HA, dartathione S-transferase (GST), a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a derivative thereof, and the like is not limited thereto.
  • Piotin, digoxigen, fluorescein, Alexa, etc. are easy to obtain from the market and have the advantage of low price.
  • sugar chains and peptides have the advantage that it is easy to prepare multiple types with a high degree of freedom in designing chemical structures.
  • the ligand to be used may be appropriately selected depending on the nucleic acid to be detected, the sample and the like.
  • a target nucleic acid in which one or more different types of first and second ligands are respectively bound to the nucleic acid to be detected is first formed.
  • a method for obtaining a target nucleic acid having a structure in which the first and second ligands are bound to the nucleic acid to be detected is, for example, (i) A method in which the first ligand 31 and the second ligand 32 are covalently bound to the base and / or the 5 ′ end of the nucleic acid by using a linker or via a linker (FIG.
  • nucleic acid to be detected is mixed with other non-detectable nucleic acids, such as biological samples or arbitrary analytes
  • the methods (ii) and (iii) are preferred.
  • the nucleic acid to be detected is present alone, any method may be used.
  • a nucleic acid to be detected contained in a biological sample or the like may be detected after being amplified by PCR, but may be used as it is without being amplified.
  • the target nucleic acid 30 there are two types of ligands in the target nucleic acid 30, the first ligand 31 and the second ligand 32.
  • the structure of the nucleic acid is flexible, and in the present invention, as described later, it is essential that the target nucleic acid binds to different types of first and second microparticles.
  • the number of the first ligand and the second ligand in the target nucleic acid may be one each, but may be two or more. Since the volume ratio of nucleic acid to microparticle is extremely large, it is unlikely that three or more microparticles will bind to one nucleic acid. Therefore, even if there are multiple ligands in one target nucleic acid, it is considered that the degree of aggregation of the fine particles to which the target nucleic acid is bound will not be affected.
  • the method (ii) or (iii) may be performed simultaneously to prepare a plurality of types of target nucleic acids.
  • at least one of the first ligand and the second ligand in each target nucleic acid is preferably different for each type of target nucleic acid.
  • the detection process is broadly divided into two methods, and it is possible to detect either method alone, but by combining the two methods, more accurate detection results can be obtained.
  • the power of S is possible. The following describes the two methods in turn.
  • First microparticles in which a plurality of first receptors that specifically bind to the first ligand are bound, and second microparticles in which a plurality of second receptors that specifically bind to the second ligand are bound Prepare the particles.
  • the fine particles used in the present invention are dispersible fine particles.
  • fine particles that are dispersed in a solution such as colloid particles, and latex particles are preferably used, but are not limited thereto.
  • the particle diameters of the first fine particles and the second fine particles are preferably 0.:! To 10. Onm. If fine particles with such a particle size are used, stable aggregates can be easily obtained.
  • specific binding means, for example, a highly specific intermolecular force formed in a structure-selective manner between specific substances such as an antigen and an antibody. It means a connection based on.
  • Latex particles are mainly composed of polystyrene, and metatalic acid is copolymerized to improve hydrophilicity and dispersibility.
  • the charge on the plain type surface has a negative charge due to the presence of methacrylic acid, and can be ionized with a positively charged region in the protein molecule. It can also be hydrophobically bound to protein molecules.
  • Plain type latex particles adsorb proteins by simply mixing them with proteins, making protein fixation easy. As a receptor, various types of force can be used as described later. When various proteins are used, such plain type latex particles are preferably used as fine particles.
  • Latex particles having a functional group are designed such that a carboxy group or an amino group is exposed on the surface, and various types of functional group type latex particles can be used.
  • a conventionally known method can be applied, in which the functional group in the functional group type latex particle and the functional group of the receptor are bound.
  • EDAC method to combine carboxylic acid and amino group with water-soluble carbopositimide, 1 _ethyl _ 3 _ (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydride chloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) are mixed in advance to bond carboxylic acid and amino group, a method of crosslinking amino groups with a bipolar linker, activated aldehyde And a method for bonding a functional group in a receptor with a group or tosyl group.
  • EDC epimethylaminopropyl carbodiimide hydride chloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • a conventionally known method or a known method can be used as long as the effects of the present invention are not impaired, but the EDAC method is particularly preferable.
  • functional group type latex particles are preferably used when various proteins are used as a receptor.
  • the receptor can be bound by a conventionally known method according to the type of fine particles.
  • the first receptor that binds to the first microparticle is a receptor that specifically binds to the first ligand in the target nucleic acid, and the second receptor that binds to the second microparticle.
  • a receptor that specifically binds to the second ligand is used.
  • an antibody, a lectin, a streptavidin or the like that can be used is not limited thereto. Of these, proteins, particularly antibodies, are preferably used.
  • a single kind of receptor is bound to one fine particle.
  • at least two types of ligands are bound to the target nucleic acid
  • at least two types of microparticles are prepared for one type of target nucleic acid. That is, as shown in FIG. 2A to FIG. 2B, the first fine particles 33 (FIG. 2A) to which the first receptor 331 that specifically binds to the first ligand 31 is bound, and the second ligand 32 A second microparticle 34 (FIG. 2B) to which a second receptor 341 that specifically binds is bound is prepared.
  • two or more kinds of receptors may be bound to one fine particle.
  • a receptor that specifically binds to one type of ligand and a receptor other than a receptor that specifically binds to the remaining types of ligands are combined into one fine particle. That is, it is designed so that only one kind of two or more kinds of ligands in the target nucleic acid binds to one fine particle.
  • the first fine particles and the second fine particles are preferably optically distinguishable from each other.
  • the first fine particles and the second fine particles are not the same color but different.
  • the color is preferred. In this way, it becomes easy to identify the fine particles at the operation stage, and even when self-aggregation occurs with one kind of fine particles when observing the aggregated image, it can be easily distinguished by color.
  • the possibility of misjudging agglomeration as agglomeration by the first and second fine particles is reduced. That is, the target nucleic acid can be detected with higher accuracy.
  • the binding of the receptor to the microparticles in this step may be performed when detecting the target nucleic acid, but the microparticles to which the receptor has been bound in advance may be used for detection. In addition, this step may be performed before or after the step of preparing the target nucleic acid.
  • This step is performed in a container having a sediment capturing part on the bottom surface, which will be described later. If the sample possibly containing the target nucleic acid for detection actually contains the target nucleic acid, the binding between the first ligand and the first receptor as described above, and the second The target nucleic acid and the microparticles are linked through the binding between the ligand and the second receptor, and an aggregate is formed as described later. If the sample to be detected does not contain the target nucleic acid, such binding does not occur and aggregates do not form.
  • This step may be performed by mixing the sample that may contain the target nucleic acid, the first microparticle, and the second microparticle at the same time, or the sample that may contain the target nucleic acid.
  • the first fine particles and the second fine particles may be mixed in order and sequentially performed.
  • the sample, the first microparticles, and the second microparticles that may contain the target nucleic acid are preferably used as solutions.
  • the solution used in this step is more preferably a buffer solution that promotes the preferred aggregation of the buffer solution.
  • Examples of such a preferable buffer include a buffer having the following composition; 200 mM OPSO (pH 7.4), 4% dextran, lOOmM NaCl, and 0.1% sodium azide. What is necessary is just to select suitably according to the kind of microparticles
  • the amount of the first and second microparticles used for mixing is too small, because the detection accuracy is lowered. Specifically, it is preferable that the amount of the first and second microparticles is smaller than the target nucleic acid.
  • the amount of fine particles is more preferably 0.01 to 0.5 w / v% with respect to the target nuclear acid.
  • this step is preferably performed at 0 to 37 ° C for 5 to 30 minutes.
  • a suitable temperature, time, and buffer solution can be selected according to the type of combination.
  • FIG. 3 shows a state in which the target nucleic acid and the first and second microparticles are linked.
  • the first ligand 31 in the target nucleic acid 30 is linked to the first microparticle 33 via the first receptor 331.
  • the second ligand 32 in the target nucleic acid 30 is linked via the second microparticle 34 and the second receptor 341. That is, one target nucleic acid 30 is connected to the first fine particle 33 and the second fine particle 34, whereby the first fine particle 33 and the second fine particle 34 are connected to each other.
  • a plurality of target nucleic acids 30 are linked to one fine particle, and each of the target nucleic acids 30 is linked to other fine particles. As a result, a large number of fine particles are linked together, resulting in aggregation of the fine particles.
  • the dotted line extended for receptor strength simply represents the bound nucleic acid.
  • the sediment refers to the aggregate and the first and second fine particles that have settled without being used for ligation with the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid can be detected by this step.
  • the presence or absence of the agglomerates or the degree thereof is determined by the naked eye or image processing.
  • image processing for example, a technique such as analyzing image data captured by a CCD camera can be used.
  • the sample (1) containing a known concentration of the target nucleic acid is used, and the target nucleic acid is mixed with the microparticles according to the method described above. Clump Observe the collection distribution of the collection and use it as a positive control. Furthermore, the sample (2) not containing the target nucleic acid is mixed with the fine particles according to the method described above, and the sediment capture distribution on the bottom of the container is observed to serve as a negative control. Then, the sample (3) that may contain the target nucleic acid is mixed with the microparticles in the same manner as described above, and the sediment distribution on the bottom of the container is observed, and the positive control and negative control are performed.
  • the presence or concentration of the target nucleic acid in the sample (3) is confirmed by comparing with the control. Specifically, if the pattern of the capture distribution when using the sample (3) matches or is similar to the positive control, it is judged as positive, and the target nucleic acid is contained in the sample (3). It is confirmed that On the other hand, if the pattern of the capture distribution when using the sample (3) matches or is similar to the negative control, it is judged as negative and the target nucleic acid is contained in the sample (3). It is confirmed that it is not. On the other hand, when the pattern of the capture distribution when using the sample (3) is intermediate between the positive control and the negative control, it is determined as a false positive. In this case, the target nucleic acid may be contained in a small amount in the sample (3).
  • the presence or absence of the target nucleic acid in the sample (3) can be easily confirmed.
  • the amount of target nucleic acid in the sample (3) can be confirmed by comparing the amount of sediment captured when the sample (3) is used with the positive control and the negative control.
  • a sample that may contain the target nucleic acid can be obtained without using the control. It is also possible to confirm the presence or concentration of the target nucleic acid in the sample simply by subjecting it to detection. In this way, the detection process can be simplified.
  • a sample contains a plurality of types of target nucleic acids, for example, a set of different first and second ligands is prepared for each type of target nucleic acid.
  • the target Nucleic acids can be selectively detected.
  • a microparticle to which the first and second receptors that specifically bind to the first and second ligands in the target nucleic acid are bound is prepared for each target nucleic acid. If these fine particles are used for mixing, two or more kinds of target nucleic acids can be detected simultaneously.
  • first and second ligands in the target nucleic acid different ligands may be used for each type of target nucleic acid as described above, but one of the first and second ligands may be used. These ligands may be common among a plurality of types of nucleic acids. In this way, the detection process can be simplified.
  • the container of the present invention used for detection of the target nucleic acid will be described in detail below.
  • the container may be used alone, but a plurality of the containers provided on the same plate may be used.
  • a 96-well microphone port plate using the container as a well can be mentioned.
  • the number of uels is not limited to 96.
  • the capacity of one container is preferably 0.:! To 0.5 ml.
  • the bottom surface of the container of the present invention is provided with a site for capturing a precipitate, so that an aggregate formed by linking a target nucleic acid and fine particles and a precipitate other than the aggregate can be more easily obtained. In addition, it can be identified with high accuracy.
  • the sediment trapping part will be described in detail. For example, as shown in FIG. 4, a plurality of concavities and convexities 42 having a sawtooth shape in the radial direction are arranged concentrically on a bottom surface 41 having a mortar shape of a container 40. Can be mentioned.
  • the length (h) of the first inclined surface connecting the mountain to the valley from the bottom center 43 to the outside is preferably 0.2 to 20 ⁇ m, and the valley from the center 43 to the outside is preferred.
  • the length of the second slope connecting the mountain to the mountain (1) should be between 0.5 and 50 111, and the angle ( ⁇ ) between the straight line connecting the mountain and the center 43 with the horizontal plane is Les, preferably 15-45 °.
  • the number of irregularities 42 is 1
  • the number is preferably 0 to 50.
  • a plurality of recesses 52 are independently provided on a bottom 51 having a mortar shape of a container 50.
  • the angle ( ⁇ ) between the bottom surface 51 and the horizontal surface (bottom surface of the container) is preferably 15 to 45 °.
  • ⁇ is a function excluding the concave portion 52 on the inclined surface of the bottom surface 51.
  • the recess 52 has a substantially hemispherical shape, and the diameter of the opening (U is preferably 0.05 to: lOO xm is preferably 0.03 to 60 ⁇ m in depth (d). Is preferred.
  • the shape of the recess 52 is not limited to the substantially hemispherical shape shown here, as long as it can accommodate a plurality of the first fine particles and / or the second fine particles, preferably about 3 to 7. Different shapes and sizes may be used.
  • the number of the recesses 52 is preferably about several tens to several hundreds.
  • the above-mentioned size and shape of the sediment trapping part have been particularly found so that the aggregate and the sediment other than the aggregate can be easily and accurately distinguished.
  • the target nucleic acid can be detected easily and with high accuracy. Therefore, when the above-mentioned range is exceeded, it may be difficult to distinguish the sediment trapping distribution pattern between the aggregate and sediment other than the aggregate.
  • the target nucleic acid can be detected with higher accuracy.
  • the target nucleic acid When the target nucleic acid is not contained in the sample mixed with the first microparticle 33 and the second microparticle 34 (negative), as shown in (a) and (b) in FIG. Involved in consolidation The first fine particles 33 and the second fine particles 34 that did not settle settle on the bottom surface 41, and most of them get over the concave 42 and reach the bottom bottom vicinity.
  • the target nucleic acid when the target nucleic acid is contained (positive), as shown in (c) and (d) of FIG. 6, the first microparticle 33 and the second microparticle 34 are the target nucleic acid as described above. They are connected to each other through agglomerates and settle.
  • FIG. 6 (a) and (c) are longitudinal cross-sectional views of the container 40 in a state where the aggregate and the soot or the sediment other than the aggregate are captured in the sediment capturing part. ) And (d) are views when the bottom surface of the container 40 is viewed from above.
  • the target nucleic acid When the target nucleic acid is not contained in the sample mixed with the first microparticle 33 and the second microparticle 34 (negative), as shown in (a) and (b) in FIG.
  • the target nucleic acid when the target nucleic acid is contained (positive), as shown in (c) and (d) of FIG. 7, the first microparticle 33 and the second microparticle 34 are the target nucleic acid as described above. They are connected to each other through agglomerates and settle.
  • the aggregate Since the aggregate is large in size, most of the aggregate reaches the vicinity of the lowermost portion of the bottom surface 51 without being captured by the recess 52. If the amount of target nucleic acid is large, the amount of aggregates deposited near the bottom of the bottom surface 51 increases and the area covering the bottom surface 51 increases, and if it is small, the amount of aggregates deposited near the bottom of the bottom surface 51 increases. And the area covering the bottom surface 51 is reduced. Therefore, the color intensity and region of the discoloration site on the bottom of the container change according to the target nucleic acid concentration in the sample. In FIG.
  • FIG. 7 are vertical cross-sectional views of the container 50 in a state where aggregates and / or sediments other than the aggregates are captured in the sediment capturing part, (b ) And (d) are views when the bottom surface of the container 50 is viewed from above.
  • the target nucleic acid can be detected easily and with high accuracy. Can do.
  • the container of the present invention as shown in FIG. 4 or FIG. 5 can be produced by a conventionally known technique such as mold molding.
  • Examples of magnetic fine particles to be used include triiron tetroxide (Fe 2 O 3), diiron trioxide ( ⁇ _Fe
  • hydrophobic polymers such as polystyrene,
  • the particle size of the magnetic fine particles is preferably 0.1 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the sediment distribution pattern of sediment may be difficult to distinguish between the aggregate and sediment other than the aggregate.
  • Examples of the method of binding the second receptor for the second ligand in the target nucleic acid to the magnetic fine particles include a method of physically adsorbing the receptor or a method of chemically supporting the receptor.
  • a receptor is directly adsorbed on magnetic fine particles. And a method in which the receptor is chemically bound to another protein such as albumin and then adsorbed and immobilized.
  • various functional groups such as an amino group, a carboxyl group, a mercapto group, a hydroxyl group, an aldehyde group, and an epoxy group existing on the surface of the magnetic fine particle are activated to form a surface on the receptor.
  • a method of immobilizing a receptor directly on a magnetic fine particle by bonding with various functional groups a method of immobilizing a magnetic fine particle and a receptor by chemically bonding them through a spacer molecule, such as albumin
  • a spacer molecule such as albumin
  • any conventionally known method may be applied.
  • the container used here may be any of transparent, translucent, colored and the like.
  • the material include plastics such as polystyrene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polyethylene, methylpentene resin (TPX), fluororesin, acrylic resin, polycarbonate, polyurethane, and chlorinated resin. Then, it may be molded by a conventionally known method such as mold molding.
  • a method for binding the first receptor that specifically binds to the first ligand in the target nucleic acid to the bottom surface of the container a method of binding the receptor to fine particles or magnetic fine particles can be applied. What is necessary is just to select suitably according to the kind of body.
  • a receptor bound to the magnetic fine particles and the container for example, an antibody, a lectin, a streptavidin, a nickel and the like can be used.
  • Nickel can be used because it has chelating ability.
  • two or more types of receptors may be bound to one magnetic fine particle or container.
  • a receptor that specifically binds to one type of ligand and a receptor other than a receptor that specifically binds to the remaining types of ligands are bonded to one magnetic fine particle or container. That is, it is designed so that only one of two or more kinds of ligands in the target nucleic acid binds to one magnetic fine particle or container.
  • the sample may contain the target nucleic acid that can be added to the container.
  • the magnetic fine particles may be added to the container at the same time.
  • the magnetic fine particles are added to the container.
  • the sample that may contain the target nucleic acid and the magnetic fine particles are preferably used as solutions.
  • PBS is an example of a preferable buffer that preferably uses a buffer, but may be appropriately selected according to the situation.
  • the amount of magnetic fine particles is a small excess of the target nucleic acid. Specifically, a target of several tens to several hundreds nM The amount of fine particles is more preferably 0.01-0.5 w / v% with respect to the nucleic acid.
  • the number of first receptors bound to the bottom surface of the container should be about 1.2 to 2 times the number of ligands that should be larger than the number of first ligands in the target nucleic acid. Is preferred.
  • the sample that may contain the target nucleic acid for detection actually contains the target nucleic acid 30 as shown in FIG. 1 OA, as shown in FIG. 10B, the first ligand The target nucleic acid 30 is linked to the bottom surface 81 of the container 80 through the binding between 31 and the first receptor 331, and the binding between the second ligand 32 and the second receptor 341 is performed as shown in FIG.
  • the target nucleic acid 30 and the magnetic fine particle 90 are linked via the. That is, the container 80 and the magnetic fine particle 90 are connected via the target nucleic acid 30. If the sample to be detected does not contain the target nucleic acid, such binding does not occur, and the magnetic microparticle 90 is not linked to the container 80.
  • [0057] Provides for observing the distribution of magnetic fine particles on the bottom of the container)
  • the distribution pattern of the magnetic fine particles on the bottom of the container changes depending on the presence or absence or concentration of the target nucleic acid in the sample to be measured, so that the target nucleic acid can be detected easily and with high accuracy.
  • FIG. 11 (a) and (b) are longitudinal sectional views of the container 80 in a state where the magnetic fine particles 90 are connected to the container 80, and (d) and (e) are drawings of the magnetic fine particles 90.
  • the longitudinal cross-sectional views of the container 80 in a state where it is not connected to the container 80, (c) and (f) are views when the bottom surface of the container 80 is viewed from above.
  • this step is preferably performed at 0 to 37 ° C for 5 to 30 minutes.
  • a suitable temperature, time, and buffer solution can be selected according to the type of combination.
  • the sample (1) containing a known target nucleic acid is added, and the target nucleic acid is added to the container according to the method described above. Add to the container and check the distribution pattern of magnetic fine particles when magnetic force is applied. Let's make one move. Further, the sample (2) not containing the target nucleic acid is added to the container according to the method described above, the magnetic fine particles are added to the container, and the distribution pattern of the magnetic fine particles when the magnetic force is applied is confirmed. Use as a negative control. Then, the sample (3) that may contain the target nucleic acid is added to the container in the same manner as described above, and the magnetic fine particles are added to the container, so that the distribution pattern of the magnetic fine particles on the bottom of the container is determined. The presence or concentration of the target nucleic acid in the sample (3) is confirmed by comparing with the positive control and negative control.
  • a sample obtained using a sample containing a known different concentration of the target nucleic acid, using the distribution pattern of the magnetic fine particles on the bottom surface of the container as a control may contain the target nucleic acid.
  • the distribution pattern of the magnetic fine particles when (4) is used with the control the presence or concentration of the target nucleic acid in the sample (4) can be confirmed.
  • the target nucleic acid may be contained without using the control. It is also possible to confirm the presence or concentration of the target nucleic acid in the sample simply by subjecting the sample to detection. In this way, the detection process can be simplified.
  • the first and second ligands that are different for each type of target nucleic acid are used, and one kind of the plurality of types is selected.
  • the second receptor that specifically binds to the second ligand in the target nucleic acid If only the bound magnetic particles are added, the target nucleic acid can be selectively detected.
  • the second ligand in the plurality of types of target nucleic acids specifically. If all of the magnetic fine particles to which the second receptor to be bound is bound are added, the plurality of types of target nucleic acids can be detected simultaneously.
  • the nucleic acid it is possible to detect the nucleic acid to be detected alone or to simultaneously detect a plurality of nucleic acids to be detected.
  • the first and second ligands in the target nucleic acid different ligands may be used for each type of target nucleic acid as described above.
  • One of the ligands may be common among a plurality of types of nucleic acids. In this way, the detection process can be simplified.
  • two types of ligands are used for one type of target nucleic acid, but three or more types of ligands may be used.
  • a receptor that specifically binds to each ligand is used.
  • those that bind to the container and those that bind to the magnetic fine particles can be appropriately selected according to the purpose. good.
  • the container used in this step is, for example, the one shown in FIG. 8 in consideration of the ease with which the magnetic fine particles are collected when magnetic force is applied to the magnetic fine particles. That is, the bottom surface 81 is substantially hemispherical, and the angle ( ⁇ ) between the bottom surface 81 and the horizontal plane is 15 to
  • the bottom surface 81 may be substantially conical in addition to the substantially hemispherical shape shown here. ⁇ is more specifically the bottom surface 8
  • the angle formed by a straight line connecting an arbitrary point on the inclined surface of 1 and the center of the bottom surface 81 is the horizontal plane.
  • such a container may be used alone, but a plurality of such containers provided on the same plate can also be used. Specifically, for example, a 96-well microphone opening plate using the container as a well can be mentioned. Of course, the number of wells is not limited to 96. When such a plurality of containers are provided, the capacity of one container is preferably 0.:! To 0.5 ml.
  • the container used in the second method is acceptable if the receptor is bonded to the bottom of the container molded by a conventionally known method such as mold molding as described above.
  • the target nucleic acid can be detected with higher accuracy.
  • the target nucleic acid can be detected with even higher accuracy by using the containers shown in FIGS. 4 and 5 together. You can.
  • the nucleic acid to be detected can be detected at low cost simply and with high accuracy. This is effective, for example, in reducing the cost and simplifying clinical tests.
  • the target nucleic acid detection method of the present invention includes, for example, a single nucleotide polymorphism (SNP:
  • PCR-SSP Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer method
  • the PCR-SSP method is designed to match the SNP site with the 3 'end of the primer by designing the sequence so that the 3' end of one of the two primers overlaps the SNP site in the nucleic acid to be detected.
  • this is a method of controlling amplification by PCR.
  • a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 Prepare a primer with FITC bound to the end and a primer with biotin bound to the 5 ′ end of the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • an amplification reaction is carried out by the PCR-SSP method on the nucleic acid to be detected consisting of “base alignment I shown in SEQ ID NO: 5”.
  • the aryl type is A / A homo, A / G hetero, and G / G homo.
  • the DIG-labeled primer of SEQ ID NO: 2 matches the SNP site, and the nucleic acid to be detected is amplified by PCR together with the piotin-labeled primer of SEQ ID NO: 4. Is done. Since amplification is not performed with the FITC-labeled primer of SEQ ID NO: 2, the amplification product is double-stranded DNA (target nucleic acid 1) in which DIG and piotin are separately bound to both 5 ′ ends.
  • the PCR product is It becomes double-stranded DNA (target nucleic acid 2) in which FITC and biotin are separately bound to both 5 'ends. Furthermore, if the sample SNP site is A / G heterozygous, an amplification product in which target nucleic acid 1 and target nucleic acid 2 are mixed is obtained. By detecting the presence or absence of amplification of these nucleic acids, S
  • a target nucleic acid modified with a hapten corresponding to the polymorphism can be obtained.
  • primers with different types of haptens bound to different SNP sites may be prepared, and the nucleic acid to be detected may be amplified by the PCR-SSP method according to the method described above.
  • DNA was extracted from human blood. Specifically, an automatic nucleic acid extractor “Magtration System 6CG (Brazion 'System” manufactured by Science Co., Ltd.) was used, and the usage procedure was in accordance with the instruction manual for the product.
  • Magtration System 6CG Branzion 'System manufactured by Science Co., Ltd.
  • the nucleic acid to be detected having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 containing SNP was amplified. It was.
  • the PCR tube was set in a thermal cycler “Gene AmpPCRsystem 9700 (manufactured by Applied Biosystems)”, and PCR reaction was carried out under the conditions shown in Table 3.
  • the target nucleic acid amplification reaction was performed on the subjects 1 to 9 by the above-described method.
  • nucleic acid consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 is bound to the 5 ′ end of the nucleic acid
  • nucleic acid consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 is bound to the 5 ′ end of the nucleic acid.
  • a heavy chain artificially synthesized target nucleic acid (I) was prepared and FITC was bound to the 5 ′ end of the nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and 5 of the nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the target nucleic acid to which the ligand was bound prepared in the above step was detected.
  • the procedure and detection result of each detection method are shown below.
  • the target nucleic acid was detected using the container shown in FIG.
  • a solution of latex particles A (particle size 0.1 ⁇ m, made by Seradin) sensitized with an anti-DIG antibody (DAKO, Catalog No: D5105) is added to a buffer solution (200 mM MOPSO (pH 7.4)). ), 4% dextran, lOOmM NaCl, 0.1% sodium azide) and a container a (h; 0.2 xm, l; 0.5 xm ⁇ ; 30 °)
  • latex particle B particle size 10 ⁇ m, Magus sensitized with anti-FITC antibody (DAK O, catalog No: D5101)
  • 96 solution that uses the solution ⁇ b (h; 20Mm, l; 50 / im, ⁇ ; 30 °) shown in Fig. 4 prepared by die-molding instead of container a.
  • the target nucleic acid was detected in the same manner as in Example 1 except that the plate was used.
  • the target nucleic acid was detected using the container shown in FIG.
  • the target nucleic acid was detected in the same manner as in Example 1.
  • Latex particles sensitized with anti-DIG antibody instead of the solution of sputum, a solution of latex particles B sensitized with anti-FITC antibody (DAK O, catalog No: D5101) was used. Instead, the container d (L; 100 zm, d; 60 xm, ⁇ ; 30
  • the target nucleic acid was detected in the same manner as in Example 3 except that a 96-well reaction plate with a well) was used.
  • the target nucleic acid was detected using the container shown in FIG.
  • Anti-biotin antibody is applied to the bottom of the 96-well plate “Immobilizer Amino Rockwell Module Plate (Nunc, Catalog No. 436023)” according to a conventionally known method. Combined.
  • Target nucleic acid was detected in the same manner as in Example 5 except that magnetic particles conjugated with anti-FITC antibody were used instead of magnetic particles conjugated with anti-DIG antibody. (judgment result)
  • the present invention is suitable for simplification of clinical tests and cost reduction, and is useful in two fields related to medical treatment.

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Abstract

本発明はハイブリダイゼーション法を利用することなく、標的核酸を簡便かつ高精度に検出する方法、及び該検出方法に用いる容器を提供することを目的とする。本発明の標的核酸の検出方法においては、検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガンド３１及び第二のリガンド３２が結合された標的核酸３０の検出方法であって、第一のリガンド３１と特異的に結合する第一の受容体３３１が複数結合された第一の微粒子３３、及び第二のリガンド３２と特異的に結合する第二の受容体３４１が複数結合された第二の微粒子３４を調製する工程と、底面に沈降物捕捉部を有する容器内で、標的核酸３０を含有している可能性のある試料、第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４を混合する工程と、混合工程後に、連結された標的核酸３０と第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４からなる凝集物並びに／又は第一の微粒子３３及び第二の微粒子３３の沈降物の、容器底面における捕捉分布を観測する工程を有することを特徴とする。

Description

明 細 書
標的核酸の検出方法及び該検出方法に用いる容器
技術分野
[0001] 本発明は、検出対象の核酸の有無あるいは濃度を検出する方法及び該検出方法 に用レ、る容器に関する。
背景技術
[0002] 試料中に存在する特定の標的核酸を検出する代表的な技術としては、ノ、イブリダィ ゼーシヨン法を利用したものが知られている（特許文献 1参照）。この方法は、多種類 の核酸が含まれる試料中から、非常に少量しか存在しない DNAや RNAの標的核酸 をプローブで検出することを可能にする技術である。
[0003] 一方、試料中に存在する特定の標的分子を、凝集させることで検出する方法も知ら れている。この方法で凝集反応を行って得られる凝集物を検出する容器としては、こ れまでに種々のものが提案されている。例えば、凝集物の凝集パターンを目視で判 定できる容器が提案されてレ、る（特許文献 2参照)。
特許文献 1 :特開平 7— 51099号公報
特許文献 2：特公昭 63_ 60854号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] しかし、核酸は、非特異的にハイブリダィゼーシヨンすることがあるという問題を本質 的に有している。例えば、標的核酸が非標的核酸と類似の塩基配列を有する場合に は、試料中力も標的核酸だけを選択的に検出することが困難となることがある。従つ て特許文献 1に記載の方法では、必ずしも高い精度で標的核酸を検出することがで きないとレ、う問題点があった。
また、特許文献 2に記載の容器は、赤血球の検出に用レ、るものである。核酸と赤血 球は分子サイズや構造に大きな相違があるため、この容器をそのまま標的核酸の検 出に用いることができないとレ、う問題点があった。
[0005] 本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ハイブリダィゼーシヨン法を利用 することなぐ標的核酸を簡便かつ高精度に検出する方法、及び該検出方法に用い る容器を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
上記課題を解決するため、本発明は下記の構成をとる。
(1)本発明の標的核酸の検出方法は、検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガ ンド及び第二のリガンドが結合された、標的核酸の検出方法であって、前記第一のリ ガンドと特異的に結合する第一の受容体が複数結合された第一の微粒子、及び前 記第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された第二の微粒 子を調製する工程と、底面に沈降物捕捉部を有する容器内において、前記標的核 酸を含有してレ、る可能性のある試料、前記第一の微粒子及び第二の微粒子を混合 する工程と、前記混合工程後に、第一のリガンドと第一の受容体との結合及び第二 のリガンドと第二の受容体との結合を介してそれぞれ連結された前記標的核酸と前 記第一の微粒子及び第二の微粒子からなる凝集物並びに/又は前記第一の微粒 子及び第二の微粒子の沈降物の、前記容器底面における捕捉分布を観測する工程 を有することを特徴とする標的核酸の検出方法である。
(2)本発明の標的核酸の検出方法は、検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガ ンド及び第二のリガンドが結合された、標的核酸の検出方法であって、前記第一のリ ガンドと特異的に結合する第一の受容体が底面に複数結合された容器を調製する 工程と、前記第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された磁 性微粒子を調製する工程と、前記容器内に、前記標的核酸を含有している可能性の ある試料及び前記磁性微粒子を添加する工程と、該添加工程後に、前記磁性微粒 子に対して前記容器外側より磁力を印加して該容器底面における磁性微粒子の分 布を観測する工程を有することを特徴とする標的核酸の検出方法である。
(3)本発明の標的核酸の検出方法は、上記（1)に記載の検出方法と、上記（2)に 記載の検出方法をいずれも行うことを特徴とする標的核酸の検出方法である。
(4)本発明の標的核酸の検出方法は、前記（1)〜（3)のいずれか一つに記載の標 的核酸の検出方法において、濃度既知の標的核酸を含有している試料（1)を用い た時の観測結果と、該標的核酸を含有してレ、なレ、試料 (2)を用いた時の観測結果と 、該標的核酸を含有している可能性のある試料（3)を用いた時の観測結果とを比較 して、前記試料（3)中の標的核酸の有無又は濃度を確認することを特徴とする標的 核酸の検出方法である。
(5)本発明の標的核酸の検出方法は、上記（1)〜（3)のいずれか一つに記載の標 的核酸の検出方法において、既知の異なる濃度の標的核酸を含有している試料を 用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有している可能性のある試料 (4)を用いた 時の観測結果とを比較して、前記試料 (4)中の標的核酸の有無又は濃度を確認す ることを特徴とする標的核酸の検出方法である。
(6)本発明の標的核酸の検出方法は、前記リガンドが、親水性有機化合物、ジゴキ シゲン、フルォロセイン、アレクサ、フルォロセインイソチオシァネート（FITC)、 2, 4 —ジニトロフヱノール（DNP)、テトラメチルローダミン (TAMRA)、アミノ酸残基数が 6以上のポリペプチド、単糖が 2以上結合した糖鎖、ピオチン、タンパク質、ポリヒスチ ジン、 HA、ダルタチオン S—トランスフェラーゼ（GST)、配列番号 1で表されるァミノ 酸配列からなるペプチド（Flag)及びこれらの誘導体からなる群から選ばれるものであ ることを特徴とする上記（1)〜（5)のいずれか一つに記載の標的核酸の検出方法で ある。
(7)本発明の標的核酸の検出方法は、前記標的核酸が、第一のリガンドを結合さ せた第一のプライマー、及び第二のリガンドを結合させた第二のプライマーを用いて 、ポリメラーゼ連鎖反応法によって調製されたものであることを特徴とする上記（1)〜 (6)のいずれか一つに記載の標的核酸の検出方法である。
(8)本発明の標的核酸の検出方法は、前記標的核酸が、第一のプライマーを用い て、第一のリガンドを結合させたヌクレオチドを少なくとも一つ取り込ませながら、さら に第二のプライマーを用いて、第二のリガンドを結合させたヌクレオチドを少なくとも 一つ取り込ませながら、ポリメラーゼ連鎖反応法によって調製されたものであることを 特徴とする上記（1)〜（6)のいずれか一つに記載の標的核酸の検出方法である。
(9)本発明の標的核酸の検出方法は、前記標的核酸が複数の異なる種類であり、 これら標的核酸中の第一及び第二のリガンドのうち少なくとも一方は標的核酸の種類 ごとに異なることを特徴とする上記（1)〜（8)のいずれか一つに記載の標的核酸の検 出方法である。
( 10)本発明の標的核酸の検出方法は、前記標的核酸が生体由来であることを特 徴とする上記（1 )〜（9)のいずれか一つに記載の標的核酸の検出方法である。
( 1 1 )本発明の標的核酸の検出方法は、前記第一及び第二の微粒子が、粒径 0. 1 〜： 10 μ mであり、互いに光学的に区別可能であることを特徴とする上記（1 )及び（3) 乃至（10)のレ、ずれか一つに記載の標的核酸の検出方法である。
( 12)本発明の標的核酸の検出方法は、複数の前記容器が同一プレート上に設け られており、各容器の容量が 0.：!〜 0. 5mlであることを特徴とする上記（1)〜（1 1 ) のいずれか一つに記載の標的核酸の検出方法である。
( 13)本発明の標的核酸の検出方法は、前記容器の沈降物捕捉部は、すり鉢状を なす底面に、その径方向断面が鋸歯状である複数の凹凸が同心円状に配されたも のであり、中心から外側へ向けて山から谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（h)が 0. 2〜2 0 /i m、中心から外側へ向けて谷から山を結ぶ第二の傾斜面の長さ（1)が 0. 5〜50 /i mであり、山と中心とを結ぶ直線が水平面とのなす角度（Θ )が 15〜45° であるこ とを特徴とする上記（1 )及び（3)乃至（12)のいずれか一つに記載の標的核酸の検 出方法である。
( 14)本発明の標的核酸の検出方法は、前記容器の沈降物捕捉部は、すり鉢状を なす底面に、複数個の凹部が独立して設けられたものであり、底面と水平面とのなす 角度（Θ )が 15〜45° であることを特徴とする上記（1 )及び（3)乃至（12)のいずれ
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か一つに記載の標的核酸の検出方法である。
( 15)本発明の標的核酸の検出方法は、前記凹部の、開口部の直径 (L)が 0. 05 〜100 μ m、深さ（d)が 0. 03〜60 μ mであることを特徴とする上記（14)に記載の標 的核酸の検出方法である。
( 16)本発明の標的核酸の検出方法は、上記（13)に記載の検出方法と、上記（14 )又は（15)に記載の検出方法をいずれも行うことを特徴とする標的核酸の検出方法 である。
( 17)本発明の標的核酸の検出方法は、前記磁性微粒子の粒径が 0.：!〜 20 z m であることを特徴とする上記（2)乃至（10)及び（12)のいずれか一つに記載の標的 核酸の検出方法である。
(18)本発明の標的核酸の検出方法は、前記容器が、底面が略半球面状もしくは 略円錐面状であり、底面と水平面とのなす角度（Θ )が 15〜45° であることを特徴と
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する上記（2)乃至（10)、（12)、及び（17)のいずれか一つに記載の標的核酸の検 出方法である。
[0007] (19)本発明の標的拡散の検出用容器は、上記（1)及び（3)乃至（12)のいずれか 一つに記載の標的核酸の検出方法で用いる容器であって、すり鉢状をなす底面に、 その径方向断面が鋸歯状である複数の凹凸が同心円状に配され、中心から外側へ 向けて山から谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（h)が 0. 2〜20 z m、中心から外側へ 向けて谷から山を結ぶ第二の傾斜面の長さ（1)が 0. 5〜50 z mであり、山と中心とを 結ぶ直線が水平面とのなす角度（Θ )が 15〜45° であることを特徴とする標的核酸 の検出用容器である。
(20)本発明の標的核酸の検出用容器は、上記（1)及び（3)乃至（12)のいずれか 一つに記載の標的核酸の検出方法で用いる容器であって、すり鉢状をなす底面に、 複数個の凹部が独立して設けられ、底面と水平面とのなす角度（Θ )が 15〜45° で
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あることを特徴とする標的核酸の検出用容器である。
(21)本発明の標的核酸の検出用容器は、前記凹部の、開口部の直径 (L)が 0. 0 5〜： 100 /i m、深さ (d)力 SO. 03〜60 μ mであることを特徴とする上記 (20)に記載の 標的核酸の検出用容器である。
(22)本発明の標的核酸の検出用容器は、上記（2)乃至（10)、（12)及び（17)の いずれか一つに記載の標的核酸の検出方法で用いる容器であって、底面が略半球 面状もしくは略円錐面状であり、底面と水平面とのなす角度（Θ )が 15〜45° である
3
ことを特徴とする標的核酸の検出用容器である。
(23)本発明の標的核酸の検出用容器は、上記（19)乃至（22)のいずれか一つに 記載の容器が、同一プレート上に複数個設けられていることを特徴とする標的核酸の 検出用容器である。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、容器底面における沈降物の捕捉分布を視覚的に観測することで 、標的核酸の有無あるいは濃度を簡便かつ高精度に検出することができる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1A]標的核酸を得る方法を示す概念図である。
[図 1B]標的核酸を得る方法を示す概念図である。
[図 1C]標的核酸を得る方法を示す概念図である。
[図 1D]標的核酸を得る方法を示す概念図である。
[図 2A]受容体が結合された微粒子を示す図である。
[図 2B]受容体が結合された微粒子を示す図である。
[図 3]標的核酸と連結されて凝集を生じる時の微粒子を示す概念図である。
[図 4]本発明の容器の一例を示す断面図である。
[図 5]本発明の容器の他の例を示す断面図である。
[図 6]図 4に示す容器を用いた場合の沈降物捕捉分布の一例を示す図である。
[図 7]図 5に示す容器を用いた場合の沈降物捕捉分布の一例を示す図である。
[図 8]本発明の容器の他の例を示す断面図である。
[図 9]受容体が結合された磁性微粒子を示す図である。
[図 10A]標的核酸を介して、図 8に示す容器及び図 9に示す磁性微粒子を連結した 状態を示す概念図である。
[図 10B]標的核酸を介して、図 8に示す容器及び図 9に示す磁性微粒子を連結した 状態を示す概念図である。
[図 10C]標的核酸を介して、図 8に示す容器及び図 9に示す磁性微粒子を連結した 状態を示す概念図である。
[図 11]図 10A〜図 10Cにおける磁性微粒子の分布パターンの一例を示す図である 符号の説明
[0010] 30···標的核酸、 31···第一のリガンド、 32···第二のリガンド、 33···第一の微粒 子、 331···第一の受容体、 34···第二の微粒子、 341···第二の受容体 発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明について、詳しく説明する。 本発明の標的核酸の検出方法は大別して、検出対象の核酸にリガンドが結合され た構造の標的核酸を得る工程と、該リガンドを介して該標的核酸を検出する工程とに 分かれる。以下、各工程ごとに詳しく説明する。
[0012] <標的核酸を得る工程 >
まず、標的核酸を得る工程について説明する。
本発明において、検出対象の核酸は特に限定されず、 cDNA、ゲノム DNA、合成 DNA、 mRNA、全 RNA、 hnRNA、合成 RNA等を含む全ての核酸又は核酸類似 体であり、生体に由来するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。
[0013] 検出対象の核酸に結合されるリガンドは、従来公知のものを用いることができ、好ま しいものとして、例えば、親水性有機化合物、ハプテン、ジゴキシゲン、フルォロセィ ン、アレクサ、フルォロセインイソチオシァネート（FITC)、 2, 4—ジニトロフエノール（ DNP)、テトラメチルローダミン (TAMRA)、アミノ酸残基数が 6以上のポリペプチド、 単糖が 2以上結合した糖鎖、ピオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、 HA、ダルタチォ ン S—トランスフェラーゼ（GST)、配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチ ド（Flag)及びこれらの誘導体等を用いることができる力 これらに限定されない。ピオ チン、ジゴキシゲン、フルォロセイン、アレクサなどは巿場からの入手が容易で低価 格という利点がある。また、糖鎖やペプチドは化学構造のデザインに自由度が高ぐ 複数種類をそろえることが容易であるという利点がある。使用するリガンドは、検出対 象の核酸、試料等によって適宜選択すれば良い。
[0014] 本発明の検出方法においては、検出対象の核酸に対し、種類の異なる第一のリガ ンド及び第二のリガンドがそれぞれ一つ以上結合されている標的核酸をまず形成さ せる。検出対象の核酸に第一及び第二のリガンドが結合された構造の標的核酸を得 る方法は、図 1A〜図 1Dに示すように、例えば、（i)検出対象の核酸 10に、光やブラ チナを用いて、あるいはリンカ一を介して、該核酸の塩基及び/又は 5 '末端に第一 のリガンド 31及び第二のリガンド 32を共有結合させる方法（図 1A) (この方法の一例 としては、核酸の 5'末端の塩基のァミノ基と、リガンドのカルボキシノレ基とを共有結合 させる方法がある）； (ii)核酸合成時に第一のリガンド 31を結合させた第一のプライマ 一 11、及び第二のリガンド 32を結合させた第二のプライマー 12を用いて、ポリメラー ゼ連鎖反応（PCR)法により塩基配列を伸長させる方法（図 IB)； (iii) PCR法におい て、第一のリガンド 31を結合させたヌクレオチド 13を少なくとも一つ、及び第二のリガ ンド 32を結合させたヌクレオチド 14を少なくとも一つ、それぞれ取り込ませながら塩 基配列を伸長させる方法（図 1C)； (iv)ターミナルデォキシジルトランスフェラーゼを 用いて、第一のリガンド 31又は第二のリガンド 32を結合させたヌクレオチドを、核酸 の 3 '末端にテーリングする方法（図 1D)；等の各種方法を用いることができる。
生体試料又は任意の被検体等のように、検出対象の核酸が他の非検出対象の核 酸と混在する試料では、前記 (ii)及び (iii)の方法が好適である。検出対象の核酸が 単独で存在する場合には、何れの方法を用いてもよい。なお、例えば、生体試料等 に含まれる検出対象の核酸は、 PCR法によって増幅させてから検出しても良いが、 増幅させずにそのまま検出に供してもよい。
[0015] 図 1に示すように、標的核酸 30中のリガンドは、第一のリガンド 31及び第二のリガン ド 32の二種類である。核酸の構造は柔軟であり、本発明においては、後述するように 、標的核酸が種類の異なる第一の微粒子及び第二の微粒子に結合することが必須 である。
また、標的核酸中の第一のリガンド及び第二のリガンドの数は、それぞれ一つずつ でも良いが、それぞれ二つ以上でもよい。核酸対微粒子の体積比は極めて大きいた め、一つの核酸に三つ以上の微粒子が結合する可能性は低い。従って、一つの標 的核酸中に、複数のリガンドがあっても、標的核酸が結合した微粒子の凝集度には 影響を与えなレ、ものと考えられる。
[0016] また、標的核酸が複数種類ある場合には、例えば、前記 (ii)あるいは (iii)の方法を 同時に行って、複数種類の標的核酸を同時に調製しても良い。この場合、各標的核 酸中の第一のリガンド及び第二のリガンドのうち少なくとも一方は、標的核酸の種類 ごとに異なることが好ましい。
[0017] <標的核酸を検出する工程 >
次に標的核酸を検出する工程について説明する。
検出工程は大別して 2つの手法に別れ、何れかの手法単独でも検出を行うことは可 能であるが、二つの手法を組み合わせることによって、より精度の高い検出結果を得 ること力 S可能である。以下 2つの手法を順に説明する。
[0018] [第一の手法] (第一の微粒子及び第二の微粒子を調製する工程）
第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が複数結合された第一の微粒子 、及び第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された第二の微 粒子を調製する。
本発明で用いる微粒子とは分散性微粒子のことであり、例えば、コロイド粒子のよう に溶液中で分散する微粒子を意味し、ラテックス粒子が好適に用いられるが、これに 限定されない。第一の微粒子及び第二の微粒子の粒径は、 0.：!〜 10. Onmである ことが好ましい。このような粒径の微粒子を用いれば、安定した凝集塊が得られ易い
[0019] 本発明において、特異的結合 (特異的に結合する）とは、例えば、抗原と抗体等の ように、特定の物質間で構造選択的に形成される、特異性の高い分子間力に基づく 結合を意味する。
[0020] ラテックス粒子は主にポリスチレンから成り、親水性と分散性とを高めるためメタタリ ル酸が共重合されている。ラテックス粒子には、表面に官能基がないプレーンタイプ と官能基を有する官能基タイプがある。プレーンタイプの表面の荷電はメタクリル酸の 存在のため負の電荷を有しており、タンパク質分子中の正の電荷を持つ領域とィォ ン結合することができる。また、タンパク質分子と疎水結合させることも可能である。プ レーンタイプのラテックス粒子はタンパク質と混合するだけでタンパク質を吸着するの で、タンパク質の固定操作が容易である。受容体としては、後述のように種々のもの を用いることができる力 各種タンパク質を用いる場合に、このようなプレーンタイプの ラテックス粒子が微粒子として好適に用いられる。
[0021] 官能基を有するラテックス粒子は、表面にカルボキル基ゃァミノ基等が露出するよう に設計されており、様々なタイプの官能基タイプラテックス粒子が利用可能である。官 能基タイプラテックス粒子に受容体を結合させる場合は、官能基タイプラテックス粒子 中の官能基と、受容体の官能基を結合させれば良ぐ従来公知の方法を適用するこ とができ、例えば、水溶性カルポジイミドでカルボン酸とアミノ基を結合させる EDAC 方法、 1 _ェチル _ 3 _ (3—ジメチルァミノプロピル）カルボジイミドハイド口クロライド (EDC)と N—ヒドロキシスクシンイミド（NHS)とをあらかじめ混合してカルボン酸とァ ミノ基とを結合させる方法、双極性を有するリンカ一を用いてアミノ基同士を架橋する 方法、活性化したアルデヒド基やトシル基と受容体中の官能基を結合する方法等が ある。本発明においては、本発明の効果を損なわない範囲で従来公知のレ、かなる方 法を用いてもょレ、が、特に EDAC法が好ましい。そして、プレーンタイプのラテックス 粒子同様、受容体として各種タンパク質を用レ、る場合に、官能基タイプラテックス粒 子は好適に用いられる。
なお、ラテックス粒子以外の微粒子であっても、微粒子の種類に応じて、従来公知 の方法によって受容体を結合させることができる。
[0022] 第一の微粒子に結合される第一の受容体には、標的核酸中の第一のリガンドと特 異的に結合する受容体を用い、第二の微粒子に結合される第二の受容体には、第 二のリガンドと特異的に結合する受容体を用いる。受容体としては、例えば、抗体、レ クチン、ストレプトアビジン等を用いることができる力 これらに限定されない。なかでも 、タンパク質、特に抗体が好適に用いられる。
[0023] 本発明においては、一つの実施形態として、一つの微粒子には単一種類の受容体 を結合させる。そして本実施形態においては、標的核酸には少なくとも二種類のリガ ンドが結合されているため、一種類の標的核酸に対して少なくとも二種類の微粒子を 調製する。即ち、図 2A〜図 2Bに示すように、第一のリガンド 31と特異的に結合する 第一の受容体 331が結合された第一の微粒子 33 (図 2A)、及び第二のリガンド 32と 特異的に結合する第二の受容体 341が結合された第二の微粒子 34 (図 2B)を調製 する。
[0024] また、本発明の他の実施形態として、一つの微粒子に二種類以上の受容体を結合 させても良レ、。そして本実施形態では、一つの標的核酸中の二種類以上のリガンド のうち、一種のリガンドと特異的に結合する受容体と、残りの種類のリガンドと特異的 に結合する受容体以外の受容体を一つの微粒子に結合させる。即ち、標的核酸中 の二種類以上のリガンドのうち一種だけが一つの微粒子に結合するように設計する。
[0025] 第一の微粒子及び第二の微粒子は、互いに光学的に区別可能であることが好まし レ、。具体的には、例えば、第一の微粒子及び第二の微粒子を、同色ではなく異なる 色とすることが好ましい。このようにすることで、操作段階での微粒子の識別が容易と なり、また凝集像を観察した時に一種類の微粒子で自己凝集を起こした場合にも色 によって容易に区別が可能であり、 自己;凝集を第一の微粒子及び第二の微粒子に よる凝集と誤判定する可能性が低くなる。すなわち、標的核酸の検出をより高精度に 行うことができる。
[0026] なお、本工程における微粒子への受容体の結合は、標的核酸を検出する際に実 施しても良いが、予め受容体を結合させた微粒子を検出に供しても良レ、。また、本ェ 程は、上記の標的核酸を調製する工程と前後して実施して良い。
[0027] (標的核酸を含有している可能性のある試料、第一の微粒子及び第二の微粒子を混 合する工程）
次に、標的核酸を含有している可能性のある試料、前記第一の微粒子及び第二の 微粒子を混合する工程にっレ、て説明する。
本工程は、後述の、底面に沈降物捕捉部を有する容器内において行う。検出に供 する標的核酸を含有している可能性のある試料が、実際に標的核酸を含有していれ ば、上記したような第一のリガンドと第一の受容体との結合、及び第二のリガンドと第 二の受容体との結合を介して、標的核酸と微粒子が連結され、後述のように凝集物 が生じる。検出に供する試料が標的核酸を含有していなければ、このような結合は生 じず、凝集物も生じない。
本工程は、標的核酸を含有している可能性のある試料、第一の微粒子及び第二の 微粒子を同時に混合して行っても良ぐ或いは、標的核酸を含有している可能性の ある試料に対して、第一の微粒子及び第二の微粒子を順に混合して、逐次的に行つ ても良い。標的核酸を含有している可能性のある試料、第一の微粒子及び第二の微 粒子は、それぞれ溶液として用いることが好ましい。
[0028] 本工程で用いる溶液は緩衝液が好ましぐ凝集を促進する緩衝液がより好ましい。
このような好ましい緩衝液として、例えば、以下の組成からなる緩衝液； 200mM M OPSO (pH7. 4)、 4%デキストラン、 lOOmM NaCl、 0. 1%アジ化ナトリウムが挙 げられるが、標的核酸及び微粒子の種類に応じて適宜選定すれば良い。本工程に ぉレ、て異なる種類の緩衝液を混合する場合には、微粒子は当該異なる緩衝液で 2〜 3回洗浄してから用いることが好ましい。
[0029] 混合に供する第一及び第二の微粒子の量は、多すぎると検出精度が低下するので 、標的核酸より小過剰であることが好ましぐ具体的には、数十〜数百 nMの標的核 酸に対し、 0. 01〜0. 5w/v%の微粒子量であることがより好ましい。
[0030] 前記のリガンドー受容体の組み合わせとして、例えば、抗原及び抗体を用いる場合 は、本工程は、 0〜37°Cで、 5〜30分間行うことが好ましい。その他のリガンド—受容 体の組み合わせの場合も、この組み合わせの種類に応じて適した温度、時間、緩衝 液を適宜選択すれば良レ、。
[0031] 図 3に、標的核酸と第一及び第二の微粒子が連結した様子を示す。図 3において、 標的核酸 30中の第一のリガンド 31は、第一の微粒子 33と第一の受容体 331を介し て連結する。また、標的核酸 30中の第二のリガンド 32は、第二の微粒子 34と第二の 受容体 341を介して連結する。即ち、一つの標的核酸 30が第一の微粒子 33及び第 二の微粒子 34と連結することによって、第一の微粒子 33及び第二の微粒子 34が互 いに連結される。さらに、一つの微粒子に複数の標的核酸 30が連結し、その標的核 酸 30のそれぞれが他の微粒子と連結することによって、多数の微粒子が互いに連結 された結果、微粒子の凝集が生じることになる。なお、図 3において受容体力 延ば された点線は、結合された核酸を簡易的に表している。
これにより、標的核酸が試料中に含有されていれば、微粒子の凝集が生じる。
[0032] (容器底面における沈降物の捕捉分布を観測する工程）
続いて、容器の底面における沈降物の捕捉分布を観測する。
ここで沈降物とは、前記凝集物や、標的核酸との連結に供されることなく沈降した第 一及び第二の微粒子のことを指す。本工程によって標的核酸を検出することができる 。ここで、前記凝集物の有無あるいはその程度は、肉眼あるいは画像処理等によって 判定する。画像処理であれば、例えば、 CCDカメラにより取り込んだ画像データを解 析するなどの手法を用いることができる。
[0033] 次に、標的核酸の検出を行う具体的な方法について詳しく説明する。
上記のようなリガンドが結合してレ、る濃度既知の標的核酸を含有してレ、る試料（1) を用レ、、該標的核酸を前述の方法に従って微粒子と混合して、容器底面における凝 集物の捕捉分布を観測し、陽性コントロールとする。さらに該標的核酸を含有してい ない試料（2)を前述の方法に従って微粒子と混合して、容器底面における沈降物の 捕捉分布を観測し、陰性コントロールとする。そして、該標的核酸を含有している可 能性のある試料（3)を同様に前述の方法に従って微粒子と混合し、容器底面におけ る沈降物の捕捉分布を観測し、上記陽性コントロール及び陰性コントロールと比較す ることで、前記試料（3)中の標的核酸の有無または濃度を確認する。具体的には、 試料（3)を用いた場合の捕捉分布のパターンが陽性コントロールに一致するか類似 していれば、陽性と判断されて、試料（3)中には標的核酸が含有されていることが確 認される。これに対して、試料（3)を用いた場合の捕捉分布のパターンが陰性コント ロールに一致するか類似していれば、陰性と判断されて、試料 (3)中には標的核酸 が含有されていないことが確認される。一方、試料（3)を用いた場合の捕捉分布のパ ターンが、陽性コントロールと陰性コントロールの中間を示す場合には、擬陽性と判 断される。この場合は、試料（3)中に標的核酸が少量含有されている可能性がある。 このようにして、試料（3)中の標的核酸の有無を簡便に確認することができる。また同 様にして、例えば、試料（3)を用いた場合の沈降物の捕捉量を陽性コントロール及び 陰性コントロールと比較することで、試料（3)中の標的核酸の量を確認することができ る。
[0034] また、既知の異なる濃度の標的核酸を含有する試料を用いて得られた、容器底面 における凝集物の捕捉分布をコントロールとし、該標的核酸を含有している可能性の ある試料 (4)を用いた時の沈降物の捕捉分布をコントロールと比較することで、前記 同様、該試料 (4)中の標的核酸の有無や濃度を確認することも可能である。
また、あらかじめ標的核酸の有無や濃度の違いによる沈降物の捕捉分布の違いを 確認して記録しておけば、前記コントロールを用いなくとも、該標的核酸を含有してい る可能性のある試料を検出に供するだけで、該試料中の標的核酸の有無または濃 度を確認することも可能である。このようにすることで、検出工程を簡略化することが できる。
[0035] また、試料中に複数種類の標的核酸が含有されている場合には、例えば、標的核 酸の種類ごとに異なる第一及び第二のリガンドの組を用意して、複数種類のうちの一 種の標的核酸中の第一及び第二のリガンドの組と特異的に結合する第一及び第二 の受容体がそれぞれ結合された微粒子をそれぞれ個別に混合に供すれば、当該一 種の標的核酸を選択的に検出することができる。同様に標的核酸の種類に応じて、 該標的核酸中の第一及び第二のリガンドと特異的に結合する第一及び第二の受容 体が結合された微粒子を、各標的核酸ごとに調製し、これら微粒子を混合に供すれ ば、二種以上の標的核酸を同時に検出することができる。
このように、検出対象の核酸を単独で、或いは複数の検出対象の核酸を同時に検 出すること力 Sできる。
[0036] ここで、標的核酸中の第一及び第二のリガンドは、前述のように標的核酸の種類ご とに全て異なるリガンドを用いても良いが、第一及び第二のリガンドのうち一方のリガ ンドを、複数種類の核酸の間で共通のものとしても良い。このようにすることで、検出 工程を簡略化することができる。
[0037] なお、以上述べた検出方法では、一種類の標的核酸について二種類のリガンドを 用いているが、三種類以上のリガンドを用いても良い。この場合、リガンドに特異的に 結合する受容体が複数結合された微粒子を、リガンドの種類ごとに調製すれば良い
[0038] (標的核酸の検出に用いる容器）
標的核酸の検出に用いる本発明の容器について、以下詳しく説明する 本発明においては、該容器を単独で用いても良いが、該容器を複数同一プレート 上に設けたものを用いることもでき、このようなものとして具体的には、例えば、該容器 をゥエルとする 96ウェルマイク口プレートを挙げることができる。ただしもちろん、ゥエル の数は 96に限定されるものではない。このような複数の容器を備えている場合、一つ の容器の容量は 0. ：!〜 0. 5mlであることが好ましい。
[0039] 本発明の容器の底面には、沈降物を捕捉する部位が設けられており、標的核酸と 微粒子が連結することで生じた凝集物と、該凝集物以外の沈降物をより簡便に且つ 高精度に識別できるようになつている。沈降物捕捉部について具体的に説明すると、 例えば、図 4に示すような、容器 40のすり鉢状をなす底面 41に、その径方向断面が 鋸歯状である複数の凹凸 42が同心円状に配されたものが挙げられる。ここで凹凸 42 の、底面の中心 43から外側へ向けて山から谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（h)は 0. 2〜20 μ mであることが好ましぐ中心 43から外側へ向けて谷から山を結ぶ第二の傾 斜面の長さ（1)は 0. 5〜50 111でぁることカ 子ましく、山と中心 43とを結ぶ直線が水 平面とのなす角度（Θ )は 15〜45° であることが好ましレ、。また、凹凸 42の数は、 1
1
0〜50個であることが好ましい。
[0040] また、沈降物捕捉部の他の具体例として、例えば、図 5に示すような、容器 50のすり 鉢状をなす底面 51に、複数個の凹部 52が独立して設けられたものが挙げられる。こ こで、底面 51と水平面 (容器外底面）とのなす角度（Θ )は 15〜45° であることが好
2
ましレ、。なお Θ とは、より具体的には、底面 51の傾斜面における凹部 52を除いた任
2
意の一点と、底面 51中心とを結ぶ直線が、水平面となす角度のことである。
そして、該凹部 52は略半球状であり、その開口部の直径（Uは 0. 05〜： lOO x mで あることが好ましぐ深さ（d)は 0. 03〜60 μ mであることが好ましい。
なお、凹部 52の形状は、ここに示す略半球状に限定されず、前記第一の微粒子及 び/又は前記第二の微粒子を複数個、好ましくは 3〜7個程度収容できるものであれ ば、異なる形状及びサイズのものでも良い。凹部 52の数は、数十〜数百程度である ことが好ましい。
[0041] 沈降物捕捉部の前述のサイズ及び形状は、前記凝集物と該凝集物以外の沈降物 との識別を簡便に且つ高精度に行うことができるよう、特に見出されたものであり、こ のような沈降物捕捉部を備えた容器を用いることで、標的核酸を簡便に且つ高精度 に検出することができる。したがって、前記範囲を外れた場合、沈降物の捕捉分布パ ターンが、前記凝集物と該凝集物以外の沈降物との間で区別がつきにくくなることが ある。
また、図 4及び図 5で挙げた容器を併用することで、標的核酸の検出をより高い精 度で行うことができる。
[0042] 図 4に示すような沈降物捕捉部を有する容器 40を使用した場合の、沈降物の捕捉 分布について、図 6を参照しながら説明する。
第一の微粒子 33及び第二の微粒子 34と混合した試料中に標的核酸が含有され ていない時（陰性）は、図 6中の（a)及び (b)に示すように、標的核酸との連結に関与 しなかった第一の微粒子 33及び第二の微粒子 34が底面 41に沈降し、大部分が凹 凸 42を乗り越えて底面最下部近傍にまで到達する。一方、標的核酸が含有されてい る時（陽性）は、図 6中の（c)及び (d)に示すように、前述のように第一の微粒子 33及 び第二の微粒子 34が標的核酸を介して互いに連結されて凝集物が生じ、沈降する 。該凝集物はサイズが大きいため、凹凸 42を乗り越えることなぐ底面 41上の沈降し た場所にそのまま留まって、底面 41全面に渡って薄く堆積する。標的核酸の量が多 ければ凝集物の堆積量が多くなり、少なければ堆積量が少なくなるので、試料中の 標的核酸濃度に応じて容器底面の色の濃さが変化する。なお、図 6中、（a)及び (c) は、凝集物及び Ζ又は該凝集物以外の沈降物が、沈降物捕捉部に捕捉されている 状態での容器 40の縦断面図、（b)及び (d)は、容器 40の底面を上方から見た時の 図である。
次に、底面が図 5に示すような形状の容器 50を使用した場合の、沈降物の捕捉分 布について、図 7を参照しながら説明する。
第一の微粒子 33及び第二の微粒子 34と混合した試料中に標的核酸が含有され ていない時（陰性）は、図 7中の（a)及び (b)に示すように、標的核酸との連結に関与 しなかった第一の微粒子 33及び第二の微粒子 34が底面 51に沈降し、大部分が凹 部 52に捕捉され、底面 51の最下部近傍にまで到達せず、底面 51の、凹部 52が設 けられている領域のほぼ全面に渡って保持される。一方、標的核酸が含有されてい る時（陽性）は、図 7中の（c)及び (d)に示すように、前述のように第一の微粒子 33及 び第二の微粒子 34が標的核酸を介して互いに連結されて凝集物が生じ、沈降する 。該凝集物はサイズが大きいため、凹部 52に捕捉されることなく大部分が底面 51の 最下部近傍にまで到達する。標的核酸の量が多ければ、底面 51の最下部近傍にお ける凝集物の堆積量が多くなると共に底面 51を覆う面積が大きくなり、少なければ、 底面 51の最下部近傍における凝集物の堆積量が少なくなると共に底面 51を覆う面 積が小さくなる。したがって、試料中の標的核酸濃度に応じて容器底面の変色部位 の色の濃さ及び領域が変化する。なお、図 7中、（a)及び（c)は、凝集物及び/又は 該凝集物以外の沈降物が、沈降物捕捉部に捕捉されている状態での容器 50の縦 断面図、（b)及び (d)は、容器 50の底面を上方から見た時の図である。 [0044] このように、測定に供する試料中の標的核酸の有無あるいは濃度の違いにより、容 器底面における沈降物の捕捉分布が変化するので、標的核酸の検出を簡便に且つ 高精度に行うことができる。
[0045] また、例えば、図 4あるいは図 5に示すような本発明の容器は、金型成型等の従来 公知の手法により製造することができる。
[0046] [第二の手法] (磁性微粒子及び容器底面への受容体の結合）
次に、標的核酸を検出する第二の手法について説明する。
まず磁性微粒子に、標的核酸中の第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容 体を結合する工程にっレ、て説明する。
[0047] 用いる磁性微粒子としては、例えば、四酸化三鉄 (Fe O )、三酸化二鉄（ Ί _Fe
3 4 2
〇 ）、各種フヱライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属あるいはコ
3
バルト、ニッケル、マンガンなどを含む合金からなる磁性微粒子、又はこれら磁性微 粒子を内部に含んだポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタタリロニトリル、ポリメタ クリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、若し くはポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビュルピロリドン、ポリビュルアルコー ノレ、ポリ（2—ォキシェチルアタリレート）、ポリ（2—ォキシェチルメタタリレート）、ポリ（ 2, 3—ジォキシプロピルアタリレート）、ポリ（2, 3—ジォキシプロピルメタタリレート）、 ポリエチレングリコールメタタリレートなどの架橋した親水性重合体、又は前記重合体 のモノマーの 2—4種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リボソーム、あるい は前記磁性微粒子をラテックス、ゼラチン、リボソームなどの表面に固定化した粒子 などが挙げられる。
[0048] 磁性微粒子の粒径は、 0. 1 μ m〜20 μ mであることが好ましい。
粒径が前記寸法を外れると、沈降物の捕捉分布パターンが、前記凝集物と該凝集 物以外の沈降物との間で区別がつきにくくなることがある。
磁性微粒子に、標的核酸中の第二のリガンドに対する第二の受容体を結合する方 法としては、該受容体を物理的に吸着させる方法、あるいは化学的に担持させる方 法が挙げられる。
[0049] 物理的に吸着させる方法としては、例えば、磁性微粒子に、受容体を直接吸着させ て固定化する方法、受容体をアルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させ てから吸着させて固定化する方法が挙げられる。
化学的に担持させる方法としては、例えば、磁性微粒子の表面に存在するァミノ基 、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、ァノレデヒド基、エポキシ基などの各 種官能基を活性化して、受容体上の各種官能基と結合させて、直接磁性微粒子上 に受容体を固定化する方法、磁性微粒子と受容体とをスぺーサ一分子を介して化学 結合させることで固定化する方法、例えばアルブミンなどの他のタンパク質に受容体 を化学結合させた後、該タンパク質を磁性微粒子に化学結合させる方法が挙げられ る。ここで化学結合させる方法は、いずれも従来公知の方法を適用すれば良い
[0050] 次に、容器底面に、標的核酸中の第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容 体を結合する工程にっレ、て説明する。
ここで用レ、る容器は、透明、半透明、着色したものなどいずれでも良い。材質として は、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、メチルペンテン 樹脂 (TPX) 、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビュル 樹脂等のプラスチック等が挙げられる。そして、金型成型等の従来公知の方法によつ て成型すれば良い。
容器底面に標的核酸中の第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体を結合 する方法としては、微粒子や磁性微粒子へ受容体を結合する方法を適用することが でき、結合させる受容体の種類に応じて適宜選択すればよい。
[0051] これら磁性微粒子や容器に結合される受容体としては、例えば、抗体、レクチン、ス トレプトアビジン、ニッケル等を用いることができる力 これらに限定されなレ、。ニッケ ルを用いることができるのは、これがキレート形成能を有するからである。
[0052] 本手法においては、標的核酸には少なくとも二種類のリガンドが結合されているた め、一種類の標的核酸に対して少なくとも二種類の受容体を準備する。そして、第一 のリガンド 31と特異的に結合する第一の受容体 331が底面に結合された容器 80 (図 8)、及び第二のリガンド 32と特異的に結合する第二の受容体 341が結合された磁性 微粒子 90 (図 9)を調製する。
[0053] また本発明では、一つの磁性微粒子、容器に二種類以上の受容体を結合させても よレ、。本実施形態では、一つの標的核酸中の二種類以上のリガンドのうち、一種のリ ガンドと特異的に結合する受容体と、残りの種類のリガンドと特異的に結合する受容 体以外の受容体を、一つの磁性微粒子あるいは容器に結合させる。即ち、標的核酸 中の二種類以上のリガンドのうち一種だけが、一つの磁性微粒子あるいは容器に結 合するように設計する。
[0054] (容器内に、標的核酸を含有している可能性のある試料及び前記磁性微粒子を添加 する工程）
次に、標的核酸を含有してレ、る可能性のある試料及び前記磁性微粒子を添加する 工程について説明する。
本工程は、標的核酸を含有してレ、る可能性のある試料と磁性微粒子を混合した後 に、該混合物を容器に添加しても良ぐ標的核酸を含有している可能性のある試料と 磁性微粒子を同時に容器に添加しても良いが、好ましくは標的核酸を含有している 可能性のある試料を容器に添加した後に、磁性微粒子を該容器に添加する。標的 核酸を含有している可能性のある試料、磁性微粒子は、それぞれ溶液として用いるこ とが好ましい。この場合、緩衝液を用いることが好ましぐ好ましい緩衝液として、例え ば、 PBSが挙げられるが、状況に応じて適宜選定すれば良い。
[0055] 容器への添加に供する磁性微粒子の量は、多すぎると検出精度が低下するので、 標的核酸より小過剰であることが好ましぐ具体的には、数十〜数百 nMの標的核酸 に対し、 0. 01-0. 5w/v%の微粒子量であることがより好ましい。そして、容器底 面に結合された第一の受容体の数は、標的核酸中の第一のリガンドの数よりも多け れば良ぐリガンドの数の 1. 2〜 2倍程度であることが好ましい。
[0056] 検出に供する標的核酸を含有している可能性のある試料が、実際に図 1 OAに示す ような標的核酸 30を含有していれば、図 10Bに示すように、第一のリガンド 31と第一 の受容体 331との結合を介して容器 80の底面 81に標的核酸 30が連結され、図 10 Cに示すように、第二のリガンド 32と第二の受容体 341との結合を介して、該標的核 酸 30と磁性微粒子 90が連結される。即ち、容器 80及び磁性微粒子 90が標的核酸 3 0を介して連結される。検出に供する試料が標的核酸を含有していなければ、このよ うな結合は生じず、磁性微粒子 90は容器 80に連結されない。 [0057] (容器底面における磁性微粒子の分布を観測する工程）
続いて、磁石等の磁性体を、容器外側から容器底面に当てることで、容器内の磁 性微粒子に磁力を印加した時の、磁性微粒子の分布パターンを肉眼あるいは画像 処理等の手法を用いて観察する。画像処理等は、前述と同様の方法を適用すれば 良い。
[0058] これにより、標的核酸が試料中に含有されている時（陽性）は、図 11中の（a)〜（c) に示すように、磁性体によって磁性微粒子 90を集めようと試みても、容器 80と磁性微 粒子 90が標的核酸 30を介して連結しているので、磁性微粒子 90を集めることができ ず、磁性微粒子 90は容器 80の底面 81のほぼ全面に渡って保持される。標的核酸 3 0の量が多ければ、容器 80の底面 81を覆う磁性微粒子 90が多くなり、少なければ容 器底面 81を覆う磁性微粒子 90が少なくなるので、試料中の標的核酸 30の濃度に応 じて、底面 81の色の濃さが変化する。一方、標的核酸が試料中に含有されていない 時（陰性）は、図 11中の（d)〜（f)に示すように、磁性体によって磁性微粒子 90が底 面 81の磁性体近傍に集められる。
このように、測定に供する試料中の標的核酸の有無あるいは濃度の違いにより、容 器底面における磁性微粒子の分布パターンが変化するので、標的核酸の検出を簡 便且つ高精度に行うことができる。なお、図 11中、（a)及び (b)は、磁性微粒子 90が 容器 80に連結されている状態での容器 80の縦断面図、 （d)及び（e)は、磁性微粒 子 90が容器 80に連結されていない状態での容器 80の縦断面図、（c)及び (f)は、 容器 80の底面を上方から見た時の図である。
[0059] 前記のリガンドー受容体の組み合わせとして、例えば、抗原及び抗体を用いる場合 は、本工程は、 0〜37°Cで、 5〜30分間行うことが好ましい。その他のリガンド—受容 体の組み合わせの場合も、この組み合わせの種類に応じて適した温度、時間、緩衝 液を適宜選択すれば良レ、。
[0060] 次に、標的核酸の検出を行う具体的な方法について詳しく説明する。
上記のようなリガンドが結合してレ、る濃度既知の標的核酸を含有してレ、る試料（1) を用レ、、該標的核酸を前述の方法に従って容器内に添加し、磁性微粒子を容器内 に添加して、磁力を印加した時の磁性微粒子の分布パターンを確認し、陽性コント口 一ノレとする。さらに、該標的核酸を含有していない試料（2)を前述の方法に従って容 器内に添加し、磁性微粒子を容器内に添加して、磁力を印加した時の磁性微粒子 の分布パターンを確認し、陰性コントロールとする。そして、該標的核酸を含有してい る可能性のある試料（3)を同様に前述の方法に従って容器内に添加し、磁性微粒子 を容器内に添加して、容器底面における磁性微粒子の分布パターンを、上記陽性コ ントロール及び陰性コントロールと比較することで、前記試料（3)中の標的核酸の有 無または濃度を確認する。
[0061] また、既知の異なる濃度の標的核酸を含有する試料を用いて得られた、容器底面 における磁性微粒子の分布パターンをコントロールとし、該標的核酸を含有してレ、る 可能性のある試料 (4)を用いた時の磁性微粒子の分布パターンをコントロールと比 較することで、該試料 (4)中の標的核酸の有無または濃度を確認することも可能であ る。
また、あら力じめ標的核酸の有無や濃度の違いによる磁性微粒子の分布パターン の違いを確認して記録しておけば、前記コントロールを用いなくとも、該標的核酸を 含有している可能性のある試料を検出に供するだけで、該試料中の標的核酸の有 無または濃度を確認することも可能である。このようにすることで、検出工程を簡略化 すること力 Sできる。
[0062] また、試料中に複数種類の標的核酸が含有されている場合には、例えば、標的核 酸の種類ごとに異なる第一及び第二のリガンドを用いて、複数種類のうちの一種の標 的核酸中の第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が結合された容器に、 当該一種の標的核酸中の第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が結合 された磁性微粒子のみを添加すれば、当該一種の標的核酸を選択的に検出するこ とができる。同様に、複数種類の標的核酸中の第一のリガンドと特異的に結合する第 一の受容体がすべて結合された容器に、当該複数種類の標的核酸中の第二のリガ ンドと特異的に結合する第二の受容体が結合された磁性微粒子をすベて添加すれ ば、当該複数種類の標的核酸を同時に検出することができる。
このように、検出対象の核酸を単独で、或いは複数の検出対象の核酸を同時に検 出すること力 Sできる。 [0063] ここで、標的核酸中の第一及び第二のリガンドは、前述のように標的核酸の種類ご とに全て異なるリガンドを用いても良レ、が、第一及び第二のリガンドのうち一方のリガ ンドを、複数種類の核酸の間で共通のものとしても良い。このようにすることで、検出 工程を簡略化することができる。
[0064] なお、以上述べた検出方法では、一種類の標的核酸について二種類のリガンドを 用いているが、三種類以上のリガンドを用いても良レ、。この場合、各リガンドと特異的 に結合する受容体を用いるが、これら三種類以上の受容体のうち、容器に結合する ものと磁性微粒子に結合するものとは、 目的に応じて適宜選択すれば良い。
[0065] (標的核酸の検出に用いる容器）
本工程で用いる容器は、磁性微粒子に磁力を印加した時の、該容器に連結されて レ、ない磁性微粒子の集まり易さを考慮して、例えば、図 8に示すものが挙げられる。 すなわち、底面 81が略半球面状であり、底面 81と水平面とのなす角度（Θ )が 15〜
3
45° であるものを好ましいものとして挙げることができる。底面 81は、ここに示す略半 球面状以外にも、略円錐面状であっても良レ、。なお Θ とは、より具体的には、底面 8
3
1の傾斜面における任意の一点と、底面 81中心とを結ぶ直線が、水平面となす角度 のことである。
そして第一の手法同様、このような容器を単独で用いても良いが、該容器を複数同 一プレート上に設けたものを用いることもできる。このようなものとして具体的には、例 えば、該容器をゥエルとする 96ウェルマイク口プレートを挙げることができる。ただしも ちろん、ゥエルの数は 96に限定されるものではない。このような複数の容器を備えて いる場合、一つの容器の容量は 0.：!〜 0. 5mlであることが好ましい。第二の手法で 用いる容器は、金型成型等の従来公知の手法により成型した容器底面に、前述の手 法で受容体を結合させれば良レ、。
[0066] ここまで第二の手法について述べた点以外については、概ね第一の手法と同様の 手法を第二の手法でも適用することができる。
[0067] 本発明においては、第一の手法及び第二の手法を併用することで、標的核酸の検 出をより高精度に行うことができる。そして、第一の手法においては前述の通り、図 4 及び図 5で挙げた容器を併用すれば、さらに一層高精度に標的核酸の検出を行うこ とができる。
[0068] 以上詳述したように、本発明の標的核酸の検出方法によれば、検出対象の核酸を 低コストで簡便且つ高精度に検出することができる。これにより、例えば、臨床検査の 低コスト化、簡便化に有効である。
[0069] 本発明の標的核酸の検出方法は、例えば、検出対象の核酸の 1塩基多型（SNP :
Single Nucleotide Polymorphism)を検出する手段として用いることができる。こ の場合、複数の異なるハプテンが結合された標的核酸を得る方法として PCR法を適 用する場合、例えば、 PCR—SSP法（Polymerase Chain Reaction - Seque nce Specific Primer method)を好適に用いることができる。 PCR— SSP法は、 二種類のプライマーの片方の 3 '末端が、検出対象の核酸中の SNPサイトと重なるよ うに配列を設計することで、 SNPサイトとプライマーの 3 '末端とのマッチングの有無に よって、 PCRによる増幅を制御する方法である。
[0070] 以下、さらに原理の詳細を説明する。
第一のリガンドが結合されたプライマーとして、例えば、配列番号 2に示す塩基配列 力 成るプライマーの 5 '末端にジゴキシゲニン (DIG)を結合させたもの、配列番号 3 に示す塩基配列から成るプライマーの 5 '末端に FITCを結合させたもの、配列番号 4 に示す塩基配列から成るプライマーの 5 '末端にビォチンを結合させたものを、それ ぞれ作製する。次に、配列番号 5に示す塩基配歹 I」から成る検出対象の核酸に対して 、 PCR— SSP法で増幅反応を行う。この時、配列番号 5に示す塩基配列中に rとして 記載したように、サンプノレの SNPサイトが塩基 A (アデニン）と塩基 G (グァニン）の 2タ イブがァリルとして存在するとき、ァリルタイプは、 A/Aのホモ、 A/Gのへテロ、 G/ Gのホモと 3タイプとなる。
サンプルの SNPサイトが A/Aのホモである場合、 DIG標識された配列番号 2のプ ライマーが SNPサイトとマッチングし、ピオチン標識された配列番号 4のプライマーと ともに PCRによって検出対象の核酸の増幅が行われる。 FITC標識された配列番号 2のプライマーでは増幅が行われないので、増幅産物は両 5 '末端に DIGとピオチン が別々に結合された 2本鎖 DNA (標的核酸 1)となる。
同様な考え方で、サンプルの SNPサイトが G/Gのホモである場合、 PCR産物は 両 5'末端に FITCとビォチンが別々に結合された 2本鎖 DNA (標的核酸 2)となる。 さらにサンプルの SNPサイトが A/Gのへテロであった場合、標的核酸 1と標的核 酸 2が混合した増幅産物が得られる。これら核酸の増幅の有無を検出することで、 S
NPタイピングが可能となる。
上述の原理により、核酸の SNPを検出する場合に、その多型に対応したハプテン で修飾された標的核酸を得ることが可能となる。
さらに、検出対象の核酸の SNPを複数検出することも可能となる。この場合、 SNP サイトが異なるごとに異なる種類のハプテンを結合したプライマーを用意して、前述の 方法に従い、 PCR— SSP法により検出対象の核酸を増幅させればよい。
[0071] 以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明 は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
ここでは、前述の原理に基づいた SNPタイピングの実施例を示す。
実施例 1
[0072] < DNA (検出対象の核酸）の抽出 >
ヒト血液より DNAを抽出した。具体的には、核酸自動抽出機「Magtration Syste m 6CG (ブレジシヨン'システム 'サイエンス株式会社製）」を使用し、使用手順は、 同製品取り扱い説明書に準じた。
( 1 )被験者の血液 5mlを採血した。
(2)採血した血液の全血 100 μ 1をスクリューキャップ式 1. 5mlチューブに分注した。
(3)装置を立ち上げ、抽出試薬、被検体をセットし、操作プログラムに従い機械を操 作して DNA抽出を開始した。抽出液は TE (10mM Tris -HCl (pH8. 0 又は 7 . 5) + lmM EDTA)を用いた。
(4)抽出後、分光光度計「nano drop (米国ナノドロップ社製)」を使用して、吸光度 を測定し、抽出後濃度を計測した。
前記手法により、あら力じめ標的 SNPのァリルタイプが判っている 9人の被験者から 血液を採取し、 DNA抽出を行った結果、 100 μ ΐ全血液から表 1に示す濃度のゲノム DNA 100 /i lが得られた。
[0073] [表 1] 被驗者 N o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ァリルタイプ A/A A/A A/A A/G A/G A/G G/G G/G G/G
D NI AS度
1. 82 1. 96 1. B3 1 .71 1. 69 1. 92 1. 88 1.83 1.85
(ng/it 1)
[0074] <リガンドが結合された検出対象の核酸の増幅 >
配列番号 2に示す塩基配列から成るプライマーの 5'末端に DIGを結合させたもの 、配列番号 3に示す塩基配列から成るプライマーの 5'末端に FITCを結合させたもの 、配列番号 4に示す塩基配列から成るプライマーの 5'末端にピオチンを結合させた ものそれぞれ用いて、前記ゲノム DNAをテンプレートとした PCRによって、 SNPを含 む配列番号 5に示す塩基配列を有する検出対象の核酸の増幅を行った。
(1)ゲノム DNAを 20ng/ μ 1となるように ΤΕで濃度調整した。
(2)表 2に示す通り、試薬を被検体分調製した。
(3)調製した試薬を PCR用チューブに 20 μ 1ずつ分注した。
(4)被検体溶液を（3)の PCR用チューブに 1 μ 1ずつ加えた。
(5) PCR用チューブをサーマルサイクラ一「Gene AmpPCRsystem9700 (Applie d Biosystems社製）」にセットして、表 3に示す条件により PCR反応を行った。
[0075] [表 2]
1被検体あたりの試薬脚製量
Figure imgf000027_0001
[0076] [表 3] 1 9 4 5分
2 9 4 3 0秒
3 6 O 3 0秒
4 7 2 Ό 3 0秒
5 7 2 5分 2〜4 X 3 5
[0077] 上記手法により、被験者 1〜9の被検体について標的核酸の増幅反応を行った。
また、配列番号 6に示す塩基配列から成る核酸の 5'末端に DIGを結合させたもの と、配列番号 7に示す塩基配列から成る核酸の 5 '末端にピオチンを結合させたもの とからなる二重鎖の人工合成標的核酸 (I)を調製し、配列番号 8に示す塩基配列か ら成る核酸の 5'末端に FITCを結合させたものと、配列番号 9に示す塩基配列から 成る核酸の 5'末端にピオチンを結合させたものとからなる二重鎖の人工合成標的核 酸 (II)を調製し、これら人工合成標的核酸 (I)及び (II)を混合して、人工合成標的核 酸 (I)及び (II)がそれぞれ ΙΟΟηΜになるように TEを用いて濃度調整して、陽性コン トロールとした。また TEを陰性コントロールとした。
[0078] <標的核酸の検出 >
前記工程で作製した、リガンドが結合されている標的核酸の検出を行った。 以下に各検出方法の手順及び検出結果を示す。
図 4に示す容器を用いて標的核酸の検出を行った。
(1)抗 DIG抗体（DAKO社製、カタログ No : D5105)に感作させたラテックス粒子 A ( 粒子径 0. 1 μ m、セラディン社製）の溶液を、緩衝液（200mM MOPSO (pH7. 4) 、 4%デキストラン、 lOOmM NaCl、 0. 1 %アジ化ナトリウム）を用いて希釈し、金型 成型により作製した図 4に示す容器 a (h ; 0. 2 x m、l ; 0. 5 x m、 Θ ; 30° )をゥエル
1
とする 96ウエノレ反応プレートに、一つのゥエルにつき 50 μ 1ずつ分注した。
(2)抗ビォチン抗体（DAKO社製、カタログ No： M0743)感作ラテックス粒子溶液を 、前記緩衝液を用いて希釈し、前記 96ゥエルプレートに、一つのゥエルにつき 50μ1 ずつ分注した。
(3)被検体、陽性コントロール及び陰性コントロールを各 20 / lずつ添加して、良く分 散させた。
(4)室温で 5分間静置後、陽性コントロール、陰性コントロールと比較して、被検体の 沈降物の容器底面における捕捉分布を観測し、陽性、陰性を判定した。
実施例 2
[0079] 抗 DIG抗体に感作させたラテックス粒子 Aの溶液の代わりに、抗 FITC抗体（DAK O社製、カタログ No:D5101)に感作させたラテックス粒子 B (粒子径 10 μ m、マグス フェア社製）の溶液を用い、容器 aの代わりに金型成型により作製した図 4に示す容 §b (h;20Mm, l;50/im, θ ;30° )をウエノレとする 96ウエノレ反応プレートを用レヽ たこと以外は実施例 1と同様の手法にて、標的核酸の検出を行った。
実施例 3
[0080] 図 5に示す容器を用レ、て標的核酸の検出を行つた。
容器 aの代わりに、金型成型により作製した図 5に示す容器 c(L;0.05 xm、 d;0. 03 zm、 θ ;30° )をゥヱルとする 96ゥヱル反応プレートを用いたこと以外は、実施
2
例 1と同様の手法にて、標的核酸の検出を行った。
実施例 4
[0081] 抗 DIG抗体に感作させたラテックス粒子 Αの溶液の代わりに、抗 FITC抗体（DAK O社製、カタログ No: D5101)に感作させたラテックス粒子 Bの溶液を用い、容器 cの 代わりに金型成型により作製した図 5に示す容器 d(L;100 zm、 d;60 xm、 θ ;30
2
° )をゥエルとする 96ゥエル反応プレートを用いたこと以外は実施例 3と同様の手法 にて、標的核酸の検出を行った。
実施例 5
[0082] 図 8に示す容器を用いて標的核酸の検出を行った。
(1) 96ゥエルプレート「ィモビライザーァミノロックウェルモジュールプレート (Nunc社 製、カタログ No :436023)」の底面に、従来公知の方法に従って抗ビォチン抗体を 結合させた。
(2)前記緩衝液を一つのゥエルにつき 50 μ 1ずつ分注した。
(3)被検体、前記陽性コントロール及び前記陰性コントロールを各 20 μ 1ずつ分注し た。
(4) 5分間室温で静置した。
(5)抗 DIG抗体を結合した磁性微粒子「Dynabeads M— 450 Epoxy(DYNAL 社製、カタログ No : DB14001)」の溶液を、一つのゥエルにつき 50 μ ΐずつ分注して よく分散させた。
(6) 5分間室温で静置した。
(7)プレートの底面外側より磁石をあて、陽性コントロール、陰性コントロールと比較し て、磁性微粒子の容器底面における分布パターンを肉眼あるいは画像処理等の手 法により観察して、陽性、陰性を判定した。
実施例 6
[0083] 抗 DIG抗体を結合した磁性微粒子の代わりに、抗 FITC抗体を結合した磁性微粒 子を用いたこと以外は、実施例 5と同様の手法にて、標的核酸の検出を行った。 (判定結果）
以上、実施例:!〜 6の検出結果と、該検出結果に基づく総合的な判定結果を表 4に 示した。総合的な判定として、実施例 1〜6の判定結果のうち少なくとも 3つの検出結 果が同じであれば、その結果を最終的なタイピング結果とした。そして、本発明により 、標的核酸の検出を高精度に行うことができることが確認された。
[0084] [表 4]
Figure imgf000031_0001
産業上の利用可能性
本発明は、臨床検査の簡便化、低コスト化等に好適であり、医療関連分野 二おレ て有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガンド及び第二のリガンドが結合された、 標的核酸の検出方法であって、
前記第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が複数結合された第一の微 粒子、及び前記第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された 第二の微粒子を調製する工程と、
底面に沈降物捕捉部を有する容器内において、前記標的核酸を含有している可 能性のある試料、前記第一の微粒子及び第二の微粒子を混合する工程と、
前記混合工程後に、第一のリガンドと第一の受容体との結合及び第二のリガンドと 第二の受容体との結合を介してそれぞれ連結された前記標的核酸と前記第一の微 粒子及び第二の微粒子からなる凝集物並びに/又は前記第一の微粒子及び第二 の微粒子の沈降物の、前記容器底面における捕捉分布を観測する工程を有すること を特徴とする標的核酸の検出方法。
[2] 検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガンド及び第二のリガンドが結合された、 標的核酸の検出方法であって、
前記第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が底面に複数結合された容 器を調製する工程と、
前記第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された磁性微粒 子を調製する工程と、
前記容器内に、前記標的核酸を含有している可能性のある試料及び前記磁性微 粒子を添加する工程と、
該添加工程後に、前記磁性微粒子に対して前記容器外側より磁力を印加して該容 器底面における磁性微粒子の分布を観測する工程を有することを特徴とする標的核 酸の検出方法。
[3] 請求項 1に記載の検出方法と、請求項 2に記載の検出方法をいずれも行うことを特 徴とする標的核酸の検出方法。
[4] 請求項 1〜3のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法において、濃度既知 の標的核酸を含有している試料 (1)を用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有し ていない試料（2)を用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有している可能性のあ る試料 (3)を用いた時の観測結果とを比較して、前記試料 (3)中の標的核酸の有無 又は濃度を確認することを特徴とする標的核酸の検出方法。
[5] 請求項 1〜3のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法において、既知の異な る濃度の標的核酸を含有している試料を用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有 している可能性のある試料 (4)を用いた時の観測結果とを比較して、前記試料 (4)中 の標的核酸の有無又は濃度を確認することを特徴とする標的核酸の検出方法。
[6] 前記リガンドが、親水性有機化合物、ジゴキシゲン、フルォロセイン、アレクサ、フル ォロセインイソチオシァネート（FITC)、 2, 4—ジニトロフエノール（DNP)、テトラメチ ルローダミン (TAMRA)、アミノ酸残基数が 6以上のポリペプチド、単糖が 2以上結合 した糖鎖、ピオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、 HA、グルタチオン S—トランスフェラ ーゼ（GST)、配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Flag)及びこれら の誘導体からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項 1〜5のいずれ か一項に記載の標的核酸の検出方法。
[7] 前記標的核酸が、第一のリガンドを結合させた第一のプライマー、及び第二のリガ ンドを結合させた第二のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法によって調製 されたものであることを特徴とする請求項 1〜6のいずれか一項に記載の標的核酸の 検出方法。
[8] 前記標的核酸が、第一のプライマーを用いて、第一のリガンドを結合させたヌクレオ チドを少なくとも一つ取り込ませながら、さらに第二のプライマーを用いて、第二のリ ガンドを結合させたヌクレオチドを少なくとも一つ取り込ませながら、ポリメラーゼ連鎖 反応法によって調製されたものであることを特徴とする請求項 1〜6のいずれか一項 に記載の標的核酸の検出方法。
[9] 前記標的核酸が複数の異なる種類であり、これら標的核酸中の第一及び第二のリ ガンドのうち少なくとも一方は標的核酸の種類ごとに異なることを特徴とする請求項 1 〜8のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
[10] 前記標的核酸が生体由来であることを特徴とする請求項 1〜9のいずれか一項に 記載の標的核酸の検出方法。
[11] 前記第一及び第二の微粒子が、粒径 0. 1〜： ίθ μ ΐηであり、互いに光学的に区別 可能であることを特徴とする請求項 1及び 3〜： 10のいずれか一項に記載の標的核酸 の検出方法。
[12] 複数の前記容器が同一プレート上に設けられており、各容器の容量が 0.：!〜 0. 5 mlであることを特徴とする請求項 1〜： 11のいずれか一項に記載の標的核酸の検出 方法。
[13] 前記容器の沈降物捕捉部は、すり鉢状をなす底面に、その径方向断面が鋸歯状 である複数の凹凸が同心円状に配されたものであり、中心から外側へ向けて山から 谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（h)が 0. 2〜20 x m、中心から外側へ向けて谷から 山を結ぶ第二の傾斜面の長さ（1)が 0. 5〜50 x mであり、山と中心とを結ぶ直線が 水平面とのなす角度（Θ )が 15〜45° であることを特徴とする請求項 1及び 3〜： 12
1
のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
[14] 前記容器の沈降物捕捉部は、すり鉢状をなす底面に、複数個の凹部が独立して設 けられたものであり、底面と水平面とのなす角度（Θ )が 15〜45° であることを特徴
2
とする請求項 1及び 3〜： 12のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
[15] 前記凹部の、開口部の直径（L)が 0· 05〜： 100 /i m、深さ（d)力 SO. 03〜60 /i mで あることを特徴とする請求項 14に記載の標的核酸の検出方法。
[16] 請求項 13に記載の検出方法と、請求項 14又は 15に記載の検出方法をいずれも 行うことを特徴とする標的核酸の検出方法。
[17] 前記磁性微粒子の粒径が 0.：!〜 20 μ ΐηであることを特徴とする請求項 2〜： 10及び
12のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
[18] 前記容器が、底面が略半球面状もしくは略円錐面状であり、底面と水平面とのなす 角度（Θ )が 15〜45° であることを特徴とする請求項 2〜10、 12及び 17のいずれ
3
か一項に記載の標的核酸の検出方法。
[19] 請求項 1及び 3〜： 12のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法で用いる容器 であって、
すり鉢状をなす底面に、その径方向断面が鋸歯状である複数の凹凸が同心円状に 配され、中心から外側へ向けて山力も谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（h)が 0. 2〜20 /i m、中心力 外側へ向けて谷から山を結ぶ第二の傾斜面の長さ（1)が 0. 5〜50 μ mであり、山と中心とを結ぶ直線が水平面とのなす角度（Θ )が 15〜45° であること を特徴とする標的核酸の検出用容器。
[20] 請求項 1及び 3〜： 12のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法で用いる容器 であって、
すり鉢状をなす底面に、複数個の凹部が独立して設けられ、底面と水平面とのなす 角度（Θ )が 15〜45° であることを特徴とする標的核酸の検出用容器。
2
[21] 前記凹部の、開口部の直径（Uが 0. 05〜： !OO z m、深さ（d)力 03〜60 μ πιで あることを特徴とする請求項 20に記載の標的核酸の検出用容器。
[22] 請求項 2〜： 10、 12及び 17のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法で用い る容器であって、
底面が略半球面状もしくは略円錐面状であり、底面と水平面とのなす角度（Θ )が
3
15〜45° であることを特徴とする標的核酸の検出用容器。
[23] 請求項 19〜22のいずれか一項に記載の容器が、同一プレート上に複数個設けら れていることを特徴とする標的核酸の検出用容器。
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