WO2008020743A2 - Method for extracting a platelet aggregation inhibitor from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom - Google Patents

Method for extracting a platelet aggregation inhibitor from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom Download PDF

Info

Publication number
WO2008020743A2
WO2008020743A2 PCT/MN2006/000005 MN2006000005W WO2008020743A2 WO 2008020743 A2 WO2008020743 A2 WO 2008020743A2 MN 2006000005 W MN2006000005 W MN 2006000005W WO 2008020743 A2 WO2008020743 A2 WO 2008020743A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
buffer
tris hcl
column
poison
hcl buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/MN2006/000005
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2008020743A3 (fr
Inventor
Georgiy Volkov
Alexiy Savchuk
Vitaly Karbovskyy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WISDOM ASSET Co
Original Assignee
WISDOM ASSET Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WISDOM ASSET Co filed Critical WISDOM ASSET Co
Publication of WO2008020743A2 publication Critical patent/WO2008020743A2/ru
Publication of WO2008020743A3 publication Critical patent/WO2008020743A3/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/58—Reptiles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Definitions

  • the invention relates to the industry of bioactive substances and can be used in biotechnological industries, medicine and the pharmaceutical industry, namely the production of medicines and diagnostic preparations from snake venom.
  • a platelet aggregation inhibitor is a protein that has an inhibitory effect on the platelet activation process by various activation agents.
  • platelet activation inhibitors There are a significant number of platelet activation inhibitors from various sources. All of them differ in the strength of inhibition and the mechanisms by which this inhibition is carried out.
  • One of the effective sources of platelet activation inhibitors is snake venoms, which contain only protein components and have a stable composition.
  • Some methods for producing active enzymes from snake venom are known.
  • a method is known for producing active enzymes from the snake venom of Triteresir okppaepsis by fractionation of poisoned with buffer on Sephadex G-100, chromatography on SM-Touorerl 650M in two stages and final purification on Mono Q gel.
  • Purificapofepofitofibf -Race spake (Agistrodop asites) venom., Toxicon.-1999.-V.37, N7.-P.999-1013); from Yard Agcistrodop Asitis, in which the poison dissolved in the buffer is subjected to separation of the DEAE Sephadex A-50 anion exchanger, then chromatographed twice on Sephadex G-200 (Quaupg C, Hong J. et al. Aspirates Vpom apd its comraritiop with bovipe tlombip., Thromb.Diath.haymorrth. -1971.
  • a method for isolating snake venom of platelet aggregation PAl is proposed, the essence of which includes a method for determining the ability to inhibit platelet aggregation in snake venom, a method for purifying an inhibitor of platelet activity from various samples of snake venom, its characterization and a truncated form containing a modified lysine residue that specifically inhibits fibrin binding or von Willebrand factor with GPPb-Sha. (WO 90/15620, 06/16/1989, Platellet agregatiphibitors, COR ⁇ S, INC).
  • the disadvantage of the prototype is both a low level of profitability of the production process, a low level of purity and a large investment of time.
  • the basis of the invention is the task to develop a method for isolating a platelet activation inhibitor from Agkistrodop Yothqffii poison syriepsis poison, which allows by means of affinity chromatography followed by ion exchange chromatography and the use of carriers with higher chromatographic properties and physicochemical stability to increase the profitability of the production process and reduce the isolation time / fibrinoliptic protein and increase its purity.
  • the problem is solved in a method of an inhibitor of platelet activation from the Agkistrodop Yothoffii venereus poison in that affinity chromatography is carried out on a column with a carrier of Clin Serharose FF using 1OmM Tris HCl with pH 7.4 as a buffer solution.
  • the fraction of a material unrelated to Blue Serum FF was diluted 8 times with 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 and applied to a column filled with DEAE Serophoros FF anion exchanger, previously equilibrated with 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2.
  • the platelet activation inhibitor was eluted with 5OmM Tris HCl buffer at pH 8.2 with a content of 0.2M NaCl.
  • the protein peak containing the platelet activation inhibitor is collected, concentrated, and applied to replace the buffer with a Serhadex G25 column equilibrated with 5OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 containing 0.1 ZM NaCl.
  • the problem is solved by the proposed method, when the parameters of the process of isolation of platelet activation inhibitorg are in the ranges indicated in the claims. When the parameters are changed in the direction of increasing or decreasing, the characteristics of the resulting preparation worsen.
  • the solution of the poison is applied to a column (C 10/10, volume 7 ml) with an affinity sorbent Vlie Serharose FF, previously equilibrated with 50 ml of 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 (column equilibration rate of 2 ml / min, poison application rate 0.5 ml / min ) After application, 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 is passed through the column at a speed of 2 ml / min and all unbound material (60 ml) is collected.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the fraction of material unrelated to Vlhe Serofaros FF was diluted 8 times with 5OmM Tris HCl with a pH 8.2 buffer and applied to a column filled with DEAE Serocos FF anion exchanger (column size Ix8cm, volume 7ml), pre-equilibrated with 5OmM Tris HCl 2 buffered with a pH of 2 buffered with 2 buffered with a pH of 2 buffered with 8.2 buffer min (Sample application speed lml / min). The bulk of the proteins (85%) are collected on the anion exchanger.
  • the platelet activation inhibitor is eluted with a stepwise gradient of ionic strength 0.2M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • a protein peak containing a platelet activation inhibitor is collected (6 ml) and dried by lyophilization. Characteristic Yield, mg 2.0 mg (4.2%)
  • the solution of the poison is applied to a column (C 10/10, volume 7 ml) with an affinity sorbent Vlie Serharose FF, previously equilibrated with 50 ml of 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 (column equilibration rate of 2 ml / min, poison application rate 0.5 ml / min )
  • 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 is passed through the column at a speed of 2 ml / min and all unbound material (53 ml) is collected.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the fraction of material unrelated to Vlhe Serofaros FF was diluted 8 times with 5OmM Tris HCl with a pH 8.2 buffer and applied to a column filled with DEAE Serocos FF anion exchanger (column size Ix8cm, volume 7ml), pre-equilibrated with 5OmM Tris HCl 2 buffered with a pH of 2 buffered with 2 buffered with a pH of 2 buffered with 8.2 buffer min (Sample application speed lml / min). The bulk of the proteins (85%) are collected on the anion exchanger.
  • the platelet activation inhibitor is eluted with a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the protein peak containing the platelet activation inhibitor is collected (5.2 ml) and dried by lyophilization. Characteristic Yield, mg 1.7 mg (3.9%) Biological activity IC 5O 232nM
  • the solution of the poison is applied to a column (CU / 10, volume 7 ml) with an affinity sorbent Vlie Serharose FF, previously equilibrated with 50 ml of 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 (column equilibration rate of 2 ml / min, poison application rate of 0.5 ml / min).
  • 1OmM Tris HCl buffer with pH 7.4 is passed through the column at a speed of 2 ml / min and all material unbound with the sorbent (75 ml) is collected.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the fraction of material unrelated to Vlhe Serofaros FF was diluted 8 times with 5OmM Tris HCl with a pH 8.2 buffer and applied to a column filled with DEAE Serocos FF anion exchanger (column size Ix8cm, volume 7ml), pre-equilibrated with 5OmM Tris HCl 2 buffered with a pH of 2 buffered with 2 buffered with a pH of 2 buffered with 8.2 buffer min (Sample application speed lml / min). The bulk of the proteins (85%) are collected on the anion exchanger.
  • the platelet activation inhibitor is eluted with a stepwise gradient of ionic strength 0.2M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • a protein peak containing a platelet activation inhibitor is collected (7.1 ml) and dried by lyophilization.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Название изобретения:
Способ выделения ингибитора агрегации тромбоцитов из яда Аgкistrоdоп Ыотhоffii иssиriепsis I Меthоd fоr рrоduсtiоп оf thrоmbосуtе аggrеgаtiоп iпhibitоr trоmbосitе frоm vепоm Аgкistrоdоп Ыотhоffii иssиriепsis
МПК: А 61 К 35/588
Область техники к которой относится изобретения
Изобретение относится к промышленности биоактивных веществ и может быть использовано в биотехнологических производствах, медицине и фармацевтической промышленности, а именно к производству лекарственных и диагностических препаратов из яда змей.
Уровень техники
Ингибитор агрегации тромбоцитов-белок, обладающей инrибиторным действием на процесс активации тромбоцитами различными агентами активации.
Существует значительное количество ингибиторов активации тромбоцитов из различных источников. Все они отличаются по силе ингибирования и механизмам, по которым осуществляется данное ингибирование. Одним из эффективных источников ингибиторов активации тромбоцитов являются змеиные яды, которые содержат только белковые компоненты и имеют стабильный состав.
Известены некоторые способы получения активных ферментов из яда змеи. Например, известен способ получения активных ферментов из яда змеи Тriтеrеsиrиs окгпаvепsis путем фракционирования растворенного буфером яда на Сефадексе G-100, хроматографии на СМ-Тоуореаrl 650M в два этапа и заключительной очистки на Mono Q геле. (Nоsе S., Shimоhigаshi Y. еt аl. Рurifiсаtiоп апd сhаrасtеrizаtiоп оf а соаgulапt епzуmе, оkiпахоbiп II, frоm Тriтеrеsиrиs оkiпаvепsis (Нiтеhаbи sпакё) vепоm whiсh rеlеаsеs fibrinopeptides A апd В., Toxicoп.,-1994.-V.32,-P.1509-1520); из сырого яда змей рода Аgкistrоdоп sахаtilis, в котором сырый яд, растворенный в буфере, подвергается поэтапному фракцированию на Q-сефарозе, Сефадексе G-75 и Mono Q геле (Коh.Y., Сbдmg К., Кim.D. Вiосhеmiсаl сhаrасtеrizаtiоп оf а thrоmbiп-likе епzуmе апd а fibriпоlуtiс serine protease from snake (Аgкistrоdоп sахаtillis) vепоm., Тохiсоп. -2001. — V.39, N4. -P.555-560); из яда Аgкistrоdоп асиtиs, в котором, растворенный в буфере яд подвергают хроматографии на DЕАЕ-Сефарозе, Сефакриле S-200 и СМ-Сефарозе (Нuапg Q., Teng M., Niu L.Рurifiсаtiоп апd сhаrасtеrizаtiоп оf twо fibriпоgеп-сlоttiпg епzуmеs frоm fivе-расе sпаkе {Аgкistrоdоп асиtиs) venom.,Toxicon.-1999.-V.37, N7.-P.999-1013); из ярд Аgкistrоdоп асиtиs, в котором, растворенный в буфере яд подвергают разделению анионообменнике DEAE Сефадексе A-50, затем дважды хроматографируют на Сефадексе G-200 (Quуапg С, Hong J. еt аl. Рurifiсаtiоп апd рrореrtiеs оf thе trоmbiп-likе рriпсiрlе оf Аgкistrоdоп асиtиs vепоm апd its соmраritiоп with bоviпе tlтrоmbiп., Тhrоmb.Diаth.hаеmоrrth. -1971. -V.26 -P.224-234); из сырого яда змей рода Аgкistrоdоп асиtиs, в котором растворенный в буфере (рН 7.2), яд подвергают последовательной хроматографии на Сефадексе G-75, анионообменнике DЕАЕ-Сефадексе A-50 с градиентомд хлорида натрия 0.01-0.6M, сорбенте Гепарин-Сефарозе CL-6B (градиент хлорида натрия NaCl 0.1-0.3; 0.5M) и в отдельном случае дополнительно на Сефадексе G-100. (Коmоri Y, Nikаi Т.еt аl. А соmраrаtivе studу оf сlоttiпg fасtоrs frоm thе vепоm оf Аgкistrоdоп асиtиs соllесtеd iп сhiпа апd Таiwап., Соmр.Вiосhеm.Рhуsiоl. -1987. -V.88B, N2. -P643-649); из сырого яда змей Воthrорs аtrох, заключающийся в выделении тромбиноподобной фракции, способной вызывать коагуляцию фибриногена. (Ноllеmап W.H., Wеiss LJ., thе thrоmbiп-likе епzуmе frоm Воthrорs аtrох аmiпоbепzаmidiпе-substitutеd аgаrоsе. J Вiоl.Сhеm. 1976, Маг. -25. -251(6). —Р.1663-1669); кроме того известен способ, храктеризующий тем, что растворенный в буферном растворе яд подвергают поэтапной хроматографии на Сефадексе G-100, на катионообменнике СМ-Тоуореаrl 650M с линейным градиентом концентрации хлорида натрия и полным объёмом градиента, обеспечивающими наиболее полное выявление и раздельное элюирование тромбиноподобных ферментов, затем проводят раздельную рехроматографию этих ферментов, задавая линейные градиенты концентрации хлорида натрия из условий элюирования соответствующего тромбоподобного фермента на предыдущем этапе при одновременном увеличении полных объемов этих градиентов до уровня, обеспечивающего дополнительное разделение соседных тромбиноподобных ферментов и получают целевой продукт в гомогенном состоянии после раздельной очистки тромбиноподобных ферментов на сорбенте ABA-TSK. (RU 2271219 Cl (2004123274/15, 28.07.2004) 10.03.2006 Бюл.7., Способ получения тромбиноподобных ферментов из яда змеи).
Кроме того предложен способ выделения змеиного яда агрегации тромбоцитов PAl сущность которого включает способ определения в змеином яде способности ингибировать агрегацию тромбоцитов, способ очистки ингибитора активности тромбоцитов из различных образцов змеиного яда, его храктеристику и усеченную форму, содержащую модифицированный остаток лизина, которая специфически ингибирует связывание фибриногена или фактора фон Виллебранда с GPПb-Шa.(WO 90/15620, 16.06.1989, Рlаtеlеt аggrеgаtiоп iпhibitоrs, COR ТНЕRАРЕUТIСS, INC).
Недостатком прототипа является как низкий уровень рентабельности производственного процесса, низкий уровень чистоты и большой затрат времени.
Сущность изобретения
В основу изобретения поставлена задача разработать способ выделения ингибитора активации тромбоцитов из яда Аgkistrоdоп Ыотhqffii иssиriепsis, позволяющий путем проведения афинной хроматографии с последующей ионообменной хроматографией и применения носителей, обладающих более высокими хроматографическими свойствами и физико-химической стабилностью, повысить рентабельность производственного процесса, сократить время выделения фибриногено/фибринолиптического белка и повысить его чистоту. Поставленная задача решается в способе ингибитора активации тромбоцитов из яда Аgkistrоdоп Ыотhоffii иssиriепsis в том, что аффинную хроматографию проводят на колонке с носителем Вlие Sерhаrоsе FF, используя в качестве буферного раствора 1OmM Тris HCl с рН 7.4. ,Фpaкцию несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF, материала разбавляют 8 раз 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2. После отмывания сорбента от несвязанного материала, ингибитор активации тромбоцитов элюируют 5OmM Тris HCl буфере с рН 8.2 с содержанием 0.2M NaCl. Белковый пик, содержащий ингибитор активации тромбоцитов, собирают, концентрируют и с целью смены буфера наносят на колонку с Sерhаdех G25, уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 7.4 с содержанием 0.1 ЗМ NaCl. Осуществление изобретения
Поставленная задача решается предлагаемым способом, когда параметры процесса выделения ингибиторg активации тромбоцитов находятся в переделах, указанных в формуле изобретения. При изменении параметров в сторону увеличения или уменьшения характеристики получаемого препарата ухудшаются.
Изобретение иллюстрируется примерами 1-3 конкретного осуществления.
Пример.1
К 100мг яда щитомордника дальневосточного добавляют 5мл 1OmM Тris HCl буфера с рН
7,4 и перемешивают до полного растворения яда при 40C. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 40C в течении 15 мин. Осадок отбрасывают а надосадочную жидкость используют для афинной хроматографии. Раствор яда наносят на колонку (С 10/10, объём 7мл) с афинным сорбентом Вlие Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 50мл 1OmM Тris HCl буфером с рН 7,4 (скорость уравновешивания колонки 2 мл/мин, скорость нанесения яда 0,5мл/мин). После нанесения, через колонку со скоростью 2мл/мин пропускают 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и собирают весь несвязанный с сорбентом материал (60мл). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Фракцию несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF материала разбавляют в 8 раз 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF (размер колонки Ix8cм, объем 7мл), предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 со скоростью 2 мл/мин (Скорость нанесения образца lмл/мин). Основная часть белков (85%) собируется на анионообменнике. После отмывания сорбента от несвязанного материала буфером нанесения (120мл), ингибитор активации тромбоцитов элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0.2M NaCl в 5OmM Тris HCl буфере с рН 8.2 со скоростью 2мл/мин. Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Белковый пик содержащий ингибитор активации тромбоцитов собирают (6мл) и высушивают лиофилизацией. Характеристика Выход, мг 2.0 мг (4.2%)
Биологическая активность IC50 23OnM Пример 2.
К 96мг яда щитомордника дальневосточного добавляют 5мл 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и перемешивают до полного растворения яда при 40C. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 40C в течении 15 'мин. Осадок отбрасывают а надосадочную жидкость используют для афинной хроматографии. Раствор яда наносят на колонку (С 10/10, объём 7мл) с афинным сорбентом Вlие Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 50мл 1OmM Тris HCl буфером с рН 7,4 (скорость уравновешивания колонки 2 мл/мин, скорость нанесения яда 0,5мл/мин). После нанесения, через колонку со скоростью 2мл/мин пропускают 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и собирают весь несвязанный с сорбентом материал (53мл). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Фракцию несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF материала разбавляют в 8 раз 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF (размер колонки Ix8cм, объем 7мл), предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 со скоростью 2 мл/мин (Скорость нанесения образца lмл/мин). Основная часть белков (85%) собируется на анионообменнике. После отмывания сорбента от несвязанного материала буфером нанесения (112мл), ингибитор активации тромбоцитов элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0.2M NaCl в 5OmM Тris HCl буфере с рН 8.2 со скоростью 2мл/мин. Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Белковый пик содержащий ингибитор активации тромбоцитов собирают (5.2мл) и высушивают лиофилизацией. Характеристика Выход, мг 1.7 мг (3.9%) Биологическая активность IC5O 232nM
Пример 3.
К 110мг яда щитомордника дальневосточного добавляют 5мл 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и перемешивают до полного растворения яда при 40C. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 40C в течении 15 мин. Осадок отбрасывают а надосадочную жидкость используют для афинной хроматографии. Раствор яда наносят на колонку (СЮ/10, объём 7мл) с афинным сорбентом Вlие Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 50мл 1OmM Тris HCl буфером с рН 7,4 (скорость уравновешивания колонки 2 мл/мин, скорость нанесения яда 0,5мл/мин). После нанесения, через колонку со скоростью 2мл/мин пропускают 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и собирают весь несвязанный с сорбентом материал (75мл). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Фракцию несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF материала разбавляют в 8 раз 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF (размер колонки Ix8cм, объем 7мл), предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 со скоростью 2 мл/мин (Скорость нанесения образца lмл/мин). Основная часть белков (85%) собируется на анионообменнике. После отмывания сорбента от несвязанного материала буфером нанесения (135мл), ингибитор активации тромбоцитов элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0.2M NaCl в 5OmM Тris HCl буфере с рН 8.2 со скоростью 2мл/мин. Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Белковый пик содержащий ингибитор активации тромбоцитов собирают (7.1мл) и высушивают лиофилизацией. Характеристика
Выход, мг 2.9 мг (4.85%)
Биологическая активность IC5O 229nM

Claims

Формула изобретения
Способ выделения ингибитора активации тромбоцитов из яда Аgкistrоdоп blотhоffii иssиriепsis, включающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, аффинной хроматографии, и следующей за ней ионнообменной хроматографией, сбор фракций, содержащих биологическую активность ингибитора активации тромбоцитов и лиофилизацию отличающийся тем, что аффинную хроматографию проводят на колонке с носителем Вlие Sерhаrоsе FF, используя в качестве буферного раствора 1OmM Тris HCl с рН 7,4 и затем фракцию несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF материала разбавляют в 8 раз 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2; затем отмывают сорбента от несвязанного материала, ингибитор активации тромбоцитов элюируют 5OmM Тris HCl буфере с содержанием 0.02M NaCl, белковый пик содержащий ингибитор активации тромбоцитов собирают, концентрируют и с целью смены буфера наносят на колонку Sерhаdех G25, уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 7.4 с содержанием 0.1 ЗМ NaCl.
PCT/MN2006/000005 2006-08-16 2006-08-30 Method for extracting a platelet aggregation inhibitor from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom Ceased WO2008020743A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MN381206 2006-08-16
MN3812 2006-08-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2008020743A2 true WO2008020743A2 (en) 2008-02-21
WO2008020743A3 WO2008020743A3 (fr) 2008-07-10

Family

ID=39082466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/MN2006/000005 Ceased WO2008020743A2 (en) 2006-08-16 2006-08-30 Method for extracting a platelet aggregation inhibitor from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2008020743A2 (ru)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1293795A (en) * 1969-07-04 1972-10-25 Twyford Lab Ltd Improvements relating to anticoagulants
US5318899A (en) * 1989-06-16 1994-06-07 Cor Therapeutics, Inc. Platelet aggregation inhibitors
CN1250718C (zh) * 2002-12-05 2006-04-12 兆科药业（合肥）有限公司 蝰蛇蛇毒血凝酶的层析纯化方法
RU2271219C1 (ru) * 2004-07-28 2006-03-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации" Способ получения тромбиноподобных ферментов из яда змеи

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008020743A3 (fr) 2008-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cheng et al. Identification and inhibitory activity against α-thrombin of a novel anticoagulant peptide derived from oyster (Crassostrea gigas) protein
JP2509407B2 (ja) 生物学的に活性な化合物の単離方法
JPS62174023A (ja) 抗血液凝固物質、その製法及びそれを有効成分とする抗血液凝固剤
Hvatum et al. Studies on tissue thromboplastin-Its splitting into two separable parts
Chérifi et al. Isolation, functional characterization and proteomic identification of CC2-PLA2 from Cerastes cerastes venom: a basic platelet-aggregation-inhibiting factor
Thakur et al. Biochemical and pharmacological characterization of a toxic fraction and its cytotoxin-like component isolated from Russell's viper (Daboia russelii russelii) venom
Babaie et al. Isolation and partial purification of anticoagulant fractions from the venom of the Iranian snake Echis carinatus
ESTBORN Separation of phosphatase isoenzymes by gelfiltration
De-Simone et al. Simple affinity chromatographic procedure to purify β-galactoside binding lectins
Tian et al. Purification and biochemical characterization of a novel fibrinolytic enzyme, PSLTro01, from a medicinal animal Porcellio scaber Latreille
Lee et al. Cloning and characterization of a blood coagulation factor IX-binding protein from the venom of Trimeresurus stejnegeri
WO2014075374A1 (zh) 尖吻蝮蛇血凝酶-b
WO2008020743A2 (en) Method for extracting a platelet aggregation inhibitor from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom
US4027012A (en) Process for the extraction of components having anticoagulant activity "in vivo" from snake venoms and products obtained
Li et al. Antithrombotic and thrombolytic activities of Agkisacutacin, a snake venom proteinase, in experimental models
Mukherjee et al. Medical and diagnostic applications of snake venom proteomes
Sadeesh Kumar et al. Screening and characterization of fibrinolytic protease producing Bacillus circulans from mangrove sediments Pitchavaram, South East Coast of India
Hanumegowda et al. Kenaf seed cysteine protease (Kscp) inhibits the intrinsic pathway of the blood coagulation cascade and platelet aggregation
WO2008020742A2 (en) Method for extracting fibrinogenic/fibrinolytic protein from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom
WO2008020739A2 (en) METHOD FOR EXTRACTING α-SPECIFIC TROMBIN-LIKE ENZYME (ANCISTRON-B) FROM AGKISTRODON BLOMHOFFII USSURIENSIS VENOM
RU2262947C2 (ru) Способ получения тромбиноподобного коагулирующего фермента
JP3878668B2 (ja) 血栓性疾患の治療
KR100447101B1 (ko) 혈전용해작용이 있는 동충하초 추출물 및 이로부터 분리된혈전용해효소
JPH0965879A (ja) 新規血栓溶解酵素とその製造方法
Tan et al. Isolation and characterization of the thrombin-like enzyme from Cryptelytrops albolabris (white-lipped tree viper) venom

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 06799435

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06799435

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2