WO2008023582A1

WO2008023582A1 - Depsipeptide containing lactic acid residue

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Publication number: WO2008023582A1
Application number: PCT/JP2007/065720
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Oku; Yuya Shimoda; Aya Inoue; Chie Takayama; Keiichi Yamada; Ryoichi Katakai
Original assignee: Gunma University
Current assignee: Gunma University
Priority date: 2006-08-24
Filing date: 2007-08-10
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2009-02-24
Also published as: JPWO2008023582A1; US20100099846A1; EP2058324B1; JP5158716B2; EP2058324A1; EP2058324A4; US8153759B2

Description

[0001] 本発明は、度応答性材料として使用しうる新規なデプシペプチド化合物およびそれを重合させて得られるデプシペプチドポリマーに関する。更に詳しくは、乳酸残基とアミノ酸残基が脱水縮合されてできたデプシペプチドを構成成分として持つ新規なデプシペプチド化合物およびそれを重合させて得られるデプシペプチドポリマーに

明

関する。

本発明の材料は水、緩衝液または含水溶媒中で温度に応答し凝集または溶解す

書

る温度応答性材料として使用しうるため、生体吸収性組成物、環境分解性組成物、細胞接着剤、人工筋肉、マイクロカプセル、バイオマシン、バイオセンサー、分離膜、検査キットなどを構成するのに有用である。

背景技術

[0002] (1)デプシペプチドおよび関連材料の現況：

デプシペプチドは式 (A)に示すように主鎖がエステル結合とアミド結合で連結されたポリマーまたはオリゴマーである。その構造の骨格はアミド結合とエステル結合からできている。

アミド結合エステル結合

[0003] 骨格に含まれるアミド結合とエステル結合は分子レベルでは 3種類の相互作用が知られている。即ちアミド結合同士では、分子レベルでは分子内と分子間に水素結合により、強い相互作用と分子構造の安定化を起こす。よって巨視的には溶媒への不溶化と機械的強度の向上が期待される。またエステル結合同士では、分子レベルでは水素結合による分子間と分子内の相互作用が生じない。よって巨視的には機械的強度の減少による柔軟性または弱さが期待される。即ちアミド結合とエステル結合の間では、分子レベルでは分子内と分子間にエステル部位の酸素原子とアミド部位の NHの間でやや弱い水素結合により、分子構造の構造安定化を起こす。よって巨視的にはアミド結合のみの場合より小さな機械的強度の向上が期待される。従ってデプシペプチドはアミノ酸ゃヒドロキシカルボン酸によるオリゴマーやポリマーの特徴を生力、した材料とすること力 Sできる。つまりアミノ酸とヒドロキシカルボン酸の種類や組成、配列を変化させることで幅広い特性を持つ材料を合成することができる。さらに、デプシペプチドの長所として、体内に炎症をおこしにくいこと、酸性成分に弱い物質の薬物運搬材料として利用できること、水素結合と疎水性相互作用といった分子間や分子内相互作用により成型物の強度が極めて高いこと、の 3点が挙げられる。このようにデプシペプチドは極めて魅力的な物質である。

[0004] 実際にポリデプシペプチドにつ!/、てはさまざまな研究が行われた。例えばヒドロキシカルボン酸の側鎖を H -、 CH -、 (CH ) CH -、 (CH ) CH-CH -のように疎水性と立体障害の大きさを変化させると生体内での分解速度力 ¾週間から 6ヶ月まで幅広く調節すること力 Sできること力 Sわ力、つている。また生体組織との接合面に炎症はみられないことも特徴的である (非特許文献 1)。

ポリデプシペプチドでは炎症が見られなかった力一般にポリヒドロキシカルボン酸のみを使用する材料では分解が速い場合、炎症反応を引き起こしゃすいことが知られている（非特許文献 2)。これは乳酸ゃグリコール酸のような比較的強い酸性成分が蓄積するためと考えられている。一方、ポリデプシペプチドではデプシペプチドオリゴマーが分解物として生成するために酸性成分が蓄積されず、分解速度が速くても炎症が見られなかったと考えられる。

[0005] ポリデプシペプチドは、合成方法の点からも近年改良が行われてきた。例えば反応ステップ数を削減する研究である。すなわち、アミノ基を保護されたアミノ酸のカルボキシル基と、無保護のカルボキシル基を有するヒドロキシカルボン酸のヒドロキシル基とを、アミノビリジン化合物を触媒として反応させ、ジデプシペプチドを生成することができるようになった（特許文献 1、非特許文献 3, 4)。これらの研究により、ヒドロキシカルボン酸のカルボキシル基の保護基を形成せずに繰り返し配列をもつデプシぺプチドをより簡便に製造できるようになった。即ち、実験室レベルの合成設備 (数 mL〜数百 mL)でも、純粋なポリデプシペプチドを数百 mg〜数 gの単位で一度に合成することが可能となった。工場設備 (数 L〜数百 L)へ規模拡大した場合は数 kg単位での製造を十分に行うことができる。

[0006] (2)温度応答性材料の現況：

近年、温度を上昇させることで凝集する温度応答性材料の研究に注目が集まっている。これらは水を多く含有する性質を利用して薬物運搬体、創傷被覆材料、人工筋肉、マイクロカプセル、バイオマシン、バイオセンサー、分離膜などへの利用が期待されている。

[0007] デプシペプチドを用いた方法によっても近年、温度応答性材料が開発された。（特許文献 2、非特許文献 5)例えば、 -Gly-Val-Gly-Hmb-Pro-と _Gly_Va卜 Gly-Hmb- Ala-Pro- (Hmb = ノリン酸残基）を繰り返し単位とするデプシペプチドポリマーが開示されている。これらはバリン酸（Hmb)と呼ばれる 0分岐型ヒドロキシカルボン酸を有する点を特徴としている。ここで示した配列に於けるバリン酸の位置には、温度応答性の発現のために、 /3分岐型アミノ酸ほたはヒドロキシカルボン酸）が必要であると考えられてきたためである。

[0008] デプシペプチドまたはペプチドによる温度応答性材料に於いて、 /3分岐型アミノ酸の役割は、加熱により Val γ CH (または Hmb γ CH )と Pro δ CHの疎水性水和した水分子が熱エネルギーによる分子運動の増大で側鎖から遊離して、側鎖間に疎水性相互作用を起こすこと（加熱による温度応答性の凝集現象）、またその逆の過程が起こること (冷却による温度応答性の溶解現象)で、可逆的な温度応答性を引き起こすと考えられてきた。（Val残基での例として、非特許文献 6〜9) (lie残基での例として、非特許文献 10)

[0009] ペプチドによる温度応答性材料に於!/、て、実際に /3分岐型アミノ酸ではない、ァラニン (Ala)残基の場合、非可逆な温度応答を示し直ちに水に不溶な物質になってしまうことが指摘されて!/、る。（非特許文献 11)すなわち従来の温度応答性材料には、決まった位置に 13分岐型アミノ酸を導入する必要があり、配列の制限が大きい点で問題があった。

[0010] これまでの生体材料として実際に市販されてきたヒドロキシカルボン酸は、主に乳酸とグリコール酸を構成成分としている。これらは多くの使用例があり、長所と短所がわ力、つて!/、る点で優れて!/、る。

一方、これまでのデプシペプチドによる温度応答性材料は、その他のヒドロキシカノレボン酸である、ノリン酸（Hmb)を使用している。これは抗生物質のように多くの天然物に含まれるためほとんど問題はないと予想される力 S、生体材料として使用された事例は少ない。そのため、ノリン酸 (Hmb)を含んだ温度応答性高分子の生体応用には、体内動態を含めて多くの検討が必要と考えられる点で、まだ問題が残っていた。

[0011] 興味深い研究として、温度応答性材料に関連したポリデプシペプチド配列力 199 0年に報告されている。（非特許文献 12、 13)ここでは- Va卜 Pro-Gly-Hmb-Gly-と -V a卜 Ala-Pro-Gly-Hmb-Gly-の 2種類の繰り返し配列をもつポリマーが報告されている。これらは、温度応答性が示されていない、合成ステップ数が多い、縮合反応と呼ばれるエステル結合又はアミド結合を生成する最も重要な反応が低収率であること（5 つの反応が記載され、それぞれ 23、 33, 54, 70、 76%)、低収率の結果最終生成物のポリマー体が 10 mgしか得られていないこと、の 4点に於いて問題があった。実際、論文中には、

この配列の合成がいかに困難であるか述べてある点は注目される。

即ち、本発明者らの報告した事例 (特許文献 2、非特許文献 5)を除き、一般には現在まで、温度応答性材料に関連したポリデプシペプチドおよびオリゴデプシペプチド配列の合成は非常に困難であり、実用的ではないと考えられてきた。

特許文献 1：特開 2004-269462

特許文献 2： WO2006/043644A1

非特許文献 1 :吉田ら、 Journal of Biomedical Materials Research, 1990年、 24巻、 117 3ページ

非特許文献 2 :敷波保夫、リウマチ科、 1999年、 21巻第 3号、 267ページ

非特許文献 3 :片貝ら、 Biopolymers, 2004年、 73巻、 641ページ非特許文献 4 :奥ら、 Acta Crystallographica Section E、 2004年、 E60巻、 o927ページ非特許文献 5 :七里ら、 Peptide Science 2004、 2005年、 633ページ

非特許文献 6 :チャンら、 Journal of Biomolecular Structure and Dynamics 1989年、 6 巻、 851ページ

非特許文献 7 :ゥリーら、 Biochemistry and Biophysics Research Communication、 197 7年、 79巻、 700ページ

非特許文献 8 :ゥリーら、 Biopolymers, 1989年、 28巻、 819ページ

非特許文献 9 :ゥリーら、 Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1992年、 57巻

、 23ページ

非特許文献 10 :ゥリーら、 Biopolymers, 1986年、 25巻、 1939ページ

非特許文献 11：フノ刃ら、 International Journal of Peptide and Protein Research^ 197

8年、 81ページ

非特許文献 12 :ァラッド &グッドマン、 Biopolymers、 1990年、 29巻、 1633ページ非特許文献 13 :ァラッド &グッドマン、 Biopolymers、 1990年、 29巻、 1651ページ発明の開示

[0012] 本発明の課題は、生体材料として好ましい構成成分を有し温度応答性材料として使用しうる、新規なデプシペプチドを提供することにある。

[0013] 本発明者らは、上記目的を達成するために新たなアミノ酸配列に着目した。即ち従来は不可逆的な温度応答とその結果生じる不溶性のために注目されてこな力、つた、 β分岐型アミノ酸ではないアミノ酸、ァラニン (Ala)を持つエラスチン様ポリペプチドの配列、 -Gly-Ile-Gly-Ala-Pro- (配列番号 1)に着目した。更にァラニン (Ala)をヒドロキシカルボン酸の乳酸（Lac)に置換したデプシペプチド、 -X -X -Gly-Lac-Pro- (Xお

1 2 1 よび Xは任意のアミノ酸残基）の化学合成を計画した。

[0014] はじめに- X -X -Gly-Lac-Pro-の配列を持つポリデプシペプチドとして、 poly(Gly_Il

1 2

e-Gly-Lac-Pro),および poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)の化学合成を計画した。合成方法や各反応段階での条件を精査することで、実験室規模の設備 (数 mL〜数百 mL) にも関わらず、数百 mg〜数 gの単位を一度の工程で化学合成することができた。

[0015] さらに、これらのポリデプシペプチドは容易に水溶液となり、目視ゃ測定装置によつて明瞭な温度応答性が確認された。また、温度応答挙動は可逆的であることがわかつた。このように種々の乳酸残基を含むデプシペプチドについて合成を行い温度応答性について鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。

(1)下記一般式（I)

R -Glv-Lac-Pro-R (I)

1 2

で表される化合物。

(式中、— Gly— Lac— Pro—は下記式 (Π)の構造を示し、 Rは水素原子、アミド結合で

1

結合したアミノ酸、ポリペプチドまたはヒドロキシカルボン酸、 Rは水酸基、アミド結合で結合したアミノ酸もしくはポリペプチド、またはエステル結合で結合したヒドロキシカルボン酸を表す。 )

[化 2]

(2)前記一般式 (I)が、 X -X -Gly -Lac -Pro (Xおよび Xは α —アミノ酸残基を示

1 2 1 2

す）である（1)の化合物。

(3) (1)または（2)の化合物を重合させて得られるポリマー。

(4)末端に糖鎖配歹 IJ、タンパク質、多糖、金属錯体、高分子担体、ゲル、フィルム、ラテックス粒子、金属微粒子、無機微粒子、ガラスプレート、もしくはプラスチックプレートが結合した、（1)もしくは（2)の化合物、または（3)のポリマー。

(5) (1)もしくは（2)の化合物または（3)のポリマーを、水、緩衝液、食塩水、または含水有機溶媒と混合させることにより得られる組成物であって、溶媒和状態、ゲル状態

、懸濁物、均一な溶液、または相分離状態を形成する組成物。 (6)加温により水分子を放出し、冷却により水分子を取り込む（5)の組成物。

(7) (1)もしくは（2)の化合物または（3)のポリマーを含む温度応答性組成物。

図面の簡単な説明

[図 1]図 1は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Ile-Gly-Lac-Pro)を MALDト TOF 質量分析法により測定したスペクトルである。

[図 2]図 2は本発明の一実施態様である、 poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)を MALDI-T0F 質量分析法により測定したスペクトルである。

[図 3]図 3は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Ile-Gly-Lac-Pro)の水溶液（0.1 m g/mL)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 0〜80°Cの間で 10°C毎に温度上昇させ、各温度での温度平衡になった際に測定された、温度変化円偏光二色性スペクトルである。

[図 4]図 4は本発明の一実施態様である、 poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)の水溶液（0.1 m g/mL)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 10〜70°Cの間で 10°C毎に温度上昇させ、各温度での温度平衡になった際に測定された、温度変化円偏光二色性スペクトルである。

[図 5]図 5は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Ile-Gly-Lac-Pro)の水溶液（10 m g/mL)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 20〜70°Cの間、 l°C/5分の速度で温度を上昇、次には下降させた。 1°C毎に各温度での 350 nmの光に対して透過率 (%)を測定し、 100—透過率 (%) =濁度 (%)としてプロットしたグラフである。

[図 6]図 6は本発明の一実施態様である、 poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)の水溶液（10 mg /mL)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 20〜70°Cの間、 l°C/5分の速度で温度を上昇、次には下降させた。 1°C毎に各温度での 350匪の光に対して透過率 (%)を測定し、 100—透過率 (%) =濁度 (%)としてプロットしたグラフである。

[図 7]図 7は本発明の一実施態様である、 poly(Gly_Va卜 Gly-Lac-Pro)を MALDト T0F 質量分析法により測定したスペクトルである。

[図 8]図 8は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Vaト Gly-Lac-Pro)の水溶液（0.1 mg/mL)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 10〜70°Cの間で 10°C毎に温度上昇させ、各温度での温度平衡になった際に測定された、温度変化円偏光二色性スペクトルである。

[図 9]図 9は本発明の一実施態様である、 poly(Gly_Va卜 Gly-Lac-Pro)の水溶液（10 m g/mL)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 20〜70°Cの間、 l°C/5分の速度で温度を上昇、次には下降させた。 1°C毎に各温度での 350 nmの光に対して透過率 (%)を測定し、 100 透過率 (%) =濁度 (%)としてプロットしたグラフである。また比較例として poly(Gly_Va卜 Gly-Hmb-Pro)の水溶液（10 mg/mL)を示した。

[図 10]図 10は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Vaト Gly-Lac-Pro)について濃度の異なる水溶液（10， 20， 30， 40 mg/mL)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 20〜70°Cの間、 l°C/5分の速度で温度を上昇させた。 1°C毎に各温度での 350 nmの光に対して透過率 (%)を測定し、 100 透過率 (%) =濁度 (%)としてプロットしたグラフである。

[図 11]図 11は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Vaト Gly-Lac-Pro)の水溶液（4 0 mg/mL)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 20〜70°Cの間、 l°C/5 分の速度で温度を上昇、次には下降させた。 1°C毎に各温度での 350匪の光に対して透過率 (%)を測定し、 100 透過率 (%) =濁度 (%)としてプロットしたグラフである。発明を実施するための最良の形態

本発明の化合物（デブシペプチド）は、下記一般式（I)で表される。

R -Gly-Lac-Pro-R (I)

1 2

式 (I)中、 Gly— Lac— Pro は下記式 (Π)のグリシン残基と乳酸残基とプロリン残基の結合したトリデプシペプチド構造を示す。

[化 3]

また、 Rはァミノ基の H原子、アミド結合で結合したアミノ酸、ポリペプチドまたはヒドロキシカルボン酸を示し、 Rはカルボン酸の OH基、アミド結合で結合したアミノ酸もしくはポリペプチド、またはエステル結合で結合したヒドロキシカルボン酸を示す。

なお、 Rがアミノ酸またはポリペプチドである場合、 Rのァミノ末端にはァミノ基の保

1 1

護基が付加されていてもよい。また、 Rが OH基またはアミノ酸もしくはポリペプチドである場合、 Rのカルボキシ末端にはカルボキシル基の保護基が付加されていてもよい。ァミノ基の保護基としては、 Boc : tert_ブトキシカルボニル（t-Bu-0-CO-)などが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、 OSu : N-ヒドロキシスクシンイミドゃ OB zl :ベンジル（-0-CH -C H )などが挙げられる。

2 6 5

[0019] R及び Rに含まれるアミノ酸 (ポリペプチドを構成するものも含む）は α アミノ酸が

1 2

好ましい。また、側鎖が修飾されたもの、側鎖にペプチドなどが結合したものなどであつてもよい。また、 R及び Rがポリペプチドの場合、アミノ酸の数が 2〜20個のものが

1 2

好ましぐ 2〜9個のものがより好ましい。

R及び Rに含まれるアミノ酸 (ポリペプチドを構成するものも含む）の種類は、温度

1 2

応答性組成物の成分に合わせて、応答温度や溶解性ゃ膨潤性の調節を目的として選択が行われる。例えば一般に電荷を帯びることがなければ、アミノ酸側鎖の疎水性が大きいほど応答温度が低温側へ、親水性が大きいほど高温側に調節することが可能である。これは発明者らの関連研究（例えば Macromolecules、 1998年、 31巻、 3383 ページ； Macromolecules、 1996年、 29巻、 1065ページなど）ゃゥリーらの研究例（特表 2004-501784)により明らかである。

また、 R及び Rに含まれうるヒドロキシカルボン酸としてはバリン酸、乳酸、グリコー

1 2

ル酸などが挙げられる。

[0020] 本発明の化合物は、上記一般式（I)で表される配列力 X -X Gly— Lac— Proで

1 2

あることが好ましい。ここで、 Xおよび Xは任意の α—アミノ酸残基を示す。

1 2

具体的には、 Ala- lie- Gly-Lac- Pro、または Gly- lie- Gly-Lac- ΡΓΟ、 Gly- Vaト Gly- La c-Proなどが挙げられるがこれらには限定されない。

[0021] 本発明のポリマー化合物は上記一般式 (I)のデプシペプチド化合物を重合させて得られるポリマーである。

ポリマー化合物の構造は直鎖状構造が好まし!/、が、アミノ酸側鎖から分岐した分岐鎖を有するものであってもよレ、。

デプシペプチドポリマーの重合度は特に制限されず、一般式 (I)のデプシペプチド化合物が 2〜； 10個程度繰り返されたオリゴマーであってもよい。なお、本発明のポリマー化合物に含まれるアミノ酸残基及びヒドロキシ酸残基の総数は好ましくは 1000 個以下、より好ましくは 500個以下である。本発明のポリマー化合物は分子量 1500 〜； 10万であることが好ましぐ 1500〜5万であること力り好ましい。

本発明のポリマー化合物は、一般式 (I)のデプシペプチド単位を 2種類以上含むものであってもよい。

[0022] 本発明のポリマー化合物は、例えば、まず、一般式 (I)の化合物（デブシペプチド）を合成し、これを重合させることにより得ること力 Sできる。

一般式 (I)の化合物は後述の実施例のように化学合成によって得ることができる。後述の実施例に記載の化学合成法は、遺伝子組み換えによるポリペプチド温度応答性材料の製造スケールと比較すると、わず力、 1回〜数回の合成を小規模の実験施設で行うだけで、大規模遺伝子組み換え法製造設備に匹敵する量の温度応答性材料を得ること力 Sできる。また従来報告されてきた化学合成の方法 (ァラッド &グッドマン、 Biopolymers、 1990年、 29巻、 1633ページ。）と比較しても 100倍以上のスケールで目的物が得られる。

[0023] 一方、一般式 (I)の化合物の重合反応は通常のアミド縮合反応によって行うことができるが、反応性側鎖を有するアミノ酸が含まれる場合は側鎖を保護して重合反応を行うことが好ましい。

また、セグメント縮合と呼ばれる一単位ずつの伸長反応を用いることもできる。なお、本発明の化合物およびポリマー化合物は保護基を有するものであってもよい、 N末端及び C末端の少なくとも一方のアミノ酸残基が脱保護された場合、水系環境への溶解に適している。

[0024] 本発明の化合物およびポリマー化合物は、末端に他の化合物や材料が結合したものであってもよレ、。末端はァミノ末端側とカルボキシ末端側の!/ヽずれか一方でもよレヽし、両方でもよい。

他の化合物や材料には、ヒドロキシ酸配歹 IJ、アミノ酸配列、糖鎖配列、タンパク質、多糖、金属錯体または高分子担体、ゲル、フィルム、ラテックス粒子、金属微粒子、プラスチックプレートなどを使用することができる。他の化合物や材料とは、共有結合、配位結合、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合などで結合させることができる。

[0025] 本発明の化合物およびポリマー化合物は、水、緩衝液、食塩水、または含水有機溶媒と混合することにより、溶媒和状態、ゲル状態、懸濁物、均一な溶液、または相分離状態の組成物を形成することができる。

本発明の化合物およびポリマー化合物は温度応答性を有しているものが好ましい。温度応答性とは、例えば、水中、緩衝液、食塩水、または含水有機溶媒中において、低温側の第一の温度から高温側の第二の温度まで加温されることで凝集する性質をいう。第一の温度、第二の温度はポリマー化合物に含まれるアミノ酸の種類や末端に結合させる他の化合物の種類によって異なり、ポリマー化合物ごとに適宜設定されるカ第二の温度と第一の温度の差は 10°C以上であることが好ましい。

なお、凝集は目視、分光光度計を用いた透過率変化やみかけ上の吸光度変化などによって確言忍することができる。

また、加温により水分子を放出し、冷却により水分子を取り込むという可逆的温度応答十生を有するものが好ましレヽ。

このような性質により、本発明の化合物およびポリマー化合物は温度応答性組成物の製造に用いることができる。

[0026] 温度応答性組成物は、本発明の化合物（デブシペプチドもしくはそのポリマー）または上記他の化合物や材料に結合した本発明の化合物を単独、または、生理学的に許容される担体と組み合わせて使用される。

生理学的に許容される担体は、特に制限されず、粉体、散剤などの固形剤であつてもよいが、本発明の化合物は、通常、液体の担体と組み合わせることにより液剤として利用される。すなわち、液剤の担体としては、水、生理食塩水、緩衝液（リン酸緩衝液など）、アルコール水溶液 (エタノール水溶液など）、多価アルコール水溶液（5 %グリセリン水溶液、エチレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液など）、糖水溶液（5%グルコース水溶液、ブドウ糖水溶液など）、アルブミン水溶液（5%アルブミン溶液など）などが例示できる。なお、液剤は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、エアゾール剤、貼付剤 (パスタ剤、パップ剤）などであってもよい。液剤中の温度応答性材料（又は温度応答性重合体）の濃度は、重合体の溶液粘度などに応じて、例えば、 0. ；!〜 90重量⁰ /₀、好ましくは 0. 5〜50重量⁰ /₀、さらに好ましくは；!〜 30重量⁰ /₀ ( 例えば、；!〜 15重量％)、特に 1〜； 10重量％程度の範囲から選択できる。

温度応答性組成物は、生理的又は薬理的に許容される種々の添加剤、例えば、ポリビニノレピロリドン、マクロゴーノレ、ポリビニノレアノレコーノレ、セノレロース誘導体（セノレ口ースエーテル類など)などの高分子、保存剤、安定剤、乳化剤や懸濁化剤、 pH調整剤、緩衝剤、薬剤 (殺菌剤、消毒剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、抗アレルギ一剤、鎮痛剤、止血剤など)などを含んでいてもよい。

[0027] 本発明の温度応答性組成物は、温度に応答して凝集する（例えば、液体からゲルへ変化する）とレ、う性質を有しており、さらに生体内での安全性が高!/、と!/、う利点もある。そのため、生体 (例えば、患部など）への適用により、塗布部にゲル状の皮膜を形成できる。本発明のポリマーや組成物は生体内で分解吸収される組成物、土壌などの環境下で分解吸収される組成物、細胞接着剤、創傷被覆材料、マイクロカプセル、バイオマシン、バイオセンサー、分離膜、検査キットなどを構成するのに利用できる。これは発明者らの関連研究を踏まえれば容易に開発することが可能である（例えば、吉田ら、 Advanced Materials, 1997年、 9巻、 757ページ；廣木ら、 Journal of Polymer Science, 1998年、 36巻、 1495ページ；特開平 7-233194 ;吉田ら、 Drug Design and D elivery, 1991年、 7巻、 159ページ；真下ら、北関東医学、 1991年、 41巻、 311ページ）

〇

実施例

[0028] 以下本発明の実施態様である、 -Gly-Ile-Gly-Lac-Pro-ユニットの合成方法、およびこれらを用いて得られる、ポリマー化合物 poly(Gly-Ile-Gly-Lac-Pro)の合成方法について詳細をそれぞれ実施例 1、 2に示す。またその他の実施態様として、 -Ala-Ile- Gly-Lac-Pro-ユニットの合成方法、 poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)の合成方法、 -(Ala-Il e-Gly-Lac-Pro) _ (n = 2， 3， 4)オリゴマーの合成方法について詳細をそれぞれ実施

n

例 3、 4、 5に示す。 -Gly-Va卜 Gly-Lac-Pro-ユニットの合成方法、およびこれらを用いて得られる、ポリマー化合物 poly(Gly_Va卜 Gly-Lac-Pro)の合成方法について詳細を実施例 9に示す。また実施に於いて共通した操作は合成手順 1〜3として示した。し力、し以下の具体例は本発明を限定するものではなぐ例えば保護基や縮合剤を他の慣用のものと置換することなど、適宜変更できることは勿論である。

[0029] その他のデプシペプチド単位、つまり例えば、 -X -X -Gly-Lac-Pro-に於ける Xと X

1 2 1 2 への任意のアミノ酸残基の導入は実施例の N- a -t_ブトキシカルボニル -L-グリシン（または N- a -t_ブトキシカルボニル- L-ァラニン）と N- a -t_ブトキシカルボニル- L-ィソロイシンに代えて、対応する N- a _t-ブトキシカルボニル-アミノ酸を使用することで同様に実施される。

[0030] なお、以下の実施例では次のような略号を使用した。

[0031] (アミノ酸誘導体）

Boc-Gly-OH： N- a _t_ブトキシカルボニル-グリシン

Boc-Ala-OH： N- a _t_ブトキシカルボニル _L_ァラニン

Boc-Ile-OH： N- a _t_ブトキシカルボニル _L_イソロイシン

HCl ' H-Pro-OBzl : L-プロリンベンジルエステル塩酸塩

[0032] (ヒドロキシカルボン酸）

H-Lac-OH： L-乳酸

[0033] (アミノ酸の主鎖および側鎖保護基）

Boc： tert-ブトキシカルボニル（t-Bu-0-CO-)

OBzl :ベンジル（-0-CH -C H )

2 6 5

[0034] (ペプチド合成用試薬、その関連化合物）

DCC： N，N '-ジクロロへキシルカルポジイミド

DCUrea:ジシクロへキシルゥレア

HOSu： N-ヒドロキシスクシンイミド

HOBt : 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール

TFA :トリフルォロ酢酸

(Boc) 0 :ジ -t-ブチルカルボネート

NMM： N-メチルモルホリン

EDC · HC1： 1-ェチル -3-(3_ジメチルァミノプロピル) -カルポジイミド塩酸塩 DMAP : Ν,Ν'-ジメチルァミノピリジン

[0035] (溶媒）

THF :テトラヒドロフラン

CHC1 ：クロロホルム

CDC1：重水素化クロ口ホルム

AcOEt：酢酸ェチノレ

DMF： Ν,Ν'-ジメチノレホノレムアミド

DMSO-d：重水素化ジメチルスルホキシド

MeOH :メタノーノレ

Et 0：ジェチノレエーテノレ

[0036] (その他）

TLC：薄相クロマトグラフィー

[0037] [合成手順 1： Boc-L-アミノ酸の合成]

L-アミノ酸または側鎖を保護した L-アミノ酸（1.0 mol)を 4M NaOH (250 mL， 1.0 mol) に溶かし、氷- MeOHで徐々に冷却しながら最小量のジォキサンに溶力、した (Boc) 0 ( 240.0 g， 1.1 mol)を 30分かけて徐々に加えた。氷浴で 1時間、室温で 1時間半攪拌した。析出した NaHCOをろ別した後、 pH3.0にして AcOEtで抽出する。抽出溶液は 10

%クェン酸水溶液で洗浄の後、 Na SOで乾燥させた。乾燥剤をろ別後、ろ液は減圧濃縮し、残渣にへキサンを加えて結晶化させた。その後、 AcOEt-へキサンで再結晶を行い、 Boc-L-アミノ酸を得た。

[0038] [合成手順 2 :アミノ基末端の脱保護反応、脱 Boc化合物の合成]

アミノ基を N- a _t-ブトキシカルボニル保護したペプチド化合物を 300 mLナスフラスコに入れドラフト内で TFAほたは 4M HC1のジォキサン溶液）を加え溶解させた。直ちに塩化カルシウム管で蓋をし、水分の混入を防いだ。 TLCにより反応の終了を確認後、濃縮し TFA臭ほたは塩酸臭）がなくなるまで繰り返し蒸留 Et 0を加えて濃縮すると最終的に TFA塩ほたは塩酸塩）の白色粉末を得る。収率は、ほぼ定量的である。

[0039] [合成手順 3 :縮合反応]

アミノ基を N_ a _t -ブトキシカルボニルで保護し、カルボキシル末端を脱保護したぺプチド化合物（2.1 mmol)を 300 mL三角フラスコに入れ蒸留 CHC1に溶力、し、 HOBt

(0.28 g， 2.1 mmol), EDC -HCl (0.40 g， 2.1 mmol) (または DCC (0.43 g， 2.1 mmol))を加え攪拌した。次に 300 mlのナスフラスコにアミノ基を上記合成手順 2で脱保護し TF A塩のペプチド化合物（1.4 mmol)を入れ NMMで TFA塩を中和する。ほぼ等モル (0.1 5 mL, 1.40 mmol)で中和を確認できる力結晶性が悪い塩の場合やや多くなることがある。二つの溶液を混合攪拌しながら、直ちに氷冷し反応を開始した。そのままゆつくり室温に戻して一晩攪拌する。この混合物をエバポレーターにより濃縮し AcOEtに溶かしてから、（DCCを使用した場合は AcOEtに不溶の DCUreaを除く） 10%クェン酸水溶液、蒸留水、飽和 NaHCO水溶液、蒸留水、飽和食塩水の順に洗浄を行い Na S

0で乾燥し濃縮してオイル状または無色粉末の縮合生成物を得る。これを、シリカゲノレクロマトグラフィー（蒸留 CH C卜へキサンまたは AcOEt-ベンゼン）またはゲルろ過クロマトグラフィー（フアルマシア製 LH20、 DMFまたは MeOH)により精製する。無色粉末の場合は AcOEt-蒸留 Et 0や蒸留 CH C卜へキサンの溶媒系を

用いて再結晶により精製しても良い。収率はおおよそ 70-90%の範囲で得ることができる。

[0040] [実施例 1]

( 1 ) Boc-Gly-Ile-Gly-Lac-Pro-OBzlの合成

(la : Boc-Gly_OSuの合成） Boc-Gly-OH (1.54 g， 8.82 mmol)を 500 mLのナスフラスコに入れ蒸留 CHC1に溶かし、 DCU (2.18 g， 10.6 mmol), HOSu (1.21 g， 10.6 mmol) を入れ冷却下で攪拌を開始した。一晩放置後、 TLCにより反応の終了を確認後、濃縮し DCUreaをろ過した後、 AcOEtに溶かし再度析出した DCUreaをろ過した。その後、濃縮し AcOEt-蒸留 Et 0による再結晶を 2回行い Boc-Gly-OSuを得た。収量 1.74 g (63.9%) . ^:H NMR (CDCl， 300 MHz) : 5.04 (1H， Boc— Gly NH); 4.27, 4.23 (2H， Gly a CH ); 2.79 (4H， OSu); 1.40 (9H， Boc t— Bu).

[0041] (lb : HCl'H-Pro_OBzlの合成）排気フード内で 1L三口丸底フラスコにベンジルアルコール（200 mL)を入れ冷却攪拌した。そこへ塩化チォニル（20.0 g， 0.168 mol)を 1 時間かけてゆっくり滴下した。滴下終了後 10分間撹拌させた後、プロリン（28.8 g， 0. 250 mol)を加えた。反応系はゆっくり室温に戻しそのまま 48時間攪拌を続けた。ベンジルアルコールをロータリーエバポレーターで除き、蒸留 Et 0を加えて結晶化させた。精製は熱エタノールより再結晶を繰り返すことで行った。収量， 45.1 g (74.7%). ^:H NMR (CDC1， 300 MHz) : 7.30 (5H，— OBzl C H ); 5.21 (2H， OBzl— CH -); 4.80 (1H

， Pro a CH); 3.51 (2H， Pro δ CH ); 2.20, 1.90 (2H， Pro β CH ); 1.99 (2H， Pro y C H X

[0042] ( lc : Boc-Gly-Lac_OHの合成） 500 mLナスフラスコに Boc-Gly-OSu (27.2 g， 100 m mol)と DMAP (4.89 g， 40.0 mmol)を入れ、蒸留 THF 100 mLに溶解させた。この時、わずかな溶け残りを 1 mLのァセトニトリルを加えて溶解させた。別の 300 mLナスフラスコに H- Lac-OH (10.81 g， 120 mmol)を入れ、蒸留 THFに溶解させ、ピリジン（9.67 mL, 120 mmol)で中和させた。それを氷冷した 500 mLナスフラスコ側に加えた。反応混合物は 1時間後に室温へ戻して撹拌を続けた。反応開始から 44時間後、 TLCによりわずかな未反応物が確認されたが、そのまま溶媒を減圧留去した。残渣に EtOAcをカロえ、 10%クェン酸水溶液で 4回、蒸留水で 2回洗浄した。洗浄後、飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液で水相に目的物を 3回抽出し、氷冷撹拌しながら水相に 4M塩酸水溶液を約 150 mL加えて、 pHを 2〜3にした。その後、 EtOAcで目的物を抽出した。 TLCにて抽出が完了したことを確認後、有機相に Na SOを加えて乾燥させた。乾燥剤をろ別後、ろ液は濃縮し、目的物の Boc-Gly-Lac-OHを無色オイルとして得た。収量 13.08 g (52.9%). ^:H NMR (CDC1， 300 MHz) : 7.90 (1H， Lac - COOH); 6.31 (1H， Lac a C

H); 5.19 (1H， Gly NH); 3.98, 3.77 (2H， a CH ) ; 1.55 (3H， Lac β CH ) ; 1.45 (9H， B oc t-Bu).

[0043] ( l d : Boc- Gly-Lac- Pro- OBzlの合成） Boc-Gly-Lac- OH (7.17 g， 28.8 mmol)の入つた 500 mLナスフラスコに蒸留クロ口ホルムを加え溶解させ、 DCC (6.54 g， 31.7 mmol) と HOBt (4.86 g， 31.7 mmol)を加えた。別の 300 mLナスフラスコに HCl ' H-Pro-OBzl (7.66 g， 31.7 mmol)を入れて蒸留クロ口ホルムで溶解した。 NMM (2.84 mL, 34.1 mm ol)を加えて中性になったことを確認した後、 500 mLナスフラスコに加えた。氷冷下の攪拌を 1時間、その後、反応系を室温に戻し更に 42時間撹拌を続けた。 TLCにより反応終了を確認した後、析出した DCUreaをろ別し、濃縮した。残渣に AcOEtを加えて 3 0分間冷蔵保存した。ふたたび析出してきた DCUreaをろ別し、 10%クェン酸水溶液を加えて 1時間攪拌した。これを分液ロートに移し、 10%クェン酸水溶液で 3回、水で 2回、飽和 NaCO水溶液で 2回、蒸留水で 2回、飽和 NaCl水溶液で 1回洗浄した後、 Na S

0で乾燥させた。乾燥剤をろ別し、減圧濃縮した。残渣にベンゼンを加え脱水操作を 3回行った。残渣はへキサンを加えても結晶化しないため、を試みたが結晶化しなかったため、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒 AcOEt-ベンゼン = 1 :3 (= v/v》にて精製し、目的物を Boc-Gly-Lac-Pro-OBzlを薄黄色のオイルとして得た。収量 5.95 g (収率 47.6%). ^:H NMR (CDCl， 300 MHz): 7.37 (5H，— OBzl C H ); 5.21 (1

H， Lac a CH); 5.19, 5. 16 (2H， OBzl - CH -); 5.20, 5.18 (1H， Gly NH); 5.07 (1H， P ro a CH); 4.61 , 4.59 (2H， Gly a CH ); 3.95, 3.93 (2H， Pro δ CH ); 3.73, 3.68 (2H， Pro β CH ); 3.55, 3.54 (2H， Pro y CH ); 1.46 (9H， Boc t— Bu); 1.24 (3H， Lac β C H ).

[0044] ( le : Boc- lie- Gly-Lac- Pro- OBzlの合成） HCl ' H-Gly-Lac- Pro- OBzl (5.42 g， 14.6 mmol), NMM (1.61 ml, 14.6 mmol), Boc- lie- ΟΗ · 1/2H O (4.21 g， 17.52 mmol), ED C . HC1 (3.36 g， 17.52 mmol), HOBt (2.68 g， 17.52 mmol)を使用し、縮合反応を行い、黄色オイルを得た。収量 8.61 g (収率—100 %). ^:H NMR (DMSO-d， 300 MHz) : 8.

30 (1H， Gly NH); 7.35 (5H， -OBzl C H ); 6.65 (1H， lie NH); 5.21 (1H， Lac a CH);

5. 19, 5.16 (2H， OBzl - CH -); 4.39 (1H， Pro a CH); 3.99 (1H， lie a CH); 3.85, 3.8 2 (2H， Gly a CH ); 3.78, 3.76 (2H， Pro δ CH ); 2.19, 2. 13 (2H， Pro β CH ); 1.94, 1.92 (2H， Pro y CH ); 1.36 (9H， Boc t_Bu); 1.27 (3H， Lac β CH ); 1.08 (2H， lie y

CH ); 0.83 (3H， lie y CH ); 0.77 (3H， lie δ CH ).

[0045] [実施例 2]

(2) poly(Gly- lie- Gly-Lac- Pro)の合成

(2a： Boc-Gly-Ile-Gly-Lac-Pro-OBzlの合成）

HCl ' H- lie- Gly-Lac- Pro- OBzl (3.28 g， 6.80 mmol), NMM (0.75 mし， 6.80 mmol), B oc-Gly-OH (1.31 g， 7.50 mmol), EDC.HC1 (1.44 g， 7.50 mmol), HOBt (1. 15 g， 7.50 mmol)を使用し、縮合反応を行い、黄色オイルを得た。収量 3.45 g (収率 83.9%). ^:H NMR (DMSO-d， 500 MHz) : 8.51 (1H， Gly¹ NH); 7.66 (1H， lie NH); 7.35 (5H，—OB zl C H ); 7.00 (1H Gly³ NH); 5.21 (1H， Lac a CH); 5.11 , 5.08 (2H， OBzl— CH -); 4 .35 (1H， Pro a CH); 4.20 (1H， lie a CH) ;3.94, 3.93 (2H， Gly³ a CH ); 3.77, 3.76 ( 2H， Gly¹ a CH ); 3.51 , 3.49 (2H， Pro δ CH ); 2.19, 2.17 (2H， Pro β CH ); 1.93, 1. 91 (2H， Pro y CH ); 1.34 (9H， Boc t— Bu); 1.26 (3H， Lac β CH ); 1.03 (2H， lie y C

H ); 0.83 (3H， lie y CH ); 0.77 (3H， lie δ CH ).

[0046] (2b： Boc- Gly- lie- Gly-Lac- Pro- OHの合成）

Boc-Gly-Ile- Gly-Lac- Pro- OBzl (3.45 g, 5.71 mmol)を 300 mLナスフラスコに入れ、メタノールを加えて溶液とした。溶液中にパラジウムカーボン粉末をミクロスパチュラ 2 杯分加えた後、系全体を水素ガスに置換して接触還元反応を 11時間行った。反応終了後、 5%パラジウムカーボンをろ別、溶媒を減圧留去した。残渣にベンゼンを加え共沸による脱水操作を 3回行った。残渣にへキサンを加えると結晶化した。これをろ取し、減圧乾燥して目的物を得た。収量 2.55 g (収率 87.0 %). ^:H NMR (DMSO-d， 3

00 MHz) : 8.50 (1H， Gly¹ NH); 7.64 (1H， lie NH); 6.97 (1H， Gly³ NH); 5.21 (1H， La c a CH); 4.73 (1H， Pro a CH); 4.21 (1H， lie a CH); 3.99, 3.97 (2H， Gly³ a CH ); 3.81 , 3.79 (2H， Gly¹ a CH ); 3.51 , 3.49 (2H， Pro δ CH ); 2.19, 2.17 (2H， Pro β C H₂); 2.03, 2.01 (2H， Pro y CH ); 1.32 (9H， Boc t— Bu); 1.24 (3H， Lac β CH ); 1.04 (2H， lie y CH ); 0.83 (3H， lie y CH ); 0.77 (3H， lie δ CH ).

[0047] (2c： Boc-Gly-Ile-Gly-Lac-Pro-OSuの合成）

300 mLナスフラスコに Boc-Gly-Ile-Gly-Lac-Pro-OH (2.55 g， 4.95 mmol)と HOSu(0. 57g， 4.95 mmol)を加え、蒸留 THFに溶解させた。氷冷撹拌しながら DCC (1.12 g， 5.4 5 mmol)を加え、氷冷下で 1時間、室温で 24時間撹拌した。 TLCにより反応の終了を確認後、 DCUreaをろ別し、ろ液は減圧濃縮した。残渣に酢酸ェチルを加え 1日間冷蔵庫で静置した。生成した DCUreaをろ別し、ろ液は再び減圧濃縮した。残渣に蒸留 THFをカロえた後、へキサンで結晶化させた。蒸留 THF—へキサンより再結晶した。収量 3· 12 g (収率〜100 %). ^:H NMR (DMSO-d， 300 MHz) : 8.50 (1H， Gly¹ NH); 7.42

(1H， lie NH); 6.97 (1H， Gly³ NH); 5.21 (1H， Lac a CH); 4.73 (1H， Pro a CH); 4.21 (1H， lie a CH); 3.99, 3.97 (2H， Gly³ a CH ); 3.81 , 3.79 (2H， Gly¹ a CH ); 3.51 , 3. 49 (2H， Pro δ CH ); 2.19, 2.17 (2H， Pro β CH ); 2.03, 2.01 (2H， Pro y CH ); 2.78 (4H， OSu); 1.32 (9H， Boc t_Bu); 1.24 (3H， Lac β CH ); 1.04 (2H， lie y CH ); 0.84 (3H， lie y CH ); 0.78 (3H， lie δ CH ).

[0048] (2d： HCl · H_Gly- lie- Gly-Lac- Pro- OSuの合成）

Boc- Gly- lie- Gly-Lac- Pro- OSu (3.03 g， 4.95 mmol)を 4M HCl/dioxane (15 mL)により、アミノ基末端を脱保護し無色粉末を得た。収量： 2.57 g (収率 94.5%).

[0049] (2e： poly(Gly- lie- Gly-Lac- Pro)の合成）

100 mLナスフラスコに HCl.H-Gly-Ile-Gly-Lac-Pro-OSu (2.57 g， 4.69 mmol)を入れ、蒸留 DMF 40 mLで溶解させた。トリエチノレアミン（0.65 mL, 4.69 mmol)を加えて反応を開始した。これを室温で 2週間攪拌した。反応終了後、真空ポンプで DMFを減圧留去し、蒸留水を滴下すると無色固体が生成し、これをろ別した。ろ液に食塩を加えた後、クロ口ホルムで 4回抽出を行った。有機層を減圧濃縮後、脱水エーテルを加えて結晶化し、これをろ取した。収量 0.98 g (収率 46.2%)·

下記の MALDI-TOF法による質量分析から、得られたポリマーの重合度はおよそ 3 であった（分子量はおよそ 1200であった）。

[0050] [実施例 3]

(3) Boc-Ala-Ile-Gly-Lac-Pro_OBzlの合成

(3a： Boc-Ala-Ile-Gly-Lac-Pro-OBzlの合成）

HCl ' H- lie- Gly-Lac- Pro- OBzl (3.96 g， 8.18 mmol), NMM (0.90 mし， 8.18 mmol), B oc-Ala-OH (1.86 g， 9.82 mmol), EDC.HC1(1.88 g， 9.82 mmol), HOBt (1.50 g， 9.82 mmol)を用いて縮合反応を行い、無色結晶を得た。収量 4.93 g (収率 58.1 %). 'Η醒 R (DMSO-d， 300 MHz) : 8.47 (1H， Gly NH); 7.53 (1H， lie NH); 7.34 (5H，— OBzl C

H ); 7.02 (1H， Ala NH); 5.21 (1H， Lac a CH); 5. 17, 5.14 (2H， OBzl— CH -); 4.38 (

1H， Pro a CH); 4.20 (1H， lie a CH); 3.98, 3.94 (2H， Gly a CH ); 3.86 (1H， Ala a CH); 3.64, 3.61 (2H， Pro δ CH ); 2.19, 2.17 (2H， Pro β CH ); 1.93, 1.91 (2H， Pro y CH ); 1.36 (9H， Boc t_Bu); 1.31 (3H， Ala β CH ); 1.13 (3H， Lac β CH ); 1.03 (2

H， lie y CH ); 0.83 (3H， lie y CH ); 0.77 (3H， lie δ CH ).

[0051] [実施例 4]

(4) poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)の合成

(4a： Boc-Ala-Ile-Gly-Lac-Pro-OHの合成） 300 mLナスフラスコに Boc- Ala- lie- Gly-Lac- Pro- OBzl (3.34 g, 5.39 mmol)を入れ、メタノールを加えて溶解させた。 5%パラジウムカーボン粉末をミクロスパチュラ 2杯分加えた後、系全体を水素ガスに置換して接触還元反応を 11時間行った。反応終了後、 5%パラジウムカーボンをろ別、溶媒を減圧留去した。残渣にベンゼンを加え共沸による脱水操作を 3回行った。残渣に少量の酢酸ェチルを加えた後、へキサンを加えると結晶化した。これをろ取し、減圧乾燥して目的物を得た。

収量 2.20 g (収率 77.2%)· ^:H NMR (DMSO-d ， 300 MHz) : 8.46 (1H， Gly NH); 7.55 (

1H， lie NH); 7.01 (1H， Ala NH); 5.21 (1H， Lac a CH); 4.21 (1H， Pro a CH); 3.98 ( 1H， lie a CH); 3.97, 3.96 (2H， Gly a CH ); 3.72 (1H， Ala a CH); 3.59, 3.50 (2H， P ro δ CH ); 2.14, 2.16 (2H， Pro β CH ); 1.93, 1.91 (2H， Pro y CH ); 1.36 (9H， Boc t-Bu); 1.32 (3H， Ala β CH ); 1.14 (3H， Lac β CH ); 1.12 (2H， lie y CH ); 0.83 (3H

， lie y CH ); 0.80 (3H， lie δ CH ).

[0052] (4b： Boc- Ala- lie- Gly-Lac- Pro- OSuの合成）

Boc— Ala— He— Gly-Lac— Pro— OH (2. 18 g， 4.12 mmol)と HOSu (0.47g, 4.12 mmol)を 30 0 mLナスフラスコに入れ、蒸留 THFに溶解させた。氷冷撹拌しながら DCC (0.93 g， 4 .53 mmol)を加えて反応を開始した。氷冷下 1時間、室温で 21時間撹拌した。 TLCにより反応の終了を確認後、 DCUreaをろ別し、ろ液を減圧濃縮し、残渣に AcOEtを加え 1日間冷蔵庫で静置した。生成した DCUreaを再びろ別した後、へキサンにより結晶化させた。さらに酢酸ェチルーへキサンより再結晶した。収量 2.49

g (収率 96.5 %). ^:H NMR (DMSO-d ， 300 MHz) : 8.48 (1H， Gly NH); 7.55 (1H， lie N

H); 7.00 (1H， Ala NH); 5.24 (1H， Lac a CH); 4.73 (1H， Pro a CH); 3.97 (1H， lie a CH); 3.78, 3.74 (2H， Gly a CH ); 3.66 (1H， Ala a CH); 3.57, 3.43 (2H， Pro δ C H ); 2.79 (4H， OSu); 2.14, 2. 16 (2H， Pro β CH ); 1.93, 1.91 (2H， Pro y CH ); 1.36 (9H， Boc t-Bu); 1.33 (3H， Ala β CH ); 1.15 (3H， Lac β CH ); 1.12 (2H， lie y CH )

； 0.83 (3H， lie y CH ); 0.80 (3H， lie δ CH ).

[0053] (4c： HC1 · H-Ala- lie- Gly- Lac- Pro- OSuの合成）

Boc-Ala— lie— Gly-Lac— Pro— OSu (3.03 g, 4.95 mmol)を 4M HCl/dioxane (15 mL)により、アミノ基末端を脱保護し無色粉末を得た。収量： 2.51 g (収率〜100%). [0054] (4d : poly(Ala- lie- Gly-Lac- Pro)の合成）

100 mLナスフラスコに HCl.H_Ala-Ile-Gly_Lac-Pro-OSu (1.20 g， 2.13 mmol)を入れ、蒸留 DMF 4.0 mLで溶解させた。トリエチノレアミン（0.30 mL, 2.13 mmol)を加えて反応を開始した。これを約 35°Cの水浴で温めながら攪拌した。反応系の粘度が上昇するに従い DMFを加え、最終的に 16.0 mLとなった。 36時間後、反応系に蒸留水を滴下すると無色固体が生成し、これをろ別した。ろ液に食塩を加えた後、クロ口ホルムで 4回抽出を行った。有機層を減圧濃縮後、脱水エーテルを加えて結晶化し、これをろ取した。収量 0.20 g (収率 21.3%).融点 212- 214。C. [ a ²⁰ = -82.4。 .

D

下記の MALDI-TOF法による質量分析から、得られたポリマーの重合度はおよそ 1 0であった（分子量はおよそ 4500であった）。

[0055] [実施例 5]

(5) Boc- (Ala- lie- Gly-Lac- Pro) -OBzl(n = 2，3，4)の合成

n

(5a： Boc-(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro) -OBzlの合成）

HCl ' H-Ala— He— Gly-Lac— Pro— OBzl (2.55 g, 4.58 mmol), NMM (0.51 mし， 4.58 mmol )、 Boc- Ala- lie- Gly-Lac- Pro- OH (2.67 g， 5.05 mmol), EDC - HC1(0.97 g， 5.05 mmo 1)、 HOBt (0.77 g， 5.05 mmol)を用いて縮合反応を行い、無色結晶を得た。収量 3.70 g (収率 77.2 %).融点 159-161°C. [ α ] ²⁰ = -160.6。 . 'Η NMR (DMSO- d， 500 MHz

D 6

): 8.50 (1H， Gly³ NH); 8.45 (1H， Gly8 NH); 8.04 (1H， Ala⁶ NH); 7.61 (1H， lie⁷ NH); 7.57 (1H， lie² NH); 7.34 (5H，— OBzl C H ); 7.05, 6.55 (1H Ala¹ NH); 5.21 (2H， Lac

6 5

， Lac⁹ a CH); 5. 10, 5.05 (2H， OBzl— CH -); 4.40, 4.30 (2H， Pro⁵, Pro¹⁰ a CH); 4.2 5 (1H， Ala⁶ a CH); 4.20 (2H， lie², lie⁷ a CH); 4.00 (1H， Alal a CH); 3.98, 3.97 (2 H， Gly³, Gly⁸ a CH ); 3.70, 3.72 (2H， Gly³, Gly⁸ a CH ); 3.57, 3.53 (4H， Pro⁵, Pro¹⁰ δ CH ); 2.14, 2.04 (4H， Pro⁵, Pro¹⁰ β CH ); 1.91 , 1.80 (4H， Pro y CH ); 1.65 (2H， lie², lie⁷ y CH ); 1.36 (9H， Boc t_Bu); 1.30 (3H， Lac⁹ β CH ); 1.25 (3H， Lac β C

2 3

H ); 1.15 (6H， Ala¹, Ala⁶ β CH ); 1.12 (2H， lie², lie⁷ y CH ); 0.83 (6H， lie², lie⁷ γ C

3 3 2

H ); 0.80 (6H， lie², lie⁷ y CH ).

3 3

[0056] (5b： HC1. H_(Ala- lie- Gly- Lac- Pro) -OBzlの合成）

Boc- (Gly- lie- Gly-Lac- Pro) -OBzl (1.20 g， 1.15 mmol)を 4M HCl/dioxane (2.9 mL) により、アミノ基末端を脱保護し無色粉末を得た。収量 1.02 g (収率 91. 1%).

[0057] (5c： Boc- (Ala- lie- Gly-Lac- Pro) -OBzlの合成）

HCl ' H- (Ala- lie- Gly- Lac- Pro) - OBzl (1.02 g， 0.97 mmol), NMM (0. 118 mし， 0.970 mmol), Boc— Ala— lie— Gly-Lac— Pro— OH (0.570 g， 1.07 mmol), EDC - HC1(0.220 g， 1.0 7 mmol), HOBt (0.145 g， 1.07 mmol)を用いて縮合反応を行い、無色結晶を得た。収量 0.90 g (収率 62.8%).融点 190- 192。C. [ α ] ²⁰ = -148.8° . ^:Η NMR (DMSO-d， 500

MHz): 8.48 (1H， Gly³ NH); 8.43 (1H， Gly⁸, Gly¹³ NH); 8.05 (1H， Ala⁶, Ala¹¹ NH); 7. 65 (2H， lie⁷, lie¹² NH); 7.55 (1H， lie² NH); 7.34 (5H， -OBzl C H ); 7.05, 6.53 (1H，

Ala¹ NH); 5.20 (3H， Lac⁴, Lac⁹, Lac¹³ a CH); 5. 10, 5.05 (2H， OBzl - CH -); 4.40, 4. 30 (3H， Pro⁵, Pro¹⁰, Pro¹⁵ a CH); 4.25 (2H， Ala⁶, Ala¹¹ a CH); 4.20 (3H， lie², lie⁷, II e¹² a CH); 3.90 (1H， Ala¹ a CH); 3.98, 3.97 (3H， Gly³, Gly⁸, Gly¹³ a CH ); 3.70, 3. 72 (3H， Gly³, Gly⁸, Gly¹³ a CH ); 3.57, 3.53 (6H， Pro⁵, Pro¹⁰, Pro¹⁵ δ CH ) ;2. 14, 2. 04 (6H， Pro⁵, Pro¹⁰, Pro¹⁵ β CH ); 1.91 , 1.80 (6H， Pro⁵, Pro¹⁰, Pro¹⁵ y CH ); 1.65 (3 H， lie², lie⁷, lie¹² γ CH ); 1.36 (9H， Boc t— Bu); 1.30 (6H， Lac⁹, Lac¹³ β CH ); 1.25 (

3H， Lac⁴ β CH ); 1.15 (6H， Ala⁶, Ala¹¹ β CH ); 1.10 (3H， Ala¹ β CH ); 1.05 (3H， II e , lie⁷, lie¹² y CH ); 0.83 (9H， lie², lie⁷, lie¹² γ CH ); 0.75 (9H， lie², lie⁷, lie¹² y CH

)·

[0058] (5d： HC1 · H_(Ala- lie- Gly- Lac- Pro) -OBzlの合成）

Boc-(Gly-Ile-Gly-Lac-Pro) -OBzl (1.20 g， 1.15 mmol)を 4M HCl/dioxane (0.850 m

L)により、アミノ基末端を脱保護し無色粉末を得た。収量 0.48 g (収率〜 100%).

[0059] (5e： Boc- (Ala- lie- Gly-Lac- Pro) -OBzlの合成）

HC1 - H-(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro) -OBzl (0.48 g， 0.34 mmol), NMM (0.037 mし， 0.34 m mol)、 Boc— Ala— lie— Gly-Lac— Pro— OH (0.20 g， 5.05 mmol), EDC.HCl (0.76 g， 0.37 m mol)、 HOBt (0.050 g， 0.37 mmol)を用いて縮合反応を行い、無色粉末を得た。収量 0.370 g (収率 57.5 %). ^:H NMR (DMSO-d， 500 MHz): 8.48 (1H， Gly³ NH); 8.43 (1

H， Gly⁸, Gly¹³, Gly¹⁸ NH); 8.05 (1H， Ala⁶, Ala¹¹, Ala¹⁶ NH); 7.65 (3H， lie⁷, lie¹², lie¹⁷ NH); 7.55 (1H， lie² NH); 7.34 (5H， -OBzl C H ); 7.05, 6.53 (1H， Ala¹ NH); 5.20 (4

H， Lac⁴, Lac⁹, Lac¹⁴, Lac¹⁸ a CH); 5.10, 5.05 (2H， OBzl— CH -); 4.40, 4.30 (4H， Pr o⁵, Pro¹⁰, Pro¹⁵, Pro²⁰ a CH); 4.25 (3H， Ala⁶, Ala¹¹, Ala¹⁶ a CH); 4.20 (4H， lie², lie⁷, lie¹², lie¹⁷ a CH); 3.90 (1H， Ala¹ a CH); 3.98, 3.97 (4H， Gly³, Gly⁸, Gly¹³, Gly¹⁸ a CH ); 3.70, 3.72 (4H， Gly³, Gly⁸, Gly¹³, Gly¹⁸ a CH ); 3.57, 3.53 (8H， Pro⁵, Pro¹⁰, P ro¹⁵， Pro²⁰ δ CH ); 2. 14, 2.04 (8H， Pro⁵, Pro¹⁰, Pro¹⁵, Pro²⁰ β CH ); 1.91 , 1.80 (8H， Pro⁵, Pro¹⁰, Pro¹⁵, Pro²⁰ y CH ); 1.65 (4H， lie², lie⁷, lie¹², lie¹⁷ γ CH ); 1.36 (9H， Bo c t-Bu); 1.30 (9H， Lac9， Lac¹⁴, Lac¹⁹ β CH ); 1.25 (3H， Lac4 β CH ); 1.15 (9H， Al a6, Alal l , Ala 16 β CH ); 1.10 (3H， Ala¹ β CH ); 1.05 (4H， lie², lie⁷, lie¹², lie¹⁷ y C

H ); 0.83 (12H, lie², lie⁷, lie¹², lie¹⁷ γ CH ); 0.75 (12H, lie², lie⁷, lie¹², lie¹⁷ y CH ).

[0060] [実施例 6]

(6) MALDI-TOF法による質量分析

実施例 2および 4で得られたポリマー化合物について MALDI-スペクトルを測定した。これは重合反応で合成された化合物がどの程度の大きさの分子量を持ったポリマーである力、確かめることができる。ここには図 1と図 2に poly(Gly-Ile-Gly-Lac-Pro)と poly (Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)の例を示した。その結果、 oly(Gly-Ile-Gly-Lac-Pro) (モノマ一ユニットの質量 = 396.19)は 2〜4量体が観測された。また、 poly(Ala-Ile-Gly_Lac- Pro) (モノマーユニットの質量 = 428.2)は 7〜15量体が観測された。ここで用いた試料は透析膜による精製を行ってレ、なレ、こと、高分子量側のピークは照射レーザー強度によって変化することの 2点から、特に pol_y(Gl_y-Ile-Gl_y-L_aC-Pro)では低い重合度の化合物が観測されたと考えられる。

[0061] [実施例 7]

(7)円偏光二色性スペクトル

実施例 2および 4で得られたポリマー化合物について温度変化円偏光二色性スぺクトルを測定した。これは目視観測による温度応答性変化とは異なった情報を得ることができる。例えば溶液構造についての知見である。ここには図 3と図 4に pol_y(Gly-Ile- Gly-Lac-Pro)と poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)の例を示した。その結果、スペクトルはそれぞれ、 205 nmと 210匪に等円二色性点を示しながら変化した。希薄水溶液 (0.1 m g/mL)のために凝集はみられない。温度が上昇するに従ってそれぞれ、 195 nmと 198 nmに見られる負のバンドが減少してゆくことがわかる。これは発明者らの関連研究により溶液構造がより乱雑になってゆくためと考えられている。（例えば、奥ら、 Journal o f Polymer Science, Part A, Polymer Chemistry, 2000年、 38巻、 4524ページ。および、奥ら、 Journal of Polymer Science, Part A, Polymer Chemistry 2000年、 39巻、 56ぺ一ジ。）

[0062] [実施例 8]

(8)見かけの吸光度による温度応答性の観測

実施例 2および 4で得られたポリマーについてそれらの水系溶液を加温することによる温度応答性変化をみかけの吸光度により観測した。観測波長には 350 を用いた。これは目視による光の散乱即ち白濁する現象に対応している。ここには図 5と図 6に poly(Gly-Ile-Gly-Lac-Pro)と poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)の例を示した。グラフの縦軸は透過率から換算した濁度を用いた。これにより温度応答の速さを比較することができる。すなわち、昇温速度と降温速度が l°C/5 minの場合、 poly(Gly-Ile-Gly-Lac_Pr 0)は温度を上げるとゲル化し、冷却すると液状化するという可逆的な温度応答性を示すのに対し、 poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)は冷却しても数時間の範囲で非可逆な温度応答を示すことがわかる。また、目視による観測と測定された濁度の比較では、濁度がおおよそ 10 20%を越えた時点でも十分に凝集が進行している。

特に poly(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro)は可逆ではあるものの、高温時の凝集状態を低温（ 4°C)にした際に、通常見られる数秒間での素早い温度応答 (均一な溶液への戻り）が見られなかった点で初めての例である。実際には、溶液を;!〜 2日間 4°Cに静置することで、ようやく均一な溶液に戻すことができた。低温での非常にゆっくりとした応答 (均一な溶液への戻り）を示す点は、これまでにない全く新規な性質である。

また、実施例 5で得られたオリゴデプシペプチド Boc-(Ala-Ile-Gly-Lac-Pro) -OBzl ( n n = 2-4)についても、カルボキシ末端ゃァミノ末端の保護基を外すことにより容易に水溶液となり、ポリデプシペプチドと同様な温度応答性が確認することができた。

[0063] [実施例 9]

(9) poly(Gly_Va卜 Gly-Lac-Pro)の合成

(9a : Boc- Vaト Gly-Lac- Pro- OBzlの合成） HCl' H-Gly-Lac- Pro- ΟΒζ1(6· 18 g， 16.7m mol NMM(1830 mし， 16.70 mmol Boc- Va卜 OH(3.96 g， 18.20 mmol DCC(3.78 g， 18.30 mmol)と ΗΟΒΐ · Η2Ο(0.50 g, 3.26 mmol)を使用し、縮合反応を行い、黄色オイルを得た。収量 8.8 g (収率 99 %). ^:H NMR (DMSO-d， 300 MHz): 8· 32(1Η， Glv Ν

H); 7.37 (5Η， OBzl C H -); 6.66 (1H， Val NH); 5.22 (1H， Lac a CH); 5.08 (2H， OB zl - CH -)， 4.39 (1H， Pro a CH); 4.06 (1H， Val a CH); 3.77 (2H， Gly a CH ); 3.53 (2H， Pro y CH ); 2.20 (1H， Val β CH); 1.93 (2H， Pro y CH ); 1.37 (9H， Boc t_Bu- ); 1.27 (3H， Lac β CH ); 0.87 (3H， Val y CH ).

[0064] (9b : HCl ' H-Vaト Gly-Lac- Pro- OBzlの合成） Boc- Vaト Gly-Lac- Pro- OBzl (2.35g, 4 .40 mmol)の THF溶液に 4 M HC1 1ジォキサン（11 mL)を加えてアミノ基末端を脱保護した。無色固体。収量 1.9 g (収率 92 %). ^:H NMR (DMSO-d， 300 MHz): 8.90 (1

H， Gly NH); 8. 17 (2H， Val NH³⁺- ); 7.35 (5H， OBzl C H -); 5.25 (Lac a CH); 5.09 (

2H， OBzl -CH -); 4.37 (1H， Pro a CH); 4.17 (1H， Val a CH); 3.89 (Gly a CH ); 3. 48 (2H， Pro y CH ); 2.20 (1H， Val β CH); 1.91 (2H， Pro y CH ); 1.39 (3H， Lac β CH ); 0.97 (6H， Val y CH ).

[0065] (9c： Boc- Gly¹- Val²- Gly³- Lac⁴- Pro⁵- OBzlの合成） HCl ' Vaト Gly-Lac- Pro- ΟΒζ1(3·5 5 g, 7.55 mmol), NMM (830 mL, 7.55 mmol), Boc— Gly—OH (1.47g, 8.39 mmol), ED C - HCl (1.57 g， 8. 19 mmol), HOBt - H O (O. l lg, 0.718 mmol)を用いて縮合反応を行い、黄色オイルを得た。収量 7.7 g (収率 86 %). ^:H NMR (DMSO-d， 300 MHz): 8.4

8 (1H， Gly³ NH); 7.60 (1H， Val NH); 7.33 (5H， OBzl C H -); 6.98 (1H， Gly¹ NH); 5.

21 (1H， Lac a CH); 5.17 (2H， OBzl -CH -); 4.36 (1H， Pro a CH); 4.21 (1H， Val a CH); 3.73 (2H， Gly a CH ); 3.55 (2H， Pro δ CH ); 2.19 (1H， Val β CH); 1.94 (2 H， Pro y CH ); 1.36 (9H， Boc tBu- ); 1.25 (3H， Lac β CH ); 0.87 (6H， Val y CH ).

[0066] (9d : Boc- Gly¹- Val²- Gly³- Lac⁴- Pro⁵- OHの合成） Boc- Gly- Val-Gly-Lac- Pro- OBzl (0.81 g， 1.37 mmol),を 300 mLナスフラスコに入れ、メタノールを加えて溶解させた後、 Pd-C粉末をミクロスパチュラ 2杯加えた。装置を組み立て、 300 mLナスフラスコ中を水素ガスで満たしてから撹拌を始め接触還元を行った。 5時間後、 TLCにより反応終了を確認した。 Pd-C粉末を除去し、ろ液を濃縮した後、ベンゼン共沸によりメタノールと水分を十分に留去した。残渣に酢酸ェチル続いてへキサンを加え、これをろ取して減圧乾燥させて無色結晶を得た。収量 0.5 g (収量 73 %). ^:H NMR (DMSO-d， 50 0 MHz): 8.51 (1H， Gly³ NH); 7.67, 7.65 (1H， Val NH,構造異性に由来する 2つのシダナノレ); 7.00 (1H, Gly¹ NH); 5.21 (1H， Lac a CH); 4.20 (1H， Pro a CH); 3.98 (1H， Val a CH); 3.77 (2H， Gly a CH ); 3.56 (2H， Pro δ CH ); 2. 15 (1H， Val /3 CH); 1. 80 (2H， Pro y CH ); 1.35 (9H， Boc tBu- ); 1.29 (3H， Lac β CH ); 0.85 (6H， Val y

CH ).

[0067] (9e： Boc- Gly¹- Val²- Gly³- Lac⁴- Pro⁵- OSuの合成） Boc- Gly- Val-Gly-Lac- Pro- OH ( 0.80 g， 1.60 mmol)、 HOSu (0.19 g， 1.65 mmol)、 DCC (0.39 g， 1.89 mmol)を用い、蒸留 THF中で縮合反応を行い、無色結晶を得た。収量 0.8 g (収率 85 %). ^:H NMR (DMSO-d， 500 MHz): 8.51 (1H， Gly3 NH); 7.66, 7.63 (1H， Val NH,構造異性に由来する 2つのシグナル)； 7.00 (1H, Gly¹ NH); 5·26(1Η， Lac a CH); 4.72 (1H， Pro a CH); 4.23 (1H， Val a CH); 3.77 (2H， Gly a CH ); 3.56 (2H， Pro δ CH ); 2.79 (1H， Val β CH); 1.80 (2H， Pro y CH ); 1.35 (9H， Boc tBu-); 1.29 (3H， Lac β CH ); 0.8

5 (6H， Val y CH ).

[0068] (9f: HCl ' H- Gly¹- Val²- Gly³- Lac⁴- Pro⁵- OSuの合成） Boc- Gly- Vd-Gly- Lac- Pro- O Su (0.81 g， 1.35 mmol)の蒸留クロ口ホルム溶液にを加えてアミノ基末端を脱保護した。無色固体。収量 726 mg (収率ほぼ定量的). ^:H NMR (DMSO-d， 300 MHz): 8.61

(1H， Gly³ NH); 8.52, 8.45 (1H， Val NH); 8.07 (1H， Gly¹ NH³⁺-); 5.24 (1H， Lac a C H); 4.74 (1H， Pro a CH); 4.26 (1H， Val a CH); 3.77 (2H， Gly a CH ); 3.62 (2H， Pr o δ CH ); 2.04 (3H， Val CH, Pro y CH ); 1.34 (3H， Lac β CH ); 0.92 (6H， Val y CH ).

[0069] (9g : poly(Gly_Vaト Gly-Lac- Pro)の合成） HCl ' H-Gly-Vaト Gly-Lac- Pro- OSu(1.38 g ， 2.58 mmol)を 25mLバイアルに入れ、蒸留 DMFを 1.2 mL加えて溶解させた。トリェチルァミン（358 mM， 2.58 mmol)を加えて、 35°C付近で約 3週間攪拌した。 3週間後に反応系を減圧濃縮し、ァセトニトリルをゆっくり滴下した。無色粉末が析出したのでろ取した。 NMR測定から目的物であるとわかった。ほぼ無色の目的物固体。収量 67 3 mg (収率 65 %). 1H NMR (DMSO-d， 300 MHz): 8.70 (1H， Gly³ NH); 8.16 (1H，

Gly¹ NH); 7.67, 7.63 (1H， Val NH); 5.25 (1H， Lac a CH); 4.20 (1H， Pro a CH); 3.6 8 (1H， Val a CH); 3.60 (2H， Gly a CH ); 2.0 (5H， Val [i CH, Pro y CH , Pro δ C H ); 1.33 (3H， Lac β CH ); 0.88 (6H， Val y CH ).

[0070] [実施例 10]

(10) MALDKTOF法による質量分析

実施例 9で得られたポリマー化合物について MALDI-スペクトルを測定した。これは重合反応で合成された化合物がどの程度の大きさの分子量を持ったポリマーであるか確かめることができる。ここには図 7に poly(Gly_Val_Gly-Lac-Pro)の例を示した。その結果、 poly(Gly-Va卜 Gly- Lac-Pro) (モノマーユニットの質量 = 382.41)は 12〜； 18 量体の領域に強レ、シグナルが観測された。低分子量領域のシグナルは見かけ上 2 〜4量体に相当する。し力も実際には高分子量体の多価イオンが観測されたと考えられる。

[0071] [実施例 11]

( 1 1 )円偏光二色性スペクトル

実施例 9で得られたポリマー化合物について温度変化円偏光二色性スペクトルを測定した。これは目視観測による温度応答性変化とは異なった情報を得ることができる。例えば溶液構造にっレ、ての知見である。ここには図 8に poly(Gly_Va卜 Gly-Lac-Pro )の例を示した。その結果、スペクトルは 210匪に等円二色性点を示しながら変化した。希薄水溶液 (0.1 mg/mL)のために凝集はみられない。温度が上昇するに従って 200 nmに見られる負のバンド強度が減少してゆくことがわかる。

[0072] [実施例 12]

(12)見かけの吸光度による温度応答性の観測

実施例 9で得られたポリマーについて、水系溶液を加温することによる温度応答性変化を、みかけの吸光度により観測した。観測波長には 350匪を用いた。これは目視による光の散乱、即ち白濁する現象に対応している。ここには図 9に poly(Gly-Vaト G1 y-Hmb-Pro) (Hmb = 2-hydroxy- 3-methylbutanoic acid)との比較例を示した。グラフの縦軸は透過率から換算した濁度を用いた。これにより、ヒドロキシカルボン酸残基の違いによる、相転移温度の差を明らかにできる。すなわち、昇温速度と降温速度が 1 °C/5 minの場合、 poly(Gly-Val-Gly-Hmb-Pro)は 20〜30°Cで凝集を起こした。一方、 poly(Gly_Vaト Gly-Lac-Pro)は同じ条件では凝集温度が 70°C以上になることがわかった。これは疎水性が高いほど相転移温度が低くなることで説明できる。

[0073] 図 10に示すとおり、 poly(Gly-Vaト Gly-Lac-Pro)水溶液の濃度が高くなるにつれて、凝集が 70°C以下で観察されるようになった。また、この相転移現象は可逆（図 11)であり、凝集温度は、 10-40 mg/mLの範囲では、濃度が増加するにつれて低下することがわかった（図 10)。

産業上の利用可能性

[0074] 本発明のデプシペプチド化合物またはそのポリマーは温度応答性デプシペプチド材料やこれを含む温度応答性組成物として使用することができる。本発明の温度応答性材料や組成物は生体内で分解吸収される組成物、土壌などの環境下で分解吸収される組成物、細胞接着剤、薬物運搬体、創傷被覆材料、人工筋肉、マイクロカブセル、バイオマシン、バイオセンサー、分離膜、検査キットなどを構成するのに利用できる。これは発明者らの関連研究を踏まえれば容易に開発することが可能である（例えば、吉田ら、 Advanced Materials, 1997年、 9巻、 757ページ；廣木ら、 Journal of Pol ymer Science, 1998年、 36巻、 1495ページ；特開平 7-233194 ;吉田ら、 Drug Design a nd Delivery, 1991年、 7巻、 159ページ；真下ら、北関東医学、 1991年、 41巻、 311ぺ一ジ)。

Claims

請求の範囲下記一般式（I) R— Gly— Lac— Pro— R (I)で表される化合物。 1 2 (式中、 Gly— Lac— Pro—は下記式 (Π)の構造を示し、 Rは水素原子、アミド結合で 1 結合したアミノ酸、ポリペプチドまたはヒドロキシカルボン酸、 Rは水酸基、アミド結合で結合したアミノ酸もしくはポリペプチド、またはエステル結合で結合したヒドロキシカルボン酸を表す。 )

[化 1]

[2] 前記一般式 (I)が、 X -X -Gly -Lac -Pro (Xおよび Xは α アミノ酸残基を示す)

1 2 1 2

である請求項 1に記載の化合物。

[3] 請求項 1または 2に記載の化合物を重合させて得られるポリマー。

[4] 末端に糖鎖配列、タンパク質、多糖、金属錯体、高分子担体、ゲル、フィルム、ラテツタス粒子、金属微粒子、無機微粒子、ガラスプレート、もしくはプラスチックプレートが結合した、請求項 1もしくは 2に記載の化合物、または請求項 3に記載のポリマー。

[5] 請求項 1もしくは 2に記載の化合物または請求項 3に記載のポリマーを、水、緩衝液、食塩水、または含水有機溶媒と混合させることにより得られる組成物であって、溶媒和状態、ゲル状態、懸濁物、均一な溶液、または相分離状態を形成する組成物。

[6] 加温により水分子を放出し、冷却により水分子を取り込む請求項 5に記載の組成物。

[7] 請求項 1もしくは 2に記載の化合物または請求項 3に記載のポリマーを含む温度応答性組成物。