WO2008024009A1 - Transcriptional level of a timp3 gene in the form of a diagnosis marker of a non-small cell carcinoma of lung - Google Patents

Transcriptional level of a timp3 gene in the form of a diagnosis marker of a non-small cell carcinoma of lung Download PDF

Info

Publication number
WO2008024009A1
WO2008024009A1 PCT/RU2006/000430 RU2006000430W WO2008024009A1 WO 2008024009 A1 WO2008024009 A1 WO 2008024009A1 RU 2006000430 W RU2006000430 W RU 2006000430W WO 2008024009 A1 WO2008024009 A1 WO 2008024009A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
lung cancer
transcription
metall
level
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2006/000430
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tamara Dmitrievna Mashkova
Nina Yurievna Oparina
Olga Leonidovna Zinovieva
Evgeny Pavlovich Kopantsev
Tatyana Viktorovna Vinogradova
Marina Valerievna Zinovieva
Irina Borisovna Zborovskaya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Molekulyarnoi Genetiki Rossiiskoi Akademii Nauk IMG RAN
Original Assignee
Institut Molekulyarnoi Genetiki Rossiiskoi Akademii Nauk IMG RAN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Molekulyarnoi Genetiki Rossiiskoi Akademii Nauk IMG RAN filed Critical Institut Molekulyarnoi Genetiki Rossiiskoi Akademii Nauk IMG RAN
Priority to PCT/RU2006/000430 priority Critical patent/WO2008024009A1/ru
Priority to EA200701894A priority patent/EA010571B1/ru
Publication of WO2008024009A1 publication Critical patent/WO2008024009A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to medicine, in particular oncology, and molecular biology and can be used for early diagnosis of non-small cell lung cancer, including squamous cell cancer.
  • Lung cancer remains one of the main causes of cancer death in the world. Mortality from lung cancer exceeds mortality from cancer of the breast, colon and prostate combined [Jamal A., Siegel R., Wagd E., Murrau T., Xu J., Smigl C, Thun MJ. 2006. Sapser statists, 2006. CA Sapser J Slip. 56, 6-30]. In Russia, mortality rates from lung cancer in men are 68.2 cases per 100 thousand of the population, in women - 6.8 cases [Zaridze D.G. 2004. Epidemiology and etiology of malignant neoplasms, pp. 29-85 - in the book. Carcinogenesis / Ed. D.G. Zaridze. -M .: Medicine].
  • NSCLC includes squamous cell lung cancer (PRL), lung adenocarcinoma (AKL), and large cell cancer.
  • PRL squamous cell lung cancer
  • ADL lung adenocarcinoma
  • large cell cancer adenocarcinoma
  • the main methods for diagnosing lung cancer are instrumental - x-ray and endoscopic. Sputum analysis for atypical cells, lung tissue biopsy, computed tomography, and fluorescence fibroscopy are also used. Immunological diagnostic methods have so far limited clinical use.
  • the definition of tumor markers is of practical importance: CEA - cancer embryonic antigen - tumor marker of colon cancer, but can be used in the evaluation of lung cancer; NSE - neuron-specific enolase - in some cases used in assessing the status of patients with lung cancer; tissue polypeptide antigen (TPA) - a fragment of cytokeratin, a more specific marker lung cancer. These markers are used to monitor treatment, to identify relapses, but not to diagnose PJI at an early stage.
  • SCC markers are widely used - squamous cell carcinoma antigen and a fragment of cytokeratin-19 (CYFRA 21.1) [Rastor A., Mepepes MJ, Rastor V., Lloris R., Azpar Jc 1997, Diagpost cclu CEA and CYFRA 21.1 ip hmg sapper: a Vauesiap apalusis. European Res. J. 10, 603-609; Wussheri G., Torshio R., Ferrigno D. 2003.
  • Diagnostic signs of malignant transformation of cells can also be changes in the genome in tumor cells — point mutations in the coding and regulatory regions of genes, microsatellite instability, allelic losses, changes in the level of transcription or translation of genes, methylation of promoter regions of the gene, etc. Unlike protein molecular genetic markers have significantly greater sensitivity. Lung cancer is accompanied by a change in the functional activity of many genes.
  • the TIMP gene [Ketupep E., Anttila S., Serrapep JK, Karjalaipep A., Edgren H., Lindstrom I, Salovara R., Nissep AM, SaIo J. are considered.
  • Tissue inhibitor of metalloproteinase 3 - TIMRZ participates in intercellular interactions and induces apoptosis, can inhibit the growth of many tumors, including HMPJI, angiogenesis, germination and metastasis [Dr. A., Quax PH, Neumann M., vap der Laap WH, Pap G, Dupda S ., Meipeske L, Kekow J., Neumapp W., Huizip TW, Naumpp M., Kopig W., Pare T. 2005.
  • the TIMPS gene is considered a potential tumor suppressor gene.
  • the loss of activity of such genes occurs as a result of point mutations, alleles of deletions, homozygous deletions, or hypermethylation of the CpG island of genes, especially in the promoter regions [Velipsku SA, Klipge DM, Dekker JD, Smith MW, Vklage TJ., Gilapre FD, DD, Stidle CA, Risshi M.A. 2005. Geothermother metulatiip ip rasma apd srutum ipreseses with lupg sappeg risk. CUn. Sapser Res. 11, 6505-6511].
  • This invention was made possible by the authors of a comparative analysis of the level of transcription of the TIMRZ gene in tumor tissues of the lungs of various types and at different stages of their malignant transformation and the unexpected discovery of the fact that even the early stages of the development of malignant transformation are accompanied by a significant decrease in the level of transcription of the TMPS gene.
  • the present invention in its first aspect, relates to a new marker for the diagnosis of non-small cell lung cancer, which is the level of transcription of the JJMPP gene.
  • the reduced level in the tissue of human tissue suspected of being cancer compared with its level in healthy tissue is a diagnostic sign of non-small cell lung cancer.
  • lung cancer the marker of which is the level of transcription of the TIMRI gene, is squamous cell lung cancer.
  • the present invention relates to the use of the transcription level of the ⁇ MP3 gene as a marker for the diagnosis of non-small cell lung cancer.
  • lung cancer for which the transcription level of the TIMPZ gene serves as a diagnostic marker, is squamous cell lung cancer.
  • the present invention relates to a method for the diagnosis of non-small cell lung cancer.
  • This method includes the following steps: a) obtaining an initial pair of tissue samples from a patient, where one of the samples was obtained from tissue suspected of being affected by cancer, and the second was obtained from adjacent histologically normal (conditionally normal) tissue; b) isolation and purification of RNA preparations from the initial pair of samples; c) synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA on an RNA template using oligonucleotide primers; d) normalization of the concentration of TIMRZ cDNA according to the control gene, the transcription level of which is constant in normal conditions and in lung cancer; d) conducting a quantitative or semi-quantitative reaction of amplification of a fragment of the gene TJMP using cDNA obtained on stage c), as a matrix and a pair of gene-specific oligonucleotide primers; f) comparing the amount of the amplified TJMPS DNA fragment for
  • the oligonucleotide primers used to synthesize single or double stranded cDNA are selected from among oligo (dT) -containing primers, random hexamers, or a combination thereof, as well as gene-specific primers.
  • oligonucleotide primers selected in such a way that they specifically hybridize with cDNA even in the presence of an impurity of genomic DNA are used to amplify the cDNA in step d).
  • the primer sequence is represented by SEQ ID NO: 1 and 2.
  • the quantitative or semi-quantitative amplification reaction of a TIMPS gene fragment is real-time PCR or standard RT-PCR.
  • step d) the GAPDH gene encoding a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase protein is used as a control gene.
  • Another aspect of the present invention is a set of primers for the implementation of the polymerase chain reaction to determine the level of transcription of the TIMPS gene having the sequence of SEQ W NO: 1 and 2.
  • FIG. 1 shows the results of selecting conditions for determining the level of transcription of the TIMPS gene in lung tissue samples.
  • M is the molecular weight marker for DNA (plasmid DNA ⁇ BR222 / LM).
  • FIG. 2 shows the results of an RT-GShR analysis of the level of transcription of the TIMP 3 gene in PRL with centralized tumor location (after 30 cycles). Sample numbers are indicated above the tracks. T - tumor, N - conditional norm (tissue adjacent to the tumor). Nl - NZ - normal. The GAPDH gene (28 PCR cycles) was used as an internal control. Electrophoretic separation of PCR products was carried out on a 1.8% agarose gel.
  • This invention provides a new genetic marker for the diagnosis of non-small cell lung cancer and based on determining the level of transcription of this marker, a simple, reliable method for the diagnosis of HMPJI at various stages of the development of malignant transformation, including the initial ones.
  • a reliably detectable difference in transcription of the TIMRZ gene in normal and tumor tissues can be used to detect lung cancer.
  • biopsy samples punctate, including material obtained by bronchoscopy with direct biopsy (central cancer of the lungs) and transthoracic (percutaneous) puncture of the tumor (peripheral cancer), can be used.
  • RNA isolation and purification include the following stages: grinding of tumor and normal tissue samples in liquid nitrogen, cell lysis, RNA isolation and purification, RNA quality control by electrophoresis in 1% agarose gel in the presence of ethidium bromide dye or in a denaturing polyacrylamide gel, as well as spectrophotometric determination of the amount of RNA.
  • Homogenization of tissue pieces can be carried out manually, grinding with a pestle in a ceramic mortar, or with the help of mechanical homogenizers, for example, Ompi Mikher or Micro-Dismotr U of Sartorius (Germany).
  • mechanical homogenizers for example, Ompi Mikher or Micro-Dismotr U of Sartorius (Germany).
  • RNA isolation methods In classical RNA isolation methods, strong chaotropic agents are used, such as guanidinochloride and guanidine isothiocyanate, which dissolve the proteins, and sequential extraction with phenol and chloroform to denature and remove proteins [Sambrook J., Fritskh EF, Mapiatis T., Molisilgr. A laborotoru Mapial. 2nd Editiop ed. 1989, CoId Sprippg Narbour: CSHL Regss]. The method using the Trizol reagent [GSCO / Life Testmologie] is also widely used.
  • Trizol reagent GSCO / Life Testmologie
  • inhibitors can be used, such as an RNAsip inhibitor of placental or recombinant origin, or, for example, a vanadyl riboside complex, a non-specific broad-spectrum RNAse inhibitor.
  • Rapid and high-quality RNA isolation can be carried out using a number of commercially available kits (Klonogen, St. Russia; RN Kochsu kits (Qiagep); SV Total RNA Isolatiop Sustem, Protega (USA), etc.).
  • RNA To exclude work with aggressive agents, to speed up and simplify the isolation of RNA, various devices are used, for example, QuickGene-810 (Life Science, Japan). For the extraction of RNA, this device uses an 80 ⁇ m porous membrane, which is 12.5 times thinner than the glass filter commonly used in such devices (1000 ⁇ m). This allows you to reduce the degradation of RNA and increase its output.
  • Reverse transcription reaction synthesis of cDNA on an RNA template isolated from lung tissue samples and its conversion into double-stranded form.
  • RNA matrix if necessary, with the completion of the second chain, allows us to switch from unstable RNA molecules to more stable DNA molecules and amplify using the polymerase chain reaction to the amounts necessary for detection.
  • RT-PCR amplification allows the use of very small amounts of the original RNA (at the level of 1 nanogram), and, consequently, the amount of the studied lung tissue from which RNA is isolated.
  • the reverse transcription reaction can be carried out using a number of commercially available reverse transcriptase preparations, such as Moloney mouse leukemia virus (M-MLV), avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase, PoWerSpirt (point mutation M-MLV-RT), C.
  • M-MLV Moloney mouse leukemia virus
  • AMV avian myeloblastosis virus
  • PoWerSpirt point mutation M-MLV-RT
  • C C.
  • Thether Polr and others, with which you can get amplification products up to several thousand and even several tens of thousands of nucleotide pairs (kbp).
  • the thermo-stable DNA polymerase of Thermus thermorhilus (Th) can be used, which has reverse transcriptase activity in the presence of Mn 2+ ions .
  • primers for reverse transcription, various primers can be used, for example:
  • Oligo (dT) n -containing primers that bind to the endogenous polyA tail at the 3'-end of the mRNA (the number n is usually 12-18, but can reach a larger value). These primers are most often used to obtain full-size cDNA.
  • nucleotides A, C or G are often added at the 3'-end to "lock" the primer at the border of the transcript and the poly-A tract;
  • Random hexanucleotide primers that hybridize with RNA in numerous sites. When reverse transcription with these primers receive short cDNA. Random hexamers are used to overcome the difficulties associated with the strong secondary structure of RNA, they are more effective in reverse transcription of 5'-region of mRNA;
  • Hexamers or other short oligonucleotides (10-12 nucleotides) of random composition can also be used in combination with oligot-containing primers;
  • Gene transcription analysis can be performed using single-stranded or double-stranded and amplified cDNA.
  • Specific primers are most often used for the synthesis of the second chain and its amplification.
  • kits for cDNA synthesis based on the use of various reverse transcriptases and various primers for seed.
  • the SMART method has also been developed (swithchip mesapdism. At the 5 'end of RNA thermoplates of the transcripts), which is based on the property of reverse transcriptases to add several nucleotide residues to the 3' end of the first cDNA synthesized, mainly dC.
  • This oligo (dC) sequence serves as the annealing site for the oligonucleotide adapter having a complementary oligo (dG) sequence at the 3'-end.
  • Reverse transcriptase perceives the primer as an extension of the RNA template and continues the synthesis of the first chain [Schmidt WM, Mueller MW 1999. SarSelst: and high sepsitiv metod fog 5 ' ⁇ -depept de eshishhmept of fiill-lepgth with DNS IP PC-mediated ap of sr mRN ⁇ s. Nisleis Acids Res. 27, eZ l].
  • the first cDNA chain is flanked on one side by a 3'-primer sequence with oligo (dT) at the 3 'end, and on the other hand, by a sequence complementary to the adapter.
  • These primers have the same external sequence, differing only at the 3 'end.
  • the first chain is amplified in TTTTP with a primer corresponding to the outer part of the 3'-primer and adapter.
  • the nucleotide sequence of the common part of these primers is selected depending on further goals, for example, the production of clonotes, the use of subtractive hybridization, etc. The result is double-stranded DNA enriched with full-sized sequences.
  • RNA RNA
  • Kits for producing cDNA in this way are produced by various companies, for example, Evrogen, Russia (MINT kit), ⁇ loptesh, USA, etc.
  • thermostable DNA polymerase for example, Taq, Pfu, TfI, Tth, Tma, etc.
  • specific primers sites for which are located in the transcript of interest
  • thermostable DNA polymerase for example, Taq, Pfu, TfI, Tth, Tma, etc.
  • specific primers sites for which are located in the transcript of interest
  • conduct standard, semi-quantitative PCR in which the amplified transcript fragment is detected by simple gel electrophoresis, or real-time quantitative PCR.
  • the selection of specific primers is carried out by a method well known to specialists in this field. To select primers and annealing temperatures, it is advisable to use commercially available programs or programs that are freely available on the Internet.
  • the length of the primers can be selected in the range from 18 to 25 bp.
  • this invention does not use rhSase-free DNase.
  • primers for PCR are selected so that they specifically hybridize with cDNA even in the presence of an impurity of genomic DNA in the preparation. This can be achieved, for example, by selecting primers for different exons of the TIMRZ gene.
  • the length of the PCR product that is amplified with impurity genomic DNA will be significantly longer than the expected length of the PCR product amplified with cDNA. If at least one of the selected primers overlaps the boundary between exons, impurities of genomic DNA will not affect the results of the amplification reaction.
  • primers are used: TJRZJF (SEQ ID NO: 1) S'-ASSATSAAGSAGATGAAGATGTASS-3 'and TIMP3_R (SEQ W NO: 2) 5'-ACTTGATCTTGCAGTTACAACCCA-3' It will be understood by a person skilled in the art that others may pairs of primers that differ, for example, in their length, in their localization with respect to the transcript sequence of the ⁇ MP3 gene, which will provide specific and efficient amplification of the TJMPS gene transcript fragment even in the presence of an impurity of genomic DNA.
  • HMPJI shows the smallest spread in transcription levels in normal and tumor tissues.
  • PCR-RV real-time PCR
  • PCR-RV real-time PCR
  • the probe complementary to the middle part of the amplified fragment, contains a fluorophore and a quencher at the ends. When the fluorophore and quencher are associated with an oligonucleotide probe, only slight fluorescence emission is observed.
  • the fluorescent label passes into the solution, being released from the vicinity of the quencher, and generates a fluorescent signal that amplifies in real time in proportion to the accumulation of the amplification.
  • probes for PCR-RV can be carried out in accordance with the standard recommendations of the manufacturer of devices for PCR-RV. If there is no need for multiplex analysis of several genes simultaneously, an economical alternative can be a system using SYBR Green dye specific for double-stranded DNA, the fluorescence intensity of which increases in real time in proportion to the increase in the number of amplicons. In this embodiment, primers without a probe can be used.
  • PCR-RV PCR-RV
  • the use of PCR-RV also reduces the risk of contamination and automates the diagnostic process.
  • the process lasts two to three hours (50 or 60 PCR cycles, respectively) and includes simultaneous PCR, detection of a fluorescent signal, data processing and their presentation in graphical form (full kinetic curve) using special software.
  • a comparative method (relative measurement method, RQ method) is usually chosen, based on the relative measurement of the number of studied polynucleotide sequences, which allows a double comparison of the results for control and target genes, as well as for normal and tumor samples cDNA
  • Example 1 Samples of lung tissue.
  • TNM tumor samples were characterized according to the international system of clinical and morphological classification of TNM tumors, where T (tumo) - T0-T4 - categories reflecting the increase in the size and / or local distribution of the primary tumor, N (on) - NO-NZ - categories reflecting different the degree of defeat by metastases of the regional lymph nodes; M (metastasis) - M0-M1 - characterizes distant metastases. All possible combinations of TNM are combined into larger groups - stages that reflect the course of the tumor process. The first stage of the disease was found in six patients, the P-th - in 18, Sh-th - in five. Signs of distant metastases were not observed in any of the patients. None of the patients were exposed to radiation therapy and chemotherapy before surgery.
  • Example 2 The selection of RNA from tissue samples
  • RNA preparations were purified using the Rpaseu Ms kit kit (Qiagep, USA) according to the protocol attached by the manufacturer. Such a three-stage RNA purification procedure allowed us to effectively get rid of not only soluble glycoprotein precipitates, but also low molecular weight RNA.
  • the quality of the RNA preparation was checked by electrophoresis on a 1% agarose gel in the presence of ethidium bromide. The amount of RNA was determined spectrophotometrically [Sambrook et al, 1989, supra].
  • CDS (5'-AGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC (T) zON- l N-Z l ), and the reverse transcriptase of the Powerscrypt (Clophesh, USA).
  • RNA (1 ⁇ g / ⁇ l) 1.0 ⁇ l SMART primer (6 ⁇ M) 2.0 ⁇ l CDS primer (10 ⁇ M) 1.0 ⁇ l sterile deionized water 1.0 ⁇ l
  • the sample was heated at 72 ° C for 3 min and placed on ice.
  • Amplification conditions 95 0 C, 1.5 min 1 cycle
  • the number of cycles was selected, allowing to obtain the same amount of amplified material.
  • Example 5 Selection of conditions for determining the level of transcription of the TIMPZ gene in lung tissue samples.
  • double-stranded cDNA was amplified using gene-specific primers TIMP ⁇ _F (SEQ ⁇ NO: 1) and TIMP ⁇ _R (SEQ ⁇ NO: 2), which were matched to different exons of the TIMPZ gene, one of the primers overlapping the border between exons. Under these conditions, genomic DNA impurities do not affect the amplification results.
  • the size of the PCR fragment was 279 bp
  • the selection of the conditions for the NDP was carried out on several samples of cDNA. All primers were selected using the Rgimer Dosigper program developed at the IMB RAS.
  • Amplification was carried out in 25 ⁇ l of a mixture containing: 67 mM Tris-Hcl, pH 8.8, 16.6 mM (NI ⁇ ) 2 SO 4 , 0.1% Twep-20, 2.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM each of dNTP, 0.1 ⁇ g cDNA, 0.2 ⁇ M each of the primers, 2 units the activity of Bio-Taq DNA polymerase (Dialat Ltd., Moscow).
  • Conditions for conducting PTTR The composition of the reaction mixture (25 ⁇ l):
  • the cDNA samples were normalized by the GAPDH control gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase protein. Used primers selected for different exons of the GAPDH gene, and one of the primers overlaps the border between exons:
  • GAPDHJ S'-GGAGTSAASGGATTTGGTS-3 1 and GAPDHJL: 5'-TGGGTGGAATCAT ATTGGAACAT-3 ',
  • the size of the PCR fragment is 139 bp
  • the selection of the conditions for TTfTP was carried out on several cDNA samples. Amplification conditions: preheating at 94 0 C 2 min; 94 0 C, 30 s, 56 0 C, 30 s and 72 0 C, 30 s - 28 and 30 cycles; 72 0 C, 5 min - 1 cycle.
  • PCR was performed on a MasterSusler, Errepdorf (Germany) thermocycler with a heating cap or Tertsik thermocycler, DNA technology ( Russia). Amplification products were analyzed on a 1.8% agarose gel with 0.5 ⁇ g / ml ethidium bromide (see Fig. 1). As a result, the optimal conditions for OT- PCR (27-30-33 cycles), in which a linear relationship was obtained between the number of cycles and the number of PCR products. All amplification reactions were repeated three times.
  • the fluorescence intensity of the bands after electrophoretic separation of PCR products was quantified using the GeperProfiler photo densitometry program (https://www/scanalytics.com) and expressed as normal / tumor relative intensity values (N / T).
  • Amplified fragments of the TIMPZ gene were cloned in the pGEM®-T ⁇ facility redesign torque vector ( ⁇ romega) and sequenced. Their nucleotide sequences completely coincided with the sequences of the corresponding cDNA fragment. Sequencing was performed using the ABI PRISM® BigDue TM TERMIPATOR v reagent kit. 3.1 followed by analysis of the reaction products on an ABI PRISM 3100-Avant automated DNA sequencer.
  • Example 6 Determination of the level of transcription of the TIMRZ gene in samples of normal and tumor tissues.
  • Master-mix by mixing all PCR components except the matrix. Master-mix should be prepared at the rate of 1 reaction with a volume of 25 ⁇ l for each sample + 1 additional reaction with a volume of 25 ⁇ l.
  • the present invention also provides that determining the level of transcription of the T ⁇ MRZ gene will be useful in monitoring the effectiveness of anti-cancer therapy, and the analysis by the method of the present invention should be carried out before and after the course of treatment, and if necessary during the course of treatment.
  • An increase in the level of transcription of the TTMPS gene during or at the end of the course of treatment will indicate the restoration of the activity of the tumor suppressor gene TIMRZ, which may indicate positive changes in treatment.
  • a decrease in the level of transcription of the TIMRZ gene will indicate a further suppression of gene activity, which may indicate a lack of treatment effectiveness.
  • T0 - T4 - categories reflecting the local distribution of the primary tumor; N0 - N3 - categories reflecting a different degree of metastatic lesion of regional lymph nodes; M0-M1 - characterize the presence of distant metastases.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

УРОВЕНЬ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНА ТIМРЗ В КАЧЕСТВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАРКЕРА НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКИХ
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и молекулярной биологии и может быть использовано для ранней диагностики немелкоклеточного рака легких, включая плоскоклеточный рак.
Уровень техники
Рак легких остается одной jиз основных причин смерти онкологических больных в мире. Смертность от рака легких превышает смертность от рака молочной железы, толстой кишки и простаты, вместе взятых [Jеmаl А., Siеgеl R., Wагd E., Мurrау Т., Xu J., Smigаl С, Thun MJ. 2006. Сапсеr stаtistiсs, 2006. CA Сапсеr J Сliп. 56, 6-30]. В России показатели смертности от рака легких у мужчин 68,2 случая на 100 тысяч населения, у женщин - 6,8 случая [Заридзе Д.Г. 2004. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований, стр. 29-85 - в кн. Канцерогенез/ под ред. Д.Г. Заридзе. -M.: Медицина]. Различают два основных вида рака легких (РЛ): мелкоклеточный (MP Л) и немелкоклеточный (HMP Л), составляющих 15-20 и 75-80%, соответственно. К НМРЛ относят плоскоклеточный рак легких (ПРЛ), аденокарциному легких (АКЛ) и крупноклеточный рак. Среди разных форм рака легких по частоте встречаемости ПРЛ занимает первое место, АКЛ - второе.
Диагноз в половине случаев НМРЛ устанавливают на далеко зашедшей стадии опухолевого процесса, что делает малореальным радикальное излечение. Современные методы лечения повышают среднюю пятилетнюю продолжительность жизни больных НМРЛ не более чем на 15%. Этот показатель может быть существенно улучшен только с помощью разработки методов ранней диагностики.
Основными методами диагностики рака легких служат инструментальные - рентгеновские и эндоскопические. Используют также анализ мокроты на атипичные клетки, биопсию ткани легких, компьютерную томографию, флуоресцентную фиброскопию. Иммунологические методы диагностики находят пока ограниченное клиническое применение. Практическую значимость имеет определение опухолевых маркеров: CEA - раковоэмбриональный антиген - онкомаркер рака прямой кишки, но может использоваться в оценке рака легких; NSE — нейрон-специфическая энолаза - в ряде случаев используют в оценке состояния пациентов с раком легких; тканевой полипептидный антиген (TPA) - фрагмент цитокератина, более специфичный маркер рака легких. Эти маркеры применяют для контроля лечения, выявления рецидивов, но не для диагностики PJI на ранней стадии. Для диагностики HMPJI широко используют маркеры SCC - антиген плоскоклеточной карциномы и фрагмент цитoкepaтинa-19 (CYFRA 21.1) [Раstоr А., Мепепdеz R., Сrеmаdеs M. J., Раstоr V., Llорis R., Аzпаr J. 1997. Diаgпоstiс vаluе оf SCC, CEA and CYFRA 21.1 iп hmg сапсеr: а Вауеsiап апаlуsis. Еиr Rеsрir J. 10, 603-609; Вuссhеri G., Тоrсhiо Р., Ferrigno D. 2003. Сliαiсаl Еquivаlепсе оf Тwо Суtоkеrаtiп Маrkеrs iп Nоп-smаll CeIl Luпg Сапсеr. А Studу оf Тissuе Роlурерtidе Апtigеп апd Суtоkеrаtiп 19 Frаgmепts. Сhеst. 124, 622-632], но они также малопригодны для ранней диагностики PJI.
Диагностическими признаками злокачественной трансформации клеток могут служить также изменения генома в опухолевых клетках - точечные мутации в кодирующих и регуляторных участках генов, микросателлитная нестабильность, аллельные потери, изменение уровня транскрипции или трансляции генов, метилирование промоторных участков гена и др. В отличие от белковых молекулярно- генетические маркеры обладают значительно большей чувствительностью. Рак легких сопровождается изменением функциональной активности многих генов. В числе перспективных потенциальных маркерных генов, вовлеченных в канцерогенез разных форм HMPJI, рассматривают ген ТIМРЪ [Кеttuпеп E., Anttila S., Sеррапеп J.K., Каrjаlаiпеп A., Edgren H., Lindstrom I, Sаlоvааrа R., Nissеп A.M., SaIo J., Mattson K., Hollmen J., Knuutila S., Wikman H. 2004. Diffеrепtiаllу ехрrеssеd gепеs iп поп-smаll сеll luпg сапсеr; ехрrеssiоп рrоfiliпg оf сапсеr-rеlаtеd gепеs iп squаmоus сеll luпg сапсеr. Сапсеr Gепеt. Суtоgепгt. 149, 98-106; Dаmmапп R., Struппikоvа M., Sсhаgdаrsurепgiп U., Rаstеttеr M., Рарritz M., Наttепhоrst U.E., Ноfmапп H. S., Silbеr R.E., Вurdасh S., Напsеп G. 2005. CpG islапd mеthуlаtiоп апd ехрrеssiоп оf tumоur-аssосiаtеd gепеs iп luпg саrсiпоmа. Еиr. J. Сапсеr. 41, 1223-1236].
Тканевый ингибитор металлопротеиназы 3 - ТIМРЗ участвует в межклеточных взаимодействиях и индукции апоптоза, может подавлять рост многих опухолей, включая HMPJI, ангиогенез, прорастание и метастазирование [Drупdа А., Quах P.H., Neumann M., vап dеr Lаап W.H., Рар G, Drупdа S., Меiпесkе L, Кеkоw J., Nеumапп W., Нuiziпgа T.W., Nаumапп M., Копig W., Рар T. 2005. Gепе trапsfеr оf tissuе iпhibitоr оf metalloproteiпases-3 rеvеrsеs thе iпhibitоrу еffесts оf ТNF-аlрhа оп Fаs-iпduсеd арорtоsis iп rhеumаtоid аrthritis sупоviаl Fibrоblаsts. J Immипоl. 174, 6524-6531]. Инактивацию гена наблюдали при раках шейки матки, ободочной и прямой кишки, предстательной железы, а также при HMPJI, включая ПРЛ [Вгаесkl W.M., Grоmbасh J., Wein A., Ruсkеrt S., Роrzпеr M., Diеtmаiеr W., Rummеlе Р., Сгопег R.S., Вохbеrgег F., Кiгсhпеr Т.,
Hohenberger W., Наhп E.G., Juпg А. 2005. Аltеrаtiопs iп thе tissuе iпhibitог оf metalloproteinase-3 (TIMP-3) аге fоuпd frеquепtlу iп humап соlогесtаl tumоurs disрlауiпg еithеr miсrоsаtеllitе stаbilitу (MSS) оr iпstаbilitу (MSI). СапсеrLеtt, 223, 137-42].
Ген TIMPS относят к потенциальным генам-супрессорам опухолевого роста. Потеря активности таких генов происходит в результате точечных мутаций, аллелышх делеций, гомозиготных делеций или гиперметилирования СрG-островков генов, особенно в промоторных областях [Веliпskу S.A., Кliпgе D.M., Dеkkеr J.D., Smith M. W., Восklаgе TJ., GШilапd F.D., Сгоwеll R.E., Каrр D.D., Stidlеу C.A., Рiссhi М.А. 2005. Gепе рrоmоtеr mеthуlаtiоп iп рlаsmа апd sрutum iпсrеаsеs with luпg сапсег risk. CUn. Сапсеr Rеs. 11, 6505-6511]. Для гена ТJМРЗ с использованием в основном методов иммуногистохимического окрашивания и иммуноблоттинга выявлено изменение количества соответствующего белка при HMPJI [Кеttшiеп еt аl., 2004, suрrа]. Следует отметить, что транскрипционная активность этого гена в норме и опухолях остается малоизученной, хотя с диагностической точки зрения существенную роль при выборе кандидата на роль диагностического маркера играет высокая стабильность образующегося транскрипта.
Потеря транскрипционной активности при HMPJI показана для нескольких генов. В работе (Теrаuсhi К., Shimаdа J., Uеkаwа N., Yаоi Т., Маruуаmа M., Fushiki S. 2006. Сапсеr-аssосiаtеd lоss оf TARSH gепе ехрrеssiоп iп humап ргimаrу luпg сапсег. J. Сапсеr Rеs. CHn. Опсоl. 132. 28-34) выявлено уменьшение транскрипции гена TARSH, одного из генов, связанных со старением клеток, в опухолевых клеточных линиях и образцах HMPJI по сравнению с нормой. На основе полученных результатов авторы выдвинули предположение о возможном использовании этого гена в качестве биомаркера для диагностики HMPJI. Однако в данной работе проведен анализ только 8- ми образцов ПРЛ, наиболее распространенной формы PJI. Данный аналог наиболее близок по технической сущности заявленному изобретению и принят за прототип.
Из изложенного ясно, что в данной области существует настоятельная потребность в поиске нового диагностического маркера HMPJI, позволяющего достоверно и уже на самых ранних этапах диагностировать заболевание, и в разработке на его основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики немелкоклеточного рака легких. Раскрытие изобретения
Данное изобретение стало возможным в результате проведенного авторами сравнительного анализа уровня транскрипции гена ТIМРЗ в опухолевых тканях легких различного типа и на разных этапах их злокачественного перерождения и неожиданного открытия того факта, что уже ранние стадии развития злокачественной трансформации сопровождаются значительным снижением уровня транскрипции гена TMPS.
Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к новому маркеру для диагностики немелкоклеточного рака легких, который представляет собой уровень транскрипции гена JJМРЗ. Сниженный уровень в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легких.
В одном из воплощений рак легких, маркером которого является уровень транскрипции гена ТIМРЗ, является плоскоклеточным раком легких.
В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению уровня транскрипции гена ΗМРЗ в качестве маркера для диагностики немелкоклеточного рака легких человека.
В одном из воплощений рак легких, в отношении которого уровень транскрипции гена ТIМРЗ служит в качестве диагностического маркера, является плоскоклеточным раком легких.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики немелкоклеточного рака легких. Данный способ включает следующие стадии: а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей гистологически нормальной (условно-нормальной) ткани; б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов; в) синтез одноцепочечной или двуцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров; г) нормирование концентрации кДНК ТIМРЗ по контрольному гену, уровень транскрипции которого постоянен в норме и при раке легких; д) проведение количественной или полуколичественной реакции амплификации фрагмента гена ТJМРЗ с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров; е) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК TJMPS для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают уровень транскрипции гена ТIМРЗ, причем уменьшение транскрипции гена TIMPS служит диагностическим признаком рака легких. В одном из воплощений заявленный способ предназначен для диагностики плоскоклеточного рака легких.
В одном из воплощений способа изобретения на стадии в) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа oлигo(dT)-coдepжaщиx праймеров, случайных гексамеров, или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.
В следующем воплощении способа настоящего изобретения для амплификации кДНК на стадии д) используют олигонуклеотидные праймеры, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК.
В отдельном предпочтительном воплощении данного изобретения последовательность праймеров представлена SEQ ID NO: 1 и 2.
В еще одном воплощении способа настоящего изобретения на стадии д) количественная или полуколичественная реакция амплификации фрагмента гена TIMPS представляет собой ПЦР в реальном времени или стандартную ОТ-ПЦР.
В одном воплощении заявленного способа на стадии г) в качестве контрольного гена используют ген GAPDH, кодирующий белок глицepaльдeгид-3- фосфат-дегидрогеназу.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является набор праймеров для осуществления полимеразной цепной реакции для определения уровня транскрипции гена TIMPS, имеющих последовательность SEQ Ш NO: 1 и 2.
Перечень фигур.
Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные примеры и фигуры, где б
Фиг. 1 показывает результаты подбора условий определения уровня транскрипции гена TIMPS в образцах тканей легких. Электрофоретическое разделение в агарозном геле продуктов TTTIP (размер 279 п.н.), полученных после 27, 30 и 34 циклов проводили в 1,8 %-нoм агарозном геле. M - маркер молекулярных масс ДНК (ДНК плазмиды ρBR222/ЛM).
Фиг. 2 показывает результаты ОТ-ГШР-анализа уровня транскрипции гена TIMP 3 при ПРЛ с центральной локализацией опухоли (после 30-ти циклов). Номера образцов указаны над дорожками. T - опухоль, N - условная норма (прилежащие к опухоли ткани). Nl - NЗ - норма. Ген GAPDH (28 циклов ПЦР) использовали как внутренний контроль. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 1,8 %-нoм агарозном геле.
Осуществление изобретения
Данное изобретение обеспечивает новый генетический маркер для диагностики немелкоклеточного рака легких и основанный на определении уровня транскрипции этого маркера простой, надежный способ диагностики HMPJI на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные. Достоверно обнаруживаемое различие в транскрипции гена ТIМРЗ в нормальных и опухолевых тканях может быть использовано для обнаружения рака легких.
Образцы ткани легких для анализа
В качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы биоптаты, пунктаты, в том числе материал, полученный при бронхоскопии с прямой биопсией (центральный рак' легких) и трансторакальной (чрезкожной) пункции опухоли (периферический рак).
Выделение РНК из образцов ткани легких
Способы выделения суммарной РНК из образцов ткани млекопитающих хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%-нoм агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков ткани можно проводить вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например, Оmпi Мiхеr или Мiсrо-Dismеmbrаtоr U фирмы Sаrtоrius (Германия). Для выделения РНК могут быть использованы различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие, как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sаmbrооk J., Fritsсh E.F., Мапiаtis Т., Моlесиlаr Сlопiпg. А lаbоrаtоrу Мапиаl. 2nd Еditiоп еd. 1989, CoId Sрriпg Наrbоur: CSHL Ргеss]. Широко используют также метод с использованием реагента Тrizоl [GШСО/Lifе Тесtmоlоgiеs]. Для предотвращения разрушения РНК РНКазами могут быть использованы ингибиторы, такие как игибитор RNАsiп плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.
Быстрое и качественное выделение РНК можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт - Петербург; RNеаsу kits (Qiаgеп); SV Тоtаl RNA Isоlаtiоп Sуstеm, Рrоmеgа (США) и т. д.).
Чтобы исключить работу с агрессивными агентами, ускорить и упростить выделение РНК, применяют различные приборы, например, QuickGene-810 (Lifе Sсiепсе, Япония). Для экстракции РНК в этом приборе используют 80 мкм пористую мембрану, которая в 12,5 раз тоньше обычно используемого в таких приборах стеклянного фильтра (1000 мкм). Это позволяет уменьшить деградацию РНК и увеличить ее выход.
Реакция обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов ткани легких, и ее перевод в двуцепочечную форму.
Процесс обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, при необходимости, с достройкой второй цепи, позволяет от нестабильных молекул РНК перейти к более стабильным молекулам ДНК и амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции до количеств, необходимых для детекции. ОТ-ПЦР-амплификация позволяет использовать очень малые количества исходной РНК (на уровне 1 нанограмма), а, следовательно, и количество исследуемой легочной ткани, из которой выделяют РНК.
Реакцию обратной транскрипции можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), РоwеrSсriрt (точечная мутация M-MLV-RT), С. Тhеrm Роlуmеrаsе и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиною до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термо стабильная ДНК-полимераза Тhеrmus thеrmорhilus (Тth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Mn2+.
Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:
1) Oлигo(dT)n-coдepжaщиe праймеры, которые связываются с эндогенным полиА-хвостом на З'-конце мРНК (число п обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К oлигo(dT)-пocлeдoвaтeльнocти часто добавляют на З'-конце нуклеотиды А, С или G, чтобы «зaякopить» праймер на границу транскрипта и поли-А тракта;
2) Случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки), которые гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных с прочной вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-oблacтeй мРНК;
3) Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олигоdТ- содержащими праймерами;
4) Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.
Анализ транскрипции генов можно проводить, используя одноцепочечную или двуцепочечную и амплифицированную кДНК. Для синтеза второй цепи и ее амплификации наиболее часто используют специфичные праймеры. В продаже имеются наборы для синтеза кДНК, основанные на применении различных обратных транскриптаз и различных праймеров для затравки. Для получения кДНК разработан также SMART- метод (switсhiпg mесдапism. аt thе 5' end of RNA tеmрlаtеs оf rеvеrsе trапsсriрtаsе), в основе которого лежит свойство обратных транскриптаз добавлять на 3 '-конец синтезированной первой цепи кДНК несколько нуклеотидных остатков, преимущественно dС. Эта oлигo(dC)-пocлeдoвaтeльнocть служит местом отжига олигонуклеотидного адаптера, имеющего комплементарную oлигo(dG)- последовательность на З'-конце. Обратная транскриптаза воспринимает праймер как продолжение РНК-матрицы и продолжает синтез первой цепи [Sсhmidt W.M., Мuеllеr M. W. 1999. СарSеlесt: а highlу sепsitivе mеthоd fог 5' САР-dерепdепt ешiсhmепt оf fiill-lепgth сDNА iп РСR-mеdiаtеd апаlуsis оf mRNАs. Nисlеiс Асids Rеs. 27, еЗ l]. Таким образом, первая цепь кДНК оказывается фланкирована с одной стороны последовательностью З'-праймера с oлигo(dT) на 3 '-конце, а с другой - последовательностью, комплементарной адаптору. Эти праймеры имеют одинаковые внешние последовательности, отличаясь только на 3 '-конце. Затем первую цепь амплифицируют в TTTTP с праймером, соответствующим внешней части З'-праймера и адаптора. Нуклеотидную последовательность общей части этих праймеров подбирают в зависимости от дальнейших целей, например получения клонотек, применения вычитающей гибридизации и т.д. В результате получают двухцепочечную ДНК, обогащенную полноразмерными последовательностями. За счет использования адаптера с заблокированным 3'- концом достигается существенное снижение фоновой амплификации. При использовании модифицированного SМАRТ-метода за короткое время происходит амплификация исходного материала более чем в 105 раз, поэтому можно работать с очень небольшими количествами РНК (меньше 1 нанограмма), а следовательно и с небольшим количеством исследуемой ткани [Zhu Y. Y., Масhlеdеr E.M., Chenchik A., Li R., Siеbеrt Р.D. 2001. Rеvегsе trапsсriрtаsе tеmрlаtе switсhiпg: а SMART арргоасh fог full-lепgth сDNА librаrу сопstruсtiоп. Вiоtесhпiqиеs 30, 892-897]. Наборы для получения кДНК этим способом выпускают различные фирмы, например, Евроген, Россия (набор MINT), Сlопtесh, США и т.п.
Анализ уровня транскрипции гена ТIМРЗ с помощью ПЦР.
Используя первую или вторую цепь кДНК как матрицу, коммерчески доступную от широко спектра производителей термостабильную ДНК-полимеразу (например, Таq, Рfu, TfI, Тth, Тmа и т.д.) и специфические праймеры, сайты для которых расположены в представляющем интерес транскрипте, проводят стандартный, полуколичественный ПЦР, в котором амплифицируемый фрагмент транскрипта детектируется простым гель-электорофорезом, или количественный ПЦР в реальном времени. Выбор специфических праймеров осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области. Для подбора праймеров и температур отжига целесообразно использовать коммерчески доступные программы или программы, находящиеся в свободном доступе в Интернете. Среди таких программ можно упомянуть Оligо (версия 6.42), РrimеrSеlесt из пакета Lаsеrgепе (www.dпаstаr.соm), Рrimеr Рrешiеr 5, рrimеrsЗ (http://frodo.wi.mit.edu/cgi- bin/primerЗ/primerЗ_www.cgiC), ЕаsуЕхопРriтег (Wu X., Мuпrое DJ. 2006. ЕаsуЕхопРrimег: Аutоmаtеd Рrimег Dеsigп fоr Ехоп Sеquепсеs. Аррl Bioiпformatгcs.5,
119-120), ЕхРгimеr (Sапdhu K.S., Асhаrуа K.K. 2005. ЕхРrimеr: tо dеsigп рrimегs fгоm ехоп-ехоп juпсtiопs. Вiоiпfоrтаtiсs. 21, 2091-2092), РегlРrimеr, FаstРСR (httр ://www.bioceпteг.helsiпki. fi/bi/Ргоgrаms/fаstрсr.htm), РгimегQuеst
(http://scitools.idtdпa.com/Primerquest/). С учетом сложности анализируемого генома длина праймеров может быть выбрана в диапазоне от 18 до 25 п.н..
С целью упростить процедуру осуществления способа для целей клинического анализа и обеспечить максимальную сохранность содержащейся в образце РНК, необходимо свести к минимуму манипуляции с образцом ткани, которые потенциально могут приводить к разрушению РБК. В этой связи в одном из предпочтительных вариантов получения препарата РНК в данном изобретении не используют ДНКазу, свободную от РШСазы. При этом праймеры для ПЦР подбирают таким образом, чтобы они специфически гибридизовались с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК. Этого можно достигнуть, например, путем подбора праймеров к разным экзонам гена ТIМРЗ. При использовании гено специфичных праймеров, комплементарных участкам разных экзонов, длина продукта ПЦР, амгаiифицированноrо с примесной геномной ДНК, будет значительно больше длины ожидаемого продукта ПЦР, амплифицированного с кДНК. Если хотя бы один из подобранных праймеров перекрывает границу между экзонами, примеси геномной ДНК не будут влиять на результаты реакции амплификации.
В предпочтительном воплощении используют праймеры: ТЖРЗJF (SEQ ID NO: 1) S'-АССАТСААGСАGАТGААGАТGТАСС-З' и TIMPЗ_R (SEQ Ш NO: 2) 5'-ACTTGATCTTGCAGTTACAACCCA-3' Специалисту в данной области будет понятно, что могут быть подобраны и другие пары праймеров, различающиеся, например, по своей длине, по своей локализации относительно последовательности транскрипта гена ΗМРЗ, которые будут обеспечивать специфическую и эффективную амплификацию фрагмента транскрипта гена TJMPS даже в присутствии примеси геномной ДНК.
Количественная оценка уровня транскрипции достигается с помощью параллельного проведения ПЦР с тестируемым транскриптом и контрольным/стандартным транскриптом. В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводилось нормирование продуктов амплификации исследуемого гена ΗМРЗ, выбран «гeн домашнего xoзяйcтвa» - GAPDH, кодирующий глицepaльдeгид-3 -фосфат- дегидрогеназу. Экспрессия «гeнoв домашнего хозяйства)) (hоusекеерiпg gепеs) во всех клетках одинакова. Для гена GAPDH в случае
HMPJI показан наименьший разброс уровней транскрипции в нормальных и опухолевых тканях. (D. W. Liu, S. T. Сhеп, Н.Р. Liu. Сhоiсе оf епdоgепеоus сопtrоl fоr gепе ехрrеssiоп iп попsmаll luпg сапсеr. 2005. Еuг. Rеsрir.J. 26, 1002-1008.)
Для анализа уровня транскрипции генов может быть использована не только стандартная ПЦР, но и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). В отличие от стандартного метода, где фиксируются только конечные продукты реакции, ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации, поэтому позволяет наблюдать накопление амплифицированных фрагментов в экспоненциальной фазе реакции, что увеличивает чувствительность метода. Зонд, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента, содержит на концах флуорофор и тушитель. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5'-экзoнyклeaзнoй активности Таq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.
Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ может осуществляться в соответствии со стандартными рекомендациями производителя приборов для ПЦР-РВ. Если отсутствует необходимость мультиплексного анализа нескольких генов одновременно, экономичной альтернативой может быть система, использующая специфический к двухспиральной ДНК краситель SYBR Grееп, интенсивность флуоресценции которого возрастает в реальном времени пропорционально увеличению количества ампликонов. В таком варианте можно использовать праймеры без зонда.
Для проведения ПЦР в реальном времени различными фирмами разработаны амшшфикаторы, например: ABI Рrism 7000 Sеquепсе Dеtесtiоп Sуstеm фирмы Аррliеd Вiоsуstеms (США), Chromo4, МiпiОрtiсоп или iСусlеr iQ5 MJ Rеsеагсh (Вiо-Rаd), а также отечественные приборы ДT-322 (ДНК-Технология), AHK-32 (Институт Аналитического Приборостоения РАН, http://www.syntol,ш/productank.htm) и т.д. Применение ПЦР-РВ позволяет также уменьшить риск контаминации и автоматизировать процесс диагностики. Процесс продолжается два-три часа (50 или 60 циклов ПЦР, соответственно) и включает одновременное проведение ПЦР, детекцию флуоресцентного сигнала, обработку данных и их представление в графическом виде (полной кинетической кривой) с помощью специального программного обеспечения. Результаты анализа становятся доступными сразу после завершения процесса и не требуют дополнительно очистки и анализа продуктов ПЦР. В качестве основного метода измерения уровня транскрипции генов обычно выбирают сравнительный метод (метод относительных измерений, RQ-метод), основанный на относительном измерении количества исследуемых полинуклеотидных последовательностей, позволяющий проводить двойное сравнение результатов - для контрольных и целевых генов, а также для нормальных и опухолевых образцов кДНК.
Далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры, представляющие собой наиболее предпочтительные воплощения данного изобретения. При этом должно быть понятно, что изобретение не ограничивается этими описанными воплощениями. Напротив, предполагается, что оно включает любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности и объема изобретения.
Пример 1. Образцы тканей легких.
Анализировали 29 пар образцов легочных тканей (опухоль - условная норма) пациентов с HMPJI: 25 пар образцов ПРЛ (19 образцов с центральной локализацией опухоли и шесть - с периферической) и четыре пары образцов AKJI. За условную норму принимали гистологически нормальные ткани легких, взятые из прилегающей к опухоли ткани ближе к краю резекции. Кроме того, использовали ткани легких, полученные постмортально от 10-ти человек, не имевших в анамнезе заболеваний раком (норма): пять образцов, взятых в центральных областях легких, и пять - в периферических областях. Средний возраст пациентов, среди которых 28 мужчин и одна женщина, составляет 61 год (диапазон 34-76 лет). Диагноз в каждом случае устанавливали на основании результатов клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследований. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей TNM, где T (tumоr) - T0-T4 - категории, отражающие нарастание размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (поdulus) - NО-NЗ - категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; M (mеtаstаsis) — M0-M1 - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации TNM объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса. 1-ая стадия заболевания установлена у шести больных, П-ая - у 18-ти, Ш-ья - у пяти. Признаков отдаленных метастазов не наблюдали ни у одного из пациентов. Никто из пациентов не подвергался до операции лучевой терапии и химиотерапии. Пример 2. Выделение РНК из образцов тканей
Суммарную РНК выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей. Образцы тканей гомогенизировали на приборе Мiсrо-Dismеmbrаtоr U (Sаrtоrius, Германия). Очистку РНК проводили стандартным методом с использованием гуанидинизотиоцианата и фенола с последующим осаждением этиловым спиртом [Sаmbrооk еt аl., 1989, suрrа]. Для удаления примесей гликопротеидов, которыми богаты ткани легких, использовали дополнительное осаждение РНК солевым раствором [Сhоmсzупski Р., Масkеу К. 1995. Modification of the TRI rеаgепt рrосеdurе fог isolation of RNA frоm роlуsассhаridе- апd рrоtеоglусап-riсh sоuгсеs. Вiоtесhпiqиеs 19, 942-945]. После солевого осаждения все препараты РНК очищали с помощью набора "Rпеаsу Мшi kit" (Qiаgеп, США) согласно прилагаемому изготовителем протоколу. Такая трехэтапная процедура очистки РНК позволила эффективно избавиться не только от трудно растворимых осадков гликопротеидов, но и от низкомолекулярных РНК. Качество препарата РНК проверяли электрофорезом в 1%-нoм агарозном геле в присутствии бромида этидия. Количество РНК определяли спектрофотометрически [Sаmbrооk еt аl, 1989, suрrа].
Пример 3. Реакция обратной транскрипции.
Синтез первой цепи кДНК
На матрице РНК, выделенной, как описано в Примере 2, синтезировали одноцепочечную кДНК. Для получения кДНК использовали модифицированный SМАRТ-метод [Zhu Y. Y., Масhlеdеr E.M., Chenchik A., Li R., Siеbеrt Р.D. 2001. Rеvеrsе trапsсriрtаsе tеmрlаtе switсhiпg: а SMART аррrоасh fог full-lепgth сDNА librаrу сопstшсtiоп. Вiоtесhпiqиеs 30, 892-897], 2 нг - 1 мкг суммарной РНК, праймеры:
SMART (5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrG-S1) и
CDS (5'-AGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)зoN-lN-Зl), и обратную транскриптазу РоwеrSсriрt (Сlопtесh, США).
Условия реакции:
Состав реакционной смеси (10 мкл):
РНК (1 мкг/мкл) 1,0 мкл праймер SMART (6 мкМ) 2,0 мкл праймер CDS (10 мкМ) 1,0 мкл стерильная деионизованная вода 1,0 мкл Прогревали пробу при 720C, 3 мин и помещали в лед.
Добавляли 5 мкл смеси: буфер (Сlопtесh) для построения 1-ой цепи (5x) 2,0 мкл dNТР (10 мМ) 1,0 мкл
DTT (20 мМ) 1,0 мкл обратная транскриптаза РоwеrSсriрt (Сlопtесh.) 1,0 мкл
Инкубировали при 420C, 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 650C, 5 мин, добавляли 2 мкл 60 мМ ЭДТА и доводили объем пробы до 20 мкл. Пример 4. Синтез второй цепи кДНК
Для синтеза второй цепи кДНК и амплификации брали 1/10 часть от объема реакционной смеси, полученной в Примере 3. Синтез проводили с помощью Advantage2 DNA Роlуmеrаsе с праймером 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' согласно протоколу «Advantage 2 PCR kit» (Сlопtесh, Неidеlbеrg, Gеrmапу). Условия проведения ПЦР: Состав реакционной смеси (50 мкл):
ПНР-буфер Аdvапtаgе 2 (Сlопtесh) (1Ox) 5,0 мкл dNТР (2,5 мМ) 5,0 мкл праймер 10 мкМ 1,0 мкл кДНК (одноцепочечная) 1,0 мкл
Аdvаαtаgе 2 ДНК-полимераза (Сlопtесh.) 1,0 мкл стерильная деионизованная вода 37,0 мкл
Условия амплификации: 950C, 1,5 мин 1 цикл
950C, 20 с; 650C, 20 с; 720C, 3 мин 14-17-20-23 цикла
Для каждого образца подбирали количество циклов, позволяющих получать одинаковое количество амплифицированного материала.
Пример 5. Подбор условий определения уровня транскрипции гена ТIМРЗ в образцах тканей легких.
Протокол определения уровня транскрипции
При подборе условий определения уровней транскрипции для амплификации двуцепочечной кДНК использовали геноспецифичные праймеры TIMPЗ_F (SEQ Ш NO: 1) и TIMPЗ_R (SEQ Ш NO: 2), которые были подобраны к разным экзонам гена ТIМРЗ, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами. В этих условиях примеси геномной ДНК не влияют на результаты амплификации. Размер ПЦР-фрагмента составлял 279 п.н. Подбор условий проведения ПНР осуществляли на нескольких образцах кДНК. Все праймеры подобраны с помощью программы Ргimеr Dёsigпеr, разработанной в ИМБ РАН. Амплификацию проводили в 25 мкл смеси, содержащей: 67 мМ Трис-НСl, рН 8,8, 16,6 мМ (NI^)2SO4, 0,1% Тwееп- 20, 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из dNТР, 0,1 мкг кДНК, 0,2 мкМ каждого из праймеров, 2 ед. активности ДНК-полимеразы Вiо-Таq (Diаlаt Ltd., Москва). Условия проведения ПТТР; Состав реакционной смеси (25 мкл):
ПЦР-буфер (1Ox) 2,5 мкл
MgCl2 (25 мМ) 2,5 мкл dNТР (10 мМ) 0,5 мкл праймер TIMPЗ_F, 10 мкМ 0,5 мкл праймер ТIМРЗ R, 10 мкМ 0,5 мкл кДНК (О. l мкг/мкл) 1,0 мкл
ВiоТаq ДНК-полимераза, 5 ед/мкл 0,3 мкл стерильная деионизованная вода 17,2 мкл
Условия амплификации: 940C, 2 мин 1 цикл
940C, 30 с; 560C, 30 с; 720C, 45 с 27, 30 и 34 цикла 720C, 5 мин 1 цикл
Образцы кДНК нормировали по контрольному гену GAPDH, кодирующему белок глицepaльдeгид-3-фocфaт-дeгидpoгeнaзy. Использовали праймеры, подобранные к разным экзонам гена GAPDH, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами:
GAPDHJ: S'-GGАGТСААСGGАТТТGGТС-З1 и GAPDHJL: 5'-TGGGTGGAATCAT ATTGGAACAT-3 ',
Размер ПЦР-фрагмента составляет 139 п.н. Подбор условий проведения TTfTP осуществляли на нескольких образцах кДНК. Условия амплификации: предварительный прогрев при 940C 2 мин; 940C, 30 с, 560C, 30 с и 720C, 30 с - 28 и 30 циклов; 720C, 5 мин - 1 цикл.
ПЦР проводили на амплификаторе МаstеrСусlеr, Еррепdоrf (Германия) с нагревающейся крышкой или амплификаторе Терцик, ДНК-технология (Россия). Продукты амплификации анализировали в 1,8%-нoм агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромида этидия (см. Фиг. 1). В результате были подобраны оптимальные условия ОТ- ПЦР (27-30-33 циклов), при которых получали линейную зависимость между числом циклов и количеством продуктов ПЦР. Все реакции амплификации повторяли трижды.
Интенсивность флуоресценции полос после электрофоретического разделения продуктов ПЦР оценивали количественно с помощью программы для денситометрии фотографий GепеРrоfilеr (httр ://www/scanalytics.com) и выражали в виде значений относительной интенсивности норма/опухоль (N/Т).
Амплифицированные фрагменты гена ТIМРЗ клонировали в векторе pGEM®-T Еаsу (Рrоmеgа) и секвенировали. Их нуклеотидные последовательности полностью совпадали с последовательностями соответствующего фрагмента кДНК. Секвенирование проводили с помощью набора реактивов ABI РRISМ® ВigDуе™ Теrmiпаtоr v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant.
Пример 6. Определение уровня транскрипции гена ТIМРЗ в образцах нормальных и опухолевых тканей.
Протокол определения уровня транскрипции
1. Приготовить mаstеr-miх, смешав все компоненты ПЦР кроме матрицы. Mаstеr-miх следует готовить из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца + 1 дополнительная реакция объемом 25 мкл.
Состав реакционной смеси (25 мкл):
ПЦР-буфер (Юх) 2,5 мкл
MgCl2 (25 мМ) 2,5 мкл dNТР (10 мМ) 0,5 мкл праймер TIMPЗ_F, 10 мкМ 0,5 мкл праймер ТЖРЗ R, 10 мкМ 0,5 мкл кДНК 1,0 мкл
ВiоТаq ДНК-полимераза, (Diаlаt Ltd., Москва) 5 ед/мкл 0,3 мкл стерильная деионизованная вода 17,2 мкл
2. В пробирки на 0,6 мл (помеченные для проведения 30 циклов амплификации) добавить по 24 мкл mаstеr-miх.
3. Добавить в пробирки по 1 мкл матрицы, перемешать пипетированием несколько раз.
4. В отдельной пробирке (контроль) смешать 24 мкл mаstеr-miх и 1 мкл стерильной деионизованной воды. 5. Добавить в каждую пробирку по 1 капле минерального масла (MP Вiоmеdiсаls, LLC) и закрыть крышки пробирок (если ПЦР проводили на амгоiификаторе Терцик, ДНК-технология). В том случае, если ПЦР проводили на амплификаторе МаstегСусlег, Еррепdоrf, масло не добавляли.
6. Поместить пробирки в амплификатор и провести 27 циклов реакции амплификации.
7. После завершения реакции амплификации отобрать 4 мкл продуктов амплификации (27 циклов), продолжить реакции амплификации еще на 3 цикла, отобрать 4 мкл (30 циклов) и смешать с 2 мкл краски 6x Оrапgе Lоаdiпg Dуе. Таким же образом проводили реакции при 30 и 33 циклах. Наносили образцы на 1,8%-ный агарозный гель, содержащий 0,5 мг/л бромида этидия. Также наносили на гель маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (использовали ДНК шiазмиды pBR222/AluI, производства Сибэнзим, Россия). Гель-электрофорез проводили в ТВЕ-буфере, содержащим 10 мг/л бромида этидия. Длина разделения составляет 3-5 см геля. После гель-электрофореза визуализацию продуктов амплификации и их документирование проводить в ультрафиолете при длине волны 302 нм.
Результаты анализа уровня транскрипции гена ТIМРЗ.
Подсчет средних значений изменения уровней транскрипции исследуемых генов и стандартных ошибок проводили с помощью компьютерной программы SPSS 13.0 (SPSS Iпс, США). Достоверность наблюдаемых изменений оценивали, исходя из нормального распределения данных. Данные считали достоверными при P<0,05, где P - показатель статистической значимости (достоверности) данных.
Нами показано, что в 76% образцов НМРЛ уровень транскрипции понижен в 3 и более раз в опухолях по сравнению с условной нормой (р < 0,0001) (Фиг. 2 и Таблица). В девяти из 29-ти образцов транскрипция гена в опухолях практически отсутствует. В двух образцах транскрипция гена не обнаружена ни в опухолях, ни в прилежащих к ним тканях. Отсутствие транскрипции гена в образцах ткани, смежной с дисплазией, но морфологически нормальной, показывает возможность распространения опухолевых клеток в нормальные клетки. В шести образцах уровень транскрипции гена в опухолях приблизительно равен уровню в условной норме. Транскрипция гена обнаружена во всех 10-ти исследованных образцах нормальной легочной ткани. Связи между изменением уровня транскрипции гена TlMPS, гистологическими различиями и стадиями прогрессии опухоли не обнаружено, однако в опухолях ПРЛ с периферической локализацией наблюдали меньшее изменение уровня транскрипции гена по сравнению с нормой, чем в образцах центрального ПРЛ (Таблица). Возможно, что это связано с большей зависимостью развития центрального ПРЛ от курения пациентов, вредных условий их труда и других неблагоприятных факторов.
Настоящим изобретением также предусмотрено, что определение уровня транскрипции гена ТΪМРЗ будет полезным при мониторинге эффективности проводимой противораковой терапии, причем анализ способом настоящего изобретения следует проводить до начала и после окончания курса лечения, а также при необходимости по ходу курса лечения. Повышение уровня транскрипции гена TTMPS по ходу или по завершении курса лечения будет свидетельствовать о восстановлении активности гена-супрессора опухолевого роста ТIМРЗ, что может говорить о положительных сдвигах при лечении. Понижение уровня транскрипции гена ТIМРЗ будет свидетельствовать о дальнейшем подавлении активности гена, что может говорить об отсутствии эффективности лечения.
Таблица. Характеристика клинических образцов и изменение уровня транскрипции гена ТIМРЗ в образцах ПРЛ с центральной и периферической локализацией опухоли и AKJI по сравнению с условной нормой
Figure imgf000020_0002
Пояснения к таблице
Figure imgf000020_0001
понижение (>3 раз) уровня транскрипции гена ТIМРЗ уровень транскрипции не изменился или уменьшился незначительно (<3 раз)
Figure imgf000021_0001
отсутствие транскрипции в опухоли и в условной норме
TNM - клинико-морфологическая классификация опухолей:
T0--T4 - категории, отражающие местное распространение первичной опухоли; N0--NЗ - категории, отражающие различную степень метастатического поражения регионарных лимфатических узлов; M0-M1 - характеризуют наличие отдаленных метастазов. А - отсутствие метастазов, В - поражение одиночных лимфатических узлов, н. д. - нет данных.
Представленное выше подробное описание изобретения и его конкретных воплощений, приведенных в примерах со ссылкой на фигуры, предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Claims

Формула изобретения
1. Маркер для диагностики немелкоклеточного рака легких, представляющий собой уровень транскрипции гена 77MPЗ, где сниженный уровень в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легких.
2. Маркер по п. 1, где рак легких является плоскоклеточным раком легких.
3. Применение уровня транскрипции гена ТIМРЗ в качестве маркера для диагностики немелкоклеточного рака легких человека.
4. Применение по п. 3, где рак легких является плоскоклеточным раком легких.
5. Способ диагностики немелкоклеточного рака легких, включающий следующие стадии: а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей гистологически нормальной (условно-нормальной) ткани; б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов; в) синтез одноцепочечной или двуцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров; г) нормирование концентрации кДНК ТIМРЗ по контрольному гену, уровень транскрипции которого постоянен в норме и при раке легких; д) проведение количественной или полуколичественной реакции амплификации фрагмента гена TШ4PЗ с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров; е) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК ТIМРЗ для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают уровень транскрипции гена ТIМРЗ, причем уменьшение транскрипции гена ТIМРЗ служит диагностическим признаком рака легких.
6. Способ по п. 5, в котором рак легких представляет собой плоскоклеточный рак легких.
7. Способ по п. 5, в котором на стадии в) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза σдноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа oлигo(dT)-coдepжaщиx праймеров, случайных гексамеров или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.
8. Способ по п. 5, в котором для амплификации кДШС на стадии д) используют олигонуклеотидные праймеры, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК.
9. Способ по п. 8, в котором последовательность праймеров представлена SEQ Ш NO: 1 и 2.
10. Способ по п. 5, в котором на стадии д) количественная или полуколичественная реакция амплификации фрагмента гена TlMPS представляет собой ПНР в реальном времени или стандартную ОТ-ГЩР.
11. Способ по п. 5, в котором на стадии г) в качестве контрольного гена используют ген GAPDH, кодирующий белок глицepaльдeгид-3 -фосфат- дегидрогеназу.
12. Набор праймеров для осуществления полимеразной цепной реакции для определения уровня транскрипции гена ΗМРЗ, имеющих последовательность SEQ ID NO: I и 2.
PCT/RU2006/000430 2006-08-15 2006-08-15 Transcriptional level of a timp3 gene in the form of a diagnosis marker of a non-small cell carcinoma of lung Ceased WO2008024009A1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2006/000430 WO2008024009A1 (en) 2006-08-15 2006-08-15 Transcriptional level of a timp3 gene in the form of a diagnosis marker of a non-small cell carcinoma of lung
EA200701894A EA010571B1 (ru) 2006-08-15 2006-08-15 Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2006/000430 WO2008024009A1 (en) 2006-08-15 2006-08-15 Transcriptional level of a timp3 gene in the form of a diagnosis marker of a non-small cell carcinoma of lung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008024009A1 true WO2008024009A1 (en) 2008-02-28

Family

ID=39107023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2006/000430 Ceased WO2008024009A1 (en) 2006-08-15 2006-08-15 Transcriptional level of a timp3 gene in the form of a diagnosis marker of a non-small cell carcinoma of lung

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA010571B1 (ru)
WO (1) WO2008024009A1 (ru)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10240209B2 (en) 2015-02-10 2019-03-26 The Chinese University Of Hong Kong Detecting mutations for cancer screening
US10633713B2 (en) 2017-01-25 2020-04-28 The Chinese University Of Hong Kong Diagnostic applications using nucleic acid fragments
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US11581063B2 (en) 2015-07-23 2023-02-14 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of fragmentation patterns of cell-free DNA
US12234515B2 (en) 2017-07-26 2025-02-25 The Chinese University Of Hong Kong Enhancement of cancer screening using cell-free viral nucleic acids

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094629A2 (en) * 2000-06-05 2001-12-13 Avalon Pharmaceuticals Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets
WO2003052135A2 (en) * 2001-12-14 2003-06-26 Epigenomics Ag Method and nucleic acids for the analysis of a lung cell proliferative disorder

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094629A2 (en) * 2000-06-05 2001-12-13 Avalon Pharmaceuticals Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets
WO2003052135A2 (en) * 2001-12-14 2003-06-26 Epigenomics Ag Method and nucleic acids for the analysis of a lung cell proliferative disorder

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUICHEN FENG ET AL.: "Down-regulation and promoter methylation of tissue inhibitor of metalloproteinase 3 in choriocarcinoma", GYNECOLOGIC ONCOLOGY, vol. 94, no. 2, August 2004 (2004-08-01), pages 375 - 382 *
KURTIS E. ET AL.: "Methylation-associated Silencing of the Tissue inhibitor of Metalloproteinase-3 Gene Suggests a Suppressor Role in Kidney, Brain and Other Human Cancers", CANCER RESEARCH, 15 February 1999 (1999-02-15), pages 798 - 802 *
VAN DER VELDEN P.A. ET AL.: "Expression profiling reveals that methylation of TIMP is involved in uveal melanoma development", INT. J. CANCER, vol. 106, no. 4, 10 September 2003 (2003-09-10), pages 472 - 479 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US10240209B2 (en) 2015-02-10 2019-03-26 The Chinese University Of Hong Kong Detecting mutations for cancer screening
US11168370B2 (en) 2015-02-10 2021-11-09 The Chinese University Of Hong Kong Detecting mutations for cancer screening
US11581063B2 (en) 2015-07-23 2023-02-14 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of fragmentation patterns of cell-free DNA
US11605445B2 (en) 2015-07-23 2023-03-14 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of fragmentation patterns of cell-free DNA
US11615865B2 (en) 2015-07-23 2023-03-28 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of fragmentation patterns of cell-free DNA
US10633713B2 (en) 2017-01-25 2020-04-28 The Chinese University Of Hong Kong Diagnostic applications using nucleic acid fragments
US11479825B2 (en) 2017-01-25 2022-10-25 The Chinese University Of Hong Kong Diagnostic applications using nucleic acid fragments
US12234515B2 (en) 2017-07-26 2025-02-25 The Chinese University Of Hong Kong Enhancement of cancer screening using cell-free viral nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
EA010571B1 (ru) 2008-10-30
EA200701894A1 (ru) 2008-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Catarino et al. Quantification of free circulating tumor DNA as a diagnostic marker for breast cancer
Bashyam et al. Array-based comparative genomic hybridization identifies localized DNA amplifications and homozygous deletions in pancreatic cancer
EP2707506B1 (en) Method of detecting cancer through generalized loss of stability of epigenetic domains, and compositions thereof
CN106755344B (zh) 用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用
JP2019522478A (ja) 遺伝子発現プロファイルを用いた肺癌の診断のための組成物及び方法
AU2020445677B2 (en) Tumor detection reagent and kit
EP2808397B1 (en) Method for obtaining information on colon cancer and marker and kit for obtaining information on colon cancer
US10196696B2 (en) RNA-biomarkers for diagnosis of prostate cancer
WO2013038737A1 (ja) 膀胱癌細胞の検出方法、膀胱癌細胞の検出方法に用いるプライマー及び膀胱癌マーカ
CN108949992B (zh) 一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物
RU2351936C1 (ru) Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления
RU2324186C1 (ru) Способ диагностики плоскоклеточного рака легких и набор для его осуществления
WO2008024009A1 (en) Transcriptional level of a timp3 gene in the form of a diagnosis marker of a non-small cell carcinoma of lung
EP3227460B1 (en) Novel rna-biomarker signature for diagnosis of prostate cancer
RU2327162C1 (ru) Способ диагностики плоскоклеточного рака легких и набор для его осуществления
EP4689189A1 (en) Arrays targeting differentially accessible chromatin regions using quantitative polymerase chain reaction
RU2393472C1 (ru) Способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы и набор для его осуществления
RU2390780C1 (ru) Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления
RU2624505C1 (ru) Способ прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка
RU2374647C1 (ru) Способ диагностики рака толстой кишки и набор для его осуществления
RU2545998C2 (ru) Способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы и набор для его осуществления
RU2330285C1 (ru) Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления
Gurvich et al. Real-time PCR and multiplex approaches
RU2445627C1 (ru) Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления
EP4332240A1 (en) Rna-biomarkers for diagnosis of prostate cancer

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200701894

Country of ref document: EA

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 06847398

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06847398

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1