WO2008095623A2 - Sekretierte luziferase lu164m3 und deren verwendung - Google Patents

Sekretierte luziferase lu164m3 und deren verwendung Download PDF

Info

Publication number
WO2008095623A2
WO2008095623A2 PCT/EP2008/000625 EP2008000625W WO2008095623A2 WO 2008095623 A2 WO2008095623 A2 WO 2008095623A2 EP 2008000625 W EP2008000625 W EP 2008000625W WO 2008095623 A2 WO2008095623 A2 WO 2008095623A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
luciferase
luciferases
secreted
lul64m3
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2008/000625
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2008095623A3 (de
Inventor
Stefan Golz
Eugene Vysotski
Svetlana Markova
Ludmila Frank
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Bayer Healthcare AG
Bayer Schering Pharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Healthcare AG, Bayer Schering Pharma AG filed Critical Bayer Healthcare AG
Publication of WO2008095623A2 publication Critical patent/WO2008095623A2/de
Publication of WO2008095623A3 publication Critical patent/WO2008095623A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)

Definitions

  • the invention relates to the nucleotide and amino acid sequence, as well as the activity and use of the secreted luciferase Lul64M3, as well as the use of secreted luciferases.
  • Luminescence refers to the emission of photons in the visible spectral range, this being done by excited emitter molecules. In contrast to fluorescence, the energy is not supplied from outside in the form of radiation of shorter wavelength.
  • Chemo luminescence is a chemical reaction that leads to an excited molecule that glows when the excited electrons return to their ground state. When this reaction is catalyzed by an enzyme, it is called bioluminescence.
  • the enzymes involved in the reaction are generally referred to as luciferases.
  • the luciferases are peroxidases or mono- and dioxygenases.
  • the enzyme substrates which form the starting materials for the light-emitting products are called luciferins. They vary from species to species.
  • the quantum yield of the systems is between 0.1-0.9 photons per reacted substrate molecule.
  • Luciferases can be classified according to their origin or their enzymatic properties. Luciferases can also be distinguished by their substrate specificity. The most important substrates include coelenterazines and luciferin, as well as derivatives of both substances.
  • Luciferases which are released from the cytosol into the surrounding environment by the host organism as a recombinant or wiltype protein, are sometimes called secreted luciferases.
  • Table 1 shows an overview of secretory luciferases:
  • the secreted luciferase Lu 164 is also described in Markova et al. Of 2004. reporter systems
  • Reporter or indicator genes are generally genes whose gene products can easily be detected by simple biochemical or histochemical methods. There are at least two types of reporter genes.
  • Resistance genes are genes whose expression confers on a cell resistance to antibiotics or other substances whose presence in the growth medium leads to cell death when the resistance gene is absent.
  • reporter gene The products of reporter genes are used in genetic engineering as fused or unfused indicators. The most common
  • Reporter genes include beta-galactosidase (Alam et al., 1990), alkaline
  • Luminescence refers to the emission of photons in the visible spectral range, this being done by excited emitter molecules. In contrast to fluorescence, the energy is not supplied from outside in the form of radiation of shorter wavelength.
  • Chemiluminescence is a chemical reaction that leads to an excited molecule that glows when the excited electrons return to their ground state. When this reaction is catalyzed by an enzyme, it is called bioluminescence.
  • the enzymes involved in the reaction are generally referred to as luciferases.
  • Lul64M3 is therefore kinetically different from the previously described secreted luciferases from Metridia longa. Surprisingly, Lul64M3 can be used in combination with other coelenterazine-dependent or coelenterazine-independent luciferases because of its kinetic differentiation.
  • the luciferase has an altered activity distribution of the bioluminescent reaction due to the altered kinetic properties.
  • the Lul64M3 activity to be measured per second is significantly higher than LuI 64. This higher bioluminescence allows a higher sensitivity of the measurement method used, as a lower number of cells, less activation of Lul64M3 expression, or low substrate concentration Measurement clearly above the background signal allows.
  • the invention relates to the use of Lul64M3 to improve the sensitivity, the use of low cell counts or low substrate concentrations.
  • Lul64M3 The altered kinetic properties of Lul64M3 allow a differentiated kinetic evaluation of bioluminescence. In a continuous measurement over (for example) 90 seconds, different intervals can be used for the evaluation. By choosing the measuring window, a distinction can therefore be made between the luciferases.
  • the shape of the kinetic curve may vary depending on the experimental conditions chosen.
  • the length and selection of the measurement intervals can be based on the respective experimental conditions and can be used flexibly.
  • the total measuring time can also be flexibly selected on the basis of the data shown.
  • the invention relates to the kinetic evaluation of measurements of the bioluminescence activity of Lul64M3.
  • the invention relates to the kinetic evaluation of measurements of the bioluminescence activity of LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 and Lu52.
  • the invention relates to the kinetic evaluation of measurements of the bioluminescence activity of secreted luciferases.
  • the invention relates to the kinetic evaluation of measurements of the bioluminescence activity of proteins according to the invention.
  • the luciferase due to its altered properties, is particularly suitable for multiplex reactions.
  • the luciferase Lul64M3 shows a significantly faster kinetics compared to other luciferases, which enables a combination with other luminescent or non-luminescent measuring methods (readouts).
  • the luminescent systems do not mutually inhibit each other or the respective signals outshine.
  • the luminescence After activation of the first system (for example, by substrate addition), the luminescence must be returned to the initial level before the second reaction can be started. This is also necessary if both systems use independent substrates. Due to its fast kinetics, Lul64M3 significantly shortens the time between measurements. Inactivation of the reaction is not necessary. Since the luciferase Lul64M3 is a secreted luciferase, a combination with intracellular systems (such as Firefly luciferase) is possible.
  • FIG. 6 shows by way of example the combination of secreted luciferases (on the example of the luciferase LuI 64) from Metridia longa with the intracellular luciferase Firefly.
  • the luciferases can be expressed either in one or different cellular systems.
  • the luciferases Firefly and Lu 164 were each in vectors
  • CRE promoters stably expressed in CHO cells.
  • the cells were co-cultivated for measurement and the cAMP-dependent promoters by the addition of forskolin for 4
  • the invention relates to the use of Lul64M3 in multiplexed approaches using Lul64M3 in combination with one or more reporter genes or readouts.
  • the use of Lul64M3 in approaches for measuring several target genes is also according to the invention.
  • the invention relates to the use of Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 and Lu52 in multipex approaches in which Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 and Lu52 in combination with one or more reporter genes or readouts is used. Also useful in the invention is the use of LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6, and Lu52 in approaches to measuring multiple target genes.
  • the invention relates to the use of secreted luciferases in multipex approaches in which secreted luciferases are used in combination with one or more reporter genes or readouts.
  • the invention also relates to the use of secreted luciferases in batches for measuring a plurality of target genes.
  • the invention relates to the use of proteins according to the invention in multipex approaches in which proteins according to the invention are used in combination with one or more reporter genes or measurement techniques (readouts).
  • the invention also relates to the use of proteins according to the invention in batches for measuring a plurality of target genes.
  • the mutations and deletions were inserted using molecular biological methods.
  • the invention relates to the secreted luciferase Lul64M3 with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the invention also relates to the nucleic acid molecule shown in SEQ ID NO: 1.
  • the invention also relates to functional equivalents of the secreted luciferase Lul64M3.
  • Functional equivalents are those proteins that have comparable physicochemical or biochemical properties.
  • mutants of the Lul64M3 protein or for such encoding nucleic acids are according to the invention.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as a reporter gene for the technique of "high content screening” (HCS) .
  • HCS is an encroachment for modern microscopy technologies for cell analysis.
  • the characteristic feature of HCS methods is the quantitative detection of several parameters at the cellular or subcellular level
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as reporter gene for cellular systems especially for receptors, for ion channels, for transporters, for transcription factors or for inducible systems.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as reporter gene in bacterial and eukaryotic systems, especially in mammalian cells, in bacteria, in yeasts, in bakulo, in plants
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as a reporter gene for cellular systems in combination with bioluminescent or chemiluminescent systems especially systems with luciferases, with oxygenases, with phosphatases.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as a reporter gene for cellular systems in combination with bioluminescent or chemiluminescent systems especially systems with photoproteins and ionic indicators, especially aequorin, clytin, obelin, berovine and bolinopsin.
  • the secreted luciferase Lul64M3 turns out to be a marker protein, especially in the FACS (fluorescence activated cell sorter) sorting.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as a fusion protein especially for receptors, ion channels, transporters, transcription factors, proteinases, kinases, phosphodiesterases, hydrolases, peptidases, transferases, membrane proteins, glycoproteins.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable for immobilization, in particular by antibodies, by biotin, by magnetic or magnetizable carriers.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable for energy transfer systems such as FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistor), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence ) Systems.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable for labeling substrates or ligands specifically for proteases, for kinases, for transferases, for transporters, for ion channels and receptors.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable for expression in bacterial systems especially for titer determination, as substrates for biochemical systems especially for proteinases and kinases.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is useful as a marker specifically coupled to antibodies coupled to enzymes coupled to receptors coupled to ion channels and other proteins.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as a reporter gene in the pharmacological drug discovery, especially in HTS (High Throughput Screening).
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as components of detection systems especially for ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), for immunohistochemistry, for Western blot, for confocal microscopy.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the secreted luciferase Lul64M3 is useful as a marker for the analysis of interactions specifically for protein-protein interactions, for DNA-protein interactions, for DNA-RNA interactions, for RNA-RNA interactions, for RNA-protein interactions (DNA
  • the secreted luciferase Lul64M3 is useful as a marker or fusion protein for expression in transgenic organisms, especially in mice, in rats, in hamsters and other mammals, in primates, in fish, in worms, in plants.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as a marker or fusion protein for the analysis of embryonic development.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is useful as a marker via a coupling agent specifically via biotin, via NHS (N-hydroxysulfosuccimide), via CN-Br.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as a reporter coupled to nucleic acids, especially to DNA, to RNA.
  • the secreted luciferase Lul64M3 is suitable as a reporter coupled to proteins or peptides.
  • the nucleic acid or the peptide of the coupled protein Lul64M3 is suitable as probe especially for Northern blots, for Southern blots, for Western blots, for ELISA, for nucleic acid sequencing, for protein analyzes, chip analyzes.
  • the protein Lul64M3 is suitable as a marker of pharmacological formulations especially of infectious agents, of antibodies, of "small molecules".
  • the protein Lul64M3 is suitable for geological investigations specifically for marine, groundwater and river currents.
  • the protein Lul64M3 is suitable for expression in expression systems especially in in vitro translation systems, in bacterial systems, in yeast systems, in Bakulo systems, in viral systems, in eukaryotic systems.
  • the invention also relates to the purification of the protein Lul64M3 specifically as a wild-type protein, as a fusion protein, as a mutagenized protein.
  • the invention also relates to the use of Lul64M3 in the field of cosmetics especially bath preparations, lotions, soaps, body colors, toothpaste, body powders.
  • the invention also relates to the use of Lul64M3 for coloring especially food, bath additives, ink, textiles, plastics.
  • the invention also relates to the use of Lul64M3 for coloring paper, especially greetings cards, paper products, wallpaper, craft items.
  • the invention also relates to the use of Lul64M3 for coloring liquids especially for water pistols, for fountains, for drinks, for ice cream.
  • the invention also relates to the use of Lul64M3 for the manufacture of toys, especially finger paint, make-up, water pistols.
  • the invention relates to organisms containing a vector according to the invention.
  • the invention relates to organisms expressing a polypeptide of the invention.
  • the invention relates to organisms expressing a functional equivalent of Lul64M3.
  • the invention relates to methods for expression of the fluorescent polypeptides according to the invention in bacteria, eukaryotic cells or in in vitro expression systems.
  • the invention also relates to methods for purifying / isolating a polypeptide of the invention.
  • the invention relates to peptides having more than 5 consecutive amino acids, which are recognized immunologically by antibodies against the fluorescent proteins according to the invention.
  • the invention relates to the use of the fluorescent proteins according to the invention as marker and reporter gene, in particular for the pharmacological drug discovery and diagnostics.
  • the invention relates to the secreted luciferase Lul64M3 with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein Lul64M3 characterized in that its sequence comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 2, as well as functional fragments thereof.
  • the invention further provides a nucleic acid molecule which encodes a protein comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1, as well as functional fragments thereof.
  • a component of the invention is a recombinant RNA or DNA vector which comprises a nucleic acid as described in the preceding section.
  • a component of the invention is a method for expressing a polypeptide according to the invention in bacteria, eukaryotic cells, or in in vitro translation systems.
  • a component of the invention is the use of a nucleic acid according to the invention as marker or reporter gene also in combination with one or more other markers or reporter genes.
  • Also part of the invention is the use of a protein according to the invention as marker or reporter gene also in combination with one or more other markers or reporter gene proteins.
  • FIG. 2 shows the alignment of the luciferases Lul64M3 and Lul64.
  • the luciferase Lul64M3 represents a significantly shorter polypeptide than the wild-type enzyme Lul64.
  • mutants or derivatives of the luciferases Lu 164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered kinetic properties of the luminescence reaction.
  • mutants or derivatives are the changes or deletions in the region of the amino acids 18 and 58 of the luciferases Lu 164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 and Gaussia luciferase with altered kinetic properties of the luminescence reaction.
  • mutants or derivatives which are changes or deletions in the region of the amino acids 23 and 48 of the luciferases Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu 16, Lu52 and Gaussia luciferase with altered biochemical or physicochemical properties of the luminescence reaction.
  • mutants or derivatives are the changes or deletions in the region of amino acids 13 and 88 of the lucerases Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered kinetic properties of the luminescence reaction.
  • mutants or derivatives are the changes or deletions in the region of the amino acids 33 and 68 of the luciferases LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered kinetic properties of the luminescence reaction.
  • SPCS Single Plate Clone Selection
  • Secretory luciferases such as the luciferases of the invention, are useful as reporter genes for the identification of cell lines with recombinant genes.
  • stable reporter gene lines with a secretory luciferase e.g. Lul64M3 or Lu 164 made.
  • the luciferase expression can be regulated via promoters with responsive elements.
  • CRE elements cAMP responsive element
  • the change in cAMP concentration can be determined by the modulation of a recombinant or endogenous target gene (target).
  • target a recombinant or endogenous target gene
  • GPCR Gs-coupled G protein-coupled receptor
  • the cell line described above is transfected with the cDNA of the GPCR to be expressed.
  • the transfected cells are then seeded on microtiter plates (eg 384 or 1536 well plates) and the transfected cells are selected.
  • microtiter plates eg 384 or 1536 well plates
  • the GPCR is activated by the addition of the agonist, resulting in an increase in intracellular cAMP concentration in a Gs-coupled receptor. This cAMP increase in concentration leads to increased reporter gene expression.
  • the substrate in Coulenterazine Lul64M3 and Lul64
  • bioluminescence measurement without lysing the cells.
  • the medium-substrate mixture can be removed and the underlying cells are removed.
  • the removed cells are then available for further cultivation, cultivation and measurement.
  • conventional systems using intracellular reporter gene such as the Firefly luciferse
  • duplication or multiplication of the seed plate prior to measurement is necessary because the measurement destroys the cells and access to a copy plate becomes necessary. This can lead to duplication errors that can be avoided with the SPCS method.
  • the SPCS method allows 1.
  • FIG. 5 shows the result of a clone identification by means of the SPCS method.
  • LuI 64 As a secreted luciferase LuI 64 was used in the vector pASM.
  • the target gene of the clone to be identified was a Gs-coupled G-protein coupled receptor in the vector pcDNA3.
  • the chosen representation allows the induction factor for each clone to be determined directly at the chosen time and the corresponding clone to be isolated from the same hole.
  • the agonist, the culture conditions or the measurement systems parameters of later measurement methods may be included in the identification of the recombinant clones.
  • the invention relates to the use of Lul64M3 in the identification of cell clones by the SPCS method.
  • the invention relates to the use of the secreted luciferases LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 and Lu52 in the identification of cell clones according to the SPCS method.
  • the invention relates to the use of secreted luciferases in the identification of cell clones according to the SPCS method.
  • the invention relates to the use of proteins according to the invention in the identification of cell clones by the SPCS method.
  • the invention relates to the use of bioluminescent or non-bioluminescent reporter genes in the identification of clones according to the SPCS method.
  • the use of several measuring methods in an experimental approach allows the coupled measurement of different parameters or pharmacological target genes.
  • different reporter systems can be combined for this purpose.
  • the secreted luciferase Lul64M3, as well as the secreted luciferases from Metridia longa, can be combined with various intracellular and secreted reporters.
  • the combination of secreted and intracellular reporter genes is exemplified below.
  • the secreted luciferase LuI 64 was combined with the intracellular luciferase Firefly.
  • the luciferases were cloned into vectors which regulate cAMP-dependent expression of the luciferases (pASM vectors).
  • Both vectors were transfected into independent CHO cell lines and the cell lines stably cultured.
  • both cell lines were co-cultivated on microtiter plates and subsequently stimulated with forskolin.
  • forskolin leads to an increase in the intracellular cAMP concentration, which leads to the expression of the respective luciferase in both cell lines.
  • the microtiter plate was placed in a bioluminescence meter, which allows the addition of liquids within the meter (schematic representation in Figure 6 and 7). After the addition of the substrate of the secreted luciferase (here coelenterazine), the measurement was started.
  • the bioluminescence was measured for a time interval of 60 seconds. Subsequently, the second luciferase substrate (here firefly luciferin) was added in combination with a detergent (here Triton) to disrupt the cells. The addition of Triton stops the bioluminescence reaction of the secreted luciferase and lowers luminescence to the background level. The bioluminescence reaction of the firefly luciferase, which is uninfluenced by this, can subsequently be measured. The total measurement time was 150 seconds under the present conditions. This method can be carried out with Lul64M3, the secretory luciferases from Metridia longa, or other secretory luciferases or reporter genes.
  • Lul64M3 the secretory luciferases from Metridia longa, or other secretory luciferases or reporter genes.
  • the invention relates to the use of Lul64M3 in multiplex approaches.
  • the invention relates to the use of Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 and Lu52 in multiplex approaches.
  • the invention relates to the use of secreted luciferases in multiplex approaches.
  • the invention relates to the use of proteins according to the invention in multiplex mixtures.
  • SEQ ID NO: 1 (Lul64M3 nucleotide sequence)
  • SEQ ID NO: 3 (Lul64 - nucleotide sequence - coding)
  • FIG. 1 A first figure.
  • FIG. 1 shows the vector map of the construct pcDNA3-Lul64M3.
  • FIG. 2 shows an alignment Lul64M3 with LuI 64 at the amino acid level.
  • the figure shows the result of the bioluminescence measurement of Lul64M3 at a constant substrate concentration and decreasing concentration of Lul64M3 by dilution of the cell supernatant.
  • the figure shows the result of the bioluminescence measurement of LuI 64 at a constant substrate concentration and decreasing concentration of LuI 64 by dilution of the cell supernatant.
  • X-axis time in seconds.
  • Y axis relative light units (relative light units
  • the figure shows the use of secretory luciferases to identify clones according to the SPCS system.
  • the reporter gene used was the secreted luciferase LuI 64
  • the figure shows the schematic sequence of a cell-based multiplex approach using a secretory luciferase in combination with a non-secretory luciferase.
  • the figure shows the result of a cell-based multiplexing approach using a secretory luciferase in combination with a non-secretory luciferase using the kinetics of the various measurement sections. Indicated are the relative light units (relative light units
  • the plasmid pcDNA3.1 (+) from Clontech was used for consumptive expression.
  • the vector pASM contains cAMP responsive elements (CRE), which regulate the promoter activity as a function of the cAMP concentration.
  • CRE cAMP responsive elements
  • the derivative of the vector was named pASM-Lul64.
  • the derivative of the vector pcDNA3 was designated as pcDNA3-Lul64M3 or pcDNA3-Lul64M3.
  • the cloning was carried out using standard molecular biological methods.
  • the vectors pcDNA3-Lul64, pcDNA3-Lul64M3 and pASM-Lul64 were used to express Lul64M3 and Lul64 in eukaryotic systems.
  • FIG. 1 shows the plasmid map of the vector pcDNA3-Lul64M3.
  • Consumptive eukaryotic expression was carried out in CHO cells by transfecting the cells with the expression plasmids pcDNA3-Lul64M3, pcDNA3-Lul64 and pcDNA3 (without cDNA insertion) in transient experiments.
  • 10 000 cells per hole in DMEM-F 12 medium were plated on 96-well microtiter plates and incubated overnight at 37 0 C.
  • the transfection was carried out using the Fugene 6 kit (Roche) according to the manufacturer's instructions.
  • the transfected cells were incubated overnight at 37 ° C in DMEM-F12 medium.
  • the measurement of the bioluminescence results after substrate addition with an imaging system.
  • buffer A pH 7.4
  • the measurement of diluted supernatants was carried out in buffer A (pH 7.4) with the composition 130mM NaCl, 5mM KCl, 20mM Hepes, 1mM MgC12 x 6H2O and 5mM NaHCO3
  • the transfected cells were selected with 2 mg / ml geneticin and the bioluminescence activity of the clones or supernatants was determined.
  • FIG. 2 shows the alignment of the secreted luciferases at the amino acid level.
  • Christopoulos TK Verhaegent M, Recombinant Gaussia luciferase. Overexpression, purification, and analytical application of a bioluminescent reporter for DNA hybridization. Anal Chem. 2002, Sep; 74 (17): 4378-85.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft die Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung von Lu164M3, sowie der Verwendung von sekretierten Luziferasen.

Description

Sekretierte Luziferase Lul64M3 und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft die Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung der sekretierten Luziferase Lul64M3, sowie der Verwendung von sekretierten Luziferasen.
Luziferasen
Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.
Man unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemo lumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.
Eine Übersicht über lumineszierende Organismen findet sich bei Wilson & Hastings 1998.
Bei den Luziferasen handelt es sich um Peroxidasen oder Mono- und Dioxygenasen. Die Enzym-Substrate, die die Ausgangssubstanzen für die lichtemittierenden Produkte bilden, heißen Luciferine. Sie sind von Species zu Species unterschiedlich. Die Quantenausbeute der Systeme liegt zwischen 0,1-0,9 Photonen je umgesetztem Substratmolekül.
Luziferasen lassen sich aufgrund ihrer Herkunft oder ihrer enzymatischen Eigenschaften klassifizieren. Luziferasen lassen sich ebenfalls durch ihre Substratspezifität voneinander unterscheiden. Zu den wichtigsten Substraten gehören Coelenterazine und Luciferin, sowie Derivate beider Substanzen.
Luziferase Substrate
Im Folgenden werden die Strukturen einiger Luziferasesubstrate beispielhaft dargestellt : Coelenterazine
Figure imgf000003_0001
Coelenterazine f
Figure imgf000003_0002
Coelenterazine e
Figure imgf000003_0003
Coelenterazine cp
Figure imgf000003_0004
Coelenterazine h
Figure imgf000004_0001
Coelenterazine n
Figure imgf000004_0002
Firefly Luziferin
Figure imgf000004_0003
Cypridia Luziferin
Figure imgf000004_0004
Sekretierte Luziferasen
Luziferasen, die vom Wirtsorganismus als rekombinantes- oder wilttyp-Protein aus dem Cytosol ins umgebende Milieu abgegeben werden, bezeichnet mal als sekretierte Luziferasen. Tabelle 1 zeigt eine Übersicht über sekretortische Luziferasen:
Figure imgf000005_0001
Tabelle 1
Übersicht über sekretierte Luziferasen
Die sekretierte Luziferase Lu 164 ist ebenfalls beschrieben in Markova et al. 2004. Reportersysteme
Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.
1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
2. Reportergen. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten
Reportergenen gehört die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische
Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere
Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).
Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.
Man unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.
Sekretierte Luziferase Lul64M3
Bei der Suche nach Mutanten der sekretierten Luziferase Lu 164 aus Metridia longa wurde überraschenderweise eine Mutante identifiziert (im weiteren als Lul64M3 genannt) und kloniert, deren biochemische und physikochemische Eigenschaften sich deutlich von den bisher identifizierten Luziferase LuI 64 unterscheidet. Diese Eigenschaften werden im folgenden beschrieben :
Kinetik
Bei der Expression der sekretierten Luziferase Lul64M3 stellte sich überraschenweise heraus, das die Luziferase eine veränderte zeitliche Auflösung der Biolumineszenzreaktion (Kinetik) ausweißt. Der Verlauf der Biolumineszenzreaktion für Lul64M3 und Lul64 ist in Figur 3 gezeigt. Deutlich ist die wesentlich schnellere Kinetik von Lul64M3 zu erkennen. Lul64M3 zeigt schon nach wenigen Sekunden einen Abfall der zu messenden Lumineszenz pro Sekunde als Lul64. Nach 50 Sekunden sind bereits 65-80 % des Integralsignals von 90 Sekunden erfaßt. Lul64 zeigt einen wesentlich langsameren Abfall des Biolumineszenzsignals pro Sekunde, so daß auch noch nach 90 Sekunden ein deutliches Signal über Hintergrund meßbar ist. Lul64M3 unterscheidet sich daher kinetisch von den bisher beschriebenen sekretierten Luziferasen von Metridia longa. Lul64M3 kann aufgrund dieser Eigenschaft überraschenderweise in Kombination mit anderen Coelenterazin-abhängigen oder Coelenterazin-unabhängigen Luziferasen genutz werden, da eine kinetische Unterscheidung möglich ist.
Aktivität
Bei der Expression der sekretierten Luziferase Lul64M3 stellte sich überraschenweise heraus, das die Luziferase eine veränderte Aktivitätsverteilung der Biolumineszenzreaktion aufgrund der veränderten kinetischen Eigenschaften aufweist. Zu Beginn der Biolumineszenzreaktion ist die zu messende Aktivität von Lul64M3 pro Sekunde deutlich höher als von LuI 64. Diese höhere Biolumineszenz ermöglicht eine höhere Sensitivität der verwendeten Meßmethode, da eine geringere Anzahl an Zellen, eine geringere Aktivierung der Lul64M3-Expression oder eine geringer Substratkonzentration eine Messung deutlich über dem Hintergrundsignal ermöglicht.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lul64M3 zur Verbesserung der Sensitivität, der Verwendung geringer Zellzahlen oder geringer Substratkonzentrationen. Kinetische Auswertung
Die veränderten kinetischen Eigenschaften von Lul64M3 ermögliche eine differenzierte kinetische Auswertung der Biolumineszenz. Bei einer konkinuierlichen Messung über (zum Beispiel) 90 Sekunden können verschiedene Intervalle zur Auswertung herangezogen werden. Durch die Wahl des Messfensters kann daher zwischen den Luziferasen unterschieden werden. Die Form der Kinetikkurve kann in Abhängigkeit von den gewählten experimentellen Bedingungen variieren.
Die Länge und Auswahl der Messintervalle können sich an den jeweiligen Experimenten Bedingungen orientieren und sind flexible einsetzbar. Auch die Gesamtmesszeit ist aufgrund der dargestellten Daten flexible wählbar.
Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität von Lul64M3.
Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität von LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 und Lu52.
Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität sekretierter Luziferasen.
Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität von erfindungsgemäßen Proteinen.
Multiplexing
Bei der Expression der sekretierten Luziferase Lul64M3 stellte sich überraschenweise heraus, das sich die Luziferase aufgrund ihrer veränderten Eigenschaften besonders für Multip lex-Reaktionen eignet. Die Luziferase Lul64M3 zeigt im Vergleich zu anderen Luziferasen eine deutlich schnellere Kinetik, wodurch eine Kombination mit anderen lumineszenten oder nicht-lumineszenten Messmethoden (readouts) möglich wird.
Um lumineszente Messverfahren zu kombinieren, ist es notwendig, dass sich die lumineszenten Systeme nicht gegenseitig inhibieren oder die jeweiligen Signale überstrahlen. Nach der Aktivierung des ersten Systems (zum Beispiel durch Substratzugabe) muss die Lumineszenz auf das Ausgangsniveau zurückgegangen sein, bevor die zweite Reaktion gestartet werden kann. Dies ist auch notwendig, wenn beide Systeme unabhängige Substrate verwenden. Lul64M3 verkürzt aufgrund ihrer schnellen Kinetik den Zeitraum zwischen den Messung deutlich. Eine Inaktivierung der Reaktion ist nicht notwendig. Da es sich bei der Luziferase Lul64M3 um eine sekretierte Luziferase handelt, ist eine Kombination auch mit intrazellulären Systeme (wie zum Beispiel Firefly Luziferase) möglich.
Auch anderere Luziferasen von Metridia longa eignen sich zur Kombination mit intrazellulären Systemen wie der Firefly Luziferase. Allerdings ist ein Inaktivierungsschritt notwendig, um die Restbiolumineszenz auf ein niedriges Niveau abzusenken. Figur 6 zeigt beispielhaft die Kombination sekretierter Luziferasen (am Beispiel der Luziferase LuI 64) aus Metridia longa mit der intrazelluläre Luziferase Firefly. Hierbei könne die Luziferasen entweder in der einer oder verschiedenen zellulären Systeme expremiert werden. Im gewählten Beispiel wurden die Luziferasen Firefly und Lu 164 jeweils in Vektoren mit
CRE-Promotoren stabil in CHO Zellen expremiert. Die Zellen wurden zur Messung kokultiviert und die cAMP-abhängigen Promotoren durch die Zugabe von Forskolin für 4
Stunden unter Standardbedingungen inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von
Coelenterazin direkt zu den kultivierten Zellen. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe gestartet.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lul64M3 in multiplexen Ansätzen, bei denen Lul64M3 in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von Lul64M3 in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 und Lu52 in multipexen Ansätzen, bei denen Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 und Lu52 in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 und Lu52 in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene. Die Erfindung betrifft die Verwendung von sekretierten Luziferasen in multipexen Ansätzen, bei denen sekretierte Luziferasen in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von sekretierten Luziferasen in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen in multipexen Ansätzen, bei denen erfindungsgemäße Proteine in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.
Identifizierung der Luziferase LuI 64M3
Zur Herstellung der Mutanten wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen und Deletionen eingefügt.
Die Erfindung betrifft die sekretierte Luziferase Lul64M3 mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2. Ebenfalls betrifft die Erfindung das Nukleinsäuremolekül dargestellt in SEQ ID NO : 1.
Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente der sekretierten Luziferase Lul64M3. Funktionelle Äquivalente sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische oder biochemische Eigenschaften aufweisen.
Ebenfalls sind funktionelle Fragmente des Lul64M3 Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß.
Ebenfalls sind Mutanten des Lul64M3 Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß .
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Reportergen für die Technik des „high content Screening" (HCS). HCS steht als Übergriff für moderne Mikroskopie-Technologien zur Zellanalyse. Kennzeichnend für HCS-Verfahren ist die quantitative Erfassung mehrerer Parameter auf zellulärer oder subzellulärer Ebene Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Photoproteine und Ionenindikatoren, speziell Aequorin, Clytin, Obelin, Berovin und Bolinopsin.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 sich als sich als Markerprotein, speziell bei der FACS (Fluorescence activated cell sorter) Sortierung.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Fusionsproteine speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine, für Glykoproteine.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich für Systeme des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ,BRET- (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen. Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich zur Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen, für Transporter, für Ionenkanäle und Rezeptoren.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrate für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Komponenten von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mirkoskopie.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein- Wechselwirkungen, für DNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechslewirkungen (DNA
deoxyribonucleic acid; RNA
ribonucleic acid).
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Marker oder Fusionsproteine für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung. Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.
Die sekretierte Luziferase Lul64M3 eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.
Die an Nukleinsäure oder das Peptid des gekoppelten Protein Lul64M3 eignet sich als Sonde speziell für Northem-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip- Analysen.
Das Protein Lul64M3 eignet sich als Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".
Das Protein Lul64M3 eignet sich als für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.
Das Protein Lul64M3 eignet sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in- vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefen Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.
Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Protein Lul64M3 speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lul64M3 auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lul64M3 zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lul64M3 zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lul64M3 zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lul64M3 zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke, Wasserpistolen.
Die Erfindung betrifft Organismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.
Die Erfindung betrifft Organismen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid expremieren.
Die Erfindung betrifft Organismen, die ein funkionelles Äquivalente von Lul64M3 expremieren.
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides.
Die Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die erfindungsgemäßen fluoreszierende Proteine erkannt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine als Marker- und Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Die Erfindung betrifft die sekretierte Luziferase Lul64M3 mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2 und der Nukleotidsequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 1.
Erfindungsgemäß ist ein Protein Lul64M3, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 umfasst, sowie funktionelle Fragmente desselben. Erfindungsgemäß ist des weiteren ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Protein kodiert, dass die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 umfasst, sowie funktionelle Fragmente desselben.
Bestandteil der Erfindung ist ein rekombinanter RNA oder DNA- Vektor, welcher eine Nukleinsäure wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben umfasst.
Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Expression eines erfmdungsgemäßen Polypeptides in Bakterien, eukaryontischen Zellen, oder in in vitro Translationssystemen.
Bestandteil der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure als Marker oder Reportergen auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Marker oder Reportergenen.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins als Marker oder Reportergen auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Marker oder Reportergenproteinen..
Mutanten und Derivate sekretorischer Luziferasen
m Figur 2 ist das Alignment der Luziferasen Lul64M3 und Lul64 dargestellt. Die Luziferase Lul64M3 stellt eine deutlich kürzeres Polypeptid dar, als das wildtyp Enzym Lul64.
Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate der Luziferasen Lu 164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 18 und 58 der Luziferasen Lu 164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu 16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 und 48 der Luziferasen Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu 16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 und 88 der Luziferasen Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 33 und 68 der Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Klonidentifizierung mit Sekretierten Luziferasen
Single Plate Clone Selection (SPCS)
Sekretorische Luziferasen, wie die erfindungsgemäßen Luziferasen, eignen sich als Reportergen zur Identifizierung von Zelllinien mit rekombinanten Genen. Hierzu werden stabile Reportergenzeillinien mit einer sekretorischen Luziferase wie z.B. Lul64M3 oder Lu 164 hergestellt. Die Luziferaseexpression kann über Promo toren mit responsive Elementen reguliert werden. Durch Detektion der intrazellulären cAMP-Konzentration können CRE-Elemente (cAMP responsive element
CRE) verwendet werden. Mit Hilfe einer solchen Zelllinie kann die Veränderung der cAMP-Konzentration durch die Modulation eines rekombinanten oder endogenen Zielgens (Targets) bestimmt werden. Zur Identifizierung von Zelllinien, die z.B. ein Gs gekoppelten G-Protein gekoppelten Rezeptor (GPCR) rekombinant expremieren, wird die oben beschriebene Zelllinie mit der cDNA des zu expremierenden GPCRs transfiziert. Die transfizierten Zellen werden anschließend auf Mikrotiterplatten (z.B. 384 oder 1536 Loch Platten) ausgesät und die transfizierten Zellen selektioniert. Sind ausreichend Zellen gewachen, wird der GPCR durch Zugabe des Agonisten aktiviert, was bei einem Gs- gekoppelten Rezeptor zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP Konzentration führt. Dieser cAMP -Konzentrationsanstieg führt zu einer erhöhten Reportergenxpression. Bei sekretorischen Luziferasen kann deren enzymatische Aktivität direkt durch Zugabe des Substrates (bei Lul64M3 und Lul64 ist dies Coelenterazine) und anschließender Biolumineszenzmessung bestimmt werden, ohne die Zellen zu lysieren. Nach der Messung kann das Medium-Substratgemisch abgenommen und die darunterliegenden Zellen entnommen werden. Die entnommen Zellen stehen dann zur weiteren Kultivierung, Anzucht und Messung zur Verfügung. Bei herkömmlichen Systemen, die intrazelluläre Reportergen wie z.B. die Firefly Luziferse, verwenden, ist eine Dublizierung oder Multiplizierung der Aussaatplatte vor der Messung notwendig, da die Messung die Zellen zerstört und der Zugriff auf eine Kopieplatte notwendig wird. Hierbei können Dublikationsfehler auftreten, die mit der SPCS Methode vermeidbar sind. Die SPCS Methode ermöglicht 1. Verwendung einer deutlich nierigeren Anzahl an Mikrotiterplatten durch das fehlen der Dublikations- oder Multiplikationsschrittes, 2. Zeitersparnis durch das Fehlen des Dublikations- bzw. Multiplikationsschrittes mit der anschließenden Wachstumsphase, 3. direkte kinetische Auswertung einzelner Klone, 4. Materialersparnis, 5. direktes picken des gemessenen Klones in der bestehenden Wachstumsphase und Klonzusammensetzung.
In Figur 5 ist das Ergebnis einer Klonidentifizierung mit Hilfe der SPCS-methode dargestellt. Als sekretierte Luziferase wurde LuI 64 im Vektor pASM verwendet. Als Zielgen des zu identifizierenden Klons wurde ein Gs gekoppelter G-Protein gekoppelter Rezeptor im Vektor pcDNA3 verwendet. Durch die gewählte Darstellung kann der Induktionsfaktor für jeden Klon zu dem gewählten Zeitpunkt direkt bestimmt und der entsprechende Klon aus dem gleichen Loch isoliert werden. Durch die Festlegung z.B. des Messzeitpunktes, des Agonisten, der Kulturbedingungen oder der Messsysteme können Parameter späterer Messverfahren bei der Identifizierung der rekombinanten Klone mit einbezogen werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lul64M3 bei der Identifizierung Zellklonen von nach der SPCS-Methode. Die Erfindung betrifft die Verwendung der sekretierten Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 und Lu52 bei der Identifizierung von Zellklonen nach der SPCS- Methode.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von sekretierten Luziferasen bei der Identifizierung von Zellklonen nach der SPCS-Methode.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen bei der Identifizierung Zellklonen von nach der SPCS-Methode.
Die Erfindung betrifft de Verwendung von biolumineszenten oder nicht biolumineszenten Reportergenn bei der Identifizierung von Klonen nach der SPCS-Methode.
Multiplex-Reaktionen mit sekretorsichen Luziferasen
Die Verwendung mehrerer Messverfahren in einem experimentellen Ansatz, ermöglicht die gekoppelte Messung verschiedenener Parameter oder pharmakologischer Zielgene. In zellbasierten Ansätzen können hierzu verschiederen Reportersysteme kombiniert werden. Die sekretierten Luziferase Lul64M3, sowie die sekretierten Luziferasen aus Metridia longa, können hierbei mit verschiedenen intrazellulären und sekretierten Reportern kombiniert werden. Die Kombination aus sekrertierten und intrazellulären Reportergenn wird im Folgenden beispielhaft vorgestellt. In einem zeilbasierten Ansatz wurden die sekretierte Luziferase LuI 64 mit der intrazellulären Luziferase Firefly kombiniert. Hierzu wurden die Luziferasen in Vektoren kloniert, die cAMP-abhängig die Expression der Luziferasen reguliert (pASM - vektoren). Beide Vektoren wurden in unabhängigen CHO Zelllinien transfiziert und die Zelllinien stabil kultiviert. Zur Durchführung einer Multiplex-Messung wurden beide Zelllinien auf Mikrotiterplatten kokultiviert und anschliessend mit Forskolin stimmuliert. Forskolin führt durch die Aktivierung der Adenylatzyklase zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP -Konzentration, die in beiden Zelllinien zur Expression der jeweiligen Luziferase führt. Zur Messung wurde die Mikrotiterplatte in ein Biolumineszenzmeßgerät eingebracht, das die Zugabe von Flüssigkeiten innerhalb des Messgerätes ermöglicht (schematische Darstellung in Figur 6 und 7). Nach der Zugabe des Substrates der sekrertierten Luziferase (hier Coelenterazine), wurde die Messung gestartet. Die Biolumineszenz wurde für ein Zeitinterval von 60 Sekunden gemessen. Anschließend erfolgte die Zugabe des zweiten Luziferasesubstrates (hier Firefiy Luziferin) in Kombination mit einem Detergenz (hier Triton) zum Aufschluß der Zellen. Durch die Zugabe von Triton wird die Biolumineszenzreaktion der sekretierten Luziferase gestoppt und Lumineszenz auf das Hintergrundniveau abgesengt. Die hiervon unbeeinflusste Biolumineszenzreaktion der Firefiy Luziferase kann anschließend gemessen werden. Die gesamte Messzeit betrug unter den vorliegenden Bedingungen 150 Sekunden. Dieses Verfahren kann sowohl mit Lul64M3, den sekretorischen Luziferasen von Metridia longa, oder anderen sekretorischen Luziferasen oder Reportergenn durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lul64M3 in Multiplex- Ansätzen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 und Lu52 in Multiplex-Ansätzen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von sekretierten Luziferasen in Multiplex- Ansätzen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen in Multiplex- Ansätzen.
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO:1 (Lul64M3 - Nukleotidsequenz)
5'-
GATTCAAACAACTGGATCCAAAAGGAAAGGTACTCAAAGTATTACCTGGAGGA AACATGGATATAAAGGTTGTCTTTACTCTTGTTTTCTCAGCATTGGTTCAGGCA CAGAAGACCGATATTGCAGATACTGATAGAGCCAGCAACTTTGTTGCAACTGA AACCGATGCTAACCGTGGAAAAATGCCTGGCAAAAAACTGCCACTGGCAGTTA TCATGGAAATGGAAGCCAATGCTTTCAAAGCTGGCTGCACCAGGGGATGCCTT ATCTGTCTTTCAAAAATAAAGTGTACAGCCAAAATGAAGGTGTACATTCCAGG AAGATGTCATGATTATGGTGGTGACAAGAAAACTGGACAGGCAGGAATAGTTG GTGCAATTGTTGACATTCCCGAAATCTCTGGATTTAAGGAGATGGCACCCATG GAACAGTTCATTGCTCAAGTTGATCGTTGCGCTTCCTGCACTACTGGATGTCTC AAAGGTCTTGCCAATGTTAAGTGCTCTGAACTCCTGAAGAAATGGCTGCCTGA CAGATGTGCAAGTTTTGCTGACAAGATTCAAAAAGAAGTTCACAATATCAAAG GCATGGCTGGAGATCGTTGAATAAATCTGGCAGAACTATGCAATGGATAAAAC CTGGCAGAATAATGCAATGAATAACTGGATAATGATACACTTGCCTAATGCTA AAAACTGGCCATTTTTTCTCAATGATTATGCTTGTCTTTGTCTTGAAAATAATG AAAT AATGTTTAAT ATGTAAACT AATAAATGACGTC ATGCTAAAAAAAAA -3 Λ
Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von:
SEQ ID NO:2 (LuI 64M3 - Aminosäuresequenz)
MDIKWFTLVFSALVQAQKTDIADTDRASNFVATETDANRGKMPGKKLPLAVIMEMEANAF KAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMAP MEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
SEQ ID NO:3 (Lul64 - Nukleotidsequenz - kodierend)
5'-
ATGGATATAAAGGTTGTCTTTACTCTTGTTTTCTCAGCATTGGTTCAGGCAAAATCAACTG AATTCGATCCTAACATTGACATTGTTGGTTTAGAAGGAAAATTTGGTATAACAAACCTTGA GACGGATTTATTCACAATATGGGAGACAATGGAGGTCATGATCAAAGCAGATATTGCAGAT ACTGATAGAGCCAGCAACTTTGTTGCAACTGAAACCGATGCTAACCGTGGAAAAATGCCTG GCAAAAAACTGCCACTGGCAGTTATCATGGAAATGGAAGCCAATGCTTTCAAAGCTGGCTG CACCAGGGGATGCCTTATCTGTCTTTCAAAAATAAAGTGTACAGCCAAAATGAAGGTGTAC ATTCCAGGAAGATGTCATGATTATGGTGGTGACAAGAAAACTGGACAGGCAGGAATAGTTG GTGCAATTGTTGACATTCCCGAAATCTCTGGATTTAAGGAGATGGCACCCATGGAACAGTT CATTGCTCAAGTTGAACGTTGCGCTTCCTGCACTACTGGATGTCTCAAAGGTCTTGCCAAT GTTAAGTGCTCTGAACTCCTGAAGAAATGGCTGCCTGACAGATGTGCAAGTTTTGCTGACA AGATTCAAAAAGAAGTTCACAATATCAAAGGCATGGCTGGAGATCGTTGA
-3λ Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von : SEQ ID NO:4 (Lul64 - Aminosäuresequenz)
MDIKWFTLVFSALVQAKSTEFDPNIDIVGLEGKFGITNLETDLFTIWETMEVMIKADIAD TDRASNFVATETDANRGKMPGKKLPLAVIMEMEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVY I PGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDI PEI SGFKEMAPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLAN VKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
Beschreibung der Figuren
Figur 1
Die Figur 1 zeigt die Vektorkarte des Konstruktes pcDNA3-Lul64M3.
Figur 2
Die Figur 2 zeigt ein Alignment Lul64M3 mit LuI 64 auf Aminosäureebene.
Figur 3
Die Figur zeigt das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von Lul64M3 bei einer konstanten Substratkonzentration und abnehmender Konzentration an Lul64M3 durch Verdünnung des Zellüberstandes. X-Achse
Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units
RLU). Legende
■ Angabe und Zuordnung des Verdünnungsfaktor (ausgehend vom unverdünnten Überstand).
Figur 4
Die Figur zeigt das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von LuI 64 bei einer konstanten Substratkonzentration und abnehmender Konzentration an LuI 64 durch Verdünnung des Zellüberstandes. X-Achse: Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units
RLU). Legende: Angabe und Zuordnung des Verdünnungsfaktor (ausgehend vom unverdünnten Überstand). Figur 5
Die Figur zeigt die Verwendung der sekretorischen Luziferasen zur Identifizierung von Klonen nach dem System SPCS. X-Achse
Klonnummer (clone) in logarithmischer Darstellung. Yl (linke Y-Achse)
relative Lichteinheiten (relative light units
RLU). Y2 (rechte Y-Achse)
Induktionsfaktor zwischen der Biolumineszenzreaktion mit und ohne Agonisten des Zielgens. Als Reportergen wurde die sekretierte Luziferase LuI 64 verwendet
Figur 6
Die Figur zeigt den schematischen Ablauf eines zellbasierenden Multiplex- Ansatzes unter Verwendung einer sekretorischen Luziferase in Kombination mit einer nicht-sekretorsichen Luziferase.
Figur 7
Die Figur zeigt das Ergebnis eines zeilbasierten Multiplex-Ansatzes unter Verwendung einer sekretorischen Luziferase in Kombination mit einer nicht-sekretorsichen Luziferase anhand der Kinetiken der verschiedenen Messabschnitte. Angegeben sind die relative Lichteinheiten (relative light units
RLU, X-Achsen) pro Zeitintervall (Y-Achsen
Zeit in Sekunden). Bei der Messung handelt es sich um einen Messvorgang von insgesamt 150 Sekunden. Beispiele
Beispiel 1
Herstellung und Verwendung der Konstrukte
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech zur konsumtiven Expression verwendet. Zur Detektion von Veränderungen der intrazellulären cAMP Konzentration, wurde die cDNA von Lu 164 in den Vektor pASM kloniert. Der Vektor pASM enthält cAMP responsive Elemente (CRE), die die Promotoraktivität in Abhängigkeit von der cAMP Konzentration reguliert. Das Derivat des Vektors wurde als pASM-Lul64 bezeichnet. Das Derivat des Vektors pcDNA3 wurde als pcDNA3-Lul64M3 bzw. pcDNA3-Lul64M3 bezeichnet. Die Klonierungen erfolgte unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden. Die Vektoren pcDNA3-Lul64, pcDNA3-Lul64M3 und pASM-Lul64 wurden zur Expression von Lul64M3 und Lul64 in eukaryotischen Systemen verwendet.
Die Figur 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-Lul64M3.
Beispiel 2
Eukarvotische Expression
Die konsumtive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-Lul64M3, pcDNA3-Lul64 und pcDNA3 (ohne cDNA Insertion) in transienten Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F 12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 370C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM-F 12 Medium inkubiert. Die Messung der Biolumineszenz erfolge nach Substratzugabe mit einem Imaging-System. Die Messung verdünnter Überstaände erfolgte in Puffer A (pH 7,4) mit der Zusammensetzung 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM Hepes, 1 raM MgC12 x 6H2O und 5 mM NaHCO3
Zur Herstellung stabiler Zelllinien wurden die transfizierten Zellen mit 2 mg/ml Geneticin selektioniert und die Biolumineszenzaktivität der Klone bzw. Überstände bestimmt.
Beispiel 3
Sequenzvergleich
Um die Sequenzen der sekretierten Luziferasen vergleichen und darstellen zu können, wurde ein Alignment der Aminosäuresequenzen durchgeführt. Die Figur 2 zeigt das Alignment der sekretierten Luziferasen auf Aminosäureebene.
Literatur / Patente
WO0242470 Al
Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997); Gapped BLAST and PSI- BLAST: a new generation of protein database search programs; Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Λ«α/ Biochem. 1990 Aug l;188(2):245-54
Christopoulos TK. Verhaegent M, Recombinant Gaussia luciferase. Overexpression, purification, and analytical application of a bioluminescent reporter for DNA hybridization. Anal Chem. 2002 Sep l;74(17):4378-85.
Cullen Bryan R., Malim Michael H., Secreted placental alkaline Phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Methods in Enzymology. 216:362ff
Svetlana V. Markova, Stefan GoIz, Ludmila A. Frank, Bernd Kalthof, Eugene S. Vysotski, Cloning and Expression of cDNA for a Luciferase from the Marine Copepod Metridia longa. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 5, Issue of January 30, pp. 3212-3217, 2004
Phillips GN. Structure and dynamics of green fluorescent protein. Curr Opin Struct Biol. 1997 Dec;7(6):821-7
Shimomura O., Bioluminescence in the sea: photoprotein Systems. Symp Soc Exp Biol. 1985;39:351-72.
Snowdowne KW, Borle AB. Measurement of cytosolic free calcium in mammalian cells with aequorin. Am JPhysiol. 1984 Nov;247(5 Pt l):C396-408. Tsuji FI, Lynch RV 3rd, Stevens CL, Some properties of luciferase from the bioluminescent crustacean, Cypridina hilgendorfii. Biochemistry. 1974 Dec 3;13(25):5204- 9.
Therese Wilson and J. Woodland Hastings, Bioluminescence. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. 14:197-230
Yang Te-Tuan, Sinai Parisa, Kitts Paul A. Kain Seven R., Quantifϊcation of gene expresssion with a secreted alkaline Phosphatase reporter System. Biotechnique. 1997 23(6) l l lOff

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 umfasst;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz umfassen;
c) Fragmenten der Nukleinsäuremoleküle gemäß a) oder b), wobei die Fragmente funktionelle Luziferasen kodieren und den Bereich der Aminosäuren 17-20 (AQKT) bezogen auf SEQ ID NO:2 umfassen.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, welche einen funktionalen Promotor 5λ zur das Photoprotein kodierenden Sequenz enthält.
3. Rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche Nukleinsäuren nach Anspruch 2 enthalten.
4. Eukaryontische oder prokaryontische Zelle oder ein nicht humaner Organismus, einen Vektor gemäß Anspruch 3 enthaltend.
5. Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch oder komplementär zu einer Teilsequenz eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 1 sind.
6. Polypeptid, das durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert ist.
7. Verfahren zur Expression der Luziferase Polypeptide gemäß Anspruch 6 in Bakterien, eukaryotischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
8. Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines Luziferase Polypeptides gemäß Anspruch 6.
9. Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die Luziferase MLuc7 erkannt werden.
10. Verwendung einer eine Luziferase kodierende Nukleinsäure gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 als Marker- oder Reportergen.
11. Verwendung einer Luziferase gemäß Anspruch 6 als Marker oder Reporter.
12. Antikörper, der spezifisch eine Luziferase gemäß Anspruch 6 erkennt.
13. Verwendung gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei neben der Luziferase MLuc7 mindestens ein weiteres Reportergen eingesetzt wird.
14. Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte und/oder zelluläre Luziferasen handelt.
15. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte Luziferasen handelt.
16. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um die firefly Luziferase, oder um Luziferasen aus dem Organismus Metridia longa handelt.
17. Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei den weiteren sekretierten Luziferasen um Luziferasen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu 16 und Lu52 handelt.
18. Verfahren gemäß Ansprüchen 10, 11, oder 13, wobei die Lumineszenzmessungen kinetisch ausgewertet werden.
19. Verfahren gemäß Ansprüchen 10,11, 13 oder 18, wobei mehrere Zielproteine gemessen werden.
20. Verfahren zur Identifizierung von Zelllinien mit rekombinanten Genen, dadurch gekennzeichnet, dass eine sekretierte Luziferase als Reportergen eingesetzt wird und dass die Luziferase-Aktivität aus dem Überstand der kultivierten Zellen ermittelt wird.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei es sich bei den sekretierten Luziferasen um eine Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MLuc7, LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 und Lu52 handelt.
PCT/EP2008/000625 2007-02-06 2008-01-26 Sekretierte luziferase lu164m3 und deren verwendung Ceased WO2008095623A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007005804.9 2007-02-06
DE200710005804 DE102007005804A1 (de) 2007-02-06 2007-02-06 Sekretierte Luziferase Lu164M3 und deren Verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2008095623A2 true WO2008095623A2 (de) 2008-08-14
WO2008095623A3 WO2008095623A3 (de) 2008-11-20

Family

ID=39323759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2008/000625 Ceased WO2008095623A2 (de) 2007-02-06 2008-01-26 Sekretierte luziferase lu164m3 und deren verwendung

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102007005804A1 (de)
WO (1) WO2008095623A2 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013544100A (ja) * 2010-12-03 2013-12-12 ジーン・ストリーム・ピーティワイ・リミテッド 改良光放射分子
CN116536354A (zh) * 2022-09-27 2023-08-04 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种欧洲海鲈npffr2重组质粒、细胞系及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT508478B1 (de) 2009-06-26 2012-01-15 Tdw Delaware Inc Sensorarray für die inspektion der innenwand eines rohres

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10058091A1 (de) 2000-11-23 2002-06-06 Bayer Ag Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung
WO2006061906A1 (ja) * 2004-12-09 2006-06-15 Nec Soft, Ltd. 新規なルシフェラーゼをコードする遺伝子

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013544100A (ja) * 2010-12-03 2013-12-12 ジーン・ストリーム・ピーティワイ・リミテッド 改良光放射分子
EP2646548A4 (de) * 2010-12-03 2014-05-14 Gene Stream Pty Ltd Verbesserte lichtemittierende moleküle
AU2011335901B2 (en) * 2010-12-03 2016-12-15 Gene Stream Pty Ltd Improved light-emitting molecules
US10428317B2 (en) 2010-12-03 2019-10-01 Gene Stream Pty Ltd Light-emitting molecules
US11661587B2 (en) 2010-12-03 2023-05-30 Promega Corporation Light-emitting molecules
CN116536354A (zh) * 2022-09-27 2023-08-04 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种欧洲海鲈npffr2重组质粒、细胞系及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
DE102007005804A1 (de) 2008-08-07
WO2008095623A3 (de) 2008-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60203123T2 (de) Photoprotein mit verbesserter Biolumineszenz
EP2126057A2 (de) Sekretierte luziferase mluc7 und deren verwendung
US7223550B2 (en) Biosensor for defecting chemical agents
WO2008095623A2 (de) Sekretierte luziferase lu164m3 und deren verwendung
EP1339853B1 (de) Isolierte luziferasen sowie deren verwendung
EP1664102B1 (de) Isoliertes photoprotein mtclytin, sowie dessen verwendung
EP1572732B1 (de) Isoliertes fluoreszierendes protein aus clytia gregaria cgfp, sowie dessen verwendung
US12613237B2 (en) Biosensors for detecting arrestin signaling
DE10328067A1 (de) Isoliertes Photoprotein Bolinopsin, sowie dessen Verwendung
DE10339567A1 (de) Isoliertes Photoprotein Berovin, sowie dessen Verwendung
DE102005022146A1 (de) Isoliertes Photoprotein AQdecay sowie dessen Verwendung
WO2008107104A1 (de) Isoliertes photoprotein mtclytindecay, sowie dessen verwendung
WO2006081976A1 (de) MUTANTEN DES FLUORESZIERENDEN PROTEINS CGFPs, SOWIE DEREN VERWENDUNG
WO2006108518A1 (de) Isoliertes photoprotein gr-bolinopsin, sowie dessen verwendung
DE102006026586A1 (de) Fluoreszierende Proteine wfCGFP, sowie deren Verwendung
WO2016038750A1 (ja) 分割型組換えルシフェラーゼ及びそれを用いた解析方法
DE102004035687A1 (de) Isoliertes Photoprotein Aequorin Y89F, sowie dessen Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08707331

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08707331

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2