WO2009000764A2 - Verfahren und schnelltest zum nachweis spezifischer nukleinsäuresequenzen - Google Patents

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WO2009000764A2 PCT/EP2008/057857 EP2008057857W WO2009000764A2 WO 2009000764 A2 WO2009000764 A2 WO 2009000764A2 EP 2008057857 W EP2008057857 W EP 2008057857W WO 2009000764 A2 WO2009000764 A2 WO 2009000764A2
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method and a test kit for detecting specific nucleic acid sequences comprising the steps of amplification, hybridization by means of probes and the detection of the hybridization event, wherein the detection of the hybridization reaction takes place outside the reaction vessel of the amplification / hybridization on a solid phase.
  • Genetic diagnostics has become an indispensable part of modern medical laboratory diagnostics, forensic diagnostics, veterinary laboratory diagnostics or food and environmental diagnostics. Genetic diagnostics have been revolutionized with the invention of PCR technology, which allows to specifically multiply any nucleic acid sequence. Using PCR, there are a variety of methods that in combination with the PCR technology also allow specific detection of successful amplification. In particular, the specifications of an exact genetic diagnosis must use procedures that ensure that a generated Amplif ⁇ kationseck also corresponds to the specific target sequence to be detected. The widespread use of the visualization of a PCR product by gel electrophoresis is not sufficient.
  • a possibility, which is in principle very fast and can be realized without great experimental effort, for the detection of specific nucleic acids can be achieved by the so-called real-time PCR methods.
  • the amplification reaction is directly coupled with the actual detection reaction.
  • a widely used method for the detection of specific nucleic acids is the light cycler technology (Roche).
  • the Roche company developed special hybridization probes consisting of two different oligonucleotides, each labeled with only one fluorochrome. At the 3 "end of one probe is the acceptor, the other oligonucleotide is provided at the 5" end with a donor.
  • the probes are chosen so that they both bind to the same strand of DNA, the distance between the acceptor and donor may only be a maximum of 1 to 5 nucleotides, so that it can come to the so-called. FRET effect.
  • the measurement of the fluorescence takes place during the Annealing suitses, wherein only light of this wavelength is detectable, as long as both
  • Probes are bound to the DNA.
  • the melting point of both probes should be identical in this system.
  • the specificity of this detection system is extremely high.
  • Double Dye Probes carry two fluorochromes on a probe.
  • the reporter dye is here at the 5 ⁇ - end, the quencher dye at the 3 "end.Additionally, at the 3" end of the probe may still have a phosphate group, so that the probe during elongation can not act as a primer.
  • the polymerase hits the probe and hydrolyzes it polymerase to hydrolyze an oligonucleotide (or probe) during strand synthesis as 5 "-3" exonuclease activity.
  • Taq and Tth polymerase The principle is referred to as the TaqMan principle: After probe hydrolysis, the reporter dye is no longer in close proximity to the quencher, and the emitted fluorescence is no longer transformed, and this fluorescence increase is measured.
  • terkalierenden dyes ethidium bromide, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 or SYBR Green TM, etc.
  • the dye is present as a free dye in the reaction mixture, the emission is very low. Only by the intercalation of the dye, ie by the incorporation into the small groove of double-stranded DNA molecules, the light emission is greatly enhanced.
  • the dyes are inexpensive and universally applicable, since with them in principle any PCR reaction can be tracked in real time. In addition, they have a high signal strength, since each DNA molecule binds several dye molecules. But the advantages also result in a more extreme applicative Disadvantage: By intercalating dyes you can not in principle between correct
  • the point at which double-stranded DNA melts is characterized by a decrease (peak) in the fluorescence of the intercalating dye, since the intercalating dye dissociates from the single-stranded DNA. If the PCR is optimally adjusted, expect a peak of melting point to be tapered. This melting point represents the specific, expected product. Differently sized products and products of different sequence have different melting points.
  • the described methods fulfill the need for the specific detection of an amplification product.
  • a major disadvantage is that they are implemented on very expensive device platforms, which must combine the process of both the amplification and subsequent, corresponding to the question of optical detection in a hardware solution. Furthermore, many of these described detection methods are always based on real-time tracking of the amplification process. Based on this strategy, the workup of the measured fluorescence values takes place in the course of the amplification reaction. It is clear to the person skilled in the art that an enormously high degree of analysis algorithms must be integrated into real-time systems. This ultimately explains the high financial cost invested in the use of Real Time PCR systems must become. Ultimately, the operation of such device systems to a high degree
  • Inexpensive methods for the detection of nucleic acids are in this context e.g. PCR-ELISA.
  • the DNA sequence to be tested is amplified and the generated DNA fragment subsequently covalently immobilized on a solid phase (e.g., microtiter plate or strip), subsequently denatured into a single strand and hybridized with a sequence-specific probe.
  • the successful binding of the probe can be visualized by an antibody-mediated color reaction.
  • Another variant is based on immobilizing the probes to a solid phase and, after denaturing the PCR product, bringing it into contact with the immobilized probe. The proof of a successful hybridization event is analogous to the first variant of the method.
  • PCR ELISA are basically simple to perform, but include multiple steps, so that in addition to the time required to perform the PCR and several hours of working time are required for the implementation of the subsequent detection method. Such a procedure usually requires 8h and is thus not suitable as a rapid test.
  • KR 1020060099022 A (method and kit for rapid and accurate detection and analysis of nucleotide sequence with naked eye by using membrane lateral flow analysis).
  • a so-called. Lateral flow method is used to detect nucleic acids. This method also uses the technology of hybridization of nucleic acids to a solid phase. It is advantageous that a lateral flow method is a small, handy test format (strip test).
  • a very fast detection method which is also the detection of Amplif ⁇ kations occur using a test strip and is offered commercially, in contrast to the above patent again based on a completely different principle.
  • the PCR reaction is carried out with a biotinylated primer and a non-biotinylated primer.
  • PCR product which is biotin-labeled at one end.
  • the detection utilizes a test strip (e.g., Millenia Co.) containing two separate binding sites. A streptavidin site for coupling the biotin-labeled DNA strand and an FITC binding site to monitor the function of the test strip.
  • a test strip e.g., Millenia Co.
  • the detection of the PCR product is realized by denaturing after PCR PCR PCR approach and hybridized with a probe complementary to the biotin-labeled DNA strand.
  • the probe is marked FITC.
  • the PCR batch is mixed with a running buffer and applied to the test strip.
  • the biotinylated DNA strand binds to the streptavidin binding site of the strip.
  • Detection takes place via the FITC label of the probe hybridized with the DNA strand. It forms a typical signal in the form of a strip. This signal is intended to be the specific detection of the amplification product.
  • the method does not combine the hybridization of the probe with the process of PCR, but performs this as a separate process step.
  • the process has a fundamental and dramatic source of error.
  • the detection of the target nucleic acid to be detected is not specific.
  • the cause is that artifacts generated during the PCR, e.g.
  • primer dimers of course, bind specifically to the streptavidin binding site of the test strip and thus can also cause a positive reaction like a specific PCR product.
  • Flow Assay be adapted.
  • example 1 of WO 2004/092342 A2 one of the RT reaction and subsequent amplification with two labeled primers is carried out.
  • This methodology can lead to false positives through primer bucking and mispriming.
  • the second possibility (Fig. 20 d-e) represents a subsequent hybridization with two labeled probes. The problem of primer bucket formation and mispriming is not recognized in the document.
  • the aim of the present invention was to provide a universally usable method for the specific detection of target nucleic acids, which is very quickly feasible and simple and beyond no expensive device systems needed.
  • the procedure should itself as a molecular genetic Schelltest own and the defaults of the take account of diagnostic specificity assurance. It is essential that only a specific amplification product is detected and amplification artifacts can be clearly discriminated.
  • the present invention solves the existing task in a most ideal way. Moreover, the method according to the invention for the first time combines the amplification reaction and specific probe hybridization in one and the same reaction vessel and can nevertheless completely dispense with the extremely expensive equipment systems of REAL Time PCR.
  • the method according to the invention for the detection of specific nucleic acid sequences is based on a probe hybridization integrated in the PCR and a subsequent simple detection of the specific hybridization event. This detection occurs outside the PCR reaction vessel.
  • a probe hybridization integrated in the PCR e.g. a lateral flow technology (detection strip).
  • detection strip e.g. a lateral flow technology
  • the test procedure requires only one PCR device and one test strip and is easy to carry out, extremely fast and easy to carry out even for untrained personnel.
  • the rapid cycler technology (patent) is used.
  • the combination of rapid PCR and detection strips allows testing to detect a specific nucleic acid in less than an hour at extremely low cost.
  • the method according to the invention is based on the following steps:
  • PCR reagents known per se: PCR buffers, polymerases, dNTPs and optionally further
  • the actual amplification reaction is followed by a denaturation step at a temperature of> 90 0 C for the thermal separation of the strand generated during the PCR Amplif ⁇ kations resides.
  • the PCR reaction mixture is cooled to the hybridization temperature of the probe.
  • the hybridization probe specifically binds to the complementary DNA strand of the amplification product. This strand carries the messenger label, which was incorporated by the biotin-labeled primer in the PCR product.
  • commercially available lateral flow test strips (for example from Millenia) are used for detection.
  • the test strip contains two separate binding sites. A streptavidin site for coupling the messenger-labeled label and a FITC binding site for functional testing of the test strip.
  • the PCR mixture is mixed with a running buffer and applied to the test strip. The following binding events can occur.
  • Hybridization probe or hybridization product between biotin-labeled DNA strand and FITC-labeled hybridization probe bind in the lower
  • 2. in the further course of the test strip is the streptavidin binding site.
  • the following nucleic acids can bind to this binding site: 1. the biotin-labeled primers, 2. the biotin-labeled DNA strands, and 3. the hybridization products between biotin-labeled DNA strand and FITC-labeled hybridization probe.
  • a detection signal can only be detected if the specific hybridization product between biotin-labeled DNA strand and FITC-labeled hybridization probe is present, since only this product is also coupled to the detection system (FITC-anti FITC gold particles).
  • the process of the invention solves the problem, surprisingly, by chemically modifying the hybridization probe so that it is in the process of Amplif ⁇ kation can no longer act as a primer, ie that an extension through the
  • Polymerase is no longer possible. This is achieved by blocking the probe against the 5 ' ⁇ 3' polymerase activity, preferably by phosphorylating the last nucleotide of the probe. The process is further enhanced by the fact that the melting temperature of the probe is far below the temperatures at which the PCR runs. By using a modified probe, the described problem could be completely eliminated (see Example 1).
  • a further increase in efficiency of the test method can be achieved by modifying the PCR protocol in addition to the described denaturation step after completion of the amplification reaction.
  • performing an asymmetric PCR causes an increase in the detection efficiency (higher signal strength on the test strip).
  • the detection of the specific detection signal is not by means of fluorescence, which is released by the carried out by the Taq polymerase probe hydrolysis (EP 0972 848 A2).
  • the method according to the invention also differs from the patent (EP 0 826 066 B1), which also represents a combination of PCR and hybridization.
  • a fluorescence signal mediated by the FRET effect is detected. This arises during the amplification process by the hybridization of a probe having a lower annealing temperature than the primers.
  • the release of the fluorescence is not carried out by hydrolysis of the probe as a result of the exonuclease activity of the polymerase, but by the fact that in the hybridization of the secondary structure of the Probe is resolved and the fluorescence is less quenched.
  • Enzymes are used for the Amplif ⁇ kation that have no exonuclease activity (for example, Klenow fragment or T4 or T7 polymerases).
  • the measurement of fluorescence is always measured at the probe hybridization temperature. Thus, this procedure always requires extremely expensive real-time PCR devices.
  • the method according to the invention uses as final detection e.g. easy to handle strips (Latral Flow formats) or other solid phases, which are able to bind the DNA strand to be detected of the PCR product. Subsequently, the detection of the label of the probe then takes place by means of technologies known to those skilled in the art.
  • the inventive method is a test format, which can be realized in principle under field conditions.
  • L. monocytogenes antisense primer (5'-BIOTIN-TCC GCG TGT TTC TTT TCG AT-3 ')
  • monocytogenes probe (5'-FITC-CCA TGG CAC CAC CAG CAT CT-3')
  • L.monocytogenes probe (5'-FITC-ATG CAT CTG CAT TCA ATA-Pho-3 ')
  • the PCR is carried out in the SpeedCycler (Analytik Jena) using the Rapid-Cycler technology:
  • the amplification event / the hybridization reaction is detected by gel electrophoretic separation of the amplification / hybridization mixture (FIG. 1) and by means of lateral flow test strips (GeneLine HybriDetect, Millenia Biotec GmbH, FIG.
  • the comparison of both figures demonstrates the disadvantages of not protected by the polymerase activity probe (approach 1) and thus the unsuitability of the lateral flow method in probes without a polymerization blocking.
  • the negative control contains no specific DNA band, but the test strip shows a strong positive signal caused by double-labeled primer dimers.
  • Lane 1 DNA ladder
  • Lane 2 positive control from batch 1
  • Lane 3 negative control from batch 1
  • Lane 4 positive control from batch 2
  • Lane 5 negative control from batch 2
  • FIG. 2 shows the detection of the specific hybridization event on a lateral flow test strip.
  • Strip 1 positive control from batch 1; Strip 2: negative control from approach 1; Strip 3: positive control from batch 2; Strip 4: negative control from batch 2
  • the inventive method was used as an example for the detection of isolated from the tick tissue rickettsial DNA.
  • the specificity of the method was based on the entrainment of Rickettsien- negative, also isolated from the tick tissue DNA samples performed.
  • Rickettsia sense primer 5'-GGG ACC TGC TCA CGG CGG-3 '
  • Rickettsia antisense primer 5'-biotin-TCT ATT GCT ATT TGT AAG AGC GGA TTG-3 '
  • Rickettsia probe 5'-FITC-CAA AGA AGT ATT AAA GGA ACT C-Pho-3 '
  • the PCR is carried out in the SpeedCycler (Analytik Jena) using the Rapid-Cycler technology:
  • Lane 1 DNA ladder
  • Lane 2 negative sample
  • Lane 3 positive sample
  • Lane 4 negative sample
  • Lane 5 positive sample
  • Lane 6 negative sample
  • Lane 7 positive sample
  • Lane 8 PCR blank control Figure 4 shows the detection of specific hybridization events on a
  • Strip 1 negative sample
  • Strip 2 positive sample
  • Strip 3 negative sample
  • Strip 4 positive sample
  • Strip 5 negative sample
  • Strip 6 positive sample
  • Strip 7 PCR blank control

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen mit den Schritten Amplifikation, Hybridisierung mittels Sonden und dem Nachweis des Hybridisierungsereignisses, wobei der Nachweis der Hybridisierungsreaktion außerhalb des Reaktionsgefäßes der Amplifikation/Hybridisierung an einer festen Phase stattfindet.

Description

Verfahren und Schnelltest zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen mit den Schritten Amplifikation, Hybridisierung mittels Sonden und dem Nachweis des Hybridisierungsereignisses, wobei der Nachweis der Hybridisierungsreaktion außerhalb des Reaktionsgefäßes der Amplifikation / Hybridisierung an einer festen Phase stattfindet.
Stand der Forschung
[0002] Die Gendiagnostik ist zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik oder der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden. [0003] Revolutioniert wurde die genetische Diagnostik mit der Erfindung der PCR- Technologie, die es gestattet, jede beliebige Nukleinsäuresequenz spezifisch zu vervielfachen. [0004] Unter Verwendung der PCR existieren eine Vielzahl von Methoden, die in Kombination mit der PCR-Technologie darüber hinaus den spezifischen Nachweis einer erfolgten Amplifikation ermöglichen. Insbesondere die Vorgaben einer exakten genetischen Diagnostik müssen sich Verfahren bedienen, die sicherstellen, dass ein erzeugtes Amplifϊkationsprodukt auch der spezifisch nachzuweisenden Zielsequenz entspricht. Die weit verbreitete Nutzung der Visualisierung eines PCR-Produktes mittels Gelelektrophorese ist dazu nicht ausreichend.
[0005] Eine prinzipiell sehr schnelle und ohne großen experimentellen Aufwand realisierbare Möglichkeit zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren kann durch die sog. Real Time PCR- Methoden erreicht werden. Hierbei ist die Amplifϊkationsreaktion mit der eigentlichen Nachweisreaktion direkt gekoppelt.
[0006] Eine weit verbreitete Methode zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist die Light Cycler Technologie (Fa. Roche). Die Firma Roche entwickelte dazu spezielle Hybridisierungssonden bestehend aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind. Am 3 "-Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5 "-Ende mit einem Donor versehen. Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum sog. FRET-Effekt kommen kann. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Annealingschrittes, wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide
Sonden an die DNA gebunden sind. Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden zusätzlich zu den verwendeten Primern ist die Spezifität dieses Detektionsystems äußerst hoch. [0007] Eine weitere Real Time PCR Anwendung zum Nachweis spezifischer Nukliensäure- Targets kann mit sog. Double Dye Sonden, welche in der Patentschrift US 5210015 und US 5487972 offenbart sind (TaqMan-Sonden), durchgeführt werden. Double Dye Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5Λ- Ende, der Quencherfarbstoff am 3 "-Ende. Zusätzlich befindet sich am 3 "-Ende der Sonde eventuell noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Lichtstärke gering, da fast die gesamte Lichtenergie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird „gequenched", d.h. gelöscht. Dieser FRET-Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als 5 "-3" Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine 5 "-3" Exonukleaseaktivität (Taq- und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Das Prinzip wird als TaqMan- Prinzip bezeichnet. Nach Sondenhydrolyse befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen. [0008] Eine weitere Möglichkeit zum spezifischen Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels Real Time PCR Technologie besteht in der Nutzung von interkalierenden Farbstoffen (Ethidiumbromid, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ u.a.). Diese Farbstoffe emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff als freier Farbstoff im Reaktionsgemisch vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs, d.h. durch die Einlagerung in die kleine Furche doppelsträngiger DNA-Moleküle wird die Lichtemission stark verstärkt. Die Farbstoffe sind preiswert und universell verwendbar, da mit ihnen prinzipiell jede PCR- Reaktion in Echtzeit verfolgt werden kann. Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, da jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein extremer applikativer Nachteil: Durch interkalierende Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem
Produkt und Amplifϊkations-Artefakten (wie z.B. Primer Dimeren oder Fehlprodukten) unterscheiden. Entstehende Primer Dimere und andere Artefakte binden naturgemäß ebenfalls interkalierende Farbstoffe und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben. Eine klare Differenzierung zwischen spezifischem Amplifϊkationsereignis bzw. Artefakt ist aber zwingend notwendig. Um dies dennoch zu erreichen, nutzt man eine sog. Schmelzpunktanalyse am Ende der eigentlichen PCR-Reaktion. Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 Grad- Schritten von 50 0C auf 95 0C erhitzt. Bei diesem Prozess wird kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierende Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert. Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte.
[0009] Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur graphisch auf, so kann man den Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen. Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Amplifikations- Produkt von Artefakten zu unterscheiden. Auf diese Weise ist es möglich, auch zwischen homozygot (ein Peak) und heterozygot (zwei Peaks) zu unterscheiden.
[0010] Mittels REAL-Time PCR Anwendungen ist es darüber hinaus auch möglich, eine
Quantifizierung der nachzuweisenden Targets durchzuführen.
[0011] Wie schon aufgeführt, erfüllen die beschriebenen Verfahren die Notwendigkeit des spezifischen Nachweises eines Amplifikationsproduktes.
[0012] Ein großer Nachteil besteht allerdings darin, dass sie auf sehr teuren Geräteplattformen implementiert sind, welche den Prozess sowohl der Amplifikation als auch nachfolgenden, der Fragestellung entsprechenden optischen Detektion in einer Hardware-Lösung vereinen müssen. Weiterhin basieren viele dieser beschriebenen Nachweisverfahren immer auf der Echtzeitverfolgung des Amplifikationsprozesses. Auf dieser Strategie basierend erfolgt auch die Aufarbeitung der gemessenen Fluoreszenzwerte im Verlauf der Amplifϊkationsreaktion. Dem Fachmann ist klar, dass damit verbunden auch ein enorm hoher Grad an Analysealgorithmen in Real Time Systeme integriert sein muss. Dies erklärt letztlich den hohen finanziellen Aufwand, der für die Nutzung von Real Time PCR Systemen investiert werden muss. Letztlich ist auch die Bedienung solcher Gerätesysteme an ein hohes Maß an
Expertise gebunden.
[0013] Neben den dargestellten REAL-Time PCR basierten diagnostischen Nachweisen existieren aber auch alternative Varianten zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren.
[0014] Preiswertere Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren sind in diesem Zusammenhang z.B. PCR-ELISA. Bei dieser Methode wird die zu untersuchende DNA- Sequenz amplifϊziert und das erzeugte DNA-Fragment nachfolgend an einer festen Phase (z.B. Mikrotiterplatte oder Streifen) kovalent immobilisiert, nachfolgend zu einem Einzelstrang denaturiert und mit einer sequenzspezifischen Sonde hybridisiert. Die erfolgreiche Anbindung der Sonde kann durch eine antikörpervermittelte Farbreaktion sichtbar gemacht werden. Eine andere Variante basiert darauf, dass man die Sonden an eine feste Phase immobilisiert und nach erfolgter Denaturierung des PCR-Produktes dieses in Kontakt mit der immobilisierten Sonde bringt. Der Nachweis eines erfolgten Hybridisierungsereignisses erfolgt in Analogie zur ersten Verfahrensvariante.
[0015] PCR-ELISA sind prinzipiell einfach in der Durchführung, umfassen allerdings multiple Verfahrensschritte, so dass neben der benötigten Zeit zur Durchführung der PCR auch mehrere Stunden Arbeitszeit für die Durchführung des nachfolgenden Detektionsverfahrens benötigt werden. Ein solches Verfahren benötigt in der Regel 8h und ist damit auch als Schnelltest nicht geeignet.
[0016] Darüber hinaus werden auch einige Geräte wie eine Temperierstation, ein sog. Washer oder auch ein Messgerät zum Nachweis des Hybridisierungssignals benötigt. Darüber hinaus sind ggf. weitere Spezialgräte oder Spezialverbrauchsmaterialien notwendig. [0017] Weitere einfache Verfahren zum Nachweis von Amplifikationsprodukten basieren auf der Amplifikation der Zielsequenzen und der nachfolgenden Hybridisierung von Amplifikationsprodukten an einer Membran. Auch bei diesem Verfahren gibt es dem Fachmann bekannte verschiedene Varianten. Diese Verfahren sind aber auch wieder aufwendig in der Durchführung und benötigen eine Vielzahl an abzuarbeitenden Verfahrensschritten und sind damit als Schnelltests nicht geeignet. Dies betrifft dann auch die Nutzung von Biochip-Strategien, welche die Hybridisierung von PCR-Produkten mit Hybridisierungssonden zum Nachweis der Spezifität nutzen. Auch diese Verfahren sind aufwendig und an sehr teure Geräteplattformen gebunden. [0018] Eine deutliche Reduktion von Arbeitsschritten wird in der Patentschrift
KR 1020060099022 A (Method and kit for rapid and Accurate detection and analysis of nucleotide sequence with naked eye by using membrane lateral flow analysis) offenbart. [0019] Hierbei wird ein sog. Lateral Flow Verfahren genutzt, um Nukleinsäuren zu detektieren. Auch dieses Verfahren bedient sich der Technologie der Hybridisierung von Nukleinsäuren an einer festen Phase. Vorteilhaft ist, dass es sich bei einem Lateral Flow Verfahren um eine kleines handliches Testformat handelt (Streifentest). [0020] Eine sehr schnelle Nachweismethodik, welche sich auch dem Nachweis von Amplifϊkationsprodukten mittels eines Teststreifens bedient und kommerziell angeboten wird, basiert im Gegensatz zur obigen Patentschrift wiederum auf einem völlig anderen Prinzip. Hierbei erfolgt die Durchführung der PCR-Reaktion mit einem biotinylierten Primer und einem nicht-biotinylierten Primer. Nach Durchführung der PCR liegt ein PCR-Produkt vor, welches an einem Ende damit Biotin-markiert ist. Der Nachweis nutzt einen Teststreifen (z.B. Fa. Millenia), welcher zwei getrennte Bindungsstellen enthält. Eine Streptavidin- Stelle zur Kopplung des Biotin-markierten DNA Stranges und eine FITC-Bindungstelle zur Funktionskontrolle des Teststreifens.
[0021] Der Nachweis des PCR-Produktes realisiert sich dadurch, dass man nach durchgeführter PCR den PCR- Ansatz denaturiert und mit einer zum Biotin-markierten DNA- Strang komplementären Sonde hybridisiert. Die Sonde ist FITC markiert. [0022] Zum Nachweis wird der PCR-Ansatz mit einem Laufpuffer gemischt und auf den Teststreifen aufgetragen. Nach der Testbeschreibung bindet sich der biotinylierte DNA-Strang an die Streptavidin-Bindungstelle des Streifens. Der Nachweis erfolgt über die FITC- Markierung der mit dem DNA-Strang hybridisierten Sonde. Es bildet sich ein typisches Signal in Form eines Streifens aus. Dieses Signal soll der spezifische Nachweis des Amplifϊkationsproduktes sein. Das Verfahren kombiniert aber nicht die Hybridisierung der Sonde mit dem Prozess der PCR, sondern führt dies als separaten Verfahrensschritt durch. Das Verfahren hat aber eine grundsätzliche und dramatische Fehlerquelle. [0023] Die Detektion der nachzuweisenden Zielnukleinsäure ist nicht spezifisch. Die Ursache liegt darin, dass während der PCR entstandene Artefakte, z.B. Primer-Dimere, natürlich auch spezifisch an die Streptavidin-Bindungsstelle des Teststreifens binden und damit auch wie ein spezifisches PCR-Produkt eine positive Reaktion hervorrufen können.
[0024] Das Dokument WO 2004/092342 A2 beschreibt die Technologie des Lateral-Flow Assays. Als molekularbiologische Anwendungsbeispiele werden bereits bekannten und teilweise kommerziell verfügbaren Technologien verwendet, die an das erfundene Lateral
Flow Assay adaptiert werden. In dem Beispiel 1 von WO 2004/092342 A2 wird eine der RT- Reaktion und nachfolgende Amplifϊzierung mit zwei markierten Primern durchgeführt. Diese Methodik kann zu falschpositiven Ergebnissen durch Primerdimer-Bildung und Misspriming führen. Diezweite Möglichkeit (Abb. 20 d-e) stellt eine nachträgliche Hybridisierung mit zwei markierten Sonden dar. Die Problematik der Primerdimerbildung und des Missprimings wird in der Druckschrift nicht erkannt.
[0025] Die wichtige Problematik der falschpositiven Resultate durch Primerdimerbildung wurde in der Veröffentlichung von Kozwich u.a. richtig erkannt (Development of a novel, rapid inte~lrated Cryptosporidium parvum detection assay. Appl. Environ. Microbiol. (2000) 66 (7) 2711 7, Seite 2712, rechte Spalte 2. Absatz, Abb. 3). Die Lösung des Problems (Nested PCR mit den markierten und den nichtmarkierten Primern) unterscheidet sich prinzipiell von der erfindungsgemäßen Lösung, für die hiermit Schutz beantragt wird (ein markierter Primer und eine markierte Sonde). Die in der Publikation von Kozwich u.a vorgeschlagene Lösung schließt die Bildung von Primerdimeren nur der Wahrscheinlichkeit nach, jedoch nicht prinzipiell, aus. Das so oft stattfindende Misspriming wird auch bei der von Kozwich u.a. vorgeschlagenen Lösung nicht vollständig als Fehlerquelle ausgeschlossen
[0026] All die beschriebenen alternativen Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen ohne REAL-Time PCR-Technologien haben also unabhängig von dem doch notwendigen hohen manuellen Arbeitsaufwand auch eine wesentliche Gemeinsamkeit. Die notwendige Hybridisierungsreakion zwischen PCR-Produkt und spezifischer Sonde findet immer außerhalb des Prozesses der PCR statt. Dieses Merkmal liegt all diesen Verfahren zu Grunde. Ein großer Vorteil von REAL-Time PCR-Technologien besteht aber grade darin, dass der Prozess von Amplifikation und spezifischer Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß abläuft und damit der Prozess von Amplifikation und Hybridisierung nicht entkoppelt wird. Darüber hinaus führen in diesen Fällen Amplifikationsartefakte häufig zu einem falsch positiven Signal.
[0027] Ziel der vorliegenden Erfindung lag darin, ein universell nutzbares Verfahren zum spezifischen Nachweis von Targetnukleinsäuren bereitzustellen, welches sehr schnell durchführbar sowie einfach ist und darüber hinaus keine teuren Gerätesysteme benötigt. Das Verfahren soll sich als molekulargenetischer Schelltest eigenen und den Vorgaben der diagnostischen Spezifϊtätssicherung Rechnung tragen. Wesentlich ist dabei, dass nur ein spezifisches Amplifikationsprodukt detektiert wird und Amplifikations-Artefakte eindeutig diskriminiert werden können.
[0028] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
[0029] Die vorliegende Erfindung löst die bestehende Aufgabenstellung dabei in idealster Weise. Das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert darüber hinaus zum ersten Mal die Amplifϊkationsreaktion und spezifische Sondenhybridisierung in ein und demselben Reaktionsgefäß und kann trotzdem auf die extrem teuren gerätetechnischen Systeme der REAL Time PCR gänzlich verzichten.
[0030] Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen basiert auf einer in die PCR integrierte Sondenhybridisierung und einem nachfolgenden einfachen Nachweis des spezifischen Hybridisierungsereignisses. Dieser Nachweis erfolgt außerhalb des PCR-Reaktionsgefäßes. Vorzugsweise nutzt man z.B. eine Lateral Flow Technologie (Nachweis- Streifen). Damit benötigt die Testdurchführung nur noch ein PCR- Gerät und einen Teststreifen und ist in der Durchführung einfach, extrem schnell und auch für ungeübtes Personal problemlos durchführbar. In einer bevorzugten Ausführungsvariante wird die Rapid-Cycler Technologie (Patent) genutzt. Die Kombination von Rapid-PCR und Nachweisstreifen erlaubt die Testdurchführung zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäure in nicht einmal einer Stunde und dies bei extrem niedrigen Testkosten.
[0031] Das erfindungsgemäße Verfahren basiert dabei auf folgenden Schritten:
A. Bereitstellung eines PCR-Reaktionsansatzes bestehend aus:
1. zwei PCR Primer, dabei ist einer der Primer am 5 '-Ende mit einem Markierungs- Molekül (z.B. Biotin markiert)
2. einer spezifischen Hybridisierungssonde (ebenfalls mit einer Markierung versehen; z.B. FITC), die sich an den Strang der Zielsequenz hybridisieren kann, der den markierten Primer enthält. 3. an sich bekannte PCR Reagenzien: PCR-Puffer, Polymerasen, dNTPs und ggf. weitere
Zusätze
B. Durchführung des Amplifϊkationsprozesses mit integrierter Sondenhybridisierung
[0032] Die Amplifϊkationsreaktion erfolgt unter Standardbedingungen. Dabei folgt der eigentlichen Amplifϊkationsreaktion ein Denaturierungsschritt bei einer Temperatur > 900C zur thermischen Strangtrennung des während der PCR generierten Amplifϊkationsproduktes. Nach Denaturierung wird der PCR-Reaktionsansatz auf die Hybridisierungstemperatur der Sonde abgekühlt. Während dieses Schrittes bindet die Hybridisierungssonde spezifisch an den komplementären DNA-Strang des Amplifϊkationsproduktes. Dieser Strang trägt dabei die Botin-Markierung, welche durch den Biotin-markierten Primer in das PCR-Produkt eingebaut wurde.
C. Nachweis des Hybridisierungsereignisses
[0033] Der Nachweis des spezifischen Hybridisierungsereignisses erfolgt über die spezifische Ankopplung des biotinylierten DNA-Stranges an eine feste Phase und der spezifischen Detektion der Markierung der Hybridisierungssonde, welche an der zur Sonde komplementären Sequenz des biotinylierten DNA-Stranges hybridisiert ist. In einer bevorzugten Variante nutzt man für den Nachweis kommerziell verfügbare Lateral Flow Teststreifen (z.B. Fa. Millenia). Der Teststreifen enthält, wie schon aufgeführt, zwei getrennte Bindungsstellen. Eine Streptavidin- Stelle zur Kopplung der Botin-markierten Markierung und eine FITC-Bindungstelle zur Funktionskontrolle des Teststreifens. Zum Nachweis wird der PCR- Ansatz mit einem Laufpuffer gemischt und auf den Teststreifen aufgetragen. Folgende Bindungsereignisse können auftreten.
1. alle FITC-markierten Nukleinsäuren (nicht hybridisierte FITC-markierte
Hybridisierungssonde bzw. Hybridisierungsprodukt zwischen Biotin-markiertem DNA Strang und FITC-markierter Hybridisierungssonde) binden im unteren
Probenauftragsbereich des Teststreifens an Goldpartikel, die mit anti-FITC- Antikörpern beschichtet sind. 2. im weiteren Verlauf des Teststreifens befindet sich die Streptavidin-Bindungstelle. An diese Bindungsstelle können sich folgende Nukleinsäuren binden: 1. die Biotin- markierten Primer, 2. die Biotin-markierten DNA-Stränge und 3. die Hybridisierungsprodukte zwischen Biotin-markiertem DNA Strang und FITC-markierter Hybridisierungssonde.
Ein Nachweissignal kann aber nur dann sichtbar werden, wenn das spezifische Hybridisierungsprodukt zwischen Biotin-markiertem DNA Strang und FITC-markierter Hybridiserungssonde vorliegt, da nur dieses Produkt auch mit dem Nachweissystem (FITC-anti FITC-Goldpartikel) gekoppelt ist.
3. Im weiteren Verlauf des Teststreifens binden dann noch überschüssige mit anti-FITC- Antikörpern beschichte Goldpartikel, welche als Kontrolle zur Funktionsfähigkeit des Teststreifens dienen.
[0034] Nach der Durchführung des beschriebenen Verfahrens (Ausführungsbeispiel 1) konnte problemlos der Nachweis eines Amplifikationsproduktes erbracht werden. Allerdings zeigte sich, dass auch die mitgeführte Negativkontrolle ebenfalls ein stark positives Testsignal auf dem Testreifen erbringen kann. Als Ursache für das falsch-positive Ergebnis wurde folgender Tatbestand herausgefunden. Während der PCR kann auch die FITC-markierte Hybridisierungssonde als Primer fungieren. Dadurch kommt es zu einem verkürzten Amplifϊkationsprodukt, welches damit genauso detektiert werden würde wie das spezifische Amplifϊkationsprodukt. Dieses Ergebnis ist dabei prinzipiell nicht problematisch, da es natürlich auch spezifisch wäre. Das Problem besteht aber darin, das Amplifikations- Artefakte natürlich auch entstehen, wenn die Hybridisierungssonde als Primer arbeitet. Diese so oftmals entstehenden Primer-Dimere führen dann auf dem Teststreifen zu einem falsch-positiven Signal, da sie spezifisch an die Streptavidinstelle binden und über die eingebaute FITC- Markierung nachgewiesen werden. Dieses experimentelle Ergebnis zeigt damit, dass in der dargestellten Form die Integration der Nachweissonde im PCR-Ansatz und damit die Kopplung von Amplifikation und spezifischer Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß nicht funktionieren kann.
[0035] Das erklärt möglicherweise, dass es bisher ein diesbezügliches Nachweissystem nicht gibt.
[0036] Das erfindungsgemäßen Verfahren löst das Problem überraschenderweise dadurch, dass man die Hybridisierungssonde chemisch so modifiziert, dass sie im Prozess der Amplifϊkation nicht mehr als Primer fungieren kann, d.h. dass eine Verlängerung durch die
Polymerase nicht mehr möglich ist. Dies erreicht man durch eine Blockierung der Sonde gegen die 5'~>3'-Polymeraseaktivität, vorzugsweise durch eine Phosphorylierung des letzten Nukleotides der Sonde. Der Prozess wird noch dadurch verstärkt, dass die Schmelztemperatur der Sonde weit unter den Temperaturen liegt, bei denen die PCR abläuft. Durch die Verwendung einer modifizierten Sonde konnte das geschilderte Problem vollständig beseitigt werden (siehe Ausführungsbeispiel 1).
[0037] Eine weitere Effizienzsteigerung des Testverfahrens kann dadurch erreicht werden, dass man neben dem beschriebenen Denaturierungsschritt nach abgeschlossener Vervielfältigungsreaktion das PCR-Protokoll modifiziert. So bewirkt die Durchführung einer asymmetrischen PCR (anstelle der Standard PCR-Reaktion) eine Erhöhung der Detektionseffizienz (höhere Signalstärke auf dem Teststreifen).
[0038] Zusammenfassend steht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nun ein extrem einfaches Nachweisverfahren zur Verfügung. Die erfindungsgemäße Integration einer Hybridisierungssonde in die PCR gibt die Sicherheit, dass das amplifizierte Fragment wirklich die Zielsequenz beinhaltet. Dadurch werden die durch Mispriming entstehenden falschpositiven Resultate ausgeschlossen. Die Verwendung der chemisch modifizierten Sonde (vorzugsweise Phosphorylierung des letzten Nukleotides der Sonde) verhindert die Verlängerung der Sonde durch 5'~>3'-Polymeraseaktivität und verhindert damit, dass die Sonde als Primer fungiert und unspezifische PCR- Artefakte (Primer-Dimere) erzeugt, die als falsch positive Signale detektiert werden würden.
[0039] Im Unterschied zu REAL-Time PCR Verfahren erfolgt die Detektion des spezifischen Nachweissignals nicht mittels Fluoreszenz, welche durch die von der Taq-Polymerase durchgeführte Sondenhydrolyse freigesetzt wird ( EP 0972 848 A2 ). Es wird aber trotzdem der Vorteil von Real-Time Technologien genutzt, das PCR und die Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß erfolgen, nicht aber durch Quenching und Exonukleaseaktivität. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich auch von der Patentschrift (EP 0 826 066 Bl), welche ebenfalls eine Kombination von PCR und Hybridisierung darstellt. Auch bei diesem Verfahren wird wiederum ein durch FRET-Effekt vermitteltes Fluoreszenzsignal detektiert. Dieses entsteht während des Amplifikationsvorganges durch die Hybridisierung einer Sonde, die eine niedrigere Annealingtemperatur hat, als die Primer. Die Freisetzung der Fluoreszenz erfolgt dabei nicht durch Hydrolyse der Sonde in Folge der Exonukleaseaktivität der Polymerase, sondern dadurch, dass bei der Hybridisierung die sekundäre Struktur der Sonde aufgelöst wird und die Fluoreszenz weniger gequencht wird. Hierbei können nur
Enzyme für die Amplifϊkation eingesetzt werden, die keine Exonukleaseaktivität besitzen (z.B. Klenow Fragment oder T4 oder T7 Polymerasen).
[0040] Die Messung der Fluoreszenz wird immer bei der Sonden- Hybridisierungstemperatur gemessen. Damit benötigt auch dieses Verfahren immer extrem teure Real-Time PCR Geräte. Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt als finale Detektion z.B. einfach zu handhabende Streifen (Latral Flow Formate) oder andere feste Phasen, welche in der Lage sind, den nachzuweisenden DNA-Strang des PCR-Produktes zu binden. Nachfolgend erfolgt dann mittels dem Fachmann bekannter Technologien der Nachweis der Markierung der Sonde.
[0041] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist erstmals ein extrem einfaches, schnelles und universelles Verfahren zum spezifischen Nachweis eines Amplifϊkationsereignisses verfügbar, welches gerätetechnisch lediglich ein PCR-Gerät benötigt. Die Kombination von PCR-Reaktion und Sondenhybridisierung in einem Reaktionsgefäß bedeutet, dass die Detektion nur noch durch das In- Kontakt- bringen des PCR-Reaktionsansatzes mit dem Teststreifen erfolgt. Damit stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein Testformat dar, welches prinzipiell auch unter Feldbedingungen realisiert werden kann.
[0042] Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert, wobei die Ausführungsbeispiele keine Einschränkung des Verfahren darstellen sollen.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1:
Nachweis der Listeria monocytogenes DNA mittels in die PCR integriertem Hybridisierungsverfahren und Lateral Flow Detektion. Vergleich einer unphosphorylierten und einer phosphorylierten Hybridisierungssonde
[0043] Im Ansatz werden zwei Typen von markierten Sonden gegeneinander getestet. Die erste Sonde ist am 5 '-Ende FITC-markiert, die zweite Sonde ist darüber hinaus an ihrem 3'- Ende eine phosphoryliert. Die 3 '-Phosphorylierung der Sonde verhindert ihre Verlängerung durch die Taq-Polymerase. Ansatz 1 (unphosphorylierte Hybridisierungssonde) PCR-Primer /Sonde L.monozytogenes sense Primer (5 '-CGC AAC AAA CTG AAG CAA AGG-3 ')
L.monozytogenes antisense Primer (5'-BIOTIN-TCC GCG TGT TTC TTT TCG AT-3') L.monozytogenes Sonde (5'-FITC-CCA TGG CAC CAC CAG CAT CT-3')
Reaktionsansatz (Amplifϊkation/Hybridisierung) Pro Probe: sense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl antisense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl
Sonde (25 pmol/μl) 0,1 μl dNTP-Mix (12,5 mM) 0,3 μl 10X PCR-Buffer (MgCl2 included) 1,5 μl
Taq-DNA-Polymerase 0,75 U
PCR-Grade H2O add 15 μl
Ansatz 2 (phosphorylierte Hybridisierungssonde) PCR-Primer /Sonde
L.monozytogenes sense Primer (5'-CGC AAC AAA CTG AAG CAA AGG-3')
L.monozytogenes antisense Primer (5'-BIOTIN-TCC GCG TGT TTC TTT TCG AT-3')
L.monozytogenes Sonde (5'-FITC-ATG CAT CTG CAT TCA ATA-Pho-3')
Reaktionsansatz (Amplifϊkation/Hybridisierung) Pro Ansatz: sense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl antisense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl
Sonde (25 pmol/μl) 0,1 μl dNTP-Mix (12,5 mM) 0,3 μl 10X PCR-Buffer (MgCl2 included) 1,5 μl
Taq-DNA-Polymerase 0,75 U
PCR-Grade H2O add 15 μl [0044] Zur Testung wird von jedem Ansatz jeweils eine negative Probe (beinhaltend nur
PCR-Chemikalien und H2O) und eine positive Probe (beinhaltend zusätzlich L. monocytogenes DNA (1,5 μl, Gesamt DNA- Konzentration ca. 50 ng/μl)) eingesetzt.
[0045] Die PCR wird im SpeedCycler (Analytik Jena) unter der Nutzung der Rapid-Cycler- Technologie durchgeführt:
Amplifϊkations/Hybridisierungskonditionen Schritt 1 : Denaturierung 95°C 120"
Schritt 2
Amplifϊzierung 37 Zyklen
95°C 4" 55°C 4" 72°C 20"
Schritt 3
Denaturierung 95°C 300" Schritt 4
Hybridisierung 15°C 600"
[0046] Der Nachweis des Amplifϊkationsereignisses/der Hybridisierungsreaktion erfolgt mittels gelelektrophoretischer Auftrennung des Amplifikations/Hybridisierungsansatzes (Figur 1) sowie mittels Lateral Flow Teststreifen (GeneLine HybriDetect; Millenia Biotec GmbH; Figur 2). [0047] Der Vergleich beider Abbildungen demonstriert die Nachteile der nicht von der Polymeraseaktivität geschützten Sonde (Ansatz 1) und damit die Untauglichkeit des Lateral Flow- Verfahrens bei Sonden ohne einer Polymerisationblockierung. Auf dem Gelbild beinhaltet die Negativkontrolle keine spezifische DNA-Bande, auf dem Teststreifen zeigt sich dagegen ein starkes positives Signal, das von doppelt markierten Primer-Dimeren verursacht wird.
[0048] Dagegen zeigt der Amplifikationsansatz/Hybridisierungsansatz mit der am 3 '-Ende phosphorylierten Hybridisierungssonde auf dem Teststreifen nur ein positives Signal, bei der Positivkontrolle. Damit korreliert das Ergebnis auf dem Teststreifen eindeutig mit dem Gelbild. Erklärung zu Figur 1:
Spur 1 : DNA Leiter; Spur 2: Positivkontrolle aus Ansatz 1; Spur 3: Negativkontrolle aus Ansatz 1; Spur 4: Positivkontrolle aus Ansatz 2; Spur 5: Negativkontrolle aus Ansatz 2
[0049] Figur 2 zeigt den Nachweis des spezifischen Hybridisierungsereignisses auf einem Lateral Flow Teststreifen.
Erklärung zu Figur 2:
Streifen 1: Positivkontrolle aus Ansatz 1; Streifen 2: Negativkontrolle aus Ansatz 1; Streifen 3: Positivkontrolle aus Ansatz 2; Streifen 4: Negativkontrolle aus Ansatz 2
Beispiel 2:
Durchführung des Verfahrens mittels asymmetrischer PCR und Überprüfung der Spezifität des Tests anhand der Testung positiver und negativer Ausgangsproben
[0050] Das erfindungsgemäße Verfahren wurde exemplarisch für den Nachweis von aus dem Zeckengewebe isolierter Rickettsien DNA eingesetzt. Die Spezifität des Verfahrens wurde anhand der Mitführung von Rickettsien- negativen, gleichfalls aus dem Zeckengewebe isolierten DNA Proben, durchgeführt.
PCR -Primer/Sonde:
Rickettsien sense Primer: 5'-GGG ACC TGC TCA CGG CGG-3'
Rickettsien antisense Primer: 5'-Biotin-TCT ATT GCT ATT TGT AAG AGC GGA TTG-3'
Rickettsien Sonde: 5'-FITC- CAA AGA AGT ATT AAA GGA ACT C-Pho-3'
Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung) Pro Ansatz: sense Primer (50 pmol/μl) 0,05 μl antisense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl Sonde (25 pmol/μl) 0,1 μl dNTP-Mix (12,5 mM) 0,3 μl
1 OX PCR-Buffer (MgCl2 included) 1 ,5 μl Taq-DNA-Polymerase 0,75 U DNA (positiv oder negativ) 1,5 μl (ca. 50 ng)
PCR-Grade H2O add 15 μl
[0051] Die PCR wird im SpeedCycler (Analytik Jena) unter der Nutzung der Rapid-Cycler- Technologie durchgeführt:
Amplifϊkations/Hybridisierungskonditionen Schritt 1 :
Denaturierung 95°C 120"
Schritt 2 Amplifizierung 37 Zyklen
95°C 4" 55°C 4" 72°C 20" Schritt 3 Denaturierung 95°C 300"
Schritt 4
Hybridisierung 45°C 600"
[0052] Nach der Durchfuhrung des gekoppelten Amplifϊkations/Hybridisierungsverfahrens erfolgte die Visualisierung des spezifischen Nachweises der Erreger-Nukleinsäure wiederum mittels eines Lateral Flow Teststreifens (Figur 4) als auch mittels Gelelektrophorese (Figur 3). Die Ergebnisse zeigen eindrucksvoll die spezifische Detektion der nachzuweisenden Zielnukleinsäure. Das gesamte Verfahren benötigt ca. 50 min.
Erklärung zu Figur 3:
Spur 1 : DNA Leiter; Spur 2: negative Probe; Spur 3: positive Probe; Spur 4: negative Probe; Spur 5: positive Probe; Spur 6: negative Probe; Spur 7: positive Probe; Spur 8: PCR- Leerkontrolle [0053] Figur 4 zeigt den Nachweis der spezifischen Hybridisierungsereignisse auf einem
Lateral Flow Teststreifen.
Erklärung zu Figur 4:
Streifen 1 : negative Probe; Streifen 2: positive Probe; Streifen 3: negative Probe; Streifen 4: positive Probe; Streifen 5: negative Probe; Streifen 6: positive Probe; Streifen 7: PCR- Leerkontrolle

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung mindestens einer spezifischen Nukleinsäuresequenz
(Zielsequenz) mit den Schritten • Amplifϊkation der zur bestimmenden Nukleinsäuresequenz mit mindestens einem
Primer und ggf. anschließender Strangtrennung und
• Hybridisierung mit mindestens einer zu der Zielsequenz ganz oder partiell komplementären Sonde und
• Nachweis der Hybridisierungsreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Amplifϊkation, ggf. die Strangtrennung und die Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß erfolgt und b) mindestens ein Primer mit einem Molekül markiert ist und c) die Hybridisierungssonde mit einer Markierung versehen ist und sich an den Strang der Zielsequenz hybridisiert, der den markierten Primer enthält und d) der Nachweis der Hybridisierungsreaktion außerhalb des unter a) genannten Reaktionsgefäßes an einer festen Phase erfolgt und e) die feste Phase eine Bindungsstelle für die Markierung entweder der Primer oder der Sonde enthält und dadurch das Hybridisierungprodukt dadurch an die feste Phase gebunden wird und f) der Nachweis der Hybridisierungsreaktion außerhalb des unter a) genannten Reaktionsgefäßes an einer festen Phase dadurch erfolgt, dass
• die feste Phase eine Bindungsstelle aufweist, die eine Bindung mit der Markierung des Primers oder mit der Markierung der Hybridisierungssonde ermöglicht, wodurch das Hybridisierungsprodukt an die feste Phase gebunden wird und der Nachweis des gebunden Hybridisierungsproduktes durch den direkten oder indirekten Nachweis der noch freien Markierung erfolgt oder
• das die Markierung des Primers oder die Markierung der Hybridisierungssonde eine Bindung mit einem Nachweismolekül eingeht und nachfolgend die freie Markierung eine Bindung mit einer Bindungsstelle der festen Phase eingeht, wodurch das Hybridisierungsprodukt an die festen Phase gebunden wird und der Nachweis des an der festen Phase gebundenen Hybridisierungsproduktes über das Nachweismolekül erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Visualisierung der bzw.
Messung des PCR-Hybridisierungsereignisses mit Hilfe einer optischen Einrichtung erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonde gegen die 5' -> 3'-Polymeraseaktivität geschützt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonde gegen die 5' -^ 3'-Polymeraseaktivität durch eine Markierung oder durch eine Phosphorylierung geschützt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer mit Biotin markiert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonde mit FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) markiert ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase ein Teststreifen verwendet wird, der eine Streptavidin- Stelle zur Kopplung der Botin-markierten Markierung und eine FITC-Bindungstelle zur Funktionskontrolle des
Teststreifens enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der PCR- Ansatz (Amplifϊkationsansatz) mit einem Laufpuffer gemischt und auf den Teststreifen aufgetragen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass im unteren Probenauftragsbereich des Teststreifens sich Goldpartikel befinden, die mit anti-FITC- Antikörpern beschichtet sind und dass sich im weiteren Verlauf des Teststreifens die Streptavidin-Bindungstelle befindet.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass anstelle der Standard PCR-Reaktion eine asymmetrischen PCR durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall der
Bestimmung von RNA vor der Amplifikation eine reverse Transkription erfolgt.
12. Testkit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend:
• ein Reaktionsgefäß zur Durchführung der Amplifikation, der Strangtrennung und der Hybridisierung mit der Sonde und
• mindestens 1 Primer, der mit einem Molekül markiert ist und
• mindestens einer zu der Zielsequenz ganz oder partiell komplementären Sonde, die gegen die 5' -^ 3'-Polymeraseaktivität geschützt ist und/oder mit einer Markierung versehen ist und sich an den Strang der Zielsequenz hybridisiert, der den markierten Primer enthält und
• mindestens eine feste Phase, die eine Bindungsstelle für die Markierung entweder der Primer oder der Sonde enthält und « an sich bekannte PCR Reagenzien wie PCR-Puffer, Polymerasen, dNTPs und ggf. weitere Zusätze sowie mindestens ein Laufmittel für den Nachweis der Hybridisierung
13. Testkit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäß die Primer, die Sonde und die an sich bekannte PCR Reagenzien in fester Form enthält.
14. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder des Testkits gemäß Anspruch 12 oder 13 zum qualitativen Nachweis von Zielnukleinsäuren.
15. Verwendung nach Anspruch 14 als Schnelltest, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis weniger als eine Stunde dauert.
16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Methodik einer Multiplexdetektion , dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Primer und Sonden, die entweder durch gleich oder durch unterschiedliche Moleküle markiert sind, Anwendung findet.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zum Nachweis einer Infektion mit Viren oder Bakterien.
18. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15 zum Nachweis für Bakterien, insbesondere für die Lebensmitteldiagnostik, Umweltanalytik und Krankenhaushygiene,
19. Verwendung nach Anspruch 14 zum Nachweis von Salmonella, Listeria, E. coli, Campylobacter, Shigella, Enterobacter ; MRSA-Keime oder Legionellen.
20. Verwendung nach Anspruch 15 zum Nachweis von durch Zecken übertragbare Erreger wie Borrelien, Rickettsien, Erlichien oder Babesien.
21. Verwendung nach Anspruch 14 zum Nachweis von SNP 's, Mutationen oder von methylierten Sequenzmotiven.
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