WO2009093530A1 - 顕微鏡システム - Google Patents

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lens
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observation
differential interference
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Kumiko Matsui
Katsuya Watanabe
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Nikon Corp
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    • Y10S359/00—Optical: systems and elements
    • Y10S359/90—Methods

Definitions

  • the present invention relates to a microscope system for microinsemination that enables observation by a differential interference observation method and a modulation contrast observation method.
  • ICSI Intra-cytoplasmic Sperm Injection
  • sperm is selected using a modulation contrast observation method (see, for example, Patent Document 1), and sperm having good motility and form is injected into an egg.
  • IVF In Vitro Fertilization
  • IMSI Intra-cytoplasmic Morphologically Selected ⁇ ⁇ Sperm Injection: a method of performing microinsemination by selecting spermatozoa under high magnification, in which microinsemination is performed after observing and selecting the sperm head in detail )
  • a modulation contrast observation method used for ICSI and a differential interference observation method (for example, refer to Patent Documents 2 and 3) using a high magnification objective lens used for IMSI. ing.
  • JP 51-128548 A Japanese Patent No. 3456252 Japanese Patent No. 3415294
  • a high-magnification lens has a high numerical aperture (NA) and an immersion objective. Lenses have been used.
  • NA numerical aperture
  • the immersion system is used for the high magnification objective lens
  • the drying system is used for the medium / low magnification objective lens.
  • the present invention has been made in view of such a problem, and after performing sperm observation and selection by differential interference observation using a dry high-magnification objective lens, it is switched by the same dry low-magnification objective lens.
  • a series of operations of microinsemination can be performed accurately and quickly while ensuring resolution.
  • An object of the present invention is to provide a suitable microscope system.
  • the present invention is a microscope system suitable for microinsemination, and includes at least one of a transmission illumination optical system having a light source and a condenser lens, a differential interference observation method, and a modulation contrast observation method.
  • the first objective lens and the second objective lens can be switched and used.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating various aberrations of the second objective lens according to Example 1, where (a) is a spherical aberration diagram, (b) is an astigmatism diagram, and (c) is a distortion diagram.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a microscope system mainly suitable for micro insemination according to the present embodiment.
  • the microscope system according to the present embodiment is based on IMSI (Intra-cytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection: a method of performing microinsemination by selecting sperm under high magnification) and ICSI (Intra-cytoplasmic Sperm Injection: intracytoplasmic sperm injection method).
  • a transmission illumination optical system including a light source 11 and a condenser lens 13, a collector lens 12, a sample 14, an objective lens 15, a turret 16, and an illumination-side birefringent optical member are suitable. It includes BP1, an imaging-side birefringent optical member BP2, a polarizer P, and an analyzer A.
  • the illumination light from the light source 11 is collected by the collector lens 12, and then enters the polarizer P and is converted into linearly polarized light.
  • an illumination-side birefringent optical member BP1 and a condenser lens 13 that irradiates the sample 14 with illumination light are disposed in this order from the light source 11 side. Is incident on the illumination-side birefringent optical member BP1, separated into two linearly polarized components whose vibration directions are orthogonal to each other by the birefringence action, and enters the condenser lens 13.
  • the two light beams separated by the illumination-side birefringent optical member BP1 travel with a slight separation angle ⁇ and become parallel light beams separated by a small amount of shear S due to the condensing action of the condenser lens 13, and the sample 14 is removed. Illuminate.
  • the two light beams that have passed through a slightly distant position on the sample 14 enter the imaging side birefringent optical member BP2 through the objective lens 15, and are synthesized by the birefringence action of the imaging side birefringent optical member BP2. Proceed on the same optical path.
  • the combined light beam enters the analyzer A, and only the unidirectional vibration components in the linearly polarized light orthogonal to each other are extracted and interfered by the analyzer A.
  • interference fringes corresponding to the phase difference imparted between the two light beams when passing through slightly different positions in the sample 14 form an enlarged image (interference image) 17 on the image plane.
  • An observer can observe the magnified image 17 through an eyepiece optical system (not shown).
  • the enlarged image 17 is an image having a uniform intensity distribution and no contrast (since there is no phase difference between the two separated light beams).
  • the magnified image 17 corresponds to a portion having a refractive index change, a gradient, or a step (because a phase difference occurs between the two separated light beams). Contrast occurs in the part. Therefore, the refractive index change, gradient, and level difference are visualized, and the sample 14 can be enlarged and observed.
  • the objective lens 15 includes a first objective lens (hereinafter also referred to as a dry-type medium-magnification objective lens or a medium-magnification objective lens) 15a having a magnification of 20 to 40 times, and contrast observation using a differential interference observation method.
  • a second objective lens hereinafter also referred to as a dry-type high-magnification objective lens or a high-magnification objective lens) 15b having a magnification of 60 to 100 times that can be used.
  • These medium-magnification objective lens 15a and high-magnification objective lens 15b Is configured to be switchable by a turret 16 or the like.
  • the first objective lens 15a can be observed by at least one of the differential interference observation method and the modulation contrast observation method.
  • the principle of the modulation contrast observation method will be briefly described with reference to FIGS.
  • 21 is a condenser lens
  • S is a sample
  • 22 is an objective lens
  • 23 is an aperture plate
  • 24 is a disk-shaped modulator.
  • the aperture plate 23 has a rectangular aperture 23a at the focal position on the light source side of the condenser lens 21 and away from the center.
  • the modulator 24 is disposed at a position substantially conjugate with the aperture plate 23, and includes a region 24a having a transmittance of 100% that can include an image of the aperture 23a, a region 24b having a transmittance of 15%, and a transmittance of 0%.
  • the region 24c is arranged adjacently in order.
  • the rectangular opening 23a is arranged at a position decentered from the optical axis, the light incident on the condenser lens 21 is emitted so as to illuminate the sample S from an oblique direction.
  • the transparent sample S is flat as shown in FIG. 2A, the light beam transmitted through the sample S is imaged in the region 24b of the modulator 24 by the objective lens 22, and FIG. As shown, an opening image 23a 'is formed in the region 24b.
  • the surface of the sample S has a slope that rises to the right as shown in FIG. 2B, when passing through the sample S, the light beam is refracted to the right and is confined in the region 24 c of the modulator 24. As shown in FIG.
  • an aperture image 23a ′ is formed in the region 14c. If the surface of the sample S has a slope that rises to the left as shown in FIG. 2C, the light beam is refracted to the left when passing through the sample S and forms an image in the region 24a of the modulator 24. Then, as shown in FIG. 3C, an aperture image 23a ′ is formed in the region 24a.
  • the sample S is a colorless transparent body having a flat surface and a slope as shown in FIG. 4A
  • the observed image is a flat surface portion as shown in FIG. 4B. Appears gray and the slopes appear black or white.
  • the modulation contrast observation method it is possible to observe a colorless and transparent sample as a three-dimensional image having a shadow by the different transmittance regions provided in the modulator 24 and the effect of oblique illumination. .
  • the illumination-side birefringence optical member that is a member used for observation by the differential interference observation method described above is used.
  • the member BP1 the imaging-side birefringent optical member BP2, the polarizer P, and the analyzer A
  • an aperture plate 23 and a modulator 24 are disposed between the light source 11 and the condenser lens 13 (in order from the light source 11 side). That's fine.
  • the numerical aperture of the second objective lens (high magnification objective lens) of the dry system is NA
  • the focal length is f
  • the working distance is WD
  • the shear amount on the object plane is S
  • the numerical aperture of the second objective lens is NA
  • the wavelength of the light to be observed is When ⁇ , it is preferable to satisfy the conditional expression (3) below.
  • conditional expression (1) that defines the appropriate numerical aperture NA range of the high-magnification objective lens will be described.
  • the size of the head of the sperm to be observed is about 4 to 5 ⁇ m, and the vacuole of the head on one focus surface has various sizes of about 1 to 10 in size. It is confirmed that they are scattered. Therefore, if a size of about 0.4 to 0.5 ⁇ m can be visualized and identified with good contrast, it can be seen that the level is sufficiently usable for IMSI applications.
  • FIG. 5 shows an MTF curve of an incoherent optical system generally used in a microscope optical system (that is, the relationship between the contrast shown on the vertical axis and the resolution of the optical system shown on the horizontal axis).
  • the lateral resolution of the microscope optical system is RES
  • the relationship with the lateral resolution RES corresponding to the spatial frequency f is expressed by the following equation (4).
  • the medium is air.
  • Refractive index n 1). Therefore, the upper limit value of the numerical aperture NA is 1.
  • the preferable numerical aperture NA of the high-magnification objective lens for enabling visual observation with high contrast is conditional expression (1), that is, 0.78 ⁇ NA ⁇ 1.0. Become. More preferably, from the conditional expression (8), the numerical aperture NA of the high-magnification objective lens is 0.89 ⁇ NA ⁇ 1.0.
  • conditional expression (2) that defines an appropriate range of the working distance WD in the high-magnification objective lens will be described.
  • a high numerical aperture immersion objective lens used as a high-magnification objective lens generally has a difficult working distance. For this reason, if the sample during operation is to be used for ICSI observation or IMSI observation, in which it is an absolute requirement to keep the sample at 37 ° C. with a heat retention device or the like, the tip of the objective lens is changed when the objective lens is switched from high magnification to medium magnification. There was a problem that the heat retaining device easily interferes.
  • the working distance WD represented by the conditional expression (2) is added to the numerical aperture NA represented by the conditional expression (1) by configuring the high-magnification objective lens with a dry system lens. It also has the condition of being large.
  • magnification of the objective lens is determined by the ratio between the focal length of the imaging lens and the objective lens (as in this embodiment, a high magnification objective lens having a magnification of 60 to 100 times). Then, for example, if the focal length of the imaging lens is 200 mm, the focal length of the objective lens is 2.00 to 3.33 m). The higher the magnification, the shorter the focal length. In general, since the working distance is proportional to the focal length of the objective lens, the working distance decreases as the magnification of the objective lens increases.
  • Another factor that determines the working distance is the numerical aperture. If the numerical apertures are the same, the longer the working distance, the higher the ray height on the first lens surface (object side lens surface) of the objective lens, making aberration correction more difficult.
  • the high magnification objective lens in the conventional microscope system emphasizes the working distance and the magnification and numerical aperture. It was polarized to what was important. Specifically, in the former case, a magnification of 60 times / a numerical aperture of 0.7 / a working distance of about 2 mm is a typical specification, and in the latter case, a magnification of 100 times / a numerical aperture of 1.4 / a working distance of around 0.1 mm. However, if the IMSI observation is used, the numerical aperture NA does not necessarily exceed 1 as shown in the conditional expression (1), and the working efficiency is improved by increasing the working distance accordingly.
  • conditional expression (2) that is, f / 3 ⁇ WD ⁇ 2f. Is preferably satisfied. If this conditional expression (2) is less than the lower limit value, there is a high possibility of causing problems such as the tip of the objective lens interfering with the heat retaining device when the objective lens is switched. On the other hand, if the conditional expression (2) exceeds the upper limit value, the light beam height on the first lens surface of the objective lens becomes too high, and it is difficult to ensure the numerical aperture NA defined by the conditional expression (1). Become.
  • FIG. 6 shows a phase contrast MTF curve when the shear amount S is changed from 1.5 ⁇ / NA to 0.15 ⁇ / NA (Note that the calculation method of the phase contrast MTF in the differential interference observation method is disclosed in Patent Documents). 3)
  • phase contrast MTF in the differential interference observation method does not take a larger contrast value than the incoherent MTF curve.
  • FIG. 6 shows that the phase contrast MTF takes a negative value when the shear amount S is large (for example, 1.5 ⁇ / NA). This is a state in which black and white called pseudo-resolution is inverted. .
  • the false resolution as described above does not occur, that is, the phase contrast MTF does not take a negative value.
  • the upper limit value of the shear amount S of the objective lens in the present embodiment is 0.61 ⁇ / NA that can maintain the point resolution.
  • a more preferable upper limit value of the shear amount S is 0.5 ⁇ / NA (which is closer to the incoherent MTF curve than the curve of 0.61 ⁇ / NA) and can maintain the line resolution.
  • the visibility in the high spatial frequency band can be maintained at 0.1, which is substantially equal to the contrast value of the incoherent MTF.
  • the lower limit value of the shear amount S of the objective lens in the present embodiment is 0.3 ⁇ / NA.
  • conditional expression (3) that is, 0.3 ⁇ / NA ⁇ S ⁇ 0.61 ⁇ / NA is satisfied, and more preferably, the shear amount S satisfies 0.3 ⁇ / NA ⁇ S ⁇ 0.5 ⁇ / NA.
  • differential interference observation method it is possible to observe the vacuole in the sperm head with high contrast by visual observation without substantially impairing the resolution of the objective lens.
  • the second objective lens (high-magnification objective lens) according to the present embodiment preferably has a correction ring that corrects aberration variations due to changes in the thickness, temperature, etc. of the cover glass. This is because the correction ring can be used to cancel the aberration caused by the thickness error of the cover glass, temperature, etc., and to make adjustments where the resolution and contrast of the objective lens are both optimal.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view showing a lens configuration of a second objective lens (drying system high magnification lens) according to the present embodiment.
  • the microscope objective lenses according to the present example are arranged in order from the object side, a positive meniscus lens L1 having a concave surface facing the object side, and a positive meniscus lens L2 having a concave surface facing the object side.
  • a cover glass C is disposed on the object side of the positive meniscus lens L1.
  • Table 1 shows the specification values of each lens constituting the second objective lens according to the present example.
  • m is the order of lens surfaces from the object side (hereinafter referred to as surface number) along the direction in which the light beam travels
  • r is the radius of curvature of each lens
  • d is each The distance on the optical axis from the optical surface to the next optical surface (or image surface)
  • nd represents the refractive index with respect to the d-line (wavelength 587.6 nm)
  • ⁇ d represents the Abbe number with respect to the d-line.
  • the surface numbers 1 to 25 in Table 1 correspond to the surfaces 1 to 25 shown in FIG.
  • ⁇ represents a magnification
  • WD represents a working distance
  • NA represents a numerical aperture.
  • mm is generally used as the unit of the radius of curvature r, the surface interval d, and other lengths. However, since the optical system can obtain the same optical performance even if it is proportionally enlarged or reduced, the unit is not limited to “mm”, and other appropriate units can be used.
  • the curvature radius “ ⁇ ” indicates a plane, and the description of the refractive index “1.00000” of air is omitted.
  • FIG. 8A and 8B are graphs showing various aberrations of the microscope objective lens according to this example.
  • FIG. 8A is a spherical aberration diagram
  • FIG. 8B is an astigmatism diagram
  • FIG. 8C is a distortion diagram.
  • NA is the numerical aperture
  • y is the image height (mm)
  • the solid line is the d line (wavelength 587.6 nm)
  • the broken line is the C line (wavelength 656.3 nm)
  • the alternate long and short dash line is the F line (wavelength). 486.1 nm)
  • the two-dot chain line represents the g-line (wavelength 435.8 nm).
  • the solid line indicates the sagittal image plane
  • the broken line indicates the meridional image plane.
  • the second objective lens dry high-magnification objective lens according to this example has various aberrations corrected satisfactorily and excellent imaging performance is ensured. I understand that.
  • sperm is observed and selected, such as the presence or absence of vacuoles in the sperm head, by a differential interference observation method using a high magnification (60 to 100 times) objective lens of a dry system. After that, the objective lens is switched by the turret 16 or the like, and the selected sperm is injected into the egg by the differential interference observation method or the modulation contrast observation method using the middle-fold (20 to 40 times) objective lens in the same dry system. It is possible to provide a microscope system suitable for IMSI / ICSI that can perform a series of operations accurately and quickly with good workability.

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Abstract

　顕微鏡システムは、光源（１１）と、コンデンサレンズ（１３）とを有する透過照明光学系と、微分干渉観察法および変調コントラスト観察法の少なくともいずれか一方による観察が可能である２０倍以上４０倍以下の第１の乾燥系対物レンズ（１５ａ）と、微分干渉観察法による観察が可能である６０倍以上１００倍以下の第２の乾燥系対物レンズ（１５ｂ）とを備え、第１の対物レンズ（１５ａ）と第２の対物レンズ（１５ｂ）とは切り替え使用可能であることを特徴とする。

Description

顕微鏡システム
　本発明は、微分干渉観察法および変調コントラスト観察法による観察を可能にした顕微授精用の顕微鏡システムに関する。
　現在、顕微授精法の一つとして、ＩＣＳＩ（Intra-cytoplasmic Sperm Injection：卵細胞質内精子注入法）が普及している。これは、変調コントラスト観察法（例えば、特許文献１を参照）を用いて精子の選別を行い、良好な運動性と形態とを持ちあわせた精子を卵子に注入する顕微授精法である。しかしながら、近年、ＩＶＦ（In Vitro Fertilization：体外受精）研究の進歩により、精子頭部内の空胞の有無、大きさや数等がＩＶＦ成功率に大きく関係していることが統計的に分かってきたが、この精子頭部内の空胞は従来のＩＣＳＩを行うための変調コントラスト観察法では観察が困難である。そこで、従来のＩＣＳＩに加えて、精子頭部内を詳細に観察して選別した上で顕微授精を行うＩＭＳＩ（Intra-cytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection：高倍率下で精子を選んで顕微授精を行う方法）を行える顕微鏡システムが提案されており、例えば、ＩＣＳＩに用いる変調コントラスト観察法と、ＩＭＳＩに用いる高倍対物レンズによる微分干渉観察法（例えば、特許文献２および３を参照）を併用して構成されている。
特開昭５１－１２８５４８号公報 特許第３４５６２５２号公報 特許第３４１５２９４号公報
　ところで、上記のような顕微授精など、生物顕微鏡分野における微分干渉観察法では、できるだけ微細な構造が観察できることが求められてきたため、一般に高倍レンズでは開口数（ＮＡ）の高い、液浸系の対物レンズが用いられてきた。その結果、従来の顕微鏡システムでは、高倍対物レンズには液浸系が、中低倍対物レンズには乾燥系が用いられることとなり、液浸系の高倍対物レンズでＩＭＳＩ観察を行った後、ＩＣＳＩ観察を行う乾燥系の中低倍対物レンズに切り換える際に、浸液が妨げとなってしまい、ＩＶＦの作業性を著しく損なうという問題があった。そこで、この問題を解決するため、ＩＣＳＩ観察を行う中低倍対物レンズにも、高倍対物レンズと同様に、液浸系対物レンズを用いるシステムが提案されている。しかしながら、このシステムでは、液浸系対物レンズ同士を切り替えて使用する際に浸液の粘度に起因してサンプル（一般にはディッシュ）が移動してしまい、高倍対物レンズで選別した精子を見失ったり、浸液中に気泡等が混入したりしやすいため、対物レンズの切り替え後のＩＣＳＩ観察に著しく困難をきたすおそれがあった。
　本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、乾燥系の高倍対物レンズによる微分干渉観察法で精子の観察および選別を行った後、切り替えた同じく乾燥系の低倍対物レンズによる微分干渉観察法もしくは変調コントラスト観察法で卵子内への前記選別した精子の注入を行うことにより、分解能を確保しつつ顕微授精の一連の作業を的確かつ迅速に行うことができる、ＩＭＳＩ／ＩＣＳＩに好適な顕微鏡システムを提供することを目的とする。
　このような目的を達成するため、本発明は、顕微授精用に好適な顕微鏡システムであり、光源と、コンデンサレンズとを有する透過照明光学系と、微分干渉観察法および変調コントラスト観察法の少なくともいずれか一方による観察が可能である２０倍以上４０倍以下の第１の乾燥系対物レンズと、微分干渉観察法による観察が可能である６０倍以上１００倍以下の第２の乾燥系対物レンズとを備え、前記第１の対物レンズと前記第２の対物レンズとは切り替え使用可能であることを特徴とする。
　以上説明したように、本発明によれば、適切な分解能を確保しつつ、顕微受精における一連の作業を迅速かつ的確に、作業性良く行うことができる、顕微授精用に好適な顕微鏡システムを提供することができる。
本実施形態に係る微分干渉観察法を用いた顕微鏡システムの概略断面図である。 本実施形態の顕微鏡システムに用いる別の観察法である、変調コントラスト観察法の原理を説明するための図である。 本実施形態に係る変調コントラスト観察法において、開口像と変調器との位置関係を説明するための図であり、（ａ），（ｂ），（ｃ）は図２の（ａ），（ｂ），（ｃ）にそれぞれ対応している。 本実施形態に係る変調コントラスト観察法において、（ａ）は試料の一形状例を、（ｂ）はこの試料に対応して現れる濃淡をそれぞれ示したものである。 本実施形態に係るインコヒーレント光学系のＭＴＦカーブを示す図である。 本実施形態に係る微分干渉観察法における位相試料のコントラストＭＴＦカーブを示す図である。 第１実施例に係る第２の対物レンズ（乾燥系高倍対物レンズ）の構成を示す断面図である。 第１実施例に係る第２の対物レンズの諸収差図であり、（ａ）は球面収差図、（ｂ）は非点収差図、（ｃ）は歪曲収差図である。
符号の説明
　１１　　光源（透過照明光学系）
　１２　　コレクタレンズ
　１３　　コンデンサレンズ（透過照明光学系）
　１４　　試料
　１５　　対物レンズ
　１５ａ　（微分干渉観察法による観察が可能な）中倍対物レンズ（第１の対物レンズ）
　１５ｂ　高倍対物レンズ（第２の対物レンズ）
　１６　ターレット
　ＢＰ１　照明側複屈折光学部材　
　ＢＰ２　結像側複屈折光学部材
　　Ｐ　　偏光子
　　Ａ　　検光子
　２２　　（変調コントラスト観察法による観察が可能な）中倍対物レンズ（第１の対物レンズ）
　２３　　開口板
　２３ａ　矩形状開口
　２４　変調器
　以下、好ましい実施形態について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る、主として顕微授精用に好適な顕微鏡システムの概略断面図を示す。本実施形態に係る顕微鏡システムは、ＩＭＳＩ（Intra-cytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection：高倍率下で精子を選んで顕微授精を行う方法）およびＩＣＳＩ（Intra-cytoplasmic Sperm Injection：卵細胞質内精子注入法）に好適であり、図１に示すように、光源１１およびコンデンサレンズ１３とからなる透過照明光学系と、コレクタレンズ１２と、試料１４と、対物レンズ１５と、ターレット１６と、照明側複屈折光学部材ＢＰ１と、結像側複屈折光学部材ＢＰ２と、偏光子Ｐと、検光子Ａとを有する。
　図１において、光源１１からの照明光はコレクタレンズ１２によって集光された後、偏光子Ｐに入射して直線偏光に変換される。偏光子Ｐと試料１４との間の光路中には光源１１側から順に、照明側複屈折光学部材ＢＰ１と、試料１４に照明光を照射するコンデンサレンズ１３とが配置されており、偏光子Ｐを射出された直線偏光は照明側複屈折光学部材ＢＰ１に入射して複屈折作用により振動方向が互いに直交する２つの直線偏光成分に分離され、コンデンサレンズ１３に入射する。照明側複屈折光学部材ＢＰ１で分離された２光線はわずかな分離角αを持って進行し、コンデンサレンズ１３の集光作用によって互いにわずかなシア量Ｓだけ離れた平行光線となって試料１４を照明する。試料１４上のわずかに離れた位置を透過した２光線は、対物レンズ１５を介して結像側複屈折光学部材ＢＰ２に入射し、結像側複屈折光学部材ＢＰ２の複屈折作用により合成されて同一光路上を進行する。合成された光線は検光子Ａに入射し、検光子Ａによって互いに直交する直線偏光中の同一方向振動成分だけが取り出されて干渉する。その結果、試料１４内のわずかに異なる位置を透過する際に２光線間に付与された位相差に応じた干渉縞が、像面上で拡大像（干渉像）１７を形成する。観察者は図示しない接眼光学系を介して、この拡大像１７を観察することができる。
　試料１４が平面で均質の場合には、（分離した２光線の間には位相の差がないため、）拡大像１７は強度分布が一様なコントラストのない像になる。一方、試料１４が不均質で、かつ勾配や段差がある場合、（分離した２光線の間に位相差が生じるため、）拡大像１７には屈折率変化のある部分や勾配、段差に相当する部分にコントラストが生じる。よって、屈折率の変化や勾配、段差が可視化され、試料１４を拡大観察することが可能となる。
　なお、対物レンズ１５は、２０倍以上４０倍以下の第１の対物レンズ（以下、乾燥系中倍対物レンズや中倍対物レンズと称することもある）１５ａと、微分干渉観察法によるコントラスト観察が可能である６０倍以上１００倍以下の第２の対物レンズ（以下、乾燥系高倍対物レンズや高倍対物レンズと称することもある）１５ｂとからなり、これら中倍対物レンズ１５ａと高倍対物レンズ１５ｂとはターレット１６等により切り替え使用可能に構成されている。
　また、第１の対物レンズ１５ａは、上記の微分干渉観察法、もしくは変調コントラスト観察法の少なくともいずれか一方による観察が可能であることが好ましい。ここで、変調コントラスト観察法について、図２～図４を用いてその原理を簡単に説明する。図中、２１はコンデンサレンズ、Ｓは試料、２２は対物レンズ、２３は開口板、２４は円盤状の変調器である。なお、開口板２３は、コンデンサレンズ２１の光源側焦点位置で、中心部から離れた位置に矩形状開口２３ａを有している。また、変調器２４は、開口板２３と略共役な位置に配置され、開口２３aの像を含み得る透過率１００％の領域２４ａと、例えば透過率１５％の領域２４ｂと、透過率０％の領域２４ｃとが順に隣接して配置形成されている。
　この光学系では、矩形状開口２３ａが光軸から偏心した位置に配置されているので、コンデンサレンズ２１に入射した光は試料Ｓを斜め方向から照明するように射出する。このとき、透明な試料Ｓが図２（ａ）に示すように扁平であると、試料Ｓを透過した光束は対物レンズ２２により変調器２４の領域２４ｂ内に結像し、図３（ａ）に示すように領域２４ｂ内に開口像２３ａ´が形成される。また、試料Ｓの表面が図２（ｂ）に示すように右肩上がりの斜面となっていると、試料Ｓを透過するとき光束は右方へ屈折して変調器２４の領域２４ｃ内に結像し、図３（ｂ）に示すように領域１４ｃ内に開口像２３ａ´が形成される。また、試料Ｓの表面が図２（ｃ）に示すように左肩上がりの斜面となっていると、試料Ｓを透過するとき光束は左方へ屈折して変調器２４の領域２４ａ内に結像し、図３（ｃ）に示すように領域２４ａ内に開口像２３ａ´が形成される。
　この説明で明らかなように、試料Ｓが図４（ａ）に示すような平坦面と斜面とを有する無色透明体である場合、その観察像は図４（ｂ）に示すように平坦面部分は灰色に、斜面部分は黒または白く見える。このように、変調コントラスト観察法では、変調器２４に設けた異なる透過率領域と偏斜照明の効果とにより、無色透明な試料でも陰影を持つ立体感のある像として観察することが可能となる。
　なお、本顕微鏡システムにおいて、変調コントラスト観察法によるコントラスト観察が可能な中倍対物レンズ１５ａを採用する場合は、上記した微分干渉観察法による観察のために用いた部材である、照明側複屈折光学部材ＢＰ１、結像側複屈折光学部材ＢＰ２、偏光子Ｐおよび検光子Ａに換えて、光源１１とコンデンサレンズ１３との間に（光源１１側から順に）開口板２３と変調器２４を配置すればよい。
　本実施形態に係る顕微鏡システムにおいて、乾燥系の第２の対物レンズ（高倍対物レンズ）の開口数をＮＡとし、焦点距離をｆとし、作動距離をＷＤとしたとき、次式（１）および（２）の条件式を満足することが好ましい。
　０．７８≦ＮＡ＜１．０　…（１）
　ｆ／３　≦ＷＤ＜２ｆ　　…（２）
　また、前記第２の対物レンズを用いて微分干渉観察法による観察を行う場合に、物体面におけるシア量をＳとし、前記第２の対物レンズの開口数をＮＡとし、観察する光の波長をλとしたとき、次式（３）の条件式を満足することが好ましい。
　０．３≦Ｓ≦０．６１λ／ＮＡ　…（３）
　従来、生物顕微鏡の分野における、高倍（６０倍以上１００倍以下）で高開口数の液浸対物レンズによる微分干渉観察法による観察では、重要視されるのは分解性能の良さについてであり、ビデオエハンス等の画像処理手法を介在することが前提となっていた。ところが、ＩＭＳＩ等の顕微授精を行う際には、精子を高倍観察して広範囲の（多くの）精子からより良好なものを選別した後に、この選別した精子を中倍観察下で卵子に注入するという一連の作業を迅速かつ的確に行うため、あくまで目視観察が基本である。このため、目視において十分なコントラストが得られることが望まれていたが、これを満足するような微分干渉観察法による観察可能な対物レンズの最適条件の提示は今までなかった。そこで、本顕微鏡システムでは、微分干渉観察法による観察が可能な第２の対物レンズ（高倍対物レンズ）の最適な条件式（１）～（３）を導き出した。以下、これら条件式（１）～（３）について順に説明する。
　まず、高倍対物レンズの適切な開口数ＮＡの範囲を規定する、条件式（１）について説明する。本顕微鏡システムにおいて、観察対象である精子の頭部の大きさは４～５μｍ程度であり、一つのピント面に頭部の空胞は１個乃至１０個程度の大小様々な大きさのものが散らばっていることが確認されている。従って、０．４～０．５μｍ程度の大きさがコントラスト良く可視化・識別できれば、ＩＭＳＩ用途として十分使えるレベルであることが分かる。
　図５に、顕微鏡光学系で一般に用いられるインコヒーレント光学系のＭＴＦカーブ（すなわち、縦軸に示すコントラストと横軸に示す光学系の分解能との関係）を示す。なお、図５の横軸ｆ／ｆ０は、空間周波数をｆとし、対物レンズの開口数をＮＡとし、観察する光の波長をλとしたとき、空間周波数ｆをｆ０＝ＮＡ／λで規格化したものである。顕微鏡光学系の横分解能をＲＥＳとすると、前記空間周波数ｆに対応する横分解能ＲＥＳとの関係は次式（４）で示される。
　ＲＥＳ＝１／ｆ＝｛１／（ｆ／ｆ０）｝×｛λ／ＮＡ｝　…（４）
　ここで、図５に示す横軸ｆ／ｆ０の最大値＝２．０が、顕微鏡光学系における限界分解能ＲＥＳ（max）と対応している。そこで、上記の式（４）にｆ／ｆ０＝２．０を代入することにより、顕微鏡光学系における限界分解能ＲＥＳ（max）を示す、次式（５）が得られる。この条件式（５）で規定される限界分解能ＲＥＳ（max）に相当する開口数ＮＡよりもさらに余裕を持たないと、目視で像を視認することが難しい。
　ＲＥＳ（max）＝｛１／２．０｝×｛λ／ＮＡ｝＝０．５λ／ＮＡ　…（５）
　また、一般に、人間の眼は、コントラストの値が０．１以下であれば見分けることが困難であることと、コントラストの値が０．２以上であれば視感度が良いことが知られている。図５において、コントラストの値が０．１となる空間周波数ｆ／ｆ０は１．６付近であることから、横分解能ＲＥＳが０．４μｍ（観察対象である精子頭部の空胞の大きさ）となるためには、式（４）にこれらの値を代入して、次式（６）を満足する必要がある。
　ＲＥＳ＝｛１／１．６｝×｛λ／ＮＡ｝＝０．４　…（６）
　なお、本顕微鏡システムの使用目的であるＩＭＳＩやＩＣＳＩでは目視観察が前提となるため、眼の視感度を考えると、観察時の中心波長λは５００ｎｍ～５５０ｎｍ近傍であることが望ましい。これは、５００ｎｍは暗所、５５０ｎｍは明所における眼の視感度のピークだからである。よって、観察の中心波長λ＝５００ｎｍ＝０．５μｍとして式（６）に代入すると、高倍対物レンズに必要な開口数ＮＡの最下限値として、次式（７）が得られる。
　ＮＡ＝｛１／１．６｝×０．５［μｍ］／０．４［μｍ］＝０．７８　…（７）
　また、視感度が良いとされるコントラストの値が０．２となる空間周波数ｆ／ｆ０は図５より１．４付近であることから、上記と同様に式（６）に代入すると、より好ましい開口数ＮＡの最下限値として、次式（８）が得られる。
　ＮＡ＝｛１／１．４｝×０．５［μｍ］／０．４［μｍ］＝０．８９　…（８）
　また、開口数ＮＡは、対物レンズと試料間の媒質の屈折率ｎと対物レンズの開口角φを用いるとＮＡ＝ｎ・sin（φ／２）で表され、本実施形態においては媒質が空気（屈折率ｎ＝１）である。ゆえに、開口数ＮＡの上限値は１となる。
　以上まとめると、本実施形態の顕微鏡システムにおいて、コントラスト良く目視観察可能に構成するための好ましい高倍対物レンズの開口数ＮＡの範囲は、条件式（１）すなわち０．７８≦ＮＡ＜１．０となる。さらに、より好ましくは、条件式（８）より、高倍対物レンズの開口数ＮＡの範囲は、０．８９≦ＮＡ＜１．０となる。
　次に、高倍対物レンズにおける作動距離ＷＤの適切な範囲を規定する、上記条件式（２）について説明する。従来の顕微鏡システムにおいて、高倍対物レンズとして用いられていた高開口数の液浸系対物レンズは、一般に作動距離が大きく取ることが難しかった。このため、操作時のサンプルを保温装置等により３７℃に保温することが絶対条件であるＩＣＳＩ観察やＩＭＳＩ観察で用いようとすると、高倍から中倍への対物レンズ切り替え時に対物レンズの先端部と保温装置が干渉しやすいという問題があった。また、作動距離が大きく取れないことから、高開口数の液浸系対物レンズではカバーガラス直下近傍しか観察することができず、カバーガラスから離れた位置にある精子を選別対象にすることができないという問題があった。そこで、本顕微鏡システムは、高倍の対物レンズを乾燥系レンズで構成することで、条件式（１）で示される開口数ＮＡの条件に加えて、条件式（２）で示される作動距離ＷＤが大きいという条件も兼ね備える。
　作動距離を決定する一つの要素として、対物レンズの倍率がある。対物レンズの倍率は、無限遠補正光学系の場合、結像レンズと対物レンズの焦点距離との比によって決定されるものであり（本実施形態のように６０倍以上１００倍以下の高倍対物レンズでは、例えば、結像レンズの焦点距離を２００ｍｍとすると、対物レンズの焦点距離は２．００～３．３３ｍとなる）、高倍になるほど焦点距離は短くなる。一般に、作動距離は対物レンズの焦点距離に比例するため、対物レンズの倍率が高倍になるほど作動距離は減少する。また、作動距離を決定する他の要素として、開口数がある。開口数の大きさが同じであれば、作動距離が長くなるほど、対物レンズの第１レンズ面（物体側レンズ面）における光線高さが高くなり、収差補正をより困難にする。
　つまり、対物レンズの長作動距離化と高倍率化・高開口数化とは相反する関係にあるため、従来の顕微鏡システムにおける高倍対物レンズでは、作動距離を重視したものと、倍率・開口数を重視したものとに二極化していた。具体的には、前者では倍率６０倍／開口数０．７／作動距離２ｍｍ前後が、後者では倍率１００倍／開口数１．４／作動距離０．１ｍｍ前後が、代表的なスペックである。しかしながら、ＩＭＳＩの観察を用途とするならば、上記条件式（１）に示すように必ずしも開口数ＮＡが１を超える必要はなく、その分作動距離を長くするほうが作業効率の向上につながる。
　そこで、高倍対物レンズ（第２の対物レンズ）の開口数をＮＡとし、焦点距離をｆとし、作動距離をＷＤとしたとき、本実施形態では条件式（２）すなわちｆ／３≦ＷＤ＜２ｆを満足することが好ましい。この条件式（２）が下限値を下回ると、対物レンズの切り替え時に対物レンズの先端部が保温装置と干渉する等の不具合を引き起こす可能性が高くなる。一方、条件式（２）が上限値を上回ると、対物レンズの第１レンズ面における光線高さが高くなり過ぎて、条件式（１）で規定された開口数ＮＡを確保するのが困難となる。
　続いて、微分干渉観察法におけるシア量Ｓの最適な範囲を規定する、上記条件式（３）について説明する。図６に、シア量Ｓを１．５λ／ＮＡから０．１５λ／ＮＡまで変化させたときの位相コントラストＭＴＦカーブを示す（なお、微分干渉観察法における位相コントラストＭＴＦの算出方法については、特許文献３に詳しい）。図６において、横軸ｆ／ｆ０は空間周波数ｆを対物レンズの開口数ＮＡで規定される基準周波数ｆ０＝ＮＡ／λで規格化したものを、縦軸は各周波数における位相物体のコントラストＭＴＦを示す。
　図６から、微分干渉観察法における位相コントラストＭＴＦは、インコヒーレントＭＴＦカーブよりも大きなコントラストの値を取らないことが分かる。また、図６から、（例えば１．５λ／ＮＡのように）シア量Ｓが大きいと位相コントラストＭＴＦが負値を取ることが分かるが、これは偽解像と呼ばれる白黒が反転した状態である。一般に、微分干渉観察法による観察では、上記のような偽解像が起こらない、すなわち位相コントラストＭＴＦが負値を取らない状態が好ましいとされている。
　そこで、位相コントラストＭＴＦが負値を取らない条件を満たす、低空間周波数帯域（横軸ｆ／ｆ０の値が小さい領域）の限界についてまず考える。図６より、低空間周波数帯域の最大のシア量Ｓは、約０．６１λ／ＮＡ乃至０．５λ／ＮＡであることが分かり、これらの値はちょうど顕微鏡光学系の点分解能や線分解能に相当している。図６においてシア量Ｓが０．６１λ／ＮＡのカーブを見ると、低空間周波数帯域のコントラストの値は高いが、高空間周波数帯域の横軸ｆ／ｆ０＝１．４付近でのコントラストの値が０．１程度となり、ちょうど視認度の限界に当たることが分かる。よって、本実施形態における対物レンズのシア量Ｓの上限値は、点分解能を維持できる０．６１λ／ＮＡとなる。また、より好ましいシア量Ｓの上限値は、（前記０．６１λ／ＮＡのカーブよりインコヒーレントＭＴＦカーブにより近くであり、）線分解能を維持できる０．５λ／ＮＡとなる。
　次に、位相コントラストＭＴＦが負値を取らない条件を満たす、高空間周波数帯域（横軸ｆ／ｆ０の値が大きい領域）の限界を考える。図６より、高空間周波数帯域の最大のシア量Ｓは、横軸ｆ／ｆ０＝１．６付近で最大コントラストを取るカーブ、すなわち０．３λ／ＮＡのカーブであることが分かる。このとき、低空間周波数帯域のコントラストをある程度犠牲にする代わりに、高空間周波数帯域での視認度を、インコヒーレントＭＴＦのコントラストの値とほぼ同等の０．１に保つことができる。また、これによりもシア量Ｓを小さくすると、低空間周波数帯域でも高空間周波数帯域でもそれぞれコントラストが低下するため、本実施形態の使途には好ましくない。よって、本実施形態における対物レンズのシア量Ｓの下限値は０．３λ／ＮＡとなる。
　以上まとめると、上記条件式（３）すなわち０．３λ／ＮＡ≦Ｓ≦０．６１λ／ＮＡを満足する、より好ましくは０．３λ／ＮＡ≦Ｓ≦０．５λ／ＮＡを満足するシア量Ｓを設定することにより、微分干渉観察法において対物レンズの分解能を殆ど損なわず、且つ目視にて精子頭部内の空胞を高いコントラストで観察することが可能となる。
　なお、本実施形態に係る第２の対物レンズ（高倍対物レンズ）は、カバーガラスの厚さや温度等の変化による収差変動を補正する補正環を有することが好ましい。これは、補正環を用いることによって、カバーガラスの厚み誤差や温度等により発生した収差を打ち消し、対物レンズの解像度およびコントラストを共に最良となるところで調整をすることができるからである。
　以下、本実施形態に係る第２の対物レンズ（乾燥系高倍対物レンズ）の実施例について説明する。
（第１実施例）
　第１実施例について、図７、図８及び表１を用いて説明する。図７は、本実施例に係る第２の対物レンズ（乾燥系高倍レンズ）のレンズ構成を示す断面図である。図７に示すように、本実施例に係る顕微鏡用対物レンズは、物体側より順に並んだ、物体側に凹面を向けた正メニスカスレンズＬ１と、物体側に凹面を向けた正メニスカスレンズＬ２と、両凹レンズＬ３と両凸レンズＬ４とからなる接合レンズと、両凹レンズＬ５と両凸レンズＬ６とからなる接合レンズと、平凹レンズＬ７と両凸レンズＬ８とからなる接合レンズと、両凸レンズＬ９と、像側に凹面を向けた負メニスカスレンズＬ１０と両凸レンズＬ１１と物体側に凹面を向けた負メニスカスレンズＬ１２とからなる接合レンズと、両凸レンズＬ１３と両凹レンズＬ１４とからなる接合レンズと、両凹レンズＬ１５と両凸レンズＬ１６とからなる接合レンズとを有して構成されている。なお、正メニスカスレンズＬ１の物体側には、カバーガラスＣが配置されている。
　表１は、本実施例に係る第２の対物レンズを構成する各レンズの諸元値を示している。表１に示す諸元の表において、ｍは光線の進行する方向に沿った物体側からのレンズ面の順序（以下、面番号と称する）を、ｒは各レンズの曲率半径を、ｄは各光学面から次の光学面（又は像面）までの光軸上の距離を、ｎｄはｄ線（波長587.6ｎｍ）に対する屈折率を、νｄはｄ線を基準としたアッベ数を示している。なお、表１における面番号１～２５は、図７に示す面１～２５に対応している。また、表中において、βは倍率を、ＷＤは作動距離を、ＮＡは開口数を表している。
　なお、表中において、曲率半径ｒ、面間隔ｄ、その他の長さの単位は、一般に「ｍｍ」が使われている。但し、光学系は、比例拡大または比例縮小しても同等の光学性能が得られるので、単位は「ｍｍ」に限定されることなく、他の適当な単位を用いることが可能である。また、表中において、曲率半径の「∞」は平面を示し、空気の屈折率「1.00000」の記載は省略している。
（表１）
［レンズ諸元］
　β＝100、ＷＤ＝1.4、ＮＡ＝0.85
　　ｍ　　　　　ｒ　　　　　　ｄ　　　　　ｎｄ　　　　νｄ
　　　　　　　　∞　　　　　0.17000　　　1.52216　　　58.80　（カバーガラスＣ）
　　　　　　　　∞　　　　　2.50462
　　１　　　-6.47161　　　　2.37000　　　1.81600　　　46.621
　　２　　　-4.72849　　　　0.10000
　　３　　　-83.0402　　　　2.83000　　　1.49782　　　82.557
　　４　　　-10.6607　　　　0.15000
　　５　　　-46.5266　　　　1.00000　　　1.61340　　　44.266
　　６　　　24.27074　　　　4.95000　　　1.43385　　　95.247
　　７　　　-14.7782　　　　0.20000
　　８　　　-174.834　　　　1.00000　　　1.61340　　　44.266
　　９　　　24.11495　　　　4.95000　　　1.43385　　　95.247
　　１０　　-14.5394　　　　0.20000
　　１１　　　　∞　　　　　1.00000　　　1.61340　　　44.266
　　１２　　28.67355　　　　4.20000　　　1.43385　　　95.247
　　１３　　-23.0153　　　　0.20000
　　１４　　48.93548　　　　3.00000　　　1.49782　　　82.557
　　１５　　-65.8669　　　　1.52002
　　１６　　21.78198　　　　1.00000　　　1.72916　　　54.660
　　１７　　11.99437　　　　6.30000　　　1.49782　　　82.557
　　１８　　-12.5334　　　　1.20000　　　1.75500　　　52.318
　　１９　　-59.9845　　　　7.75003
　　２０　　27.89895　　　　3.35000　　　1.59240　　　68.328
　　２１　　-7.03528　　　　8.40000　　　1.65412　　　39.682
　　２２　 　5.87805　　　　1.40000
　　２３　　-4.44814　　　　1.00000　　　1.80440　　　39.567
　　２４　 　11.0118　　　　1.90000　　　1.92286　　　18.896
　　２５　　-11.4804
　図８は、本実施例に係る顕微鏡用対物レンズの諸収差図であり、（ａ）は球面収差図、（ｂ）は非点収差図、（ｃ）は歪曲収差図を示す。また、図８において、ＮＡは開口数を、ｙは像高（ｍｍ）を、実線はｄ線（波長587.6nm）を、破線はＣ線（波長656.3nm）を、一点鎖線はＦ線（波長486.1nm）を、二点鎖線はｇ線（波長435.8nm）をそれぞれ示している。また、非点収差図において、実線はサジタル像面、破線はメリディオナル像面をそれぞれ示している。
　図８に示す各収差図から明らかであるように、本実施例に係る第２の対物レンズ（乾燥系高倍対物レンズ）は、諸収差が良好に補正され、優れた結像性能が確保されていることが分かる。
　以上説明したように、本発明によれば、乾燥系の高倍（６０倍以上１００倍以下）対物レンズによる微分干渉観察法により、精子頭部内の空胞の有無など精子の観察および選別を行った後、ターレット１６等により対物レンズの切り替えを行い、選別した精子を同じく乾燥系の中倍（２０倍以上４０倍以下）対物レンズによる微分干渉観察法もしくは変調コントラスト観察法で卵子に注入するという一連の作業を、的確かつ迅速に作業性良く行うことができる、ＩＭＳＩ／ＩＣＳＩに好適な顕微鏡システムを提供することができる。
　なお、本発明を分かりやすくするために、実施形態の構成要件を付して説明したが、本発明がこれに限定されるものではないことは言うまでもない。

Claims (4)

  1. 　光源と、コンデンサレンズとを有する透過照明光学系と、
    　微分干渉観察法および変調コントラスト観察法の少なくともいずれか一方による観察が可能である２０倍以上４０倍以下の第１の乾燥系対物レンズと、
    　微分干渉観察法による観察が可能である６０倍以上１００倍以下の第２の乾燥系対物レンズとを備え、
    　前記第１の対物レンズと前記第２の対物レンズとは切り替え使用可能であることを特徴とする顕微授精用の顕微鏡システム。
  2. 　前記第２の対物レンズの開口数をＮＡとし、焦点距離をｆとし、作動距離をＷＤとしたとき、次式
    　０．７８≦ＮＡ＜１．０
    　ｆ／３　≦ＷＤ＜２ｆ
    の条件を満足することを特徴とする請求項１に記載の顕微授精用の顕微鏡システム。
  3. 　前記第２の対物レンズを用いて微分干渉観察法による観察を行う場合に、物体面におけるシア量をＳとし、前記第２の対物レンズの開口数をＮＡとし、観察する光の波長をλとしたとき、次式
    　０．３≦Ｓ≦０．６１λ／ＮＡ
    の条件を満足することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微授精用の顕微鏡システム。
  4. 　前記第２の対物レンズは、カバーガラスの厚さや温度等の変化による収差変動を補正する補正環を有することを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の顕微授精用の顕微鏡システム。
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