WO2009095189A1 - Verfahren zum sensitiven nachweis von polyaminosäuren und anderen makromolekülen - Google Patents

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Universitaet Leipzig
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    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G01N33/683—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving metal ions

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting an analyte, which preferably contains polyamino acids or other macromolecules, by luminescence labeling in gels and on solid supports using lanthanide ions, such as. Europium (III), terbium (III), ammonium (III), neodymium (III) or dysprosium (III) complexes.
  • lanthanide ions such as. Europium (III), terbium (III), ammonium (III), neodymium (III) or dysprosium (III) complexes.
  • polyamino acids The detection and analysis of polyamino acids are important in various commercial and scientific applications.
  • polyamino acid any homopolymer or heteropolymer of amino acids including peptides, proteins and nucleic acids is considered.
  • Polyamino acids are typically detected and characterized by gel electrophoresis, solution quantification assays or by detection on solid supports such as filter membranes.
  • filter membranes are nitrocellulose membranes or polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • CBB staining Coomassie Brilliant Blue staining
  • silver staining is about 100 to 1000 times more sensitive than CBB staining, but both share some drawbacks.
  • CBB staining and silver staining are both relatively insensitive staining and have only a narrow range of linear quantifiability for densitometric evaluation.
  • the labeled gels can not be blotted for further analysis.
  • both CBB staining and silver staining require colorimetric detection procedures, ie, proteins are detected by the presence of labeled or opaque bands in the electrophoresis gel.
  • luminescent reagents to detect proteins offers the potential for greatly increased sensitivity and a larger linear quantification range, while at the same time increasing the ease of application of the labeling reagent.
  • luminescent is meant any reagent that luminesces, ie, phosphorescents, fluoresces, chemiluminesces, or electroluminesces.
  • Fluorescent reagents have already been used to label polyamino acids, such as the dye Nilrot (9-diethylamino-5H-benzo (alpha) phenoxazin-5-one) (see Daban et al, Anal )). Further examples of frequently used fluorescent reagents belong to the family of cyanine dyes (also called Cy dyes) (see Ernst LA, Gupta RK, Mujmdar RB, Wagoner AS, Cyanine dye labeling reagents for sulfhydryl groups, Cytometry 1989, 10 (1): 3-10). Cyanine dyes have been used, inter alia, as fluorescent dyes for polyamino acids in gels, on membranes or other supports.
  • organic fluorescent dyes typically suffer from the disadvantage of high background staining on solid supports and gels and rapid fading upon illumination.
  • the linear ranges of the dyes described above extend over three to four orders of magnitude as described in the publications cited.
  • the polyamino acid concentrations in a biological sample may extend up to 10 orders of magnitude (Seilers TA and Yates JR Review of Proteomics with Applications to Genetic Epidemiology, Genet Epidemiol 24: 83-98, 2003). It is therefore understood that a marking method that has a linear range of more than four orders of magnitude is desirable.
  • polyamino common detection method for example, 2D-gels, native and non-native 1-D gels 1 include isoelectric focusing, dot blots, slot blots, differential gel electrophoresis, chromatographic separation techniques, capillary electrophoresis, and others.
  • the difficulties with these techniques lie in the detection of small amounts of protein, due to limitations in the dynamic range of the detection methods, and in the identification of an individual polyamino acid in a complex mixture.
  • Biomedical specimens that are typically analyzed include, for example, body fluids such as plasma, serum, corticospinal fluid, blood and others as well as tissue specimens of various types.
  • the object of the invention is to specify a method for specifically detecting individual polyamino acids or groups of polyamino acids and nucleic acids. It should be examined to what extent a luminescent marker containing complexed lanthanide ions can be coupled to other polyamino acids which specifically recognize the polyamino acids to be detected (for example antibodies) and to what extent a luminescence marker can be coupled directly to the polyamino acids to be detected.
  • a marking method is to be specified which has a linear range of more than four orders of magnitude and high light stability.
  • the object is achieved according to the main claim accordingly.
  • the decisive factor is the use of individual selected lanthanide complexes as luminescence markers (hereinafter referred to as LM).
  • the LMs consist of a light-trapping unit (antenna), a chelate-forming skeleton, a functionality for coupling to polyamino acids, and a lanthanoid central portion (hereinafter referred to as Ln (III)).
  • Ln lanthanoid central portion
  • This compound is preferably used and referred to as LM precursor 1.
  • This compound is preferably used and referred to as LM 1.
  • the type of target polyamino acid is controlled by the coupling functionality.
  • maleimide is mainly used as the covalent sulfhydryl coupling reagent, because in this case the charge of the labeled polyamino acid does not change.
  • Essential to the invention is the measurement of the labeled polyamino acids using time-resolved luminescence spectroscopic methods.
  • Time-resolved luminescence measurements enable the differentiation between fluorescence and phosphorescence effects.
  • Phosphorescence is a specific type of luminescence that differs from fluorescence in that it has a longer lifetime.
  • a phosphorescent material emitted after light absorption time delayed longer-wave radiation. Fluorescent materials emit light excitation in the nanosecond range, whereas phosphorescent materials emit the absorbed radiation in micro to milliseconds. It is therefore possible to measure the phosphorescence separately, even if the measured material or the measured sample have a strong fluorescence. This is done by time-delayed measurement after light excitation of the material to be measured or the sample to be measured.
  • the invention relates to the phosphorescence emission of polyamino acids in gels and on solid supports using LM, which contain europium (III), terbium (III), samarium (III), neodymium (III) or dysprosium (III) as central ions.
  • LM which contain europium (III), terbium (III), samarium (III), neodymium (III) or dysprosium (III) as central ions.
  • An essential aspect of the invention is a novel polyamino acid detection technique which differs in handling from the conventional labeling technique in that LM is covalently bound to the analyte.
  • the LM is covalently linked to polyamino acids.
  • Another aspect of the invention is the use of europium (III), terbium (III), samarium (III), neodymium (III) or dysprosium (III) central ions to label polyamino acids by time-delayed detection with significantly higher sensitivity as customary, today known dyeing process for polyamino acids with at the same time a larger linear signal to concentration ratio and higher light stability.
  • the detection of polyamino acids requires a possibility to specifically detect individual polyamino acids or groups of polyamino acids. This goal can be achieved by coupling the LM to other polyamino acids which specifically recognize the polyamino acids to be detected (for example antibodies) or by coupling the LM directly to the polyamino acids to be detected. Coupling the LM to polyamino acids is therefore covalent to ensure high stability of LM-analyte binding under conditions in which the following parameters may be subject to change: stress, temperature, pH, hydrophobicity, enzyme activities, electromagnetic radiation, interfering organic and inorganic substances, radioactivity and others.
  • a covalent linkage will be a single covalent bond or a combination of stable chemical bonds, optionally including single, double, triple or aromatic carbon-carbon bonds, as well as carbon-nitrogen bonds, nitrogen-nitrogen bonds, sulfur-nitrogen Bonds, carbon-oxygen bonds, carbon-sulfur bonds, phosphorus-oxygen bonds, and phosphorus-nitrogen bonds.
  • Suitable for the covalent linkage are free amino, carboxylate and sulfhydryl groups of polyamino acids.
  • the LM precursor is bound to the polyamino acid by means of one of the coupling functions X or Y:
  • the labeling process is completed by adding the lanthanum salt solution to the mixture.
  • the formation of the corresponding complex can be monitored by luminescence or UV-Vis spectroscopy.
  • the present invention utilizes the LMs described above to label an analyte, followed by detection of the binding of the LM to the analyte and optionally its quantification or other analysis.
  • the analyte is typically a biomolecule.
  • the analyte is a polyamino acid.
  • the analyte is labeled by first adding Ln (III) -free LM (hereinafter referred to as LM precursor) to a sample mixture suspected to contain the analyte such that following aliquot addition of Ln (III ) Ions, an optical luminescence effect after light excitation is observed.
  • LM precursor Ln (III) -free LM
  • a rapid method for detecting an analyte comprises the following steps:
  • Additional steps are optionally and independently used in any combination before, after, or concurrently with the label to provide for separation or purification of the analyte, to enhance detection of the analyte, to quantitate the analyte, to identify a specific analyte, or A group of analytes, for example by using an immunological reagent such as an antibody, an aptamer or a lectin.
  • an immunological reagent such as an antibody, an aptamer or a lectin.
  • the analyte is a biomolecule. In another embodiment, the analyte is a polyamino acid. In another embodiment, the analyte is a polyamino acid having post-translational modifications. Posttranslational modifications are defined as chemical modifications of a polyamino acid after its naturally occurring translation process.
  • post-translational modifications include phosphorylation, ubiquitination, methylation, glycosylation, glycation, SUMOylation, acylation, alkylation, methylation, amidation tion, biotinylation, formylation, carboxylation, glutamylation, glyoxylation, hydroxylation, isoprenylation, lipoylation, myristoylation, farnesylation, geranylgeranylation, ADP-ribosylation, oxidation, pegylation, phosphopantetheinylation, pyroglutamate formation, sulfation, selenoylation, ISGylation and others.
  • the analyte is a polyamino acid that has been chemically modified resulting in a polyamino acid modification that does not naturally occur.
  • Examples of chemical modifications that result in a polyamino acid modification that does not occur naturally are listed in the ABRF (Association of biomolecular resource facilities) database at www.abrf.org.), But these are not limited to the examples given.
  • the analyte is a biomolecule having at least one nucleic acid.
  • the analyte is a polymer which is a polyamino acid.
  • the present invention is used to detect the desired analyte by combining a sample mixture that is believed to contain the analyte with a marker mixture that is combined with at least one of the LMs of the present invention.
  • Ln (III) ions As a rule, it is necessary to combine one of the mentioned Ln (III) ions with the LM precursor in order to obtain a detectable luminescence.
  • the complex formation of the LM precursor with the Ln (III) ions can take place before the coupling to polyamino acids, DNA, RNA or PNA, but also after the coupling of the LM precursor to the polyamino acids, DNA, RNA or PNA with subsequent Ln (III) ion incubation take place.
  • incubation of the LM with europium (III), terbium (III), samarium (III) neodymium (III) or dysprosium (III), coupled or not coupled may take place at the following time points of analysis:
  • Incubation with the above-mentioned lanthanide ions may also take place at more than one time to enhance the signal obtained by the optical response upon illumination.
  • the sample mixture is irradiated in the above-mentioned applications with a suitable excitation wavelength to obtain a detectable luminescence signal.
  • this wavelength is in the range of 280 nm to 400 nm.
  • this wavelength is in the range of 350 nm to 370 nm.
  • this wavelength is 360 nm.
  • the luminescence signal is observed at at least one suitable emission wavelength.
  • this wavelength is in the range of 280 nm to 800 nm.
  • this wavelength is in the range of 500 nm to 700 nm.
  • these wavelengths are around 595 nm and 616 nm.
  • the solution according to the invention is realized with a test kit which is composed as described below.
  • Components of the test kit are: a solution of the europium (III), terbium (III), samarium (III), neodymium (III) or dysprosium (III) ions of specified concentration
  • test kit
  • test kit contains the following components:
  • test kit a) dissolve the lyophilized antibody in 100 ⁇ l PBS, vortex b) Western blot of a 1D or 2D gel onto the supplied PVDF membrane as described in the literature (see eg http: // www c) blocking the membrane with, for example, milk powder, washing steps, incubating the membrane with primary antibody as desired, washing steps as described in the literature, eg http://www.westernblotting.org /protocols%20western%20blot.htm) d) Mix the lyophilized antibody from step a) with the supplied (lll) chloride solution: 1 ⁇ l of antibody plus 1 ⁇ l of europium (III) chloride solution per 2 ml of TBS-T (Tris buffered saline). Tween 20) Incubation with Western Blot for 1 hour, three times with TBS-T. e) Measurement of the PVDF membrane at 616nm emission wavelength and 360nm excitation wavelength.
  • Selected LMs are used, which are coupled to proteins after chemical activation and complexed with europium ions. After excitation in the UV range, the radiated energy is transferred to the complexed europium ion. The luminescence of the complexed europium ion is measured. Since the phosphorescence of these europium compounds decays much more slowly than the background fluorescence of the membrane, the proteins labeled with the new LMs can be detected very sensitively on the membrane by means of time-resolved spectroscopic methods. The complex is stable during the electrophoretic separation and the proteins can then be detected in both the gel and the blot membrane with approximately the same sensitivity. The detection limits are 0.3 ng per band (bovine serum albumin).
  • the detection limit is 0.5 ⁇ g per spot (bovine serum albumin).
  • the linear range extends over 6 orders of magnitude.
  • the advantages of the detection method are obvious, especially in the case of using membranes.
  • the simultaneous detection of all proteins on a membrane and individual proteins by means of antibodies with comparable sensitivity is possible. This could not be achieved with the previously known dyeing techniques.
  • the protein recognized by the antibody can now be quantified relative to the particular band.
  • statements about foreign proteins in the band or post-translational modifications can be quantified.
  • Further advantages are the wide linear signal to concentration range over six orders of magnitude and in the high light stability. Legends to the pictures
  • BSA bovine serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • RT room temperature
  • ME mercaptoethanol, Std.
  • a + 1: 67231 Da corresponds to (A) + the LM-mass -31 Da

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines polyaminosäurehaltigen Analyten. Es ist die Aufgabe gestellt, Polyaminosäuren hochempfindlich nachzuweisen. Die Aufgabe wird gelöst, indem ein LM nach chemischer Aktivierung an ein Protein gekoppelt und mit einem Lanthanoidion komplexiert wird. Zur Detektion der Polyaminosäuren wird nach elektrophoretischer Trennung die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung eingesetzt. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,5 pg pro Spot (Rinderserumalbumin), wobei sich der lineare Bereich über 6 Größenordnungen erstreckt. Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf nukleinsäurehaltige Analyten.

Description

Verfahren zum sensitiven Nachweis von Polyaminosäuren und anderen Makromolekülen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, der vorzugsweise Polyaminosäuren oder andere Makromoleküle enthält, durch Lumineszenzmarkierung in Gelen und auf festen Trägern unter Verwendung von Lanthanoidionen, wie z. B. Europium(lll)-, Terbium(lll)-, Samaπum(lll)-, Neodymium(lll)- oder Dysprosium(lll)-Komplexen.
Der Nachweis und die Analyse von Polyaminosäuren sind bei verschiedenen kommerziellen und wissenschaftlichen Anwendungen wichtig. Nachfolgend wird als Polyaminosäure jedes Homopolymer oder Heteropolymer von Aminosäuren, einschließlich Peptiden, Proteinen und Nukleinsäuren angesehen.
Polyaminosäuren werden typischerweise durch Gelelektrophorese, Lösungs- quantifizierungsassays oder durch Nachweis auf festen Trägern wie beispielsweise Filtermembranen nachgewiesen und charakterisiert. Ein Beispiel für Filtermembranen sind Nitrocellulosemembranen oder Membranen aus Polyvinylidendifluorid (PVDF). Kleine Mengen von Polyaminosäuren sind allgemein für das bloße Auge nicht sichtbar und müssen markiert werden, bevor sie lokalisiert und identifiziert werden können.
Zwei der gängigsten Verfahren des Markierens von Polyaminosäuren in Gelen sind die Coomassie-Brilliantblau-Färbung (hiernach als CBB-Färbung bezeichnet) und Silberfärbung. Bei bestimmten Polyaminosäuren ist die Silberfärbung etwa 100 bis 1000 Mal empfindlicher als die CBB-Färbung, beiden sind jedoch einige Nachteile gemeinsam. Die CBB-Färbung und die Silberfärbung sind beide relativ unempfindliche Färbungen und besitzen nur einen engen Bereich einer linearen Quantifizierbarkeit für die densitometri- sche Auswertung. Außerdem lassen sich die markierten Gele nicht für weitergehende Analysen blotten. Darüber hinaus bedürfen sowohl die CBB-Färbung als auch die Silberfärbung kolorimetrische Nachweisverfahren, d. h. Proteine werden durch Vorhandensein markierter bzw. opaker Banden in dem Elektrophoresegel nachgewiesen. Die Verwendung lumineszierender Reagenzien zum Nachweis von Proteinen bietet die Möglichkeit einer stark erhöhten Empfindlichkeit und eines größeren linearen Quantifizierungsbereichs, während sich gleichzeitig die Einfachheit der Anwendung des Markierungsreagens erhöht. Mit „lumineszierend" ist jedes Reagens gemeint, das luminesziert, d. h. phosphoresziert, fluoresziert, chemiluminesziert oder elektroluminesziert.
Fluoreszierende Reagenzien sind bereits zum Markieren von Polyaminosäu- ren verwendet worden, wie beispielsweise der Farbstoff Nilrot (9-Diethylamino -5H-benzo(alpha)phenoxazin-5-on) (dazu Daban et ai, ANAL. BIOCHEM. 199, 169 (1991)). Weitere Beispiele häufig verwendeter fluoreszierender Reagenzien gehören zu der Familie der Cyaninfarbstoffe (auch Cy-Farbstoffe genannt) (dazu Ernst LA, Gupta RK, Mujυmdar RB, Waggoner AS. Cyanine dye labeling reagents for sulfhydryl groups. Cytometry. 1989;10(1):3-10). Cyaninfarbstoffe sind unter Anderem auch als fluoreszierende Farbstoffe für Polyaminosäuren in Gelen, auf Membranen oder anderen Trägern verwendet worden. Während das Markieren mit niedermolekularen organischen Farbstoffen sehr schnell verläuft und relativ unempfindlich gegenüber der Zusammensetzung der Polyaminosäure ist und kein Entfärben erfordert, leiden organische Fluoreszenzfarbstoffe typischerweise an dem Nachteil hoher Hintergrundfärbung auf festen Trägern und Gelen und einem schnellen Ausbleichen bei Illumination.
Alle bekannten Markierungsverfahren für Polyaminosäuren in Gelen und auf festen Trägern haben allerdings eine relativ schlechte Nachweisgrenze im unteren Nanogramm- bis oberen Pikogrammbereich (ng bis pg). Dies gilt auch für die empfindlichsten der heute bekannten Markierungsverfahren für Polyaminosäuren, wie beispielsweise die Silbermarkierung, die Verwendung von Cyaninfarbstoffen und Andere (dazu Übersicht: Hirsch J, Hansen KC, Buriingame AL, Matthay MA. (2004) Proteomics: current techniques and Potential applications to lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. Jul;287(1):L1-23 AND Gade D, Thiermann J, Markowsky D, Rabus R (2003). Evaluation of two-dimensional difference gel electrophoresis for protein profiling. J Mol Microbiol Biotechnol; 5(4):240-51.)
Die linearen Bereiche der oben beschriebenen Farbstoffe erstrecken sich über drei bis vier Größenordnungen, wie in den angegebenen Veröffentlichungen beschrieben. Gleichzeitig können sich die Polyaminosäurekonzent- rationen in einer biologischen Probe über bis zu 10 Größenordnungen erstrecken (Seilers TA and Yates JR. Review of proteomics with applications to genetic epidemiology. Genet Epidemiol 24: 83-98, 2003.). Es ist daher verständlich, dass ein Markierungsverfahren wünschenswert ist, das einen linearen Bereich von mehr als vier Größenordnungen aufweist.
Zu den Ausführungsformen gängiger Polyaminosäure-Nachweisverfahren gehören beispielsweise 2D-GeIe, native und nicht-native 1 D-GeIe1 isoelektrische Fokussierung, Dot-Blots, Slot-Blots, differentielle Gelelektrophorese, chromatographische Trenntechniken, Kapillarelektrophorese und andere. Die Schwierigkeiten bei diesen Techniken liegen im Nachweis kleiner Proteinmengen, bedingt durch Limitationen im dynamischen Bereich der Nachweis- verfahren, und in der Identifizierung einer individuellen Polyaminosäure in einem komplexen Gemisch. Biomedizinische Proben, die typischerweise analysiert werden, umfassen beispielsweise Körperflüssigkeiten wie Plasma, Serum, Kortikospinalflüssigkeit, Blut und Andere sowie Gewebeproben verschiedener Art. Diese Arten von Proben sind komplexe Gemische von Polyaminosäuren mit Polyaminosäurekonzentrationen in einem dynamischen Bereich von bis zu 10 Größenordnungen (Seilers TA and Yates JR. Review of proteomics with applications to genetic epidemiology. Genet Epidemiol 24: 83-98, 2003). Die Expressions- und Modifikationsänderungen bei weniger häufigen Polyaminosäuren („Proteine mit geringer Kopienzahl", 10-1.000 Kopien je Zelle) sind möglicherweise die interessantesten. Ihre Visualisierung wird häufig von stark exprimierten Polyaminosäuren („dominante Proteine", 10.000 und mehr Kopien je Zelle) überdeckt (Blackstock WP and WeirMP. Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins. Trends Biotechnol 17: 121-127, 1999). Die Erfindung hat das Ziel, die Nachteile der oben erwähnten Analyseverfahren zu überwinden. Die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens soll signifikant gesteigert werden
Die Erfindung hat die Aufgabe ein Verfahren anzugeben, individuelle PoIy- aminosäuren oder Gruppen von Polyaminosäuren sowie Nukleinsäuren spezifisch nachzuweisen. Es soll geprüft werden, inwieweit sich ein Lumines- zenzmarker, der komplex gebundene Lanthanoidionen enthält, an andere Polyaminosäuren koppeln lässt, welche die nachzuweisenden Polyaminosäuren spezifisch erkennen (beispielsweise Antikörper), und inwieweit sich ein Lumineszenzmarker direkt an die nachzuweisenden Polyaminosäuren koppeln lässt.
Es soll weiterhin ein Markierungsverfahren angegeben werden, das einen linearen Bereich von mehr als vier Größenordnungen sowie eine hohe Lichtstabilität aufweist. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dem Hauptanspruch entsprechend gelöst.
Entscheidend ist die Verwendung einzelner ausgewählter Lanthanoid- Komplexe als Lumineszenzmarker (nachfolgend als LM bezeichnet).
Die hohe Emissionsintensität sowie die lange Lebensdauer der elektronischen Anregungszustände dieser Verbindungen eröffnen die Möglichkeit, diese Verbindungen in der zeitaufgelösten Fluorimetrie einzusetzen.
Die LM bestehen aus einer Licht einfangenden Einheit (Antenne), einem Chelat bildenden Gerüst, einer Funktionalität zum Koppeln an Polyaminosäuren sowie einem Lanthanoidzentralion (im folgenden als Ln(III) bezeichnet). Wie m WO 2005/108405 beschrieben ist es möglich, die unterschiedlichsten Kombinationen dieser Untereinheiten für die Synthese von LM zusammenzustellen. Sie bieten aufgrund ihrer chemischen Konstitution die Basis für eine Optimierung absorptionsspektroskopischer Eigenschaften durch Variieren der Antenne und der Emission durch Variation des Lanthanoidions. Die allgemeine Formel lässt sich wie folgt wiedergeben:
Figure imgf000006_0001
mit
X Funktionalität zur Kopplung an ein Biomolekül
Y Funktionalität zur Kopplung an ein Biomolekül
R1:
Figure imgf000006_0002
Figure imgf000006_0003
R2:
Figure imgf000006_0004
X:
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0002
Y:
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
,NH.
Aus einer ungewöhnlich großen Anzahl möglicher Verbindungen sind die nachfolgend beschriebenen ausgewählt und für die Anwendung im vorliegend beanspruchten Analyseverfahren als geeignet erkannt worden.
Es sind nach langer Suche und vielen Experimenten verschiedene Heterocyc- len aus der Gruppe der 2-(4'-Aminophenylethinyl)-1 ,10-phenanthroline, unterschiedlich substituiert, als geeignete Antennen für LM zum Nachweis von Polyaminosäuren gefunden worden. Aus dieser Gruppe ist mehr als eine geeignete Antenne erkannt worden, jedoch hat sich als besonders geeignet (6,9-Dicarboxymethyl-3-{(4[1 , 10]-phenanthrol-2-ylethinylphenylcarbamoyl)- methyl}-3,6,9-triaza)-undeca-1 ,11-dicarboxylsäure erwiesen, insbesondere für den Fall, dass als Lanthanoidion Eu(III) gewählt wird.
Figure imgf000009_0001
Diese Verbindung wird bevorzugt verwendet und als LM-Precursor 1 bezeichnet.
Figure imgf000009_0002
Diese Verbindung wird bevorzugt verwendet und als LM 1 bezeichnet.
Die Art der Ziel-Polyaminosäure wird von der Kopplungsfunktionalität gesteuert. Jedoch wird bei der Gelelektrophorese hauptsächlich Maleimid als kovalentes Sulfhydryl-Kopplungsreagens verwendet, weil sich in diesem Fall die Ladung der markierten Polyaminosäure nicht ändert. Erfindungswesentlich ist das Vermessen der markierten Polyaminosäuren unter Anwendung zeitaufgelöster lumineszenzspektroskopischer Methoden.
Zeitaufgelöste Lumineszenzmessungen ermöglichen die Differenzierung zwischen Fluoreszenz und Phosphoreszenzeffekten. Bei der Phosphoreszenz handelt es sich um eine spezifische Art von Lumineszenz, die sich von der Fluoreszenz dadurch unterscheidet, dass sie von längerer Lebensdauer ist. Ein phosphoreszierendes Material emittiert nach Lichtabsorption zeitverzögert längerwellige Strahlung. Fluoreszierende Materialien emittieren nach Lichtanregung im Nanosekundenbereich, wohingegen phosphoreszierende Materialien die absorbierte Strahlung in Mikro- bis Millisekunden emittieren. Es ist daher möglich, die Phosphoreszenz separat zu messen, selbst, wenn das gemessene Material bzw. die gemessene Probe eine starke Fluoreszenz aufweisen. Dies erfolgt durch zeitverzögerte Messung nach Lichtanregung des zu messenden Materials bzw. der zu messenden Probe.
Die Erfindung betrifft die Phosphoreszenzemission von Polyaminosäuren in Gelen und auf festen Trägern mithilfe von LM, die Europium(lll), Terbium(lll), Samarium(lll), Neodymium(lll) oder Dysprosium(lll) als Zentralionen enthalten.
Ein wesentlicher Aspekt der Erfindung ist eine neuartige Polyaminosäu- re-Nachweistechnik, die sich in der Handhabung von der herkömmlichen Markierungstechnik insofern unterscheidet, dass LM kovalent an den Analyten gebunden werden. Dabei wird der LM in einer bevorzugten Ausführungform der Erfindung kovalent mit Polyaminosäuren verknüpft. Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Europium(lll)-, Terbium(lll)-, Samarium(lll)-, Neodymium(lll)- oder Dysprosium(lll)-Zentralionen zum Markieren von Polyaminosäuren durch zeitverzögerte Detektion mit signifikant höherer Empfindlichkeit als übliche, heute bekannte Färbeverfahren für Polyaminosäuren mit gleichzeitig einem grosseren linearen Signal zu Konzentrationsverhältnis und höherer Lichtstabilität. Der Nachweis von Polyaminosäuren verlangt eine Möglichkeit, individuelle Polyaminosäuren oder Gruppen von Polyaminosäuren spezifisch nachzuweisen. Dieses Ziel lässt sich erreichen, indem der LM an andere Polyaminosäuren gekoppelt wird, welche die nachzuweisenden Polyaminosäuren spezifisch erkennen (beispielsweise Antikörper), oder indem der LM direkt an die nachzuweisenden Polyaminosäuren gekoppelt wird. Das Koppeln des LM an Polyaminosäuren erfolgt deshalb kovalent, um eine hohe Stabilität der LM- Analyt-Bindung unter Bedingungen zu gewährleisten, in denen folgende Parameter Veränderungen unterworfen sein können: Spannung, Temperatur, pH-Wert, Hydrophobizität, Enzymaktivitäten, elektromagnetische Strahlung, interferierende organische und anorganische Substanzen, Radioaktivität und andere.
Nachfolgend wird unter einer kovalenten Verknüpfung eine einzelne kovalente Bindung oder eine Kombination stabiler chemischer Bindungen, gegebenenfalls umfassend Einzel-, Doppel-, Dreifach- oder aromatische Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindungen sowie Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, Stickstoff- Stickstoff-Bindungen, Schwefel-Stickstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Sauerstoff- Bindungen, Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen, Phosphor-Sauerstoff- Bindungen und Phosphor-Stickstoff-Bindungen verstanden.
Geeignet für die kovalente Verknüpfung sind freie Amino-, Carboxylat- und Sulfhydrylgruppen von Polyaminosäuren. In einem ersten Schritt wird der LM- Precursor mit Hilfe einer der Kopplungsfunktionen X oder Y an die Polyami- nosäure gebunden:
Der Markierungsprozess wird durch Zugabe der Lanthanoidsalzlösung zu dem Gemisch abgeschlossen. Die Bildung des entsprechenden Komplexes lässt sich durch Lumineszenz oder UV-Vis-Spektroskopie überwachen.
Die vorliegende Erfindung nutzt die oben beschriebenen LM zum Markieren eines Analyten, gefolgt vom Nachweis der Bindung des LM an den Analyten und gegebenenfalls seiner Quantifizierung bzw. einer anderen Analyse. Bei dem Analyten handelt es sich typischerweise um ein Biomolekül. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem Analyten um eine Polyaminosäure.
Der Analyt wird markiert, indem ein Probengemisch, von dem angenommen wird, dass es den Analyten enthält, mit zunächst Ln(lll)-freiem LM (im folgenden als LM-Precursor bezeichnet) versetzt wird, so dass nach aliquoter Zugabe von Ln(lll)-Ionen ein optischer Lumineszenzeffekt nach Lichtanregung beobachtet wird.
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LM-Precursor
In einem Aspekt der Erfindung umfasst ein Schnellverfahren zum Nachweis eines Analyten folgende Schritte:
a) Markieren eines Probengemisches, von dem angenommen wird, dass es den Analyten enthält, zunächst mit LM-Precursor, und Zugeben eines aliquoten Anteils von Europium(lll)-, Terbium(lll)-, Samarium(lll)-, Neodymium(lll)- oder Dysprosium(ll!)-Ionen aufweist, um ein LM-markiertes Gemisch zu bilden, wobei jede Europium(lll)-, Terbium(lll)-, Samarium(lll)-, Neodymi- um(lll)- oder Dysprosium(lll)-koordinierte LM unabhängig umfasst: i) ein Europium(lll)-, Terbium(lll)-, Samarium(lll)-, Neodymium(lll)- oder
Dysprosium(lll)-Ion, ii) mindestens einen Chelatliganden iii) mindestens einer Antenne und iv) eine Kopplungsfunktion zum kovalenten Koppeln des LM mit einer Polyaminosäure unter Anwendung der oben beschriebenen Bedingungen.
b) Inkubieren des Analyt-LM mit Europium(lll)-, Terbium(lll)-, Samarium(lll)-, Neodymium(lll)- oder Dysprosium(lll)-Ionen, um vollständige Komplexbildung mit ausgewählten Ln(lll)lonen zu gewährleisten, so dass nach Lichtanregung markierte Analyten eine nachweisbare Lumineszenz auftritt,
oder die direkte Verwendung des kovalent an Polyaminosäuren gekoppelten Lumineszenzmarkers in einem Polyaminosäure-Analyseverfahren, das bei Lichtanregung eine nachweisbare Lumineszenz zeigt;
c) Lichtanregung des Komplexes aus LM/Polyaminosäure und
d) Nachweis der Lumineszenz mittels zeitaufgelöster spektroskopischer Verfahren.
Weitere Schritte werden gegebenenfalls und unabhängig in beliebiger Kombination vor, nach oder gleichzeitig mit der Markierung verwendet, um für eine Trennung oder Reinigung des Analyten zu sorgen, um den Nachweis des Analyten zu verstärken, zur Quantifizierung des Analyten, zur Identifizierung eines spezifischen Analyten oder einer Gruppe von Analyten, beispielsweise durch Verwendung eines immunologischen Reagens wie beispielsweise eines Antikörpers, eines Aptamers oder eines Lektins.
In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Analyten um ein Biomolekül. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Analyten um eine Polyaminosäure. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Analyten um eine Polyaminosäure, die posttranslationale Modifikationen aufweist. Posttranslationale Modifikationen sind als chemische Modifikationen einer Polyaminosäure nach ihrem natürlicherweise stattfindenden Translationsprozess definiert. Beispiele für posttranslationale Modifikationen umfassen Phosphorylierung, Ubiquitierung, Methylierung, Glykosylierung, Glykierung, SUMOylierung, Acylierung, Alkylierung, Methylierung, Amidie- rung, Biotinylierung, Formylierung, Carboxylierung, Glutamylierung, Glykylie- rung, Hydroxylierung, Isoprenylierung, Lipoylierung, Myristoylierung, Farnesy- lierung, Geranylgeranylierung, ADP-Ribosylierung, Oxidation, Pegylierung, Phosphopantetheinylierung, Pyroglutamatbildung, Sulfation, Selenoylierung, ISGylierung und andere.
In einer anderen Ausführungsform ist der Analyt eine Polyaminosäure, die chemisch modifiziert wurde, was zu einer Polyaminosäuremodifikation führt, die natürlicherweise nicht vorkommt. Beispiele für chemische Modifikationen, die zu einer Polyaminosäuremodifikation führen, die nicht natürlicherweise vorkommt, sind in der ABRF (Association of biomolecular resource facilities)- Datenbank unter www.abrf.org.) aufgeführt, diese sind aber nicht auf die gegebenen Beispiele beschränkt.
In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Analyten um ein Biomolekül, das mindestens eine Nukleinsäure aufweist.
Vorzugsweise ist der Analyt ein Polymer, das eine Polyaminosäure ist.
Typischerweise wird die vorliegende Erfindung verwendet, um den gewünschten Analyten nachzuweisen, indem ein Probengemisch, von dem angenommen wird, dass es den Analyten enthält, mit einem Markierungsstoffgemisch kombiniert wird, der mit mindestens einem der erfindungsgemäßen LM kombiniert wird.
Im Regelfall ist es erforderlich, eines der genannten Ln(lll)-Ionen mit dem LM- Precursor zu kombinieren, um eine nachweisbare Lumineszenz zu erhalten. Die Komplexbildung des LM-Precursors mit den Ln(lll)-Ionen kann stattfinden, vor der Kopplung an Polyaminosäuren, DNA, RNA oder PNA, aber auch nach der Kopplung des LM-Precursors an die Polyaminosäuren, DNA, RNA oder PNA mit anschließender Ln(lll)-Ionen-Inkubation stattfinden. Darüber hinaus kann die Inkubation des LM mit Europium(lll), Terbium(lll), Samarium(lll) Neodymium(lll) oder Dysprosium(lll), gekoppelt oder nicht gekoppelt, zu folgenden Zeitpunkten der Analyse stattfinden:
- bevor oder nachdem eine Trenntechnik zur Analyse einer relevanten Probe angewandt wird;
- zu einem beliebigen Zeitpunkt bei der Analyse einer Probe auf einer festen oder halbfesten Matrix. Die Inkubation mit den oben erwähnten Lanthanoidionen kann auch zu mehr als einem Zeitpunkt stattfinden, um das Signal, das durch die optische Reaktion bei Beleuchtung erhalten wird, zu verstärken.
Nach der LM-Markierung des Analyten wird das Probengemisch in den oben erwähnten Anwendungen mit einer geeigneten Anregungswellenlänge bestrahlt, um ein nachweisbares Lumineszenzsignal zu erhalten. In einem Szenario liegt diese Wellenlänge im Bereich von 280 nm bis 400 nm. In einem anderen Szenario liegt diese Wellenlänge im Bereich von 350 nm bis 370 nm. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dieser Wellenlänge um 360 nm.
Nach Lichtanregung des Probengemisches wird das Lumineszenzsignal bei mindestens einer geeigneten Emissionswellenlänge beobachtet. In einem Szenario liegt diese Wellenlänge im Bereich von 280 nm bis 800 nm. In einem anderen Szenario liegt diese Wellenlänge im Bereich von 500 nm bis 700 nm. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung handelt es sich bei diesen Wellenlängen um 595 nm und 616 nm.
Die Angaben werden durch die Abbildungen illustriert.
Die erfindungsgemäße Lösung wird mit einem Testkit realisiert, der wie nachfolgend beschrieben zusammengesetzt ist.
Allgemeine Beschreibung eines Testkits
Bestandteile des Testkits sind: - eine Lösung die Europium(lll)-, Terbium(lll)-, Samarium(lll)-, Neodymi- um(lll)- oder Dysprosium(lll)-Ionen bestimmter Konzentration
- eine Lösung oder ein Pulver einer oder mehrerer Polyaminosäuren die mit dem LM-Precursor chemisch gekoppelt ist, wie unter Punkt 3.1 beschrieben,
- optional ein oder mehrere Lösungen die für das Lösen einer Polyamino- säure in Pulverform nötig ist,
- eine PVDF- oder Nitrocellulosemembran,
- erpackungsmaterialien und geeignete Gefässe zur Lieferung und Anwendung des Kits.
Beispielhafte Beschreibung eines Testkits
In einem konkreten Fall enthält der Testkit folgende Komponenten:
- 100μl einer 10μM Europium(lll)chlorid Lösung,
- 1mg eines lyophilisierten, mit LM-Precursor markierten Ziege-anti-Maus IgG Antikörpers,
- 100μl PBS Lösung,
- eine PVDF Membran der Grosse 30x50cm.
Zur Anwendung des Testkits sind folgende Schritte notwendig: a) Lösen des lyophilisierten Antikörpers in 100μl PBS, vortexen b) Western Blot eines 1 D- oder 2D-GeIs auf die mitgelieferte PVDF Membran wie in der Literatur beschrieben (siehe z.B. http://www.westernblotting.org/protocols%20western%20blot.htm) c) Blockieren der Membran mit z.B. Milchpulver, Waschschritte, Inkubation der Membran mit primärem Antikörper nach Wunsch, Waschschritte wie in der Literatur beschrieben, z.B. http://www.westernblotting.org/protocols%20western%20blot.htm) d) Mix des lyophilisierten Antikörpers aus Schritt a) mit mitgelieferter Eu- ropium(lll)chloridlösung: 1μl Antikörper plus 1μl Europium(lll)chlorid- lösung pro 2ml TBS-T (Tris buffered saline-Tween 20) Inkubation mit Western Blot für 1 Stunde, drei mal Waschen mit TBS-T. e) Messung der PVDF Membran bei 616nm Emissionswellenlänge und 360nm Excitationswellenlänge.
Technische und ökonomische Vorteile der Erfindung
Es werden ausgewählte LM eingesetzt, die nach chemischer Aktivierung an Proteine gekoppelt und mit Europiumionen komplexiert werden. Nach Anregung im UV-Bereich wird die eingestrahlte Energie auf das komplexierte Europiumion übertragen. Die Lumineszenz des komplexierten Europiumions wird gemessen. Da die Phosphoreszenz dieser Europiumverbindungen deutlich langsamer abklingt als die Hintergrundfluoreszenz der Membran, können die mit den neuen LM markierten Proteine sehr sensitiv mittels zeitaufgelöster spektroskopischer Verfahren auf der Membran detektiert werden. Der Komplex ist während der elektrophoretischen Trennung stabil und die Proteine können danach sowohl im Gel als auch auf der Blotmembran mit etwa gleicher Empfindlichkeit detektiert werden. Die Nachweisgrenzen liegen bei 0,3 ng pro Bande (Rinderserumalbumin). Bei dem direkten Spotten der markierten Proteine auf eine Membran liegt die Nachweisgrenze bei 0,5 pg pro Spot (Rinderserumalbumin). Der lineare Bereich erstreckt sich über 6 Größenordnungen. Die Vorteile der Detektionsmethode sind offensichtlich, besonders im Fall der Verwendung von Membranen. Damit ist auch die gleichzeitige Detektion aller Proteine auf einer Membran und einzelner Proteine mittels Antikörper mit vergleichbarer Empfindlichkeit möglich. Dies konnte mit den bisher bekannten Färbetechniken nicht erreicht werden. Nunmehr kann zum Beispiel das vom Antikörper erkannte Protein relativ zur jeweiligen Bande quantifiziert werden. Damit sind auch Aussagen über Fremdproteine in der Bande oder posttranslationale Modifikationen quantifizierbar. Weitere Vorteile liegen in dem weiten linearen Signal zu Konzentrationsbereich über sechs Grössenordnungen sowie in der hohen Lichtstabilität. Legenden zu den Abbildungen
Legende zu Abb. 4.1
Signalintensitäten von BSA (bovines Serumalbumin) einfach markiert mit LM 1. Die Proben wurden auf eine PVDF Membran gespottet und vermessen. (Emission 616nm, Excitation 360nm). Gezeigt sind die Ergebnisse von 6 unabhängigen Messungen verglichen mit dem Hintergrund der Membran. Die Konzentrationen von BSA sind logarithmisch aufgetragen und decken einen Bereich von 100.000 bis 5pg ab.
Legende zu Abb. 4.2
Gezeigt sind die Signalverhältnisse vor/nach Elektroblot von an BSA gekoppeltem LM 1. Hierzu wurde BSA mit LM-Precursor 1 markiert und auf eine PVDF Membran im Dot Blot Verfahren aufgetragen, die resultierenden Signale gemessen und anschliessend diese Membran im Elektroblotverfahren für 15min bei 25V (Semi-dry blot) belassen. Danach erfolge eine erneute Vermessung der Signale. Die Verhältnisse unterscheiden sich nicht signifikant von eins, somit ist keine Abschwächung durch Elektroblot zu beobachten. BSA = bovines Serumalbumin
Legende zu Abb. 4.3
a) Signalintensität von LM 1 Peptid nach isoelektrischer Fokussierung (IEF). Inkubation des LM-Precursor 1 mit Europium(lll) vor der IEF. Stoffmengen des eingesetzten Peptids zwischen 1000 und 10ng. IEF-Streifen: 7 cm, pH 3- 10, linear. IEF-Bedingungen:
1) in 15 min auf 250 V
2) in 10 h auf 4.000 V (schneller Anstieg)
3) ca. 4 h auf 500 V Anschliessende Messung des Streifens bei 616nm Emission, 360 nm Excita- tion. Es zeigt sich, dass das Europium(lll) vom LM komplexiert bleibt und ein Signal abhängig von der eingesetzten Konzentration detektiert werden kann.
Legende zu Abb. 4.4
Durchschnittliche Signalintensitäten von BSA (bovines Serumalbumin) einfach markiert mit LM 1. Die Proben wurden auf PVDF Membran gespottet und vermessen. (Emission 616nm, Excitation 360nm). Gezeigt sind die gemittel- ten Ergebnisse von 6 unabhängigen Messungen. Die Konzentrationen von BSA sind logarithmisch aufgetragen und decken einen Bereich von 100.000 bis 5 pg ab. Eine Linearität des Signals über sechs Grössenordnungen ist damit gegeben.
Legende zu Abb. 4.5
LM 1 -Stabilität nach verschiedenen Denaturierungsmethoden nach ein bzw. zwei Stunden verglichen mit unbehandelter Probe (Std.). RT = Raumtemperatur, ME = Mercaptoethanol, Std.
Legende zu Abb. 4.6
ESI-TOF-Massenspektrum von unmarkiertem BSA (bovines Serumalbumin)
Legende zu Abb. 4.7
Ausschnitt aus Abb. 4.6
Legende zu Abb. 4.8 ESI-TOF-Massenspektrum von BSA (bovines Serumalbumin) mit LM- Precursor 1 markiert
Legende zu Abb. 4.9
Ausschnitt aus Abb. 4.8 Masse des Maleimid-aktivierten gekoppelten LM-
Precursor 1 : 793Da
A: 66468 Da (Ladung: 55+);
B: 66627 Da (Ladung: 55+);
A+1 : 67231 Da (Ladung 56+); entspricht (A) + der LM-masse -31 Da
B+1 : 67393 Da (Ladung 56+); entspricht (A) + der LM-masse-30 Da
A+2: 68022 Da (Ladung 56+); entspricht (A+1) + der LM-masse-1
B+2: 68185 Da (Ladung 56+); entspricht (B+1) + der LM-masse+1

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum sensitiven Nachweis von Polyaminosäuren und anderen Makromolekülen, bei dem es sich um ein Polymer oder Makromolekül handelt, das mindestens eine Thiolgruppe oder mindestens eine primäre oder sekundäre Aminogruppe enthält, oder um ein Polymer oder Makromolekül, das chemisch modifiziert werden kann, um mindestens eine Thiolgruppe oder mindestens eine primäre oder sekundäre Aminogruppe zu enthalten, das folgende Schritte umfasst:
a) Versetzen eines Probengemisches, von dem angenommen wird, dass es den Analyten enthält, mit einem Antennenchelatliganden, nachfolgend als LM-Precursor bezeichnet, der in der Lage ist, Lanthanoid(lll)- lonen zu komplexieren, insbesondere Europium(lll), Terbium(lll), Sa- marium(lll), Neodymium(lll) oder Dysprosium(lll), der chemisch aktiviert ist, um die Thiolgruppe, die primäre Amino- oder die sekundären Aminogruppen des Polymers oder des Makromoleküls kovalent zu binden, wobei der Antennenchelatligand eine derivatisierte Polyaminopolycar- bonsäure ist, und mit einem Aktivator A, der eine chemische Gruppe ist, die mit Thi- olgruppen reagiert oder alternativ mit einem Aktivator B, der eine chemische Gruppe darstellt, die mit primären oder sekundären Aminogruppen reagiert,
b) Inkubieren des kombinierten Gemisches für eine Zeit, die ausreichend ist für den mit Aktivator A aktivierten Präfluorophor, um mit den Thiolgrup- pen zu reagieren, oder alternativ mit dem mit Aktivator B aktivierten Präfluorophor, um mit den primären Amino- oder sekundären Aminosäuren zu reagieren, in dem Färbegemisch, um das Makromolekül oder das Polymer zu derivatisieren;
c) Inkubieren des mit dem LM-Precursor markierten, kombinierten Gemisches für eine ausreichende Zeit mit Lanthanoid(lll)-Ionen, insbesondere Europium(lll)-, Terbium(lll)-, Samarium(lll)-, Neodymium(lll)- oder Dyspro- sium(lll)-lonen, um einen stabilen Komplex mit dem Analyten zu bilden, der mindestens einen LM-Precursor trägt, komplexiert mit Lanthanoid(lll)- lonen, der bei Lichtanregung eine nachweisbare Lumineszenzemission ergibt;
d) Trennung oder teilweise Trennung des Analytgemisches, damit eine Analyse der Einzelverbindungen durch Ausfällung, Extraktion, Festphasenextraktion, Immunfärbetechniken einschließlich Immunoassays wie ELISA, Dialyse, Zentrifugation, Chromatographie, Elektrophorese, Mas- senspektrometrie, lonenmobilität, Interaktion zwischen dem Analyten und anderen Molekülen, insbesondere Makromolekülen wie beispielsweise Proteine, DNA, RNA, Antikörper, Aptamere und Phagen möglich wird, während nach dem Trennen die Analyten direkt analysiert werden können oder zunächst in ein anderes Lösungsmittel übertragen werden, wozu sich Elektroelution anbietet oder an eine Fläche adsorbiert werden, was gemeinhin als Blotting bezeichnet wird
e) Lichtanregung des kovalenten Analyt-LM-Komplexes; und
f) Nachweis der Lumineszenzreaktion mittels zeitaufgelöster spektroskopischer Methoden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei es sich bei dem Analyten um eine Polyaminosäure, ein Peptid, Peptidomimetika, eine Peptidnukleinsäure PNA oder ein Protein handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei es sich bei dem Analyten um eine Polynukleinsäure, eine einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, RNA oder ein Oligonukleotid mit mindestens einer Thiolgruppe und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppe handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , welches des Weiteren das Quantifizieren des Analyten durch zeitaufgelöste Messung der nachweisbaren Lumineszenz- reaktion und Vergleichen des Messwertes mit einem Standard umfasst.
5. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei sich der Analyt auf oder in einer festen oder halbfesten Matrix befindet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei der Matrix um ein Elektrophoresegel oder eine proteinbindende Membran handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, welches des Weiteren die elektrophoretische Trennung des Probengemisches, bevor.während oder danach es mit dem Färbegemisch kombiniert wird, umfasst.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die elektrophoretische Trennung, der Bestrahlungsschritt oder der Beobachtungsschritt mittels automatischer Verfahren erfolgen.
9. Verfahren nach Anspruch 2, welches des Weiteren das Analysieren der Polyaminosäure, des Peptids, der Peptidomimetika, der Peptidnukleinsäure PNA oder des Proteins durch Massenspektrometrie umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 2, welches des Weiteren das Analysieren der Polyaminosäure, des Peptids oder des Protein durch Edman-Sequenzierung umfasst.
11. Verfahren nach Anspruch 3, welches des Weiteren das Analysieren der Polynukleinsäure, einer einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen DNA, RNA, PNA oder eines Oligonukleotids durch Massenspektrometrie umfasst.
12. Verfahren nach Anspruch 3, welches des Weiteren das Analysieren der Polynukleinsäure, einer einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen DNA, RNA, PNA oder eines Oligonukleotids durch Sequenzanalyse umfasst.
13. Verfahren nach Anspruch 1, welches des Weiteren das Zugeben eines weiteren Reagens zu dem Probengemisch, dem LM-Precursor und den entsprechenden Ln(lll)-Ionen oder dem kombinierten Gemisch umfasst.
14. Verfahren nach Anspruch 2, welches des Weiteren den Nachweis einer bestimmten Polyaminosäure, eines bestimmten Peptids oder Proteins oder eine Klasse einer Polyaminosäure, eines Peptids, von Peptidomimetika, PNA oder einem Protein mit einem monoklonalen, polyklonalen oder rekom- binanten Antikörper oder einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder Phagen umfasst, welche vorzugsweise zuvor nach Anspruch 1 markiert wurden.
15. Verfahren nach Anspruch 14 zur Quantifizierung des/der Analyten bestehend aus Polyaminosäure, Peptid, Peptidomimetika, PNA oder Protein, relativ zu dem monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder einem Phagen, welche den Analyten erkennen.
16. Verfahren nach Anspruch 2, wobei mindestens zwei Polyaminosäure-, Peptid- oder Proteingemische mit verschiedenen LM markiert worden sind, was einen parallelen und unabhängigen Nachweis aller Analyten in derselben Lösung, demselben Volumen oder auf derselben Fläche erlaubt, um die in jedem Gemisch vorhandenen Analyten relativ zu den in einem anderen Gemisch vorhandenen Analyten zu quantifizieren.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Proteine elektrophoretisch getrennt wurden, um in jedem der Gemische, die einen anderen LM enthalten, ein bestimmtes Protein zu quantifizieren.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Polyaminosäuren, Proteine, Peptidomimetika, PNA oder Peptide auf eine Membran übertragen worden sind.
19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei bestimmte Proteine zusätzlich mit einem monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder einem Phagen markiert werden, welche zuvor nach Anspruch 1 markiert worden sind.
20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei bestimmte Proteine zusätzlich mit einem monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder einem Phagen markiert werden, welche zuvor nach Anspruch 1 markiert worden sind.
21. Verfahren nach Anspruch 3, welches des Weiteren den Nachweis einer Polynukleinsäure, einer einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen DNA, RNA, PNA oder eines Oligonukleotids mit einem monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder einem Phagen oder einem beliebigen anderen Protein oder Oligonukleo- tid, einer Polynukleinsäure, einer einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen DNA, RNA oder PNA umfasst, die hybridisieren können und welche vorzugsweise zuvor nach Anspruch 1 markiert worden sind.
22. Verfahren nach Anspruch 14 zur Quantifizierung des/der Analyten bestehend aus RNA oder, relativ zu der eingesetzen DNA-Sonde den Analyten erkennen.
23. Verfahren nach Anspruch 2, wobei mindestens zwei DNA- oder RNA gemische mit verschiedenen LM markiert worden sind, was einen parallelen und unabhängigen Nachweis aller Analyten in derselben Lösung, demselben Volumen oder auf derselben Fläche erlaubt, um die in jedem Gemisch vorhandenen Analyten relativ zu den in einem anderen Gemisch vorhandenen Analyten zu quantifizieren.
24. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die DNA oder RNA elektrophoretisch getrennt wurden, um in jedem der Gemische, die einen anderen LM enthalten, ein bestimmtes DNA oder RNA zu quantifizieren.
25. Verfahren nach Anspruch 17, wobei bestimmte DNA- oder RNA zusätzlich mit DNA- oder RNA-Sonde markiert werden, welche zuvor nach Anspruch 1 markiert worden sind.
26. Verwendung von Derivaten des 2-(4'-Aminophenylethinyl)-1 ,10-phenan- throlins als Lumineszenzmarker zur Bestimmung von Biomolekülen durch zeitaufgelöste Lumineszenzspektroskopie.
27. Verwendung von Derivaten des 2-(4'-Aminophenylethinyl)-1 ,10-phenan- throlins nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass (e.θ-Dicarboxymethyl-S^II .lOJ-phenanthrol^-ylethinylphenylcarbamoyl)- methyl}-3,6,9-triaza)-undeca-1 ,11-dicarboxylsäure, als LM-Precursor 1 bezeichnet, eingesetzt wird.
28. Testkit zum Durchführen des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er die folgenden Bestandteile enthält a) eine wässrige Lösung eines dreiwertigen Lanthanoidions b) eine oder mehrere Polyaminosäuren, die mit einem LM aus der Gruppe der der 2-(4'-Aminophenylethinyl)-1 , 10-phenanthroline, unterschiedlich substituiert als Lumineszenzmarker chemisch gekoppelt ist c) eine oder mehrere Lösungen, die für das Lösen einer Polyaminosäure nötig sind d) eine PVDF- oder Nitrocellulosemembran e) an sich bekannte Hilfs- und Packungsmittel.
29. Testkit nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass er die folgenden Bestandteile konfektioniert und in beliebiger Anzahl enthält
- 100 μl einer 10 μM Eu(lll)chloridlösung
1 mg eines lyophylisierten lumineszenzmarkierten Ziege-anti-Maus-lgG- Antikörpers, wobei als LM Precursor 1 6,9-Dicarboxymethyl-3-{(4[1 ,10]- phenanthrol-2-ylethinylphenylcarbamoyl)-methyl}-3,6,9-triaza)-undeca- 1 ,11-dicarboxylsäure eingesetzt ist
- 100 μl PBS-Lösung - eine PVDF-Membran der Grösse 30 x 50 cm.
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