WO2009123188A1 - ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示されるサーバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の部分ペプチドとその利用法 - Google Patents

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    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to an antigenic polypeptide that can be used for cancer immunotherapy and a therapeutic agent for malignant neoplasm containing the polypeptide.
  • cancer immunotherapy One method for treating refractory cancer (malignant neoplasm) is so-called cancer immunotherapy in which cancer cells are regressed using the immune system of the individual patient.
  • cancer immunotherapy is so-called cancer immunotherapy in which cancer cells are regressed using the immune system of the individual patient.
  • the important point in this method is how to make the immune system recognize the cancer cell as a foreign substance and lead to an immune cell that is aggressive to the cancer cell.
  • CD8 positive T cells are T cells that, when activated, lyse cells presenting antigens that bind to HLA class I molecules.
  • CD4-positive T cells are Th cells that secrete cytokines and are activated by macrophages and / or dendritic cells that present antigens by HLA class II molecules and have a helper function for induction and maintenance of CD8-positive T cells. Demonstrate.
  • Th cells may be Th1 cells (producing IFN- ⁇ or the like), Th2 cells (producing IL-4 or the like), and Th0 cells (having low cytokine production capacity or IFN- ⁇ , It is known to be classified into (IL-4 and the like together), and the role of each cell is being elucidated.
  • CD4 positive T cells also have effector effects by an indirect mechanism for MHC class II molecule negative tumors (MHC class II-tumors), for example through macrophage activation or by a direct mechanism for MHC class II positive tumors. It can also have a function.
  • Patent Literature CD8 positive HLA class I-restricted CTL response
  • Patent Document 2 the number of which is CD8 positive HLA class I It is significantly less than reported cases of restricted peptides.
  • tyrosinase is also the only melanoma-associated tissue that binds to MHC class II molecules expressed in normal cells and tumor cells of the melanocyte lineage and shown as a specific target for CD4 positive melanoma reactive T cells. It is a specific antigen (Non-patent Document 1).
  • tyrosinase is an antigen that is expressed only in a limited type of tumor, and is not a promising cancer antigen in cancer immunotherapy.
  • Non-patent Document 2 a gene encoding a tumor-specific antigen recognized by CD8-positive T cells, called survivin, has been reported (Non-patent Document 2).
  • Survivin is a protein consisting of a total of 142 amino acid residues, identified as a substance that inhibits the apoptotic effect.
  • Survivin expression is up-regulated in normal tissues such as fetal tissues, limited tissues such as thymus and testis in adults, and tumor tissues, particularly tumorized lung, colon, mammary gland, spleen, prostate and lymphoma
  • the present inventors have found that a therapeutic agent containing a tumor antigen and Th cells specific for the tumor antigen has an effect of remarkably reducing a malignant neoplasm expressing the tumor antigen.
  • a novel antigenic peptide that can be used as the tumor antigen was identified, and the following inventions were completed.
  • the polypeptide comprising the amino acid sequence of b) to g) is an epitope possessed by the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and induces Survivin-specific Th cells from CD4-positive T cells.
  • the polypeptide according to (1) which is a polypeptide having the epitope.
  • a vaccine for malignant neoplastic immunotherapy comprising as an active ingredient at least one of the polypeptides according to (1) or (2).
  • a method for inducing Survivin-specific Th cells comprising a step of in vitro incubation of at least one of the polypeptides according to (1) or (2), an antigen-presenting cell, and a CD4-positive T cell.
  • a therapeutic agent for malignant neoplasm comprising the polypeptide according to (1) or (2) and Th cells specific for the polypeptide or Survivin.
  • polypeptide of the present invention has a small number of constituent amino acid residues and can be produced in large quantities not only by genetic recombination techniques but also by organic synthetic methods, so that it can be stably and inexpensively used in clinical research or clinical applications. Can be supplied.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm containing the polypeptide of the present invention can more strongly promote cytokine production for Th cells by combining the tumor antigen with Th cells specific for the tumor antigen.
  • the produced cytokine induces an antitumor immune response specific to the malignant neoplasm expressing the tumor antigen in the living body, and causes the tumor to regress.
  • Anti-HLA-DP antibody, anti-HLA-DQ antibody and anti-HLA-DR antibody are added to cell groups including Sur / Th cells derived from humans whose HLA genotype is HLA-DRB1 * 0101 / HLA-DRB1 * 0901 respectively. It is a figure which shows the result of having measured the production of IFN- ⁇ by Sur / Th cells when added by ELISA. In the figure, the vertical axis represents the production amount of IFN- ⁇ (IFN-g).
  • SU18 connate
  • control peptide irrelevant
  • the vertical axis indicates the HLA genotype
  • the horizontal axis indicates the amount of IFN- ⁇ (IFN-g) produced.
  • IFN- ⁇ producing cells by Sur / Th cells when the polypeptides T1 to T10 are added to Sur / Th cells derived from humans whose HLA genotype is HLA-DRB1 * 1201 / HLA-DRB1 * 1502, respectively.
  • ELISPOTAssay shows the result of having measured the number.
  • Anti-HLA-DP antibody, anti-HLA-DQ antibody and anti-HLA-DR antibody are added to cell groups including Sur / Th cells derived from humans whose HLA genotype is HLA-DQB1 * 0302 / HLA-DQB1 * 0601 respectively. It is a figure which shows the result of having measured the production of IFN- ⁇ by Sur / Th cells when added by ELISA.
  • PBMCs PBMCs
  • SU18 conjugated protein
  • control peptide allogeneic PBMCs
  • the present invention relates to a survivin partial polypeptide, a tumor antigen containing the partial polypeptide, and a therapeutic agent for malignant neoplasm comprising the tumor antigen and Th cells specific for the tumor antigen.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention is preferably a tumor antigen containing a survivin partial polypeptide, and the tumor antigen induced by the tumor antigen from CD4-positive T cells recovered from the patient to be treated.
  • a therapeutic agent containing specific Th cells is preferably a tumor antigen containing a survivin partial polypeptide, and the tumor antigen induced by the tumor antigen from CD4-positive T cells recovered from the patient to be treated.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention comprises a combination of a tumor antigen that is a survivin partial polypeptide and a Th cell specific to the tumor antigen. As compared with the case where each is administered to a patient alone, it has a remarkable effect in the regression of malignant neoplasms.
  • a Th cell specific to a tumor antigen containing a Survivin partial polypeptide is a Th0 cell, a Th1 cell, or a Th2 cell as long as it is a Th cell that produces cytokine by being specifically stimulated by the tumor antigen. However, it is more preferable if it is a Th1 cell.
  • Th cells specific for such tumor antigens can be obtained by incubating the tumor antigens, antigen-presenting cells expressing HLA class II molecules, and CD4 positive T cells under appropriate conditions. Can be derived from and prepared.
  • the CD4-positive T cells that can be used in the method of the present invention can be isolated from the collected blood by a general method, for example, a method using MACS (Miltenyi Biotech) or the like. In the present invention, it is preferable to use CD4 positive T cells collected from a patient having a malignant neoplasm to be treated.
  • Antigen-presenting cells that can be used in the method of the present invention may be cells that express HLA class II molecules on the surface, and in addition to dendritic cells, B cells, macrophages, monocytes, nonproliferative transfer cells. Examples include but are not limited to kant.
  • Incubation may involve simultaneously incubating a tumor antigen containing a Survivin partial polypeptide, an antigen-presenting cell, and a CD4-positive T cell, or incubating the tumor antigen and the antigen-presenting cell first, followed by a CD4-positive T cell. May be incubated in the presence of. Incubation conditions are as follows: in the presence of IL-2, antigen-presenting cells are presented with the desired antigen via HLA class II molecules, and mature Th cells specific for the antigen are induced from CD4-positive T cells. For example, the method described in Tim et al. (Immunology Today, 1996, Vol. 17, No. 3, pp. 138-146) may be used. Further, based on the description of Nishimura et al. (J. Exp. Med., 1999, Vol. 190, No. 5, pp. 617-627), CD4 positive T It is possible to specifically induce either Th0 cells, Th1 cells, or Th2 cells from the cells.
  • polypeptide of the present invention is an antigenic polypeptide corresponding to the 76th to 94th amino acid sequence (SEQ ID NO: 17, hereinafter referred to as SU18) of a tumor antigen protein (survivin 2) referred to as Survivin It is.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence having the following relationships b) to g) with respect to the amino acid sequence of the polypeptide of SU18 (SEQ ID NO: 17) can also be used as the tumor antigen of the present invention.
  • Amino acid sequence g) An amino acid sequence in which 1 to 5 amino acid residues are further substituted in the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids at the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 are deleted.
  • amino acid substitution, deletion or addition in the above are silent substitution, deletion and addition, and substitution between conservative amino acids is particularly preferred. These do not change the activity of producing cytokines for the Sur / Th cells in the polypeptide of the present invention, or the epitope for inducing Thvi specific to Survivin or SU18 from CD4 positive T cells.
  • Representative conservative substitutions include mutual substitution between the hydrophobic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile, mutual substitution of the hydroxyl amino acids Ser and Thr, mutual substitution of the acidic residues Asp and Glu, amides Type amino acids Asn and Gln, mutual substitution of the basic amino acids Lys and Arg, mutual substitution of the aromatic amino acids Phe and Tyr, and the like.
  • a therapeutic agent for malignant neoplasm comprising Survivin and / or SU18, antigen-presenting cells and CD4 positive T cells, which are derived from CD4 positive T cells, and Th18 specific to SU18 are also included in the present invention. It is one mode.
  • SU18 becomes a tumor antigen against a human having the HLA genotype HLA-DRB1 * 0101, and at the same time a human whose HLA genotype is HLA-DRB1 * 1201 / HLA-DRG1 * 1502 or HLA-DQB1 * 0601 It is considered that it is a polypeptide that becomes a tumor antigen.
  • Each of the above polypeptides is a novel polypeptide that can be used as a component of a therapeutic agent for malignant neoplasms, and / or the activity of inducing Th cells specific for the polypeptide from CD4 positive T cells. It has the activity of producing cytokines in Th cells or Sur / Th cells.
  • the activity of causing a Th cell specific for the polypeptide or Survivin to produce a cytokine is stimulated with the polypeptide, and the produced cytokine is measured by various known methods. This can be confirmed. For example, the production of interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) can be easily measured and confirmed using other commercially available ELISA kits manufactured by BD Bioscience.
  • each of the polypeptides according to one aspect of the present invention has an amino acid sequence constituting them, for example, His-Tag, which is widely used as a tag sequence useful for protein separation and purification, and an appropriate linker sequence are used. It is also possible to further add the amino acid sequence of a marker protein such as GFP, or to add a labeling compound such as biotin to the polypeptide. Therefore, the amino acid sequence constituting the polypeptide which is one embodiment of the present invention causes Th cells or Sur / Th cells specific for these polypeptides to produce cytokines, or induces the cells from CD4-positive T cells.
  • polypeptide consisting of an amino acid sequence to which any amino acid residue used for purposes other than the above, or a polypeptide to which an appropriate labeling compound is added to the polypeptide of the present invention.
  • polypeptides are still within the scope of the present invention as long as they have an activity that causes the cell to produce cytokines or an epitope that induces specific Th cells from CD4 positive T cells.
  • the polypeptides of the present invention can be produced as recombinant proteins by applying various known gene recombination techniques to the DNA encoding them.
  • a DNA encoding the polypeptide of the present invention is synthesized using an appropriate DNA synthesizer and a reference book in the art, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring).
  • An expression vector that expresses the polypeptide of the present invention is constructed by appropriately selecting or combining various techniques introduced in Harbor Laboratory, Press, 1989, etc., and an appropriate host cell such as E. coli is transformed with this expression vector. What is necessary is just to convert and to produce the said polypeptide.
  • various operations used for production of the recombinant polypeptide can be added, such as addition of His-tag.
  • the polypeptide of the present invention can also be produced chemically and synthetically using amino acids modified with various protecting groups as raw materials.
  • Methods for organically synthesizing polypeptides without using genes or host cells are well known to those skilled in the art.
  • “Fifth Edition, Experimental Chemistry Course 16—Synthesis of Organic Compounds IV” by Saburo Aimoto et al., Edited by the Chemical Society of Japan) etc. introduces various methods of chemical synthesis of polypeptides. It can be synthesized using any of the methods. Moreover, it can also synthesize
  • the above polypeptide can induce CD4 positive T cells into Th cells by incubation of antigen presenting cells and CD4 positive T cells under appropriate conditions.
  • the present invention is specific to the above-mentioned polypeptide and / or Survivin by incubating an antigen-presenting cell expressing an HLA class II molecule, a CD4-positive T cell, and the above polypeptide in vitro.
  • methods of inducing specific Th cells In incubation, it is preferable to add one or more of IFN- ⁇ , IL-12, or anti-IL-4 antibody in addition to IL-2, and in such conditions, IFN- ⁇ is produced and IL-4 Th1 cells with low production can be induced.
  • antigen-presenting cells that can be used in this method can be used as long as they express HLA class II molecules on their surfaces.
  • dendritic cells B cells, macrophages, monocytes, Non-proliferative transfectants and the like can be mentioned, but are not limited thereto.
  • the above-mentioned polypeptide, antigen-presenting cells, and CD4-positive T cells may be incubated at the same time.
  • the polypeptide of the present invention and antigen-presenting cells are incubated first, and then CD4-positive T cells coexist. May be incubated.
  • various conditions for incubation of the peptide of the present invention and antigen-presenting cells expressing HLA class II molecules on the cell surface with CD4-positive T cells are as follows.
  • Sur / Th cells can be induced and cultured in vitro by recovering antigen-presenting cells and CD4-positive T cells from a patient and incubating them with the polypeptide of the present invention. . Returning the Sur / Th cells induced by this method to the patient is expected to activate the patient's own immune system and regress tumor cells.
  • the polypeptide of the present invention can induce an antibody capable of specifically recognizing Survivin in the animal by administering it to an appropriate animal such as a rabbit.
  • an antibody can specifically detect the presence of Survivin-expressing cells, that is, the presence of cancer cells, and can be used for efficient diagnosis of malignant neoplasms.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention is generally used for pharmaceutical preparations in addition to a tumor antigen and a Th cell specific for the tumor-specific antigen, as long as these actions are not inhibited. It may contain various excipients and other pharmaceutically active ingredients.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention is preferably in the form of a buffer solution or a liquid medium capable of stably holding a tumor antigen and Th cells specific for the tumor-specific antigen.
  • Non-limiting examples of buffer solutions include neutral buffered saline or phosphate buffered saline.
  • carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose, dextran, mannitol, proteins, amino acids, antioxidants, bacteriostatic agents, chelating agents (for example, EDTA or glutathione), adjuvants (for example, aluminum hydroxide), osmotic pressure
  • chelating agents for example, EDTA or glutathione
  • adjuvants for example, aluminum hydroxide
  • osmotic pressure It may further contain a regulator, suspending agent, thickener and / or preservative.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention is preferably in a form in which a tumor antigen and a Th cell specific for the tumor-specific antigen are mixed.
  • it may be in the form of a so-called kit in which specific Th cells are stored separately and can be mixed and administered at the time of use.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • PBMC-Ad Monocyte-derived antigen-presenting cells
  • PBMC-nonAd CD4-positive T cells using non-adherent PBMC
  • Example 3 Establishment of Th cell group containing Sur / Th cells using synthetic peptide PBMC-Ad and CD4 positive T cells (1 ⁇ 10 6 cells / well) prepared in Example 2) were used in this Example 1. 5) Human Serum in AIM-V 1 mL in the presence of a peptide (MIX 1-5, final concentration 10 ⁇ g / mL) mixed with 5 types of Survivin overlapping peptides prepared in (1) at 37 ° C. in a CO 2 incubator. The culture was started.
  • a peptide MIX 1-5, final concentration 10 ⁇ g / mL
  • the cells were collected, 200 ⁇ L of Fixation and Permeabilization solution (BD Biosciences) was added, left at room temperature for 20 minutes, washed with 0.5% BSA / PBS, added with FITC-labeled IFN- ⁇ antibody, and stained at room temperature for 15 minutes. did. After washing with 0.5% BSA / PBS, fluorescence signals were captured using flowcytometry (FACS Calibur, BD biosciences), and 3-color analysis was performed using CellQuest TM (BD biosciences). The result is shown in FIG.
  • Fixation and Permeabilization solution BD Biosciences
  • SU18 has a polymorphism having an epitope presented by a Survivin-specific HLA class II molecule. The peptide was confirmed.
  • HLA-DR restriction Since the genotypes of HLA of healthy individuals from which peripheral blood was collected in 2) of Example 1 are HLA-DRB1 * 0101 and HLA-DRB1 * 0901, 4 of Example 1 HLA-DR restriction was confirmed using the allogeneic antigen-presenting cells for Th cell groups containing Sur / Th cells that specifically react with SU18 obtained in (1).
  • allogeneic PBMC (1 ⁇ 10 5 cells / well) which is DRB1 * 0101
  • a Th cell group containing Sur / Th cells specifically reacting with the SU18 after treatment for 2 hours (5 ⁇ 10 4 c cell / well) and 96-well U plate (BD Bioscience) and 5% human serum in AIM-V 200 ⁇
  • IFN- ⁇ was produced when PBMCs with HLA genotypes of HLA-DRB1 * 0101 / HLA-DRB1 * 0802 and HLA-DRB1 * 0101 / HLA-DRB1 * 0101 were used. From this, it was confirmed that SU18 is restrained by HLA-DRB1 * 0101 in HLA-DR.
  • Example 3 Examination of HLA-DRB1 * 1201 / HLA-DRB1 * 1502 Restricted SU18 Recognition Site 1) Establishment of Th Cell Group Containing Sur / Th Cells Described in 2) and 3) of Example 1 According to the method, 28 days of co-culture was performed to prepare a Th cell group containing Sur / Th cells from peripheral blood of a healthy person whose HLA genotype was HLA-DRB1 * 1201 / HLA-DRB1 * 1502.
  • ELISPOTassay was performed using an ELISPOT plate (MAHAHS4510, Millipore) and an ELISPOT kit (Mabtech, Nacka).
  • the specifically induced Th cells and T-APCs were sufficiently collected on an ELISPOT plate coated with an anti-human IFN- ⁇ antibody (clone name 1-D1K, mAb) at a concentration of 2 ⁇ g / mL.
  • the cells were cultured in the presence of an amount of antigenic peptide. After 20 hours from the start of the culture, the culture supernatant was washed with a washing solution (0.05% Tween 20 / PBS).
  • biotinylated anti-human IFN- ⁇ antibody was added to the plate at a concentration of 0.2 ⁇ g / mL, and the reaction was carried out at 4 ° C. for 16 hours.
  • the plate was washed again with the above washing solution, and each hole was filled with 100 ⁇ L of PBS / streptavidin AP solution (the kit) and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the supernatant was washed away with the above washing solution, filled with BCIP / NBT-Bule Liquid substrate solution (Sigma), reacted for 10 minutes, and then washed with distilled water to stop the reaction. After completion of the reaction, the plate was dried and measured using CTLCTImmunoSpot Plate Reader (Cellular Technology). The result is shown in FIG.
  • antigen-specific reactions could be confirmed at T3 (5 amino acids missing from the N-terminal from SU18) and T8 (4 amino acids missing from the C-terminal from SU18). For this reason, it was confirmed that SU18 can induce Survivin-specific Sur / Th cells even when 4 amino acids are missing from the C-terminus or 5 amino acids are missing from the N-terminus.
  • SU18 is not only for patients whose HLA genotype is HLA-DRB1 * 0101 / HLA-DRB1 * 0901, but also for patients whose HLA genotype is HLA-DRB1 * 1201 / HLA-DRB1 * 1502. Was also found to be an effective polypeptide in immunotherapy.
  • Example 4 Examination of HLA-DQB1 * 0601 restricted SU18 recognition site 1) Confirmation of HLA restriction From peripheral blood of healthy person Y whose HLA genotype is HLA-DQB1 * 0302 / HLA-DQB1 * 0601
  • a Th4 cell group comprising a Sur / Th cell that specifically reacts with SU18 by preparing a CD4 positive T cell by the same method as 2) of Example 1 and by the same method as 3) and 4) of Example 1.
  • the cells were co-cultured for 24 hours in a CO 2 incubator at 37 ° C. in the presence of SU18 peptide. After the cultivation, IFN- ⁇ contained in the culture supernatant was measured using an ELISA kit (BD Bioscience). The result is shown in FIG.
  • a 96-well U-plate (BD Bioscience) and 5% human serum were prepared together with a Th cell group (5 ⁇ 10 4 cells / well) containing Sur / Th cells that specifically react with SU18.
  • Th cell group (5 ⁇ 10 4 cells / well) containing Sur / Th cells that specifically react with SU18.
  • AIM-V 200 ⁇ L co-culture was performed in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours. After the cultivation, IFN- ⁇ contained in the culture supernatant was measured using an ELISA kit (BD Bioscience). The result is shown in FIG.
  • HLA-DQB1 * 0301 / HLA-DQB1 * 0302 and HLA-DQB1 * 0302 / HLA-DQB1 * 0401 are used.
  • HLA-DQB1 * 0301 / HLA-DQB1 * 0601 produced IFN- ⁇ when PBMC was used, confirming that SU18 is restricted to HLA-DQB1 * 0601 in HLA-DQ It was done.
  • Th cell group containing Sur / Th cells that specifically react with SU18 and PBMC (1 ⁇ 10 5 cells / well) in a 96-well U plate (BD bioscience) and 200 ⁇ L of 5% human serum in AIM-V
  • Each of the overlapping peptides T1 to T10 was added to (5 ⁇ 10 4 cells / well) so that the final concentration was 10 ⁇ g / mL, and co-culture was performed in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours. After the cultivation, IFN- ⁇ contained in the culture supernatant was measured using an ELISA kit (BD Bioscience). The result is shown in FIG.
  • overlapping peptides T3 (5 amino acids missing from the N-terminal from SU18), T4 (4 amino acids missing from the N-terminal from SU18), T5 (3 amino acids from the N-terminal amino acid from SU18, and C T6 (one missing 2 amino acids from the N terminal and 2 amino acids from the C terminal) and T7 (1 amino acid missing from the N terminal and 3 amino acids from the C terminal from SU18) were used.
  • At least the peptide KHSSGCAFLSV of SEQ ID NO: 37 (K; lysine, H; histidine, S; serine, G; glycine, respectively) C: Cysteine, A: Alanine, F: Phenylalanine, L: Leucine, V Peptide comprising indicating valine) found that can induce Survivin-specific Sur / Th cells was confirmed.
  • Th cell group containing Sur / Th cells that specifically react with SU18 and PBMC (1 ⁇ 10 5 cells / well) in a 96-well U plate (BD bioscience) and 200 ⁇ L of 5% human serum in AIM-V
  • Each of the partially substituted peptides S1 to S17 was added to (5 ⁇ 10 4 cells / well) so as to have a final concentration of 10 ⁇ g / mL, and co-cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 24 hours. After the cultivation, IFN- ⁇ contained in the culture supernatant was measured using an ELISA kit (BD Bioscience). The result is shown in FIG.

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Abstract

【課題】　本発明は、新たな腫瘍抗原、及び該腫瘍抗原を利用して悪性新生物を治療する方法において有用な新たな治療剤と、該治療剤に利用可能な腫瘍抗原を提供するものである。 【解決手段】　本発明は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞であるＴｈ１細胞を誘導するエピトープを有する新たな腫瘍抗原とその利用法を提供する。 　本発明は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列等からなり、かつＳｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞にサイトカインを産生させる活性を有するポリペプチドである。本発明のペプチドは、これを抗原提示細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞とインキュベーションすることで、Ｓｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞を誘導し、またこのＳｕｒ／Ｔｈ細胞に対してサイトカインを産生させる活性を有している。

Description

ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示されるサーバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の部分ペプチドとその利用法
　本発明は、癌免疫療法に利用可能な抗原性ポリペプチドと、当該ポリペプチドを含む悪性新生物治療剤に関する。
　難治性の疾患である癌（悪性新生物）に対する治療法の一つに、患者個体の持つ免疫系を利用して癌細胞を退縮させる、いわゆる癌免疫療法が挙げられる。この方法における重要な点は、如何にして免疫系に癌細胞を異物として認識させ、癌細胞に対して攻撃性を有する免疫細胞を導くか、である。
　抗腫瘍免疫に関与する重要な免疫細胞に、細胞表面蛋白質であるＣＤ８を発現している細胞傷害性（ＣＤ８陽性Ｔ細胞）と、細胞表面蛋白質であるＣＤ４を発現しているＴ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）とがある。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、活性化された場合、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する抗原を提示している細胞を溶解するＴ細胞である。ＣＤ４陽性Ｔ細胞はサイトカインを分泌するＴｈ細胞であって、ＨＬＡクラスＩＩ分子により抗原を提示するマクロファージ及びあるいは樹状細胞等により活性化され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導及び維持のためのヘルパー機能を発揮する。
　また、Ｔｈ細胞は分泌するサイトカインの種類によってＴｈ１細胞(ＩＦＮ－γ等を産生する) 、Ｔｈ２細胞（ＩＬ－４等を産生する) 及びＴｈ０細胞(サイトカイン産生能は低いか、あるいはＩＦＮ－γ、ＩＬ－４等を共に産生する)に分類されることが知られており、各細胞の役割も解明されつつある。またＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子陰性腫瘍（ＭＨＣクラスＩＩ－腫瘍）に対する間接的な機構によって、例えばマクロファージの活性化を介して、又はＭＨＣクラスＩＩ陽性腫瘍に対する直接的な機構によって、エフェクター機能を持つこともできる。
　これまで、ヒトの癌免疫治療におけるＴ細胞の研究は、ＣＤ８陽性ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答(ＣＤ８＋ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ)の同定及び誘導に、主に焦点が絞られていた（特許文献１）。ＣＤ４陽性Ｔ細胞については、癌抗原の一つであるチロシナーゼとそのＣＤ４陽性Ｔ細胞に対するエピトープの同定その他いくつかのエピトープが報告されている（特許文献２）が、その数はＣＤ８陽性ＨＬＡクラスＩ拘束性ペプチドの報告例と比較し著しく少ない。
　また、既報のチロシナーゼは、メラノサイト系列の正常細胞及び腫瘍細胞の中で発現され、ＣＤ４陽性メラノーマ反応性Ｔ細胞の特異的標的として示された、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する唯一のメラノーマ会合性組織特異的抗原である（非特許文献１）。しかし、チロシナーゼは限られた型の腫瘍でのみ発現する抗原であり、癌免疫治療における有望な癌抗原であるとは言い難い。
　最近になって、サーバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）と称される、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される腫瘍特異抗原をコードしている遺伝子が報告されている（非特許文献２）。Ｓｕｒｖｉｖｉｎは、アポトーシス作用を阻害する物質として同定された、全１４２アミノ酸残基からなるタンパク質である。Ｓｕｒｖｉｖｉｎの発現は、正常組織では胎児組織、成人における胸腺及び精巣等の限定的な組織と、腫瘍組織、特に腫瘍化した肺、結腸、乳腺、脾臓、前立腺及びリンパ腫等において増加調節されていることが、際立った特徴として報告されている（非特許文献２）。
　Ｓｕｒｖｉｖｉｎは、その発現の増加調節が腫瘍性疾患における予後に好ましくない関連があるとの報告もあり、腫瘍抗原としては非常に重要な役割を示すタンパク質であると考えられており、ＳｕｒｖｉｖｉｎにおけるＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドの同定が行われている（非特許文献３）。しかし、非特許文献３に報告されたペプチドが拘束するＨＬＡクラスＩＩは限られたＨＬＡタイプに対したものであり、臨床に適応するためには、より多くのＨＬＡタイプに適応する複数のペプチドを用いることが必要である。
Ｔｏｐａｌｉａｎ、Ｓ．Ｌ．ら、１９９４年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９１巻、第９４６１－９４６５頁 Ｃｈｉａｒａ　Ｃａｓａｔｉら、ＣＡＮＣＥＲ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ、２００３年、第６３号、第４５０７－４５１５頁 Ｍａｔｔｈｉａｓ　Ｐｉｅｓｃｈｅら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００７年、第６８巻、第５７２－５７６頁 ＷＯ９５／１９７８３号公報 ＷＯ９７／１１６６９号公報
　本発明は、新たな腫瘍抗原、及び該腫瘍抗原を利用して悪性新生物を治療する方法において有用な新たな治療剤と、該治療剤に利用可能な腫瘍抗原を提供するものである。
　本発明者らは、腫瘍抗原と、該腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞とを含む治療剤が、該腫瘍抗原を発現している悪性新生物を著しく退縮させる効果を有していることを実験的に見いだし、さらに該腫瘍抗原として利用可能な新規な抗原性ペプチドを特定し、下記の各発明を完成した。
（１）下記のａ）～ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつＳｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞にサイトカインを産生させる活性を有するポリペプチド。
　ａ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列；
　ｂ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
　ｃ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＮ末端の１～４アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
　ｄ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＣ末端の１～５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
　ｅ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列。
　ｆ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
　ｇ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１～５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに１～数個のアミノ酸残基が置換したアミノ酸配列。
（２）ｂ）～ｇ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するエピトープであって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＳｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞を誘導する当該エピトープを有するポリペプチドである、（１）に記載のポリペプチド。
（３）（１）又は（２）に記載のポリペプチドをコードする核酸。
（４）（３）に記載の核酸を含むベクター。
（５）（１）又は（２）に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
（６）（１）又は（２）に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上を有効成分として含む、悪性新生物免疫治療用ワクチン。
（７）（１）又は（２）に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞とをインビトロでインキュベーションする工程を含む、Ｓｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞を誘導する方法。
（８）（１）又は（２）に記載のポリペプチドと該ポリペプチド又はＳｕｒｖｉｖｉｎに対して特異的なＴｈ細胞とを含む、悪性新生物治療剤。
　本発明のペプチドは、これを抗原提示細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞とインキュベーションすることで、Ｓｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞（以下、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞と表す）を誘導し、またこのＳｕｒ／Ｔｈ細胞に対してサイトカインを産生させる活性を有している。このＳｕｒ／Ｔｈ細胞はＳｕｒｖｉｖｉｎを発現している悪性新生物を特異的に攻撃するので、本発明のペプチドは悪性新生物治療剤の成分として利用することができる。
　また本発明のポリペプチドは、構成アミノ酸残基数が少なく、遺伝子組み換え手法に限らず、有機合成的方法によって大量に製造することができるので、臨床研究あるいは臨床応用において、安定的にかつ安価に供給され得る。
　また本発明のポリペプチドを含む悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原を当該腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞と組み合わせることで、Ｔｈ細胞に対してサイトカインの産生をより強く促すことができる。産生されたサイトカインは該腫瘍抗原を発現している悪性新生物に対して特異的な抗腫瘍免疫反応を生体に惹起し、腫瘍を退縮させる。
ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含む細胞群に混合ペプチドＭＩＸ１～ＭＩＸ５をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生を測定した結果を示す細胞内染色結果の図である。図中、縦軸はＣＤ４の発現強度を、横軸がＩＦＮ－γの発現強度を示す。 ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含む細胞群にポリペプチドＳＵ１６～ＳＵ２２をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生を測定した結果を示す細胞内染色結果の図である。図中、縦軸はＣＤ４の発現強度を、横軸がＩＦＮ－γの発現強度を示す。 ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含む細胞群に抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体及び抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＩＦＮ－γ（ＩＦＮ－ｇ）の産生量を示す。 ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含む細胞群と、ＨＬＡの遺伝子型がそれぞれ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４１０／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０２及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１であるａｌｌｏｇｅｎｅｉｃなＰＢＭＣに、ＳＵ１８（ｃｏｎｇｎａｔｅ）及びコントロールペプチド（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＨＬＡの遺伝子型を示し、横軸はＩＦＮ－γ（ＩＦＮ－ｇ）の産生量を示す。 ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞にポリペプチドＴ１～Ｔ１１をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＨＬＡの遺伝子型を示し、横軸はＩＦＮ－γ（ＩＦＮ－ｇ）の産生量を示す。 ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞にポリペプチドＴ１～Ｔ１０をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生細胞数を測定した結果を示すＥＬＩＳＰＯＴａｓｓａｙの図である。 ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０２／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含む細胞群に抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体及び抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＩＦＮ－γ（ＩＦＮ－ｇ）の産生量を示す。 ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０２／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含む細胞群と、ＨＬＡの遺伝子型がそれぞれ、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０１／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０４０１／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０２／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０４０１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０１／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１であるａｌｌｏｇｅｎｅｉｃなＰＢＭＣに、ＳＵ１８（ｃｏｎｇｎａｔｅ）及びコントロールペプチド（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＨＬＡの遺伝子型を示し、横軸はＩＦＮ－γ（ＩＦＮ－ｇ）の産生量を示す。 ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞にポリペプチドＴ１～Ｔ１０をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＨＬＡの遺伝子型を示し、横軸はＩＦＮ－γ（ＩＦＮ－ｇ）の産生量を示す。 ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１であるヒトから誘導したＳｕｒ／Ｔｈ細胞にポリペプチドＳ１～Ｓ１７をそれぞれ加えたときの、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ－γの産生をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＨＬＡの遺伝子型を示し、横軸はＩＦＮ－γ（ＩＦＮ－ｇ）の産生量を示す。
　本発明は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎの部分ポリペプチド、該部分ポリペプチドを含む腫瘍抗原、及び該腫瘍抗原と該腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞とを含む、悪性新生物治療剤に関する。本発明の悪性新生物治療剤は、好ましくは、Ｓｕｒｖｉｖｉｎの部分ポリペプチドを含む腫瘍抗原と、治療対象患者から回収されるＣＤ４陽性Ｔ細胞から該腫瘍抗原によって誘導される、該腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞とを含む治療剤である。
　本発明の悪性新生物治療剤は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎの部分ポリペプチドである腫瘍抗原と該腫瘍抗原に特異的なＴｈ細胞を組み合わせてなるという構成によって、該腫瘍抗原又は該腫瘍抗原に特異的なＴｈ細胞をそれぞれ単独で患者に投与した場合に比べて、悪性新生物の退縮作用において顕著な効果を奏する。
　Ｓｕｒｖｉｖｉｎの部分ポリペプチドを含む腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞とは、該腫瘍抗原によって特異的に刺激されることによってサイトカインを産生するＴｈ細胞であれば、Ｔｈ０細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞のいずれであってもよいが、Ｔｈ１細胞であればなおよい。かかる腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞は、該腫瘍抗原、ＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している抗原提示細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞を適当な条件下でインキュベーションすることで、該ＣＤ４陽性Ｔ細胞から誘導し、調製することができる。
　本発明の方法で利用可能なＣＤ４陽性Ｔ細胞は、採取された血液から一般的な方法、例えばＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）等を用いた方法で単離することができる。本発明では、治療対象となる悪性新生物を有する患者から回収されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の利用が好ましい。
　本発明の方法で利用可能な抗原提示細胞は、表面にＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している細胞であればよく、樹状細胞の他にＢ細胞、マクロファージ、単球、非増殖性のトランスフェクタント等を挙げることができるが、これらには限定されない。
　インキュベーションは、Ｓｕｒｖｉｖｉｎの部分ポリペプチドを含む腫瘍抗原と抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞とを同時にインキュベーションしてもよく、あるいは該腫瘍抗原と抗原提示細胞を先にインキュベーションし、その後にＣＤ４陽性Ｔ細胞を共存させてインキュベーションしてもよい。インキュベーションの条件は、ＩＬ－２の存在下で、抗原提示細胞に所望の抗原を、ＨＬＡクラスＩＩ分子を介して提示させ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞から当該抗原に特異的な成熟したＴｈ細胞を誘導するための一般的な方法、例えばＴｉｍら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１９９６年、第１７巻、第３号、第１３８－１４６頁）に記載の方法に従えばよい。また、西村ら（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１９９９年、第１９０巻、第５号、第６１７－６２７頁）の記載に基づいて、インキュベーションの諸条件を種々に変更することによって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞から、Ｔｈ０細胞、Ｔｈ１細胞、又はＴｈ２細胞のいずれかを特異的に誘導することが可能である。
　Ｔｈ０細胞、Ｔｈ１細胞、又はＴｈ２細胞が誘導されたことは、Ｓｕｒｖｉｖｉｎの部分ポリペプチドである腫瘍抗原で再刺激したときに産生される細胞毎のサイトカイン（例えば前述のＴｉｍら）を確認することで行うことができる。サイトカイン産生の確認は、ＥＬＩＳＡ法、細胞内染色法、エリスポット法、その他の種々の方法を利用することができる。
　本発明のポリペプチドの一態様は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎと称される腫瘍抗原蛋白質（前記非特許文献２）の７６～９４番目のアミノ酸配列（配列番号１７、以下ＳＵ１８とする）に相当する抗原性ポリペプチドである。
　さらに、ＳＵ１８（配列番号１７）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して、以下のｂ）～ｇ）のような関係にあるアミノ酸配列からなるポリペプチドも、本発明の腫瘍抗原として利用することができる。
　ｂ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
　ｃ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＮ末端の１～４アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
　ｄ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＣ末端の１～５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
　ｅ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列；
　ｆ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
　ｇ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１～５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに１～数個のアミノ酸残基が置換したアミノ酸配列。
　上記のｂ）～ｇ）のアミノ酸配列は、ＳＵ１８に存在するエピトープを保持し、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞に対してサイトカインを産生させる活性を有する、あるいはＣＤ４陽性Ｔ細胞からＳｕｒｖｉｖｉｎ又はＳＵ１８に特異的なＴｈ細胞を誘導するエピトープを有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列として規定したものである。
　ｂ）～ｇ）において規定される置換、欠失あるいは付加されるアミノ酸残基の種類は、先に示したポリペプチドの活性ないし機能を保持する範囲において特に制限はないが、ｂ）ならびにｆ）における１～数十個のアミノ酸の付加とは、１～５０アミノ酸、好ましくは１～３０アミノ酸、さらに好ましくは１～１５アミノ酸の付加である。
　上記におけるアミノ酸の置換、欠失あるいは付加の好ましい例はサイレント置換、欠失、及び付加であり、特に保存性アミノ酸間の置換が好ましい。これらは、本発明のポリペプチドにおけるＳｕｒ／Ｔｈ細胞に対してサイトカインを産生させる活性、あるいはＣＤ４陽性Ｔ細胞からＳｕｒｖｉｖｉｎ又はＳＵ１８に特異的なＴｈ細胞を誘導するエピトープを変化させない。代表的な保存性置換としては、疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅの間での相互の置換、ヒドロキシルアミノ酸Ｓｅｒ及びＴｈｒの相互の置換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの相互の置換、アミド型アミノ酸Ａｓｎ及びＧｌｎの相互の置換、塩基性アミノ酸Ｌｙｓ及びＡｒｇの相互の置換、芳香属アミノ酸Ｐｈｅ及びＴｙｒの相互の置換等が挙げられる。
　ＳＵ１８は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎと抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞とをインキュベーションすることで、ＣＤ４陽性Ｔ細胞から誘導されるＳｕｒ／Ｔｈ細胞に対してサイトカインを産生させる活性を有している。このことは、ＳＵ１８がＳｕｒ／Ｔｈ細胞によって認識されるエピトープを有しており、さらに当該エピトープが、Ｓｕｒｖｉｖｉｎを取り込んだ抗原提示細胞の表面に発現しているＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるエピトープであることを意味する。従って、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＳＵ１８とＳｕｒ／Ｔｈ細胞とを含む悪性新生物治療剤は、本発明の一態様である。また、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ及び／又はＳＵ１８と抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞とをインキュベーションすることでＣＤ４陽性Ｔ細胞から誘導されるＳＵ１８に特異的なＴｈ細胞とを含む悪性新生物治療剤も、本発明の一態様である。
　ＳＵ１８はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１というＨＬＡの遺伝子型を有するヒトに対して腫瘍抗原となると同時に、ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１／ＨＬＡ－ＤＲＧ１＊１５０２、あるいはＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１であるヒトに対しても腫瘍抗原となるポリペプチドであると考えられる。
　上記の各ポリペプチドは、いずれも悪性新生物治療剤の一成分として利用可能な新規なポリペプチドであり、ＣＤ４陽性Ｔ細胞から該ポリペプチドに特異的なＴｈ細胞を誘導する活性及び／又はかかるＴｈ細胞又はＳｕｒ／Ｔｈ細胞にサイトカインを産生させる活性を有する。上記の各ポリペプチドにおける、該ポリペプチド又はＳｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞にサイトカインを産生させる活性は、該Ｔｈ細胞を該ポリペプチドで刺激し、産生されるサイトカインを種々の公知の方法で測定することで確認することができる。例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製その他の市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、簡便に測定、確認することができる。
　なお、本発明の一態様である前記の各ポリペプチドは、それらを構成するアミノ酸配列を有する限り、例えば蛋白質の分離精製に有用なタグ配列として汎用されているＨｉｓ－Ｔａｇや、適当なリンカー配列、ＧＦＰの様なマーカー蛋白質のアミノ酸配列等をさらに付加したり、あるいはビオチン等の標識化合物をポリペプチドに付加させたりすることも可能である。従って、本発明の一態様であるポリペプチドを構成するアミノ酸配列に、それらのポリペプチドに特異的なＴｈ細胞やＳｕｒ／Ｔｈ細胞にサイトカインを産生させること、あるいはＣＤ４陽性Ｔ細胞から前記細胞を誘導すること以外の目的のために利用される任意のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドや、本発明のポリペプチドに適当な標識化合物が付加されたポリペプチドであっても、該細胞にサイトカインを産生させる活性あるいはＣＤ４陽性Ｔ細胞から特異的なＴｈ細胞を誘導するエピトープを有する限り、その様なポリペプチドは依然として本発明の範囲内である。
　本発明のポリペプチドは、それらをコードするＤＮＡに種々の公知の遺伝子組み換え手法を適用することで、当該ポリペプチドを組み換え蛋白質として製造することが可能である。典型的には、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを適当なＤＮＡ合成機を用いて合成し、当該技術分野における参考書、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等）に紹介されている種々の手法を適当に選択あるいは組み合わせて本発明のポリペプチドを発現する発現ベクターを構築し、大腸菌等の適当な宿主細胞をこの発現ベクターで形質転換させ、当該ポリペプチドを生産させればよい。その際、先に述べたように、Ｈｉｓ－ｔａｇの付加等の様に、組み換えポリペプチドの製造に利用される種々の操作を加えることができる。
　また、本発明のポリペプチドは、種々の保護基で修飾されたアミノ酸を原料として化学合成的に製造することもできる。ポリペプチドを遺伝子や宿主細胞を用いずに有機化学的に合成する方法は当業者に広く知られている。例えば、「第５版 実験化学講座１６ 有機化合物の合成ＩＶ」（相本三郎ら著、日本化学会編）等は、ポリペプチドの化学合成法を種々紹介しており、本発明のポリペプチドはこれらのいずれの方法を用いても合成することができる。また、一般にペプチドシンセサイザーと称される市販機器を用いて合成することもできる。
　上記のポリペプチドは、適当な条件下での抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞とのインキュベーションにより、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ細胞に誘導することができる。この様に、本発明は、ＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している抗原提示細胞と、ＣＤ４陽性Ｔ細胞と、上記のポリペプチドとをインビトロでインキュベーションして、上記のポリペプチド及び／又はＳｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞を誘導する方法も提供する。インキュベーションにおいて、ＩＬ－２に加えて、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、又は抗ＩＬ－４抗体の１以上を添加することが好ましく、かかる条件において、ＩＦＮ－γを産生し、かつＩＬ－４の産生が低いＴｈ１細胞を誘導することができる。
　この方法で利用可能な抗原提示細胞は、前述と同様に、表面にＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している細胞であれば利用可能であり、樹状細胞の他にＢ細胞、マクロファージ、単球、非増殖性のトランスフェクタント等を挙げることができるが、これらには限定されない。また、インキュベーションは、上記のポリペプチドと抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞とを同時にインキュベーションしてもよく、また本発明のポリペプチドと抗原提示細胞を先にインキュベーションし、その後ＣＤ４陽性Ｔ細胞を共存させてインキュベーションしてもよい。また、本発明のペプチドと細胞表面にＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞とのインキュベーションの諸条件は、前述の通り、抗原提示細胞に所望の抗原を、ＨＬＡクラスＩＩ分子を介して提示させ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞から当該抗原に特異的な成熟したＴｈ細胞を誘導するための一般的な方法、例えば前記Ｔｉｍらに記載の方法におけるインキュベーションの条件に準じて定めることができる。
　本発明の方法によれば、患者から抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞を回収し、これらと本発明のポリペプチドとをインキュベーションすることにより、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞をインビトロで誘導、培養することができる。この方法によって誘導されたＳｕｒ／Ｔｈ細胞を患者に戻すことによって、患者自身の免疫系を活性化させ、腫瘍細胞を退縮させることができるものと期待される。
　また本発明のポリペプチドは、これをウサギ等の適当な動物に投与することで、Ｓｕｒｖｉｖｉｎを特異的に認識することのできる抗体を当該動物において誘導することができる。この様な抗体は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎが発現している細胞の存在、すなわち癌細胞の存在を特異的に検出することができ、効率的な悪性新生物の診断に利用することができる。
　本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該該腫瘍特異抗原に対して特異的なＴｈ細胞の他に、これらの作用を阻害しない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分等を含んでいてもよい。特に、本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該該腫瘍特異抗原に対して特異的なＴｈ細胞を安定に保持できる緩衝液あるいは液体培地の形態にあることが好ましい。
　緩衝液の非限定的な例としては、中性の緩衝化生理食塩水又はリン酸緩衝化生理食塩水等を挙げることができる。また、例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の糖質、タンパク質、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、浸透圧調節剤、懸濁剤、増粘剤及び／又は保存剤等をさらに含んでいてもよい。
　また本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該該腫瘍特異抗原に対して特異的なＴｈ細胞とが混合されている形態にあることが好ましいが、腫瘍抗原と該該腫瘍特異抗原に対して特異的なＴｈ細胞とが別々に保存され、使用時に混合して投与することのできる、いわゆるキットの形態であってもよい。
　以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞　ＳＵ１８の同定
１）ペプチドの合成
　Ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ（配列番号５６）の１～２０番目のアミノ酸配列からなるペプチド、８～２７番目のアミノ酸配列からなるペプチド、１４～３４番目のアミノ酸配列からなるペプチドの様に、Ｃ末端及び／又はＮ末端に７～８アミノ酸のオーバーラップ配列を有する１９～２０アミノ酸残基からなるペプチド（表１）を、ＳｕｒｖｉｖｉｎのＮ末端からＣ末端に至るまで全２５種類（ＳＵ１～ＳＵ２７とする）設計し、それぞれ化学合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　さらに、ＳＵ１～ＳＵ５のペプチド混合物、ＳＵ６～ＳＵ１０のペプチド混合物というように、ＳＵ１～ＳＵ２７の順序（ただしＳＵ１７、１９は欠番とした）で、５種類のペプチドからなるペプチド混合物を５種類（ＭＩＸ１～ＭＩＸ５）調製した。
２）単球由来樹状細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製
　ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１である健常人Ｘの末梢血より、ファイコール (Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ; ＧＥ ＨｅａｌＴｈｃａｒｅ社)重層法を用いてｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ（以下ＰＢＭＣと表す）を分離した。ＰＢＭＣ（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４穴プレートに播き、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＦＮ－γ（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した５％ヒト血清含有培地（５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ １ｍＬにて、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。２時間後、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ、協和発酵工業社）にて４５分間処理し、ＰＢＭＣを不活化させた。ＭＭＣの洗浄後に残った付着性ＰＢＭＣを、単球由来抗原提示細胞（ＰＢＭＣ－Ａｄ）とした。さらに、ＰＢＭＣ－Ａｄを誘導する際に得られた非付着性ＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ－ｎｏｎＡｄ）からＥａｓｙ Ｓｅｐ（ＶＥＲＩＴＡＳ社）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を得た。
３）合成ペプチドを用いたＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群の樹立
　本実施例２）で調製したＰＢＭＣ－ＡｄとＣＤ４陽性Ｔ細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とを、本実施例１）で作製したＳｕｒｖｉｖｉｎオーバーラッピングペプチドを５種類ずつ混合したペプチド（ＭＩＸ１～５、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）存在下で５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ １ｍＬにて、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で共培養を開始した。
　共培養開始から７日後、初日と同様にｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＦＮ－γ処理したＰＢＭＣ－ＡｄとペプチドＭＩＸ１～５とを用いて、培養中の自己ＣＤ４陽性Ｔ細胞を再刺激し、さらにその２日後、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＬ－２を最終濃度１０Ｕ／ｍＬになるように添加した。さらに　共培養開始から１４日目に、７日目と同様の処理にて作製したＰＢＭＣ－Ａｄと１４日間培養した自己ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対し２回目の再刺激を行った。さらに、共培養開始から２１日後に、１４日目と同様の再刺激を繰り返した。
　細胞を回収し、９６穴Ｕプレート (ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社)及び５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ２００μＬにて、ＰＢＭＣ（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と、あらかじめＰＥ標識抗ＣＤ４抗体で染色を行ったＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群（４×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）とに、それぞれＭＩＸ１、ＭＩＸ２，ＭＩＸ３，ＭＩＸ４，ＭＩＸ５（１０μｇ／ｍＬ）を加え、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で２時間共培養を行った後、ｂｒｅｆｅｌｄｉｎｅ Ａ ５００μｇ／ｍＬ（ＢＦＡ；Ｓｉｇｍａ、Ａｙｒｓｈｉｒｅ社）を４μＬ加え、さらに４時間共培養を行った。細胞を回収し、Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）２００μＬを加え室温で２０分間置いた後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄を行い、ＦＩＴＣ標識ＩＦＮ－γ抗体を加え室温で１５分間染色した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて蛍光シグナルを取り込み、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて３－ｃｏｌｏｕｒ解析を行った。その結果を図１に示す。
　図１に示すように、ＭＩＸ４に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群が得られた。
４）ポリペプチドの同定
　本実施例３）で得られたＭＩＸ４に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群を用いて、ポリペプチドの同定を行った。
　９６穴Ｕプレート (ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社)及び５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ２００μＬにて、ＰＢＭＣ（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と、あらかじめＰＥ標識抗ＣＤ４抗体で染色を行った上記ＭＩＸ４を用いた細胞に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群（４×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）とに、それぞれＳＵ１６、ＳＵ１８、ＳＵ２０、ＳＵ２１及びＳＵ２２のそれぞれを、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で２時間共培養を行った後、ｂｒｅｆｅｌｄｉｎｅ Ａ ５００μｇ／ｍＬ（ＢＦＡ；Ｓｉｇｍａ、Ａｙｒｓｈｉｒｅ社）を４μＬずつ加え、さらに４時間共培養を行った。細胞を回収し、Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）２００μＬを加え室温で２０分間おいた後、０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄を行い、ＦＩＴＣ標識ＩＦＮ－γ抗体をそれぞれ加え室温で１５分間染色した。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて蛍光シグナルを取り込み、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて３－ｃｏｌｏｕｒ解析を行った。その結果を図２に示す。
　図２に示すように、ＳＵ１８を添加した細胞において、抗原特異的にＩＦＮ－γを発現する細胞が確認できたことから、ＳＵ１８がＳｕｒｖｉｖｉｎ特異的なＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されるエピトープを有するポリペプチドであることを確認した。
＜実施例２＞　ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１拘束性のＳＵ１８認識部位の検討
１）ＨＬＡ拘束性の確認
　実施例１の４）で得られたＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群と阻害抗体とを用いて、ＳＵ１８に対するＨＬＡ拘束性を確認した。
　９６穴Ｕプレート（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ２００μＬにて、ＰＢＭＣ（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と上記ＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群（５×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）とに、抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ社）、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ社）及び抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のそれぞれを最終濃度が５μｇ／ｍＬとなるように加え、ＳＵ１８ペプチド存在下、３７℃、ＣＯ２ インキュベーター内で２４時間共培養を行った。培養後、培養上清中に含まれるＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。その結果を図３に示す。
　図３に示すように、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体によりＩＦＮ－γ産生が阻害されたことから、ＳＵ１８はＨＬＡ－ＤＲに拘束されることが確認された。
２）ＨＬＡ－ＤＲ拘束性の確認
　実施例１の２）で末梢血を採取した健常人のＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１であることから、実施例１の４）で得られたＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群に対するアロジェニックな抗原提示細胞を用いて、ＨＬＡ－ＤＲ拘束性を確認した。
　ＳＵ１８（ｃｏｎｇｎａｔｅ）及びコントロールペプチド（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）のそれぞれを最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにして、ＨＬＡの遺伝子型がそれぞれ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４１０／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０２及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１であるａｌｌｏｇｅｎｅｉｃなＰＢＭＣ（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に加え、２時間処理した後、上記ＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群（５×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）とともに、それぞれ９６穴Ｕプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ２００μＬにて、３７℃、ＣＯ２ インキュベーター内で２４時間共培養を行った。培養後、培養上清中に含まれるＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。その結果を図４に示す。
　図４に示すように、ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０２及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１であるＰＢＭＣを用いた場合にＩＦＮ－γが産生されたことから、ＳＵ１８は、ＨＬＡ－ＤＲのうちＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１に拘束されることが確認された。
３）ＳＵ１８の部分欠損における認識部位の確認
　　実施例１の４）で得られたＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群と、表２に示した刺激用ペプチドであるオーバーラッピングペプチドＴ１～Ｔ１１とを用いて、ＳＵ１８の部分欠損における認識部位を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　９６穴Ｕプレート（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ２００μＬにて、ＰＢＭＣ（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と上記ＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群（５×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）とに、オーバーラッピングペプチドＴ１～Ｔ１１のそれぞれを最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃、ＣＯ２ インキュベーター内で２４時間共培養を行った。培養後、培養上清中に含まれるＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。その結果を図５に示す。
　図５に示すように、オーバーラッピングペプチドＴ６（ＳＵ１８よりＮ末端より２アミノ酸及びＣ末端より２アミノ酸欠落したもの）、Ｔ７（ＳＵ１８よりＮ末端より１アミノ酸及びＣ末端より３アミノ酸欠落したもの）、Ｔ８（ＳＵ１８よりＣ末端より４アミノ酸欠落したもの）、Ｔ９（ＳＵ１８よりＣ末端より５アミノ酸欠落したもの）、Ｔ１０（ＳＵ１８よりＣ末端より６アミノ酸欠落したもの）及びＴ１１（ＳＵ１８よりＣ末端より７アミノ酸欠落したもの）を用いた場合にＩＦＮ－γが産生され、抗原特異的な反応を確認することができたことから、少なくとも配列番号３７のペプチドＧＣＡＦＬＳＶＫＫＱ（それぞれ、Ｇ；グリシン、Ｃ；システイン、Ａ；アラニン、Ｆ；フェニルアラニン、Ｌ；ロイシン、Ｓ；セリン、Ｖ；バリン、Ｋ；リシン、Ｑ；グルタミンを示す）を含むペプチドが、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ特異的なＳｕｒ／Ｔｈ細胞を誘導できることが確認された。
＜実施例３＞　ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２拘束性のＳＵ１８認識部位の検討
１）Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群の樹立
　実施例１の２）及び３）に記載された方法に従って２８日間の共培養を行って、ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２である健常人の末梢血から、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群を調製した。さらに、単一細胞群を樹立するために９６穴Ｕプレートにヒト血清とウシ胎児血清の混合培地（２．５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ、２．５％ ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ）２００μＬ、ＰＢＭＣ－Ａｄ（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＬ－２（最終濃度２０Ｕ／ｍＬ）、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＬ－７（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、及びｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ、ＳＥＩＫＡＧＡＫＵ Ｃｏ．、最終濃度５μｇ／ｍＬ)を含む培地を用意し、前記Ｔｈ細胞群（１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を加えて、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で共培養を行なった。
　共培養開始１４日後に細胞のブラストがみられたｗｅｌｌを４８穴プレート、５％ ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ５００μＬにスケールアップを行った。以後、１週間間隔でＳＵ１８を用いてパルスしたＰＢＭＣ－Ａｄにより再刺激を行い、Ｓｕｒ／Ｔｈ細胞クローンを得た。
２）ＳＵ１８の部分欠損における認識部位の確認
　本実施例１で調製したＳｕｒ／Ｔｈ細胞クローンと、表３に示したＴ１～Ｔ１０を刺激用ペプチドとを用いて、以下に示すＥＬＩＳＰＯＴａｓｓａｙによりＳＵ１８の部分欠損における認識部位を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭＡＨＡ Ｓ４５１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社)とＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｎａｃｋａ社)を用いてＥＬＩＳＰＯＴａｓｓａｙを行った。キットの使用方法に従い、特異的に誘導したＴｈ細胞とＴ－ＡＰＣｓを、２μｇ／ｍＬの濃度で抗ヒトＩＦＮ－γ抗体（クローン名１－Ｄ１Ｋ、ｍＡｂ社）をコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレート上で、十分量の抗原ペプチド存在下にて培養した。培養開始２０時間後に培養上清を洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で洗浄した。さらにプレートにビオチン化抗ヒトＩＦＮ－γ抗体（ｍＡｂ社）０．２μｇ／ｍＬの濃度で添加し、４℃の状態で１６時間反応させた。再び上記洗浄液で洗浄し、各穴にＰＢＳ／ストレプトアビジンＡＰ液（上記キット）１００μＬで満たし、室温で１時間反応させた。その後、上清を上記洗浄液で洗い流し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ－Ｂｕｌｅ Ｌｉｑｕｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社）を満たし１０分反応後、蒸留水で洗浄し反応を停止した。反応終了後、プレートを乾燥後、ＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社).を用いて測定を行った。その結果を図６に示す。
　図６に示すように、Ｔ３（ＳＵ１８よりＮ末端より５アミノ酸欠落したもの）及びＴ８（ＳＵ１８よりＣ末端より４アミノ酸欠落したもの）において抗原特異的な反応を確認することができた。このためＳＵ１８はＣ末端より４アミノ酸欠落又はＮ末端より５アミノ酸欠落があってもＳｕｒｖｉｖｉｎ特異的なＳｕｒ／Ｔｈ細胞を誘導できることが確認された。また、ＳＵ１８は、ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１である患者だけではなく、ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２である患者に対しても、免疫療法において有効なポリペプチドであることが明らかとなった。
＜実施例４＞　ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１拘束性のＳＵ１８認識部位の検討
１）ＨＬＡ拘束性の確認
　ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０２／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１である健常人Ｙの末梢血より、実施例１の２）と同様の手法によってＣＤ４陽性Ｔ細胞を調製し、実施例１の３）及び４）と同様の手法によってＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群を得た。このＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞群と阻害抗体とを用いて、ＳＵ１８に対するＨＬＡ拘束性を確認した。
　９６穴Ｕプレート（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ２００μＬにて、ＰＢＭＣ（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と上記ＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群（５×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）とに、抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ社）、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ社）及び抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のそれぞれを最終濃度が５μｇ／ｍＬとなるように加え、ＳＵ１８ペプチド存在下、３７℃、ＣＯ２ インキュベーター内で２４時間共培養を行った。培養後、培養上清中に含まれるＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。その結果を図７に示す。
　図７に示すように、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体によりＩＦＮ－γ産生が阻害されたことから、ＳＵ１８はＨＬＡ－ＤＱに拘束されることが確認された。
２）ＨＬＡ－ＤＱ拘束性の確認
　本実施例１）で得られたＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群に対するアロジェニックな抗原提示細胞を用いて、ＨＬＡ－ＤＱ拘束性を確認した。
　ＳＵ１８（ｃｏｎｇｎａｔｅ）及びコントロールペプチド（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）のそれぞれを最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにして、ＨＬＡの遺伝子型がそれぞれ、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０１／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０４０１／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０２／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０４０１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０１／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１であるａｌｌｏｇｅｎｅｉｃなＰＢＭＣ（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に加え、２時間処理した後、上記ＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群（５×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）とともに、それぞれ９６穴Ｕプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ２００μＬにて、３７℃、ＣＯ２ インキュベーター内で２４時間共培養を行った。培養後、培養上清中に含まれるＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。その結果を図８に示す。
　図８に示すように、ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０１／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０２及びＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０２／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０４０１であるＰＢＭＣを用いた場合にＩＦＮ－ｇが産生されず、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３０１／ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１であるＰＢＭＣを用いた場合にＩＦＮ－γが産生されたことから、ＳＵ１８は、ＨＬＡ－ＤＱのうちＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１に拘束されることが確認された。
３）ＳＵ１８の部分欠損における認識部位の確認
　　本実施例１の１）で得られたＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群と、表３に示した刺激用ペプチドであるオーバーラッピングペプチドＴ１～Ｔ１０とを用いて、ＳＵ１８の部分欠損における認識部位を確認した。
　９６穴Ｕプレート（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ２００μＬにて、ＰＢＭＣ（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と上記ＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群（５×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）とに、オーバーラッピングペプチドＴ１～Ｔ１０のそれぞれを最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃、ＣＯ２ インキュベーター内で２４時間共培養を行った。培養後、培養上清中に含まれるＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。その結果を図９に示す。
　図９に示すように、オーバーラッピングペプチドＴ３（ＳＵ１８よりＮ末端より５アミノ酸欠落したもの）、Ｔ４（ＳＵ１８よりＮ末端より４アミノ酸欠落したもの）、Ｔ５（ＳＵ１８よりＮ末端アミノ酸より３アミノ酸及びＣ末端より１アミノ酸欠落したもの）Ｔ６（ＳＵ１８よりＮ末端より２アミノ酸及びＣ末端より２アミノ酸欠落したもの）及びＴ７（ＳＵ１８よりＮ末端より１アミノ酸及びＣ末端より３アミノ酸欠落したもの）を用いた場合にＩＦＮ－γが産生され、抗原特異的な反応を確認することができたことから、少なくとも配列番号３７のペプチドＫＨＳＳＧＣＡＦＬＳＶ（それぞれ、Ｋ；リシン、Ｈ；ヒスチジン、Ｓ；セリン、Ｇ；グリシン、Ｃ；システイン、Ａ；アラニン、Ｆ；フェニルアラニン、Ｌ；ロイシン、Ｖ；バリンを示す）を含むペプチドが、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ特異的なＳｕｒ／Ｔｈ細胞を誘導できることが確認された。
４）ＳＵ１８の部分置換における認識部位の確認
　本実施例１）で得られたＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群と、表４に示す刺激用ペプチドである、ＳＵ１８の各アミノ酸をアラニン（Ａ）又はグリシン（Ｇ）で置換した部分置換ペプチドＳ１～Ｓ１７とを用いて、ＳＵ１８の部分置換における認識部位を確認した。
　９６穴Ｕプレート（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び５％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ＡＩＭ－Ｖ ２００μＬにて、ＰＢＭＣ（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と上記ＳＵ１８に特異的に反応するＳｕｒ／Ｔｈ細胞を含むＴｈ細胞群（５×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）とに、部分置換ペプチドＳ１～Ｓ１７のそれぞれを最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃、ＣＯ２ インキュベーター内で２４時間共培養を行った。培養後、培養上清中に含まれるＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。その結果を図１０に示す。
　図１０に示すように、部分置換ペプチドＳ４（ＳＵ１８のＣ末端から４番目のリシンをアラニンに置換したもの）、Ｓ５（Ｓｕ１８のＣ末端から５番目のヒスチジンをアラニンに置換したもの）、Ｓ７（ＳＵ１８のＣ末端から７番目のセリンをアラニンに置換したもの）及びＳ９（ＳＵ１８のＣ末端から９番目のシステインをグリシンに置換したもの）を用いた場合には、ＩＮＦ－γがほとんど産生されないことが確認された。すなわち、少なくとも配列番号５５のペプチドＸＸＸＫＨＸＳＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（それぞれ、Ｘａａ；任意のアミノ酸、Ｋ；リシン、Ｈ；ヒスチジン、Ｓ；セリン、Ｃ；システインを示す）であるペプチドが、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ特異的なＳｕｒ／Ｔｈ細胞を誘導できることが確認された。

Claims (8)

  1. 　下記のａ）～ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつＳｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞にサイトカインを産生させる活性を有するポリペプチド。
    　ａ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列；
    　ｂ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
    　ｃ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＮ末端の１～４アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
    　ｄ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＣ末端の１～５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
    　ｅ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列。
    　ｆ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
    　ｇ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１～５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに１～数個のアミノ酸残基が置換したアミノ酸配列。
  2. 　ｂ）～ｇ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するエピトープであって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＳｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞を誘導する当該エピトープを有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  4. 　請求項３に記載の核酸を含むベクター。
  5. 　請求項１又は２に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
  6. 　請求項１又は２に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上を有効成分とする、悪性新生物免疫治療用ワクチン。
  7. 　請求項１又は２に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞とをインビトロでインキュベーションする工程を含む、Ｓｕｒｖｉｖｉｎに特異的なＴｈ細胞を誘導する方法。
  8. 　請求項１又は２に記載のポリペプチドと該ポリペプチド又はＳｕｒｖｉｖｉｎに対して特異的なＴｈ細胞とを含む、悪性新生物治療剤。
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