ES2345200T3 - Vacunas de adn contra el crecimiento tumoral y procedimientos de utilizacion de las mismas. - Google Patents

Abstract

Vacuna de ADN adecuada para provocar una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas que comprende un montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos una proteína survivina y por lo menos un producto génico inmunoactivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el montaje de ADN se incorpora operativamente en un vector bacteriano atenuado.

Description

Vacunas de ADN contra el crecimiento tumoral y procedimientos de utilización de las mismas.

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica los derechos de la solicitud provisional US para la patente nº de serie 60/457.009 presentada el 24 de marzo de 2003, cuya exposición está incorporada en la presente memoria como referencia.

Derechos gubernamentales

La presente invención fue realizada con la ayuda gubernamental con las subvenciones nº 1R01CA83856-01 y CA83856 de los National Institutes of Health, subvención nº 9RT00-17 del Tobacco Related Disease Research Program, y las subvenciones nº DAMD17-02-1-0137 y nº DAMD17-02-1-0562 del Department of Defense. El gobierno presenta determinados derechos sobre la invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a vacunas de ácido desoxirribonucleico (ADN) que codifican moléculas adecuadas, eficaces, para provocar una respuesta inmunitaria contra las células tumorales. Más específicamente la presente invención se refiere a vacunas de ADN que codifican un inhibidor asociado al cáncer de la proteína de la familia Apoptosis (IAP) y un producto génico inmunoactivo. La presente invención se refiere también a procedimientos de utilización de las vacunas de ADN para inhibir el crecimiento del tumor.

Antecedentes de la invención

Se han utilizado vacunas para proporcionar una protección de larga duración contra numerosas enfermedades mediante la administración muy limitada de un agente profiláctico que estimula un sistema inmunitario del organismo para destruir organismos patógenos de enfermedades antes de que puedan proliferar y producir un efecto patológico. Se describen varios procedimientos para vacunas y vacunaciones en Bernard R. Glick y Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, segunda edición, ASM Press págs. 253-276 (1998).

La vacunación es una manera de provocar al sistema inmunitario del propio cuerpo para buscar y destruir un agente infeccioso antes de que produzca un respuesta patológica. Por lo general, las vacunas son agentes infecciosos vivos, pero atenuados (virus o bacterias) o una forma destruida del agente. Una vacuna consistente en bacterias o virus vivos debe ser apatógena. Por lo general, un cultivo bacteriano o vírico se atenúa (debilita) por tratamiento físico o químico. Aunque el agente es avirulento, puede provocar todavía una respuesta inmunitaria en un paciente tratado con la vacuna.

Los antígenos, que pueden ser macromoléculas específicas o un agente infeccioso, provocan una respuesta inmunitaria. Estos antígenos son generalmente proteínas, polisacáridos, lípidos o glucolípidos, que son reconocidos como "extraños" por los linfocitos conocidos como linfocitos B y linfocitos T. La exposición de ambos tipos de linfocitos a un antígeno provoca una división celular rápida y una respuesta de diferenciación, dando como resultado la formación de clones de los linfocitos expuestos. Los linfocitos B producen células de plasma, que a su vez, producen proteínas denominadas anticuerpos (Ab) que se unen selectivamente a los antígenos presentes en el agente infeccioso, neutralizando o inactivando de este modo el patógeno (inmunidad humoral). En algunos casos, la respuesta del linfocito B requiere la asistencia de linfocitos T CD4 colaboradores.

El clon del linfocito T especializado que se forma en respuesta a la exposición al antígeno, es un linfocito T citotóxico (LTC), que puede unirse a patógenos y eliminarlos y a tejidos presentadores de antígeno (inmunidad mediada por células o celular). En algunos casos, una célula presentadora de antígeno (CPA) tal como un dendrocito, desarrollará un patógeno u otra célula extraña por endocitosis. La CPA procesa a continuación los antígenos procedentes de las células y presenta estos antígenos en forma de un complejo de histocompatibilidad molécula:péptido al receptor de linfocitos T (RLT) en los LTC, estimulando de este modo una respuesta inmunitaria.

La inmunidad humoral caracterizada por la formación de anticuerpos específicos es generalmente la más eficaz contra las infecciones bacterianas agudas y repiten infecciones procedentes de virus, mientras que la inmunidad mediada por células es más eficaz contra la infección vírica, la infección bacteriana intracelular crónica y la infección micótica. La inmunidad celular es también conocida porque protege contra cánceres y es responsable del rechazo de trasplantes de órganos.

Los anticuerpos contra antígenos procedentes de infecciones anteriores permanecen detectables en la sangre durante períodos muy prolongados, proporcionando de este modo un medio de determinación antes de la exposición al patógeno. Durante la reexposición al mismo patógeno, el sistema inmunitario previene eficazmente la reinfección eliminando el agente patógeno antes de que pueda multiplicarse y produzca una respuesta patógena.

La misma respuesta inmunitaria que provocaría un patógeno puede también a veces ser producida por un agente apatógeno que presenta el mismo antígeno como patógeno. De esta manera, el paciente puede ser protegido contra la exposición posterior al patógeno sin haber combatido previamente una infección.

No obstante, no todos los agentes infecciosos pueden cultivarse e inactivarse fácilmente, a medida que se necesita para la formación de la vacuna. Las técnicas modernas de ADN recombinante han permitido la modificación genética de nuevas vacunas para buscar superar esta limitación. Pueden crearse agentes infecciosos que carecen de genes patógenos, permitiendo así una forma viva, no virulenta del organismo que va a utilizarse como vacuna. También es posible modificar genéticamente un organismo relativamente no patógeno tal como E. coli para presentar los antígenos de la superficie celular de un vehículo patógeno. El sistema inmunitario de un paciente vacunado con dicho vehículo transformado es "engañado" en la formación de anticuerpos contra el patógeno. Las proteínas antigénicas de un agente patógeno pueden modificarse genéticamente y expresarse en una especie apatógena y las proteínas antigénicas pueden aislarse y purificarse para producir una "vacuna subunitaria". Las vacunas subunitarias tienen la ventaja de ser estables, seguras y químicamente bien definidas; sin embargo, su producción puede ser de coste prohibitivo.

En los últimos años ha aparecido una nueva metodología para vacunas, denominada a grandes rasgos inmunización genética. En esta metodología, un gen que codifica un antígeno de un agente patógeno se inserta de manera operable en las células en el paciente que va a ser inmunizado. Las células tratadas, preferentemente células presentadoras de antígeno (CPA) tales como los dendrocitos, se transforman y producen las proteínas antigénicas del patógeno. Estos antígenos producidos in vivo desencadenan a continuación la respuesta inmunitaria deseada en el hospedador. El material genético utilizado en dichas vacunas genéticas puede ser un montaje de ADN o de ARN. Con frecuencia el polinucleótido que codifica el antígeno se introduce en combinación con otras secuencias activadoras del polinucleótido para aumentar la inserción, replicación o expresión del gen.

Las vacunas de ADN que codifican genes de antígeno pueden introducirse en las células hospedadoras del paciente mediante varios sistemas de administración. Estos sistemas de administración incluyen sistemas de administración procariótica y vírica. Por ejemplo, una metodología consiste en utilizar un vector vírico, tal como un virus de vacuna que incorpora el nuevo material genético, para inocular las células hospedadoras. Alternativamente, el material genético puede incorporarse en un vector plásmido o puede suministrarse directamente a las células hospedadoras como un polinucleótido "desnudo", es decir simplemente como ADN purificado. Además, el ADN puede transfectarse de manera estable en bacterias atenuadas tal como Salmonella typhimurium. Cuando un paciente es vacunado por vía bucal con la Salmonella transformada, las bacterias son transportadas a parches de Peyer en el intestino (es decir, tejidos linfoides secundarios), que a continuación estimulan una respuesta inmunitaria.

Las vacunas de ADN proporcionan una oportunidad para inmunizar contra enfermedades que no son producidas por patógenos tradicionales, tales como las enfermedades genéticas y el cáncer. Por lo general, una vacuna genética contra el cáncer introduce en las CPA un gen que codifica un antígeno, y las CPA transformadas de este modo producen antígenos contra un tipo específico de célula tumoral. Una vacuna general eficaz contra numerosos tipos de cáncer puede suponer numerosas vacunas individuales para cada tipo de célula cancerosa contra la que va a ser inmunizada.

El inhibidor de proteínas de apoptosis (es decir, proteínas de la familia IAP) es una clase antígenos naturales expresados en muchas células tumorales diferentes. Como sugiere el nombre, estas proteínas, en su forma natural, inhiben la apoptosis (es decir, la muerte celular programada), lo que a su vez, puede conducir a resistencia de las células cancerosas a la apoptosis que producen agentes quimioterapéuticos, tal como el etopósido. Los ejemplos de proteínas de la familia IAP incluyen la IAP asociada al cromosoma X (XIAP), NAIP, cIAP1 (conocida también como BIRC2), cIAP2 (conocida también como BIRC3), bruce (conocida también como BIRC6), survivina (conocida también como BIRC5) y livina (conocida también como BIRC7, KIAP y ML-IAP). La familia de proteínas IAP de mamífero incluye proteínas con tres dominios BIR (por ejemplo, XIAP, cIAP1, cIAP2 y NAIP) así como proteínas con un solo dominio BIR (por ejemplo, survivina y livina).

Tamm et al. Cancer Res. 1998; 58(23):5315-20, han descrito la expresión de la survivina humana en 60 estirpes de células tumorales humanas. Tamm et al. han descrito también que la survivina y la XIAP eran ambas eficaces en la inhibición de la muerte celular programada (apoptosis) provocada por el tratamiento de las células tumorales con agentes inductores de apoptosis tales como Bax o Fas (CD95). La survivina y otras proteínas de la familia IAP inhiben supuestamente la apoptosis uniéndose a las proteasas efectoras de la muerte celular, por ejemplo, caspasa-3 y caspasa-7. Las mutaciones en las proteínas de la familia IAP pueden conducir a actividad de inhibición reducida de la apoptosis o incluso a actividad inductora de apoptosis en comparación con la actividad de la proteína natural de la familia IAP. Se cree que la actividad antiapoptósica de las proteínas de la familia IAP está asociada al dominio BIR.

Supuestamente la survivina está presente en las células cancerosas humanas más comunes, incluyendo en los cánceres de pulmón, próstata, mama y páncreas. La survivina se ha identificado también en linfomas no hodgkinianos de calidad superior pero no en linfomas no hodgkinianos de calidad inferior. Supuestamente, la survivina está presente en células normales durante el desarrollo del feto, pero a diferencia de la mayoría de otras proteínas de la familia IAP, la survivina es prácticamente indetectable en los tejidos normales humanos de adulto. Véase Ambrosini et. al. Nat. Med. 1997; 3(8): 917-21.

Se ha detectado livina en algunos tejidos de adulto y en tejidos embrionarios. Se han publicado niveles de expresión elevados de livina en melanomas, células de cáncer de colon, células de cáncer de vejiga y células de cáncer de pulmón. Se han publicado dos variantes de corte y empalme de livina, las cuales contienen un solo dominio BIR. La variante alfa completa tiene 298 restos de aminoácidos, mientras que la variante beta tiene 280 restos de aminoácidos.

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Se han identificado también proteínas de la familia IAP, en numerosas especies además de la humana, incluyendo mamíferos tales como el ratón, anfibios tales como la especie Xenopus (ranas africanas de uñas), insectos tal como la especie Drosophila, y baculovirus.

La naturaleza omnipresente y muy selectiva de la expresión de survivina en células cancerosas la convierte en un marcador para diagnóstico potencialmente útil para el cáncer. Por ejemplo, Rohayem et al. Cancer Res. 2000; 60:1815-17, han identificado supuestamente anticuerpos contra survivina en pacientes humanos de cáncer de pulmón y colorrectal.

Se ha identificado también a la survivina como diana para la terapia del cáncer. El efecto inhibidor de survivina sobre caspasa-3 y caspasa-7 ha estado implicado en la resistencia de las células cancerosas a varios tratamientos quimioterapéuticos que estimulan la apoptosis. Se ha publicado que un oligonucleótido complementario que dirige la expresión de survivina regula por disminución la expresión de survivina en una estirpe de células de adenocarcinoma y sensibiliza las células cancerosas al etopósido del agente quimioterapéutico. Véase Olie et al. Cancer Res. 2000; 60:2805-9 y Mesri et al. J. Clinical. Res., 2001; 108:981-990.

Las citocinas son proteínas y polipéptidos producidos por células que pueden afectar al comportamiento de otras células, tal como la proliferación celular, la diferenciación celular, la regulación de las respuestas inmunitarias, la hematopoyesis y las respuestas inflamatorias. Las citocinas se han clasificado en numerosas familias, incluyendo las quimiocinas, hematopoyetinas, inmunoglobulinas, factores de necrosis tumoral y varias moléculas sin asignar. Véase generalmente Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, edición revisada, Oxford University Press., 2000; y C. A. Janeway, P. Travers, M. Walport y M. Schlomchik, Immunobiology, quinta edición., Garland Publishing, 2001 (en lo sucesivo Janeway y Travers). Una clasificación concisa de citocinas se presenta en Janeway y Travers, Apéndice III, páginas 677-679, cuyas exposiciones aplicables se incorporan en la presente memoria como
referencia.

Las hematopoyetinas incluyen, por ejemplo eritropoyetina, interleucina-2 (IL-2, proteína de 133 aminoácidos producida por los linfocitos T e implicada en la proliferación de los linfocitos T), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-15 (proteína similar a IL-2 de 114 aminoácidos, que estimula el crecimiento del epitelio intestinal, los linfocitos T y las células NK), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), oncostatina M (OSM) y factor inhibidor de leucemia (LIF).

Los interferones comprenden, por ejemplo, IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma (proteína homodimérica de 143 aminoácidos producida por los linfocitos T y las células NK, que está implicada en la activación de macrófagos, en el aumento de expresión de las moléculas MHC y los componentes del tratamiento de antígenos, en el cambio de posición de la clase IG y en la supresión de T_{H}2).

Las inmunoglobulinas comprenden, por ejemplo, B7.1 (CD80), y B7.2 (CD86), ambas coestimulan las respuestas de linfocitos T.

La familia del factor de necrosis tumoral (TNF) incluye, TNF-\alpha, TNF-\beta (linfotoxina), linfotoxina-\beta (LT-\beta), ligando CD40, ligando Fas, ligando CD27, ligando CD30, ligando 4-1BB, Trail y ligando OPG.

Varias citocinas que no están asignadas a una familia específica incluyen, por ejemplo, el factor-\beta de crecimiento tumoral (TGF-\beta), IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-1 RA, IL-10, IL-12 (factor estimulante de células destructoras naturales, un heterodímero de una cadena de 197 aminoácidos y de una cadena de 306 aminoácidos, que está implicado en la activación de las células NK y en la inducción de la diferenciación de linfocitos T a las células similares a T_{H}1), factor inhibidor de macrófagos (FIM), IL-16, IL-17 (factor de inducción de la producción de citocinas, que induce la producción de citocinas en epitelios, endotelios y fibroblastos) e IL-18.

Las quimiocinas son una familia de citocinas que son proteínas y polipéptidos quimiotaxinas relativamente pequeñas, que estimulan la migración y activación de varias células, tal como la migración de leucocitos (por ejemplo, fagocitos y linfocitos). Las quimiocinas desempeñan una función en la inflamación y otras respuestas inmunitarias. Las quimiocinas se han clasificado en numerosas familias, incluyendo las quimiocinas C, quimiocinas CC, quimiocinas CXC, y las quimiocinas CX_{3}C. Las denominaciones se refieren al número y espaciado de restos de cisteína en las moléculas; las quimiocinas C que tienen una cisteína, las quimiocinas CC que tienen dos cisteínas contiguas, las CXC que tienen dos cisteínas separadas por un solo resto de aminoácido y las quimiocinas CX_{3}C que tienen dos cisteínas separadas por restos de tres aminoácidos. Las quimiocinas interactúan con numerosos receptores de quimiocina presentes en las superficies celulares. Véase Janeway y Travers, Apéndice IV, pagina 680, cuyas exposiciones aplicables están incorporadas a la presente memoria como referencia.

Además, las quimiocinas pueden tener actividad inmunomoduladora y han estado implicadas en respuestas inmunitarias al cáncer. Por ejemplo, 6Ckine/SLC, el análogo de ratón de la quimiocina humana tisular linfoide secundaria (SLC), actualmente denominada frecuentemente CCL21, se ha publicado que provoca una respuesta antitumoral, en una estirpe de células tumorales C-26 del carcinoma de colon. Véase Vicari et al. J. Immunol. 2000; 165(4):1992-2000. CCL21 humana y su contrapartida murina, 6Ckine/SLC, están clasificadas como quimiocinas CC, que interactúan con el receptor de la quimiocina CCR7. Vicari et al. han publicado también que la 6Ckine/SLC murina (muCCL21) es un ligando para el receptor de quimiocinas CXCR3. CCL21 humana, muCCL21 murina y varias otras quimiocinas están implicadas en la regulación de varias células del sistema inmunitario tales como los dendrocitos, los linfocitos T y las células destructoras naturales (NK).

Mig e IP-10 son quimiocinas CXC que interactúan con el receptor CXCR3, que está asociado a linfocitos T activados. La linfotactina es una quimiocina C, que interactúa con el receptor XCR1 asociado a los linfocitos T y a células NK. La fractalcina es una quimiocina CX_{3}C, que interactúa con el receptor CX_{3}CR1 que está asociado a linfocitos T, monocitos y neutrófilos.

Las células NK son linfocitos granulares grandes que reconocen y destruyen células que han sido infectadas con un virus. Las células NK pueden ser reguladas por la interacción de ligandos de polipéptido inmunomoduladores con receptores en la superficie de la célula NK. Por ejemplo, ligandos para el receptor NKG2D que pueden regular la actividad de las células NK, incluyen quimiocinas tales como muCCL21, y ligandos de polipéptido inducibles por estrés tales como los antígenos relacionados con la cadena de MHC clase 1 y las proteínas que se unen a UL16. Se ha informado de que el péptido del antígeno con histocompatibilidad menor H60 murino se une también al receptor NKG2D. Véase por ejemplo, Robertson et al. Cell. Immunol. 2000; 199(1):8-14; Choi et al. Immunity 2002; 17(5): 593-603 y Farag et al., Blood, 2002; 100(6):1935-1947.

La presente invención satisface una necesidad en curso para las vacunas que pueden estimular una respuesta inmunitaria general contra las células cancerosas proporcionando una vacuna de ADN que codifica una proteína de la familia IAP asociada al cáncer y un producto génico inmunoactivo en un solo vector.

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Sumario de la invención

Una vacuna de ADN eficaz para provocar una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas comprende un montaje de ADN que codifica operativamente una proteína y un producto génico inmunoactivo en un vehículo de survivina farmacéuticamente aceptable. El montaje de ADN se incorpora operativamente a un vector tal como una bacteria atenuada (por ejemplo, un vector de Salmonella typhimurium atenuada). La vacuna de ADN incluye un polinucleótido que codifica por lo menos una proteína junto con un polinucleótido que codifica un producto génico survivina inmunoactivo. Preferentemente el producto génico inmunorreactivo codificado por el montaje de ADN es una citocina, un ligando para el receptor de la superficie de las células destructoras naturales o una molécula inmunorreactiva
similar.

En una forma de realización, la vacuna de ADN comprende preferentemente un ADN que codifica operativamente una proteína survivina seleccionada de entre el grupo constituido por (a) survivina humana natural con la secuencia SEC. ID. nº: 2 de restos de aminoácidos, (b) un homólogo inmunógeno de survivina humana natural con la secuencia de restos de aminoácidos por lo menos 80% idénticos a la SEC. ID. nº: 2, (c) una variante de corte y empalme de survivina humana con la secuencia de restos de aminoácidos de SEC. ID. nº: 23, (d) una variante de corte y empalme de la survivina humana con la secuencia de restos de aminoácidos SEC. ID. nº: 24, y (e) un fragmento de una proteína survivina que se une a una molécula MHC de clase I y es reconocido por linfocitos T citotóxicos.

La citocinas preferidas incluyen quimiocinas, tales como CCL21 humana, CCL21 murina, linfotactina, fractalcina, IP-10 y similares, hematopoyetinas, tales como IL-2, IL-15 y similares; interferones, tales como IFN-\gamma y similares; así como otras citocinas asociadas a la migración o proliferación de linfocitos T y células NK, tales como IL-12, IL-17 y similares.

Los ligandos receptores de la superficie de las células destructoras naturales preferidas son proteínas inducibles por estrés tales como MICA humana, MICB humana, ULBP1 humana, ULBP2 humana, ULBP3 humana y similares, que se unen al receptor de la superficie de células NKG2D. Los ligandos NKG2D particularmente preferidos son MICA y MICB.

Los adyuvantes convencionales tales como alúmina, emulsiones de aceite en agua, conservantes y similares, pueden estar también presentes en las vacunas. Las vacunas de ADN de la presente invención estimulan una respuesta inmunitaria contra las células tumorales, incluyendo la estimulación de la apoptosis de la célula tumoral, inhibiendo de este modo el crecimiento tumoral y la metástasis.

En un aspecto del procedimiento de la presente invención, se utiliza una vacuna de ADN para proporcionar inhibición del crecimiento del tumor de larga duración en un paciente vacunado. Una vacuna de ADN que comprende un montaje polinucleotídico operable que codifica una proteína survivina y un producto génico inmunoactivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra (preferentemente por vía bucal) a un paciente necesitado de inhibición del crecimiento tumoral en una cantidad que es suficiente para provocar un respuesta inmunitaria contra las células tumorales.

Las vacunas de la presente invención son útiles para el tratamiento de varios tipos de cánceres. Por ejemplo, un paciente que padece un cáncer pulmonar, cáncer colorrectal, melanoma y similares, puede beneficiarse de la inmunización por las vacunas de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos, la figura 1 representa la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la survivina humana, SEC. ID. nº: 1;

la figura 2 representa la secuencia de restos de aminoácidos de la survivina humana, SEC. ID. nº: 2;

la figura 3 representa la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la TIAP murina, SEC. ID. nº: 3;

la figura 4 representa la secuencia de ácidos nucleicos de la TIAP murina, SEC. ID. nº: 4;

la figura 5 representa la homología de secuencias entre la survivina humana y la TIAP murina;

la figura 6 representa la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la SLC humana (CCL21), SEC. ID. nº: 5;

la figura 7 representa la secuencia de restos de aminoácidos de la SLC humana (CCL21), SEC. ID. nº: 6;

la figura 8 representa la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la 6Ckine/SLC murina (muCCL21), SEC. ID. nº: 7;

la figura 9 representa la secuencia de aminoácidos de la 6Ckine/SLC murina (muCCL21), SEC. ID. nº: 8;

la figura 10 representa la homología de proteínas entre SLC humana (CCL21) y 6Ckine/SLC murina ( muCCL21);

la figura 11 representa una secuencia parcial de ácidos nucleicos que codifica el péptido H60 del antígeno murino con histocompatibilidad menor, SEC. ID. nº: 9;

la figura 12 representa una secuencia parcial de restos de aminoácidos del péptido H60 del antígeno con histocompatibilidad menor, SEC. ID. nº: 10;

la figura 13 es una representación esquemática de montajes de ADN que codifica a una proteína survivina (survivina murina, conocida también como TIAP) y una quimiocina inmunomoduladora (CCL21, conocida también como SLC) en un vector pBudCE4.1;

la figura 14A representa gráficamente el volumen medio del tumor para la metástasis pulmonar de carcinomas pulmonares de Lewis en ratones tratados con un tampón de referencia (E), una vacuna de referencia que comprende un vector vacío (D), una vacuna de ADN que se compone de una quimiocina (C), una vacuna que se compone de una proteína (B) survivina y una vacuna de la invención (A); la figura 14B incluye fotografías de la metástasis de tumor pulmonar típica extirpada del ratón vacunado tal como se describe en la Fig. 14A;

la figura 15 representa la citotoxicidad mediada por linfocitos T provocada por las vacunas de ADN descritas en la figura 14A contra las células de cáncer pulmonar D121; el porcentaje de lisis (eje Y) está representado por tres células efectoras diferentes para las relaciones (E/T) de la célula diana para cada vacunación (es decir, 100:1, punto del primer dato; 50:1, punto del segundo dato y 25:1, punto del tercer dato);

la figura 16 ilustra gráficamente la expresión regulada por aumento de la activación de linfocitos T en ratones vacunados con una vacuna de la invención, tal como se determina por el análisis de citometría de flujo;

la figura 17 ilustra gráficamente la expresión aumentada de moléculas coestimuladoras por dendrocitos, después de las vacunaciones de ratones con una vacuna de la invención y varias vacunas de referencia;

la figura 18 ilustra la inducción de liberación de citocina intracelular después de las vacunaciones de ratones con una vacuna de la invención y varias vacunas de referencia, tal como se determina por el análisis de citometría de flujo;

la figura 19 ilustra representaciones en FACS que demuestran un aumento en la apoptosis en células D121 de tumor pulmonar después de la vacunación de ratones con la vacuna de la invención y varias vacunas de referencia (A) 3 horas después de la vacunación; y (B) 24 horas después de la vacunación;

la figura 20 representa una representación esquemática de montajes de expresión que incorporan TIAP y un péptido H60 del antígeno con histocompatibilidad menor;

la figura 21 ilustra gráficamente datos de ensayos de citotoxicidad de esplenocitos aislados de ratones vacunados con una vacuna de la invención;

la figura 22 representa pulmones extirpados de ratones vacunados tal como se describe en el Ejemplo 10 (superior) y un gráfico de barras (inferior) del peso medio del pulmón de ratones de los grupos de tratamiento;

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la figura 23 es un gráfico del porcentaje de supervivencia de ratones vacunados y sometidos a la prueba de provocación con células CT-26 de tumor;

la figura 24 ilustra la expresión del péptido H60 (A) y muSurvivina (B);

la figura 25 ilustra la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante CCL21b de 6Ckine/SLC, SEC. ID. nº: 11;

la figura 26 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de la variante CCL21b de 6Ckine/SLC, SEC. ID. nº: 12;

la figura 27 ilustra la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la MICA humana, SEC. ID. nº: 13;

la figura 28 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de la MICA humana, SEC. ID. nº: 14;

la figura 29 ilustra la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la MICB humana, SEC. ID. nº: 15;

la figura 30 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de la MICB humana, SEC. ID. nº: 16;

la figura 31 ilustra la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la ULBP1 humana, SEC. ID. nº: 17;

la figura 32 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de la ULBP1 humana, SEC. ID. nº: 18;

la figura 33 ilustra la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la ULBP2 humana, SEC. ID. nº: 19;

la figura 34 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de la ULBP2 humana, SEC. ID. nº: 20;

la figura 35 ilustra la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la ULBP3 humana, SEC. ID. nº: 21;

la figura 36 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de la ULBP3 humana, SEC. ID. nº: 22;

la figura 37 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de la survivina-2B (SEC. ID. nº: 23) variante de corte y empalme de la survivina humana y de la survivina-\DeltaEx3 (SEC. ID. nº: 24) variante y empalme;

la figura 38 es una reproducción del registro en GENBANK para el nº de Registro NP 005922, que describe variantes alélicas de MICB;

la figura 39 representa la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante de corte y empalme de livina alfa humana completa, SEC. ID. nº: 26;

la figura 40 representa la secuencia de aminoácidos de la variante de corte y empalme de livina alfa humana, SEC. ID. nº: 27;

la figura 41 representa la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante de corte y empalme de livina beta humana completa, SEC. ID. nº: 28; y

la figura 42 representa la secuencia de aminoácidos de la variante de corte y empalme de livina beta humana, SEC. ID. nº: 29.

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Descripción detallada de las formas de realización preferidas

Una vacuna de ADN eficaz para provocar una respuesta inmunitaria contra las células tumorales se compone de un montaje de ADN que codifica operativamente la proteína survivina y un producto génico inmunoactivo. La expresión "montaje de ADN" tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas significa una estructura de ADN sintético que puede transcribirse en células diana. El montaje puede comprender un ácido nucleico lineal, tal como un ADN purificado, un ADN incorporado en un vector plásmido, o un ADN incorporado en cualquier otro vector adecuado para introducir ADN en una célula hospedadora. Preferentemente, el ADN se incorpora en un vector vírico o bacteriano, más preferentemente en un vector vírico o bacteriano atenuado, que no es patógeno, aún más preferentemente en un vector bacteriano atenuado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inmunidad", se refiere a la protección inmunológica de larga duración contra la forma virulenta del agente infeccioso o del antígeno tumoral. El término "inmunización", se refiere a la exposición profiláctica a un antígeno de un agente patógeno procedente de una fuente no virulenta, que produce inmunidad al patógeno en el paciente tratado.

El término "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula que es una proteína glucosilada, una inmunoglobulina, que se une específicamente a un antígeno.

El término "antígeno", tal como se utiliza en la presente memoria, indica una entidad que, cuando se introduce en un animal inmunocompetente, estimula la producción de anticuerpo o anticuerpos específicos que pueden combinarse con el antígeno. El término "inmunógeno", tal como se utiliza en la presente memoria, indica una entidad que por sí misma no puede estimular la producción de anticuerpos pero puede hacerlo si se combina con un vehículo.

La expresión "sustitución conservadora", tal como se utiliza en la presente memoria indica el reemplazamiento de un resto de aminoácido por otro, resto biológicamente similar. Los ejemplos de sustituciones conservadoras, incluyen la sustitución de un resto hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un resto hidrófilo tal como arginina por lisina o viceversa, ácido glutámico por ácido aspártico y viceversa o glutamina por asparagina y viceversa y similares.

La expresión "corresponde sustancialmente", en sus varias formas gramaticales, tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a medios de secuencias peptídicas, una secuencia peptídica tal como se describe más o menos de hasta tres restos de aminoácidos en uno de las dos o ambos terminales amino y carboxi y que contiene solamente sustituciones conservadoras a lo largo de la secuencia polipeptídica.

La expresión "producto génico inmunoactivo", y sus variaciones gramaticales, tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, incluye proteínas y polipéptidos con actividad inmunomoduladora, tales como las proteínas y polipéptidos que interactúan con la actividad de los linfocitos T y de las células NK y la modulan.

La expresión "proteína de la familia IAP", tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, incluye cualquiera de las clases de antígenos naturales expresados en células tumorales, que inhiben la apoptosis en su forma natural. Las proteínas de la familia IAP incluyen, por ejemplo, survivina humana, IAP unida al cromosoma X humano (XIAP), TIAP murina (análogo murino de survivina), livina humana, c-IAP-1 humana, c-IAP-2 humana, NAIP humana, cualquier otra proteína que incluya por lo menos un inhibidor baculovírico del dominio con repetición (BIR) de apoptosis o un homólogo de las mismas. El dominio BIR está presente en todas las proteínas de la familia IAP naturales. Incluye cuatro hélices alfa relativamente cortas y una zona de estructura de la lámina beta antiparalela de tres cadenas. El dominio une el Zn utilizando tres restos de cisteína y un resto de histidina, que se conservan a través de las proteínas de la familia IAP. La expresión "proteína de la familia IAP", tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas incluye también variantes de proteínas IAP naturales, tales como las variantes de corte y empalme y las variantes de sustitución, y similares, así como fragmentos y homólogos inmunógenos de las mismas que se unen a una molécula de clase I (MHC) con histocompatibilidad mayor y son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos (es decir, epítopos de la proteína survivina).

La expresión "asociada al cáncer", tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, en referencia a las proteínas de la familia IAP significa una proteína de la familia IAP que se expresa en concentraciones elevadas en las células de cáncer que está en las células normales, no cancerosas. Los ejemplos de proteínas de la familia IAP asociadas al cáncer incluyen, sin limitación, survivina humana y livina humana.

La expresión "proteína survivina", tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas comprende la molécula survivina humana completa (SEC. ID. nº: 2), el análogo murino completo de la misma (es decir, TIAP, tal como se describe en la presente memoria), variantes de survivina humana o de survivina murina, tal como las variantes de corte y empalme y las variantes de sustitución, así como fragmentos (por ejemplo, epítopos) de survivina humana y homólogos inmunógenos de survivina humana que se unen a una molécula (MHC) de clase I, con histocompatibilidad mayor y son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos. Las variantes de sustitución conocidas de survivina humana comprenden una proteína con la sustitución T34A en la secuencia SEC. ID. nº: 2 de restos de aminoácidos, una proteína que tiene la sustitución D53A en la secuencia SEC. ID. nº: 2 de restos de aminoácidos y una proteína con la sustitución C84A en la secuencia SEC. ID. nº: 2 de restos de aminoácidos (véase Song et al., Mol. Biol. Cell, 2004; 15(3):1287-1296, Publicación E de 29 de diciembre de 2003). Cada una de estas variantes conocidas tiene actividad apoptósica, en contraste con la survivina natural que tiene actividad antiapoptósica.

En una forma de realización preferida, la vacuna de ADN de la presente invención comprende un montaje de ADN que codifica operativamente una proteína survivina tal como la survivina humana natural que tiene la secuencia SEC. ID. nº: 2 de restos de aminoácidos, un homólogo inmunógeno de la survivina humana natural que tiene una secuencia de restos de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la SEC. ID. nº: 2, una variante de corte y empalme de la survivina humana con la secuencia SEC. ID. nº: 23 de restos de aminoácidos, una variante de corte y empalme de la survivina humana con la secuencia SEC. ID. nº: 24 de restos de aminoácidos, y un fragmento de la proteína survivina que se une a la molécula MHC de clase I y es reconocida por linfocitos T citotóxicos.

La expresión "proteína livina", tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, comprende la variante de corte y empalme livina alfa humana completa (SEC. ID. nº: 27) la variante de corte y empalme de la livina beta humana (SEC. ID. nº: 29), las variantes de corte y empalme de livina alfa y beta humanas, así como los fragmentos y los homólogos inmunógenos de las mismas que se unen a una molécula MHC de clase I y son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos.

Tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, la expresión "homólogo inmunógeno" y sus variaciones gramaticales, cuando se utilizan en referencia a las proteínas de la familia IAP asociadas al cáncer, tales como survivina y livina, significa una proteína con un alto grado de homología para una proteína de la familia IAP natural asociada al cáncer y que puede unirse a una molécula MHC de clase I y puede ser reconocida por linfocitos T citotóxicos que son activos contra la correspondiente proteína natural de la familia IAP. Preferentemente los homólogos inmunógenos tienen una secuencia de restos de aminoácidos que por lo menos es aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de proteína de la familia IAP natural asociada al cáncer, más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% idéntica, aún más preferentemente por lo menos aproximadamente 95% idéntica.

Sin estar ligados por la teoría, se cree que la vacunación de un paciente, tal como un paciente humano, con una vacuna de la invención conduce a la presentación selectiva de antígenos derivados de la proteína de la familia IAP asociada al cáncer en la superficie de células inmunitarias, tales como las células presentadoras de antígeno, y además a la expresión selectiva del producto génico inmunoactivo en estas células. La presentación aumentada de la proteína de la familia IAP asociada al cáncer, tal como la proteína survivina o la proteína livina en la superficie celular de la célula presentadora de antígeno, en combinación con la expresión de un producto génico inmunoactivo, tal como una citocina o un ligando para un receptor de la superficie de la célula NK, conduce a una respuesta inmunitaria aumentada contra las células cancerosas que expresan proteínas de la familia IAP asociadas al cáncer, tales como la proteína survivina o la proteína livina. En personas adultas, la survivina se expresa casi exclusivamente en células cancerosas. Asimismo la expresión de livina, es supuestamente elevada en algunas estirpes de células de cáncer, particularmente en estirpes de células de melanoma.

En una forma de realización preferida, la vacuna de ADN comprende una secuencia polinucleotídica que codifica de manera operativa una proteína survivina y una citocina. Preferentemente, la proteína survivina es survivina humana, una survivina murina o un epítopo de las mismas. Preferentemente la citocina modula la actividad de los linfocitos T o de las células NK. Las citocinas preferidas incluyen quimiocinas, hematopoyetinas e interferones. Otras citocinas preferidas incluyen citocinas activadoras de células NK tales como IL-12 y factores estimulantes de producción de citocina tal como IL-17.

Las quimiocinas preferidas incluyen quimiocinas CC, particularmente aquellas que son ligandos para el receptor CCR7 de quimiocina, tal como CCL21 (SLC) y similares; quimiocinas C que son ligandos del receptor CR1, tal como linfotactina y similares; las quimiocinas CX_{3}C que son ligandos del receptor CX_{3}CR1, tal como la fractalcina y similares; quimiocinas CXC, específicamente las que son ligandos del receptor CXCR3, tal como IP-10 y similares. Aún más preferentemente la quimiocina es la CCL21 humana o el análogo murino de la misma (CCL21 murina).

Las hematopoyetinas preferidas incluyen los factores de crecimiento de linfocitos T tales como IL-2, IL-15 y similares. Los interferones preferidos incluyen los producidos por los linfocitos T y las células NK, tales como IFN-\gamma y similares. Otras citocinas preferidas incluyen las citocinas activadoras de células NK tales como IL-12 y similares, y las citocinas que inducen la producción de citocina en células tales como la de los epitelios, endotelios y fibroblastos, incluyendo IL-17 y similares.

En otra forma de realización preferida, la vacuna de ADN comprende una secuencia polinucleotídica que codifica de manera operativa una proteína survivina y un ligando para un receptor de la superficie de las células destructoras naturales. Preferentemente, la proteína survivina es la survivina humana, la survivina murina o un epítopo de la survivina humana. Preferentemente el ligando para un receptor de la superficie de las células destructoras natural es un ligando para el receptor de la superficie de las células NKG2D. Preferentemente el receptor de la superficie de las células NKG2D, es un antígeno (MIC) relacionado con la cadena de MHC de clase I tales como MICA y MICB, una proteína de fijación UL16 (ULBP) tales como ULBP1, ULBP2 y ULBP3 y similares. Los ligandos NKG2D murinos comprenden, por ejemplo, Rae1 y el péptido H60 del antígeno de histocompatibilidad menor. Aún más preferentemente, el ligando para el receptor de la superficie celular NKG2D es MICA o MICB.

Preferentemente, un montaje de ADN de la presente invención, que codifica de manera operativa una proteína y un producto génico inmunoactivo, survivina, está también unido de manera operativa a los elementos reguladores necesarios para la expresión génica, que son bien conocidos en la técnica.

Preferentemente, el montaje de ADN se incorpora de manera operativa, en un vector de expresión tal como el vector de expresión BUDCE4.1 disponible en Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA. Otros vectores de expresión adecuados, están disponibles en el mercado, por ejemplo, en BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA. Una vez incorporado en el vector de expresión, el montaje de ADN puede introducirse en un vector hospedador tal como un vector bacteriano vivo y atenuado transfectando la célula hospedadora con el vector de expresión para proporcionar una vacuna de la presente invención.

Los montajes de ADN comprenden preferentemente elementos reguladores necesarios para la expresión de los nucleótidos. Dichos elementos incluyen, por ejemplo, un activador, un codón de iniciación, un codón de terminación y una señal de poliadenilación. Además, se requieren con frecuencia potenciadores para la expresión de una secuencia que codifica una proteína diana inmunógena. Como es conocido en la técnica, estos elementos están preferentemente unidos de manera operativa a la secuencia que codifica la proteína deseada. Se seleccionan preferentemente elementos reguladores que son compatibles con la especie a la que van a administrarse.

Los codones de iniciación y los codones de terminación están incluidos preferentemente como parte de una secuencia nucleotídica que codifica a la proteína survivina y el polipéptido inmunomodulador es una vacuna genética de la presente invención. Los codones de iniciación y los codones de terminación deben estar, desde luego, en el marco con las secuencias de codificación para la proteína survivina y el polipéptido inmunomodulador.

Los activadores y las señales de poliadenilación incluidas en una vacuna de la presente invención se seleccionan preferentemente para que sean funcionales dentro de las células del paciente que va a ser inmunizado.

Los ejemplos de activadores útiles en las vacunas de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para seres humanos, incluyen pero no se limitan a los activadores del Virus 40 de Simio (SV40), al activador del virus del tumor de mama de ratón (MMTV), el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tal como el activador de la repetición terminal larga (LTR) del VIH, el virus de Moloney, citomegalovirus (CMV) tal como el activador precoz inmediato de CMV, el virus de Epstein-Barr Virus (EBV), el virus del sarcoma de Rous (RSV) así como activadores de genes humanos, tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de los músculos humanos y metaltioneína humana.

Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles en las vacunas de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para seres humanos, comprenden de manera no limitativa a las señales de poliadenilación de SV40 y a las señales de poliadenilación de LTR.

Además de los elementos reguladores necesarios para la expresión de ADN pueden incluirse también otros elementos en la molécula de ADN. Dichos elementos adicionales incluyen potenciadores. El potenciador puede ser, por ejemplo, actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina del músculo humano y potenciadores víricos tales como los de CMV, RSV y EBV.

Las secuencias reguladoras y los codones generalmente dependen de la especie. Para maximizar la producción de proteínas, las secuencias reguladoras y los codones se seleccionan para que sean eficaces en las especies que van a inmunizarse. Un experto en la materia puede producir fácilmente montajes de ADN que son funcionales en una especie de paciente dado.

Los montajes de ADN de las presentes vacunas pueden ser ADN "desnudos" como se define en Restifo et al. Gene Therapy 2000; 7:89-92, cuya exposición pertinente incorporada como referencia. Preferentemente, el ADN está incorporado de manera operativa en un vector. Los vectores de suministro útiles incluyen microcápsulas biodegradables, complejos inmunoestimulantes (ISCOM) o liposomas, y vectores vivos atenuados modificados genéticamente tales como virus o bacterias.

Los ejemplos de vectores bacterianos vivos atenuados adecuados incluyen Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, especies de Shigella, especies de Bacillus, especies de Lactobacillus, bacilo Calmette-Guerin (BCG), Escherichia coli, Vibrio cholerae, especies de Campylobacter, especies de Listeria, o cualquier otro vector bacteriano adecuado, como es conocido en la materia. Preferentemente el vector es un vector de Salmonella typhimurium vivo atenuado. Las Salmonella typhimurium vivas atenuadas preferidas incluyen las cepas AroA^{-} tal como SL7207, o las cepas AroA^{-} y dam^{-} doblemente atenuadas, tal como RE88. Las AroA^{-} y dam^{-} doblemente atenuadas Salmonella typhimurium son un vector particularmente preferido.

Los procedimientos de transformación de vectores bacterianos vivos con un montaje de ADN exógeno están bien descritos en la materia. Véase, por ejemplo, Joseph Sambrook y David W. Rusell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001) (Sambrook y Rusell).

Los vectores víricos preferidos incluyen bacteriófagos, herpes virus, adenovirus, virus de la poliomielitis, virus de la vacuna y virus de la viruela aviar. Los procedimientos de transformación del vector vírico con un montaje de ADN exógeno están también bien descritos en la técnica. Véase Sambrook y Rusell, anteriormente.

Los vectores liposómicos útiles son vesículas unilaminares o multilaminares, que tienen una parte de la membrana formada por material lipófilo y una parte acuosa interior. La parte acuosa se utiliza en la presente invención para contener el material polinucleotídico que va a suministrarse a la célula diana. Resulta generalmente preferido que el liposoma que forma los materiales que tienen un grupo catiónico, como por ejemplo un grupo amonio cuaternario, uno o más grupos lipófilos, como por ejemplo grupos alquilo saturados o insaturados, que tienen aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. Un grupo de materiales adecuados se describe en la solicitud de patente europea 0187702, y expuesto además en la patente US nº 6.228.844 de Wolff et al., cuyas descripciones pertinentes están incorporadas como referencia. Muchos otros compuestos lipídicos catiónicos adecuados que forman liposomas se describen en la bibliografía. Véase, por ejemplo, L. Stamatatos, et al., Biochemistry 1988; 27:3917-3925; y H. Eibl, et al., Biophysical Chemistry 1979; 10:261-271. Alternativamente, puede utilizarse una microesfera, tal como una microesfera biodegradable de poliactida-coglicolida. Un montaje de ácido nucleico está encapsulado o por el contrario acomplejado con el liposoma o la microesfera para suministrar el ácido nucleico a un tejido, como se conoce en la técnica.

Otros vectores útiles incluyen microesferas poliméricas que comprenden materiales poli(ortoéster) biodegradables, tal como se describe en Wang et al., Nat. Mater., 2004; 3(3):190-6. Epub 15 de febrero de 2004, cuyas descripciones aplicables se incorporan a la presente memoria como referencia.

Un aspecto del procedimiento de la presente invención implica administrar vacuna de ADN operativamente que codifica una proteína y un producto génico inmunorreactivo de survivina al tejido de un mamífero, como por ejemplo un ser humano. En algunas formas de realización preferidas, las vacunas de ADN se administran por vía bucal, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica o tópica. Preferentemente la vacuna de ADN se administra por vía bucal.

En un procedimiento preferido, una vacuna de ADN de la presente invención puede utilizarse para proporcionar inhibición a largo plazo del crecimiento del tumor en un paciente tratado por la vacuna. La vacuna de ADN comprende un montaje polinucleotídico de ADN que codifica operativamente una proteína survivina, un producto génico inmunoreactivo, como por ejemplo una citocina, o un ligando para un receptor de la superficie de las células NK y un vehículo farmacéuticamente aceptable de las mismas. La vacuna se administra a un mamífero que requiera inhibición de células crecimiento tumoral en una cantidad que es suficiente para provocar una respuesta inmunitaria para las células tumorales.

Preferentemente el mamífero tratado con una vacuna de la invención, es un ser humano. Un paciente que padece cáncer, tal como, carcinoma pulmonar o de colon, tumores de mama o tumores de próstata, y cánceres similares, puede beneficiarse de la inmunización mediante las vacunas de la presente invención.

Las vacunas de la presente invención preferentemente se formulan con vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agua, solución salina, dextrosa, glicerol y similares, así como combinaciones de los mismos. Las vacunas pueden contener también sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, tampones, conservantes, adyuvantes y similares.

Las vacunas de la presente invención, se administran preferentemente por vía bucal a un mamífero, tal como un ser humano, en forma de solución o suspensión, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, a una concentración de ADN comprendida en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 microgramos por mililitro. La dosis apropiada dependerá del paciente que va a ser vacunado, y en parte del criterio del especialista médico que administra o solicita la administración de la vacuna.

Las vacunas de la presente invención pueden estar envasadas en recipientes esterilizados de manera apropiada, como por ejemplo ampollas, botellas o viales, en forma de dosis múltiples o en dosis unitarias. Los recipientes están preferentemente herméticamente sellados después de rellenarse con una preparación de la vacuna. Preferentemente, las vacunas se envasan en un recipiente que tiene una etiqueta fijada al mismo, etiqueta que identifica la vacuna, y lleva una nota en la forma prescrita por la agencia gubernamental tal como la United States Food and Drug Administration que refleja la aprobación de la vacuna por leyes apropiadas, información de la dosis y similares. La etiqueta contiene preferentemente información acerca de la vacuna que es útil para un profesional en atención sanitaria que administra la vacuna a un paciente. El envase contiene además preferentemente materiales de información impresos en relación con la administración de la vacuna, instrucciones, indicaciones y algunas advertencias necesarias requeridas.

La secuencia de ADN de survivina humana y su correspondiente secuencia de la proteína han sido descritas por Strausberg en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., nº de registro de ADN BC034148, cuyas descripciones están incorporadas en la presente memoria como referencia. La secuencia de ADN y la correspondiente secuencia de la proteína de TIAP murina han sido descritas por Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1999; 96:1457-62; nº de registro de ADN AB01389 en la base de datos EMBL del Instituto Bioinformático Europeo, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas descripciones están incorporadas a la presente memoria como referencia.

La secuencia de ácido nucleico que codifica la survivina humana se presenta en la figura 1 (SEC. ID. nº: 1), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 2) se proporciona en la figura 2. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la survivina murina (es decir, TIAP) se presenta en la figura 3 (SEC. ID. nº: 3), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 4) se proporciona en la figura 4.

La homología de proteínas entre la survivina humana y su contrapartida murina, TIAP, se ilustra en la figura 5. Hay aproximadamente 83% de identidad de secuencia de restos de aminoácidos entre la survivina humana (SEC. ID. nº: 2) y la TIAP murina (SEC. ID. nº: 4) como se muestra en la figura 5.

Mahotka et al., han identificado dos variantes de corte y empalme de survivina humana, denominadas survivina-\DeltaEx3 y survivina-2B, que también son adecuadas para su utilización en la presente invención. Mahotka et al., Cancer Res., 1999; 59:6097-6102, cuyas descripciones pertinentes están incorporadas en la presente memoria como referencia. Las secuencia de restos de aminoácidos de survivina-2B (SEC. ID. nº: 23), y de la survivina-\DeltaEx3 (SEC. ID. nº: 24) se muestran en la figura 37. Hirohashi et al., han identificado un epítopo potente de linfocitos T de la survivina-2B que presenta la secuencia de restos de aminoácidos AYACNTSTL (SEC. ID. nº: 25), denominada survivina-2B80-88, que provoca una respuesta a linfocitos T citotóxicos contra la survivina-2B. Hirohashi et al., Clinical Cancer Res., 2002; 8:1731-39, cuyas descripciones pertinentes están incorporadas a la presente memoria como referencia. Este epítopo, es un fragmento de survivina que puede unirse a una molécula MHC de clase I y es reconocido por los linfocitos T citotóxicos, y es adecuado para su utilización en el componente de la proteína de la familia IAP de una vacuna de la presente invención.

Otra variante de corte y empalme de la survivina humana es la variante survivina-3B descrita por Badran et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004; 314(3):902-907. La secuencia polinucleotídica que codifica la survivina-3B y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos se describe en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., nº de registro de ADN AB154416, cuyas descripciones están incorporadas a la presente memoria como referencia.

La livina humana completa (conocida como la variante alfa) es una proteína de la familia IAP, que tiene un solo dominio BIR y que está constituida por 298 restos de aminoácidos. La secuencia de ADN y la correspondiente secuencia de la proteína de la variante alfa de livina humana han sido publicadas por Clark et al., en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., nº de registro de ADN NM 139317, cuyas exposiciones están incorporadas a la presente memoria como referencia. La secuencia de ADN y la correspondiente secuencia de la proteína de la variante beta de livina humana han sido publicadas por; nº de registro NM 022161 en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas a la presente memoria como referencia.

La secuencia de ácido nucleico que codifica la livina humana completa (variante alfa) se representa en la figura 39 (SEC. ID. nº: 26), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 27) se proporciona en la figura 40. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante beta de la livina humana se representa en la figura 41 (SEC. ID. nº: 28), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 29) se proporciona en la figura 42. La variante beta de la livina humana carece de los restos 216 a 233 de aminoácidos de la variante de corte y empalme de la livina alfa humana completa (SEC. ID. nº: 27). La variante beta es idéntica a la variante alfa de la livina humana desde todos los demás puntos de vista. El dominio BIR tanto de las variantes alfa como beta de la livina humana está en la zona desde el resto R90 de aminoácido hasta el resto L155 de aminoácido de las SEC. ID. nº: 27 y la SEC. ID. nº: 29.

En una forma de realización preferida, las vacunas de la presente invención se componen de montajes de ADN que codifican una o más proteínas de survivina, tal como la survivina humana, TIAP (survivina murina) y homólogos inmunógenos de las mismas. Los homólogos inmunógenos comparten preferentemente por lo menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de restos de aminoácidos con la survivina humana, más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de restos de aminoácidos, aún más preferentemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de restos de aminoácidos con la SEC. ID. nº: 2. Alternativamente, la vacuna puede comprender un montaje de ADN que codifica uno o más epítetos de linfocito T de la proteína survivina humana.

Debido a la degeneración intrínseca del código genético, las secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia o una secuencia de restos de aminoácidos funcionalmente equivalente a las proteínas naturales de la familia IAP asociadas al cáncer (es decir, naturales) tales como la survivina humana, la survivina murina y otras variantes de corte y empalme de la livina humana, pueden utilizarse en las vacunas de la invención. Dichas secuencias de ADN incluyen las que son capaces de hibridarse con las secuencias de ADN de la survivina natural, así como las variantes alélicas y similares. Preferentemente el ADN de los homólogos funcionalmente equivalentes, comparten por lo menos aproximadamente 70% de identidad de la secuencia de nucleótidos con el ADN que codifica las proteínas de la survivina natural mencionada anteriormente, más preferentemente por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de nucleótidos.

Los productos génicos inmunoactivos codificados por los montajes de ADN de las presentes vacunas son preferentemente citocinas o ligandos de receptores naturales de la superficie de la célula destructora. Particularmente las citocinas preferidas son las quimiocinas CC. Las quimiocinas CC particularmente útiles son ligandos para el receptor de la quimiocina CCR7. Los ligandos selectivos CCR7 incluyen CCL19 (conocido también como exodus-3, ELC, MIP-3\beta, CK\beta11) y CCL21 (conocido también como exodus-2, SLC, 6Ckine, TCA4 y CK\beta9). Las quimiocinas particularmente preferidas son CCL21 humana y su contrapartida murina 6Ckine/SLC (muCCL21) y las quimiocinas que corresponden sustancialmente a éstas.

Las secuencias de ADN y proteínas para SLC humano han sido publicadas por Nishimura et al., en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., nº de registro de ADN AB002409, cuyas exposiciones se incorporan en la presente memoria como referencia. La CCL21a murina, una variante de ADN de 6Ckine/SLC y las secuencias de la proteína han sido publicadas por Hromas et al., J. Immunol. 1997; 159(6):2554-2558, nº de registro NM011335 de ADN en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K, cuyas exposiciones se incorporan en la presente memoria como referencia. Se ha informado de la variante de CCL216 murina de ADN 6Ckine/SLC y las secuencias de proteína por Hedrick et al., J. Immunol. 1997; 159(4):1589-1593, nº de acceso de ADN NM011124 en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Welcome Trust Genome Campus,
Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK, y cuyas exposiciones se incorporan a la presente memoria como referencia.

La secuencia de ácido nucleico que codifica CCL21 humana (SLC) se presenta en la figura 6 (SEC. ID. nº: 5), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 6) se proporciona en la figura 7. La secuencia de ácido nucleico que codifica CCL21 murina (variante de CCL21b) se representa en la figura 8 (SEC. ID. nº: 7), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 8) se proporciona en la figura 9.

La homología de proteínas entre la CCL21 humana (SLC) y su contrapartida murina (6Ckine/SLC, CCL21b), se ilustra en la figura 10. Existe aproximadamente 73% de identidad de secuencia de restos de aminoácidos entre la CCL21 humana (SEC. ID. nº: 6) y la CCL21 murina (SEC. ID. nº: 8) como se muestra en la figura 10.

La secuencia de ácido nucleico que codifica la variatne de CCL21 de SLC murina se presenta en la figura 25 (SEC ID nº 11) y su secuencia amino correspondiente (SEC ID nº 12) está prevista en la figura 26.

Los ligandos preferidos para los receptores de la superficie de las células destructoras naturales son ligandos para el receptor murino de la superficie de NKG2D. Los ligandos preferidos para el receptor de la superficie NKG2D son MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 y similares. Aún más preferentemente MICA y MICB. Otros ligandos conocidos para los receptores de la superficie NKG2D incluyen Rea-1\beta murino y el péptido H60 del antígeno de histocompatibilidad menor murino.

El ADN del péptido del antígeno con histocompatibilidad menor H60 murino y las secuencias de proteínas han sido publicadas por Malarkannan et al., J. Immunol. 1998; 161(7):3501-3509, nº de registro de ADN AF084643, en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K, cuyas exposiciones están incorporadas en la presente memoria como referencia. Una secuencia parcial de ácido nucleico que codifica el péptido murino con antígeno de histocompatibilidad menor H60 se presenta en la figura 11 (SEC. ID. nº: 9) y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos parcial (SEC. ID. nº: 10) se proporciona en la figura 12.

Las secuencias de ADN y proteínas para MICA humana han sido publicadas por Zwirner et al., nº de registro de ADN AY204547, en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas en la presente memoria como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica la MICA humana se presenta en la figura 27 (SEC. ID. nº: 13), y su correspondiente secuencia de restos aminoácidos (SEC. ID. nº: 14) se proporciona en la figura 28.

Las secuencias de ADN y proteínas para MICB humana han sido publicadas por Bahram et al., Immunogenetics 1996; 45(2):161-162, nº de registro de ADN U65416 en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas en la presente memoria como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica la MICB humana se presenta en la figura 29 (SEC. ID. nº: 15), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 16) se proporciona en la figura 30. Variantes alélicas de MICB se describen en el nº de registro NP 005922 del GENBANK, incorporadas en la presente memoria como referencia. La figura 38 es una reproducción de la entrada para el nº de registro NP 005922.

Las secuencias de ADN y proteínas para la ULBP1 humana han sido publicadas por Cosman et al., Immunity 2001; 14(2):123-133, nº de registro de ADN AF304377 en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas en la presente memoria como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica la ULBP1 humana se presenta en la figura 31 (SEC. ID. nº: 17), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 18) se proporciona en la figura 32.

Las secuencias de ADN y proteínas para la ULBP2 humana han sido publicadas por Cosman et al., Immunity 2001; 14(2):123-133, nº de registro de ADN AF304378 en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas en la presente memoria como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica la ULBP2 humana se presenta en la figura 33 (SEC. ID. nº: 19), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 20) se proporciona en la figura 34.

Las secuencias de ADN y proteínas para la ULBP3 humana han sido publicadas por Cosman et al., Immunity 2001; 14(2):123-133, nº de registro de ADN AF304379 en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas en la presente memoria como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica la ULBP3 humana se presenta en la figura 35 (SEC. ID. nº: 21), y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 22) se proporciona en la figura 36.

Los ligandos particularmente preferidos para el receptor de la superficie de las células destructoras naturales comprenden ligandos para el receptor NKG2D tales como MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 y equivalentes funcionales de las mismas. Los equivalentes funcionales comparten preferentemente por lo menos aproximadamente el 80% de identidad de la secuencia de restos de aminoácidos con los polipéptidos inmunomoduladores mencionados anteriormente, más preferentemente por lo menos aproximadamente el 95% de identidad de la secuencia de restos de aminoácidos.

Debido a la degeneración intrínseca del código genético, las secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia o una secuencia de restos de aminoácidos funcionalmente equivalente a los productos génicos inmunoactivos naturales útiles tales como CCL21, CCL21 murina, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 y y materiales similares equivalentes que corresponden sustancialmente a éstas pueden utilizarse en la vacunas de la invención. Dichas secuencias de ADN incluyen las que son capaces de hibridarse con las secuencias de ADN polipeptídico inmunomodulador, así como las variantes alélicas y similares. Preferentemente el ADN de los homólogos funcionalmente equivalentes, comparten por lo menos aproximadamente 70% de identidad de la secuencia de nucleótidos con el ADN que codifica los polipéptidos inmunomoduladores naturales mencionados anteriormente.

Las secuencias de ADN alteradas que pueden utilizarse según la invención incluyen eliminaciones, adiciones o sustituciones de diferentes restos nucleotídicos en la secuencia natural del polinucleótido que codifica una proteína de la familia IAP asociada al cáncer natural que resulta en una secuencia que codifica la proteína natural o un homólogo inmunógeno de la misma. Las secuencias de ADN alteradas que pueden utilizarse según la invención pueden incluir además eliminaciones, adiciones, o sustituciones de diferentes restos de nucleótidos en el polinucleótido natural que codifica un producto génico inmunogénico que da como resultado una secuencia que codifica el producto génico inmunoreactivo natural o un equivalente funcional del mismo. Funcionalmente el producto génico inmunoactivo equivalente puede contener eliminaciones, adiciones, o sustituciones de restos de aminoácidos con una citocina natural o ligando el receptor de la superficie de las células NK que da como resultado un cambio imperceptible produciendo de este modo una molécula funcionalmente equivalente. Dichas sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservadoras) pueden hacerse basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos principales polares sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen los siguientes, lisina, leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Tal como se utiliza en la presente invención, un producto génico inmunoactivo funcionalmente equivalente tal como citocina o el ligando receptor de la superficie de las células NK se refiere a un polipéptido que tiene sustancialmente la misma actividad inmunomoduladora que su contrapartida el producto génico inmunoactivo natural.

Las secuencias de ADN que codifican operativamente la proteína survivina y los productos génicos inmunoreactivos útiles en las vacunas de la invención, pueden ser modificadas para alterar las secuencias de codificación con varios fines incluyendo, pero sin limitarse a, alteraciones que modifican el tratamiento y la expresión del producto génico. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones, utilizando técnicas que son bien conocidas en la materia, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio para insertar nuevas áreas de restricción para alterar los modelos de glucosidación, fosforilación y similares.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de vacunación de un mamífero contra el cáncer. El procedimiento comprende administrar al mamífero una vacuna de la presente invención, tal como se describe en la presente memoria, en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra las células de cáncer. Preferentemente el mamífero es un ser humano.

En otro aspecto, la presente invención comprende también células operadoras transformadas, que han sido transfectadas con un vector que comprende un montaje de ADN que codifica un inhibidor de la proteína de la familia Apoptisis y un producto génico inmunoactivo tal como se describe en la presente memoria. La célula hospedadora puede ser una célula procariótica o una célula eucariótica.

La presente invención proporciona también vectores de plásmido aislados que comprenden un montaje de ADN que codifica operativamente un inhibidor de la proteína de la familia Apoptisis y un producto génico inmunoreactivo. Los vectores son útiles para transfectar células hospedadoras como, tales como las células bacterianas adecuadas, para preparar las vacunas de la invención.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar con mayor detalle las características y formas de realización de la presente invención, y no significa que sean limitativas.

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Materiales, procedimientos y ejemplos

Materiales. Se obtuvieron ratones C57/BL/6J y Balb/C en la instalación de apareamiento del Scripps Research Institute. El ADN que codifica TIAP (forma murina de survivina) fue clonada por PCR a partir de ADNc MC3P. El ADN que codifica la 6Ckine murina (CCL21 murina) se clonó en esplenocitos. El ADN que codifica el péptido del antígeno de histocompatibilidad menor H60 (forma murina de MICA y MICB) fue proporcionado gentilmente por el Dr. Davis H. Ranlet de la University of California (Berkley). El ADN para la vacuna que codifica la CCL21 murina (muCCL21, conocido también como 6Ckine/SLC) y survivina murina (muSurvivina, conocida también como TIAP) se clonó en vectores de expresión eucariótica pBudCE4.1 de Invitrogen, Inc., utilizando las secuencias de restricción HindIII y BamHI para muCCL21 y utilizando XhoI para ambos extremos muSurvivina. El ADN para la vacuna que codifica H60 TIAP se clonó en los vectores de expresión eucarióticos pBudCE41 de Invitrogen, Inc., utilizando las secuencias de restricción Hind y BamHI para muCCL21, y utilizando XhoI para ambos extremos de muSurvivina. El ADN para la vacuna que codifica H60 TIAP se clonó en los vectores de expresión eucarióticos pBudCE4.1 de Invitrogen, Inc., utilizando las secuencias de restricción HindIII y XbaI para H60 y para muSurvivina, utilizando las secuencias de restricción KpnI y Xhol. Una cepa AroA^{-} atenuada de Salmonella typhimurium (SL2707) y una cepa de AroA^{-}, dam^{-} doblemente atenuada de Salmonella typhimurium (RE88) se adquirieron en Remedyne, Santa Barbara, CA. Se adquirieron anticuerpos en BD Biosciences, Bedford, MA. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) y R-ficoeritrina (PE) se adquirieron en Molecular Probes, Eugene, OR. Se prepararon anticuerpos marcados de FITC y marcados de PE según los protocolos fabricados recomendados.

Parte A. Vacunas de Salmonella tiphymurium atenuada AroA^{-} transformada

Ejemplo 1 Preparación de una vacuna de ADN que codifica a muSurvivina y muCCL21

El vector pBudCE4.1 que contiene ADN de muSurvivina y muCCL21 (aproximadamente 1 a 10 \mug de ADNp) se electroporó en Salmonella tiphymurium (SL2707) atenuada, recién preparada, utilizando un Pulser de Bio-Rad a 2,5 kV, 25 \muF y 200 ohmios según los procedimientos recomendados por el fabricante. Se seleccionó Salmonella que contiene el vector en placas que contienen zeocina. Se seleccionaron las colonias al día siguiente y se cultivaron durante la noche en caldo de cultivo LB (EM Science, Gibbstown, NJ) con zeocina añadida. Se aislaron las bacterias y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las bacterias lavadas se pusieron en suspensión a continuación en medio PBS a una concentración aproximadamente 1 x 10^{9} de Salmonella recombinante por mililitro de PBS, para formar una solución de la vacuna para uso posterior.

Se prepararon también según el mismo procedimiento vacunas de referencia que constan de Salmonella transformada con el vector solo, un vector que incorpora solamente ADN con muSurvivina, y un vector que incorpora solamente ADN con muCCL21. La figura 13 proporciona una representación esquemática de los montajes de expresión.

Las vacunas se almacenaron en ampollas selladas hasta ser utilizadas. El ADN plásmido se almacenó a aproximadamente -80ºC antes de transformar la Salmonella.

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Ejemplo 2 Vacunación de ratones con las vacunas de ADN del Ejemplo 1

Se vacunaron ratones Balb/C (aproximadamente 8 ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del Ejemplo 1 (aproximadamente 1 x 10^{8} de Salmonella recombinante en aproximadamente 100 \mul de PBS) por sonda bucal 3 veces en intervalos de 2 semanas.

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Ejemplo 3 Evaluación de la resistencia del tumor de ratones vacunados

Aproximadamente 1 semana después de la última vacunación los ratones de Balb/C del Ejemplo 2 (aproximadamente 8 ratones por grupo de tratamiento) se sometieron a la prueba de provocación con aproximadamente 1 x 10^{5} células de carcinoma de pulmón D121 Lewis (por vía subcutánea). Los tumores subcutáneos de pulmón de Lewis se extrajeron quirúrgicamente después de aproximadamente 2 semanas de crecimiento para permitir la diseminación espontánea al pulmón. Se midió el crecimiento del tumor subcutáneo en dos dimensiones cada dos días, y se calculó el volumen del tumor según la fórmula:

volumen = (anchura ^{2})(longitud \textdiv 2)

para cada tumor. La cantidad de metástasis espontánea de D121 en los pulmones se evaluó aproximadamente 24 a 28 días después de la eliminación del tumor primario subcutáneo. Se sacrificaron los ratones, se les practicó la necropsia, y se evaluaron las cargas del tumor de los pulmones según el porcentaje de la superficie pulmonar que estaba cubierta por el tumor y se puntuó "0" para carencia de tumor, "1" para inferior aproximadamente 20% de espacio del tumor, "2" para aproximadamente 20 a 30% de espacio del tumor, y "3" para un espacio del tumor superior para aproximadamente un 50%.

Las puntuaciones de la carga del tumor para los ratones vacunados con las vacunas del Ejemplo 1 se proporcionan en la Tabla 1. La figura 14, presenta fotografías de los pulmones de los ratones vacunados con las vacunas del Ejemplo 1. Los volúmenes del tumor se publican en la Tabla 1 y en la figura 14. En la figura 14, la barra A representa el volumen medio del tumor pulmonar (en milímetros cúbicos) para los ratones vacunados con la vacuna con muSurvivina/muCCL21 de la invención; la barra B representa el volumen medio del tumor para los ratones vacunados con la vacuna que incorporaba solamente ADN con muSurvivina; la barra C representa el volumen medio del tumor para los ratones vacunados con la vacuna que incorporaba solamente ADN con muCCL21; la barra D representa el volumen medio del tumor para los ratones vacunados con la vacuna que incorporaba solamente el vector vacío; y la barra E representa el volumen medio del tumor para los ratones vacunados con tampón PBS. La figura 14 incluye además fotografías de los pulmones extirpados representativos de cada grupo de tratamiento, representado a continuación cada uno de sus respectivas barras en la figura 14.

TABLA 1 Metástasis del tumor en ratones Balb/C sometidos a la prueba de provocación con células de carcinoma pulmonar de Lewis D121

1

Los resultados proporcionados en la Tabla 1 y en la figura 14 (diagramas A y B) demuestran que la vacuna de ADN que comprende un montaje de ADN que codifica una proteína de la familia IAP (es decir, muSurvivina) y un producto génico inmunoactivo (es decir, muCCL21) pueden inmunizar eficazmente ratones contra metástasis de tumor pulmonar y el crecimiento inhibido de tumores pulmonares.

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Ejemplo 4 Citotoxicidad mediada por linfocitos T contra células D121 de cáncer de pulmón inducida por la vacuna de ADN de la invención

Se vacunaron ratones C5/7BL/6J (aproximadamente 8 ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del Ejemplo 1 tal como se describe en el Ejemplo 2. Se aislaron esplenocitos aproximadamente 4 días después de la vacunación y se analizó su actividad lítica en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4 horas, tal como se describe en Current Protocols Immunology en 3.11.4, Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1994). Se utilizaron células D121 como células diana para los esplenocitos.

La figura 15 ilustra gráficamente la citotoxicidad mediada por linfocitos T contra células D121 de cáncer pulmonar producidas por las vacunas de ADN de la invención. Los puntos de los datos representados por los círculos en blanco representan los datos de los ensayos de inhibición en los que las células se trataron con 50 \mug/ml de anticuerpos contra antígenos MHC de clase I H-2K^{b}/H-2D^{b} (clon SF1-1.1; 34-2-12 IgG2a, \kappa) y los cuadrados en negro representan datos sin anticuerpos inhibidores. El porcentaje de lisis de las células tumorales (eje Y) está representado por tres células efectoras diferentes para las relaciones (E/T) de la célula diana para cada grupo de vacunación (es decir, E/T de 100:1 para el primer punto de datos; de 50:1 para el segundo punto de datos; y de 25:1 para el tercer punto de datos). Los resultados demuestran que la vacuna de muSurvivina/muCCL21 de la invención (etiquetada SLC/TIAP) produjo un aumento de casi 5 veces de la lisis a la relación E/T 100:1 en comparación con las vacunas de referencia que contienen PBS, vector vacío y ADN con muCCL21, y un aumento de aproximadamente el doble sobre la vacuna de referencia que comprende ADN con muSurvivina solo.

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Ejemplo 5 Regulación por incremento de los marcadores de activación CD25, CD69 y CD28 en esplenocitos (linfocitos T CD8+) de ratones vacunados

Se vacunaron ratones C5/7BL/6J (aproximadamente 4 ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del Ejemplo 1 tal como se describió en el Ejemplo 2. Se aislaron esplenocitos de los ratones inmunizados y el grupo de ratones de referencia aproximadamente 1 semana después de la última vacunación. Las células se tiñeron a continuación con anticuerpo CD8+ conjugado con FITC y anticuerpos conjugados con PE de CD25, CD69 y CD28. Se evaluaron las suspensiones celulares utilizando un citómetro de flujo de dos colores Becton Dickenson FAC scan para determinar el porcentaje de linfocitos T CD8+ positivos para CD25, CD69 y CD28 para cada esplenocito. Los resultados se presentan en la figura 16. El valor numérico en el cuadrante derecho superior en cada representación FACS indica el porcentaje de células presentaban tanto a antígeno CD8+ así como de CD25, CD28 o CD69, como puede darse el caso. Los resultados numéricos se presentan en la Tabla 2. Estos resultados demuestran la expresión aumentada del marcador de linfocitos T con la vacuna de la presente invención, lo que indica aumento de activación de linfocitos T.

TABLA 2 Regulación por incremento de los marcadores de activación de CD25, CD69 y CD28, en los esplenocitos de ratones vacunados

2

Los datos de la Tabla 2 y de la figura 16 demuestran que la vacuna de la invención del Ejemplo 1, que comprende un montaje de ADN que codifica la muSurvivina y muCCL21 conducen a la expresión regulada por incremento de las moléculas de activación de linfocitos T.

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Ejemplo 6 Expresión aumentada de las moléculas coestimuladoras en dendrocitos en ratones vacunados

Se vacunaron ratones C5/7BL/6J (aproximadamente 4 ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del Ejemplo 1 tal como se describe en el Ejemplo 2. Se aislaron esplenocitos de los ratones inmunizados y del grupo del ratón de referencia aproximadamente 1 semana después de la última vacunación. Las células se tiñeron a continuación con anticuerpo CD11c conjugado con FITC en combinación con anticuerpos conjugados con PE de moléculas coestimuladoras B7 (CD80), ICAM-1 y DEC205. Se evaluaron las suspensiones celulares utilizando un citómetro de flujo de dos colores Becton Dickenson FAC scan. La figura 17 ilustra gráficamente los valores medios de fluorescencia para las células que presentan aumento de expresión de ICAM-1 (parte superior), CD80 (medio) y DEC205 (parte inferior) para esplenocitos aislados de ratones vacunados con la vacuna muSurvivina/muCCL21 de la invención, en comparación con las vacunas de referencia.

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Ejemplo 7 Provocación de liberación de citocina intracelular

Se sometieron ratones inmunizados a una prueba de provocación como en el ejemplo 2 (8 ratones por grupo de tratamiento) con células de cáncer de pulmón D121 como en el Ejemplo 3. Se recogieron esplenocitos de cada ratón aproximadamente una semana después de la prueba de provocación de la célula tumoral. Los esplenocitos se tiñeron con anticuerpo CD-3 con FITC y a continuación se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron posteriormente con anticuerpo anti-IFN-\gamma conjugado con PE. Las células teñidas de dos colores se analizaron por citometría de flujo FACS. Los resultados se ilustran en la figura 18. Se fijaron las células utilizando un kit iniciador de tinción intracelular de BD Pharmingen, La Jolla, CA.

Los resultados representados en la figura 18 demuestran que el porcentaje de células que liberan la citocina IFN-\gamma aumentaron hasta aproximadamente 3,17% para los esplenocitos aislados de los ratones vacunados con una vacuna de la invención, en comparación a solamente 0,41% para los ratones que reciben la vacuna de referencia con PBS, aproximadamente 0,38% para los ratones que reciben la vacuna de referencia con vector vacío, aproximadamente 0,96% para los ratones que reciben la vacuna de referencia SLC y aproximadamente 1,53% para los ratones que reciben la vacuna de referencia con muSurvivina.

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Ejemplo 8 Aumento de apoptosis de células de cáncer de pulmón en ratones vacunados

Ratones inmunizados como en el Ejemplo 2 (8 ratones por grupo) se sometieron a la prueba de provocación con células D121 de cáncer de pulmón como en el Ejemplo 3. Se recolectaron esplenocitos de cada ratón aproximadamente una semana después de la prueba de provocación de la célula tumoral. Los esplenocitos se incubaron con células D121 de tumor a una temperatura de aproximadamente 37ºC, durante aproximadamente 3 horas. Se aislaron a continuación las células tumorales y se analizaron por FACS. Se utilizó anexina V-FITC para cuantificar el porcentaje de células en la población que experimentan activamente apoptosis. Se utilizó yoduro de propidio (PI) para distinguir las células viables de las inviables utilizando un kit de detección de apoptosis disponible en BD Pharmingen, La Jolla, CA.

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La figura 19 ilustra gráficamente los resultados del análisis FACS evaluados después de aproximadamente 3 horas (serie superior de representaciones) y después de aproximadamente 24 horas (serie inferior de representaciones). El número en el cuadrante derecho inferior de cada representación representa el porcentaje de células que experimentan apoptosis para cada grupo de tratamiento. Después de 3 horas, aproximadamente 5,39% de las células D121 intactas (es decir, sin exposición a los esplenocitos) había experimentado apoptosis. Aproximadamente 2,28% de las células D121 incubadas con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de referencia que contiene solamente tampón PBS había experimentado apoptosis. Solo aproximadamente 5,19% de las células D121 incubadas con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de referencia que comprende el ADN del vector vacío había experimentado apoptosis. De modo similar, aproximadamente 5,15% de las células D121 experimentaron apoptosis cuando se incubaron con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de referencia que contiene el ADN con mUCCL21 solo; mientras que aproximadamente 11,46% de las células D121 experimentaron apoptosis cuando se incubaron con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de referencia que comprende el ADN con muSurvivina solo. Sorprendentemente después de 3 horas aproximadamente 18,44% de las células D121 habían experimentado apoptosis cuando se incubaron con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de la invención que comprende tanto ADN con muCCL21 como con muSurvivina.

Asimismo después de 24 horas, en un análisis FACS controlado (controlado para las células que experimentan apoptosis), ninguna de las células D121 íntegras (es decir, sin exposición a esplenocitos), había experimentado apoptosis. Aproximadamente 8,46% de las células D121 incubadas con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de referencia que contiene solamente tampón PBS había experimentado apoptosis. Sólo aproximadamente 4,78% de las células D121 incubadas con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de referencia que comprende el ADN del vector vacío habían experimentado apoptosis. Sorprendentemente después de 24 horas, aproximadamente 59,2% de las células D121 había experimentado apoptosis cuando se incubaron con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de la invención que comprende ADN tanto con muCCL21 como con muSurvivina.

Ejemplo 9 Preparación de una vacuna de ADN que codifica TIAP y el péptido del antígeno de histocompatibilidad menor H60 murino

El vector pBudCE4.1 que contiene TIAP y el ADN del antígeno de histocompatibilidad menor H60 murino (aproximadamente 1 \mug de ADNp) se electroporó en Salmonella typhimurium (SL2707) atenuada recién preparada, utilizando un pulsador de Bio-Rad a 2,0 kV, 25 \muF y 100 ohmios según los procedimientos recomendados por el fabricante. La figura 20 proporciona un diagrama esquemático de los vectores de expresión para H60 y muSurvivina incorporados en el vector.

Se seleccionaron las Salmonella que contenían el vector en placas que contenían zeocina. Se eligieron las colonias al día siguiente y se cultivaron durante la noche en caldo de cultivo LB (EM Science, Gibbstown, NJ) con zeocina añadida. Se aislaron las bacterias y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las bacterias lavadas se pusieron en suspensión a continuación en medio PBS a una concentración de aproximadamente 5 x 10^{9} de Salmonella recombinante por mililitro de PBS, para formar una solución de vacuna para uso posterior.

Las vacunas de referencia consistentes en Salmonella transformada con el vector solo, un vector que incorpora solamente ADN de muSurvivina, y un vector que incorpora solamente ADN del antígeno de histocompatibilidad menor H60 (H60) se prepararon también según el mismo procedimiento.

Se almacenaron las vacunas en ampollas selladas hasta su utilización. El ADN plásmido se almacenó a aproximadamente -20ºC antes de transformar la Salmonella.

Ejemplo 10 Vacunación de ratones con vacunas de ADN del Ejemplo 9

Se vacunaron ratones Balb/C (aproximadamente 8 ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del ejemplo 9 (aproximadamente 5 x 10^{8} de Salmonella recombinante en aproximadamente 100 \mul de PBS) por sonda bucal, tres veces a intervalos dos semanas.

Ejemplo 11 Ensayos de citotoxicidad de esplenocitos aislados procedentes de vacunas de ADN de ratones vacunados del Ejemplo 10

Se aislaron esplenocitos procedentes de los ratones vacunados en el Ejemplo 10, y se estimularon con células CT-26 irradiadas. Después de 5 días se recolectaron los esplenocitos y se realizaron ensayos citotóxicos contra células CT-26 y células Yac-1 (linfocitos T sensibles a NK) en dianas. Se determinó el grado de lisis específica de la célula a las relaciones E/T de 25:1, 50:1 y 100:1 por un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4 horas, tal como se describe en Current Protocols in Immunology en 3.11.4, Coligan, et al.; editores, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Los resultados están ilustrados gráficamente en la figura 21.

Los resultados indican que los esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de la presente invención que contiene ADN de muSurvivina y H60 presentaban unos aumentos del doble o mayores en la lisis de las células CT-26 de cáncer colorrectal comparadas con los esplenocitos aislados de ratones vacunados con el vector vacío, H60 y vacunas de referencia de muSurvivina en la relación E/T 100:1. Se observó muy poca lisis de Yac-1 para todas las vacunas en todas las relaciones E/T, lo que indica que la destrucción observada estaba mediada probablemente por linfocitos T.

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Ejemplo 12 Evaluación de la resistencia del tumor de ratones vacunados

Aproximadamente 2 semanas después de la tercera vacunación, los ratones Balb/C del ejemplo 10 (aproximadamente 8 ratones por tratamiento) se sometieron a la prueba de provocación con aproximadamente 1 x 10^{5} células CT-26 murinas de cáncer colorrectal (por vía intravenosa; i.v.).

Se evaluó la cantidad de metástasis espontánea de las células CT-26 en los pulmones aproximadamente 25 días después de la prueba de provocación i.v. con células CT-26. Se sacrificaron los ratones, se les practicó la necropsia y se evaluaron las cargas del tumor de los pulmones registrando el peso medio de los pulmones de cada grupo. Un peso de pulmón normal es de aproximadamente 0,2 gramos. La figura 22 ilustra los pulmones típicos (parte superior) extraídos de los ratones vacunados, sometidos a prueba de provocación con CT-26. La figura 22 incluye también un gráfico (parte inferior) del peso medio del pulmón para cada grupo de tratamiento. Se observó una disminución drástica en la carga del tumor en los ratones vacunados con la vacuna H60/muSurvivina de la invención en comparación con las vacunas de referencia.

La figura 23 incluye un gráfico de porcentaje de ratones que sobreviven después de 26 días en cada grupo de tratamiento. Se observó un aumento significativo de la supervivencia en los ratones vacunados con la vacuna H60/muSurvivina de la invención en comparación con las vacunas de referencia.

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Ejemplo 13 Evaluación de la expresión de H60 y muSurvivina en células 293T

La figura 24A ilustra la expresión de H60. Se transfectaron células 293T con el vector vacío (V) o pH60 (H) durante 24 horas, se recolectaron y se tiñeron con el tetrámero NKG2D y se analizaron por citometría de flujo. La eficacia de la transfección fue de aproximadamente el 45% evaluada por transfección con pGFP (proteína verde fluorescente). La figura 24B ilustra la expresión de muSurvivina. Se transfectaron células 293T con el vector vacío o pmuSurvivina durante 24 horas, se recolectaron, se lisaron y analizaron por inmunotransferencia Western. La inmunotransferencia Western indica que muSurvivina es detectable en las células transfectadas, pero no en las células naturales.

Parte B. Vacunas de Salmonella typhimurium doblemente atenuada AroA^{-}, dam^{-} transformadas

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Ejemplo 14 Preparación de una vacuna de ADN que codifica a muSurvivina y muCCL21

Las zonas codificadoras completas para la survivina murina (muSurvivina) y CCL21 murina (muCCL21) se ampliaron por reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa utilizando 1 \mug del ARN completo extraído de células D121 de carcinoma de pulmón de Lewis de ratón y esplenocitos de ratón activados respectivamente. El ARN completo se extrajo con el RNEASY® Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) y se llevó a cabo la RT-PCR con un sistema thermoscript RT-PCR cuantitativo de una etapa de platino (Gibco/BRL) según las instrucciones del fabricante. Se realizaron varios montajes basándose en el vector pBudCE4.1 (Invitrogen), utilizando los productos de la PCR diseñados para la expresión independiente de dos genes de un solo plásmido en vectores de expresión de mamífero. El primer montaje muSurvivina/muCCL21 que comprende la survivina murina completa y CCL21 murina, se insertó en el punto A de multiclonación entre las secuencias de restricción HindIII y BamHI. Se generó la muCCL21 de quimiocina insertando el gen en el punto B de la multiclonación entre las secuencias de restricción XhoI y NotI, respectivamente. Los demás vectores utilizados para la vacunación con ADN estaban basados en la primera construcción más bien que en la ausencia de muCCL21 o muSurvivina. El vector vacío se generó como referencia.

La expresión proteica de muSurvivina y muCCL21 se demostró por inmunotransferencia Western de lisados celulares después de la transfección de los plásmidos en células COS-7 utilizando los anticuerpos anti-survivina y anti-CCL21, respectivamente. La expresión de la actividad de EGFP en parches de Peyer de ratones C57/BL/6J, se detectó en los ratones tras la administración bucal de Salmonella typhimurium (cepa RE88 de AroA^{-}, dam^{-}) transformada con pEGFP. Se sacrificaron los ratones en los puntos de tiempo de 8, 16 y 36 horas y se extrajeron muestras recientes de intestino delgado para análisis después de lavado intenso con PBS. La expresión de fluorescencia de EGFP se detectó con microscopia colfocal.

Se evaluaron posibles toxicidades causadas en el hospedador por las bacterias atenuadas comparando la cepa RE88 AroA^{-}, dam^{-}, doblemente atenuada, con la cepa aislada SL2707 AroA^{-} atenuada. La utilización de la cepa RE88 dio como resultado la supervivencia de los 16 ratones sin efectos secundarios tóxicos obvios, mientras que 2 de los 16 ratones inmunizados con la cepa SL2707 murieron por toxicidad e infección. De este modo, la mutación dam^{-} de la cepa RE88, que controla la virulencia bacteriana, produjo aparentemente esta cepa particularmente útil en el vehículo de la vacuna de ADN.

Ejemplo 15 Vacunación bucal y prueba de provocación en el tumor de ratones con una vacuna del Ejemplo 14

Los ratones C57/BL/6J se dividieron en cinco grupos y se inmunizaron 3 veces a intervalos de 2 semanas por sonda nasogástrica con aproximadamente 100 \mul de PBS que contenía aproximadamente 1 x 10^{8} de S. typhimurium doblemente atenuada (RE88) que alberga uno de los siguientes: vector pBUd vacío; vectores de expresión individual de pBud-muSurvivina/muCCL21, pBud-muSurvivina o pBud-muCCL21 junto con grupos de tratamiento de PBS. Todos los ratones en los tratamientos profilácticos se sometieron a la prueba de provocación mediante inyecciones i.v. de aproximadamente 1 x 10^{5} células D121 de carcinoma de pulmón de Lewis murino aproximadamente 1 semana después de la última inmunización. En escenarios terapéuticos se inyectaron por vía i.v. los ratones en primer lugar con aproximadamente 1 x 10^{5} células D121 de carcinoma pulmonar de Lewis murino y 1 semana después se sometieron a 3 vacunaciones con la S. typhimurium transformada. Se examinaron los ratones diariamente, se sacrificaron y se examinaron las metástasis pulmonares aproximadamente 28 días después de la prueba de provocación con la célula tumoral en el escenario profiláctico o 63 días después de la inoculación de la célula tumoral inicial en el modelo terapéutico.

Las puntuaciones de la metástasis pulmonar después de la inmunización con vacunas de PBS, el vector vacío, CCL21, survivina o CCL21/survivina respectivamente, para tratamiento profiláctico con las vacunas se presentan en la Tabla 3. Los resultados en la Tabla 3, se muestran como puntuaciones de metástasis expresadas como % de la superficie pulmonar cubierta por los focos metastásicos fusionados: 0 = nada, 1 = inferior al 5%; 2 = 5-50%; y 3 \geq 50%. Las diferencias en las puntuaciones de las metástasis entre grupos de ratones tratados con la vacuna CCL21/survivina y todos los grupos de referencia eran estadísticamente significativos (P \leq 0,001). La inhibición del crecimiento del tumor se observó también en este modelo terapéutico.

TABLA 3 Metástasis tumoral en ratones Balb/C sometidos a prueba de provocación con células D121 de carcinoma de pulmón de Lewis tras la vacunación

3

En este escenario profiláctico los autores se observó la supresión decisiva de metástasis pulmonares diseminadas de carcinoma D121 murino de pulmón de Lewis en los ratones vacunados 3 veces a intervalos de 2 semanas y sometidos a continuación prueba de provocación 1 semana después por inyección i.v. de células tumorales. De hecho, 6 de cada 8 ratones rechazaron completamente todas las metástasis de tumor pulmonar mientras que los restantes animales pusieron de manifiesto un notable incremento de supresión de las metástasis tumorales (ver la Tabla 3) En cambio, la vacuna de ADN a base de survivina que carece de la supresión de metástasis completa producida por muCCL21 en solamente uno de cada 8 animales, dos presentaron menos del 5% del crecimiento de tumor metastásico, mientras que todos los ratones restantes presentaban crecimiento del tumor metastásico extenso. Animales adicionales que fueron tratados solamente con vacunaciones de referencia de PBS o del vector vacío no presentaban ninguna protección al tumor en absoluto y murieron 4 semanas después de la prueba de provocación de la célula tumoral debido a la metástasis extendida. Aunque la inmunización con Salmonella doblemente atenuada portadora únicamente del plásmido muCCL21 secretor no suprimió drásticamente la metástasis tumoral, todavía produjo retrasos de metástasis estadísticamente significativos cuando se compara con las referencias.

Significativamente la vacuna de ADN a base de muSurvivina/muCCL21 era además eficaz para suprimir de manera notable el crecimiento de la metástasis pulmonar ya bien demostrada en todos los animales experimentales en un escenario terapéutico. En cambio, todos los ratones que reciben solamente las vacunas a base de muSurvivina o muCCL21, por sí mismas, o el vector vacío y las referencias PBS, pusieron de manifiesto grandes metástasis pulmonares diseminadas de carcinoma de pulmón de células D121 no pequeñas en este escenario experimental. Los pesos del pulmón de varios grupos experimentales a partir del modelo terapéutico se indican en la Tabla 4. El peso normal del pulmón fue aproximadamente 0,3 g.

TABLA 4 Metástasis del tumor en ratones Balb/C sometidos previamente a prueba de provocación con células D121 de carcinoma pulmonar de Lewis - Peso del pulmón

4

Ejemplo 16 Determinación de los efectos antiangiógénicos en los ratones vacunados del Ejemplo 15

Dos semanas después de la última vacunación, se inyectaron los ratones por vía subcutánea (s.c.) en la región del esternón con aproximadamente 500 ml de Matrigel reducido con factor de crecimiento (BD Biosciences) que contenía aproximadamente 400 ng/ml de FGF-2 murino (PeproTech, Rocky Hill, NJ) y células D121 tumorales (1 x 10^{4}/ml) que se irradiaron con 1.000 Gy. En todos los ratones, excepto en 2 animales de referencia, se tiñó el tejido del endotelio 6 días más tarde por inyección en la vena lateral de la cola, con 200 ml de 0,1 mg/ml de lectina I fluorescente de Bandeiraea simplicifolia, Isolectina B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA); aproximadamente 30 minutos después se sacrificaron los ratones y se extrajeron los tapones de Matrigel y se evaluaron al microscopio. Se extrajo a continuación lectina-FITC de 100 ml de cada tapón en 500 ml de lisis de RIPA y se analizaron cuantitativamente por fluorimetría a 490 nm. La fluorescencia de fondo hallada en los dos ratones de referencia no inyectados se sustrajo en cada caso.

La vacuna a base de muSurvivina/muCCL21 suprimió con decisión la angiogénesis en los vasos sanguíneos del tumor. Se observó una disminución significativa en la neovascularización del tumor, tal como se indica en los ensayos con Matrigel, y análisis cuantitativo por fluorescencia relativa medida después de la tinción in vivo de endotelio de ratón con lectina conjugada con FITC. Se observaron diferencias macroscópicamente evidentes en la vascularización del tumor entre los grupos tratados con la vacuna muSurvivina/muCCL212 y grupos de referencia de ratones en el examen de tapones de Matrigel representativos retirados 6 días después de la inyección s.c. de lectina conjugada con FITC. Los ratones vacunados con una vacuna de la invención, presentaban significativamente menos vascularización del tumor en comparación con los grupos de referencia.

Ejemplo 17 Ensayo de citotoxicidad

Se aislaron esplenocitos de ratones vacunados con éxito 5 días después de la prueba de provocación con la célula tumoral. Se evaluó la toxicidad por un ensayo de liberación de ^{51}Cr habitual contra dianas de células D121 de tumor o células endoteliales murinas que sobreexpresan survivina. Para determinar la restricción de citotoxicidad de MHC de clase I específica, se llevaron a cabo evaluaciones de inhibición con 10 \mug/ml, de anticuerpos H-2Kb-Db de MHC de clase I antirratón (PharMingen, San Diego, CA).

El ensayo de liberación de ^{51}Cr indicaba citotoxicidad notable producida por los linfocitos T CD8^{+} específicos extraídos de los ratones después de la vacunación y posterior prueba de provocación con células D121 de carcinoma pulmonar de Lewis. Los linfocitos T CD8^{+} aislados de esplenocitos de ratones inmunizados con muSurvivina/muCCL21 o con la vacuna con muSurvivina por sí misma, lisaron eficazmente el 50% y el 30% de las células tumorales D121, respectivamente. Por contraste, los linfocitos T CD8^{+} aislados de animales de referencia resultaron ineficaces en la provocación de cualquier destrucción perceptible de células tumorales, ya que presentaban solamente actividades citotóxicas de fondo. De manera característica, la citotoxicidad mediada por linfocitos T CD8^{+} observada fue restringida por el antígeno MHC de clase I ya que la citotoxicidad fue eliminada completamente por adición de anticuerpos anti-H2Kb/H2Db.

Ejemplo 18 Análisis citométrico de flujo y ensayo de liberación de citocina

Los marcadores de activación de los linfocitos T y la expresión de moléculas coestimuladoras en CD11c y en las DC positivas a Ag de MHC de clase II se determinaron por análisis citométrico de flujo de 2 ó 3 colores con un BD Biosciences FACScan. Se determinó la activación de linfocitos T tiñendo esplenocitos recién aislados de ratones vacunados con éxito con anticuerpo anti-CD3e marcado con FITC en combinación con anticuerpos anti-CD25, CD28 o CD69 conjugados con PE. La activación de moléculas coestimuladoras en las APC se midió con anticuerpo anti-CD11c marcado con FITC y anticuerpo anti-IAb biotinilado, seguido de estreptavidina-aloficocianina, y en combinación con los anticuerpos anti-ICAM-1, CD80 o DEC205 conjugados con PE. Todos los experimentos citométricos de flujo se llevaron a cabo en presencia 0,1 \mug/ml de yoduro de propideo para excluir las células muertas. Todos los reactivos para estos ensayos se adquirieron en BD Pharmingen (La Jolla, CA).

Se utilizó citometría de flujo para la detección de citocinas intracelulares. Con este fin, se recolectaron esplenocitos de ratones B57BL/6J aproximadamente 2 semanas después de la prueba de provocación de las células D121 del tumor y se cultivaron durante aproximadamente 24 horas en medio de linfocito T completo junto con las células D121 irradiadas, tal como se describió anteriormente. Células preincubadas se pusieron en suspensión con aproximadamente 1 mg de anticuerpo 2.4G2 purificado (BD Pharmingen) para bloquear la tinción inespecífica. Se lavaron las células y a continuación se tiñeron con 0,5 mg de anticuerpo anti-CD3+ conjugado con FITC. Después de lavar 2 veces, se fijaron las células y se tiñeron con 1 mg/ml de PE conjugado con anticuerpos anti-IL2 o anti-IFN-g, para análisis citométrico de flujo. Todos los anticuerpos se adquirieron en BD Pharmingen (La Jolla, CA.).

Solamente la vacuna muSurvivina/muCCL21 por sí misma fue eficaz de manera óptima en regular por incremento notablemente la expresión de los marcadores de activación de linfocitos T CD25, CD28 y CD69. La regulación por incremento de CD28 es de particular importancia ya que sus interacciones con las moléculas coestimuladoras B7 en las DC se sabe que es esencial para conseguir interacciones críticas y múltiples entre los linfocitos T naturales y las DC presentadoras al antígeno. En cambio, las vacunas de ADN que codifican solamente muSurvivina o muCCL21 por sí mismas aumentaron la expresión de los marcadores de activación del linfocito T solamente una vez. La activación de los linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ por la vacuna muSurvivina/muCCL21 estaba también indicada por su aumento decisivo en las citocinas proinflamatorias intracelulares IFN-g e IL-2. En comparación, se descubrió que la PBS y las referencias del vector vacío así como las vacunas de ADN que codifican solamente muSurvivina o muCCL21 eran considerablemente menos eficaces en producir estas citocinas.

La expresión regulada por incremento de ICAM-1, CD80 y DEC205 sobre las DC, conseguida por la vacuna de ADN a base de muSurvivina/muCCL21 es particularmente importante ya que es bien sabido que la activación de los linfocitos T depende críticamente de fuertes interacciones célula-célula con estas moléculas coestimuladoras expresadas en las DC con objeto de conseguir ligadura óptima con los receptores de linfocitos T. De nuevo, la inmunización con Salmonella typhimurium doblemente atenuada, que lleva plásmidos eucarióticos que codifican muSurvivina/muCCL21 produjo la regulación por incremento más eficaz de estos marcadores de activación, que fue hasta 2 a 3 veces superior a las de las referencias.

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Ejemplo 19 Análisis de apoptosis en células tumorales

Se determinó la apoptosis en células D121 tumorales provocada por vacunación aproximadamente a las 3 horas y aproximadamente a las 24 horas después de la vacunación, respectivamente. Tanto los animales de referencia como los experimentales se sometieron a la prueba de provocación i.v. con aproximadamente 1 x 10^{5} células D121 1 semana después de la última de 3 inmunizaciones. Se recolectaron esplenocitos de cada ratón 1 semana después de la prueba de provocación de la célula tumoral, y después se cultivaron conjuntamente aproximadamente 2,5 x 10^{7} esplenocitos durante 4 horas con aproximadamente 5 x 10^{5} células D121 en placas de 6 pocillos. Se utilizó el kit II de detección de la apoptosis ANNEXIN®V-FITC (BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA) para la confirmación de las etapas iniciales de apoptosis. Para confirmar la apoptosis de la célula tumoral en la etapa última, se cultivaron conjuntamente aproximadamente 5 x 10^{5} células D121 y aproximadamente 2,5 x 10^{7} esplenocitos durante aproximadamente 24 horas y a continuación se analizó la apoptosis por FACS por el ensayo TUNEL con el kit APO-DIRECT^{TM} (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante.

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Se observó apoptosis antes de 3 horas y con un aumento considerable además después de 24 horas, tal como se indica por análisis citométrico de flujo de los datos obtenidos por los ensayos con Anexina V o TUNEL. Por lo tanto, la apoptosis en la etapa inicial fue hasta 3 a 4 veces mayor en los grupos de ratones inmunizados con la vacuna muSurvivina/muCCL21 que en las referencias después de incubar conjuntamente los esplenocitos recolectados de dicho ratón con células tumorales. La vacuna que codifica muSurvivina sola desencadenó algo de apoptosis, pero solamente fue una vez superior a las referencias. Sin embargo, a las 24 horas se observó un aumento drástico del 85% en apoptosis solamente en los ratones inmunizados con la vacuna muSurvivina/muCCL21, lo que sugiere que una potente inmunidad de las células tumorales producidas por los CTL desencadenó este hecho.

Ejemplo 20 Preparación de la vacuna de ADN que codifica muSurvivina y H60

Un plásmido que contiene el ligando H60 de NKG2D murina completo fue una donación generosa de los Drs. A. Diefenbach y D.H. Raulet (University of California, Berkeley, CA). Se construyeron vectores de expresión en un eje central de pBudCE4.1 (Invitrogen) tal como se describió anteriormente.

Se transformaron (AroA^{-}, dam^{-}) de S. typhimurium doblemente atenuadas con plásmidos de la vacuna de ADN por electroporación tal como se describió anteriormente en la presente memoria. En resumen, las bacterias recién preparadas (aproximadamente 1 x 10^{8}) en fase de crecimiento semilogarítmico, se mezclaron con ADN plásmido (1-2 \mug) en hielo en una cubeta de 0,1 cm y se electroporaron a aproximadamente 2,0 KV, 25 \muF y 100 \Omega. Las colonias resistentes que alojan los vectores con la vacuna ADN se cultivaron y se almacenaron a -80ºC tras la confirmación de las secuencias de codificación.

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Ejemplo 21 Vacunación bucal y prueba de provocación del tumor de ratones con una vacuna del Ejemplo 20

Se inmunizaron dos veces grupos de ratones (n = 4-12) BALB/c A2Kb a intervalos de 2 semanas por sonda nasogástrica, con 100 \mul de PBS que contenía aproximadamente 5 x 10^{8} de S. typhimurium doblemente atenuada que contiene los vectores de expresión. En modelos profilácticos, los ratones BALB/c se sometieron a la prueba de provocación i.v. con aproximadamente 1 x 10^{5} células CT-26 2 semanas después de la última vacunación, y en escenarios terapéuticos 5 días antes de la primera vacunación. Se sacrificaron los ratones 25 ó 28 días después de la prueba de provocación del tumor, y la metástasis pulmonar o los pesos del tumor, se determinaron respectivamente y se compararon con los de las referencias. La significación estadística de los resultados de la fórmula leucocitaria entre los grupos experimentales y las referencias se determinó por la prueba de la t-Student. Los resultados se consideraban significativos, si los valores P de dos colas eran < 0,05.

Se confirmaron las expresiones de H60 y muSurvivina transfectando células 293T y se comprobaron por citometría de flujo o por análisis de inmunotransferencia Western. Se confirmó la expresión de H60 por tinción positiva del tetrámero NKG2D. Se transfectaron células con survivina con control positivo tal como se indica por una sola banda en el peso molecular esperado de aproximadamente 16,5 KDa. El nivel del ligando NKG2D expresado por CT-26 es relativamente bajo en comparación con las células Yac-1 con control positivo. Las células tumorales con bajos niveles de expresión del ligando NKG2D se publicaron previamente que no pueden provocar rechazo del tumor. En el escenario profiláctico los pesos de los pulmones y las puntuaciones de la metástasis (descritos anteriormente en la presente memoria) se evaluaron tras el sacrificio de los ratones 25 días después de la prueba de provocación del tumor. Los resultados se presentan en la Tabla 5 y Tabla 6. Los datos demuestran que las vacunas de H60 y muSurvivina protegieron cada una los ratones en alguna medida, mientras que la combinación de H60 y muSurvivina (vacuna muSurvivina/H60) aumentaron en gran medida la protección contras las pruebas de provocación de tumor como se demostró por las puntuaciones de las metástasis significativamente inferiores y las cargas del tumor disminuidas en los pulmones. Estos resultados fueron estadísticamente significativos en comparación con los grupos de referencia de PBS, pBub, pH60 y pmuSurvivina (p<0,0001, 0,002, 0,01 y 0,005, respectivamente).

En un escenario terapéutico, es decir, contra metástasis probada de carcinoma de colon, se evaluó la carga del tumor pulmonar tras el sacrificio el día 28. Significativamente 8 de cada 12 ratones tratados con la vacuna H60/muSurvivina sobrevivieron, y más significativamente, 2 de estos animales supervivientes estaban completamente exentos de metástasis, mientras que otros 2 presentaban menos del 5% de su superficie pulmonar cubierta por metástasis tumoral fusionada. En comparación, solamente 2 ratones sobrevivieron en el grupo de referencia tratado con el vector pBud vacío, y más del 50% de la superficie pulmonar de todos los ratones supervivientes se recubrió por metástasis tumoral fusionada. La vacunación con la vacuna muSurvivina sola, no produjo ninguna protección significativa en el modelo terapéutico, y el tratamiento con la vacuna H60 sola, presentaba solamente efecto terapéutico marginal. Esto último fue sugerido por una proporción de supervivencia ligeramente mejorada por uno de los ratones supervivientes que presentaba solamente < 5% de su superficie pulmonar cubierta por metástasis tumoral fusionada.

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TABLA 5 Metástasis tumoral en ratones BALB/C sometidos a pruebas de provocación con células CT-26 tras la inmunización

5

TABLA 6 Metástasis tumoral en ratones BALB/C sometidos a pruebas de provocación con células CT-26 antes de la inmunización

6

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Ejemplo 22 Ensayo de citotoxicidad

Se midió la citotoxicidad mediante un ensayo normalizado de liberación de ^{51}Cr, como se describió anteriormente en la presente memoria. En resumen, se recolectaron esplenocitos 2 semanas después de la última inmunización, y se estimularon in vitro con células CT-26 irradiadas (1.000 Gy) a 37ºC durante 5 días en RPMI 1640 enriquecido con FBS al 10%, L-glutamina, HEPES 15 mM, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 2-ME e IL-2 recombinante a 20 U/ml (PeproTech, Rocky Hill, NJ). Se recolectaron esplenocitos y se separaron con medio de separación de Lympholyte-M cell (Cedarlane Laboratories Limited, Hornby, Ontario, Canadá). Se marcaron las células diana con ^{51}Cr, durante aproximadamente 1,5 horas a temperatura ambiente y se incubaron con células efectoras en varias proporciones de célula efectora-célula diana a aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 4 horas. Se calculó el porcentaje de lisis específica de células diana mediante la fórmula [(E-S)/(T-S)] x 100, en la que E es la liberación experimental media, S la liberación espontánea media y T la liberación total media.

Se observó que la actividad de NK había aumentado de manera significativa en los ratones inmunizados con la vacuna H60, y aún se observó mayor destrucción por NK en los ratones inmunizados con la vacuna muSurvivina/H60. Los esplenocitos de los ratones inmunizados con la vacuna muSurvivina/muH60 presentaban la mayor citotoxicidad contra las células diana CT-26. En cambio, dichos esplenocitos aislados de las referencias inmunizadas con pBud pusieron de manifiesto una destrucción citotóxica mínima, mientras que los esplenocitos de los ratones vacunados con la vacuna H60 o con muSurvivina de por sí presentaban una destrucción citotóxica algo mayor. Después de 5 días de cultivo celular las células NK no parecían desempeñar un papel principal en este ensayo de citotoxicidad, ya que no se observó ninguna diferencia significativa, cuando se utilizaban células diana Yac-1 NK, lo que sugiere que la citotoxicidad detectada estaba mediada principalmente por los LTC.

Pueden introducirse numerosas variaciones y modificaciones de las formas de realización descritas anteriormente. Las formas de realización específicas ilustradas en la presente memoria no se proporcionan de manera limitativa.

<110> Xiang, Rong

\hskip1cm Zhou, He

\hskip1cm Reisfeld, Ralph A.

\hskip1cm The Scripps Research Institute

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<120> Vacunas de ADN contra el crecimiento tumoral y procedimientos para la utilización de las mismas

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<130> TSRI-874.1PC

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<150> 60/457.009

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<151> 2003-03-24

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<160> 29

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 1643

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<212> ADN

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<213> HOMO SAPIENS

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<400> 1

7

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<210> 2

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<211> 142

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<212> PRT

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<213> HOMO SAPIENS

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<400> 2

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8

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<210> 3

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<211> 955

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<212> ADN

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<213> MUS MUSCULUS

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<400> 3

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9

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<210> 4

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<211> 140

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<212> PRT

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<213> MUS MUSCULUS

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<400> 4

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10

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<210> 5

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<211> 852

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<212> ADN

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<213> HOMO SAPIENS

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<400> 5

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11

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<210> 6

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<211> 134

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<212> PRT

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<213> HOMO SAPIENS

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<400> 6

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12

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<210> 7

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<211> 615

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<212> ADN

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<213> MUS MUSCULUS

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<400> 7

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13

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<210> 8

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<211> 133

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<212> PRT

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<213> MUS MUSCULUS

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<400> 8

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14

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<210> 9

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<211> 746

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<212> ADN

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<213> MUS MUSCULUS

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<400> 9

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15

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<210> 10

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<211> 244

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<212> PRT

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<213> MUS MUSCULUS

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<400> 10

16

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<210> 11

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<211> 878

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<212> ADN

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<213> MUS MUSCULUS

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> MUS MUSCULUS

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1155

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2385

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 383

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 735

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 741

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 735

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HOMO SAPIENS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (174)...(1070)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

36

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1268

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (174)...(1016)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

39

40

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

42

Claims (21)

1. Vacuna de ADN adecuada para provocar una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas que comprende un montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos una proteína survivina y por lo menos un producto génico inmunoactivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el montaje de ADN se incorpora operativamente en un vector bacteriano atenuado.

2. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el montaje de ADN codifica operativamente una proteína survivina seleccionada de entre el grupo constituido por (a) survivina humana natural que presenta la secuencia de restos de aminoácidos de SEC ID nº 2, (b) un homólogo inmunógeno de survivina humana natural que presenta una secuencia de restos de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la SEC. ID. nº: 2, (c) una variante de corte y empalme de survivina humana que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 23 de restos de aminoácidos, (d) una variante de corte y empalme de la survivina humana que presenta la secuencia de restos de aminoácidos de SEC ID nº 24, y (e) un fragmento de una proteína survivina que se une a una molécula MCH de clase I y es reconocido por los linfocitos T citotóxicos.

3. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el montaje de ADN codifica operativamente un homólogo inmunógeno de survivina humana natural que presenta una secuencia de restos de aminoácidos por lo menos 90%, preferentemente por lo menos 95% idéntica a la SEC. ID. nº: 2.

4. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el producto génico inmunoactivo codificado operativamente por el montaje de ADN es una citocina o un ligando para un receptor de la superficie de la célula destructora natural.

5. Vacuna de ADN según la reivindicación 4, en la que la citocina se selecciona de entre el grupo constituido por una quimiocina, una hematopoyetina, un interferón un factor estimulante de células destructoras naturales y un factor de inducción de la producción de citocinas.

6. Vacuna de ADN según la reivindicación 5, en la que la citocina es la CCL21.

7. Vacuna de ADN según la reivindicación 4, en la que el ligando para un receptor de la superficie de la célula destructora natural es una proteína inducible por estrés seleccionada de entre el grupo constituido por MICA humana, MICB humana, ULBP1 humana, ULBP2 humana, y ULBP3 humana.

8. Vacuna de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el vector bacteriano atenuado se selecciona de entre el grupo constituido por Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, especies de Shigella, especies de Bacillus, especies de Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, Vibrio cholerae, especies de Campylobacter y especies de Listeria atenuadas.

9. Vacuna de ADN según la reivindicación 8, en la que la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa AroA^{-} de Salmonella typhimurium.

10. Vacuna de ADN según la reivindicación 8, en la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa AroA^{-}, dam^{-} de Salmonella typhimurium.

11. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos una proteína survivina comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID. nº 1 y SEC. ID. nº 3.

12. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos un producto génico inmunoactivo comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 7, SEC. ID. nº 11, SEC. ID. nº 13, SEC. ID. nº 15, SEC. ID. nº 17, SEC. ID. nº 19 y SEC. ID. nº 21.

13. Vacuna de ADN según la reivindicación 11 ó 12, en la que el montaje de ADN se incorpora operativamente en un vector de Salmonella typhimurium atenuada.

14. Utilización de un montaje de ADN que codifica operativamente una proteína survivina y un producto génico inmunoactivo, y de un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de una vacuna de ADN destinada a inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero, debiéndose dicha vacuna de ADN administrar oralmente al mamífero en una cantidad que provoque una respuesta inmunológica eficaz y dicho mamífero presenta una respuesta inmunitaria provocada por la vacuna y específica para las células tumorales, en la que el montaje de ADN está incorporado operativamente en un vector bacteriano atenuado.

15. Utilización de un montaje de ADN que codifica operativamente una proteína survivina y un producto génico inmunoactivo, y de un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de una vacuna de ADN destinada a vacunar a un mamífero contra el cáncer, debiéndose dicha vacuna de ADN administrar oralmente al mamífero en una cantidad que provoque una respuesta inmunológica eficaz y dicho mamífero presenta una respuesta inmunitaria provocada por la vacuna y específica para las células tumorales, en la que el montaje de ADN está incorporado operativamente en un vector bacteriano atenuado.

16. Utilización según la reivindicación 14 ó 15, en la que el producto génico inmunoactivo codificado por el montaje de ADN es una citocina o un ligando para un receptor de la superficie de la célula destructora natural.

17. Utilización según la reivindicación 14 ó 15, en la que el mamífero es un ser humano.

18. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en la que el vector bacteriano atenuado se selecciona de entre el grupo constituido por Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, especies de Shigella, especies de Bacillus, especies de Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, Vibrio cholerae, especies de Campylobacter y especies de Listeria.

19. Utilización según la reivindicación 18, en la que la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa AroA^{-} de Salmonella typhimurium.

20. Utilización según la reivindicación 18, en la que la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa AroA^{-}, dam^{-} de Salmonella typhimurium.

21. Artículo de fabricación que comprende una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, embalado en un recipiente estéril, herméticamente sellado, presentando el recipiente una etiqueta fijada al mismo, llevando la etiqueta material impreso que identifica la vacuna y que proporciona información útil para un individuo que administra la vacuna a un paciente.