WO2009125819A1 - アミノ糖化合物及びその生産方法 - Google Patents

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裕美 笹村
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the present invention relates to an amino sugar compound useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition, particularly a pharmaceutical composition for treating diabetes.
  • the polysaccharide ingested by the diet is partially digested by saliva-derived ⁇ -amylase in the oral cavity and stomach, and then mostly digested by pancreatic ⁇ -amylase in the duodenum and jejunum. It becomes sugar. These are hydrolyzed into monosaccharides by glucosidases typified by maltase and sucrase localized in the microintestinal microvillous membrane, and the monosaccharides are absorbed from the intestinal tract.
  • the absorbed monosaccharide moves into the blood, and when the blood sugar level rises, insulin is secreted from the pancreas, which lowers the sugar release from the liver and increases the sugar uptake into muscle and adipose tissue The blood glucose level is lowered and its homeostasis is maintained.
  • insulin secretion insufficiency
  • insulin resistance insulin action deficiency
  • postprandial hyperglycemia is important for the suppression of the onset and progression of diabetic complications.
  • Postprandial hyperglycemia has been shown to be an independent risk factor for cardiovascular death, even if mild.
  • the importance and necessity of pharmacotherapy for postprandial hyperglycemia for example, a state in which the blood glucose level at 2 hours after meal is 200 mg / dL or more has been recognized.
  • glucosidase inhibitors that are digestive enzyme inhibitors are actually used in clinical practice (for example, acarbose and voglibose).
  • side effects such as digestive symptoms (abdominal bloating, diarrhea, loose stool, flatulence, feces, etc.) due to glucosidase inhibition are a problem.
  • ⁇ -amylase inhibitors may be mentioned as different postprandial hyperglycemia treatments (digestive enzyme inhibitors).
  • glucosidase is inhibited, a large amount of undigested oligosaccharide (disaccharide) is produced as a by-product, but even when ⁇ -amylase is inhibited, the amount of undigested oligosaccharide (disaccharide) produced as a by-product is small. It is expected to inhibit sugar absorption without causing gastrointestinal symptoms.
  • Patent Document 2 a malto-oligosaccharide compound having hexahydro-3,5,6-trihydroxy-1H-azepine as an essential skeleton has been reported (Patent Document 2).
  • n 0 to 3
  • X represents H or a hydrophobic group.
  • Non-patent Document 1 a compound having a reducing sugar structure at the terminal where n is 0 to 3 in the following formula is known (Non-patent Document 1).
  • a compound useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition particularly a pharmaceutical composition for treating diabetes.
  • the present invention relates to a compound comprising a compound of formula (I) or a salt thereof, a composition containing a compound of formula (I) or a salt thereof, a compound of formula (I) or a salt thereof, and an excipient. And a method for producing a compound of formula (I) or a salt thereof.
  • n 4, 5 or 6.
  • the present invention can also be obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Streptomyces that produces a compound having an ⁇ -amylase inhibitory activity or a salt thereof in a medium and recovering the compound or the salt thereof from the culture solution. Further, a compound having an ⁇ -amylase inhibitory activity and a molecular formula of C 94 H 156 N 4 O 64 , C 113 H 187 N 5 O 76 , or C 132 H 218 N 6 O 88 (provided that a reducing sugar is present at the terminal) Except for compounds having a structure) or a salt thereof, and a composition containing these compounds or a salt thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes containing a compound of formula (I) or a salt thereof, that is, a therapeutic agent for diabetes containing a compound of formula (I) or a salt thereof.
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (I) or a salt thereof for the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes, or a compound of formula (I) for the prevention or treatment of diabetes or
  • the present invention relates to the use of a salt thereof, and a method for preventing or treating diabetes, which comprises administering to a patient an effective amount of a compound of formula (I) or a salt thereof.
  • the compound of formula (I) or a salt thereof has an ⁇ -amylase inhibitory action and can be used as a preventive or therapeutic agent for diabetes, obesity, NASH (nonalcoholic steatohepatitis) and the like. Further, unlike glucosidase inhibitors, it is expected that sugar absorption inhibition can be exerted without causing digestive symptoms such as diarrhea.
  • FIG. 1 shows the 1 H-NMR spectrum of Compound A.
  • FIG. 2 shows the 13 C-NMR spectrum of Compound A.
  • FIG. 3 shows the 1 H-NMR spectrum of Compound B.
  • FIG. 4 shows the 13 C-NMR spectrum of Compound B.
  • FIG. 5 shows the 1 H-NMR spectrum of Compound C.
  • FIG. 6 shows the 13 C-NMR spectrum of compound C.
  • FIG. 7 shows the blood glucose elevation inhibitory action of Compound A when loaded with carbohydrate.
  • (A) shows changes over time in blood glucose level, and (B) shows AUC.
  • FIG. 8 shows the insulin elevation inhibitory effect of Compound A upon carbohydrate loading.
  • (A) shows time course of insulin level, and (B) shows AUC.
  • FIG. 9 shows the HPLC chromatogram of Compound A.
  • FIG. 10 shows the HPLC chromatogram of Compound B.
  • FIG. 11 shows the HPLC chromatogram of Compound C.
  • Geometric isomers may exist in the compounds of formula (I).
  • the compound of the formula (I) may be described in only one form of an isomer, but the present invention also includes other isomers, separated isomers, or those isomers. And mixtures thereof.
  • the compound of formula (I) may have an optical isomer based on an asymmetric carbon atom.
  • the present invention also includes separated optical isomers of the compound of formula (I) or a mixture thereof.
  • the present invention includes a pharmaceutically acceptable prodrug of the compound represented by the formula (I).
  • Pharmaceutically acceptable prodrugs are compounds having groups that can be converted to amino groups, hydroxyl groups, etc. by solvolysis or under physiological conditions. Examples of groups that form prodrugs include those described in Prog. Med., 5, 2157-2161 (1985) and ⁇ Development of pharmaceuticals '' (Yodogawa Shoten, 1990), Vol. 7, Molecular Design 163-198. Is mentioned.
  • the salt of the compound of the formula (I) is a pharmaceutically acceptable salt of the compound of the formula (I) and may form an acid addition salt.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid Acid addition with organic acids such as lactic acid, malic acid, mandelic acid, tartaric acid, dibenzoyltartaric acid, ditoluoyltartaric acid, citric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, aspartic acid, glutamic acid Salt.
  • the present invention also includes various hydrates and solvates of the compound of formula (I) and salts thereof, and crystalline polymorphic substances.
  • the present invention also includes compounds labeled with various radioactive or non-radioactive isotopes.
  • the “compound having a reducing sugar at the terminal” is not particularly limited, but examples thereof include acarbose, acarbiostatin 103, acarbiostatin II03, acarbiostatin III03, and acarbiostatin IV03. And compounds such as natural products having a terminal saccharide having a free aldehyde group (or ketone group).
  • the compound of the present invention can be produced using a microorganism belonging to the genus Streptomyces and having the ability to produce the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a microorganism is preferably Streptomyces sp.
  • Streptomyces sp. 6982 was isolated from a soil sample collected in Iriomote Island, Okinawa Prefecture.
  • the culture medium and method for investigating the morphology, culture properties and physiological properties of this strain are mainly Shirring, Gott Kunststoff (Shirling, E. B. and D. Gottlieb: Methods for characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340, 1966), and Waxman (Waksman, sS. A .: The actinomycetes Vol. 2: Classification, identification and description of genera and species: The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 196)
  • the culture temperature was 30 ° C., and the culture days were observed for 14 days after culturing.
  • yeast extract-starch agar is a solution of 2.0 g powdered yeast extract S (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 g soluble starch and 16 g agar. Sterilized in an autoclave. The growth temperature was determined with yeast extract-starch agar. The availability of carbon sources is determined in the medium of Pridham Gott Kunststoff (Pridoham, TG and D. Gottlieb: lieThe utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an acid for species determination: J. Bacteriol. 56: 107-114, 1948). did.
  • the base sequence of 16S rDNA was determined according to the method of Nakagawa et al. (Nakagawa Atsuyoshi, Kawasaki Hiroko, Classification and Identification of Actinomycetes pp.83-117. ).
  • Homology search is FASTA search on the National Institute of Genetics website (a) http://www.ddbj.nig.ac.jp (b) DJ Lipman, WR Pearson: Rapid and sensitive protein similarity searches, Science, 227, 1435-1441 (1985) and (c) WR Pearson, DJ Lipman: Improved tools for biological sequence comparison, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85, 2444-2448 (1988)
  • the 16S rDNA base sequence of the reference strain was obtained from the database of the National Institute of Genetics (http://www.ddbj.nig.ac.jp).
  • the phylogenetic tree was created by using the Clustal W package by the neighbor join method (Clustal W Thompson, JD, Higgins, insDG and Gibson, TJ: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alighnment through sequence weighting, and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680,6801994).
  • the “related strain” refers to a strain having a homologous value of 97% or more between the base sequences of Streptomyces sp. Strain 6982 and 16S rDNA. It is known that when the homology value of the base sequence of 16S rDNA is less than 97%, they are judged as different species. Stackebrandt, E. & Goebel, B. M., Int J Syst Bacteriol., 44, (1994) 846-849
  • Streptomyces sp This strain has been deposited internationally with the deposit number FERM BP-10802 (date of deposit March 22, 2007) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Also, since microorganisms artificially or naturally mutate, the Streptomyces sp. 6982 strain of the present invention can be artificially mutated with ultraviolet rays, X-rays, chemical agents, etc. in addition to microorganisms isolated from nature. And the natural mutants thereof.
  • the amino sugar derivative of the present invention is a microorganism having the ability to produce a compound belonging to the genus Streptomyces and having ⁇ -amylase activity, preferably a microorganism having the ability to produce the amino sugar derivative, more preferably Streptomyces sp.
  • the strain can be obtained by inoculating a medium containing a nutrient source and growing it aerobically.
  • the medium used for the culture may be any medium in which the microorganisms used can grow, and a synthetic medium, semi-synthetic medium, or natural medium can be used.
  • nitrogen sources include kinako, defatted soybean flour, peptone, meat extract, corn steep liquor, cottonseed flour, peanut flour, soybean flour, yeast extract, dry yeast, NZ-amine, casein hydrolyzate, fish meal, nitric acid Inorganic or organic nitrogen sources such as sodium and ammonium nitrate can be used.
  • carbon source examples include starch such as potato starch and corn starch, molasses, dextrin, sucrose, glucose, maltose, trehalose, fructose, xylose, rhamnose, mannitol, glycerin and other carbohydrates or fats, preferably starch and Kinako flour.
  • starch such as potato starch and corn starch
  • molasses dextrin
  • sucrose glucose
  • maltose trehalose
  • fructose xylose
  • rhamnose mannitol
  • glycerin glycerin
  • other carbohydrates or fats preferably starch and Kinako flour.
  • metal salts such as Na, K, Mg, Ca, Zn, Fe, hydrochlorides, nitrates, phosphates, carbonates, etc. are added as necessary, preferably calcium carbonate and / or Sodium chloride.
  • conventionally known amino acids, production promoting compounds such as methyl oleate, lard oil, silicone oil, surfactant and the like or an antifoaming agent are appropriately used.
  • any microorganisms that can be used by the producing bacteria and useful for the production of the compound of the present invention can be used as desired.
  • the culture may be performed in the same manner as the culture in general antibiotic production, and the culture method may be solid culture or liquid culture.
  • the culture method may be solid culture or liquid culture.
  • static culture, shaking culture, or stirring culture may be performed.
  • aeration stirring culture may be performed.
  • the culture temperature can be suitably applied within the range where the producing bacteria grow and can produce the compound of the present invention, that is, in the range of 15 to 42 ° C., preferably about 20 to 30 ° C., more preferably 23 to 27 ° C. .
  • the pH can be appropriately applied in the range of 4 to 9, but 6 to 8 is preferable.
  • the culture time varies depending on various conditions, and can be appropriately applied in the range of usually 1 to 30 days, preferably 4 to 10 days.
  • the substance in the culture is obtained by filtering the culture solution as it is, or by centrifugation or adding a filter aid to the culture. At this time, an organic solvent such as acetone, MeOH, EtOH, or MeCN may be added to the culture solution, and hydrochloric acid or the like may be added to adjust pH if desired.
  • the substance can be separated by bringing the filtrate into contact with an appropriate carrier, adsorbing the produced substance in the filtrate, and then eluting with a suitable solvent.
  • the substance is adsorbed by contacting with a porous adsorption resin such as Amberlite (registered trademark) XAD2, Diaion (registered trademark) HP20, Diaion CHP20P, or Diaion SP850.
  • a porous adsorption resin such as Amberlite (registered trademark) XAD2, Diaion (registered trademark) HP20, Diaion CHP20P, or Diaion SP850.
  • the material is then eluted using a mixture of organic solvent such as acetone, MeOH, EtOH, MeCN and water.
  • hydrochloric acid or the like may be added to adjust the pH.
  • the fraction containing the substance can be efficiently obtained by increasing the mixing ratio of the organic solvent to a high concentration stepwise or continuously from a low concentration.
  • the present compound was purified by adding a base in order to remove unstable and difficult-to-isolate compounds such as reducing sugar compounds. Moreover, in order to ensure the purity as a pharmaceutical, it refine
  • the compound of formula (I) is isolated and purified as a free compound, its salt, hydrate, solvate, or crystalline polymorphic substance.
  • the salt of the compound of the formula (I) can also be produced by subjecting it to a conventional salt formation reaction. Isolation and purification are performed by applying ordinary chemical operations such as extraction, fractional crystallization, and various fractional chromatography.
  • recovery means an operation performed for obtaining the compound (I) of the present invention alone or as a composition, and includes “purification” and “isolation”.
  • purification includes an operation performed for the purpose of “isolating” the compound of the present invention, and the compound of the present invention may be “isolated” by “purification”.
  • Various isomers can be produced by selecting an appropriate raw material compound, or can be separated by utilizing a difference in physicochemical properties between isomers.
  • optical isomers can be obtained by general optical resolution of racemates (for example, fractional crystallization leading to diastereomeric salts with optically active bases or acids, chromatography using chiral columns, etc.). You can also.
  • chromatography means chromatography that is widely used in analytical chemistry, and is not particularly limited.
  • gas chromatography GC
  • liquid chromatography LC
  • supercritical fluid chromatography Includes SFC
  • liquid chromatography means a general term for chromatography using a liquid in a moving bed, and is not particularly limited, but includes, for example, medium speed liquid chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC). Etc.
  • the composition containing the compound of the formula (I) or a salt thereof refers to a composition obtained in the stage of purifying or isolating the compound of the formula (I), and can be used as a drug production base. Although it does not specifically limit, For example, it is a mixture of 1 type, or 2 or more types of compounds of formula (I), or its salt, and active ingredients, such as acarbiostatin IV03, or another component.
  • the present composition is not limited to this, but the compound of formula (I) or a salt thereof is about 80% or more by area analysis, preferably 85% or more, more preferably, by chromatographic analysis. 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.
  • a pharmaceutical composition containing one or more compounds of the formula (I) or a salt thereof as an active ingredient is an excipient normally used in the art, that is, a pharmaceutical excipient or a pharmaceutical carrier.
  • Administration is orally by tablets, pills, capsules, granules, powders, solutions, etc., or injections such as intra-articular, intravenous, intramuscular, suppositories, eye drops, ophthalmic ointments, transdermal solutions, Any form of parenteral administration such as an ointment, a transdermal patch, a transmucosal liquid, a transmucosal patch, and an inhalant may be used.
  • Tablets, powders, granules, etc. are used as solid compositions for oral administration.
  • one or more active ingredients are combined with at least one inert excipient such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone. And / or mixed with magnesium aluminate metasilicate.
  • the composition may contain an inert additive, for example, a lubricant such as magnesium stearate, a disintegrant such as sodium carboxymethyl starch, a stabilizer, or a solubilizing agent according to a conventional method. .
  • tablets or pills may be coated with a sugar coating or a film of a gastric or enteric substance.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups or elixirs and the like, and commonly used inert diluents such as purified water. Or EtOH.
  • the liquid composition may contain solubilizers, wetting agents, auxiliaries such as suspending agents, sweeteners, flavors, fragrances and preservatives in addition to the inert diluent.
  • the injection for parenteral administration contains a sterile aqueous or non-aqueous solution, suspension or emulsion.
  • aqueous solvent include distilled water for injection or physiological saline.
  • Non-aqueous solvents include, for example, vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol or olive oil, alcohols such as EtOH, or polysorbate 80 (a pharmacopeia name).
  • Such compositions may further contain isotonic agents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, or solubilizing agents. These are sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericidal agent or irradiation. These can also be used by producing a sterile solid composition and dissolving or suspending it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.
  • External preparations include ointments, plasters, creams, jellies, poultices, sprays, lotions, eye drops, eye ointments and the like.
  • ointment bases include commonly used ointment bases, lotion bases, aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like.
  • ointments or lotion bases include polyethylene glycol, propylene glycol, white petrolatum, honey beeswax, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, glyceryl monostearate, stearyl alcohol, cetyl alcohol, lauromacrogol, sorbitan sesquioleate Etc.
  • a transmucosal agent such as an inhalant or a nasal agent is used in a solid, liquid, or semi-solid state, and can be produced according to a conventionally known method.
  • known excipients, and further pH adjusters, preservatives, surfactants, lubricants, stabilizers, thickeners and the like may be appropriately added.
  • an appropriate device for inhalation or insufflation can be used.
  • a known device such as a metered dose inhalation device or a nebulizer
  • the compound is administered alone or as a powder in a formulated mixture or as a solution or suspension in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. be able to.
  • the dry powder inhaler or the like may be for single or multiple administration, and a dry powder or a powder-containing capsule can be used. Alternatively, it may be in the form of a pressurized aerosol spray using a suitable propellant, for example, a suitable gas such as chlorofluoroalkane, hydrofluoroalkane or carbon dioxide.
  • a suitable propellant for example, a suitable gas such as chlorofluoroalkane, hydrofluoroalkane or carbon dioxide.
  • the daily dose is about 0.01 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 10 mg / kg per body weight, which is divided into 1 or 2 to 4 times.
  • As a transmucosal agent about 0.001 to 100 mg / kg per body weight is administered once to several times a day. The dose is appropriately determined according to individual cases in consideration of symptoms, age, sex, and the like.
  • the compound of the formula (I) can be used in combination with various therapeutic agents or preventive agents for diseases for which the compound of the formula (I) is considered to be effective.
  • the combination may be administered simultaneously, separately separately, or at desired time intervals.
  • the simultaneous administration preparation may be a compounding agent or may be separately formulated.
  • the manufacturing method of the compound of Formula (I) is demonstrated in detail.
  • this invention is not limited to the compound as described in the following Example.
  • the production method of the compound of the formula (I) is not limited to the production methods of the specific examples shown below.
  • the compound of the formula (I) may be a combination of these production methods or a person skilled in the art. It can also be produced by methods that are self-evident.
  • Example 1 (culture)
  • the solution was dispensed one by one and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 30 minutes.
  • This seed medium was inoculated with 1 platinum loop of a slope culture of Streptomyces sp. Strain 6982 and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days.
  • This active fraction was washed with distilled water, 0.5M and 1M NaCl aqueous solution using DOWEX 50W X1 (made by The Dow Chemical Company) cation exchange resin (resin amount 550 mL), and then 3M NaCl. Elute with aqueous solution. Then, using Daiso gel SP-120-15 / 30-ODS-B (resin amount 1 L, manufactured by Daiso Corporation), by eluting with 10%, 15% aqueous MeOH, compounds A and B were obtained, Compound C was obtained by elution with 20% and 25% aqueous MeOH.
  • DOWEX 50W X1 made by The Dow Chemical Company
  • the eluate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain 1.14 g of powder.
  • 200 mg of the above powder dissolved in water was eluted with 2% MeCN aqueous solution (containing 0.05% TFA) using Daiso Pack SP-120-5-ODS-BP (20 ⁇ 250 mm, manufactured by Daiso Corporation).
  • the eluate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain 136 mg of powder.
  • the eluate was concentrated under reduced pressure and then lyophilized to obtain 970 mg of powder.
  • 450 mg of the above powder dissolved in water was eluted with 2.2% aqueous MeCN (containing 0.05% TFA) using Daiso Pack SP-120-5-ODS-BP (20 ⁇ 250 mm).
  • the eluate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain 190 mg of powder.
  • the eluate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain 1 g of powder.
  • the above powder dissolved in water was eluted with 2.2% to 3.2% MeCN aqueous solution (containing 0.05% TFA) using Daiso Pack SP-120-5-ODS-BP (20 ⁇ 250 mm).
  • the eluate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain 236 mg of powder.
  • the area percentages (%) of the compounds A, B, and C were 99.0%, They were 98.2% and 98.3%.
  • the area percentage (%) was obtained from the ratio of the peak areas of the respective components to the sum of the peak areas of the respective components obtained on the chromatogram during the retention time of 6 to 22 minutes. .
  • the HPLC chromatograms of Compound A to Compound C are shown in FIGS.
  • Example 2 The ⁇ -amylase inhibitory activity of the compound of the present invention was confirmed by the following method.
  • Mouse, rat, dog and monkey pancreatic ⁇ -amylase solutions are ICR mice (male, 8 weeks old, purchased from Japan SLC), SD rats (male, 8 weeks old, purchased from Japan Charles River), beagle Prepared from the pancreas of dogs (male, 35 months old, purchased from Narku Co., Ltd.) and cynomolgus monkeys (male, 10 years old, purchased from Clea Japan).
  • Human saliva and pancreatic ⁇ -amylase solution were prepared from enzymes purchased from Sigma-Aldrich Co.
  • Various ⁇ -amylase solutions (20 U, 25 ⁇ L) and compounds (25 ⁇ L) prepared by dissolution in assay buffer were added to a 96-well microplate and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, starch solution (5 mg / mL, 50 ⁇ L) was added and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the compounds of the present invention have inhibitory activity against ⁇ -amylases of all the species examined, and the inhibitory activities (IC 50 values) of mouse pancreatic ⁇ -amylase of compounds A, B and C are respectively 1.90 nM, 2.06 nM and 1.73 nM, and the inhibitory activity against rat pancreatic ⁇ -amylase (IC 50 value) was 2.01 nM, 2.12 nM and 1.95 nM, respectively, and the inhibitory activity against canine pancreatic ⁇ -amylase (IC 50 (Value) are 2.06 nM, 2.38 nM and 2.07 nM, respectively, and the inhibitory activity (IC 50 value) on monkey pancreatic ⁇ -amylase is 2.14 nM, 1.90 nM and 2.02 nM, respectively, and inhibition against human salivary ⁇ -amylase The activity (IC 50 value) was 2.20 nM, 1.87 nM and 1.99 nM, respectively, and the inhibitory activity (IC 50 value)
  • Example 3 The oral activity of the compound of the present invention was confirmed by the following method.
  • Male ICR (normal) mice (6 weeks old, purchased from Japan SLC) were used as animals.
  • a solution was prepared using a 0.5% methylcellulose solution.
  • Blood was collected from mice fasted overnight for blood glucose level and plasma insulin level measurement, and solvent or compound A (0.3, 1, 3, 10 mg / kg) was orally administered, and immediately a carbohydrate solution (75 mg / mL starch, 25 mg / mL sucrose, 20 mL / kg) was orally administered.
  • a carbohydrate solution 75 mg / mL starch, 25 mg / mL sucrose, 20 mL / kg
  • the blood glucose level was measured using Glucose CII-Test Wako reagent (Wako Pure Chemical Industries), and the plasma insulin concentration was measured using a mouse insulin ELISA kit (Shiba Goat Co., Ltd.). The test results are shown as mean ⁇ standard error. Calculate the area under the blood glucose level-time curve (AUC) from the blood glucose level up to 2 hours after compound administration, and the plasma insulin level-time AUC from the plasma insulin level up to 1 hour. The test was conducted using Dunnett's multiple range test, and a significance level of less than 5% was considered significant.
  • Example 4 The disaccharide hydrolase inhibitory activity of the compound of the present invention was confirmed by the following method.
  • (1) Experimental method Brush border samples prepared from ICR mice, SD rats, beagle dogs and cynomolgus monkey small intestine, and human small intestine microsome samples (BD Biosciences; Lot 36869) were used as various disaccharide hydrolase solutions. These disaccharide hydrolase solutions and compounds were all prepared using phosphate buffer (NaCl 48 mM, KCl 5.4 mM, Na 2 HPO 4 28 mM, NaH 2 PO 4 43 mM, mannitol 35 mM, pH 6.0).
  • Disaccharide hydrolase solution 10 mg / mL, 40 ⁇ L
  • compound solution 20 ⁇ L
  • Incubation was performed for 10 minutes.
  • a disaccharide hydrolase substrate sucrose: 100 mM sucrose, maltase: 100 mM maltose, isomaltase: 100 mM isomaltose, lactase: 100 mM lactose, trehalase: 100 mM trehalose, 40 ⁇ L
  • a disaccharide hydrolase substrate sucrose: 100 mM sucrose, maltase: 100 mM maltose, isomaltase: 100 mM isomaltose, lactase: 100 mM lactose, trehalase: 100 mM trehalose, 40 ⁇ L
  • a disaccharide hydrolase substrate sucrose: 100 mM sucrose, maltase: 100 mM maltose, isomaltase: 100 mM isomaltose, lactase: 100 mM lactose, trehalase: 100 mM trehalose, 20 ⁇ L
  • Incubation was performed at 37 ° C. Stop the reaction by adding 0.04 M perchloric acid solution (100 ⁇ L), perform centrifugation (2,000 rpm, 15 minutes), and determine the glucose concentration in the supernatant as glucose GII-Test Wako reagent (Wako Pure Chemical) It measured using.
  • the disaccharide hydrolase inhibitory activity was calculated from the absence of enzyme (0%) and the absence of compound (100%).
  • Results The compounds of the present invention showed no inhibitory activity against all the disaccharide hydrolyzing enzymes (sucrose, maltase, isomaltase, lactase and trehalase) examined (IC 50 > 10 ⁇ M).
  • the compound of the formula (I) has ⁇ -amylase inhibition, blood glucose level and plasma insulin level lowering action and can be used for the treatment of diabetes and the like.
  • the compound of formula (I) or a salt thereof has an ⁇ -amylase inhibitory action and can be used as a preventive or therapeutic agent for diabetes, obesity, NASH (non-alcoholic steatohepatitis) and the like.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • sugar absorption can be inhibited without causing gastrointestinal symptoms such as diarrhea.

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Abstract

【課題】α-アミラーゼ阻害作用を有する医薬組成物、特に糖尿病治療用医薬組成物の有効成分として有用な化合物を提供する 【解決手段】本発明者らは、ストレプトマイセス属の放線菌であるストレプトマイセス エスピー(Streptomyces sp.)6982株の産生する化合物から、α-アミラーゼ阻害活性を有する化合物について検討したところ、アミノ糖化合物がα-アミラーゼ阻害作用を有することを確認し、本発明を完成した。本発明のアミノ糖化合物はα-アミラーゼ阻害作用を有し、糖尿病、肥満、NASH（非アルコール性脂肪肝炎）の予防若しくは治療剤、殊として、食後過血糖の改善剤として使用しうる。

Description

アミノ糖化合物及びその生産方法
　本発明は医薬組成物、殊に糖尿病治療用医薬組成物の有効成分として有用なアミノ糖化合物に関する。
　食事摂取された多糖類は、口腔及び胃内において唾液由来α-アミラーゼにより一部消化され、次いで、十二指腸及び空腸内で膵臓由来α-アミラーゼにより大部分が消化されることで、二糖類やオリゴ糖となる。これらは小腸上皮微絨毛膜に局在するマルターゼ、スクラーゼに代表されるグルコシダーゼによって単糖へと加水分解され、単糖が腸管より吸収される。吸収された単糖は血中に移行し、血糖値が上昇すると、膵臓からインスリンが分泌され、肝臓からの糖放出を低下させると共に、筋肉や脂肪組織への糖取り込みを増加させる事によって、上昇した血糖値を降下させ、その恒常性は保たれている。
　しかしながら、糖尿病態では、インスリンの分泌不全、あるいはインスリン抵抗性(インスリン作用不足)により、食後高血糖や空腹時高血糖などの慢性的な血糖制御不全状態に陥っている。
　近年、大規模臨床試験により、糖尿病性合併症の発症ならびに進展抑制には食後高血糖の是正が重要であることが確認された。食後高血糖はたとえ軽度であっても心血管死の独立した危険因子であることを示している。以上のような背景により、食後高血糖(例えば、食後２時間の血糖値が 200 mg/dL以上の状態)に対する薬物治療の重要かつ必要性が認識されるようになっている。
　食後高血糖の治療薬として、消化酵素阻害剤であるグルコシダーゼ阻害剤が臨床において実際に用いられている(例えば、アカルボースやボグリボース)。しかしながら、グルコシダーゼ阻害による、消化器症状(腹部膨満感、下痢、軟便、鼓腸、放屁など)が起こるという副作用が問題となっている。
　また、異なる食後高血糖の治療薬(消化酵素阻害薬)として、α-アミラーゼ阻害剤が挙げられる。グルコシダーゼを阻害すると、未消化のオリゴ糖(二糖類)を多く副生させるが、α-アミラーゼを阻害しても未消化のオリゴ糖(二糖類)は副生させる量が少ないため、下痢等の消化器症状を引き起こさずに糖の吸収阻害が発揮できると期待されている。
　α-アミラーゼ阻害活性を有するアミノ糖化合物が幾つか報告されている。
　例えば、ストレプトマイセス属の放線菌から単離されたトレスタチン誘導体（下記式、但し、式中nは１～３を示す）が報告されている(特許文献１)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　また、ヘキサヒドロ-3,5,6-トリヒドロキシ-1H-アゼピンを必須骨格とするマルト-オリゴ糖化合物が報告されている(特許文献２)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、nは０～３を、XはH又は疎水性基を示す。）
　また、下式中nが0から3である末端に還元糖構造を有する化合物が知られている(非特許文献１)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　当該非特許文献で開示されているアカルビオスタチン（Acarviostatin）ＩＶ０３(n=3)は、分子式がＣ94Ｈ156 Ｎ4Ｏ64がであり、本願のn=4の化合物と同じであるが、これは末端に還元糖構造を有する化合物である点で構造上異なる。
特開昭54-163511号公報 米国特許第6596696号明細書
Carbohydrate Research, 343 (2008), 882-892
　医薬組成物、特に糖尿病治療用医薬組成物の有効成分として有用な化合物を提供する。
　α-アミラーゼ阻害薬としては、消化管内で安定性を示す必要がある。消化管内において不安定であることは、その分解産物が吸収され、予期しない副作用を起こす可能性がある。
　本発明者らは、医薬品の探索を目的として、微生物が産生する物質について鋭意検討した結果、ストレプトマイセス属の放線菌6982株が優れたα-アミラーゼ阻害活性を有する化合物を生産することを見い出して本発明を完成した。
　即ち、本発明は、式(I)の化合物又はその塩、式(I)の化合物又はその塩を含有する組成物、式(I)の化合物又はその塩、及び賦形剤を含有する医薬組成物、並びに、式(I)の化合物又はその塩の生産方法に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 (式中、nは、4、5又は6を示す。)
　また、本発明は、培地中で、α－アミラーゼ阻害活性を有する化合物又はその塩を産生するストレプトマイセス属の微生物を培養し、その培養液から当該化合物又はその塩を回収することにより得られた、α－アミラーゼ阻害活性を有し、分子式がＣ94Ｈ156 Ｎ4Ｏ64、Ｃ113Ｈ187Ｎ5Ｏ76、又は、Ｃ132Ｈ218 Ｎ6Ｏ88の化合物（ただし、末端に還元糖構造を有する化合物を除く）又はその塩、及びこれらの化合物又はその塩を含有する組成物に関する。
　さらに、本発明は、式(I)の化合物又はその塩を含有する糖尿病の予防用若しくは治療用医薬組成物、即ち、式(I)の化合物又はその塩を含有する糖尿病治療剤に関する。
　また、本発明は、糖尿病の予防用若しくは治療用医薬組成物の製造のための式(I)の化合物又はその塩の使用、若しくは、糖尿病の予防若しくは治療のための式(I)の化合物又はその塩の使用、並びに、式(I)の化合物又はその塩の有効量を患者に投与することからなる糖尿病の予防用若しくは治療方法に関する。
　式(I)の化合物又はその塩は、α-アミラーゼ阻害作用を有し、糖尿病、肥満、NASH（非アルコール性脂肪肝炎）等の予防若しくは治療剤として使用できる。また、グルコシダーゼ阻害剤とは異なり、下痢等の消化器症状を引き起こさずに糖の吸収阻害が発揮できると期待される。
図１は、化合物Ａの1H-NMRスペクトルを示す。 図２は、化合物Ａの13C-NMRスペクトルを示す。 図３は、化合物Ｂの1H-NMRスペクトルを示す。 図４は、化合物Ｂの13C-NMRスペクトルを示す。 図５は、化合物Ｃの1H-NMRスペクトルを示す。 図６は、化合物Ｃの13C-NMRスペクトルを示す。 図７は、炭水化物負荷時の化合物Ａによる血糖上昇抑制作用を示す。(A)は血糖値の経時変化、(B)はAUCを示す。 図８は、炭水化物負荷時の化合物Ａによるインスリン上昇抑制作用を示す。(A)はインスリン値の経時変化、(B)はAUCを示す。 図９は、化合物ＡのHPLCのクロマトグラムを示す。 図１０は、化合物ＢのHPLCのクロマトグラムを示す。 図１１は、化合物ＣのHPLCのクロマトグラムを示す。
　例えば、本発明の化合物(I)において、nが４の化合物は下式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式(I)の化合物には、幾何異性体が存在しうる。本明細書中、式(I)の化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
　また、式(I)の化合物には、不斉炭素原子に基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、式(I)の化合物の光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
　さらに、本発明は、式(I)で示される化合物の製薬学的に許容されるプロドラッグも包含する。製薬学的に許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解により又は生理学的条件下で、アミノ基、水酸基等に変換されうる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Prog. Med., 5, 2157-2161(1985)や、「医薬品の開発」(廣川書店、1990年)第7巻 分子設計163-198に記載の基が挙げられる。
　また、式(I)の化合物の塩とは、式(I)の化合物の製薬学的に許容される塩であり、酸付加塩を形成する場合がある。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、が挙げられる。
　さらに、本発明は、式(I)の化合物及びその塩の各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形の物質も包含する。また、本発明は、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物も包含する。
　本明細書において、「末端に還元糖を有する化合物」とは、特に限定されないが、例えば、acarbose（アカルボース）、アカルビオスタチンＩ０３、アカルビオスタチンＩＩ０３、アカルビオスタチンＩＩＩ０３、アカルビオスタチンＩＶ０３のように遊離となるアルデヒド基（あるいはケトン基）をもつ糖が末端にある天然物等の化合物が挙げられる。
(生産方法)
　本発明の化合物は、ストレプトマイセス属に属し、かつ該化合物又はその製薬学的に許容される塩の生産能を有する微生物を用いて製造することができる。このような微生物として好ましくは、沖縄県西表島で採取された土壌より分離されたストレプトマイセス属に属するストレプトマイセス エスピ-(Streptomyces sp.)6982株である。本菌株の菌学的性状は次の通りである。
　ストレプトマイセス エスピー6982株は、沖縄県西表島で採集された土壌サンプルから分離された。本菌株の形態、培養性状、生理的性質を調べるための培地および方法は、主にシャーリング、ゴットリーブ(Shirling, E. B. and D. Gottlieb: Methods for characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340, 1966)、および、ワックスマン(Waksman, S. A.: The actinomycetes Vol. 2: Classification, identification and description of genera and species: The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961)に従った。培養温度30℃、培養日数は14日間、培養した後に観察した。
　形態観察は、酵母エキス-デンプン寒天培地において培養した後に、光学および走査型電子顕微鏡で観察することにより判定した。酵母エキス-デンプン寒天は、粉末酵母エキスS(和光純薬製)2.0 g、可溶性デンプン10 g および寒天16 gを含む水道水 1 Lの溶液を、1M NaOH水溶液でpH=7.2に調製した後、オートクレーブで滅菌して調製した。生育温度は、酵母エキス-デンプン寒天で判定した。炭素源の利用性は、プリドハム・ゴットリーブの培地(Pridoham,T.G. and D. Gottlieb: The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an acid for species determination: J. Bacteriol. 56: 107-114,1948)において判定した。
　色名は「メシューエン・ハンドブック・オブ・カラー」( Kornerup, A. and J. H. Wanscher: Methuen Handbook of Colour, Methuen, London, 1978)から引用した。
　細胞壁のアミノ酸の分析は、ベッカーらの方法に従った(Becker, B., M. P. Lechevalier, R. E. Gordon and H. A. Lechevalier: Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates: Appl. Microbiol. 12, 421-423, 1964)。
　16SrDNAの塩基配列は、中川らの方法に従って決定した(中川恭好、川▲崎▼浩子、放線菌の分類と同定 pp. 83-117. 2001年日本放線菌学会編: 東京、日本学会事務センター)。
　相同性検索は、国立遺伝学研究所のウェブサイトのFASTA検索
　(a) http://www. ddbj. nig.ac.jp 
　(b)D. J. Lipman, W. R. Pearson: Rapid and sensitive protein similarity searches, Science, 227, 1435-1441 (1985)　及び
　(c) W. R. Pearson, D. J. Lipman: Improved tools for biological sequence comparison, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)
を用い、基準株の16SrDNA塩基配列は国立遺伝学研究所のデータベース(http:// www.ddbj.nig.ac.jp)より入手した。
　系統樹はClustal Wパッケージを用いて近隣結合法により作成した（Clustal W Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J.: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alighnment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680, 1994)。
　また、ストレプトマイセス エスピー6982株とその近縁株とのDNA相同性は、以下の文献に示される江崎らの方法により確認できる。
　（ａ）Ezaki, T., Hashimoto, Y., Takeuchi, T., Yamamoto, H., Liu, S.-L., Matsui, K & Yabuuchi, E., J Clin Microbiol., 26, (1988) 1708-1713
　（ｂ）Ezaki, T., Hashimoto, Y. & Yabuuchi, E., Int J Syst Bacteriol., 39, (1989) 224-229
　本明細書において「近縁株」とは、ストレプトマイセス エスピー6982株と16SrDNAの塩基配列の相同値が97%以上である菌株をいう。尚、16SrDNAの塩基配列の相同値が97%未満である場合、それらは別種と判断されることが知られている。
　Stackebrandt, E. & Goebel, B. M., Int J Syst Bacteriol., 44, (1994) 846-849
(1)形態的特徴
　基生菌糸はよく発達し、不規則に分枝した。気菌糸は不完全ならせん状を呈し、10個以上の分節胞子連鎖で形成されていた。胞子の表面は平滑、形状は楕円状、サイズは1.2 x 1.0μmであった。菌核、胞子嚢、基生菌糸の断裂、遊走子は観察されなかった。
(2)培養性状
　気菌糸は、酵母エキス-デンプン寒天、酵母エキス-麦芽エキス寒天、オートミール寒天、無機塩-デンプン寒天、グリセリン-アスパラギン寒天上で、良好な着生を示し、チロシン寒天上ではかすかに着生が認められた。ペプトン-酵母エキス-鉄寒天上では気菌糸着生は認められなかった。気菌糸の色は灰色味褐色、褐色味灰色であった。生育裏面の色は黄色味褐色、褐色味ベージュ、灰色味黄色、淡黄色、褐色味橙色、淡橙色であった。トリプトン-酵母エキス培地及びペプトン-酵母エキス-鉄寒天上で、メラノイド色素の産生は認められなかった。可溶性色素の産生が認められなかった。菌体内色素はpHにより変化しなかった。
　これらの各培地上での生育状況を表1に示した。略号は次の意味を示す。G:生育 A:気菌糸 R:生育裏面の色 S:可溶性色素
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
(3)細胞壁タイプ
　全菌体分解物を分析した結果、アミノ酸としてLL-ジアミノピメリン酸の存在が確認できた。
(4)生理学的性質
　D-グルコース、シュークロース、D-キシロース、D-フルクトース、L-ラムノース、ラフィノース、L-アラビノース、イノシトール、D-マンニトールの利用性は陽性であった。表2に、ストレプトマイセス エスピー6982株の生理学的特徴を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
(5)16SrDNA塩基配列による解析
　ストレプトマイセス エスピー6982株の16SrDNA部分塩基配列を、後記配列表に示した。相同性検索の結果、相同値が99.2 ％であるストレプトマイセス グラウセセンス DSM40716株(Accession No:X79322)が最も近縁な株であった。また、ストレプトマイセス属の基準種の基準株であるストレプトマイセス アルブス NBRC 13014株(Accession No: AB184257)との相同値は、96.2 ％であった。また、16SrDNA部分塩基配列により作成した系統樹では、ストレプトマイセス各種と同一のクラスターを形成した。
(6)同定
　下記文献(a)～(d)を参考に、形態観察、化学分析および16SrDNA塩基配列による解析の結果から、本菌株はストレプトマイセス属に属すると考えられる。
(a)Euzeby, J.P.: List of Bacterial names with standing in nomenclature: a folder available on the internet. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47, pp.590-592.
(b) Waksman, S.A., et al.: The nomenclature and classification of the actinomycetes. Journal of Bacteriology, 1943, 46, pp.337-341.
(c) Williams, S. T:　Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,　Vol. 4. 1989.
(d) Zhang, Z.et al.: A proposal to revive the genus Kitastospora　Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47, pp.1048-1054.
　そこで本菌株をストレプトマイセス エスピー 6982株と命名した。本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-10802 (受託日2007年3月22日)として国際寄託されている。
　また、微生物は人工的に又は自然に変異を起こすので、本発明ストレプトマイセス エスピー6982株は、天然から分離された微生物の他に、これを紫外線、X線、化学薬剤などで人工的に変異させたもの及びそれらの天然変異株についても包含する。
　本発明のアミノ糖誘導体は、ストレプトマイセス属に属しかつα-アミラーゼ活性を有する化合物の生産能を有する微生物、好ましくは、当該アミノ糖誘導体生産能を有する微生物、さらに好ましくはストレプトマイセス エスピー6982株を、栄養源を含有する培地に接種し好気的に発育させることにより得ることが出来る。
　培養に用いられる培地は、使用する微生物が生育可能な培地であればよく、合成培地、半合成培地あるいは天然培地を用いることができる。
　栄養物としては、本発明の菌株が資化する栄養源を使用すればよい。例えば、窒素源としては、きな粉、脱脂大豆粉、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、乾燥酵母、ＮＺ-アミン、カゼインの水解物、魚粉、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無機または有機の窒素源が使用できる。炭素源としては、ポテトスターチ、コーンスターチなどのデンプン、糖蜜、デキストリン、ショ糖、グルコース、マルトース、トレハロース、フラクトース、キシロース、ラムノース、マンニトール、グリセリン等の炭水化物あるいは脂肪等が使用できるが、好ましくはデンプン及びきな粉である。
　また金属塩として、Na、K、Mg、Ca、Zn、Fe等の硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩等が必要に応じて添加されるが、好ましくは炭酸カルシウム及び／又は塩化ナトリウムである。さらに必要に応じて通常知られているアミノ酸類や、オレイン酸メチル、ラード油、シリコーン油、界面活性剤等の生成促進化合物または消泡剤が適宜使用される。これらのもの以外でも、該生産菌が利用し、本発明化合物の生産に役立つものであれば所望により使用することができる。
　培養は、一般の抗生物質製造における培養と同様に行えばよく、その培養方法は固体培養でも液体培養でもよい。液体培養の場合は静置培養、振とう培養、攪拌培養のいずれを実施してもよく、例えば、通気攪拌培養で実施してもよい。培養条件として、培養温度は生産菌が発育し、本発明の化合物を生産しうる温度、すなわち１５～４２℃の範囲で適宜適用できるが約２０～３０℃が好ましく、２３～２７℃がより好ましい。pHは4～9の範囲で適宜適用できるが、6～8が好ましい。培養時間は種々の条件によって異なり、通常1～30日の範囲で適宜適用できるが、4～10日が好ましい。
　培養物から目的とする化合物を単離するには、微生物の代謝産物を単離する際に用いる通常の抽出、分離、精製の手段が適宜利用できる。培養物中の該物質は培養液をそのままか、又は遠心分離あるいは培養物にろ過助剤を加えてろ過によってろ液を得る。この際、培養液にアセトン、MeOH、EtOH、MeCNなどの有機溶剤を加えても良く、所望によりpH調節のため塩酸等を加えてもよい。また、ろ液を適宜の担体に接触させ、ろ液中の生産物質を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより該物質を分離することができる。例えば、アンバーライト(登録商標)XAD2、ダイヤイオン(登録商標)HP20、ダイヤイオンCHP20P、又はダイヤイオンSP850のような多孔性吸着樹脂に接触させて該物質を吸着させる。次いで、アセトン、MeOH、EtOH、MeCN等の有機溶媒と水の混合液を用いて該物質を溶出させる。所望によりpH調節のため塩酸等を加えてもよい。このときの有機溶媒の混合比率を低濃度より段階的に又は連続的に高濃度まで上げていくことにより、該物質を含む画分を効率よく得ることができる場合がある。
　本願化合物において、還元糖化合物などの不安定で単品として単離しにくい化合物を除去するために、塩基を加えて精製した。また、医薬としての純度を確保するために、繰り返し精製した。
　式(I)の化合物は、遊離化合物、その塩、水和物、溶媒和物、あるいは結晶多形の物質として単離され、精製される。式(I)の化合物の塩は、常法の造塩反応に付すことにより製造することもできる。単離、精製は、抽出、分別結晶化、各種分画クロマトグラフィー等、通常の化学操作を適用して行なわれる。
　本明細書において、「回収」とは、本発明化合物（Ｉ）を単体でもしくは組成物として入手するために行われる操作を意味し、「精製」や「単離」を含む。
　本明細書において、「精製」には、本発明化合物を「単離」することを目的として行われる操作を含み、「精製」により本発明化合物が「単離」されてもよい。
　各種の異性体は、適当な原料化合物を選択することにより製造でき、あるいは異性体間の物理化学的性質の差を利用して分離することができる。例えば、光学異性体は、ラセミ体の一般的な光学分割法(例えば、光学活性な塩基又は酸とのジアステレオマー塩に導く分別結晶化や、キラルカラム等を用いたクロマトグラフィー等)により得ることもできる。
　本明細書において、「クロマトグラフィー」とは、分析化学において汎用されるクロマトグラフィーを意味し、特に限定されないが、例えば、ガスクロマトグラフィー(GC)、液体クロマトグラフィー(LC)、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)等を含む。
　本明細書において、「液体クロマトグラフィー(LC)」とは、移動層に液体を用いるクロマトグラフィーの総称を意味し、特に限定されないが、例えば、中速液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等を含む。
　式（Ｉ）の化合物又はその塩を含有する組成物は、式（Ｉ）の化合物を精製若しくは単離する段階において得られる組成物をいい、医薬の製造原体として使用し得るものをいう。特に限定されないが、例えば、１種又は２種以上の式(I)の化合物又はその塩と、アカルビオスタチンＩＶ０３等の活性成分若しくは他の成分との混合物である。また、本組成物は、これに限定されるものではないが、クロマトグラフィーによる分析で式(I)の化合物又はその塩を面積百分率で約80 %以上、好ましくは、85 %以上、より好ましくは、90 %以上、更に好ましくは、95 %以上、更に好ましくは、98 %以上含有するものが好ましい。
　式(I)の化合物又はその塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
　投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
　経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、1種又は2種以上の有効成分を、少なくとも1種の不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、及び／又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等のような崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
　経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はEtOHを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
　非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はオリーブ油のような植物油、EtOHのようなアルコール類、又はポリソルベート80(局方名)等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通すろ過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。
　外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ロ-ション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。例えば、軟膏又はロ-ション基剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、サラシミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノーステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウロマクロゴール、セスキオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
　吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体又は半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば公知の賦形剤や、更に、pH調製剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
　通常経口投与の場合、1日の投与量は、体重当たり約0.01～100 mg/kg、好ましくは0.1～10 mg/kgが適当であり、これを1回であるいは2回～4回に分けて投与する。また、経粘膜剤としては、体重当たり約0.001～100 mg/kgを1日1回～複数回に分けて投与する。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
　式(I)の化合物は、前述の式(I)の化合物が有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療剤又は予防剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
　以下、実施例に基づき、式(I)の化合物の製造法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、下記実施例に記載の化合物に限定されるものではない。また、式(I)の化合物の製造法は、以下に示される具体的実施例の製造法のみに限定されるものではなく、式(I)の化合物はこれらの製造法の組み合わせ、あるいは当業者に自明である方法によっても製造されうる。
本明細書において以下の略号を用いることがある。
EtOH:エタノール
MeCN:アセトニトリル
MeOH:メタノール
NaCl：塩化ナトリウム
NaOH：水酸化ナトリウム
TFA：トリフルオロ酢酸
　以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって何等限定されるものではない。
実施例１
(培養)
　種培地は、100 mL容の三角フラスコに、可溶性デンプン 20 g、パインデックス＃3(松谷化学社製) 10 g、きな粉 20 gおよび蒸留水1 Lを含む培地(pH=7.0)を、30 mLずつ分注し、121℃で30分間オートクレーブで滅菌することにより調製した。
　この種培地に、ストレプトマイセス エスピー6982株の斜面培養物を、1白金耳分接種し、30℃で3日間、振とう培養した。
　生産培地は、100 mL容の三角フラスコに、可溶性デンプン 100 g、きな粉 60 g、NaCl 2.5 g、CaCO3 2 gおよび蒸留水1 Lを含む培地(pH=7.0)を、30 mLずつ分注し、121℃で30分間オートクレーブで滅菌することにより調製した。
　この生産培地に、前記の種培養液を、各フラスコに2 mLずつ接種し、25℃で7日間振とう培養した。
培養液からの粗精製
　上記の培養方法により得られた培養液22 Lを6 M HCl水溶液でpH=3に調製した後、吸引ろ過した。ろ液を6 M NaOH水溶液でpH=7に調製した後、ダイヤイオンHP20(樹脂量1.2 L)を用いて、10% MeOH水溶液で洗浄した後、25% MeOH水溶液で溶出した。
　この活性画分を、DOWEX 50W X1 (ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー社製)陽イオン交換樹脂(樹脂量 550 mL)を用いて、蒸留水、0.5Mおよび1M NaCl水溶液で洗浄した後、3M NaCl水溶液で溶出した。
　次いで、ダイソーゲルSP-120-15/30-ODS-B(樹脂量1 L、ダイソー社製)を用いて、10%、15% MeOH水溶液で溶出することで、化合物A、Bをそれぞれ得、20% 及び25% MeOH水溶液で溶出することで、化合物Cを得た。
(1)化合物Aの精製・単離
　前記のODSカラムクロマトグラフィーで精製して得られた化合物Aを含む活性画分を、SP-120-15/30-ODS-B(樹脂量337 mL)を用いて、2％、3％ MeOH水溶液(0.05% TFA含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M NaOH水溶液でpH=13に調製し、ダイヤイオンHP20SS(樹脂量500 mL)を用いて、12.5%、15% MeOH水溶液(0.05 M NaOH含有)で溶出した。
　活性画分を6 M HCl水溶液でpH=7に調製し、ダイヤイオンHP20(樹脂量200 mL)を用いて、50% MeOH水溶液で溶出した。溶出区を減圧濃縮した後、凍結乾燥し、1.14gの粉末を得た。
　水に溶解した200mgの上記粉末を、ダイソーパックSP-120-5-ODS-BP(20 x 250mm、ダイソー社製)を用いて、2% MeCN水溶液(0.05% TFA含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M NaOH水溶液でpH=7に調製し、ダイヤイオンHP20(樹脂量50 mL)に供し、50% MeOH水溶液で溶出した。溶出区を減圧濃縮した後、凍結乾燥し、136mgの粉末を得た。
　水に溶解した上記粉末を再度ダイソーパックSP-120-5-ODS-BP(20 x 250mm）を用いて、2% MeCN水溶液(0.05% TFA含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M NaOH水溶液でpH=7に調製し、ダイヤイオンHP20(樹脂量30 mL)を用いて、50% MeOH水溶液で溶出した。
　得られた活性画分を減圧濃縮した後、凍結乾燥して化合物A (65 mg)を得た。
(2)化合物Bの精製・単離
　前記のODSカラムクロマトグラフィーで粗精製することにより得られた画分を、SP-120-15/30-ODS-B(樹脂量337 mL)を用いて、3%から7%までのMeOH水溶液(0.05% TFA含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M NaOH水溶液でpH=13に調製し、ダイヤイオンHP20SS(樹脂量250 mL)を用いて、15%、17.5%、20% MeOH水溶液(0.05M NaOH含有)で溶出した。
　この活性画分を6M HCl水溶液でpH=7に調製し、ダイヤイオンHP20(樹脂量150 mL)を用いて、50% MeOH水溶液で溶出した。溶出区を減圧濃縮した後、凍結乾燥し、970mgの粉末を得た。
　水に溶解した450mgの上記粉末を、ダイソーパックSP-120-5-ODS-BP(20 x 250mm）を用いて、2.2％ MeCN水溶液(0.05% TFA含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M NaOH水溶液でpH=7に調製し、ダイヤイオンHP20(樹脂量115 mL)を用いて、50% MeOH水溶液で溶出した。溶出区を減圧濃縮した後、凍結乾燥し、190mgの粉末を得た。
　水に溶解した上記粉末を、再度ダイソーパックSP-120-5-ODS-BP(20 x 250mm）に供し、2.2% MeCN水溶液(0.05% TFA含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M NaOH水溶液でpH=7に調製し、ダイヤイオンHP20(樹脂量30 mL)を用いて、50% MeOH水溶液で溶出した。
　この活性画分を減圧濃縮した後、凍結乾燥して化合物Ｂ(129 mg)を得た。
(3)化合物Cの精製・単離
　前記のODSカラムクロマトグラフィーで粗精製することにより得られた画分をSP-120-15/30-ODS-B(樹脂量80 mL)を用いて、2% MeOH水溶液(0.05% TFA含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M NaOH水溶液でpH=13に調製し、ダイヤイオンHP20SS(樹脂量200 mL)を用いて、15%、17.5%、20% MeOH水溶液(0.05 M NaOH含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M HCl水溶液でpH=7に調製し、ダイヤイオンHP20(樹脂量150 mL)を用いて、50% MeOH水溶液で溶出した。溶出区を減圧濃縮した後、凍結乾燥し、1gの粉末を得た。
水に溶解した上記粉末を、ダイソーパックSP-120-5-ODS-BP(20 x 250mm）を用いて、2.2％から3.2％までのMeCN水溶液(0.05% TFA含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M NaOH水溶液でpH=7に調製し、ダイヤイオンHP20(樹脂量30 mL)を用いて、50% MeOH水溶液で溶出した。溶出区を減圧濃縮した後、凍結乾燥し、236mgの粉末を得た。
　水に溶解した184mgの上記粉末を、再度ダイソーパックSP-120-5-ODS-BP(20 x 250mm）を用いて、2.2% MeCN水溶液(0.05% TFA含有)で溶出した。
　この活性画分を6 M NaOH水溶液でpH=7に調製し、ダイヤイオンHP20(樹脂量30 mL)を用いて、50% MeOH水溶液で溶出した。
　得られた活性画分を減圧濃縮した後、凍結乾燥することにより化合物Ｃ(91 mg)を得た。
化合物A,B及びCの物理化学的性質
　上記抽出、分離、精製された化合物A、BおよびCは、それぞれ以下の物理化学的性質を有した。
(１)化合物Ａ
１)色及び形状：白色粉末。
２)酸性、中性、塩基性の区分：塩基性。
３)比旋光度：［α］23 D +157°(c=0.5、H2O)
４)分子式：Ｃ94Ｈ156 Ｎ4Ｏ64
５)高分解能ＴＯＦ-マススペクトル：実測値　［M+2H]2+　1183.4624
　　　　　　　　　　　　　　　　　理論値　［M+2H]2+　1183.4616
６)元素分析：Ｃ94Ｈ156 Ｎ4Ｏ64 14H2Oとして
　計算値：Ｃ 43.12, Ｈ 7.08, Ｎ 2.14,
　実測値：Ｃ 43.27, Ｈ 7.08, Ｎ 2.05
７)溶解性：水、DMF、DMSOにはよく溶けるが、アセトン、MeOH、EtOH、MeCNにはほとんど溶けない。
８)紫外部吸収スペクトル(溶剤：水)：末端吸収を示す
９)赤外部吸収スペクトル(νmax (KBr)cm-1)：3330, 2925, 1655, 1385, 1150, 1040, 935
１０)1H-NMRスペクトル(500MHz，D2O)：図１に示す。
１１)13C-NMRスペクトル(125MHz，D2O)：図２に示す。
(２)化合物Ｂ
１)色及び形状：白色粉末。
２)酸性、中性、塩基性の区分：塩基性。
３)比旋光度：［α］23 D +153°(c=0.5、H2O)
４)分子式：Ｃ113Ｈ187Ｎ5Ｏ76
５)高分解能ＴＯＦ-マススペクトル：実測値　［M+2H]2+　1416.0548
　　　　　　　　　　　　　　　　　理論値　［M+2H]2+　1416.0539
６)元素分析：Ｃ113Ｈ187 Ｎ5Ｏ76 16H2Oとして
　計算値：Ｃ 43.50, Ｈ 7.08, Ｎ 2.24,
　実測値：Ｃ 43.53, Ｈ 7.09, Ｎ 2.15
７)溶解性：水、DMF、DMSOにはよく溶けるがアセトン、MeOH、EtOH、MeCNにはほとんど溶けない。
８)紫外部吸収スペクトル(溶剤：水)：末端吸収を示す。
９)赤外部吸収スペクトル(νmax(KBr)cm-1)：3365, 2930, 1640, 1385, 1150, 1045, 935
１０)1H-NMRスペクトル(500MHz，D2O)：図３に示す。
１１)13C-NMRスペクトル(125MHz，D2O)：図４に示す。
(３)化合物Ｃ
１)色及び形状：白色粉末。
２)酸性、中性、塩基性の区分：塩基性。
３)比旋光度：［α］23 D +172°(c=0.5、H2O)
４)分子式：Ｃ132Ｈ218 Ｎ6Ｏ88
５)高分解能ＴＯＦ-マススペクトル：実測値　［M+2H]2+　1648.6467
　　　　　　　　　　　　　　　　　理論値　［M+2H]2+　1648.6462
６)元素分析：Ｃ132Ｈ218 Ｎ6Ｏ88 16H2Oとして
　計算値：Ｃ 44.22, Ｈ 7.03, Ｎ 2.34,
　実測値：Ｃ 44.23, Ｈ 7.09, Ｎ 2.35
７)溶解性：水、DMF、DMSOにはよく溶けるがアセトン、MeOH、EtOH、MeCNにはほとんど溶けない。
８)紫外部吸収スペクトル(溶剤：水)：末端吸収を示す。
９)赤外部吸収スペクトル(νmax (KBr)cm-1)：3365, 2925, 1635, 1340, 1150, 1040, 935
１０)1H-NMRスペクトル(500MHz，D2O)：図５に示す。
１１)13C-NMRスペクトル(125MHz，D2O)：図６に示す。
前記の物理化学的性質から化合物A、B及びCの化学構造を、下記のように決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 式中、化合物A：n＝４；化合物B：n＝５；及び化合物C：n＝６。
　又、上記方法にて製造した化合物A、B、Cを、以下の条件により高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法で分析すると、化合物A、B、Cの面積百分率(%)は、それぞれ99.0%、98.2%、98.3%であった。尚、面積百分率(%)は、保持時間が6分から22分の間にクロマトグラム上に得られた各成分のピーク面積の総和を100とし、それに対するそれぞれの成分のピーク面積の比から求めた。化合物Ａから化合物ＣのHPLCのクロマトグラムを図９から図１１に示す。
１）カラム：Unison US-C18 250-4.6mm （インタクト社製）
２）移動相：1-7 % MeCN水溶液（0.05% TFA含有）（0-20分）
３）流速：1.0 ml/分
４）検出：UV、210nm
５）カラム温度：50℃
６）保持時間：化合物A　16.3分、化合物B　17.9分、化合物C　19.2分
（参考文献：化学便覧　応用化学編　第六版（丸善）、第８章　分析・計測・管理、P.342～346）
実施例２
　本発明化合物のα-アミラーゼ阻害活性は以下の方法で確認した。
(１)実験方法
　マウス、ラット、イヌ及びサル膵臓α-アミラーゼ溶液はICRマウス(雄、8週齢、日本SLCより購入)、SDラット(雄、8週齢、日本チャールスリバーより購入)、ビーグルイヌ(雄、35ヶ月齢、株式会社ナルクより購入)及びカニクイザル(雄、10歳、日本クレアより購入)膵臓より調製した。ヒト唾液及び膵臓α-アミラーゼ溶液はSigma-Aldrich Co.より購入した酵素より調製した。これらのα-アミラーゼ溶液は全てアッセイバッファー(48 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 28 mM Na2HPO4, 43 mM NaH2PO4, 35 mM マンニトール, pH=7.0)を用いて800 U/mLになるように希釈調製した。96-wellマイクロプレートに各種α-アミラーゼ溶液 (20 U, 25 μL)及びアッセイバッファーで溶解調製した化合物 (25 μL)を添加して37℃、10分間インキュベーションした。その後，デンプン溶液 (5 mg/mL, 50 μL)を添加して10分間、37℃でインキュベーションした。0.33 M過塩素酸溶液 (50 μL)を添加して酵素反応を停止させた後、0.01 Mヨウ素溶液(50 μL)を添加して呈色させ、吸光度(660 nm)を測定した。α-アミラーゼ活性を50%阻害する化合物の濃度をIC50値として算出した。
(２)結果
　本発明化合物は検討を行った全ての種のα-アミラーゼに対して阻害活性を有し，化合物A、B及びCのマウス膵臓α-アミラーゼに対する阻害活性(IC50値)はそれぞれ、1.90 nM、2.06 nMおよび1.73 nMであり、ラット膵臓α-アミラーゼに対する阻害活性(IC50値)はそれぞれ、2.01 nM、2.12 nM及び1.95 nMであり、イヌ膵臓α-アミラーゼに対する阻害活性(IC50値)はそれぞれ、2.06 nM、2.38 nMおよび2.07 nMであり、サル膵臓α-アミラーゼに対する阻害活性(IC50値)はそれぞれ、2.14 nM、1.90 nMおよび2.02 nMであり、ヒト唾液α-アミラーゼに対する阻害活性(IC50値)はそれぞれ、2.20 nM、1.87 nMおよび1.99 nMであり、ヒト膵臓α-アミラーゼに対する阻害活性(IC50値)はそれぞれ、2.02 nM，2.11 nMおよび2.21 nMであった。
実施例３
　本発明化合物の経口活性を以下の方法で確認した。
(1)実験方法
　動物は雄性ICR(正常)マウス(6週齢、日本SLCより購入)を使用した。化合物は0.5% メチルセルロース溶液を用いて溶解液を調製した。一晩絶食させたマウスより血糖値及び血漿インスリン値測定用採血を行い、溶媒もしくは化合物Ａ(0.3, 1, 3, 10 mg/kg)を経口投与し、直ちに炭水化物溶液(75 mg/mLデンプン，25 mg/mLスクロース，20 mL/kg)を経口投与した。次いで、0.25、0.5及び1時間後に血漿インスリン値測定用採血を、0.5、1及び2時間後に血糖値測定用採血を行った。
　血糖値はグルコースCII-テストワコー試薬(和光純薬)を用いて、血漿インスリン濃度はマウスインスリンELISAキット(株式会社シバヤギ)を用いてそれぞれ測定した。試験結果は平均値±標準誤差で示した。
　化合物投与後2時間までの血糖値より血糖値-時間曲線下面積 (AUC)を、1時間までの血漿インスリン値より血漿インスリン値-時間AUCを算出して、溶媒投与群と化合物Ａ投与群間でDunnett's multiple range testを用いて検定を行い、危険率5% 未満を有意とした。
(2)結果
　化合物Ａ (0.3から10 mg/kg)の経口投与により用量依存的な血糖上昇抑制作用が認められ、その作用は1 mg/kg以上の用量において有意であった(図7)。この時、用量依存的かつ有意な血漿インスリン値の低下作用も併せて認められた(図8)。
実施例４
　本発明化合物の二糖類水解酵素阻害活性を以下の方法で確認した。
（１）実験方法
　ICRマウス、SDラット、ビーグルイヌ及びカニクイザル小腸より作製した刷子縁標本、ヒト小腸マイクロソーム標本 (BD Biosciences; Lot 36869)を各種の二糖類水解酵素液とした。これらの二糖類水解酵素液及び化合物は全てphosphate buffer (NaCl 48 mM, KCl 5.4 mM, Na2HPO4 28 mM, NaH2PO4 43 mM, mannitol 35 mM, pH=6.0)を用いて調製した。
　マウス、ラット、イヌ及びサル二糖類水解酵素阻害活性評価：96-wellマイクロプレ－トに二糖類水解酵素液（10 mg/mL, 40 μL）及び化合物溶液 (20 μL)を添加して37℃，10分間インキュベ－ションを行った。その後、二糖類水解酵素基質（スクラーゼ：100 mM スクロース，マルターゼ：100 mM マルトース，イソマルターゼ：100 mM イソマルトース，ラクターゼ：100 mM ラクトース，トレハラーゼ：100 mM トレハロース, 40 μL）を添加して30分間、37℃でインキュベ－ションを行った。0.04 M過塩素酸溶液 (100 μL)を添加して反応停止後、遠心分離 (2,000 rpm, 15分)を行い、上清中のグルコース濃度をグルコ－スCII-テストワコ－試薬（和光純薬）を用いて測定した。酵素非添加 (0%)及び化合物非添加 (100%)より二糖類水解酵素阻害活性を算出した。
　ヒト二糖類水解酵素阻害活性評価：96-wellマイクロプレ－トに二糖類水解酵素液 (0.1 mg/mL, 20 μL)及び化合物溶液 (10 μL)を添加して37℃、10分間インキュベ－ションを行った。その後，二糖類水解酵素基質（スクラーゼ：100 mM スクロース，マルターゼ：100 mM マルトース，イソマルターゼ：100 mM イソマルトース，ラクターゼ：100 mM ラクトース，トレハラーゼ：100 mM トレハロース, 20 μL）を添加して30分間、37℃でインキュベ－ションを行った。0.04 M過塩素酸溶液 (100 μL)を添加して反応停止後、遠心分離 (2,000 rpm, 15分)を行い、上清中のグルコース濃度をグルコ－スCII-テストワコ－試薬（和光純薬）を用いて測定した。酵素非添加 (0%)及び化合物非添加 (100%)より二糖類水解酵素阻害活性を算出した。
（２）結果
　本発明化合物は検討を行った全ての種の二糖類水解酵素（スクラーゼ，マルターゼ，イソマルターゼ，ラクターゼ及びトレハラーゼ）に対して阻害活性を示さなかった (IC50＞10 μM)。
　上記試験の結果、式(I)の化合物はα-アミラーゼ阻害、血糖値及び血漿インスリン値の低下作用を有することが確認され、糖尿病等の治療等に使用できることが確認された。
　式(I)の化合物又はその塩は、α-アミラーゼ阻害作用を有し、糖尿病、肥満、NASH（非アルコール性脂肪肝炎）等の予防若しくは治療剤として使用できる。また、グルコシダーゼ阻害剤と異なり、下痢等の消化器症状を引き起こさずに糖の吸収を阻害できると期待される。
　ストレプトマイセス エスピー6982株の16SrDNA部分塩基配列を配列表に示す。
[規則26に基づく補充 19.05.2009]　
Figure WO-DOC-RO134

Claims (18)

  1. 式(I)の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     (式中、ｎは、４から６である。)
  2. 培地中で、α－アミラーゼ阻害活性を有する化合物又はその塩を産生するストレプトマイセス属の微生物を培養し、その培養液から当該化合物又はその塩を回収することにより得られた、α－アミラーゼ阻害活性を有し、分子式がＣ94Ｈ156 Ｎ4Ｏ64、Ｃ113Ｈ187Ｎ5Ｏ76、又は、Ｃ132Ｈ218 Ｎ6Ｏ88の化合物（ただし、末端に還元糖構造を有する化合物を除く）又はその塩。
  3. ストレプトマイセス属の微生物が、ストレプトマイセス エスピー6982株(FERM BP-10802号)である請求項２記載の化合物（ただし、末端に還元糖構造を有する化合物を除く）又はその塩。
  4. 寄託番号がFERM BP-10802号であるストレプトマイセス(Streptomyces)属の放線菌、ストレプトマイセス エスピー(Streptomyces sp.)6982株およびその変異株。
  5. ストレプトマイセス属の微生物の培養液から、精製若しくは単離された式(I)の化合物又はその塩を含有する組成物。
  6. ストレプトマイセス属の微生物が、ストレプトマイセス エスピー6982株(FERM BP-10802号)である請求項５記載の組成物。
  7. クロマトグラフィーによる分析で、式（I）の化合物又はその塩を面積百分率で約80%以上含有することを特徴とする組成物。
  8. クロマトグラフィーによる分析で、式（I）の化合物又はその塩を面積百分率で約80%以上含有することを特徴とする請求項５記載の組成物。
  9. クロマトグラフィーによる分析で、式（I）の化合物又はその塩を面積百分率で約80%以上含有することを特徴とする請求項記６載の組成物。
  10. 培地中で、α－アミラーゼ阻害活性を有する化合物を産生するストレプトマイセス属の微生物を培養し、その培養液から当該化合物を回収することを含む、α－アミラーゼ阻害活性を有し、分子式がＣ94Ｈ156 Ｎ4Ｏ64、Ｃ113Ｈ187Ｎ5Ｏ76、又は、Ｃ132Ｈ218 Ｎ6Ｏ88の化合物（ただし、末端に還元糖構造を有する化合物を除く）又はその塩の生産方法。
  11. ストレプトマイセス属の微生物が、ストレプトマイセス エスピー6982株(FERM BP-10802号)である請求項１０記載の生産方法。
  12. ストレプトマイセス属の微生物の培養液から、精製若しくは単離することを特徴とする式(I)の化合物又はその塩の生産方法。
  13. ストレプトマイセス属の微生物が、ストレプトマイセス エスピー6982株(FERM BP-10802号)である請求項１２記載の生産方法。
  14. 請求項１に記載の化合物又はその塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
  15. 請求項１に記載の化合物又はその塩を含有する糖尿病の予防用若しくは治療用医薬組成物。
  16. 糖尿病の予防若しくは治療用医薬組成物の製造のための請求項１に記載の化合物又はその塩の使用。
  17. 糖尿病の予防若しくは治療のための請求項１に記載の化合物又はその塩の使用。
  18. 請求項１に記載の化合物又はその塩の有効量を患者に投与することからなる糖尿病の予防若しくは治療方法。
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