JPH08208475A - 新用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ２−イミノピペリジンまたはその医薬として
許容される塩を有効成分として含有することを特徴とす
る一酸化窒素産生阻害剤。 【効果】 ２−イミノピペリジンまたはその医薬として
許容される塩は強い一酸化窒素産生阻害作用を有し、か
つ毒性が低いため一酸化窒素産生阻害剤として有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、２−イミノピペリジ
ンまたはその医薬として許容される塩の製造方法、また
はそれらを有効成分として含有する一酸化窒素（ＮＯ）
産生阻害剤に関するものであり、医療の分野で利用され
る。

【０００２】

【従来の技術】この発明の２−イミノピペリジン・塩酸
塩は合成試薬として市販されている公知物質であるが、
２−イミノピペリジンまたはその医薬として許容される
塩の微生物由来の発酵による製造方法および一酸化窒素
（ＮＯ）産生阻害作用を有する事は知られていない。

【０００３】

【発明の構成】この発明は、２−イミノピペリジンまた
はその医薬として許容される塩の製造方法、またはそれ
らを有効成分として含有する事を特徴とする一酸化窒素
（ＮＯ）産生阻害剤に関する。２−イミノピペリジンま
たはその医薬として許容される塩は、化学合成によって
製造される以外にも、たとえば、下記に示されるように
本発明者らがニュージーランドで採取した土壌サンプル
から新たに分離した微生物ストレプトミセス・アトロオ
リバセスＮｏ．７０７５７株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ Ｎｏ．７０７５７）
によって生産する事ができる。以下に、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ Ｎｏ．７０
７５７株の菌学的性質を示す。

【０００４】Ｎｏ．７０７５７の菌学的性質 Ｎｏ．７０７５７株はニュージーランドで採集した土壌
サンプルから分離された。本菌株の形態、培養性状、生
理的性質を調べるための培地、方法は、主にシャーリン
グとゴットリーブ⁽¹⁾、ワックスマン⁽²⁾に従った。それ
ぞれの培養は３０℃で１４日間行った後、観察した。形
態観察は酵母エキス・麦芽エキス寒天、オートミール寒
天、無機塩・でんぷん寒天で培養後、光学及び走査型電
子顕微鏡で観察した。炭素源の利用性はプリドハムとゴ
ットリーブの培地⁽³⁾を用いた。色名は”メシューエン
・ハンドブック・オブ・カラー”⁽⁴⁾から引用した。細
胞壁のアミノ酸はベッカー等⁽⁵⁾、山口⁽⁶⁾の方法に従っ
た。本菌株の凍結乾燥サンプルは、工業技術院生命工学
工業技術研究所（茨城県つくば市東１−１−３）に寄託
されている。（寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−４９７２；寄
託日：１９９５年１月１８日）

【０００５】（１）形態的特徴 基生菌糸はよく発達し、不規則に分枝するが断裂しな
い。基生菌糸から伸長した気菌糸は単純分枝し、長い胞
子鎖を形成する。気菌糸の形は、直状、曲状、波状でプ
リドハム等の分類⁽⁷⁾のＲＦタイプに属する。１つの胞
子連鎖は２０個以上の胞子からなる。胞子は表面が平滑
で、０．５−０．７×０．５−０．７μｍの大きさの円
筒型であった。菌核、胞子嚢、遊走子は観察されなかっ
た。 （２）培養性状 結果を表１に示す。気菌糸の色は淡灰色から灰色、生育
裏面の色は暗灰色、オリーブ、オリーブ灰色を呈する。
菌体内色素はｐＨ感受性ではない。可溶性色素およびメ
ラノイド色素の産生はみられなかった。 （３）細胞壁タイプ 全菌体分解物の分析の結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸
の存在が確認できた。従って本菌株の細胞壁タイプはＩ
型と考えられる。 （４）生理的性質 表２に示すように多くの炭素源を利用でき、澱粉の加水
分解活性は陽性であった。 （５）同定 形態観察及び化学分析の結果からＮｏ．７０７５７株は
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属
すると考えられる⁽⁷⁾。そこで本菌株を文献に記載され
たストレプトミセス属の種と比較した^(8)-(12)。その結
果、ストレプトミセス・アトロオリバセウス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）の記
載上の性質と本株の性質は殆ど同一であった。そこで本
菌株をストレプトミセス・アトロオリバセウスＮｏ．７
０７５７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｔｒｏｏｌｉ
ｖａｃｅｕｓ Ｎｏ．７０７５７）株と命名した。

【０００６】

【表１】

【０００７】

【表２】

【０００８】引用文献 (１) Shirling, E. B. and D. Gottlieb: Methods for
characterization ofStreptomyces species. Int. J.
Syst. Bacteriol. 16, 313−340, 1966 (２) Waksman, S. A.: The actinomycetes Vol. 2: Cl
assification,identification and description of gen
era and species: TheWilliams and Wilkins Co,. Balt
imore, 1961 (３) Pridoham, T. G. and D. Gottlieb: Theutilizat
ion of carboncompounds by some Actinomycetales as
an acid for speciesdetermination: J. Bacteriol. 5
6: 107−114, 1948 (４) Kornerup, A. and J. H. Wanscher: Methuen Han
dbook of Colour,Methuen, London, 1978 (５) Becker, B., M. P. Lechevalier, R. E. Gordon
and H. A. Lechevalier:Rapid differentiation betwee
n Nocardia and Streptomyces by paperchromatography
of whole-cell hydrolysates: Appl. Microbiol. 12,4
21−423, 1964 (６) Yamaguchi, T.: Comparison of the cell wall c
omposition ofmorphologically distinct actinomycete
s: J. Bacteriol. 89.444−453,1965 (７) Pridham, T. G., et al.: Appl. Microbiol. 6:
54, 1958 (８) Shirling, E. B. and D. Gottlieb: Cooperative
discription of typeculture of Streptomyces. 2. Sp
iecies descriptions from firststudy. Intern. J. Sy
st. Bacteriol. 18: 69−189, 1968 (９) Shirling, E. B. and D. Gottlieb: Cooperative
discription of typeculture of Streptomyces. 3. Ad
ditional spiecies descriptions fromfirst and secon
d studies. Intern. J. Syst. Bacteriol. 18: 279−39
2,1968 (10) Shirling, E. B. and D. Gottlieb: Cooperative
discription of typeculture of Streptomyces. 4. Sp
iecies descriptions from second,third and forth st
udies. Intern. J. Syst. Bacteriol. 19: 391−512,19
69 (11) Skerman, V. B., V. McGowan and P. H. A. Snea
th: Approved list ofbacterial names. Intern. J. Sy
st. Bacteriol. 30: 225−420, 1980 (12) Moore, W. E., E. P. Cato and L. V. H. Moore:
Index of bacterialand Yeast Nomencultural Changes
Published in the I. J. S. B.Since the 1980 Approv
ed List of Bacterial Names Intern. J. Syst.Bacteri
ol. 35: 382−407, 1985

【０００９】２−イミノピペリジンまたはその医薬とし
て許容される塩の生産は、単に説明を目的として挙げた
だけの本明細書記載の特定の微生物の使用に限定される
ものではないことを理解すべきである。この発明は、記
載の微生物からＸ線照射、紫外線照射、Ｎ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプ
リン等の変異処理により取得できる人工変異株並びに自
然変異株を含めて２−イミノピペリジンまたはその医薬
として許容される塩を生産しうる全ての変異株の使用を
も包含するものである。

【００１０】本発明に係る２−イミノピペリジンまたは
その医薬として許容される塩は、該物質生産菌（例えば
Ｎｏ．７０７５７株）を資化しうる炭素及び窒素源を含
む栄養培地中に接種し、好気条件下で培養することによ
り（例えば、振とう培養、通気撹拌培養等）、生産せし
めることができる。炭素源としては、グルコース、シュ
ークロース、キシロース、ラムノース、アラビノース、
マンニトール、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセ
リンその他の炭水化物を使用するのが好ましい。窒素源
としては、オートミール、酵母エキス、ペプトン、グル
テンミール、綿実粉、綿実油粕、大豆粉、コーンスティ
ープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、落花生粉、チキン骨
肉ミール等を使用するのが好ましいが、アンモニウム塩
（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム等）、尿素、アミノ酸等の無機及び有機
の窒素化合物も有利に使用することができる。

【００１１】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには、生長因子や微量要素が含まれ
ている場合などもあり、有利な場合があるからである。
必要ある場合には、例えば次のような無機塩類を培地に
添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸
カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化
ナトリウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化
カリウム、マグネシウム塩（硫酸マグネシウム等）、銅
塩、コバルト塩等。特に、培地が強く発砲するのであれ
ば、必要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物
油、鉱物油、アデカノール ＬＧ−１０９（旭電化工業
株式会社製）、シリコン等を添加してもよい。

【００１２】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気撹拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。また、培養を大きなタンクで行う場合、
２−イミノピペリジンおよびその医薬として許容される
塩の生産工程において菌の生育遅延を防止するため、は
じめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次
に培養物を大きな生産タンクに移してそこで生産培養す
るのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地及び
生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であ
ってもよいし必要あれば両者を変えてもよい。

【００１３】培養は通気撹拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による撹拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。培養温度は、本２−イミノピペリジンまた
はその医薬として許容される塩生産菌が本物質を生産す
る範囲内で適宜変更しうるが、通常は１〜４０℃、好ま
しくは１４〜３６℃で培養するのがよい。培養時間は、
培養条件や培養量によっても異なるが通常は約１日〜１
週間である。発酵終了後、培養物から目的とする２−イ
ミノピペリジンまたはその医薬として許容される塩を回
収する。すなわち、菌体は、直接水及び／又は有機溶媒
による抽出、あるいは、これを機械的に又は超音波等既
知の手段を用いて破壊した後、水及び／又は有機溶媒で
抽出した後、常法にしたがって回収、精製する。培養液
の場合は、直接、常法にしたがって回収、精製すればよ
い。

【００１４】回収、精製方法としては、例えば、水、有
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；イオン交換
樹脂等を用いるクロマトグラフィー；単一溶媒又は混合
溶媒からの再結晶等常法が適宜単独であるいは組合わせ
て使用できる。２−イミノピペリジンの医薬として許容
される塩は慣用の無毒性の塩であって、例えば、有機酸
との塩（例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メ
タンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ギ酸塩、ト
ルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等）、無機酸
との塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸
塩等）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミ
ン酸、等）との塩などが挙げられる。

【００１５】この発明の２−イミノピペリジンまたはそ
の医薬として許容される塩は一酸化窒素（ＮＯ）産生阻
害作用を有し、一酸化窒素産生阻害剤の有効成分として
有用である。この発明の一酸化窒素産生阻害剤は、敗血
症性ショック、Ｉ型糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網
膜症、糖尿病性神経障害、潰瘍性大腸炎、慢性大腸炎、
糸球体腎炎、脳梗塞、慢性関節リウマチ、変形性関節
症、痛風、片頭痛、神経炎、骨粗鬆症、ＳＬＥ（全身性
エリテマトーデス）、臓器移植、喘息、ＡＲＤＳ（呼吸
窮迫症候群（成人））、帯状疱疹後神経痛、心筋炎、心
不全、滑膜炎、ガンの転移、アルツハイマー病等の予防
および治療に有効である。次に、この発明の２−イミノ
ピペリジンまたはその医薬として許容される塩が、一酸
化窒素（ＮＯ）産生に対して優れた阻害作用を示すこと
を試験例１により説明する。

【００１６】試験例１ （１） Ｊ７７４．１細胞を用いた一酸化窒素（ＮＯ）
産生阻害活性 １０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコウ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁したＪ７７４．１細胞
（マウスマクロファージ由来）を９６穴プレート（コー
ニング社製）に分注し、３７℃ ５％炭酸ガス培養器内
で細胞が６−８×１０⁴ ケ／ｗｅｌｌになるまで培養し
た。次いで目的濃度に予め希釈した試験化合物を含むリ
ポポリサッカライド（ＬＰＳ）（１μｇ／ｍｌ）及びイ
ンターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）（４Ｕ／ｍｌ）を添
加した１０％ ＦＢＳ：ＤＭＥＭで培地交換し、さらに
２０時間培養した。このようにして得られた細胞培養上
清９０μｌにＧｒｉｅｓｓ試薬（スルファニルアミド１
％とナフチルエチレンジアミン０．１％を含む２．５％
リン酸水溶液）１００μｌを加え５５０ｎｍにおける吸
光度を測定することによりＮＯの代謝物としての亜硝酸
塩量を定量し、ＮＯ産生阻害活性を算出した。 （２）試験化合物：２−イミノピペリジン・塩酸塩 （３）結果：

【表３】 さらに、この発明の２−イミノピペリジンまたはその医
薬として許容される塩が、安全性においても優れている
ことを試験例２により説明する。

【００１７】試験例２ 急性毒性実験 （１）試験化合物：２−イミノピペリジン・塩酸塩 （２）試験方法及び結果：５週令の雌性ＩＣＲマウスに
生理食塩水に溶解した試験化合物を経口ゾンデを用いて
経口投与し、薬物投与から７日目まで観察し、死亡例の
有無を調べた。その結果、試験化合物を３２０ｍｇ／ｋ
ｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋ
ｇ及び３．２ｍｇ／ｋｇを経口投与したマウスを１週間
飼育観察したが死亡例は全く認められなかった。

【００１８】この発明の一酸化窒素産生阻害剤の有効成
分である２−イミノピペリジンまたはその医薬として許
容される塩はそれ自体をそのまま投与することもできる
が、一般には、医薬として許容される種々の製剤組成物
として投与される。製剤組成物の剤形の例としては、例
えば溶液、乳濁液、懸濁液、カプセル剤、顆粒剤、散
剤、錠剤、シロップ剤等の経口剤、軟膏剤、点眼剤、点
鼻剤等の外用もしくは局所投与剤、吸入剤、注射剤、坐
剤等が挙げられる。これらの製剤組成物は例えば蔗糖、
でんぷん、マンニット、ソルビット、乳糖、ぶどう糖、
セルロース、タルク、燐酸カルシウム、炭酸カルシウム
等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラ
チン、アラビヤゴム、ポリエチレングリコール、蔗糖、
でんぷん等の結合剤、例えばでんぷん、カルボキシメチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルでんぷん、炭酸水素
ナトリウム、燐酸カルシウム、カルボキシメチルセルロ
ースカルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、例え
ばステアリン酸マグネシウム、タルク、ラウリル硫酸ナ
トリウム等の滑沢剤、例えばクエン酸、メントール、グ
リシン、ソルビトール、オレンジ末等の矯味剤、例えば
安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパ
ラベン、プロピルパラベン等の保存剤、例えばクエン
酸、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、酢酸等
の安定剤、例えばメチルセルロース、ポリビニルピロリ
ドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、例えばヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース等の分散剤、例えば
水等の溶剤、例えば塩酸等の溶解剤、例えばモノステア
リン酸ナトリウム等の乳化剤、例えばレモンエッセンス
プレミヤ等の着香剤、例えば塩化ベンザルコニウム等の
防腐剤、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、マ
イクロクリスタリンワックス、サラシミツロウ、流動パ
ラフィン、白色ワセリン等の基剤等を用いて、常法によ
り製剤化される。この発明の製剤組成物の投与量は患者
の年令、体重、症状、投与法などにより異なるが、通
常、その有効成分である２−イミノピペリジンまたはそ
の医薬として許容される塩を１回当り１〜３００ｍｇの
範囲内で、好ましくは１〜１００ｍｇの範囲内で、経口
投与または非経口投与される。以下に本発明を実施例に
より説明する。

【００１９】実施例１ 下記処方中の成分を常法に従って混合して注射剤を得
る。

【表４】

【００２０】実施例２ 下記処方中の成分を常法に従って混合して吸入剤を得
る。

【表５】 実施例３ 下記処方中の成分を常法に従って混合して点滴用注射剤
を得る。

【表６】

【００２１】実施例４ 下記処方中の成分を常法に従って混合し、圧縮して錠剤
を得る。

【表７】

【００２２】実施例５ 下記処方中の成分を常法に従って混合し、軟膏剤を得
る。

【表８】

【００２３】実施例６ 下記処方中の成分を常法に従って混合し、シロップ剤を
得る。

【表９】

【００２４】実施例７ 下記処方中の成分を常法に従って混合し、点鼻剤および
点眼剤を得る。

【表１０】

【００２５】実施例８ 下記処方中の成分を常法に従って混合し、坐剤を得る。

【表１１】

【００２６】実施例９ コーンスターチ１％、グルコース１％、落花生粉末０．
５％、大豆粉０．５％、乾燥酵母０．５％およびＣaＣ
Ｏ₃ ２％の組成からなる液体培地を、５００ｍｌ容エ
ルレンマイヤーフラスコ４本に１６０ｍｌずつ分注し、
１２１℃で３０分間滅菌した。各々の培地にＳｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ Ｎｏ．
７０７５７株の斜面培養物を一白金耳ずつ接種し３０℃
で３日間振とう培養した。次に、シュークロース２％、
変性デンプン１％、コーンスティープリカー０．５％、
ペプトン０．５％、落花生粉末１％、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ ０．０５％、ＣaＣＯ₃ ０．０２％（ＣaＣＯ₃は６
Ｎ−水酸化ナトリウムで液体培地をｐＨ６．８に修正後
添加）及び消泡剤［アデカノールＬＧ−１０９（旭電化
工業株式会社製）］０．０５％の組成からなる液体培地
を３０ ｌ容ジャーファーメンター２ 基に２０ ｌずつ
注入し、１２１℃で３０分間滅菌した後、上記培養物を
２本ず つ接種し３０℃で３日間通気撹拌培養した。培
養終了後、上記培養物に濾過補助剤を添加し、濾過する
ことにより３５ ｌの濾液を得た。この濾液を４ ｌの陰
イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ １×２；ＯＨ^- タイプ）
カラムに付し通過させた。この通過液を６Ｎ−ＨＣｌで
ｐＨ６．５に修正し、２ ｌの活性炭カラムに吸着させ
１０ ｌの水で洗浄後０．０１Ｎ−ＨＣｌで溶出した。
溶出区（２２ ｌ）を６Ｎ−ＮaＯＨでｐＨ６．０に修正
し１ｌの陽イオン交換樹脂ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ
−２５（ファルマシアジャパン株式会社製）（０．２Ｍ
−ＮaＨ₂ＰＯ₄で平衡化）カラムに吸着させた。このカ
ラムを４ ｌのイオン交換水で洗浄後、０．１Ｍ−ＮaＨ
₂ＰＯ₄で活性物質を溶出した。この溶出区３．３ ｌを
１ ｌの吸着樹脂Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ−２０７
（三菱化成株式会社製）カラムに吸着させた後、３ ｌ
の０．１Ｍ−ＮaＨ₂ＰＯ₄及び４ ｌのイオン交換水で洗
浄し、０．００２５Ｎ−ＨＣｌ−５０％メタノール溶液
で活性物質を溶出した。活性分画を減圧下に濃縮しメタ
ノールを除去した後、凍結乾燥した。凍結乾燥品に５０
ｍｌのメタノールを加え不溶物を除去後、減圧下に濃縮
乾固することにより４５０ｍｇの油状物質を得た。この
油状物質をアセトニトリル（３０ｍｌ）に溶解し沈澱物
を除去し減圧濃縮することにより白色粉末（２３０ｍ
ｇ）を得た。得られた白色粉末の理化学的性質は以下の
通りである。

【００２７】(1) 分子式： C₅H₁₀N₂・HCl (2) FAB-MS： FAB-MS (m/z) : 99 (フリー体のM+H) (3) 元素分析： 計算値(%)(C₅H₁₀N₂・HCl として) C: 44.61; H: 8.24; N: 20.81; Cl: 26.34 実測値(%) C: 44.15; H: 8.64; N: 20.37; Cl: 24.9
2 (4) 赤外線吸収スペクトル： FT-IR(KBr)：3300〜2700, 1680, 1530, 1420, 1360, 13
30, 1170,990 cm^-1 (5) ¹H核磁気共鳴スペクトル： NMR (400MHz, CD₃OD, δ)： 3.36-3.40 (2H,m), 2.60-2.64 (2H,m), 1.78-1.87 (4H,
m) (6) ¹³C核磁気共鳴スペクトル：¹³ C NMR (100MHz, CD₃OD,δ)： 168.3 (s), 42.6 (t), 26.8 (t), 21.7 (t), 19.0 (t) さらに上記理化学的性質から、その構造決定を試みて、
２−イミノピペリジン・塩酸塩と同定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/445 ＡＢＪ ＡＢＮ ＡＣＤ ＡＣＪ ＡＤＦ ＡＤＭ ＡＤＰ ＡＤＴ ＡＤＵ // Ｃ０７Ｄ 211/72 Ｃ１２Ｐ 17/12 (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２−イミノピペリジンまたはその医薬と
   して許容される塩を有効成分として含有することを特徴
   とする一酸化窒素産生阻害剤。