WO2009125924A2 - 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법 - Google Patents

퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법 Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines

Definitions

  • the present invention relates to a mutant microorganism having high putrescine performance and a method for producing putrescine using the same, and more specifically, a gene that is involved in the degradation or use of putrescine (putrescine) is weakened or deleted.
  • the present invention relates to a mutant microorganism having high trecine high performance and a method for producing putrescine in high yield by culturing it under anaerobic conditions.
  • Putrescine (or 1,4 butanediamine) is an important raw material for the production of polyamides 4 and 6, including nylons 4 and 6, by acrylonitrile by the addition of hydrogen cyanide.
  • Produced mainly on an industrial scale by hydrogenation of succinonitrile produced by Synthetic pathways for these chemicals require non-renewable petrochemical products as raw materials and relatively high temperatures associated with expensive catalyst systems as well as multi-step, muti-reactor designs. And pressure is required.
  • existing chemical synthesis pathways are not good for the environment because they are very toxic and flammable. Accordingly, there is a need to produce putrescine from renewable biomass-derived carbon sources as an alternative to the chemical production process.
  • Putrescine is a type of polyamine found in bacteria in a whole range of organisms, such as plants and animals.
  • putrescine plays an important role in cell proliferation and normal cell growth and is known to be an important substance in defense against oxidative stress (Tkachenko et al., Arch. Microbiol ., 176: 155-157, 2001).
  • polyamine content in cells is finely controlled by biosynthesis, degradation, uptake and secretion (Igarashi and Kashiwagi et al., J. Bacteriol ., 170 (7): 3131-3135, 1988).
  • Putrescine concentration in E. coli has been known to be very high, about 2.8 g / l.
  • Microorganisms also have potentially good resistance to high concentrations of polyamines. For example, Mimitsuka et al. Reported that Corynebacterium glutamicum could grow in the presence of more than 30 g / L of cadaverine. Therefore, research is continuously made to use microorganisms to produce industrially available high concentrations of polyamines (putrescine).
  • European Patent Publication discloses a process for producing putrescine via fermentation using cheap industrial wastes or materials with proteins as a major member, but since the starting materials are very complex, it is possible to obtain putrescine and cadaverine production. There has been a problem that must go through many purification steps.
  • European Patent Publication discloses putrescine biochemical synthesis according to the growth of microorganisms in a minimal salt medium added with glucose as a carbon source. This enhances the activity of ornithine decarboxylase by overexpressing speC or speF , a gene encoding ornithine decarboxylase, to enhance the transformation of ornithine to putrescine. I was.
  • putrescine content is increased with increasing ornithine decarboxylase activity, there is a problem of inhibiting putrescine biosynthesis and progressing the degradation inducing action of putrescine (Igarashi and Kashiwagi et al. , Biochem. J. , 347: 297-303, 2000).
  • yeast Candida boidinii acetylates putrescine to N-acetylputrescine by N-acetyltransferase The spermidine acetyltransferase, a product of the speG gene in Escherichia coli, has a high homology with N-acetyltransferase in yeast and requires the possession of putrescine acetyltransferase (Haywood and Large, Eur. J. Biochem ., 148: 277-283, 1985). ).
  • the putrescine importer a puuP gene product, was also associated with the Puu catabolism pathway and the major putrescine importer (Kurihara et al., J. Biol. Chem ., 280: 4602-4608, 2005).
  • the present inventors are directed to a gene encoding a spermidine synthase ( speE ), spermidine N-acetyltransferase, which is involved in the degradation or utilization pathway of putrescine in a microorganism producing putrescine.
  • speE spermidine synthase
  • spermidine N-acetyltransferase which is involved in the degradation or utilization pathway of putrescine in a microorganism producing putrescine.
  • An object of the present invention is to provide a mutant microorganism having a weakened or deleted gene involved in the degradation or utilization pathway of putrescine, and having a high productivity of putrescine, and a method for producing the mutant microorganism.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing putrescine in high yield by culturing the mutant microorganisms under anaerobic conditions.
  • the present invention is a gene encoding the spermidine synthase ( speE ) involved in the degradation or use pathway of putrescine ( speE ), spermidine N-acetyltransferase (spermidine N Select from the group consisting of a gene encoding -acetyltransferase ( speG ), a gene encoding ornithine carbamoyltransferase I ( argI ), and a gene encoding putrescine importer ( puuP ).
  • speG spermidine synthase
  • speG spermidine N-acetyltransferase
  • argI a gene encoding ornithine carbamoyltransferase I
  • puuP a gene encoding putrescine importer
  • the present invention also encodes a gene ( speE ), spermidine N-acetyltransferase, which encodes a spermidine synthase involved in the degradation or utilization pathway of putrescine.
  • speE a gene encoding ornithine carbamoyltransferase I
  • puuP a gene encoding putrescine importer
  • argECBH arginine biosynthesis
  • argD gene encoding acetylornithine amino transaminease
  • putrescine gene encoding ornithine antiporters (putrescine / ornithine antiporter)
  • speF-potE genes encoding ornithine antiporters
  • putrescine / ornithine antiporter It provides a mutant microorganism having a putrescine generating ability, characterized in that the promoter is substituted with a strong promoter and a method for producing the same.
  • the present invention also encodes a gene ( speE ), spermidine N-acetyltransferase, which encodes a spermidine synthase involved in the degradation or utilization pathway of putrescine.
  • speE a gene encoding ornithine carbamoyltransferase I
  • puuP a gene encoding putrescine importer
  • argECBH arginine biosynthesis
  • the present invention also provides a method for producing putrescine, which comprises culturing the mutant microorganism to produce putrescine and recovering putrescine from the culture.
  • 1 is a schematic diagram showing a synthetic route of putrescine from glucose.
  • FIG. 2 is a graph showing the production of putrescine in fed-batch fermentation using glucose from XQ37 / pKKSpeC cells.
  • Figure 3 is a graph showing the production of putrescine in fed-batch fermentation using glucose from XQ39 cells.
  • 5 is a graph showing the production of putrescine in fed-batch fermentation using glucose from XQ43 / p15SpeC cells.
  • the term “attenuation” refers to a concept encompassing a mutation, substitution or deletion of some bases of a gene or introduction of some bases to reduce the activity of an enzyme expressed by the gene of interest. It includes everything that blocks some or much of the biosynthetic pathway.
  • the term 'deletion' is a concept encompassing a part or whole base of the gene, mutating, substituting or deleting, or introducing some base so that the gene is not expressed or does not exhibit enzymatic activity even when expressed. It includes everything that blocks the biosynthetic pathways involved in the enzymes of the gene.
  • amplification means that some bases of the gene are mutated, substituted or deleted, some bases are introduced, or a gene derived from another microorganism encoding the same enzyme is used to increase the activity of the corresponding enzyme. It is a concept that encompasses letting.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a synthetic route of putrescine from glucose.
  • microorganisms having putrescine- producing ability if attenuated or deleted genes ( speE, speG, argI, puuP ) involved in the degradation or utilization pathway of putrescine (putrescine) It was intended to confirm that tresine can be produced in high yield.
  • speE, speG, argI, puuP The reduced activity of genes ( speE, speG, argI, puuP ) involved in the degradation or utilization pathway of putrescine was confirmed by reduced transcriptional and translational efficiency compared to the respective wild-type levels.
  • a gene encoding spermidine synthase ( speE ), spermidine N-acetyltransferase involved in the degradation or use pathway of putrescine At least one selected from the group consisting of a gene encoding speG , a gene encoding ornithine carbamoyltransferase I ( argI ), and a gene encoding putrescine importer ( puuP ). It was confirmed that the mutant microorganisms having deleted were prepared, and the putrescine-producing ability of the prepared mutant microorganisms was improved.
  • the present invention provides a gene encoding a spermidine synthase ( speE ), a spermidine N-acetyltransferase (spermidine N-), which is involved in the degradation or utilization pathway of putrescine. selected from the group consisting of a gene encoding acetyltransferase ( speG ), a gene encoding ornithine carbamoyltransferase I ( argI ) and a gene encoding putrescine importer ( puuP ). It relates to a mutant microorganism having a putrescine producing ability, characterized in that at least one is weakened or deleted and a method for producing the same.
  • the mutant microorganism is a gene encoding ⁇ -glutamyl putrescine synthase ( puuA ), putrescine transamine involved in the degradation or use pathway of putrescine
  • puuA ⁇ -glutamyl putrescine synthase
  • putrescine transamine involved in the degradation or use pathway of putrescine
  • One or more selected from the group consisting of a gene encoding an oxidase (putrescine transaminase) ( ygjG ) and a gene encoding ornithine carbamoyltransferase F ( argF ) may be further weakened or deleted.
  • the gene encoding ornithine carbamoyltransferase F is an isoenzyme of the gene ( argI ) encoding ornithine carbamoyltransferase I, and the ⁇ -glu
  • the gene encoding pamil is a neighboring gene of the gene encoding the putrescine importer ( puuP ), and is putrescine transaminase.
  • Gene coding for ygjG is a gene involved in the degradation of putrescine.
  • the mutant microorganism may further be deleted the gene encoding lac operon repressor ( lacI ) so that the expression of the gene encoding the enzyme involved in putrescine biosynthesis is increased.
  • Genes encoding the enzymes involved in putrescine biosynthesis may include gdhA, argA, argB, argC, argD, argE and the like.
  • the mutant microorganism may also be characterized in that the gene ( speC ) encoding ornithine decarboxylase is further introduced or amplified.
  • the gene encoding the decarboxylase (ornithine decarboxylase) ( speC ) is characterized in that it is introduced in the form of an expression vector containing a strong promoter, the strong promoter is trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter and trp It can be selected from the group consisting of promoters.
  • the microorganism may be used as long as it is a microorganism that produces putrescine from glucose, Bacillus sp . ( Bacillus sp .), Corynebacterium sp . ( Coynebacterium sp .), Escherichia sp . , Pichia sp ., Pseudomonas sp ., Saccharomyces sp .
  • putrescine in the mutant microorganism in a gene involved in God degradation or utilization pathway is deleted, the gene encoding an operon for arginine biosynthesis (argECBH), a gene encoding acetyl ornithine amino trans amine dehydratase (argD ) And genes selected from the group consisting of inducible ornithine decarboxylase and putrescine / ornithine antiporter ( speF-potE ).
  • speF-potE putrescine inducible ornithine decarboxylase and putrescine / ornithine antiporter
  • putrescine with a gene (lacI) encoding a gene (speE, speG, argI, puuP ) and lac operon repressor involved in decomposition or the Flow deletion mutant microorganism of new (putrescine) of the present invention arginine Mutant microorganism (XQ33) by replacing the promoter of argECBH encoding gene for biosynthesis with strong promoter trc, argECBH and inducible ornithine decarboxylase and putrescine / ornithine anti Of the mutant microorganism (XQ37), argECBH, speF-potE and the gene encoding acetylornithine amino transaminease ( argD ), in which the trc-substituted promoter of the gene ( speF-potE ) encoding a porter (putrescine / ornithine antiporter)
  • the present invention provides a gene ( speE ), spermidine N-acetyltransferase (spermidine N-), which encodes a spermidine synthase involved in the degradation or utilization pathway of putrescine. selected from the group consisting of a gene encoding acetyltransferase ( speG ), a gene encoding ornithine carbamoyltransferase I ( argI ) and a gene encoding putrescine importer ( puuP ).
  • speG a gene encoding acetyltransferase
  • argI ornithine carbamoyltransferase I
  • puuP a gene encoding putrescine importer
  • genes encoding operon for arginine biosynthesis argECBH
  • genes encoding acetylornithine amino transaminease argD
  • inducible ornithine decarboxylase and putrescine / ornithine anti porter is selected from the group consisting of a gene (speF-potE) encoding the (putrescine / ornithine antiporter)
  • Mutation is one or more gene promoter having the putrescine producing ability, characterized in that substituted a strong promoter relates to microorganisms and methods for their preparation.
  • the gene encoding the operon for arginine biosynthesis is a co-regulatory operon, which includes two convergent promoters, argEp and argCBHp, on the side and an operator therein. Both promoters are inhibited by arginine (Charlier and Glansdorff, 2004).
  • argECBH arginine biosynthesis
  • the argE is the gene encoding the N-acetylornithinase
  • argC is the gene encoding the N-acetylglutamylphosphate reductase
  • argB is a gene encoding N-acetylglutamate kinase
  • argH is a gene encoding a argininosuccinase.
  • genes coding for inducible ornithine decarboxylase and putrescine / ornithine antiporter ( speF-potE ) induced at low pH are inducible ornithine decarboxylase and putrescine / ornithine. Code an antiporter Therefore, when the native promoter of the speF-potE operon is replaced with a strong promoter, the speF-potE operon can be expressed at all times, thereby improving the production ability of putrescine.
  • the promoter of the gene ( argD ) encoding the acetylornithine amino transaminease is inhibited by arginine (Charlier and Glansdorff, 2004).
  • arginine arginine
  • the mutant microorganism includes a gene encoding ⁇ -glutamylputrescine synthase ( puuA ), a gene encoding putrescine transaminase ( ygjG), and One or more selected from the group consisting of ornithine carbamoyltransferase F encoding gene ( argF ) may be further weakened or deleted.
  • puuA ⁇ -glutamylputrescine synthase
  • ygjG putrescine transaminase
  • argF One or more selected from the group consisting of ornithine carbamoyltransferase F encoding gene
  • mutant microorganism having the putrescine-producing ability may be further deleted by a gene encoding lac operon repressor ( lacI ) so that expression of a gene encoding an enzyme involved in putrescine biosynthesis is increased.
  • lacI lac operon repressor
  • the gene ( speC ) encoding the ornithine decarboxylase is preferably introduced in the form of an expression vector containing a strong promoter.
  • the strong promoter associated with the substitution of the gene promoter and the introduction of a gene ( speC ) encoding ornithine decarboxylase is a trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter and trp promoter It may be characterized in that it is selected from the group consisting of.
  • the most preferred examples are the gene encoding the spermidine synthase involved in the degradation or utilization pathway of putrescine ( speE ), spermidine N-acetyltransferase (spermidine N Select from the group consisting of a gene encoding -acetyltransferase ( speG ), a gene encoding ornithine carbamoyltransferase I ( argI ), and a gene encoding putrescine importer ( puuP ).
  • the gene encoding the operon for arginine biosynthesis argECBH
  • the gene encoding acetylornithine amino transaminease argD
  • the inducible ornithine decarboxylase argD
  • the gene coding for putrescine / ornithine antiporter speF-potE
  • One or more selected gene promoters are substituted with strong promoters, and may be a mutant microorganism having a putrescine-producing ability, characterized in that a gene ( speC ) encoding ornithine decarboxylase is introduced or amplified. have.
  • the present invention relates to a method for producing putrescine, which comprises culturing the mutant microorganism to produce putrescine and recovering putrescine from the culture solution.
  • the culturing of the mutant microorganism and the obtaining process of putrescine can be carried out using a culture method commonly known in the conventional fermentation process (batch culture, fed-batch culture) and the separation and purification method of putrescine.
  • the biotechnological production of putrescine can be carried out intracellularly or in vitro.
  • Microorganisms which are putrescine-producing microorganisms as specific vectors and host cells in order to remove the gene according to the present invention, but different types of vectors and putrescine are produced.
  • the use of microorganisms will also be apparent to those skilled in the art.
  • deletion of genes on the chromosome was performed by double-crossover homologous recombination (Datsenko, KA, & Wanner, BL Proc. Natl. Acad. Sci ., 97: 6640-6645, 2000).
  • the lox71-chloramphenicol marker (CmR) -lox66 cassette was prepared by PCR using primers containing 50 nucleotides homologous to the upstream and downstream sequences of the target gene.
  • pECmulox Karl, JM, Lee, KH & Lee, SY, FEMS Microbiol.
  • the antibiotic marker was subsequently removed by a helper plasmid pJW168 containing a temperature-sensitive replication origin and IPTG-inducible cre recombinase (Palmeros et al., Gene , 247 (1): 255-264, 2000).
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOS: 1 and 2, and the plasmid pECmulox as a template to prepare a PCR product in which the lacI gene was deleted.
  • the purified PCR product was purified, and then electroporated to E. coli (W3110) containing ⁇ recombinase to prepare WL3110 (W3110 ⁇ lacI ).
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOS: 3 and 4, pECmulox, a plasmid as a template, to prepare a PCR product lacking the speE gene.
  • the purified PCR product was purified and then electroporated to the WL3110 strain prepared in 1-1 to prepare an XQ08 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ).
  • PCR was carried out using the plasmid pECmulox as a template, the primers of SEQ ID NOs: 5 and 6, to prepare a PCR product lacking the puuA gene.
  • the purified PCR product was purified, and then electroporated to the WL3110 strain prepared in 1-1 to prepare an XQ17 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ puu A).
  • PCR was carried out using the plasmid pECmulox as a template, the primers of SEQ ID NOs: 6 and 7, to prepare a PCR product lacking the puuP gene.
  • the purified PCR product was purified, and then electroporated to the XQ17 strain (W3110 ⁇ lac I ⁇ puuA ) prepared in 1-3 to prepare the XQ22 strain (W3110 ⁇ lac I ⁇ puuP ⁇ puuA ).
  • PCR was performed using the plasmid pECmulox as a template and primers of SEQ ID NOs: 8 and 9 to prepare a PCR product from which the speE gene was deleted.
  • the purified PCR product was purified and then electroporated to the WL3110 strain prepared in 1-1 to prepare an XQ23-1 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ).
  • PCR was carried out using the plasmid pECmulox as a template, the primers of SEQ ID NOs: 10 and 11, to prepare a PCR product from which the speG gene was deleted.
  • the purified PCR product was purified, and then electroporated to the previously prepared XQ23-1 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ) to prepare the XQ23-2 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ).
  • PCR was performed using the plasmid pECmulox as a template, the primers of SEQ ID NOs: 12 and 13, to prepare a PCR product that lacked the argI gene.
  • the purified PCR product was purified and then used as a template, and PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 14 and 15.
  • the XQ23 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ) was prepared by electroporation to the previously prepared XQ23-2 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ).
  • PCR products deleted from puuA gene prepared in 1-3 and PCR products deleted from puuP gene prepared in 1-4 were sequentially electroporated to XQ23 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ) to XQ26 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ⁇ puuP ⁇ puuA ) was prepared.
  • PCR was carried out using the plasmid pECmulox as a template, the primers of SEQ ID NOs: 16 and 17, to prepare a PCR product that lacked the ygjG gene.
  • the PCR product from which the ygjG gene prepared in 1-7 was deleted was electroporated to the XQ26 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ⁇ puuP ⁇ puuA ) prepared in the above 1-6 to prepare the XQ29 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ ygpG ⁇ PJ ⁇ PJARG ) It was.
  • the promoter of the mutant strain (XQ26) prepared in Example 1 was replaced with trc as a strong promoter.
  • the exchange of the argECBH operon to the trc promoter for the native promoter was performed according to the following.
  • the fused lox71-chloroamphenicol antibiotic marker-lox66 DNA fragment was obtained by first PCR using pECmulox as a template and SEQ ID NOs: 18 and 19 as primers.
  • the first PCR product was used as a template and a second PCR reaction was performed using the primers of SEQ ID NOs: 20 and 21.
  • a second PCR product was used as a template, and a third PCR reaction was performed using primers of SEQ ID NOs: 22 and 23.
  • the final PCR product was electroporated to the XQ26 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ⁇ puuP ⁇ puuA ) prepared in 1-6 to prepare a recombinant microorganism, which was then agar solid medium containing chloroamphenicol. Only cells that had undergone double homologous recombination during culture were screened to prepare XQ33 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ⁇ puuP ⁇ puuA PargECBH :: Ptrc ). Next, the exchange of the prepared strain to the trc promoter was confirmed by DNA sequence analysis.
  • the first PCR reaction was carried out using pECmulox, a plasmid as the template, SEQ ID NO: 19 above and SEQ ID NO: 24 below.
  • the second PCR reaction was carried out using the first PCR product as a template and the primers of SEQ ID NOs: 25 and 26.
  • the third PCR reaction is based on the second PCR product. It was performed using the primers of SEQ ID NOs: 27 and 28.
  • the final PCR product was electroporated into the XQ33 strain prepared in 2-1 (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ⁇ puuP ⁇ puuA PargECBH :: Ptrc ) to prepare a recombinant microorganism, which was then agar containing chloroamphenicol.
  • XQ37 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ⁇ puuP ⁇ puuA PargECBH :: Ptrc PspeF-potE :: Ptrc ) was screened by screening only cells that had undergone double homologous recombination while incubated in solid medium. Promoter exchange to the trc promoter was confirmed by DNA sequence analysis.
  • the first PCR reaction was carried out using pECmulox as a template and primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 29 below.
  • the second PCR reaction was carried out using the first PCR product as a template and the primers of SEQ ID NOs: 30 and 31.
  • the third PCR reaction was carried out using the first PCR product as a template and the primers of SEQ ID NOs: 32 and 33.
  • the final PCR product was electroporated to the XQ37 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ⁇ puuP ⁇ puuA PargECBH :: Ptrc PspeF-potE :: Ptrc ) prepared in 2-2 above to obtain the XQ39 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ pP ⁇ Ppe ⁇ speE ⁇ speG -potE :: Ptrc PargD :: Ptrc ) was prepared.
  • the prepared strains were screened only in cells subjected to double homologous recombination while culturing in agar solid medium containing chloroamphenicol. Promoter exchange to the trc promoter was confirmed by DNA sequence analysis.
  • the exchange of the speC gene to the trc promoter for the wild type promoter was performed according to the following method.
  • the first PCR reaction was carried out using pECmulox as a template and primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 36.
  • the second PCR reaction was carried out using the first PCR product as a template and the primers of SEQ ID NOs: 37 and 38.
  • the third PCR reaction was carried out using the second PCR product as a template and using the primers of SEQ ID NOs: 39 and 40.
  • the final PCR product was electroporated to the XQ39 strain prepared in the above 2-3 (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ argI ⁇ puuP ⁇ puuA PargECBH :: Ptrc PspeF-potE :: Ptrc PargD :: Ptrc ) to produce the XQ43 strain (W3110 ⁇ P ⁇ ⁇ P ⁇ ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ P ⁇ ⁇ psA :: Ptrc PspeF-potE :: Ptrc PargD :: Ptrc PspeC :: Ptrc ) was prepared. Next, the prepared strains were screened only in cells subjected to double homologous recombination while culturing in agar solid medium containing chloroamphenicol. Promoter exchange to the trc promoter
  • the variant strains ( E. coli K12 WL3110 variants) of Table 1 prepared in Examples 1 and 2 were 4g / L (NH 4 ) 2 HPO 4 , 13.5g / L KH 2 PO 4 , 1.7g / L citric acid, 0.7 In a minimum R medium consisting of g / L MgSO 4 7H 2 O, 0.5% (v / v) trace metal solution (Lee, SY, & Chang, HN, Biotechnol. Lett ., 15: 971-974, 1993) The flask was cultured.
  • Trace metal solution contains 5M HCl per liter: 10g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.25g ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O, 1g CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.5g MnSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.23g Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 O, 2g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, and 0.1g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 .
  • Glucose (100 g / l) stock solution was sterilized separately and added to the sterilized medium to a final concentration of 10 g / l.
  • This instrument uses a C18-reverse phase column equilibrated to buffer A (buffer A, 45% 0.1 M sodium acetate pH 7.2 / Methanol buffer B methanol).
  • the assay was performed using the following conditions (1-6 min 100% A equilibration, 6-10 min linear gradient from 0 to 30% buffer B, 10-15 min 30% to 50% buffer B, 15-19 min 50% to 100% buffer B, 19 -23min 100% buffer B and 23-25 min from 100% to 30% buffer B, 25-28min from 30% B to 100% A with a flow rate of 0.8 ml / min).
  • a standard material was used for calibration, and the measured concentration of putrescine is shown in Table 1 below.
  • mutant microorganisms in which genes involved in the degradation or utilization pathway of putrescine ( puuP, puuA, speE, speG, argI ) are deleted are produced according to the type and number of genes deleted. It was confirmed that this was increased.
  • the gene encoding the operon for arginine biosynthesis of the mutant microorganism argECBH
  • the gene encoding acetylornithine amino transaminease argD
  • the inducible ornithine decarboxylase and putrescine /
  • the ornithine antiporter ornithine antiporter
  • speF-potE ornithine antiporter
  • speC ornithine decarboxylase
  • Example 4 Amplification of the gene (speC) encoding ornithine decarboxylase
  • Ornithine decarboxylase which encodes speC of E. coli W3110 at all times, was cloned into pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) expression vector for strong gene expression of tac promoter.
  • E.coli W3110 by genomic DNA (derived from E. coli K-12 , ⁇ - -, F, prototrophic) as a template, by using the synthetic primer of SEQ ID NO: 34 and 35, perform the PCR, speC fragment (2156 bp) was prepared.
  • the prepared speC fragment (2156bp) and pKK223-3 plasmid were treated with restriction enzymes (EcoRI and PstI), followed by treatment with T4 DNA ligase to polymerize the speC fragment and pKK223-3 plasmid digested with restriction enzymes.
  • Ornithine decarboxylase which encodes speC of E. coli W3110 at all times, was cloned into pTac15K (p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock) expression vector, which undergoes strong gene expression of the tac promoter.
  • E. coli W3110 by genomic DNA of (derived from E. coli K-12 , ⁇ - -, F, prototrophic) as a template, by using the synthetic primer of SEQ ID NO: 34 and 35, perform the PCR, speC fragment (2156 bp) was prepared.
  • the prepared speC fragment (2156bp) and the pTac15K plasmid were treated with restriction enzymes (EcoRI and PstI), followed by treatment with T4 DNA ligase to polymerize the speC fragment and pTac15K plasmid digested with the restriction enzyme.
  • the recombinant plasmid vector p15SpeC was prepared.
  • the WL3110 / pKKSpeC strain was prepared by introducing the pKKSpeC vector prepared in 4-1 into the WL3110 strain prepared in Example 1-1. Next, the recombinant strains were selected while culturing the prepared strains in agar (agar) solid medium containing ampicillin (ampicillin).
  • the XQ17 / pKKSpeC strain was prepared by introducing the pKKSpeC vector prepared in 4-1 to the XQ17 strain prepared in Example 1-3. Next, the recombinant strains were selected while culturing the prepared strains in agar (agar) solid medium containing ampicillin (ampicillin).
  • the XQ22 / pKKSpeC strain was prepared by introducing the pKKSpeC vector prepared in 4-1 into the XQ22 strain prepared in Examples 1-4. Next, the recombinant strains were selected while culturing the prepared strains in agar (agar) solid medium containing ampicillin (ampicillin).
  • the XQ26 / pKKSpeC strain was prepared by introducing the pKKSpeC vector prepared in 4-1 into the XQ26 strain prepared in Example 1-6. Next, the recombinant strains were selected while culturing the prepared strains in agar (agar) solid medium containing ampicillin (ampicillin).
  • the XQ33 / pKKSpeC strain was prepared by introducing the pKKSpeC vector prepared in 4-1 into the XQ33 strain prepared in Example 2-1. Next, the recombinant strains were selected while culturing the prepared strains in agar (agar) solid medium containing ampicillin (ampicillin).
  • the XQ37 / pKKSpeC strain was prepared by introducing the pKKSpeC vector prepared in 4-1 into the XQ37 strain prepared in Example 2-2. Next, the recombinant strains were selected while culturing the prepared strains in agar (agar) solid medium containing ampicillin (ampicillin).
  • the XQ39 / pKKSpeC strain was prepared by introducing the pKKSpeC vector prepared in 4-1 to the XQ39 strain prepared in Example 2-3. Next, the recombinant strains were selected while culturing the prepared strains in agar (agar) solid medium containing ampicillin (ampicillin).
  • the XQ43 / p15SpeC strain was prepared by introducing the p15SpeC vector prepared in 4-2 into the XQ43 strain prepared in Example 2-4. Next, the recombinant strains were selected while culturing the prepared strains in agar (agar) solid medium containing ampicillin (ampicillin).
  • Example 4 The variant strains prepared in Example 4 were cultured in shake flasks containing the same medium as in Example 3.
  • mutant microorganisms when co-expressed with ornithine decarboxylase speC have reduced putrescine degradation and utilization activity.
  • the potential of reduced putrescine degradation and utilization activity was analyzed in fed-batch fermentation with increased ornithine decarboxylase activity.
  • the fed-batch fermentation was carried out in a 6.6 liter fermenter (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) after adding 10 g / l glucose to 2 liters of R medium.
  • 1 ml of the activated XQ37 / pKKSpeC culture in LB medium was added to a 350-mL baffled flask containing 50 mL of the same medium, followed by incubation at 30 ° C. and 220 rpm for 24 hours until OD 600 became 5. 200 ml of the preliminary culture was then used to inoculate the fermentor.
  • Dissolved oxygen was maintained at 20% saturated air by automatically increasing the stirring speed of 850 rpm.
  • the feed solution was automatically added to increase the glucose concentration to 3 g / l or more.
  • the feed solution also contains 500 g / l of glucose and 200 g / L of (NH 4 ) 2 SO 4 .
  • the pH was maintained at 6.8 by adding mostly 28% (v / v) ammonia solution. Samples were taken, the cells were separated using centrifugation, and the dissociated supernatants were analyzed by HPLC in the same manner as in Example 3. As shown in FIG.
  • XQ37 / pKKSpeC strain produced 14.3 g / l putrescine after 55.8 hours of inoculation, and the maximum putrescine productivity was 0.28 g L ⁇ 1 h ⁇ 1 after 47 hours of inoculation. It was.
  • a fed-batch fermentation was carried out in the same manner as in Example 6, except that the XQ39 strain was used instead of the XQ37 / pKKSpeC strain, and the fermentation broth was analyzed by HPLC. As shown in FIG. 3, the XQ39 strain produced 14.7 g / l of putrescine 36 hours after inoculation, and the maximum putrescine productivity was 0.42 g L ⁇ 1 h ⁇ 1 after 31 hours of inoculation.
  • the XQ43 strain prepared in Example 2 was prepared using 2 g / L (NH 4 ) 2 HPO 4 , 6.75 g / L KH 2 PO 4 , 0.85 g / L citric acid, 0.7 g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.5% ( v / v) 3 g / L of (NH 4 ) 2 SO 4 in a minimum R / 2 medium consisting of trace metal solution (Qian et al., Biotechnol. and Bioeng, 101 (3): 587-601, 2008) The flask was cultured in 50 ml of additional medium.
  • Trace metal solution contains 5M HCl per liter: 10g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.25g ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O, 1g CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.5g MnSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.23g Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 O, 2g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, and 0.1g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 .
  • Glucose (100 g / l) stock solution was sterilized separately and added to the sterilized medium to a final concentration of 10 g / l.
  • XQ43 strain produced 18.0 g / l putrescine 30 hours after inoculation, and the maximum putrescine productivity was 0.63 g L ⁇ 1 h ⁇ 1 after 28 hours of inoculation.
  • a fed-batch fermentation was carried out in the same manner as in Example 8, except that the XQ43 / p15SpeC strain was used instead of the XQ43 strain, and the fermentation broth was analyzed by HPLC. As shown in FIG. 5, the XQ43 / p15SpeC strain produced 21.7 g / l putrescine 37 hours after inoculation, and the maximum putrescine productivity was 0.58 g L ⁇ 1 h ⁇ 1 37 hours after inoculation. It was.
  • the present invention is useful for producing putrescine, which is widely used industrially, in high yield by preparing a mutant microorganism having putrescine-producing ability.

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Abstract

본 발명은 퓨트레신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 혐기조건하에서 배양하여 퓨트레신을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 퓨트레신(putrescine) 고생성능을 가지는 변이 미생물은 산업적으로 널리 사용되는 퓨트레신을 고수율로 제조하는데 유용하다.

Description

퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법
본 발명은 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 혐기조건하에서 배양하여 퓨트레신을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
퓨트레신(또는 1,4 부탄다이아민)은 나일론 4, 6을 포함하는 폴리아미드 4, 6의 생산을 위한 중요한 원료물질로서, 수소 시안화물(hydrogen cyanide) 첨가에 의해 아크릴로니트릴(acrylonitrile)로 생산되는 숙시노니트릴(succinonitrile)의 수소화에 의한 산업적 규모에서 주로 생산되었다. 이들 화학물질의 합성경로에서는 비 재생적인 석유화학적 산물을 원료 물질로서 필요로 하며, 상대적으로 다중 단계(multi step), 다중 반응기 설계(muti-reactor design) 뿐만 아니라, 값비싼 촉매시스템과 관련한 높은 온도와 압력이 필요하다. 게다가 매우 강한 독성과 가연성이 있는 반응물이기 때문에 기존의 화학합성 경로는 환경적인 측면에서 좋지 않다. 이에, 상기 화학생산공정의 대안으로 재생가능한 바이오매스 유래 탄소원으로부터 퓨트레신을 생산이 요구되는 실정이다.
퓨트레신은 박테리아에서 동식물과 같은 전범위의 유기체에서 발견되는 폴리아민의 한 종류이다. 예를 들면, 퓨트레신은 세포 증식과 정상 세포성장에서 중요한 역할을 하고 있고, 산화적 스트레스에 방어 기작에도 중요한 물질로 알려져 있다(Tkachenko et al., Arch. Microbiol., 176:155-157, 2001). 한편 세포 내 폴리아민 함량은 생합성, 분해, 흡수, 분비에 의해서 정교하게 조절된다(Igarashi and Kashiwagi et al., J. Bacteriol., 170(7):3131-3135, 1988). 대장균에서의 퓨트레신 농도는 약 2.8g/l로 매우 높다고 알려져 왔다. 또한 미생물들은 고농도의 폴리아민에 잠재적으로 좋은 내성을 갖고 있다. 예를들면, Mimitsuka 등은 Corynebacterium glutamicum은 30g/L 이상의 카다베린(cadaverine) 존재 하에서도 성장할 수 있다고 보고하였다. 따라서, 산업적으로 이용 가능한 고농도의 폴리아민(퓨트레신)을 생산하기 위하여 미생물을 이용하려는 연구가 지속적으로 이루어 지고 있다.
유럽공개특허(EP0726240A1)에서는 값싼 산업 폐기물 혹은 주요 구성원으로 단백질을 가진 물질들을 이용하여 발효를 통해 퓨트레신을 생산하는 방법을 개시하였지만, 개시 물질들이 매우 복잡하기 때문에, 퓨트레신과 카다베린 생산을 얻기 위해서는 많은 정제 단계들을 거쳐야 하는 문제점이 있었다. 또한 유럽공개특허(EP1784496A1)는 탄소원으로써 포도당이 추가된 최소염배지(minimal salt medium)에서 미생물 성장에 따른 퓨트레신 생화학적 합성을 개시하였다. 이는 오르니틴의 퓨트레신으로의 변형을 향상 시키기 위해, 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자인 speC 또는 speF를 과발현(overexpression)시켜, 오르니틴 디카르복실라제의 활성을 증가시켰다. 그러나, 오르니틴 디카르복실라제 활성이 증가함에 따라 퓨트레신 함유량이 증가 되었을 때, 퓨트레신 생합성의 저해가 있고, 퓨트레신의 분해 유도작용이 진행되는 문제점이 있었다(Igarashi and Kashiwagi et al., Biochem. J., 347:297-303, 2000).
미생물내에서의 퓨트레신 분해 및 이용 활성도에 대한 연구는 다음과 같다. Bowman 등은 speE 유전자 산물인 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)가 대장균 내에서 퓨트레신으로부터 스퍼미딘(spermidine)의 생합성을 촉진시키는 것을 보고하였다(Bowman et al., J. Biol. Chem., 248:2480-2486, 1973). spermidine synthase (EC:2.5.1.16)는 거의 모든 세포시스템에서 spermidine의 합성을 위해 존재한다.
Haywood 등은 효모인 Candida boidinii가 N-acetyltransferase에 의해 acetylates 퓨트레신을 N-acetylputrescine로 아세틸화시킨다고 보고하였다. 대장균에서 speG 유전자 산물인 spermidine acetyltransferase는 효모의 N-acetyltransferase와 상동성(homology)이 매우 높아서 putrescine acetyltransferase를 소유하는 것이 요구된다(Haywood and Large, Eur. J. Biochem., 148:277-283, 1985).
또한 Samsonova 등은 대장균에서 γ-glutamylation 없이 YgjG putrescine transaminase 및 YdcW dehydrogenase 복합 작용에 의해 퓨트레신은 γ-aminobutyric acid로 전환된다는 또 다른 퓨트레신 분해 경로에 대해서 설명하였다(Samsonova et al., BMC Microbiol., 3:2, 2003, ; Samsonova et al., FEBS Lett., 579:4107-4112, 2005).
그리고, Kurihara 등은 ‘Puu pathway’라 하여, 퓨트레신 분해 경로는 대장균 내의 γ-glutamylated 대사체와 연관깊다고 분명하게 보고하였다. 이 경로의 γ-glutamylation 통해 알데하이드 중간체인 γ-aminobutyraldehyde를 안정화 시킬 수 있다. puuA 유전자의 산물인 γ-glutamylputrescine synthetase은 퓨트레신을 γ-glutamyl-L-퓨트레신으로 형질전환시키면서 이 경로의 첫 번째 반응을 촉진시킨다. 또한 Puu 이화 경로(catabolic pathway)는 대장균이 유일한 질소원으로서 퓨트레신을 포함하는 배지에서 성장할 때, 주요한 요소가 된다고 밝혔다. 또한 puuP 유전자 산물인 putrescine importer는 Puu 이화 경로와 주요 putrescine importer에 관련있다고 보았다(Kurihara et al., J. Biol. Chem., 280:4602-4608, 2005).
이에, 본 발명자들은 퓨트레신을 생산하는 미생물에서, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 변이균주를 제조하고, 이를 혐기조건에서 배양한 결과, 퓨트레신을 고수율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고, 퓨트레신의 고생산능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 혐기조건하에서 배양하여, 퓨트레신을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, arginine 생합성을 위한 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH), 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD) 및 유도 가능한 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 프로모터가 strong promoter로 치환된 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, arginine 생합성을 위한 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH) , 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD) 및 유도 가능한 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 프로모터가 strong promoter로 치환되어 있으며, 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)가 도입 또는 증폭된 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 배양하여 퓨트레신을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 퓨트레신을 회수하는 것을 특징으로 하는 퓨트레신의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 포도당으로부터 퓨트레신의 합성경로를 나타내는 모식도이다.
도 2는 XQ37/pKKSpeC cells로부터 포도당을 이용한 유가식 발효에서 퓨트레신의 생산을 나타낸 그래프이다.
도 3은 XQ39 cells로부터 포도당을 이용한 유가식 발효에서 퓨트레신의 생산을 나타낸 그래프이다.
도 4는 XQ43 cells로부터 포도당을 이용한 유가식 발효에서 퓨트레신의 생산을 나타낸 그래프이다.
도 5는 XQ43/p15SpeC cells로부터 포도당을 이용한 유가식 발효에서 퓨트레신의 생산을 나타낸 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
본 발명에서 “약화”란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 ‘결실’이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 “증폭”이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.
도 1은 포도당으로부터 퓨트레신의 합성경로를 나타내는 모식도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 퓨트레신 생성능을 가지는 미생물에서, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(speE, speG, argI, puuP)를 약화 또는 결실시키면 퓨트레신을 고수율로 제조할 수 있음을 확인하고자 하였다. 상기 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(speE, speG, argI, puuP)의 감소된 활성도는 각각의 야생형 수준과 비교하여 감소된 전사적, 번역적 효율에 의하여 확인할 수 있었다.
본 발명의 일 실시예에서는 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 결실시킨 변이 미생물을 제조하고, 제조된 변이 미생물의 퓨트레신 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 변이 미생물은 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 γ-글루타밀퓨트레신 합성효소(γ-glutamylputrescine synthase)를 코딩하는 유전자(puuA), 퓨트레신 트랜스아민아제(putrescine transaminase)를 코딩하는 유전자(ygjG) 및 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) F를 코딩하는 유전자(argF)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 약화 또는 결실될 수도 있다.
상기 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) F를 코딩하는 유전자(argF)는 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI)의 이소엔자임(isoenzyme)이고, 상기 γ-글루타밀퓨트레신 합성효소(γ-glutamylputrescine synthase)를 코딩하는 유전자(puuA)는 상기 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)의 이웃 유전자이며, 퓨트레신 트랜스아민아제(putrescine transaminase)를 코딩하는 유전자(ygjG)는 퓨트레신(putrescine)의 분해에 관여하는 유전자이다.
본 발명에서, 상기 변이 미생물은 또한, 퓨트레신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac operon repressor를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실될 수 있다. 상기 퓨트레신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 gdhA, argA, argB, argC, argD, argE 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서, 상기 변이 미생물은 또한, 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하는 것을 특징으로 하며, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 미생물은 글루코즈로부터 퓨트레신을 생성하는 미생물이면 제한없이 사용할 수 있으며, 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서는 또한, 퓨트레신의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 결실되어 있는 변이 미생물에서, arginine 생합성을 위한 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH), 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD) 및 유도 가능한 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE)로 구성된 군에서 선택되는 유전자의 프로모터를 strong promoter로 치환시키면 퓨트레신을 더욱 고수율로 제조할 수 있음을 확인하고자 하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(speE, speG, argI, puuP) 및 lac operon repressor를 코딩하는 유전자(lacI)가 결실된 변이 미생물에서, arginine 생합성을 위한 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH)의 프로모터를 strong promoter인 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ33), argECBH와 유도 가능한 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE)의 프로모터를 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ37), argECBH, speF-potE와 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD)의 프로모터를 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ39) 및 argECBH, speF-potE, argD와 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)의 프로모터를 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ43)을 제조하고, 이들 변이 미생물의 퓨트레신 생성능이 급격히 증가됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, arginine 생합성을 위한 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH), 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD) 및 유도 가능한 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 프로모터가 strong promoter로 치환된 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 arginine 생합성을 위한 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH)는 공동 조절 오페론(divergent operon) 으로서, 측면에 두개의 convergent 프로모터인 argEp, argCBHp와 내부에 오퍼레이터(operator)를 포함한다. 상기 두 프로모터들은 arginine에 의해 억제된다(Charlier and Glansdorff, 2004). 따라서, argECBH 오페론의 야생형 프로모터(native promoter)를 strong promoter로 치환시키면 Ornithine에 대한 대사 플럭스를 증가시킬 수 있다. 상기 argE는 N-acetylornithinase를 코딩하는 유전자이고, argC는 N-acetylglutamylphosphate reductase를 코딩하는 유전자이고, argB는 N-acetylglutamate kinase를 코딩하는 유전자이고, argH는 argininosuccinase를 코딩하는 유전자이다.
또한, 낮은 pH에서 유도되는 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE)는 inducible ornithine decarboxylase와 putrescine/ornithine antiporter를 코딩한다. 따라서, speF-potE 오페론의 야생형 프로모터(native promoter)를 strong promoter로 치환시키면 speF-potE operon을 항시적으로 발현시킬 수 있으므로, 퓨트레신의 생성능을 향상시킬 수 있다.
또한 상기 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD)의 프로모터는 arginine에 의해 억제된다(Charlier and Glansdorff, 2004). 따라서, argD 오페론의 야생형 프로모터(native promoter)를 strong promoter로 치환시키면 Ornithine에 대한 대사 플럭스를 증가시킬 수 있다.
상기 변이 미생물은 앞서 설명한 바와 같이, γ-글루타밀퓨트레신 합성효소(γ-glutamylputrescine synthase)를 코딩하는 유전자(puuA), 퓨트레신 트랜스아민아제(putrescine transaminase)를 코딩하는 유전자(ygjG) 및 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) F를 코딩하는 유전자(argF)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 약화 또는 결실될 수 있다.
또한, 상기 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물은 퓨트레신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac operon repressor를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자 프로모터의 치환 및 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)의 도입과 관련된 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서 본 발명에 있어서, 가장 바람직한 예는 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, arginine 생합성을 위한 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH), 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD) 및 유도 가능한 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 프로모터가 strong promoter로 치환되어 있으며, 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)가 도입 또는 증폭된 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에 있어서, 상기 변이 미생물을 배양하여 퓨트레신을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 퓨트레신을 회수하는 것을 특징으로 하는 퓨트레신의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 변이 미생물의 배양 및 퓨트레신의 수득 과정은 종래 발효공정에서 통상적으로 알려진 배양방법(회분식 배양, 유가식 배양) 및 퓨트레신의 분리 및 정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 퓨트레신의 생물공학적 생산은 세포 내 혹은 세포 외(in vivo or in vitro)에서 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 제거하기 위하여 특정 벡터와 숙주세포로 퓨트레신 생성 미생물인 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 미생물만을 예시하였으나, 다른 종류의 벡터와 퓨트레신 생성 미생물들을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 결실된 변이 미생물의 제조
본 발명에 있어서, 염색체 상의 유전자들(puuA, puuP, ygjG, speE, speG, argF, argI)의 결실은 이중교차상동 재조합(double-crossover homologous recombination)에 의해서 수행되었다(Datsenko, K. A., & Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci., 97:6640-6645, 2000). lox71-chloramphenicol marker (CmR)-lox66 카세트는 타겟 유전자의 상단서열(upstream)과 하단서열(downstream)과 상동하는 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머들을 사용하여 PCR을 통해 제조하였다. lox71-CmR-lox66 카세트를 포함하는 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 PCR의 주형으로 사용하였다. 상기 PCR 산물들은 λ recombinase를 포함하는 전기충격용 대장균 세포(electrocompetent cells)에 트랜스포메이션시켰다. 콜로니들은 클로로암페니콜(Cm; 34μg/ml)을 포함하는 Luria-Bertani (LB) agar (Sambrook, J., Fritsch E. F., & Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000) 플레이트에서 선택되었다. CmR 의 성공적인 유전자 대체는 direct colony PCR에 의해서 확인되었다. 상기 항생제 마커는 차후에 temperature-sensitive replication origin과 IPTG-inducible cre recombinase (Palmeros et al., Gene, 247(1):255-264, 2000)를 포함하는 helper plasmid pJW168에 의해 제거되었다.
1-1: WL3110 균주의 제조
서열번호 1과 2의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, lacI 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, λ recombinase를 함유하는 전기충격용 대장균(W3110)에 electroporation하여 WL3110(W3110 ΔlacI)를 제조하였다.
[서열번호 1] : 5’-GTGAAACCAGTAACGTTATACGATRTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTC TTAGATTGGCAGCATTACACGTCTTG-3’
[서열번호 2] : 5’-TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTA ATGCACTTAACGGCTGACATGGG-3’
1-2: XQ08 균주의 제조
서열번호 3 및 4의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, speE 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-1에서 제조된 WL3110 균주에 electroporation하여 XQ08 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE)를 제조하였다.
[서열번호 3]: 5’-CGCCTGAATAATTTCGGTTGAGAGATGGCGTAAGGCGTCGTTATCTGT CGGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 4]: 5’-ATGTTGCGCCCTTTTTTTACGGGTGTTAACAAAGGAGGTATCAACCCA TGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3’
1-3: XQ17 균주의 제조
서열번호 5 및 6의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, puuA 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-1에서 제조된 WL3110 균주에 electroporation하여 XQ17 균주(W3110 ΔlacI ΔpuuA)를 제조하였다.
[서열번호 5]: 5’-GATGAAACAACCCCGCAAGGGGTATTACGCGTTTTTCAACATCCACTC AAGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 6]: 5’-CGAGCGGAAAACAAACCAAAGGCGAAGAATCATGGAAACCAATATCGT TGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3’
1-4: XQ22 균주의 제조
서열번호 6 및 7의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, puuP 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-3에서 제조된 XQ17 균주(W3110 ΔlacI ΔpuuA)에 electroporation하여 XQ22 균주(W3110 ΔlacI ΔpuuP ΔpuuA)를 제조하였다.
[서열번호 6]: 5’-CGAGCGGAAAACAAACCAAAGGCGAAGAATCATGGAAACCAATATCGT TGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3’
[서열번호 7]: 5’-TCACCATCATACAACGGCACTTTGCGATAGCGGCGGATCAGATACCA TAAGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
1-5: XQ23 균주의 제조
서열번호 8 및 9의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, speE 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-1에서 제조된 WL3110 균주에 electroporation하여 XQ23-1 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE)를 제조하였다.
[서열번호 8]: 5’-CGCCTGAATAATTTCGGTTGAGAGATGGCGTAAGGCGTCGTTATCTG TCGGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 9]: 5’-ATGTTGCGCCCTTTTTTTACGGGTGTTAACAAAGGAGGTATCAACCC ATGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3’
서열번호 10 및 11의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, speG 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 앞서 제조된 XQ23-1 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE)에 electroporation하여 XQ23-2 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG)를 제조하였다.
[서열번호 10]: 5’-GAATGTAAGGACACGTTATGCCAAGCGCCCACAGTGTTAAGCTACG CCCGGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 11]: 5’-CTATTGTGCGGTCGGCTTCAGGAGAGTCTGACCCGGTGTTTTGTGCT CTGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3’
서열번호 12 및 13의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, argI 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다.
[서열번호 12]: 5’-TAATGTGATGCCGGGATGGTTTGTATTTCCCGGCATCTTTATAGCGA TAGGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 13]: 5’-CCATATAAATTGAATTTTAATTCATTGAGGCGTTAGCCACAGGAGGG ATCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3’
다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 이를 주형으로 하고, 서열번호 14 및 15의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 앞서 제조된 XQ23-2 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG)에 electroporation하여 XQ23 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI)를 제조하였다.
[서열번호 14]: 5’-ATAGCAATAGAACACTTTGGGTGGAAGAATAGACCTATCACTGCATA AAATAATGTGATGCCGGGATGGTT-3’
[서열번호 15]: 5’-CCACCTTTGTGACAAAGATTTATGCTTTAGACTTGCAAATGAATAAT CATCCATATAAATTGAATTTTAA-3’
1-6: XQ26 균주의 제조
상기 1-3에서 제조된 puuA 유전자가 결실된 PCR 산물 및 상기 1-4에서 제조된 puuP 유전자가 결실된 PCR 산물을 순차적으로 XQ23 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI)에 electroporation하여 XQ26 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA)를 제조하였다.
1-7: XQ27 균주의 제조
서열번호 16 및 17의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, ygjG 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다.
[서열번호 16]: 5’-CTGCAATACTTAAATCGGTATCATGTGATACGCGAGCCTCCGGAGCA TATGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 17]: 5’-CGTCGTATCGCCATCCGATTTGATATTACGCTTCTTCGACACTTACT CGCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3’
제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-5에서 제조된 XQ23-2 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG)에 electroporation하여 XQ27-1 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG)를 제조하고, 여기에 상기 1-3에서 제조된 puuA 유전자가 결실된 PCR 산물 및 상기 1-4에서 제조된 puuP 유전자가 결실된 PCR 산물을 순차적으로 electroporation하여 XQ27 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔpuuP ΔpuuA)를 제조하였다.
1-8: XQ29 균주의 제조
상기 1-7에서 제조된 ygjG 유전자가 결실된 PCR 산물을 상기 1-6에서 제조된 XQ26 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA)에 electroporation 하여 XQ29 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA)를 제조하였다.
실시예 2: 프로모터의 치환
퓨트레신의 생성능을 향상시기키 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 변이 균주(XQ26)의 프로모터를 strong promoter인 trc로 치환시켰다.
2-1: XQ33 균주의 제조
argECBH 오페론의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc 프로모터로의 교환은 하기의 내용에 따라 수행하였다.
융합된 lox71-클로로암페니콜 항생제 마커-lox66 DNA 절편은 주형으로 pECmulox, 프라이머로 서열번호 18, 19를 사용하여 첫 번째 PCR을 통해 획득하였다.
[서열번호 18]: 5’-TATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGT CAACAGCTGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 19]: 5’-TATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGT CAACAGCTCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3’
trc 프로모터를 도입하기 위하여, 첫번째 PCR산물을 주형으로서 사용하고, 서열번호 20 및 21의 프라이머를 사용하여 2번째 PCR 반응을 수행하였다.
[서열번호 20]: 5’-CGCTGGCACCCACAATCAGCGTATTCAACATGGTCTGTTTCCTGTGT GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3’
[서열번호 21]: 5’-TCTCGATAAATGGCGGTAATTTGTTTTTCATGGTCTGTTTCCTGTGT GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3’
최종 PCR 산물로 상동성 부위를 도입하기 위하여, 두 번째 PCR산물을 주형으로 하고, 서열번호 22와 23의 프라이머를 사용하여 3번째 PCR반응을 수행하였다.
[서열번호 22]: 5’-ATGTTCATATGCGGATGGCGATTTACATAGGTCACTAGCTCTGCGCC AGCGTAGCCGCTGGCACCCACAATCAGC-3’
[서열번호 23]: 5’-TCGAGTGCCTCTTCCGTGGCGCTTATTGAAGGTGTGGCAATCAGAGC GCGGTAAATCTCGATAAATGGCGGTAAT-3’
최종 PCR 산물을 상기 1-6에서 제조된 XQ26 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA)에 electroporation 하여 재조합 미생물을 제작한 다음, 이를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하여, XQ33 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc)를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
2-2: XQ37 균주의 제조
speF-potE 오페론의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc promoter로의 교환은 하기 방식에 따라 수행하였다.
첫 번째 PCR 반응은 주형으로써 플라스미드인 pECmulox와 상기의 서열번호 19와 하기의 서열번호 24 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 24]: 5’-ACTAAGGGCACTTCAGCGTACAGGTCTTCCTGACTCTCTGTAGACAC TATAGAACGCGGCCG-3’
두 번째 PCR반응은 첫 번째 PCR산물을 주형으로서 사용하고, 서열번호 25 및 26의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 25]: 5’-AGCTTCGACTTTCACTTCTTCAATGCCCGTTAGTCTACCGACTAAGG GCACTTCAGCGTA-3’
[서열번호 26]: 5’-AATCACTAACCGCAATTTTTAATTTTGACATGGTCTGTTTCCTGTG TGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3’
세 번째 PCR반응은 두 번째 PCR산물을 주형으로 하고. 서열번호 27 및 28의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 27]: 5’-AAGGCGGACAACTCATATTATGAAGTTTGCTCATCGCAATAGCTTCG ACTTTCACTTCTT-3’
[서열번호 28]: 5’-CGACTTTCATTAATGTAGATACATTCTCGCTGCGTGGTAAAACAGTC CGGGCAAGAATCACTAACCGCAATTTTTAA-3’
최종 PCR 산물을 상기 2-1에서 제조된 XQ33 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc)에 electroporation 하여 재조합 미생물을 제작한 다음, 이를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서, 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하여 XQ37 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc)를 제조하였다. trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
2-3: XQ39 균주의 제조
argD 오페론의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc promoter로의 교환은 하기 방식에 따라 수행하였다.
첫 번째 PCR반응은 pECmulox를 주형으로 하고 상기의 서열번호 19와 하기의 서열번호 29의 프라이머를 이용하여 수행하였다.
[서열번호 29]: 5’-CAACTGCTGGCTAATTTCCTGCATCGCTGATTTCTGATTGGACACTA TAGAACGCGGCCG-3’
두 번째 PCR반응은 첫 번째 PCR산물을 주형으로서 사용하고, 서열번호 30 및 31의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 30]: 5’- GCAGTTCCATCCAGAAAGTATTCTTAGCGAACAAGGACATCAACTG CTGGCTAATTTCCT-3’
[서열번호 31]: 5’- CGCGTGTAATTGCTGTTTGTTCAATTGCCATGGTCTGTTTCCTGTG TGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3’
세 번째 PCR반응은 첫 번째 PCR산물을 주형으로서 사용하고, 서열번호 32 및 33의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 32]: 5’- TTATGGGGATTCGCCATCGCCAGTGGGATCTGGAAGGTGTGCAGTT CCATCCAGAAAGTA-3’
[서열번호 33]: 5’- CGGAGCATAAATCGGCAGGATCACTTCATCGAAAGTCGCGCGTGTA ATTGCTGTTTGT-3’
최종 PCR산물은 상기 2-2에서 제조된 XQ37 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc)에 electroporation 하여 XQ39 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc)를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하였다. trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
2-4: XQ43 균주의 제조
speC 유전자의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc promoter로의 교환은 하기 방식에 따라 수행하였다. 첫 번째 PCR 반응은 pECmulox를 주형으로 하고 상기의 서열번호 19와 하기의 서열번호 36의 프라이머를 이용하여 수행하였다.
[서열번호 36]: 5’-TTTGCCCGATGCACGCCATCTCCTTACATTCTCTCGCTTATCGCCG TTTCGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
두 번째 PCR반응은 첫 번째 PCR산물을 주형으로서 사용하고, 서열번호 37 및 38의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 37]: 5’-TGCCATGATTGCGCGAATTTTCTCCTCTCTGTACGGAGTTTGCCCG ATGCACGCCAT-3’
[서열번호 38]: 5’- TACTGGCGGCAATATTCATTGATTTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGA AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAT-3’
세 번째 PCR반응은 두 번째 PCR산물을 주형으로서 사용하고, 서열번호 39 및 40의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 39]: 5’- GATGGCTTGTTTGTTCGCAAAGTCCTGGCTTGCACGCTTTAGCGAA AGGTGCCATGATTGCGCGAATTT-3’
[서열번호 40]: 5’- ATCTCCCAACGCCACCACGCGACGATGAGAAGAAAGTCGGGATACC AGTTCACTACTGGCGGCAATATTCATTGA-3’
최종 PCR산물은 상기 2-3에서 제조된 XQ39 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc)에 electroporation 하여 XQ43 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc PspeC::Ptrc)를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하였다. trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
실시예 3: 변이 미생물을 이용한 퓨트레신의 제조
실시예 1 및 2에서 제조된 표 1의 변이 균주(E. coli K12 WL3110 변이체)들을 4g/L (NH4)2HPO4, 13.5g/L KH2PO4, 1.7g/L citric acid, 0.7g/L MgSO4·7H2O, 0.5% (v/v) trace metal solution으로 구성되는 최소 R배지(Lee, S. Y., & Chang, H. N., Biotechnol. Lett., 15: 971-974, 1993)에서 플라스크 컬쳐하였다. Trace metal solution은 1리터당 5M HCl: 10g FeSO4·7H2O, 2.25g ZnSO4·7H2O, 1g CuSO4·5H2O, 0.5g MnSO4·5H2O, 0.23g Na2B4O7·10H2O, 2g CaCl2·2H2O, 및 0.1g (NH4)6Mo7O24을 포함한다. 포도당(100g/l) 저장 용액은 별도로 멸균시켰고, 최종 농도 10g/l까지 멸균된 배지에 추가 하였다.
LB 배지에서 활성화된 100μL 세포 컬쳐들을 예비 최소배지로 접종시킨 후, 30℃, 220 rpm으로 24시간동안 최대 OD600이 5가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 이 들 중 1ml을 동일한 배지 50mL을 포함하는 350-mL baffled flask에 첨가한 후, 30℃, 220 rpm으로 15시간 동안 배양하였다. 원심분리를 이용하여 세포를 분리한 후에, 해리된 상등액을 HPLC로 분석하였다. 상등액에 포함된 아민들은 휴렛페커드 1100 시리즈 장비(230nm 영역)에서 ophthaldialdehyde(OPA) 유도체로 검출하였다. 이 장비는 a C18-reverse phase column equilibrated to buffer A (buffer A, 45% 0.1 M sodium acetate pH 7.2/Methanol buffer B methanol)를 사용한다. 분석은 다음의 조건(1-6min 100% A equilibration, 6-10min linear gradient from 0 to 30% buffer B, 10-15min 30% to 50% buffer B, 15-19min 50% to 100% buffer B, 19-23min 100% buffer B and 23-25 min from 100% to 30% buffer B, 25-28min from 30% B to 100% A with a flow rate of 0.8 ml/min)에서 수행되었다. 이때, 보정을 위하여 표준물질을 사용하였으며, 측정된 퓨트레신(putrescine)의 농도를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2009001103-appb-T000001
표 1로부터, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(puuP, puuA, speE, speG, argI)가 결실된 변이 미생물들은 결실된 유전자의 종류 및 그 수에 따라 퓨트레신의 생성능이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 상기 변이 미생물의 arginine 생합성을 위한 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH), 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD) 및 유도 가능한 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE), 오르니틴 디카르복실라제를 코딩하는 유전자(speC) 프로모터가 strong promoter로 교환된 경우, 퓨트레신의 생성능이 더욱 증가되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)의 증폭
4-1: 플라스미드 pKKSpeC 제조
항시적, 생합성적 E.coli W3110의 speC를 코딩하는 ornithine decarboxylase는 tac promoter의 강한 유전자 발현을 진행하는 pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 발현벡터로 클로닝하였다. E.coli W3110 (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 34와 35의 프라이머를 이용하여, PCR을 수행함으로써, speC 절편(2156bp)을 제조하였다.
[서열번호 34]: 5’-CAGCGAATTCATGAAATCAATGAATATTGCC-3’
[서열번호 35]: 5’-CATTCTGCAGTTACTTCAACACATAACCGTA-3’
다음으로 제조된 speC 절편(2156bp) 및 pKK223-3 플라스미드에 제한효소(EcoRI 와 PstI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 speC 절편 및 pKK223-3 플라스미드를 중합시킴으로써, high copy number의 재조합 플라스미드인 벡터 pKKSpeC를 제조하였다.
4-2: 플라스미드 p15SpeC 제조
항시적, 생합성적 E. coli W3110의 speC를 코딩하는 ornithine decarboxylase는 tac promoter의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15K(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock) 발현벡터로 클로닝하였다. E. coli W3110 (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 34와 35의 프라이머를 이용하여, PCR을 수행함으로써, speC 절편(2156bp)을 제조하였다.
다음으로 제조된 speC 절편(2156bp) 및 pTac15K 플라스미드에 제한효소(EcoRI 와 PstI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 speC 절편 및 pTac15K 플라스미드를 중합시킴으로써, low copy number의 재조합 플라스미드인 벡터 p15SpeC를 제조하였다.
4-3: WL3110/pKKSpeC 균주의 제조
실시예 1-1에서 제조된 WL3110 균주에 상기 4-1에서 제조된 pKKSpeC 벡터를 도입시켜 WL3110/pKKSpeC 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
4-4: XQ17/pKKSpeC 균주의 제조
실시예 1-3에서 제조된 XQ17 균주에 상기 4-1에서 제조된 pKKSpeC 벡터를 도입시켜 XQ17/pKKSpeC 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
4-5: XQ22/pKKSpeC 균주의 제조
실시예 1-4에서 제조된 XQ22 균주에 상기 4-1에서 제조된 pKKSpeC 벡터를 도입시켜 XQ22/pKKSpeC 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
4-6: XQ26/pKKSpeC 균주의 제조
실시예 1-6에서 제조된 XQ26 균주에 상기 4-1에서 제조된 pKKSpeC 벡터를 도입시켜 XQ26/pKKSpeC 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
4-7: XQ33/pKKSpeC 균주의 제조
실시예 2-1에서 제조된 XQ33 균주에 상기 4-1에서 제조된 pKKSpeC 벡터를 도입시켜 XQ33/pKKSpeC 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
4-8: XQ37/pKKSpeC 균주의 제조
실시예 2-2에서 제조된 XQ37 균주에 상기 4-1에서 제조된 pKKSpeC 벡터를 도입시켜 XQ37/pKKSpeC 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
4-9: XQ39/pKKSpeC 균주의 제조
실시예 2-3에서 제조된 XQ39 균주에 상기 4-1에서 제조된 pKKSpeC 벡터를 도입시켜 XQ39/pKKSpeC 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
4-10: XQ43/p15SpeC 균주의 제조
실시예 2-4에서 제조된 XQ43 균주에 상기 4-2에서 제조된 p15SpeC 벡터를 도입시켜 XQ43/p15SpeC 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
실시예 5: ornithine decarboxylase를 코딩하는 유전자(speC)가 증폭된 변이 미생물을 이용한 퓨트레신의 제조
실시예 4에서 제조된 변이 균주들을 실시예 3과 동일한 배지를 함유하는 shake flask에서 배양하였다.
LB 배지에서 활성화된 100μL 세포 컬쳐들을 예비 최소배지로 접종시킨 후, 30℃, 220 rpm으로 30시간 동안 최대 OD600이 5가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 이들 중 1ml을 동일한 배지 50mL을 포함하는 350-mL baffled flask에 첨가한 후, 30℃, 220 rpm으로 27시간 동안 배양하였다. 원심분리를 이용하여 세포를 분리한 후에, 해리된 상등액을 HPLC로 실시예 3과 동일한 조건에서 분석하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2009001103-appb-T000002
표 2로부터, ornithine decarboxylase speC와 함께 동시발현되었을 때, 감소된 퓨트레신 분해 및 이용 활성도를 갖는 변이 미생물들(WL3110/pKKSpeC, XQ17/pKKSpeC, XQ22/pKKSpeC, XQ26/pKKSpeC, XQ33/pKKSpeC, XQ37/pKKSpeC, XQ39/pKKSpeC 및 XQ43/p15SpeC)은 pKKSpeC 또는 p15SpeC가 도입되지 않은 표 1의 변이 미생물(WL3110, XQ17, XQ22, XQ26, XQ33, XQ37, XQ39 및 XQ43)보다 퓨트레신 생산이 월등히 증가되었음을 알 수 있었다.
실시예 6: XQ37/pKKSpeC 균주의 유가식 배양을 통한 퓨트레신의 제조
감소된 퓨트레신 분해 및 이용 활성도의 포텐셜을 증가된 오르니신 디카르복실레이즈 활성도와 함께 유가식 발효에서 분석하였다. 유가식 발효는 R배지 2리터에 10g/l 농도의 포도당을 첨가한 후, 6.6리터 발효기(Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에서 수행하였다. LB배지에서 활성화된 XQ37/pKKSpeC 컬쳐 중 1ml을 동일한 배지 50mL을 포함하는 350-mL baffled flask에 첨가한 후, 30℃, 220rpm으로 24시간동안 OD600이 5가 될 때까지 배양하였다. 예비 컬쳐 200ml은 그 후 발효기로 접종하기 위해 사용되었다. 용존산소(Dissolved oxygen)는 850 rpm의 교반속도를 자동적으로 증가시킴으로써 포화공기 20%로써 유지되었다. 포도당 고갈에 따라 고정된 pH 6.8보다 0.02 정도로 더 올라갔을 때, 포도당 농도롤 3g/l 이상으로 증가시키기 위해 공급 용액은 자동적으로 추가되었다. 또한 공급용액은 500g/l의 포도당과 200g/L의 (NH4)2SO4를 포함한다. 포도당 고갈에 따른 pH증가의 짧은 시간을 제외하면, 대부분 28% (v/v) 암모니아 용액을 추가시킴으로써 pH를 6.8로 유지시켰다. 샘플을 채취하고, 원심분리를 사용하여 세포를 분리한 후에 해리된 상등액을 실시예 3과 동일한 방법으로 HPLC 분석하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, XQ37/pKKSpeC균주는 접종 55.8시간 후, 14.3g/l의 퓨트레신을 생산하였고, 최대 퓨트레신 생산성(productivity)는 접종 47시간 후, 0.28g L-1 h-1 이었다.
실시예 7: XQ39 균주의 유가식 배양을 통한 퓨트레신의 제조
XQ37/pKKSpeC 균주 대신에 XQ39 균주를 사용한 것을 제외하고, 실시예 6과 동일한 방법으로 유가식 발효를 수행하였고, 발효액을 HPLC로 분석하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, XQ39 균주는 접종 36시간 후, 14.7g/l의 퓨트레신을 생산하였고, 최대 퓨트레신 생산성(productivity)는 접종 31시간 후, 0.42g L-1 h-1 이었다.
실시예 8: XQ43 균주의 유가식 배양을 통한 퓨트레신의 제조
실시예 2에서 제조된 XQ43균주를 2g/L (NH4)2HPO4, 6.75g/L KH2PO4, 0.85g/L citric acid, 0.7g/L MgSO4·7H2O, 0.5% (v/v) trace metal solution으로 구성되는 최소 R/2배지(Qian et al., Biotechnol.and Bioeng, 101(3): 587-601, 2008)에 3g/L of (NH4)2SO4가 추가된 배지 50ml 에서 플라스크 컬쳐하였다.
Trace metal solution은 1리터당 5M HCl: 10g FeSO4·7H2O, 2.25g ZnSO4·7H2O, 1g CuSO4·5H2O, 0.5g MnSO4·5H2O, 0.23g Na2B4O7·10H2O, 2g CaCl2·2H2O, 및 0.1g (NH4)6Mo7O24을 포함한다. 포도당(100g/l) 저장 용액은 별도로 멸균시켰고, 최종 농도 10g/l까지 멸균된 배지에 추가 하였다. 이 때, LB배지에서 활성화된 XQ43 컬쳐 중 1ml을 상기에 제시된 배지 50mL을 포함하는 350mL baffled flask에 첨가한 후, 37℃, 220rpm으로 24시간동안 OD600이 3.3이 될 때까지 배양하였다. 예비 컬쳐 200ml은 그 후 발효기로 접종하기 위해 사용되었다. 용존산소(Dissolved oxygen)는 1000 rpm의 교반속도를 자동적으로 증가시킴으로써 포화공기 20%로써 유지되었다.
XQ43 균주의 유가식 발효는 상기와 동일한 배지에 10g/l 농도의 포도당을 첨가한 후, 6.6리터 발효기(Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에서 수행하였다. 포도당 고갈에 따라 고정된 pH 6.8보다 0.01 정도로 더 올라갔을 때, 포도당 농도롤 2g/l 이상으로 증가시키기 위해 공급 용액은 자동적으로 추가되었다. 또한 공급용액은 522g/l의 포도당과 8g/L의 MgSO4 170g/L의 (NH4)2SO4를 포함한다. 포도당 고갈에 따른 pH증가의 짧은 시간을 제외하면, 대부분 10M KOH 용액을 추가시킴으로써 pH를 6.8로 유지시켰다. 샘플을 채취하고, 원심분리를 사용하여 세포를 분리한 후에 해리된 상등액을 실시예 3과 동일한 방법으로 HPLC 분석하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, XQ43균주는 접종 30시간 후, 18.0g/l의 퓨트레신을 생산하였고, 최대 퓨트레신 생산성(productivity)은 접종 28시간 후, 0.63g L-1 h-1 이었다.
실시예 9: XQ43/p15SpeC 균주의 유가식 배양을 통한 퓨트레신의 제조
XQ43 균주 대신에 XQ43/p15SpeC 균주를 사용한 것을 제외하고, 실시예 8과 동일한 방법으로 유가식 발효를 수행하였고, 발효액을 HPLC로 분석하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, XQ43/p15SpeC 균주는 접종 37시간 후, 21.7g/l의 퓨트레신을 생산하였고, 최대 퓨트레신 생산성(productivity)는 접종 37시간 후, 0.58g L-1 h-1 이었다.
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하고, 이를 이용함으로써, 산업적으로 널리 사용되는 퓨트레신을 고수율로 제조하는데 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (31)

  1. 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, γ-글루타밀퓨트레신 합성효소(γ-glutamylputrescine synthase)를 코딩하는 유전자(puuA), 퓨트레신 트랜스아민아제(putrescine transaminase)를 코딩하는 유전자(ygjG) 및 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) F를 코딩하는 유전자(argF)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 퓨트레신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac operon repressor를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  8. 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, arginine 생합성을 위한 argECBH 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH), 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD) 및 유도 가능한 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 프로모터가 strong promoter로 치환된 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  9. 제8항에 있어서, γ-글루타밀퓨트레신 합성효소(γ-glutamylputrescine synthase)를 코딩하는 유전자(puuA), 퓨트레신 트랜스아민아제(putrescine transaminase)를 코딩하는 유전자(ygjG) 및 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) F를 코딩하는 유전자(argF)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 퓨트레신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac operon repressor를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  11. 제8항에 있어서, 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  13. 제8항 또는 제12항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  14. 제8항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물.
  15. 퓨트레신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, γ-글루타밀퓨트레신 합성효소(γ-glutamylputrescine synthase)를 코딩하는 유전자(puuA), 퓨트레신 트랜스아민아제(putrescine transaminase)를 코딩하는 유전자(ygjG) 및 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) F를 코딩하는 유전자(argF)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  17. 제15항에 있어서, 퓨트레신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac operon repressor를 코딩하는 유전자(lacI)를 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  18. 제15항에 있어서, 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)를 추가로 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 발현벡터는 pKKSpeC 또는 p15SpeC인 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  23. 퓨트레신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 퓨트레신(putrescine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 스퍼미딘 합성효소(spermidine synthase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) I를 코딩하는 유전자(argI) 및 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 다음, arginine 생합성을 위한 오페론을 코딩하는 유전자(argECBH), 아세틸오르니틴 아미노 트랜스아민아제를 코딩하는 유전자(argD) 및 유도 가능한 오르니틴 디카르복실라제(inducible ornithine decarboxylase)와 퓨트레신/오르니틴 안티포터(putrescine/ornithine antiporter)를 코딩하는 유전자(speF-potE)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 프로모터를 strong promoter로 치환시키는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, γ-글루타밀퓨트레신 합성효소(γ-glutamylputrescine synthase)를 코딩하는 유전자(puuA), 퓨트레신 트랜스아민아제(putrescine transaminase)를 코딩하는 유전자(ygjG) 및 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) F를 코딩하는 유전자(argF)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 퓨트레신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac operon repressor를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  26. 제23항에 있어서, 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)를 추가로 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(speC)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  28. 제23항 또는 제27항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 발현벡터는 pKKSpeC 또는 p15SpeC인 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  30. 제23항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퓨트레신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  31. 제1항 내지 제14항중 어느 한 항의 변이 미생물을 배양하여 퓨트레신을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 퓨트레신을 회수하는 것을 특징으로 하는 퓨트레신의 제조방법.
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