ES2589378T3 - Microorganismo mutante con capacidad elevada para producir putrescina, y preparación de putrescina usando el mismo - Google Patents
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Abstract
Un microorganismo mutante que tiene la capacidad para producir putrescina, en el que está inactivado o suprimido al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen speE que codifica espermidina sintasa, un gen speG que codifica espermidina N-acetiltransferasa, un gen argI que codifica monómero de la cadena I de ornitina carbamoiltransferasa, y un gen puuP que codifica el importador de putrescina, que están implicados en la ruta de degradación o utilización de putrescina; y en el que además está inactivado o suprimido al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen puuA que codifica γ-glutamilputrescina sintasa, un gen ygjG que codifica putrescina transaminasa, y un gen argF que codifica ornitina carbamoiltransferasa F; y en el que un promotor de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen argECBH que codifica un operón para la biosíntesis de arginina, un gen argD que codifica acetilornitina aminotransferasa, y un gen speF-potE que codifica ornitina descarboxilasa inducible y el antiportador de putrescina/ornitina, se sustituye por un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor trc, un promotor tac, un promotor T7, un promotor lac y un promotor trp; y seleccionado del grupo que consiste en Bacillus sp. y Escherichia sp.
Description
mediante la primera reacción de PCR con los cebadores de SEQ ID NOS: 18 y 19 usando pECmulox como molde.
A fin de introducir el promotor trc, se llevó a cabo la segunda reacción de PCR con los cebadores de SEQ ID NOS: 20 y 21 usando como molde el producto de la primera PCR. A fin de introducir regiones homólogas en el producto de la PCR final, se llevó a cabo la tercera reacción de PCR con los cebadores de SEQ ID NOS: 22 y 23 usando como molde el producto de la segunda PCR.
El producto de la PCR final se electroporó en la cepa XQ26 (W3110 (W3110) lacI (W3110) speE (W3110) speG (W3110) argI (W3110) puuP (W3110) puuA) preparada en al Ejemplo 1-1, construyendo así un microorganismo recombinante. Después, las células del microorganismo mutante se cultivaron en una placa de agar que contiene
15 cloranfenicol, mientras que las células en las que se produjo recombinación homóloga doble se seleccionaron en la placa de agar, preparando así una cepa XQ33 (W3110 (W3110) lacI (W3110) speE (W3110) speG (W3110) argI (W3110) puuP (W3110) puuA PargECBH::Ptrc). Después, la sustitución de la cepa preparada con el promotor trc se confirmó mediante análisis de la secuencia de ADN.
2-2: Preparación de la cepa XQ37
20 La sustitución del promotor nativo del operón speF-potE por el promotor trc se llevó a cabo de la siguiente manera. La primera reacción de PCR se llevó a cabo con los cebadores de SEQ ID NOS: 19 y 24 usando el plásmido pECmulox como molde.
La segunda reacción de PCR se llevó a cabo con los cebadores de SEQ ID NOS: 25 y 26 usando como molde el 25 producto de la primera PCR. La tercera reacción de PCR se llevó a cabo con los cebadores de SEQ ID NOS: 27 y 28 usando como molde el producto de la segunda PCR.
El producto de la PCR final se electroporó en la cepa XQ33 (W3110 (W3110) lacI (W3110) speE (W3110) speG (W3110) argI (W3110) puuP (W3110) puuA PargECBH::Ptrc) preparada en el Ejemplo 2-1, construyendo así un
9
microorganismo recombinante. Después, las células del microorganismo recombinante se cultivaron en una placa de agar que contiene cloranfenicol, mientras que las células en las que se produjo la recombinación homóloga doble se seleccionaron en la placa de agar, preparando así una cepa XQ37 (W3110 (W3110) lacI (W3110) speE (W3110) speG (W3110) argI (W3110) puuP (W3110) puuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc). La sustitución con el promotor trc se confirmó mediante análisis de la secuencia de ADN.
2-3: Preparación de la cepa XQ39
La sustitución del promotor nativo del operón argD por el promotor trc se llevó a cabo de la siguiente manera. La primera reacción de PCR se llevó a cabo con los cebadores de SEQ ID NOS: 19 y 29 usando el plásmido pECmulox como molde.
La segunda reacción de PCR se llevó a cabo con los cebadores de SEQ ID NOS: 30 y 31 usando como molde el producto de la primera PCR. La tercera reacción de PCR se llevó a cabo con los cebadores de SEQ ID NOS: 32 y 33 usando como molde el producto de la segunda PCR.
El producto de la PCR final se electroporó en la cepa XQ37 (W3110 (W3110) lacI (W3110) speE (W3110) speG (W3110) argI (W3110) puuP (W3110) puuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc) preparada en el Ejemplo 2-2,
20 preparando así una cepa XQ39 (W3110 (W3110) lacI (W3110) speE (W3110) speG (W3110) argI (W3110) puuP (W3110) puuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc). Después, las células del microorganismo recombinante se cultivaron en una placa de agar que contiene cloranfenicol, mientras que las células en las que se produjo recombinación homóloga doble se seleccionaron en la placa de agar. La sustitución con el promotor trc se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN.
25 2-4: Preparación de la cepa XQ43
La sustitución del promotor nativo del gen speC por el promotor trc se llevó a cabo de la siguiente manera. La primera reacción de PCR se llevó a cabo con los cebadores de SEQ ID NOS: 19 y 36 usando el plásmido pECmulox como molde.
30 La segunda reacción de PCR se llevó a cabo con los cebadores de SEQ ID NOS: 37 y 38 usando como molde el producto de la primera PCR. La tercera reacción de PCR se llevó a cabo con los cebadores de SEQ ID NOS: 39 y 40 usando como molde el producto de la segunda PCR.
10 5
10
15
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25
30
El producto de la PCR final se electroporó en la cepa XQ39 (W3110 (W3110) lacI (W3110) speE (W3110) speG (W3110) argI (W3110) puuP (W3110) puuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc) preparada en el Ejemplo 2-3, preparando así una cepa XQ43 (W3110 (W3110) lacI (W3110) speE (W3110) speG (W3110) argI (W3110) puuP (W3110) puuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc PspeC::Ptrc). Después, las células del microorganismo recombinante se cultivaron en una placa de agar que contiene cloranfenicol, mientras que las células en las que se produjo recombinación homóloga doble se seleccionaron en la placa de agar. La sustitución con el promotor trc se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN.
Ejemplo 3: Producción de putrescina usando microorganismos mutantes
Cada una de las cepas mutantes (mutantes de E. coli K12 WL3110) de la Tabla 1, preparadas en los Ejemplos 1 y 2, se cultivó en un matraz en medio R mínimo que contiene 4 g/l de (NH4)2HPO4, 13,5 g/l de KH2PO4, 1,7 g/l ácido cítrico, 0,7 g/l de MgSO4·7H2O y disolución de metales en trazas al 0,5% (v/v) (Lee, S.Y. y Chang, H.N., Biotechnol. Lett., 15: 971-974, 1993). La disolución de metales en trazas contenía (por litro): 5 M de HCl, 10 g de FeSO4·7H2O, 2,25 g de ZnSO4·7H2O, 1 g de CuSO4·5H2O, 0,5 g de MnSO4·5H2O, 0,23 g de Na2B4O7·10H2O, 2 g de CaCl2·2H2O, y 0,1 g de (NH4)6Mo7O24. De forma separada, una disolución que contiene glucosa (100 g/l) se esterilizó y se añadió al medio esterilizado hasta una concentración final de 10 g/l.
Se inocularon en medio mínimo 100 l de cada uno de los cultivos celulares activados en medio LB, y después se cultivaron a 30ºC a 220 rpm durante 24 horas, hasta que la OD600 máxima alcanzó 5. Después, se añadió 1 ml del caldo de cultivo a un matraz con deflectores de 350 ml que contiene 50 ml del mismo medio, y entonces se cultivó a 30ºC a 220 rpm durante 15 horas. Las células se separaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se analizó mediante HPLC. Las aminas contenidas en el sobrenadante se detectaron mediante derivación con oftaldialdehído (OPA) en un sistema de Hewlett Packard 1100 Series (230 nm) usando una columna de fase inversa C18 (tampón
A: 45% de acetato de sodio 0,1 M, pH 7,2; tampón B: metanol. El análisis se llevó a cabo en las siguientes condiciones: 1-6 min.: equilibración con 100% de tampón A, 6-10 min.: gradiente lineal desde 0 hasta 30% de tampón B, 10-15 min.: gradiente desde 30% hasta 50% de tampón B, 15-19 min.: gradiente desde 50% hasta 100% de tampón B, 19-23 min.: gradiente hasta 100% de tampón B, y 23-25 min.: gradiente desde 100% hasta 30% de tampón B, 25-28 min.: desde 30% de B hasta 100% de A con un caudal de 0.8 ml/min.). Aquí, se usó un patrón para la calibración, y las concentraciones medidas de putrescina se muestran en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1
- Cepa
- Genotipo Concentración de putrescina (mg/l)
- WL3110
- W3110 ΔlcicI 0
- XQ08
- W3110 ΔlacI ΔspeE 0,65
- XQ17
- W3110 ΔlacI ΔpuuA 0
- XQ22
- W3110 ΔlacI ΔpuuP ΔpuuΔ 0,6
- XQ23
- W3110 ΔlacI ΔspaE ΔspeG ΔargI 1,8
- XQ26
- W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA 8,5
- XQ27
- W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔpuuP ΔpuuA 4,2
- XQ29
- W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA 8,5
- XQ33
- W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc 28,3
- XQ37
- W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc 510
- XQ39
- W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc 820
- XQ43
- W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc PspeC::Ptrc 827
Como se puede ver en la Tabla 1, en los microorganismos mutantes en los que se han suprimido los genes (puuP, 11
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