WO2009138146A2 - Neue therapeutika für die hepatitis-therapie - Google Patents

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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Definitions

  • the present invention relates to the use of substances, in particular in the form of inhibitors or repressors, which are capable of regulating the gene activity of a gene associated with the multiplication or replication of hepatitis viruses, in particular hepatitis C viruses, in the context of The field of diagnosis and therapy of hepatitis, in particular hepatitis type C.
  • the gene associated with the multiplication or replication of hepatitis C viruses is preferably the human interferon-stimulated gene ISG1.
  • the present invention relates to the use of a substance which inhibits or at least degrades the gene activity of a substance associated with the multiplication or replication of hepatitis viruses, in particular hepatitis C viruses, in particular hepatitis C viruses, in particular inhibitors or repressors, for the manufacture of a medicament or medicament for the prophylactic or curative treatment of hepatitis, in particular hepatitis type C.
  • the present invention relates to the use of an interferon-stimulated gene, in particular ISGl 5, for the discovery or provision of a medicament for the prophylactic or curative treatment of hepatitis, in particular hepatitis type C, and / or for the prediction of individual drug effects and / or for the prediction of side effects or the response of medicinal products.
  • an interferon-stimulated gene in particular ISGl 5
  • ISGl 5 for the discovery or provision of a medicament for the prophylactic or curative treatment of hepatitis, in particular hepatitis type C, and / or for the prediction of individual drug effects and / or for the prediction of side effects or the response of medicinal products.
  • the present invention relates to a method for the identification of substances, in particular inhibitors or repressors, which are the gene activity of an interferon-stimulated gene, in particular in connection with the multiplication or replication of hepatitis viruses, in particular hepatitis C viruses ISG 15, or a method for the identification of substances that regulate the activity of the corresponding gene products or gene-related products. Furthermore, the present invention relates to a Process for improving the pharmacological properties of these substances.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition which contains at least one pharmacologically active substance, in particular inhibitor or repressor, which is found on the basis of the inventive methods, the substance having the gene activity of one with the replication or replication of hepatitis C viruses influenced gene, in particular inhibits or inhibits;
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, preferably for the prophylactic or therapeutic treatment of hepatitis C diseases, which contains at least one siRNA in effective, especially pharmaceutically effective amounts.
  • HCV hepatitis C virus
  • the hepatitis C virus belongs to the family of Flaviviridae and is the only representative of the genus Hepaciviren.
  • the hepatitis C virus was originally assigned to the so-called NonA-NonB hepatitis viruses, until in 1989 succeeded in the sequencing of the viral genome.
  • Today, six genotypes are characterized, which in turn subdivide into subtypes. Infection with the virus takes place in most cases via transfusion of infected blood reserves, especially in the seventies, or via cannula puncture wounds, for example, to hospital staff. Other transmission options include unprotected intercourse and the use of common injections among drug addicts.
  • the acute infection is usually asymptomatic. In about 70 to 80% of cases, chronic liver infection then occurs which can lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma.
  • Interferon in particular ⁇ -interferon (synonymously also referred to as interferon-alpha or IFN- ⁇ , preferably pegylated IFN- ⁇ , as the hitherto most efficient therapy of chronic hepatitis type C), is used in the prior art. optionally in combination with the antiviral ribavirin. Depending on the genotype and other factors, this therapy will cure only in 50% to 90% of patients. One of the most common side effects of this therapy is IFN-induced major depression, which, in addition to deteriorating quality of life, may lead to discontinuation or even suicide. A vaccine against the hepatitis C virus has not yet been developed.
  • Interferons are low-molecular proteins and are counted among the cytokines.
  • Type I interferons occur in monomeric form and can be subdivided into superfamilies whose main difference is their origin.
  • IFN- ⁇ and IFN-ß account for most of type I interferons.
  • the group of ⁇ -interferons in turn, can be subdivided into a number of subtypes that are expressed by different genes. They are produced largely in leukocytes and fibroblasts, while IFN-ß is mainly produced by endothelial cells and fibroblasts.
  • IFN- ⁇ and IFN- ⁇ belong to type I interferons.
  • Type I interferons is induced by the recognition of viral as well as bacterial pathogenic patterns. They are secreted by infected cells and act both paracrine on neighboring cells and autocrine on the IFN-producing cell itself. Binding to the receptor triggers a signal cascade that ends in the induction of interferon-stimulated genes (ISGs).
  • ISGs interferon-stimulated genes
  • the enzymes E1, E2 and E3 are also up-regulated by type I interferons, leading to increased ISG-ylation and enhancing the interferon response.
  • Uspl ⁇ the protease that reverses ISGylation, - A -
  • interferons are used for the therapy of tumors, autoimmune diseases and viral infections (e.g., HBV and HCV) because of their properties and the ability to induce a variety of cellular defense mechanisms and to support the body's immune response.
  • autoimmune diseases and viral infections e.g., HBV and HCV
  • the use of pegylated IFN- ⁇ 2a or IFN- ⁇ 2b in combination with the nucleoside analog ribavirin (RBV) has in particular established itself in the therapy of hepatitis type C diseases or infections.
  • the response to therapy depends on the HCV genotype, viral load, age of the patient, already incurred liver damage, and co-infections.
  • genotype 2 and 3 genomes up to 80% of patients have a sustained virus decline after 24 weeks, whereas only genotypes of genotype 1 infections respond to treatment, with a continuing decline in the number of genotypes Viral load after 48 weeks at a body weight-dependent RBV dosage have.
  • the response to therapy can be divided into two phases. Early viral response (EVR), depending on the genotype and the dose of drugs used in the first phase, is followed by a slower, but sustained, decreased viral response (SVR). in the second phase. Investigations have shown that, if within the first 12 weeks after initiation of therapy no EVR with a decrease in viral load by at least 21og 1 o-phases, no sustained response is expected and the therapy can be stopped. Different expression patterns of ISGs in both peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and liver biopsies from patients also allow predictions of response to therapy to be made. A disadvantage of the aforementioned therapy of the prior art are thus sometimes strong side effects, especially as regards the formation of depression, and the fact that an effective therapeutic success - as described above - is not always guaranteed.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • an object of the present invention is to provide new and efficient therapy or treatment options for hepatitis diseases, in particular hepatitis C diseases, which have over the approaches known in the art, a higher efficacy with reduced side effect should.
  • a further object of the present invention is to provide a method for the determination of substances or substances as such, with which the gene expression or gene activity related in connection with the multiplication or replication of hepatitis C viruses Genes, in particular ISGl 5, can be reduced or prevented in order to at least reduce virus replication or replication.
  • a further object of the present invention is to provide a method by which specific genes can be identified, which are significantly involved in the multiplication or replication of hepatitis C virus, which are preferably human or interferon-stimulated genes.
  • the Applicant has succeeded, in a completely surprising manner, for the first time in identifying a specific gene which is significantly associated with the multiplication or replication of hepatitis C viruses in a host system, in particular in humans .
  • the Applicant has surprisingly found that the interferon-stimulated gene ISG 15 is significantly involved in the aforementioned proliferation or replication of hepatitis C virus and induction or activation of this gene can lead to an undesirable increase in virus replication.
  • the gene ISG1 5 identified with regard to its relevance with regard to the multiplication or replication of hepatitis C viruses can thus be used as a basis for methods or medicaments for the therapy of a hepatitis C disease or infection, according to the invention is turned off on an inactivation of the corresponding gene.
  • the Applicant has found in completely surprising manner that the specific use of an inhibitor or repressor, with which the (gene) activity of the gene in connection with the multiplication or replication of hepatitis C virus, in particular ISG 15, and thus influencing its gene activity leads to a significant reduction of hepatitis C viral load, which is largely due to a significantly reduced proliferation or replication of the hepatitis C virus.
  • the Applicant was able to show, quite surprisingly, that the targeted use of a so-called siRNA tailored specifically to ISG 15 or directed against ISG 15 leads to a significant decrease in the gene activity of ISG 15 and consequently to a significant decrease decreased synthesis or proliferation or replication of hepatitis C virus in the host system leads.
  • the Applicant has succeeded in providing a completely novel and, in addition, low-side-effects therapeutic approach, on the basis of which hepatitis C disease can be effectively treated.
  • the present invention - according to a first aspect of the present invention - is thus the use according to the invention as claimed in claim 1, that is to say in other words the use of an inhibitor and / or repressor of a protein associated with the propagation and / or replication of yeast.
  • Patitis viruses in particular hepatitis C viruses, related nucleic acid molecule, in particular gene and / or its DNA sequence and / or its associated RNA sequence and / or its associated (poly) peptide for the manufacture of a medicament for prophylactic and / or therapeutic treatment of hepatitis, especially hepatitis type C.
  • the central idea of the present invention thus lies in specifically lowering and / or inhibiting, in particular, the gene activity of such a gene, which is associated with the multiplication or synthesis or synthesis of hepatitis C virus.
  • the term "inhibitor” and / or “repressor” used according to the invention refers in particular to a gene activity-reducing and / or suppressing, in particular inhibiting substance.
  • the inhibitor or the repressor thus constitutes a compound which suppresses or at least minimizes the activity of the gene, the pharmacological action of the inhibitor or repressor being at the gene level, ie, for example, by a direct interaction with the gene or its associated Promoters and / or enhancers, as well as at the level of the gene product (s), such as transcription products (eg mRNA) and / or translation products (eg proteins).
  • s such as transcription products (eg mRNA) and / or translation products (eg proteins).
  • the inhibitor or repressor used according to the invention can reduce expression or gene activity, for example, and in a non-limiting manner by direct or indirect interaction with the DNA sequence or DNA and / or its associated RNA sequence or mRNA and / or by direct or indirect influence or interaction with the gene product in the form of the gene or of the DNA Sequence coded (poly) peptide lead.
  • the inhibitor or repressor is in particular a substance with antiviral properties against hepatitis viruses, in particular hepatitis C viruses.
  • the present invention aims significantly at a purposeful suppression of gene expression or gene activity of genes related to the replication or synthesis of hepatitis C viruses, in particular ISGl 5, which in general also as gene knockdown or as gene silencing can be called.
  • the corresponding nucleic acid molecule or the corresponding DNA sequence is likewise included in this regard.
  • the present invention also relates equally, as stated above, to the RNA sequence assigned to the gene, in particular mRNA, which acts as a posttranscriptional product, so to speak, and may be complementary to the co-dogenic strand of the DNA of the gene.
  • the (poly) peptide encoded by the nucleic acid or the gene in particular as previously defined, and thus to a certain extent the translation product, can also be used or used as the target molecule or "target”.
  • nucleic acid molecule is synonymous with the term “polynucleic acid” or “Polynukleinkla- Ie” and may be related to both DNA and RNA.
  • DNA sequence or “RNA sequence” in this context refers not only to the complete, the gene assigned or corresponding DNA, but also to corresponding sections of the gene or not only in particular in the context of transcription synthesized complete RNA, but also on RNA sections or RNA fragments.
  • the gene considered in the context of the use according to the invention is concerned, it is preferably a human gene.
  • the gene considered in the context of the use according to the invention may be an interferon-stimulated gene (ISG).
  • the gene may be a gene stimulated by Type I interferons, preferably ⁇ -interferon and / or ⁇ -interferon. How to- described above, this is in particular a gene which can be induced or activated as a result of an increased interferon concentration, so that its expression is increased, in particular under the influence of interferon, for example caused by an infection with hepatitis C viruses.
  • the Applicant has found, in a completely surprising manner, that a gene responsible for the replication or replication of hepatitis C viruses is formed by the gene ISG 15. This is likewise an interferon-stimulated gene.
  • the gene in question is ISG 15, in particular with the transcript ID (locus) NM 005101 or in particular according to sequence listing I and / or in particular according to SEQUENCE LISTING.
  • ISG 15 which is also referred to as a so-called Homo sapiens ISG 15 ubiquitin-like modifier to a particularly effective in terms of the use of the invention in the context of the therapy of hepatitis type C target or Target, whose inactivation or suppression leads to a significant reduction of hepatitis C viruses in the host system.
  • sequence listing I given above and the previously mentioned SEQUENCE LISTING refer to the DNA sequence to the gene ISG15.
  • the sequence protocol I is synonymous with the corresponding SEQUENCE LISTING or the same content.
  • the essential difference between the sequence protocols is that the sequence protocol I is based on a scientifically standardized specification or presentation, while the SEQUENCE LISTING was created on the basis of a patent-legally standardized specification or representation using the software PatentIN Version 3.3.
  • this is a purely formal representation, but not a difference in content.
  • the inhibitor or the repressor has a gene associated with the gene, in particular with ISGl 5, or with its DNA sequence and / or with its associated RNA sequence and / or with its ( Poly) peptide interacting substance.
  • the term "inhibitor” or “repressor” is to be understood very broadly; in particular, it may be a substance which directly and / or indirectly, for example via metabolic cascades or signal transduction, with the corresponding target or Target, in particular with ISGl 5, interacts and thereby reduces or inhibits its gene activity, in particular inhibited.
  • the influencing of the gene, in particular of ISGl 5, or of the gene or ISG 15 associated products can also be caused in the form of precursor substances, for example, only in the cell or Host system is converted to the actually interacting substance, for example via metabolism-specific processes.
  • the direct and / or indirect interaction of the substance with the target structure, in particular with the gene, such as ISG 15, can be realized on many levels:
  • the interacting substance or the inhibitor and / or repressor with the promoter and / or enhancer of the gene, in particular of ISG 15, interact and / or interact such that the binding of particular endogenous transcription factors, in particular activators to which promoter and / or enhancer is prevented or at least inhibited.
  • the substance or the inhibitor and / or repressor with a particular endogenous transcription factor, in particular activator interacts such that the binding of the transcription factor, in particular activator, to the promoter and / or enhancer of the gene, in particular of ISGl 5, prevented or at least inhibited.
  • the substance or the inhibitor and / or repressor with a particular endogenous transcription factor, in particular activator interacts such that the binding of the transcription factor, in particular activator, to the promoter and / or enhancer of the gene , in particular of ISG 15, is prevented or at least inhibited.
  • the inhibitor and / or repressor may be used with, in particular, endogenous, mediator-regulated mediators and / or factors, in particular ISG15-regulated mediators and / or factors, and / or with, in particular, endogenous gene regulating mediators and / or factors.
  • ISG 15-regulating mediators and / or factors interact in particular such that the activity of the gene, in particular of ISGl 5, and / or its DNA sequence and / or its associated RNA sequence and / or its associated (Poly -) Peptides reduced and / or prevented, in particular inhibited is.
  • the substance or the inhibitor and / or repressor reacts with the endogenous or endogenous transcription activators themselves and thereby causes an inactivation of the transcription factor or activator per se, in order in this way to inhibit the gene activity, in particular of ISG 15, to reduce or to prevent, in particular to inhibit.
  • the substance used in the context of the use according to the invention in the form of an inhibitor and / or repressor may be, on the one hand, a substance which has been found on the basis of the method for the identification of such substances which is described below.
  • the inhibitor and / or repressor on the other hand may be an RNA sequence which interacts preferentially with the RNA sequence, in particular ISGl 5, associated with the gene, in particular mRNA sequence.
  • the inhibitor or repressor should be an RNA or RNA sequence which is in particular complementary to the RNA or mRNA or RNA sequence or mRNA sequence assigned to the gene.
  • the inhibitor and / or repressor prefferably have an RNA sequence in the form of an oligomer, in particular of 15 to 20 bp (base pairs), preferably 18 to 25 bp, preferably 21 to 23 bp, is.
  • the RNA sequence which interacts with the RNA sequence assigned to the gene, in particular ISG1 is preferably a single-stranded RNA, and in this respect according to a particularly preferred embodiment is a so-called antisense strain, in particular with respect to the RNA associated with the gene, in particular mRNA.
  • RNA sequence interacting with the RNA sequence, which interacts with the gene, in particular ISGl 5 to be a double-stranded RNA which, in particular in the context of further modifications or metabolic processes, becomes a Single-stranded RNA, in particular in the form of an antisense strand, as previously defined, converted or modified.
  • the inhibitor and / or repressor described above is an siRNA (small interfering RNA), in particular wherein the siRNA is directed against ISG15, in particular against ISG15-specific mRNA or mRNA associated with ISG15 is.
  • the siRNA should be designed such that an interaction with the mRNA, in particular as defined above, is possible and consequently leads to the deactivation or to the degradation of the corresponding RNA.
  • the siRNA may be complementary to the mRNA or to sections of the mRNA.
  • the Applicant has found, in a completely surprising manner, that such an siRNA leads to particularly good results with regard to a reduction or inhibition of the gene activity of the gene associated with the multiplication or replication of hepatitis C viruses, in particular ISGl 5, leads.
  • siRNA used in the context of the use according to the invention is, according to a very particularly preferred embodiment, an siRNA against ISGl 5, which is available from Qiagen, Hilden, Germany under the product number or order number SI00072387 (human) or SIO 1007531 ( murine) can be obtained.
  • the mode of action of the specific ISG15-specific siRNA can be understood in such a way that initially an siRNA / protein complex is formed in the cell or host system, which is also called an RNA-induced silencing complex (RISC), in which a protein complex binds the antisense strand of the siRNA and cuts the complementary mRNA.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the RISC complex has RNA helicase and RNA nuclease activities.
  • the inhibitor and / or repressor is an inhibitor or repressor, in particular the antisense strand of an siRNA.
  • a central concept of the present invention according to this aspect of the invention using a siRNA is to be seen in that in particular synthetically produced siRNA with specificity to mRNA as a transcription product in particular of ISG 15 is introduced into the cell or host system, which leads to a degradation of the mRNA of the target gene, namely in particular ISG 15 leads, which in turn leads to a reduction of the gene products and thus to a genes ilencing or gene knockout.
  • the principle underlying the invention according to this embodiment may also be referred to as RNA interference, based on which the expression of certain (target) genes, in this case in particular ISG 15, is reduced. This occurs in particular through the interaction of siRNA directed specifically against a gene with the mRNA of the gene with the consequence of the degradation of the mRNA, which corresponds to a (gene) inactivation.
  • the introduction or transfecting can also be carried out by means of a so-called polyethylenimine complexation (PEI complexing).
  • PEI complexing polyethylenimine complexation
  • the inhibitor or repressor used according to the use of the present invention should be administered when administered in pharmaceutically effective amounts.
  • the inhibitor or the repressor should be administered systemically, for example intravenously.
  • the measures relating to this are also known to the person skilled in the art, so that no further explanation is required in this respect.
  • the inhibitor or repressor in particular as described above, is administered together with at least one interferon, in particular ⁇ -interferon, preferably pegylated ⁇ -interferon.
  • interferon in particular ⁇ -interferon, preferably pegylated ⁇ -interferon.
  • a combination of the previously described ISGl 5 -specific siRNA or ISG 15-directed siRNA with an interferon is of particular advantage. Because the Applicant could - as stated below with reference to the embodiments - in a completely surprising manner, a synergistic effect in the context of the combination described above. on the one hand and interferon on the other hand with regard to the suppression or reduction of the multiplication or replication of hepatitis C viruses in the affected host systems or cell systems. Likewise, it is possible for the inhibitor and / or repressor to be administered together and / or in combination with at least one substance having antiviral properties to hepatitis viruses, in particular hepatitis C viruses.
  • a new way of treating a hepatitis C infection or disease is provided, which is based on a completely new approach, namely the targeted inactivation of one in connection with the multiplication or Replication of hepatitis C viruses, especially ISGl 5.
  • Another object of the present invention - according to one aspect of the present invention - is the use according to the invention according to claim 15, d. H.
  • Another object of the present invention - according to a third aspect of the present invention - is the use according to claim 17, ie in other words a use of at least one interferon-stimulated nucleic acid molecule, in particular gene, preferably ISGl 5, and / or its DNA sequence and / or its associated RNA sequence and / or at least one of nucleic acid-encoded (poly) peptide for finding and / or providing a medicament for the prophylactic and / or curative treatment of hepatitis, in particular hepatitis type C, and / or for predicting individual drug effects and / or drug side effects.
  • interferon-stimulated nucleic acid molecule in particular gene, preferably ISGl 5, and / or its DNA sequence and / or its associated RNA sequence and / or at least one of nucleic acid-encoded (poly) peptide for finding and / or providing a medicament for the prophylactic and / or curative treatment of hepatitis, in
  • the gene associated with the multiplication or replication of hepatitis C viruses can be regarded as a starting material for the discovery or provision of medicaments with respect to a hepatitis C infection or disease are used.
  • the medicaments can be such that, as stated above, they interact directly or indirectly with the previously defined gene or the RNA associated therewith, in particular mRNA, and / or the corresponding (poly) peptide in order in this way in particular via a reduction or inhibition, in particular inhibition, of the gene activity to reduce or prevent the multiplication or replication of hepatitis C viruses and thus to alleviate or cure the hepatitis C disease.
  • These may thus be substances which have a gene regulatory effect.
  • Another object of the present invention - according to a fourth aspect of the present invention - is the inventive method according to claim 18, ie in other words a method for identifying an inhibitor and / or repressor of an interferon-stimulated nucleic acid molecule, in particular gene, preferably of ISG 15, and / or its DNA sequence and / or its associated RNA sequence, the method comprising the following steps: (A) contacting the nucleic acid molecule with at least one test substance under conditions which allow an interaction, in particular binding, of the test substance (s) to the nucleic acid molecule; and (b) detecting and / or analyzing whether the test substance (s) limit or prevent the gene activity and / or expression of the nucleic acid molecule and / or whether the test substance (s) increase the proliferation and / or replication of hepatitis viruses, in particular Restrict or prevent hepatitis C viruses.
  • the method according to the invention can be carried out, for example, in vitro, to a certain extent investigating an interaction of the test substance with the nucleic acid molecule or the gene and, in the presence of interaction, concluding that the gene activity as a result of this interaction is reduced.
  • the method according to the invention can equally be carried out in a corresponding host system, wherein the host should be a carrier of the gene associated with the multiplication or replication of hepatitis C viruses, in particular ISG 15, and advantageously also via a corresponding expression system features.
  • the detection of the interaction or interaction or the detection of the influence of the gene activity can be carried out by methods familiar to the person skilled in the art.
  • the present invention relates to a method according to claim 19, d. H.
  • a method for identifying an inhibitor and / or repressor of a (poly) peptide encoded by an interferon-stimulated nucleic acid molecule, in particular gene, preferably ISG 15, and / or its DNA sequence and / or its associated RNA sequence wherein the method comprises the following steps:
  • the inventive method according to this aspect thus focuses on influencing the gene product, in particular in the form of a protein or (poly) peptide.
  • the method can be carried out in a manner known to those skilled in the art both in vitro and in vivo in a host system, wherein in the latter case the host should preferably carry the nucleic acid encoding the (poly) peptide to be examined.
  • an interaction can also be carried out in vitro on isolated (poly) peptides.
  • the present invention likewise relates to a method for identifying a mediator and / or factor which is regulated by an interferon-stimulated nucleic acid molecule, in particular gene, preferably ISG 15, or which regulates an interferon-stimulated nucleic acid molecule, in particular gene, preferably ISGl 5 , interacting substance, the method comprising the following steps:
  • test substance (s) influence the activity of the mediator and / or factor and / or whether the test substance (s) is responsible for the multiplication and / or replication of hepatitis viruses, in particular hepatitis C; -Viren, restrict or prevent.
  • the interacting substance is preferably an inhibitor and / or repressor of the mediator and / or factor, provided that this is associated with an activation of the interferon-stimulated nucleic acid molecule, in particular gene, preferably ISG 15.
  • the mediator and / or factor itself is in connection with an inactivation or repression of the interferon-stimulated nucleic acid molecule, in particular gene, preferably ISG 15, this is the case the interacting substance with respect to the mediator and / or factor to an activator - with respect to the interferon-stimulated nucleic acid, in particular gene, preferably ISGl 5, based on the above definition in such a substance, however, is equally an inhibitor or Repressor, as in this case ultimately results in inactivation or repression of the interferon-stimulated nucleic acid molecule, in particular gene, preferably ISG 15 results.
  • inventive methods according to the fourth and fifth aspects of the present invention can be carried out such that several test substances are used and the following steps are carried out:
  • RNA in particular mRNA
  • hepatitis C viruses restrict or not prevent and / or which do not interact with the mediator and / or factor in the further test procedure are no longer considered;
  • step (c) repeating step (b) until a single test substance is identified which comprises reducing or inhibiting gene activity and / or expression of the nucleic acid molecule and / or reducing or inhibiting the activity of the (poly) peptide and / or the reduction or elimination of multiplication and / or Replication of hepatitis viruses, in particular hepatitis C viruses, and / or to which the interaction with the mediator and / or factor can be assigned.
  • the method according to the fourth and fifth aspect of the present invention be carried out such that the test substance (s), the nucleic acid molecule (DNA or RNA, in particular mRNA) and / or the (poly) peptide to a Readout system (readout system) and / or that a readout system is added to the test batch and / or that the readout system after binding of the test substance (s) with the nucleic acid molecule and / or the (poly) peptide is a detectable signal supplies.
  • a Readout system readout system
  • a readout system is added to the test batch and / or that the readout system after binding of the test substance (s) with the nucleic acid molecule and / or the (poly) peptide is a detectable signal supplies.
  • test substances may be low-molecular substances, peptides, aptamers, antibodies, DNA, RNA, in particular siRNA and / or fragments or derivatives thereof.
  • the aforementioned methods can be carried out, for example, in a host or host system, wherein the host or the host system preferably comprises the previously defined genes and has a corresponding expression system.
  • host or the host system preferably comprises the previously defined genes and has a corresponding expression system.
  • Such hosts are familiar to those skilled in the art or the skilled person is always able to select specific host systems in the context of the present invention, so that there is no further explanation in this regard.
  • the inventive methods can likewise be carried out in the form of high-throughput methods and / or computer-assisted.
  • test substance (c) modifying the test substance such that its binding specificity or binding affinity or binding avidity is increased for the nucleic acid molecule or the (poly) peptide.
  • the binding site in step (a) can be determined by site-directed mutagenesis, the procedures of which are known per se to those skilled in the art.
  • Yet another subject of the present invention - according to one aspect of the present invention - is the inventive method according to claim 28, d. H. in other words, a method for modifying a test substance which is identified or improved according to the methods according to the fourth and / or fifth and / or sixth aspect of the present invention, wherein the test substance is further modified as a lead structure
  • the identified, improved or modified test substance in particular the inhibitor and / or repressor of the aforementioned gene, to be further pharmacologically improved by peptide mimetics.
  • Yet another subject of the present invention - according to an aspect of the present invention - is the method according to the invention according to claim 30, d.
  • a method for the identification and / or determination of at least one nucleic acid molecule associated with the replication of hepatitis viruses, in particular hepatitis C viruses, in particular gene, preferably human and / or interferon-stimulated gene, the method comprising the following Steps includes:
  • the method may comprise, subsequent to step (c), the following step (d):
  • step (d) assignment of the nucleic acid molecule identified in step (c), in particular gene, as a nucleic acid molecule, in particular gene, associated with the multiplication and / or replication of hepatitis viruses, in particular hepatitis C viruses.
  • the inventive method according to this aspect of the present invention can be used, for example, by differential expression using so-called DNA chips.
  • DNA chips DNA chips
  • Analysis method the expression level in subjects with hepatitis C infection compared to subjects without hepatitis C infection for certain genes is determined and a gene, in particular an interferon-stimulated gene, with an increased expression level, the properties of a in connection with the multiplication or .
  • Replication of hepatitis C virus-related gene, in particular the multiplication or replication of hepatitis C virus-promoting gene can be awarded.
  • genes in particular interferon-stimulated genes, which are associated with the multiplication or replication of hepatitis C viruses in connection with a hepatitis C infection or hepatitis C disease.
  • the present invention according to a ninth aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition according to claim 32, in other words, a pharmaceutical composition, preferably for the prophylactic or therapeutic treatment of hepatitis C diseases, containing in effective, in particular pharmaceutically active Quantities of at least one pharmacokinetic gically active substance, in particular an inhibitor and / or repressor, for a nucleic acid molecule in connection with the multiplication and / or replication of hepatitis viruses, in particular hepatitis C viruses, in particular gene, preferably ISGl 5, and / or for the latter DNA sequence and / or its associated RNA sequence, in particular for its associated mRNA sequence, and / or for its associated (poly) peptide, wherein the substance according to the method according to the fourth and / or fifth and / or sixth Aspect of the present invention is available.
  • a pharmaceutical composition preferably for the prophylactic or therapeutic treatment of hepatitis C diseases, containing in effective, in particular pharmaceutically active Quantities of at
  • Yet another object of the present invention - according to a tenth aspect of the present invention - is also a pharmaceutical composition according to claim 33, in other words a pharmaceutical composition, preferably for the prophylactic or therapeutic treatment of hepatitis C diseases, containing in effective, in particular pharmaceutically effective amounts of at least one siRNA, wherein the siRNA regulates, in particular reduces or at least inhibits, the gene activity and / or gene expression of at least one interferon-stimulated gene, in particular of ISG 15.
  • the siRNA used in the context of the pharmaceutical composition according to the invention is an siRNA against ISG 15, which can be obtained from Qiagen, Hilden, Germany under the product number or order number SI00072387.
  • the cells were overlaid with 500 ⁇ l of trizole.
  • the adherent cells were detached from the bottom with a plastic scraper and transferred to a reaction vessel.
  • 0.1 ml of chloroform / 1 ml of trizole was added and mixed by shaking. Centrifugation at 12,000 g and at 2 to 8 0 C for 15 min resulted in the phase separation of the phenol / chloroform mixture.
  • the aqueous phase was removed and the dissolved RNA precipitated by 0.5 ml of isopropanol / 1 ml of trizole.
  • the pellet was then washed with 75% ethanol, dried under vacuum and finally dissolved in RNase-free water. Subsequently, the RNA was assessed using the "RNeasy Mini" kit (Qiagen, Hilden, Germany) purified according to the manufacturer's instructions and stored until further analysis at -20 0 C.
  • Quantitative real-time PCR The reverse transcription of RNA, followed by a polymerase chain reaction (RT-PCR), is a sensitive method for the quantification of specific mRNAs.
  • RT-PCR polymerase chain reaction
  • the use of specific primers first transcribes the mRNA of the gene in question into complementary DNA (cDNA), which in turn is the template or the template for the following PCR delivers.
  • cDNA complementary DNA
  • the LightCycler Rotor-Gene 2000 was used by Corbett (Mortlake, Australia).
  • the LightCycler uses a fluorimeter component to detect the fluorescence of the fluorophore after binding to double-stranded DNA.
  • QIAGEN's QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit was used, and a 25 ⁇ l mixture was pipetted together as follows: 5.25 ⁇ l H 2 O (RNase-free), 12.5 ⁇ l SYBR Green RT-PCR Master Mix, 0 , 25 ⁇ l of QuantiTect RT Mix, 2.5 ⁇ l of each primer (0.5 mM) and 2 ⁇ l total RNA (100 ng to 200 ng).
  • the LightCycler program used started with a 30 minute RT step at 55 0 C, followed by a 15 minute heat inactivation of the RT-polymerase of a conventional terminal with the PCR schemes, ie 5 s denaturation per cycle at 95 ° C., 10 s annealing temperature (55 ° C.) and 30 s elongation at 72 ° C.
  • Product formation was determined by fluorescence increase after each replication cycle. After an average of 40 replication cycles, the melting curves of the formed products were recorded to check the specificity of the PCR reaction. Due to the melting behavior of DNA, the fluorescence decreases with increasing temperature. The maximum fluorescence change per temperature increase gives a maximum in the melting curve, which is characteristic of each PCR product.
  • the copy numbers of the measured genes calculated by the LightCycler were compared with the housekeeping gene or ß-actin gene and analyzed.
  • the expression of ISGl 5 was switched off at the cell culture level in the HCV replicon system in order to investigate the direct effect on HCV replication.
  • the suppression of gene expression takes place by means of siRNA via a cellular mechanism of processing.
  • the Dicer enzyme complex cleaves cell-type dsRNA into 21 to 23 bp oligomers, the so-called small interfering RNAs (siRNA).
  • the siRNA can form the RNA-induced silencing complex (RISC) with a protein complex; this binds the antisense strand of the siRNA and cuts the complementary mRNA.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the degradation of the mRNA leads to a reduction in the translation of these mRNAs and thus to gene silencing at the post-transcriptional level.
  • siRNAs 12.5 ng were first dissolved in 3 ⁇ l Susspensionspuffer and pre-pipetted into the wells of the perforated plate in a reverse transfection.
  • 2.5 ng of the siRNAs were used for simultaneously switching off other genes (not shown graphically).
  • a noncodogenic siRNA was inserted. puts.
  • 0.75 ⁇ l of the transfection reagent Hi-PerFect TM 0.75 ⁇ l of the transfection reagent Hi-PerFect TM (Qiagen, Hilden, Germany) was transferred to 24.25 ⁇ l serum-free culture medium per batch, mixed and added to the siRNAs that were initially introduced. The transfection mixture was then incubated for 10 min at room temperature.
  • Figure IA the HCV copy number is normalized and aligned against the untreated control (MHI) and in Figure IB the HCV / ISG15 copy number is normalized and aligned against the siNC control.
  • Figures IA and IB show the significant decrease in HCV copy number when treated with ISG15-specific siRNA (siISG15). Consequently, the replication under the influence of SÜSG15 is also reduced.
  • the murine and human MHL conl-HCV replicon cells were seeded in 6-well plates and grown to a confluency of 30 to 40% at 37 0 C and a CO incubated for 2 -Luftgehalt of 5%.
  • the cells were washed and taken up in culture medium as well as with IFN- ⁇ -added medium and incubated for an additional 64th Subsequently, the cells were lysed and a protein extraction was performed.
  • the viral protein NS5A and the housekeeping gene ß-actin were detected by means of Western blot.
  • Figures 2A and 2B show in a Western blot that treatment with anti-ISGl 5 siRNA in both murine and human HCV replicon systems results in significant suppression of the HCV NS5A protein. Further, Figures 2A and 2B show that there is synergism with IFN- ⁇ since the additional administration of IFN- ⁇ (see Figures 2A and 2B: + IFN- ⁇ ) results in a significant reduction in NS5A-. Synthesis compared to the non-IFN- ⁇ treated approach (see Figures 2A and 2B: IFN- ⁇ ).
  • Fig. IA shows the inhibition of HCV replication and the lack of induction of resistant mutants when treated with ISG15-specific siRNA (siISG15) versus treatment with siNC, where the HCV copy number is normalized and balanced against the untreated control (MHI).
  • Figure IB shows the inhibition of HCV replication and the lack of induction of resistant mutants when treated with ISG15-specific siRNA (siISG15) versus siNC treatment
  • HCV / ISG 15 copy number is normalized and balanced against the siNC control.
  • Fig. 2A shows by means of a Western blot the results of a treatment performed on human conl-HCV replicon cells with gegen
  • FIG. 2B shows the results of a mouse on a western blot
  • ISG 15 directed siRNA without additional application of IFN- ⁇ on the one hand (- IFN- ⁇ ) and with additional application of IFN- ⁇ on the other hand (+ IFN- ⁇ ).
  • MHl untreated control
  • NC non-silencing control
  • ISG 15 ISG15-specific si-RNA

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Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Behandlung von Hepatitis-Infektionen bzw. Hepatitis-Erkrankungen, insbesondere von Hepatitis Typ C. Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Inhibitors und/oder Repressors eines mit der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehenden Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder kurativen Behandlung von Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C, sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Hepatitis-C-Erkrankungen, welche den Repressor und/oder Inhibitor enthält.

Description

Neue Therapeutika für die Hepatitis-Therapie
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, insbesondere in Form von Inhibitoren bzw. Repressoren, welche die Genaktivität eines mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis-C- Viren, im Zusammenhang stehenden Gens zu regulieren imstande sind, im Bereich der Diagnostik und Therapie von Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C. Bei dem mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C- Viren im Zusammenhang stehenden Gen handelt es sich vorzugsweise um das humane interferonstimulierte Gen ISGl 5.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer die Genaktivität eines mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehenden Gens unterbin- denden bzw. inhibierenden oder zumindest herabsetzenden Substanz, insbesondere Inhibitors bzw. Repressors, zur Herstellung eines Medikamentes bzw. Arzneimittels zur prophylaktischen bzw. kurativen Behandlung von Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines interferonstimulierten Gens, insbesondere ISGl 5, zur Auffindung bzw. Bereitstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen bzw. kurativen Behandlung von Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C, und/oder zur Vorhersage von individuellen Arzneimittelwirkungen und/oder zur Vorhersage von Nebenwir- kungen bzw. des Ansprechens von Arzneimitteln.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, insbesondere Inhibitoren bzw. Repressoren, welche die Genaktivität eines interferonstimulierten, insbesondere im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren, stehenden Gens, vorzugsweise ISG 15, regulieren bzw. ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, welche die Aktivität der entsprechenden Genprodukte bzw. von mit dem Gen im Zusammenhang stehenden Produkten regulieren. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften dieser Substanzen.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusam- mensetzung, welche zumindest eine auf Basis der erfindungsgemäßen Verfahren aufgefundene pharmakologisch aktive Substanz, insbesondere Inhibitor bzw. Repressor, enthält, wobei die Substanz die Genaktivität eines mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren im Zusammenhang stehenden Gens beeinflußt, insbesondere hemmt bzw. inhibiert; zudem betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Hepa- titis-C-Erkrankungen, welche in wirksamen, insbesondere pharmazeutisch wirksamen Mengen mindestens eine siRNA enthält.
Die chronische Infektion mit dem Hepatitis-C- Virus (HCV) ist mit weltweit etwa 170 Millionen Infizierten ein globales Gesundheitsproblem. Bei einer Chronifizierungsrate von etwa 80 % stellt die Hepatitis Typ C eine der Hauptursachen für Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinome dar.
Das Hepatitis-C-Virus gehört zur Familie der Flaviviridae und ist der einzige Vertreter des Genus der Hepaciviren. Das Hepatitis-C-Virus wurde ursprünglich den sogenannten NonA-NonB -Hepatitis- Viren zugeordnet, bis im Jahre 1989 die Sequenzierung des viralen Genoms gelang. Heute sind sechs Genotypen charakterisiert, die sich wiederum in Subtypen unterteilen. Die Infektion mit dem Virus erfolgt in den meisten Fällen über eine Transfusion infizierter Blutkonserven, insbesondere in den siebziger Jahren, bzw. über Kanülenstich- verletzungen beispielsweise beim Krankenhauspersonal. Weitere Übertragungsmöglichkeiten sind der ungeschützte Geschlechtsverkehr und die Verwendung gemeinsamer Spritzen unter Drogenabhängigen. Die akute Infektion verläuft meist asymptomatisch. In etwa 70 bis 80 % der Fälle kommt es dann zu einer chronischen Infektion der Leber, die im Verlauf zu einer Leberzirrhose und hepatozellulärem Karzinom fuhren kann.
Als bislang effizienteste Therapie der chronischen Hepatitis Typ C wird im Stand der Technik Interferon (IFN), insbesondere α-Interferon (synonym auch als Interferon-alpha oder IFN-α bezeichnet, vorzugsweise pegyliertes IFN-α, gegebenenfalls in Kombination mit dem Virostatikum Ribavirin, angewendet. Abhängig vom Genotyp und anderen Faktoren führt diese Therapie nur in 50 bis 90 % der Patienten zu einer Ausheilung. Eine der häufigsten Nebenwirkungen dieser Therapie sind IFN-induzierte schwere Depressionen, welche neben der Verschlechterung der Lebensqualität zum Therapieabbruch oder gar zum Suizid führen können. Ein Impfstoff gegen das Hepatitis-C- Virus konnte bisher noch nicht entwickelt werden.
Interferone (IFN) sind niedermolekulare Proteine und werden zu den Zytoki- nen gezählt. Es wird zwischen Interferonen vom Typ-I und Interferonen vom Typ-II unterschieden. Die Interferone vom Typ-I kommen in monomerer Form vor und lassen sich in Superfamilien unterteilen, deren Hauptunterschied ihr Entstehungsort ist. Bei den Interferonen vom Typ-I machen IFN-α und IFN-ß den größten Teil aus. Die Gruppe der α-Interferone läßt sich wie- derum in eine Reihe von Subtypen unterteilen, die von unterschiedlichen Genen exprimiert werden. Sie entstehen größten Teils in Leukozyten und Fibroblasten, während IFN-ß hauptsächlich von Endothelzellen und Fibroblasten produziert wird. Weiterhin zählen IFN-λ und IFN-ω zu den Interferonen vom Typ-I.
Die Expression der Interferone vom Typ-I wird durch die Erkennung von viralen aber auch bakteriellen pathogenen Mustern induziert. Sie werden von infizierten Zellen sezerniert und wirken sowohl parakrin auf benachbarte Zellen als auch autokrin auf die IFN-produzierende Zelle selbst. Die Bindung an den Rezeptor löst eine Signalkaskade aus, die in der Induktion von interferonstimulierten Genen (ISGs) endet.
Die Wirkung von über 150 ISGs wird zusätzlich über eine Modifikation erhöht und ihre Leistung gesteigert. Das ISG 15, ein 15 kD großes, IFN induzier- tes Protein, besitzt eine dem Ubiquitin ähnliche Domäne und wird über ein Set von Enzymen (El = UbelL, E2 = UbcH8 und E3 = Herc5), wie bei der Ubi- quitinylierung, kovalent an die Zielproteine gebunden. In der Literatur nennt man diesen Prozeß auch ISGylierung. Die Enzyme El, E2 und E3 werden ebenfalls durch Typ-I Interferone hochreguliert, was zu einer vermehrten ISG- ylierung führt und die Interferonantwort verstärkt. Gleichzeit wird jedoch auch Usplδ, die Protease, welche die ISGylierung wieder rückgängig macht, - A -
induziert, was neben geringen Halbwertzeiten und mit weiteren negativ wirkenden Regulationsmechanismen zu einer zeitlichen Begrenzung der Wirkung von IFN fuhrt.
Was die Interferone weiterhin anbelangt, so werden diese aufgrund ihrer Eigenschaften und der Möglichkeit, eine Vielzahl zellulärer Abwehrmechanismen zu induzieren und die körpereigene Immunantwort zu unterstützen, zur Therapie von Tumoren, Autoimmunerkrankungen und Virus infektionen (z.B. HBV und HCV) verwendet.
Wie zuvor beschrieben, hat sich in der Therapie von Hepatitis Typ C- Erkrankungen bzw. Infektionen insbesondere der Einsatz von pegyliertem IFN-α2a oder IFN-α2b in Kombination mit dem Nukleosidanalogon Ribavirin (RBV) etabliert. Das Ansprechen auf die Therapie ist abhängig von dem HCV-Genotyp, der Viruslast, dem Alter des Patienten, bereits aufgetretenen Leberschäden und Co-Infektionen. Bei der Infektion mit den Genotypen 2 und 3 ist nach 24 Wochen bei bis zu 80 % der Patienten ein anhaltender Virusrückgang zu verzeichnen, während bei Infektionen mit Genotyp 1 nur ca. 50 % der Patienten auf die Therapie ansprechen und einen anhaltenden Rück- gang der Viruslast nach 48 Wochen bei einer körpergewichtsabhängigen RBV-Dosierung aufweisen.
Das Ansprechen auf die Therapie läßt sich in zwei Phasen unterteilen. Ein frühes Ansprechen des Virus (engl. EVR, early viral response) in Abhängig- keit vom Genotyp und der eingesetzten Dosis an Medikamenten in der ersten Phase wird gefolgt von einem langsameren, aber anhaltenden Rückgang der Viruslast (engl. SVR, sustained viral response) in der zweiten Phase. Untersuchungen haben ergeben, daß, wenn innerhalb der ersten 12 Wochen nach Therapiebeginn keine EVR mit einem Rückgang der Viruslast um mindestens 21og1o-Phasen zu verzeichnen ist, kein anhaltendes Ansprechen zu erwarten ist und die Therapie abgebrochen werden kann. Unterschiedliche Expressionsmuster der ISGs sowohl in PBMCs (engl, peripheral blood mononuclear cells) als auch Leberbiopsien von Patienten ermöglichen ebenfalls die Erstellung von Prognosen über ein Ansprechen auf die Therapie. Nachteilig bei der vorgenannten Therapie des Standes der Technik sind somit deren mitunter starke Nebenwirkungen, insbesondere was die Ausbildung einer Depression anbelangt, und die Tatsache, daß ein effektiver Therapieerfolg - wie zuvor beschrieben - nicht immer gewährleistet ist.
Vor diesem Hintergrund besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, neue und effiziente Therapie- bzw. Behandlungsmöglichkeiten von Hepatitis-Erkrankungen, insbesondere Hepatitis-C-Erkrankungen, bereitzustellen, welche gegenüber den im Stand der Technik bekannten Ansätzen eine höhere Wirksamkeit bei gleichzeitig verringerter Nebenwirkung aufweisen sollen.
In diesem Zusammenhang besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Ermittlung von Substanzen bzw. Substanzen als solche bereitzustellen, mit welchen die Genexpression bzw. Genaktivität von im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis- C-Viren im Zusammenhang stehenden Genen, insbesondere ISGl 5, vermindert bzw. unterbunden werden kann, um auf diese Weise die Virusvermehrung bzw. -replikation zumindest zu vermindern.
Im übrigen besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem konkrete Gene identifiziert werden können, welche maßgeblich an der Vermehrung bzw. Replikation von Hepati- tis-C-Viren beteiligt sind, wobei es sich hierbei vorzugsweise um humane bzw. interferonstimulierte Gene handelt.
Schließlich besteht eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe darin, Verfahren, Verwendungen und Substanzen der vorgenannten Art bereitzustellen, welche die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden oder aber diese zumindest zu verringern oder abzuschwächen imstande sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es dem Anmelder in völlig überraschender Weise gelungen, erstmalig ein spezielles Gen identifiziert zu haben, welches maßgeblich im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikati- on von Hepatitis-C- Viren in einem Wirtsystem, insbesondere beim Menschen, steht. In diesem Zusammenhang hat der Anmelder völlig überraschend gefun- den, daß das interferonstimulierte Gen ISG 15 maßgeblich an der zuvor genannten Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C- Viren beteiligt ist und eine Induktion bzw. Aktivierung dieses Gens zu einer unerwünschten Erhöhung der Virusreplikation fuhren kann. Das hinsichtlich seiner Relevanz be- treffend die Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren identifizierte Gen ISGl 5 kann somit erfindungsgemäß als Grundlage für Verfahren bzw. Medikamente zur Therapie einer Hepatitis-C-Erkrankung bzw. -Infektion herangezogen werden, wobei diesbezüglich erfindungsgemäß auf eine Inaktivierung des entsprechenden Gens abgestellt wird.
Denn der Anmelder hat in völlig überraschender Weise gefunden, daß die gezielte Verwendung eines Inhibitors bzw. Repressors, mit welchem die (Gen-)Aktivität des im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren stehenden Gens, insbesondere ISG 15, und somit eine Beeinflussung dessen Genaktivität zu einer signifikanten Verringerung der Hepatitis-C- Virenlast führt, was maßgeblich auf eine deutlich verminderte Vermehrung bzw. Replikation der Hepatitis-C-Viren zurückzuführen ist. In diesem Zusammenhang konnte der Anmelder - völlig überraschend - insbesondere zeigen, daß die gezielte Verwendung einer speziell auf ISG 15 abge- stimmten bzw. gegen ISG 15 gerichteten sogenannten siRNA bei deren Applikation zu einer deutlichen Abnahme der Genaktivität von ISG 15 und folglich zu einer signifikant verminderten Synthese bzw. Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren im Wirtsystem führt. Auf diese Weise ist es dem Anmelder gelungen, einen völlig neuartigen und zudem nebenwirkungsarmen therapeutischen Ansatz bereitzustellen, auf dessen Basis eine Hepatitis-C- Erkrankung effektiv behandelt werden kann.
Es versteht sich von selbst, daß Ausgestaltungen, Ausführungsformen, Vorteile und dergleichen, welche nachfolgend zu Zwecken der Vermeidung von Wiederholungen nur zu einem Erfindungsaspekt ausführt sind, selbstverständlich auch in bezug auf die übrigen Erfindungsaspekte entsprechend gelten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem e r s t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist somit die erfindungsgemäße Verwendung nach Anspruch 1, d. h. also mit anderen Worten die Verwendung eines Inhibitors und/oder Repressors eines mit der Vermehrung und/oder Replikation von He- patitis-Viren, insbesondere Hepatitis-C- Viren, im Zusammenhang stehenden Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneten (Poly-)Peptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C.
Wie zuvor angeführt, liegt die zentrale Idee der vorliegenden Erfindung somit darin, in spezifischer Weise die Genaktivität eines solchen Gens herabzuset- zen und/oder zu unterbinden, insbesondere zu inhibieren, welches mit der Vermehrung bzw. Replikation bzw. Synthese von Hepatitis-C-Viren insbesondere insofern zusammenhängt, als die Expression bzw. Aktivierung des Gens, welche beispielsweise aufgrund der Virusinfektion induziert sein kann, zu einer erhöhten Replikation bzw. Vermehrung von Hepatitis-C-Viren im Wirt führt.
In diesem Zusammenhang bezieht sich der erfindungsgemäß verwendete Begriff "Inhibitor" und/oder "Repressor" insbesondere auf eine die Genaktivität vermindernde und/oder unterbindende, insbesondere inhibierende Substanz. Der Inhibitor bzw. der Repressor stellt somit mit anderen Worten eine die Genaktivität unterbindende oder zumindest herabsetzende Verbindung dar, wobei die diesbezügliche pharmakologische Wirkung des Inhibitors bzw. Re- pressors sowohl auf Genebene, d. h. beispielsweise durch eine direkte Interaktion mit dem Gen bzw. diesem zugeordneten Promotoren und/oder Enhancern, als auch auf Ebene des bzw. der Genprodukte, wie Transkriptionsprodukte (z. B. mRNA) und/oder Translationsprodukte (z. B. Proteine), ansetzen kann. Zudem kann die pharmakologische Wirkung bzw. die die Genaktivität vermindernde und/oder unterbindende, insbesondere inhibierende Wirkung des Inhibitors bzw. Repressors auf Ebene von genregulierten Mediatoren bzw. Faktoren und/oder auf Ebene von genregulierenden Mediatoren bzw. Faktoren ansetzen. Somit kann der erfindungsgemäß verwendete Inhibitor bzw. Repressor zu einer Verringerung der Expression bzw. Genaktivität beispielsweise und in nichtbeschränkender Weise durch direkte oder indirekte Interaktion mit der DNA-Sequenz bzw. DNA und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz bzw. mRNA und/oder durch direkte bzw. indirekte Beeinflussung bzw. Interaktion mit dem Genprodukt in Form des von dem Gen bzw. von der DNA- Sequenz codierten (Poly-)Peptids führen. Bei dem Inhibitor bzw. Repressor handelt es sich insbesondere um eine Substanz mit antiviralen Eigenschaften gegenüber Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren.
Mit anderen Worten zielt die vorliegende Erfindung maßgeblich auf eine zweckgerichtete Suppression der Genexpression bzw. Genaktivität von im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation bzw. Synthese von Hepatitis-C-Viren stehenden Genen, insbesondere ISGl 5, was im allgemeinen auch als gene-knockdown bzw. als gene-silencing bezeichnet werden kann.
Was den erfindungsgemäß verwendeten Begriff "Gen" anbelangt, so ist diesbezüglich gleichermaßen das entsprechende Nukleinsäuremolekül bzw. die entsprechende DNA-Sequenz eingeschlossen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich aber gleichermaßen auch, wie zuvor angeführt, auf die dem Gen zu- geordnete RNA- Sequenz, insbesondere mRNA, welche sozusagen als posttranskriptionales Produkt fungiert und sozusagen komplementär zum co- dogenen Strang der DNA des Gens sein kann. Gleichermaßen kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch das von der Nukleinsäure bzw. dem Gen, insbesondere wie zuvor definiert, codierte (Poly-)Peptid - und somit ge- wissermaßen das Translationsprodukt — verwendet bzw. als Zielmolekül bzw. "Target" verwendet werden. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül" ist gleichbedeutend mit dem Begriff "Polynukleinsäure" bzw. "Polynukleinsäuremolekü- Ie" und kann sowohl auf DNA als auch auf RNA bezogen sein. Der Begriff "DNA-Sequenz" bzw. "RNA-Sequenz" bezieht sich in diesem Zusammenhang nicht nur auf die vollständige, dem Gen zugeordnete bzw. entsprechende DNA, sondern auch auf entsprechende Abschnitte des Gens bzw. nicht nur auf insbesondere im Rahmen der Transkription synthetisierte vollständige RNA, sondern auch auf RNA- Abschnitte bzw. RNA-Fragmente.
Was das im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung in Betracht gezogene Gen anbelangt, so handelt es sich vorzugsweise um ein humanes Gen.
Insbesondere kann es sich bei dem im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung in Betracht gezogenen Gen um ein interferonstimuliertes Gen (ISG) handeln. Diesbezüglich kann das Gen ein durch Interferone vom Typ 1, vorzugsweise α-Interferon und/oder ß-Interferon, stimuliertes Gen sein. Wie zu- vor beschrieben, handelt es sich hierbei insbesondere um ein solches Gen, welches infolge einer erhöhten Interferonkonzentration induziert bzw. aktiviert werden kann, so daß dessen Expression insbesondere unter Interferoneinfluß - beispielsweise hervorgerufen durch eine Infektion mit Hepatitis-C- Viren - erhöht wird.
Diesbezüglich hat der Anmelder in völlig überraschender Weise herausgefunden, daß ein hinsichtlich der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C- Viren verantwortliches bzw. damit im Zusammenhang stehendes Gen durch das Gen ISG 15 gebildet wird. Hierbei handelt es sich gleichermaßen um ein interferonstimuliertes Gen. Insbesondere handelt es sich bei dem in Rede stehenden Gen um ISG 15, insbesondere mit der Transkript-ID (Lokus) NM 005101 bzw. insbesondere gemäß Sequenzprotokoll I und/oder insbesondere gemäß SEQUENCE LISTING. Diesbezüglich hat der Anmelder in völlig überraschender Weise gefunden, daß es sich bei ISG 15, welches auch als sogenannter Homo Sapiens ISG 15 Ubiquitin-like Modifier bezeichnet wird, um ein hinsichtlich der erfindungsgemäßen Verwendung im Rahmen der Therapie von Hepatitis Typ C besonders effektives Ziel bzw. Target handelt, dessen Inaktivierung bzw. Suppression zu einer signifikanten Reduzierung der Hepatitis-C-Viren im Wirtsystem führt.
Das zuvor angegebene Sequenzprotokoll I und das zuvor angeführten SE- QUENCE LISTING beziehen sich auf die DNA-Sequenz zu dem Gen ISG15. Dabei ist das Sequenzprotokoll I zu dem entsprechenden SEQUENCE LI- STING synonym bzw. inhaltsgleich. Der wesentliche Unterschied zwischen den Sequenzprotokollen besteht darin, daß das Sequenzprotokoll I auf Basis einer wissenschaftlich standardisierten Angabe bzw. Darstellung beruht, während das SEQUENCE LISTING auf Basis einer patentrechtlich standardisierten Angabe bzw. Darstellung unter Verwendung der Software PatentIN Versi- on 3.3 erstellt wurde. Hierbei handelt es sich also in bezug auf die DNA bzw. in bezug auf das Gen um einen rein formal darstellungsgemäßen, nicht aber um einen inhaltlichen Unterschied.
Was den im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzten Inhi- bitor bzw. Repressor anbelangt, so sollte es sich diesbezüglich um eine die Aktivität des Gens, insbesondere von ISGl 5, herabsetzende bzw. unterbindende, insbesondere inhibierende Substanz handeln.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es besonders vorteilhaft, wenn der Inhibitor bzw. der Repressor eine mit dem Gen, insbesondere mit ISGl 5, bzw. mit dessen DNA-Sequenz und/oder mit dessen zugeordneter RNA-Sequenz und/oder mit dessen zugeordnetem (Poly-)Peptid interagierende Substanz ist.
Diesbezüglich ist es besonders vorteilhaft, wenn die Substanz die Aktivität des Gens, insbesondere von ISGl 5, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneten
(Poly-)Peptids herabsetzt und/oder unterbindet, insbesondere inhibiert.
In diesem Zusammenhang ist der Begriff "Inhibitor" bzw. "Repressor" sehr breit zu verstehen, insbesondere kann es sich hierbei um eine Substanz han- dein, welche direkt und/oder indirekt, beispielsweise über Stoffwechselkaskaden oder Signaltransduktionen, mit dem entsprechenden Target bzw. Ziel, insbesondere mit ISGl 5, interagiert und dabei dessen Genaktivität herabsetzt bzw. unterbindet, insbesondere inhibiert. Dabei kann die Beeinflussung des Gens, insbesondere von ISGl 5, bzw. der dem Gen bzw. ISG 15 zugeordneten Produkte (z. B. Transkriptions- und/oder Translationsprodukte) auch in Form von Vorläufersubstanzen hervorgerufen werden, welche beispielsweise erst im Zell- bzw. Wirtsystem zu der eigentlich interagierenden Substanz beispielsweise über stoffwechselspezifische Prozesse umgewandelt wird.
Wie nachfolgend angeführt, kann die direkte und/oder indirekte Interaktion der Substanz mit der Zielstruktur, insbesondere mit dem Gen, wie ISG 15, auf vielerlei Ebenen realisiert sein:
Gemäß einer ersten erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform kann die interagierende Substanz bzw. der Inhibitor und/oder Repressor mit dem Promotor und/oder Enhancer des Gens, insbesondere von ISG 15, wechselwirken und/oder interagieren derart, daß die Bindung von insbesondere körpereigenen Transkriptionsfaktoren, insbesondere Aktivatoren, an den Promotor und/oder Enhancer verhindert oder zumindest gehemmt wird. Gleichermaßen ist es aber auch möglich, daß die Substanz bzw. der Inhibitor und/oder Repressor mit einem insbesondere körpereigenen Transkriptionsfaktor, insbesondere Aktivator, wechselwirkt derart, daß die Bindung des Transkriptionsfaktors, insbesondere Aktivators, an den Promotor und/oder Enhancer des Gens, insbesondere von ISGl 5, verhindert oder zumindest gehemmt wird.
Gleichermaßen ist es aber auch möglich, daß die Substanz bzw. der Inhibitor und/oder Repressor mit einem insbesondere körpereigenen Transkriptionsfak- tor, insbesondere Aktivator, wechselwirkt derart, daß die Bindung des Transkriptionsfaktors, insbesondere Aktivators, an den Promotor und/oder Enhancer des Gens, insbesondere von ISG 15, verhindert oder zumindest gehemmt wird. In diesem Zusammenhang kann der Inhibitor und/oder Repressor mit insbesondere körpereigenen, von dem Gen regulierten Mediatoren und/oder Faktoren, insbesondere ISG15-regulierten Mediatoren und/oder Faktoren, und/oder mit insbesondere körpereigenen, das Gen regulierenden Mediatoren und/oder Faktoren, insbesondere ISG 15 -regulierenden Mediatoren und/oder Faktoren, interagieren insbesondere derart, daß die Aktivität des Gens, insbesondere von ISGl 5, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder des- sen zugeordneter RNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneten (Poly-)Peptids herabgesetzt und/oder unterbunden, insbesondere inhibiert, wird.
Gleichermaßen ist es aber auch möglich, daß die Substanz bzw. der Inhibitor und/oder Repressor mit den endogenen bzw. körpereigenen Transkriptionsak- tivatoren selbst reagiert und hierdurch eine Inaktivierung des Transkriptionsfaktors bzw. -aktivators an sich hervorruft, um auf diese Weise die Genaktivität, insbesondere von ISG 15, zu verringern bzw. zu unterbinden, insbesondere zu inhibieren.
Bei der im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzten Substanz in Form eines Inhibitors und/oder Repressors kann es sich zum einen um eine Substanz handeln, welche auf Basis des nachfolgend noch geschilderten erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung solcher Substanzen aufgefunden wurde. Gemäß einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausfuhrungsform kann es sich bei dem Inhibitor und/oder Repressor zum anderen um eine vorzugsweise mit der dem Gen, insbesondere ISGl 5, zugeordneten RNA-Sequenz, insbesondere mRNA-Sequenz, interagierende RNA-Sequenz handeln. Gemäß dieser Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung sollte es sich bei dem Inhibitor bzw. Repressor um eine RNA bzw. RNA-Sequenz handeln, welche insbesondere komplementär zu der dem Gen zugeordneten RNA bzw. mRNA bzw. RNA-Sequenz bzw. mRNA-Sequenz ist.
In diesem Zusammenhang ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung von besonderem Vorteil, wenn der Inhibitor und/oder Repressor eine RNA- Sequenz in Form eine Oligomers, insbesondere mit 15 bis 20 bp (Basenpaare), vorzugsweise 18 bis 25 bp, bevorzugt 21 bis 23 bp, ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der mit der dem Gen, insbesondere ISGl 5, zugeordneten RNA-Sequenz interagierenden RNA- Sequenz vorzugsweise um eine Einzelstrang-RNA, wobei es sich diesbezüglich gemäß einer besonders bevorzugten Ausführung um einen sogenannten antisense-Stτang insbesondere in bezug auf die dem Gen zugeordnete RNA, insbesondere mRNA, handeln sollte.
Gleichermaßen ist es aber auch möglich, daß es sich bei der erfindungsgemäß eingesetzten, mit der dem Gen, insbesondere ISGl 5, zugeordneten RNA- Sequenz interagierenden RNA-Sequenz um eine Doppelstrang-RNA handelt, welche insbesondere im Rahmen weiterer Modifikationen bzw. Stoffwechselvorgänge zu einer Einzelstrang-RNA, insbesondere in Form eines antisense- Stranges, wie zuvor definiert, umgewandelt bzw. modifiziert wird.
Gemäß einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform han- delt es sich bei dem zuvor beschriebenen Inhibitor und/oder Repressor um eine siRNA {small interfering RNA), insbesondere wobei die siRNA gegen ISG15, insbesondere gegen ISG15-spezifische mRNA bzw. gegen ISG15 zugeordneter mRNA, gerichtet ist. Mit anderen Worten sollte die siRNA ausgestaltet sein derart, daß eine Interaktion mit der mRNA, insbesondere wie zu- vor definiert, möglich ist und in der Folge zur Deaktivierung bzw. zum Abbau der entsprechenden RNA führt. Beispielsweise kann die siRNA komplementär zur mRNA bzw. zu Abschnitten der mRNA sein. In diesem Zusammenhang hat der Anmelder in völlig überraschender Weise gefunden, daß eine derartige siRNA zu besonders guten Ergebnissen hinsichtlich einer Verminderung bzw. Unterbindung der Genaktivität des mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren im Zusammenhang stehenden Gens, insbesondere ISGl 5, führt.
Bei der im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzten siRNA handelt es sich gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführung um eine siRNA gegen ISGl 5, welche von der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland unter der Produktnummer bzw. Bestellnummer SI00072387 (human) bzw. SIO 1007531 (murin) bezogen werden kann.
Ohne sich auf diese Theorie festlegen zu wollen, kann die Wirkweise der spe- ziellen ISG15-spezifischen siRNA derart verstanden werden, daß zunächst im Zell- bzw. Wirtsystem ein siRNA/Protein-Komplex gebildet wird, welcher auch als RNA-induced silencing-Complex (RISC) bezeichnet wird, bei welchem ein Proteinkomplex den antisense- Strang der siRNA bindet und die dazu komplementäre mRNA schneidet. In diesem Zusammenhang weist der RISC-Komplex RNA-Helicase- und RNA-Nuklease-Aktivitäten auf. Diese Eigenschaften führen bei Interaktion mit der mRNA, welche sozusagen das Transkriptionsprodukt des mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren in Zusammenhang stehenden Gens, insbesondere ISG 15, darstellt, zu dessen Entwindung und Spaltung. Die mRNA wird folglich abgebaut, was zu einer Reduktion der Translation dieser mRNA und somit zu einem gene- silencing bzw. einem gene-knockout auf posttranskriptionaler Ebene und somit zu einer Geninaktivierung führt.
Erfindungsgemäß kann es auch vorgesehen sein, daß der Inhibitor und/oder Repressor ein insbesondere den antisense- Strang einer siRNA darstellender Inhibitor bzw. Repressor ist. Gleichermaßen kann es im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch vorgesehen sein, daß der Inhibitor bzw. Repressor einen Komplex aus einem antisense- Strang der siRNA und mindestens einer Proteinkomponente darstellt, wobei es sich bei diesem Komplex insbesondere um einen RISC-Komplex (RISC = RNA-induced silencing complex) handeln kann. Ein zentrales Konzept der vorliegenden Erfindung gemäß diesem Erfindungsaspekt unter Verwendung einer siRNA ist darin zu sehen, daß insbesondere synthetisch hergestellte siRNA mit Spezifität gegenüber mRNA als Transkriptionsprodukt insbesondere von ISG 15 in das Zell- bzw. Wirtsystem einge- bracht wird, was zu einem Abbau der mRNA des Zielgens, nämlich insbesondere ISG 15, führt, was wiederum zu einer Verringerung der Genprodukte und somit zu einem genes ilencing bzw. gene-knockout führt. Das der Erfindung zugrundeliegende Prinzip gemäß dieser Ausführungsform kann auch als RNA-Interferenz bezeichnet werden, auf deren Basis die Expression bestimm- ter (Ziel-)Gene, im vorliegenden Fall insbesondere ISG 15, verringert wird. Dies geschieht insbesondere durch die Interaktion von speziell gegen ein Gen gerichteter siRNA mit der mRNA des Gens mit der Folge des Abbaus der mRNA, was einer (Gen-)Inaktivierung entspricht.
Die Applikation bzw. das Einbringen der entsprechenden siRNA in das Zellbzw. Wirtsystem ist dem Fachmann an sich bekannt, so daß es diesbezüglich keiner weiteren Ausführungen bedarf. Beispielsweise kann das Einbringen bzw. Transfizieren auch über eine sogenannte Polyethylenimin- Komplexierung (PEI-Komplexierung) durchgeführt werden.
Der gemäß der Verwendung nach der vorliegenden Erfindung eingesetzte Inhibitor bzw. Repressor sollte bei Anwendung in pharmazeutisch wirksamen Mengen verabreicht werden. Zudem sollte der Inhibitor bzw. der Repressor systemisch, beispielsweise intravenös, verabreicht werden. Auch die diesbe- züglichen Maßnahmen sind dem Fachmann als solche bekannt, so daß es diesbezüglich keiner weiteren Ausführungen bedarf.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung kann es gleichermaßen vorgesehen sein, daß der Inhibitor bzw. Repressor, insbesondere wie zuvor be- schrieben, gemeinsam mit mindestens einem Interferon, insbesondere α- Interferon, vorzugsweise pegyliertem α-Interferon, verabreicht wird. In diesem Zusammenhang ist eine Kombination der zuvor beschriebenen ISGl 5- spezifischen siRNA bzw. gegen ISG 15 gerichteten siRNA mit einem Interferon von besonderem Vorteil. Denn der Anmelder konnte - wie nachfolgend anhand der Ausführungsbeispiele angeführt - in völlig überraschender Weise einen synergistischen Effekt im Rahmen der zuvor beschriebenen Kombinati- on von Inhibitor und/oder Repressor einerseits und Interferon andererseits hinsichtlich der Unterbindung bzw. Verminderung der Vermehrung bzw. Re- plikation von Hepatitis-C- Viren in den betroffenen Wirtsystemen bzw. Zellsystemen beobachten. Gleichermaßen ist es möglich, daß der Inhibitor und/oder Repressor gemeinsam und/oder in Kombination mit mindestens einer Substanz mit antiviralen Eigenschaften gegenüber Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren, verabreicht wird.
Insgesamt wird im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung gemäß dem hier vorliegenden Erfindungsaspekt ein neuer Weg zur Behandlung einer He- patitis-C-Infektion bzw. -Erkrankungen bereitgestellt, welcher auf einem völlig neuen Ansatz basiert, nämlich der gezielten Inaktivierung eines im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren stehenden Gens, insbesondere ISGl 5.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem z w e i t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist die erfindungsgemäße Verwendung gemäß Anspruch 15, d. h. also mit anderen Worten die Verwendung mindestens einer Substanz, insbesondere eines Inhibitors und/oder Repressors, zur Herstellung eines Medikamentes oder Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C, wobei die Substanz die Genaktivität und/oder Genexpression mindestens eines interferonstimulierten Gens, insbesondere von ISG 15 reguliert, insbesondere zumindest vermindert oder hemmt.
Für weitere Ausführungen in bezug auf die erfindungsgemäße Verwendung gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann auf die vorstehenden Ausführungen zu dem vorangehenden Aspekt verwiesen werden, welche diesbezüglich entsprechend gelten.
Wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem d r i t t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist die erfindungsgemäße Verwendung gemäß Anspruch 17, d. h. also mit anderen Worten eine Verwendung mindestens eines interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, vorzugsweise ISGl 5, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz und/oder mindestens eines von der Nukleinsäure codierten (Poly-)Peptids zur Auffindung und/oder Bereitstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder kurativen Behandlung von Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C, und/oder zur Vorhersage von individuellen Arzneimittelwirkungen und/oder Arzneimittelnebenwirkun- gen.
Was die Verwendung gemäß diesem erfindungsgemäßen Aspekt anbelangt, so kann das im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepa- titis-C- Viren stehende Gen, insbesondere ISG 15, gewissermaßen als Aus- gangsobjekt zur Auffindung bzw. Bereitstellung von Arzneimitteln in bezug auf eine Hepatitis-C-Infektion bzw. -Erkrankung eingesetzt werden. Dabei können die Arzneimittel dergestalt sein, daß sie — wie zuvor angeführt - direkt oder indirekt mit dem zuvor definierten Gen bzw. der diesem zugeordneten RNA, insbesondere mRNA, und/oder dem entsprechenden (Poly-)Peptid in- teragieren, um auf diese Weise insbesondere über eine Verringerung bzw. Unterbindung, insbesondere Inhibierung, der Genaktivität zu einer Verringerung bzw. Unterbindung der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren und somit zu einer Linderung bzw. Ausheilung der Hepatitis-C-Erkrankung zu führen. Dabei kann es sich somit um solche Substanzen handeln, die eine gen- regulatorische Wirkung aufweisen.
Dem Fachmann sind die Grundlagen in bezug auf das spezifische Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Verwendung gemäß diesem Erfindungsaspekt maßgeblich bekannt, so daß es diesbezüglich keiner weiteren Ausfüh- rungen bedarf.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem v i e r t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 18, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Identifi- zierung eines Inhibitors und/oder Repressors eines interferonstimulierten Nu- kleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, vorzugsweise von ISG 15, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Inkontaktbringen des Nukleinsäuremoleküls mit mindestens einer Testsubstanz unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung, insbesondere Bindung, der Testsubstanz(en) an das Nukleinsäuremolekül erlauben; und (b) Nachweis und/oder Analyse, ob die Testsubstanz(en) die Genaktivität und/oder Expression des Nukleinsäuremoleküls einschränken oder unterbinden und/oder ob die Testsubstanz(en) die Vermehrung und/oder Repli- kation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren, einschränken oder unterbinden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise in vitro durchgeführt werden, wobei gewissermaßen eine Interaktion der Testsubstanz mit dem Nukleinsäuremolekül bzw. dem Gen untersucht wird und bei vorliegender Interaktion auf eine resultierende verminderte Genaktivität als Folge dieser Inter- aktion geschlossen werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren kann gleichermaßen in einem entsprechenden Wirtsystem durchgeführt werden, wobei der Wirt ein Träger des im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Repli- kation von Hepatitis-C- Viren stehenden Gens, insbesondere ISG 15, sein sollte und vorteilhafterweise auch über einen entsprechendes Expressionssystem verfügt. Der Nachweis der Interaktion bzw. Wechselwirkung bzw. der Nachweis der Beeinflussung der Genaktivität kann mit dem Fachmann an sich geläufigen Verfahren durchgeführt werden.
In diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem f ü n f t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ein Verfahren nach Anspruch 19, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitors und/oder Repressors eines von einem interferonstimulierten Nukleinsäuremolekül, insbesondere Gen, vorzugsweise ISG 15, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz codierten (Poly-)Peptids, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen des (Poly-)Peptids mit mindestens einer Testsubstanz unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung, insbesondere Bindung, der Testsubstanz(en) an das (Poly-)Peptid erlauben; und
(b) Nachweis und/oder Analyse, ob die Testsubstanz(en) die Aktivität des (Poly-)Peptids einschränken oder unterbinden und/oder ob die Testsub- stanz(en) die Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren, einschränken oder unterbinden.
Das erfindungsgemäße Verfahren gemäß diesem Aspekt fokussiert somit auf eine Beeinflussung des Genproduktes insbesondere in Form eines Proteins bzw. (Poly-)Peptids. Das Verfahren kann in einer dem Fachmann an sich bekannten Art und Weise sowohl in vitro als auch in vivo in einem Wirtsystem durchgeführt werden, wobei im letzteren Fall der Wirt vorzugsweise die das zu untersuchende (Poly-)Peptid codierende Nukleinsäure tragen sollte. Glei- chermaßen kann eine Interaktion aber auch in vitro an isolierten (Po- ly-)Peptiden durchgeführt werden.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung gleichermaßen ein Verfahren zur Identifizierung einer mit einem insbesondere körpereigenen Mediator und/oder Faktor, welcher von einem interferonstimulierten Nukleinsäuremo- lekül, insbesondere Gen, vorzugsweise ISG 15 reguliert wird oder welcher ein interferonstimuliertes Nukleinsäuremolekül, insbesondere Gen, vorzugsweise ISGl 5 reguliert, interagierenden Substanz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen des Mediators und/oder Faktors mit mindestens einer Testsubstanz unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung, insbesondere Bindung, der Testsubstanz(en) an den Mediator und/oder Faktor erlauben; und
(b) Nachweis und/oder Analyse, ob die Testsubstanz(en) die Aktivität des Mediators und/oder Faktors beeinflussen und/oder ob die Testsub- stanz(en) die Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren, einschränken oder unterbinden.
Gemäß dem vorgenannten Verfahren handelt es sich bei der interagierenden Substanz vorzugsweise um einen Inhibitor und/oder Repressor des Mediators und/oder Faktors, sofern dieser mit einer Aktivierung des interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, vorzugsweise ISG 15, in Ver- bindung steht. Sofern der Mediator und/oder Faktor selbst mit einer Inaktivie- rung bzw. Repression des interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, vorzugsweise ISG 15, in Verbindung steht, handelt es sich bei der interagierenden Substanz in bezug auf den Mediator und/oder Faktor um einen Aktivator - hinsichtlich des interferonstimulierten Nukleinsäuremole- küls, insbesondere Gens, vorzugsweise ISGl 5, handelt es sich auf Basis der obigen Definition bei einer derartigen Substanz jedoch gleichermaßen um ei- nen Inhibitor bzw. Repressor, da auch in diesem Fall letztendlich eine Inakti- vierung bzw. Repression des interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, vorzugsweise ISG 15, resultiert.
Die erfmdungsgemäßen Verfahren nach dem vierten und fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung können derart durchgeführt werden, daß mehrere Testsubstanzen eingesetzt und die folgenden Schritte durchgeführt werden:
(a) Testung verschiedener Testsubstanzen in verschiedenen Reaktionsgefäßen, wobei diejenigen Testsubstanzen, welche die Genaktivität und/oder Expression und/oder Aktivität des Nukleinsäuremoleküls (DNA oder
RNA, insbesondere mRNA) nicht einschränken oder nicht unterbinden und/oder welche die Aktivität des (Poly-)Peptids nicht einschränken oder nicht unterbinden und/oder welche die Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren, nicht einschränken oder nicht unterbinden und/oder welche mit dem Mediator und/oder Faktor nicht interagieren im weiteren Testverfahren nicht mehr berücksichtigt werden;
(b) Verteilung von Testsubstanzen aus solchen Reaktionsgefäßen, bei wel- chen eine Verringerung oder Unterbindung der Genaktivität und/oder Expression und/oder Aktivität des Nukleinsäuremoleküls und/oder bei welchen eine Verringerung oder Unterbindung der Aktivität des (PoIy-)- Peptids und/oder bei welchen eine Verringerung oder Unterbindung der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere He- patits-C-Viren und/oder bei welchen eine Interaktion mit dem Mediator und/oder Faktor, in Schritt (a) ermittelt wurde, auf neue Reaktionsgefäße und Wiederholung von Schritt (a) mit den neuen Reaktionsgefäßen; und
(c) Wiederholung von Schritt (b), bis eine einzelne Testsubstanz identifiziert wird, welcher die Verringerung oder Unterbindung der Genaktivität und/oder Expression des Nukleinsäuremoleküls und/oder welcher die Verringerung oder Unterbindung der Aktivität des (Poly-)Peptids und/oder welcher die Verringerung oder Unterbindung der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren, zugeordnet werden kann und/oder welcher die Interaktion mit dem Mediator und/oder Faktor zugeordnet werden kann.
Dabei ist es gleichermaßen möglich, daß die Verfahren gemäß dem vierten und fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung derart durchgeführt werden, daß die Testsubstanz(en), das Nukleinsäuremolekül (DNA oder RNA, insbesondere mRNA) und/oder das (Poly-)Peptid an ein Auslesesystem (readout- System) gekoppelt sind und/oder daß dem Testansatz ein Auslesesystem zu- gesetzt wird und/oder daß das Auslesesystem nach Bindung der Testsub- stanz(en) mit dem Nukleinsäuremolekül und/oder dem (Poly-)Peptid ein nachweisbares Signal liefert.
Im Rahmen der vorgenannten Verfahren können die Testsubstanzen nieder- molekulare Substanzen, Peptide, Aptamere, Antikörper, DNA, RNA, insbesondere siRNA und/oder Fragmente oder Derivate davon, sein.
Wie zuvor angeführt, können die vorgenannten Verfahren beispielsweise in einem Wirt bzw. Wirtsystem durchgeführt werden, wobei der Wirt bzw. das Wirtsystem vorzugsweise die zuvor definierten Gene umfaßt sowie über ein entsprechendes Expressionssystem verfügt. Derartige Wirte sind dem Fachmann an sich geläufig bzw. der Fachmann ist jederzeit in der Lage, spezifische Wirtsysteme vor dem Hintergrund der vorliegenden Erfindung auszuwählen, so daß es diesbezüglich keiner weiteren Ausführungen bedarf. Die er- findungsgemäßen Verfahren können gleichermaßen in Form von Hochdurchsatzverfahren und/oder computerassistiert durchgeführt werden.
Für weitere Einzelheiten in bezug auf die erfindungsgemäßen Verfahren gemäß dem vierten und dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung kann auf die Ausführungen zu den übrigen Aspekten bzw. Gegenständen der vorliegenden Erfindung verwiesen werden, welche diesbezüglich entsprechend gelten.
Wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem s e c h s t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist das erfindungsgemäße
Verfahren gemäß Anspruch 26, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften der nach dem Verfahren gemäß dem vierten und/oder fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung identifizierten Testsubstanzen, wobei man (a) die Bindungsstelle der Testsubstanz an das Nukleinsäuremolekül (DNA oder RNA, insbesondere mRNA) oder an das (Poly-)Peptid und gegebenenfalls die Bindungsstelle des Nukleinsäuremoleküls oder des (PoIy-)- Peptids an die Testsubstanz identifiziert; (b) die Bindungsstelle der Testsubstanz und des Nukleinsäuremoleküls oder des (Poly-)Peptids durch molekulares Modellieren modifiziert; und
(c) die Testsubstanz dergestalt modifiziert, daß ihre Bindungsspezifität oder Bindungsaffinität oder Bindungsavidität für das Nukleinsäuremolekül oder das (Poly-)Peptid erhöht wird.
Diesbezüglich kann die Bindungsstelle in Schritt (a) durch ortsspezifische Mutagenese ermittelt werden, wobei die diesbezüglichen Verfahren dem Fachmann an sich bekannt sind.
Wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem s i e b t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 28, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Modifizierung einer Testsubstanz, die nach den Verfahren gemäß dem vierten und/oder fünften und/oder sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung identifiziert oder verbessert ist, wobei die Testsubstanz als Leitstruktur weiter modifiziert wird, um
(i) ein modifiziertes aktives Zentrum, ein modifiziertes Aktivitätsspektrum und/oder eine modifizierte Organspezifität und/oder
(ii) eine verbesserte Aktivität und/oder
(iii) eine verminderte Toxizität (einen verbesserten therapeutischen Index) und/oder
(iv) verminderte Nebenwirkungen und/oder
(v) einen zeitlich versetzten Beginn der therapeutischen Wirksamkeit und/oder Länge der therapeutischen Wirksamkeit und/oder (vi) veränderte pharmakokinetische Parameter (insbesondere Resorption, Distribution, Metabolismus und/oder Exkretion) und/oder
(vii) modifizierte physikochemische Parameter, insbesondere Löslichkeit, hy- groskopische Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität und/oder Zustandsform, und/oder
(viii) eine verbesserte generelle Spezifität, Organ-/Gewebespezifität, und/oder (ix) eine optimierte Verabreichungsform und/oder -route, insbesondere durch
(a) Veresterung von Carboxylgruppen und/oder
(b) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren und/oder
(c) Veresterung von Hydroxylgruppen, insbesondere zu Phosphaten, Pyrophosphaten oder Sulfaten und/oder Hemisuccinaten und/oder
(d) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen und/oder
(e) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen und/oder
(f) Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren und/oder (g) Einführung von hydrophilen Gruppen und/oder
(h) Einführung und/oder Austausch von Substituenten in Aromaten und/oder Seitenketten und/oder Veränderung des Substituentenmu- sters und/oder
(i) Modifikation durch Einführung von isosterischen und/oder bioiso- sterischen Gruppen und/oder
(j) Synthese von homologen Verbindungen und/oder (k) Einführung von verzweigten Seitenketten und/oder
(1) Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen und/oder
(m) Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen und/oder Aceta- len und/oder
(n) N-Acetylierung zu Amiden und/oder Phenylcarbamaten und/oder
(o) Synthese von Mannich-Basen und/oder Iminen und/oder (p) Umwandlung von Ketonen und/oder Aldehyden in Schiff-Basen, Oximen, Acetalen, Ketalen, Enolestern, Oxazolidinen, Thiozolidi- nen oder deren Kombinationen, zu erreichen.
Dabei ist es im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, daß die identifizierte, verbesserte oder modifizierte Testsubstanz, insbesondere der Inhibitor und/oder Repressor der bzw. des zuvor genannten Gens, durch Pep- tidomimetika pharmakologisch weiter verbessert wird.
Für weitere Ausführungen in bezug auf die erfindungsgemäßen Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann auf die Ausführungen zu den vorangehenden Aspekten der vorliegenden Erfindung verwiesen wer- den, welche diesbezüglich entsprechend gelten.
Wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem a c h t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung — ist das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 30, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Identifikation und/oder Ermittlung mindestens eines mit der Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehenden Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, vorzugsweise humanen und/oder interferonstimulierten Gens, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Erstellung eines Genexpressions- und/oder Genaktivitätsprofils von einer Vielzahl von Probanden eines Probandenkollektivs, wobei (i) die Probanden einer ersten Gruppe des Probandenkollektivs eine Infektion mit Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren, aufweisen und (ii) die Pro- banden einer zweiten Gruppe des Probandenkollektivs keine solche Infektion aufweisen;
(b) Analyse und Vergleich bzw. Abgleich der jeweiligen Genexpressions- und/oder Genaktivitätsprofile von (i) Probanden der ersten Gruppe und (ii) Probanden der zweiten Gruppe und
(c) Identifikation mindestens eines Nukleinsäuremoleküls, insbesondere mindestens eines Gens, welches bei (i) den Probanden der ersten Gruppe im Vergleich zu (ii) den Probanden der zweiten Gruppe eine erhöhte Genexpression und/oder Genaktivität aufweist.
Das Verfahren kann im Anschluß an Schritt (c) den nachfolgenden Schritt (d) umfassen:
(d) Zuordnung des in Schritt (c) identifizierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, als ein mit der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatitis-C- Viren, im Zusammenhang stehen- des Nukleinsäuremolekül, insbesondere Gen.
Das erfindungsgemäße Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise anhand differenzieller Expression unter Einsatz von sogenannten DNA-Chips eingesetzt werden. Dabei kann beispielsweise derart verfahren werden, daß zunächst RNA aus dem Blut eines zu untersuchenden Probanden isoliert und dieses Isolat auf speziellen Gen-Chips gegeben wird und im Rahmen von dem Fachmann an sich bekannten Auswertebzw. Analyseverfahren der Expressionsgrad bei Probanden mit Hepatitis-C- Infektion im Vergleich zu Probanden ohne Hepatitis-C-Infektion für bestimm- te Gene ermittelt wird und einem Gen, insbesondere einem interferonstimulierten Gen, mit einem erhöhten Expressionsgrad die Eigenschaften eines im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren im Zusammenhang stehenden Gens, insbesondere die Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren fördernden Gens zugesprochen werden kann.
Auf diese Weise ist es möglich, weitere Gene, insbesondere interferonstimulierte Gene, zu identifizieren, welche mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren im Zusammenhang mit einer Hepatitis-C-Infektion bzw. Hepatitis-C-Erkrankung stehen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem n e u n t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 32, mit anderen Worten somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Hepatitis-C-Erkrankungen, enthaltend in wirksamen, insbesondere pharmazeutisch wirksamen Mengen mindestens eine pharmakolo- gisch aktive Substanz, insbesondere einen Inhibitor und/oder Repressor, für ein mit der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehendes Nukleinsäuremolekül, insbesondere Gen, vorzugsweise ISGl 5, und/oder für dessen DNA-Sequenz und/oder für dessen zugeordnete RNA-Sequenz, insbesondere für dessen zugeordnete mRNA-Sequenz, und/oder für dessen zugeordnete (Poly-)Peptid, wobei die Substanz nach dem Verfahren gemäß dem vierten und/oder fünften und/oder sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung erhältlich ist.
Für weitere diesbezügliche Einzelheiten im bezug auf die erfindungsgemäße pharmakologisch aktive Substanz kann auf die übrigen Ausführungen zu den weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung verwiesen werden, welche in diesem Zusammenhang entsprechend gelten.
Wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem z e h n t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist zudem eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 33, mit anderen Worten somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Hepatitis-C-Erkrankungen, enthaltend in wirksamen, insbesondere pharmazeutisch wirksamen Mengen mindestens eine siRNA, wobei die siRNA die Genaktivität und/oder Genexpression mindestens eines interferonstimulierten Gens, insbesondere von ISG 15, reguliert, insbesondere vermindert oder zumindest hemmt.
Bei der im Rahmen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzten siRNA handelt es sich gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform um eine siRNA gegen ISG 15, welche von der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland unter der Produktnummer bzw. Bestellnummer SI00072387 bezogen werden kann.
Für weitere Einzelheiten in bezug auf die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung gemäß diesem Erfindungsaspekt der vorliegenden Erfindung kann auf die Ausführungen zu den übrigen vorgenannten Aspekten der vorliegenden Erfindung verwiesen werden, welche in diesem Zusammenhang entsprechend gelten. Weitere Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Ausfuhrungsbeispiele veranschaulicht, welche die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls beschränken.
AUSFUHRUNGSBEISPIELE;
Methoden und Untersuchungsergebnisse:
1. Isolierung von Gesamt-RNA
Zur Extraktion der Gesamt-RNA wurden die Zellen mit 500 μl Trizol überschichtet. Die adhärenten Zellen wurden mit einem Plastikschaber vom Grund gelöst und in ein Reaktionsgefaß überfuhrt. Es wurden 0, 1 ml Chloroform / 1 ml Trizol hinzugegeben und durch Schütteln vermischt. Zentrifugieren bei 12.000 g und bei 2 bis 8 0C für 15 min führte zur Phasentrennung des Phenol/Chloroform-Gemisches. Die wäßrige Phase wurde abgenommen und die gelöste RNA durch 0,5 ml Isopropanol/1 ml Trizol ausgefällt. Das Pellet wurde dann mit 75 % Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und abschließend in RNase-freiem Wasser gelöst. Im Anschluß wurde die RNA mit Hilfe des „RNeasy Mini" Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend den Herstelleranweisungen aufgereinigt und bis zur weiteren Analyse bei -200C gelagert.
2. Quantitative realtime-PCR: Die reverse Transkription von RNA, gefolgt von einer Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), ist eine sensitive Methode zur Quantifizierung spezifischer mRNAs. In einem Ein-Schritt-RT-PCR- Verfahren (one-step RT-PCR} wird durch den Einsatz spezifischer Primer zuerst die mRNA des gesuchten Gens in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben, welche wiederum das Template bzw. die Vorlage für die folgende PCR liefert.
Um eine quantitative Aussage über die eingesetzte Menge an mRNA machen zu können, wurde der LightCycler Rotor-Gene 2000 von Corbett (Mortlake, Australien) verwendet. Der LightCycler erfaßt über eine Fluorimeter- komponente die Fluoreszenz des Fluorophoren nach Bindung an doppelsträn- gige DNA. Eingesetzt wurde das QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit von QIAGEN, ein 25-μl-Ansatz wurde wie folgt zusammenpipettiert: 5,25 μl H2O (RNase-frei), 12,5 μl SYBR Green RT-PCR Master Mix, 0,25 μl QuantiTect RT-Mix, 2,5 μl jedes Primers (0,5 mM) und 2 μl Gesamt-RNA (100 ng bis 200 ng). Das verwendete LightCycler-Programm startete mit einem 30minütigen RT-Schritt bei 55 0C, gefolgt von einer 15minütigen Hitze- Inaktivierung der RT-Polymerase mit dem Anschluß eines herkömmlichem PCR-Schemas, d. h. pro Zyklus 5 s Denaturierung bei 95 0C, 10 s Annealing- temperatur (55 0C) und 30 s Elongation bei 72 0C. Die Produktbildung wurde nach jedem Replikationszyklus über den Fluoreszenzanstieg bestimmt. Nach im Durchschnitt 40 Replikationszyklen wurden die Schmelzkurven der gebil- deten Produkte erfaßt, um so die Spezifität der PCR-Reaktion zu überprüfen. Aufgrund des Schmelzverhaltens von DNA nimmt die Fluoreszenz mit steigender Temperatur ab. Die maximale Fluoreszenzänderung pro Temperaturerhöhung ergibt ein Maximum in der Schmelzkurve, welches charakteristisch für jedes PCR-Produkt ist. Die vom LightCycler kalkulierten Kopienzahlen der gemessenen Gene wurden gegen das housekeeping Gen bzw. Haushaltsgen ß-Aktin abgeglichen und analysiert.
3. Suppression der Genexpression von ISG 15 mittels siRNA:
Die Expression von ISGl 5 wurde auf Zellkulturebene im HCV-Replikon- System ausgeschaltet, um die direkte Wirkung auf die HCV-Replikation zu untersuchen. Die Suppression der Genexpression, auch gene-knockdown bzw. gene-knockout genannt, erfolgt mittels siRNA über einen zellulären Mechanismus des Prozessierens. Der Dicer-Enzymkomplex spaltet zelluntypische dsRNA in 21 bis 23 bp große Oligomere, die sogenannten small interfering RNAs (siRNA). Die siRNA kann mit einem Proteinkomplex den RNA-induced silencing complex (RISC) ausbilden; dieser bindet den antisense- Strang der siRNA und schneidet die dazu komplementäre mRNA. Die Degradation der mRNA führt zu einer Reduktion der Translation dieser mRNAs und somit zu einem gene-silencing auf posttranskriptionaler Ebene.
Ein auf der humanen Hepatomzelllinie HuH-7 basierendes conl-Replikon- Sy stem sowie die murinen MHl -Zellen, die ebenfalls ein HCV-Replikon enthalten, wurden im 96er Lochplattenformat mit siRNAs gegen ISG 15 (Qiagen) transfiziert (human: Best.-Nr. SI00072387, murin: Best.-Nr. SI01007531). Dann wurde der Effekt der Gensuppression auf die HCV-Replikation untersucht.
Hierzu wurden in einem reversen Transfektionsansatz zuerst 12,5 ng der siRNAs (5 nM) in 3 μl Susspensionspuffer gelöst und in die Vertiefungen der Lochplatte vorpipettiert. In einem weiteren Ansatz wurden jeweils 2,5 ng der siRNAs für ein gleichzeitiges Ausschalten weiterer Gene eingesetzt (nicht graphisch dargestellt). Als Kontrolle wurde eine nichtcodogene siRNA einge- setzt. Anschließend wurden pro Ansatz 0,75 μl des Transfektionsreagenz Hi- PerFect™ (Qiagen, Hilden, Deutschland) in 24,25 μl serumfreies Kulturmedium überführt, gemischt und zu den vorgelegten siRNAs gegeben. Der Trans- fektionsansatz wurde nun 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschlie- ßend wurden 1 104 Zellen zu den Transfektionsansätzen gegeben und das Volumen mit Kulturmedium auf 200 μl aufgefüllt und für 12 Stunden bei 37 0C, 5 % CO2-Gehalt und gesättigter Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die RNA wurde wie bereits beschrieben extrahiert und der Rückgang der Genexpression von ISG 15 sowie die HCV-Replikation mittels quantitativer RT-PCR bzw. We- sternblot untersucht.
4. Hemmung der HCV-Replikation im Dauerversuch über 3 Monate - fehlende Induktion resistenter Mutanten: Murine MHl-HCV-Replikon-Zellen wurden über 19 Zellpassagen mit nicht- kodierender siRNA bzw. gegen ISG 15 gerichteter siRNA kultiviert. Zur Zellpassage 1, 7, 11, 15 und 19 wurde die HCV-Kopienzahl/100.000 Kopien ß- Aktin bestimmt und jeweils gegen die unbehandelte Kontrolle (100 %) abgeglichen. Da die gegen ISGl 5 gerichtete siRNA während der gesamten Dauer des Versuchs ihre anti-HCV-Aktivität behielt, ist davon auszugehen, daß keine gegen diesen Ansatz resistenten Mutanten entstanden sind oder selek- tioniert wurden. Fig. IA und Fig. IB veranschaulichen die erhaltenen Ergebnisse (mit siNC = non silencing control, siISG15 = ISG15-spezifische siRNA). In Fig. IA ist die HCV-Kopienzahl gegen die unbehandelte Kontrolle (MHl) normiert und abgeglichen, und in Fig. IB ist die HCV/ISG15- Kopienzahl gegen die siNC-Kontrolle normiert und abgeglichen. Fig. IA und Fig. IB zeigen den erheblichen Rückgang der HCV-Kopienzahl bei Behandlung mit ISG15-spezifischer siRNA (siISG15). Folglich ist auch die Vermehrung bzw. Replikation unter Einfluß von SÜSG15 verringert.
5. Hemmung der HCV-NS 5 A-Proteinexpression mittels siRNA-Knockdown von ISG 15 — Synergismus mit IFN-α:
Die murinen MHl- und die humanen conl-HCV-Replikonzellen wurden in 6-Lochplatten ausgesät und bis zu einer Konfluenz von 30 bis 40 % bei 37 0C und einem CO2-Luftgehalt von 5 % inkubiert. Die Transfektion mit 5 nM siRNA (siNC = non silencing control, siISG15 = ISG15-spezifische humane sowie murine siRNA) erfolgte mittels „HiPerFect™ Transfection Reagent" (Qiagen, Hilden, Deutschland). Nach 8 h Inkubation (37 0C, 5 % CO2) wurden die Zellen gewaschen und wieder in Kulturmedium sowie mit IFN-α versetztem Medium aufgenommen und für weitere 64 h inkubiert. Im Anschluß wurden die Zellen lysiert und eine Proteinextraktion durchgeführt. Mittels We- sternblot konnten das virale Proteine NS5A sowie das housekeeping Gen ß-Aktin nachgewiesen werden.
Fig. 2A und Fig. 2B zeigen im Rahmen eines Westernblots, daß eine Behandlung mit gegen ISGl 5 gerichteter siRNA sowohl in murinen als auch in hu- manen HCV-Replikonsystemen zu einer deutlichen Suppression des HCV- NS5A-Proteins führt. Ferner zeigen Fig. 2A und Fig. 2B, daß ein Synergismus mit IFN-α besteht, da die zusätzliche Gabe von IFN-α (vgl. Fig. 2A und Fig. 2B: + IFN-α) zu einer signifikanter Verringerung der NS5A-Synthese im Vergleich zu dem nicht mit IFN-α behandelten Ansatz (vgl. Fig. 2 A und Fig. 2B: - IFN-α) führt.
Fig. IA zeigt die Hemmung der HCV-Replikation und die fehlende Induktion resistenter Mutanten bei Behandlung mit ISG15-spezifischer siRNA (siISG15) gegenüber einer Behandlung mit siNC, wobei die HCV-Kopienzahl gegen die unbehandelte Kontrolle (MHl) normiert und abgeglichen ist.
Fig. IB zeigt die Hemmung der HCV-Replikation und die fehlende Induktion resistenter Mutanten bei Behandlung mit ISG15-spezifischer siRNA (siISG15) gegenüber einer Behandlung mit siNC, wobei die
HCV/ISG 15 -Kopienzahl gegen die siNC-Kontrolle normiert und abgeglichen ist.
Fig. 2A zeigt anhand eines Westernblots die Ergebnisse einer an humanen conl-HCV-Replikonzellen durchgeführten Behandlung mit gegen
ISG 15 gerichteter siRNA ohne zusätzliche Applikation von IFN-α einerseits (- IFN-α) und mit zusätzlicher Applikation von IFN-α andererseits (+ IFN-α). Fig. 2B zeigt anhand eines Westemblots die Ergebnisse einer an murinen
MHl-HCV-Replikonzellen durchgeführten Behandlung mit gegen
ISG 15 gerichteter siRNA ohne zusätzliche Applikation von IFN-α einerseits (- IFN-α) und mit zusätzlicher Applikation von IFN-α an- dererseits (+ IFN-α).
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Replikation von Hepatitis-C- Viren in MHl -Zellen für verschiedene Passagen, wobei die HCV-Kopienzahl auf 100.000 ß-Aktin-Moleküle bezogen ist (MHl = unbehandelte Kontrolle, NC = non silencing control, ISG 15 = ISG15-spezifische si-RNA). Für sämtliche Passagen ist unter Einsatz von ISGl 5- spezifischer si-RNA im Vergleich zu MHl und NC ein deutlicher Rückgang der HCV-Kopienzahl und somit eine Verminderung der Virussynthese bzw. -replikation zu beobachten.

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung eines Inhibitors und/oder Repressors eines mit der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis- C- Viren, im Zusammenhang stehenden Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneten (Poly-)Peptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Gen ein humanes Gen ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gen ein interferonstimuliertes Gen ist, insbesondere wobei das Gen ein durch Interferone vom Typ I, vorzugsweise α- Interferon und/oder ß-Interferon, stimuliertes Gen ist.
4. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gen ISGl 5 ist, insbesondere mit der Transkript-ID (Lokus) NM 005101 und/oder insbesondere gemäß Sequenzprotokoll I und/oder insbesondere gemäß SEQUENCE LISTING.
5. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor und/oder Repressor eine die Aktivität des Gens, insbesondere von ISG 15, herabsetzende und/oder unterbindende, insbesondere inhibierende Substanz ist.
6. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor und/oder Repressor eine mit dem Gen, insbesondere mit ISGl 5, und/oder mit dessen DNA-Sequenz und/oder mit dessen zugeordneter
RNA-Sequenz und/oder mit dessen zugeordnetem (Poly-)Peptid inter- agierende Substanz ist, insbesondere wobei die Substanz die Aktivität des Gens, insbesondere von ISG 15, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz und/oder dessen zugeord- neten (Poly-)Peptids herabsetzt und/oder unterbindet, insbesondere inhibiert.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Inhibitor und/oder Repressor mit dem Promoter und/oder Enhancer des Gens, insbesondere von ISG 15, wechselwirkt und/oder interagiert derart, daß die Bindung von insbesondere körpereigenen Transkriptionsfaktoren, insbesondere Aktivatoren, an den Promoter und/oder Enhancer verhindert oder zumindest gehemmt wird.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Inhibitor und/oder Repressor mit einem insbesondere körpereigenen Transkriptionsfaktor, insbesondere Aktivator, wechselwirkt und/oder interagiert derart, daß die Bindung des Transkriptionsfaktors, insbesondere Aktiva- tors, an den Promoter und/oder Enhancer des Gens, insbesondere von
ISGl 5, verhindert oder zumindest gehemmt wird und/oder wobei der Inhibitor und/oder Repressor mit insbesondere körpereigenen, von dem Gen regulierten Mediatoren und/oder Faktoren, insbesondere ISGl 5- regulierten Mediatoren und/oder Faktoren, und/oder mit insbesondere körpereigenen, das Gen regulierenden Mediatoren und/oder Faktoren, insbesondere ISG 15 -regulierenden Mediatoren und/oder Faktoren, interagiert insbesondere derart, daß die Aktivität des Gens, insbesondere von ISG 15, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneten (Poly-)Peptids herabge- setzt und/oder unterbunden, insbesondere inhibiert, wird.
9. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor und/oder Repressor eine vorzugsweise mit der dem Gen, insbesondere ISGl 5, zugeordneten RNA-Sequenz, insbesondere mRNA- Sequenz, interagierende RNA-Sequenz ist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Inhibitor und/oder Repressor eine RNA-Sequenz in Form eines Oligomers, insbesondere mit 15 bis 20 Basenpaaren (bp), vorzugsweise 18 bis 25 bp, bevorzugt 21 bis 23 bp, ist.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Inhibitor und/oder Repressor eine siRNA ist, insbesondere wobei die siRNA gegen ISGl 5, insbesondere gegen ISG 15 zugeordneter mRNA, gerichtet ist.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche Anspruch 9 bis 11, wobei der Inhibitor und/oder Repressor ein insbesondere den antisense- Strang der siRNA und mindestens eine Proteinkomponente umfassender RISC- Komplex ist.
13. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor und/oder Repressor in wirksamen, insbesondere pharmazeutisch wirksamen Mengen verabreicht wird und/oder wobei der Inhibitor und/oder Repressor systemisch verabreicht wird.
14. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor und/oder Repressor gemeinsam mit mindestens einem Interferon, insbesondere α-Interferon, vorzugsweise mit pegyliertem α-Interferon, verabreicht wird und/oder wobei der Inhibitor und/oder Repressor gemeinsam und/oder in Kombination mit mindestens einer Substanz mit antiviralen Eigenschaften gegenüber Hepatitis-Viren, insbesondere He- patits-C- Viren, verabreicht wird.
15. Verwendung mindestens einer Substanz, insbesondere eines Inhibitors und/oder Repressors, zur Herstellung eines Medikamentes oder Arznei- mittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von
Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C, wobei die Substanz die Genaktivität und/oder Genexpression mindestens eines interferonstimulierten Gens, insbesondere von ISG 15, reguliert, insbesondere vermindert oder zumindest hemmt.
16. Verwendung nach Anspruch 15, gekennzeichnet durch eines oder mehrere der Merkmale nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
17. Verwendung mindestens eines interferonstimulierten Nukleinsäuremole- küls, insbesondere Gens, vorzugsweise ISG 15, und/oder dessen DNA- Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA- Sequenz und/oder minde- stens eines von der Nukleinsäure codierten (Poly-)Peptids zur Auffindung und/oder Bereitstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder kurativen Behandlung von Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C, und/oder zur Vorhersage von individuellen Arzneimittelwirkun- gen und/oder Arzneimittelnebenwirkungen.
18. Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitors und/oder Repressors eines interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, vorzugsweise von ISGl 5, und/oder dessen DNA- Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen des Nukleinsäuremoleküls mit mindestens einer Testsubstanz unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung, insbesondere Bindung, der Testsubstanz(en) an das Nukleinsäuremolekül erlauben; und
(b) Nachweis und/oder Analyse, ob die Testsubstanz(en) die Genaktivität und/oder Expression des Nukleinsäuremoleküls einschränken oder unterbinden und/oder ob die Testsubstanz(en) die Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatits-C-
Viren, einschränken oder unterbinden.
19. Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitors und/oder Repressors eines von einem interferonstimulierten Nukleinsäuremolekül, insbesondere Gen, vorzugsweise ISGl 5, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz codierten (Poly-)Peptids, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen des (Poly-)Peptids mit mindestens einer Testsub- stanz unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung, insbesondere
Bindung, der Testsubstanz(en) an das (Poly-)Peptid erlauben; und
(b) Nachweis und/oder Analyse, ob die Testsubstanz(en) die Aktivität des (Poly-)Peptids einschränken oder unterbinden und/oder ob die Testsubstanz(en) die Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatits-C- Viren, einschränken oder unterbinden.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei mehrere Testsubstanzen eingesetzt und die folgenden Schritte durchgeführt werden:
(a) Testung verschiedener Testsubstanzen in verschiedenen Reaktions- gefäßen, wobei diejenigen Testsubstanzen, welche die Genaktivität und/oder Expression und/oder Aktivität des Nukleinsäuremoleküls nicht einschränken oder nicht unterbinden und/oder welche die Aktivität des (Poly-)Peptids nicht einschränken oder nicht unterbinden und/oder welche die Vermehrung und/oder Replikation von Hepati- tis- Viren, insbesondere Hepatits-C- Viren, nicht einschränken oder nicht unterbinden im weiteren Testverfahren nicht mehr berücksichtigt werden;
(b) Verteilung von Testsubstanzen aus solchen Reaktionsgefäßen, bei welchen eine Verringerung oder Unterbindung der Genaktivität und/oder Expression und/oder Aktivität des Nukleinsäuremoleküls und/oder bei welchen eine Verringerung oder Unterbindung der Aktivität des (Poly-)Peptids und/oder bei welchen eine Verringerung oder Unterbindung der Vermehrung und/oder Replikation von Hepa- titis-Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren, in Schritt (a) ermittelt wurde, auf neue Reaktionsgefäße und Wiederholung von Schritt (a) mit den neuen Reaktionsgefäßen; und
(c) Wiederholung von Schritt (b), bis eine einzelne Testsubstanz identi- fiziert wird, welcher die Verringerung oder Unterbindung der Genaktivität und/oder Expression des Nukleinsäuremoleküls und/oder welcher die Verringerung oder Unterbindung der Aktivität des (Po- ly-)Peptids und/oder welcher die Verringerung oder Unterbindung der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis-Viren, insbe- sondere Hepatits-C-Viren, zugeordnet werden kann.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die Testsub- stanz(en), das Nukleinsäuremolekül und/oder das (Poly-)Peptid an ein Auslesesystem (readout-System) gekoppelt sind und/oder wobei dem Testansatz ein Auslesesystem zugesetzt wird und/oder wobei das Auslesesystem nach Bindung der Testsubstanz(en) mit dem Nukleinsäuremolekül und/oder dem (Poly-)Peptid ein nachweisbares Signal liefert.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei die Testsubstanzen niedermolekulare Substanzen, Peptide, Aptamere, Antikörper, DNA, RNA, insbesondere siRNA und/oder Fragmente oder Derivate davon, sind.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei das Verfahren in einem Wirt durchgeführt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei das Verfahren als ein Hochdurchsatzverfahren durchgeführt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei das Verfahren computerassistiert durchgeführt wird.
26. Verfahren zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25 identifizierten Testsubstanzen, wobei man
(a) die Bindungsstelle der Testsubstanz an das Nukleinsäuremolekül oder an das (Poly-)Peptid und gegebenenfalls die Bindungsstelle des
Nukleinsäuremoleküls oder des (Poly-)Peptids an die Testsubstanz identifiziert;
(b) die Bindungsstelle der Testsubstanz und des Nukleinsäuremoleküls oder des (Poly-)Peptids durch molekulares Modellieren modifiziert; und
(c) die Testsubstanz dergestalt modifiziert, daß ihre Bindungsspezifität oder Bindungsaffinität oder Bindungsavidität für das Nukleinsäure- molekül oder das (Poly-)Peptid erhöht wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Bindungsstelle in Schritt (a) durch ortsspezifische Mutagenese ermittelt wird.
28. Verfahren zur Modifizierung einer Testsubstanz, die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 27 identifiziert oder verbessert ist, wobei die Testsubstanz als Leitstruktur weiter modifiziert wird, um (i) ein modifiziertes aktives Zentrum, ein modifiziertes Aktivitätsspektrum und/oder eine modifizierte Organspezifität und/oder
(ii) eine verbesserte Aktivität und/oder (iii) eine verminderte Toxizität (einen verbesserten therapeutischen Index) und/oder
(iv) verminderte Nebenwirkungen und/oder (v) einen zeitlich versetzten Beginn der therapeutischen Wirksamkeit und/oder Länge der therapeutischen Wirksamkeit und/oder
(vi) veränderte pharmakokinetische Parameter (insbesondere Resorption, Distribution, Metabolismus und/oder Exkretion) und/oder
(vii) modifizierte physikochemische Parameter, insbesondere Löslichkeit, hygroskopische Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität und/oder Zustandsform, und/oder (viii) eine verbesserte generelle Spezifität, Organ-/Gewebespezifität, und/oder
(ix) eine optimierte Verabreichungsform und/oder -route, insbesondere durch
(a) Veresterung von Carboxylgruppen und/oder
(b) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren und/oder
(c) Veresterung von Hydroxylgruppen, insbesondere zu Phosphaten, Pyrophosphaten oder Sulfaten und/oder Hemisuccinaten und/oder (d) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen und/oder
(e) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen und/oder (f) Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren und/oder (g) Einführung von hydrophilen Gruppen und/oder
(h) Einführung und/oder Austausch von Substituenten in Aroma- ten und/oder Seitenketten und/oder Veränderung des Substi- tuentenmusters und/oder
(i) Modifikation durch Einführung von isosterischen und/oder bioisosterischen Gruppen und/oder (j) Synthese von homologen Verbindungen und/oder
(k) Einführung von verzweigten Seitenketten und/oder
(1) Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen und/oder
(m) Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen und/oder Acetalen und/oder (n) N-Acetylierung zu Amiden und/oder Phenylcarbamaten und/oder
(o) Synthese von Mannich-Basen und/oder Iminen und/oder (p) Umwandlung von Ketonen und/oder Aldehyden in Schiff-
Basen, Oximen, Acetalen, Ketalen, Enolestern, Oxazolidinen, Thiozolidinen oder deren Kombinationen, zu erreichen.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei die identifizierte, verbesserte und/oder modifizierte Testsubstanz durch Peptidomimetika pharmakologisch weiter verbessert wird.
30. Verfahren zur Identifikation und/oder Ermittlung mindestens eines mit der Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis-C- Viren, im Zusammenhang stehenden Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, vorzugsweise humanen und/oder interferonstimulierten Gens, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Erstellung eines Genexpressions- und/oder Genaktivitätsprofils von einer Vielzahl von Probanden eines Probandenkollektivs, wobei (i) die Probanden einer ersten Gruppe des Probandenkollektivs eine Infektion mit Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis-C- Viren, aufwei- sen und (ii) die Probanden einer zweiten Gruppe des Probandenkollektivs keine solche Infektion aufweisen ;
(b) Analyse und Vergleich bzw. Abgleich der jeweiligen Genexpressions- und/oder Genaktivitätsprofile von (i) Probanden der ersten Gruppe und (ii) Probanden der zweiten Gruppe und
(c) Identifikation mindestens eines Nukleinsäuremoleküls, insbesondere mindestens eines Gens, welches bei (i) den Probanden der ersten Gruppe im Vergleich zu (ii) den Probanden der zweiten Gruppe eine erhöhte Genexpression und/oder Genaktivität aufweist.
31. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Verfahren im Anschluß an Schritt (c) den nachfolgenden Schritt umfaßt: (d) Zuordnung des in Schritt (c) identifizierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, als ein mit der Vermehrung und/oder Replikati- on von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehendes Nukleinsäuremolekül, insbesondere Gen.
32. Pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Hepatitis-C-Erkrankungen, enthaltend in wirksamen, insbesondere pharmazeutisch wirksamen Mengen mindestens eine pharmakologisch aktive Substanz, insbesondere einen Inhibitor und/oder Repressor, für ein mit der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis- Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren, im
Zusammenhang stehendes Nukleinsäuremolekül, insbesondere Gen, vorzugsweise ISGl 5, und/oder für dessen DNA-Sequenz und/oder für dessen zugeordnete RNA-Sequenz, insbesondere für dessen zugeordnete mRNA-Sequenz, und/oder für dessen zugeordnete (Poly-)Peptid, wobei die Substanz nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 31 erhältlich ist.
33. Pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Hepatitis-C-Erkrankungen, enthaltend in wirksamen, insbesondere pharmazeutisch wirksamen Mengen mindestens eine siRNA, wobei die siRNA die Genaktivität und/oder Genexpression mindestens eines interferonstimulierten Gens, insbesondere von ISGl 5, reguliert, insbesondere vermindert oder zumindest hemmt.
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