WO2009145307A1 - 生残菌数推定方法及び保証菌数の設定方法 - Google Patents

生残菌数推定方法及び保証菌数の設定方法 Download PDF

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WO2009145307A1
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文明 阿部
綾子 内島
綾子 堀米
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Morinaga Milk Industry Co Ltd
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Morinaga Milk Industry Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Definitions

  • the present invention relates to a method for estimating the number of surviving bacteria of a composition containing a strain such as probiotics and a method for setting a guaranteed number of bacteria.
  • Bifidobacteria and lactic acid bacteria are used as probiotics in various foods.
  • bifidobacteria and lactic acid bacteria are in the form of powders, capsules, tablets, and the like, and are used in foods for a wide range of uses such as health foods, confectionery, and infant formula.
  • bifidobacteria and lactic acid bacteria have been used as probiotics in the medical field and the livestock feed field.
  • probiotics exert beneficial effects on human and animal health by the growth of bacteria administered to humans and animals in the intestine. Therefore, it is important that probiotics are alive. Although it is very difficult to add bifidobacteria and lactic acid bacteria to the product and maintain the number of surviving bacteria within the warranty period (best-before period), several methods have been developed in the past. Foods, pharmaceuticals and feeds (hereinafter referred to as probiotic products) containing probiotics are commercialized.
  • probiotic products When developing a probiotic product, there are numerous considerations, such as predicting changes in the number of surviving bacteria in the product, setting the shelf life of the product, and checking the effectiveness of the product.
  • probiotic products need to clarify the guaranteed number of bacteria in the product within the warranty period from the viewpoint of ensuring the reliability of the product to consumers. Therefore, when developing probiotic products, the number of probiotics remaining in the product during the storage period is actually measured by a storage test to evaluate the survival of the probiotics. There was a need. However, probiotic products often have a warranty period of 1 to 3 years, and the number of probiotics remaining at the end of the warranty period is measured. To set it, a long-term storage test comparable to the warranty period was required, and it took time for commercialization.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 a method of performing an accelerated test at a high storage temperature and estimating the number of surviving bacteria from the result of the accelerated test has been studied (see Non-Patent Documents 1 to 4).
  • the storage temperature should be set high, so that the killing rate of the bacteria is increased by the high temperature, and it is very difficult to accurately estimate the survival at the storage temperature at room temperature. It was difficult. Further, when the set temperature of the accelerated test is slightly higher than room temperature, the storage test period could not be shortened sufficiently.
  • Non-Patent Document 5 it is known that the viability of bifidobacteria changes depending on the water content and water activity value of the product (see Non-Patent Document 5). Furthermore, it is known that the viability of bifidobacteria varies not only with the water activity value of the product but also with the storage temperature of the product (see Non-Patent Document 6). In addition, it is known that Bifidobacteria have different survival characteristics for each strain (see Non-Patent Document 7). Moreover, even in lactic acid bacteria, there is a report that the viability changes depending on the storage temperature and the water activity value (see Non-Patent Document 8).
  • Non-Patent Documents 5 to 8 have not led to the idea of analyzing the correlation between the storage temperature and the water activity value and estimating the number of surviving bacteria in the product from the correlation.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and by accurately estimating the number of surviving bacteria of a specific strain relative to the storage period of a probiotic product, it is possible to reduce the product development period.
  • Provided are a method for estimating the number of bacteria and a method for setting a guaranteed number of bacteria that can easily lead to the guaranteed number of bacteria of a specific strain in a probiotic product within a quality guarantee period.
  • the present inventors determined that the number of surviving bacteria of the strain when storing a composition containing a specific strain belonging to bifidobacteria, lactic acid bacteria, etc. depends on the storage temperature of the composition and the water activity value of the composition. It was found that there is a correlation between the common logarithm of the number of surviving bacteria and the storage period. The regression coefficient derived from the correlation was defined as the killing rate of the bacteria. And it discovered that a death rate changes with water activity values, and the natural logarithm value of a death rate shows a positive correlation with a water activity value.
  • the death rate has a correlation with the storage temperature according to Arrhenius' law, and the death rate coefficient and constant of the regression line derived from the relationship between the death rate and the water activity value strongly correlate with the storage temperature. I found that there is sex. Then, from the correlation between the killing rate, the storage temperature, and the water activity value, a relational expression regarding the killing rate of the bacteria and the survival cell count (CFU / g) of the specific strain is completed.
  • the viable cell count (CFU / g) can be accurately estimated by substituting the viable cell count, storage temperature (° C.), water activity value, and storage period (day).
  • a survival cell count estimation method wherein the survival cell count n t (CFU / g) of the strain when a composition containing a specific strain is stored is estimated by the following formula (I) .
  • Log 10 n t Log 10 n 0 ⁇ t ⁇ EXP ⁇ (A T ⁇ T + B T ) w + (C T ⁇ T + D T ) ⁇ (I) t: Storage period (days) x 1/30.
  • n t Number of surviving bacteria (CFU / g) of the strain contained in the composition after storage period t (days).
  • n 0 the viable cell count (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage.
  • T Storage temperature (° C.).
  • w Water activity value of the composition.
  • a T A coefficient specific to the strain obtained by experiment.
  • B T A constant specific to the strain obtained by experiment.
  • C T A coefficient peculiar to the strain obtained by experiments.
  • D T A constant specific to the strain obtained by experiment.
  • the strain is any one of Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, and Bifidobacterium pseudolongum.
  • the strains are Lactobacillus gasseri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus ramnosus, Lactobacillus nacto, Lactobacillus nacto, The survival cell count estimation method according to [2], which is any one type of lactic acid bacteria of faecium).
  • Guarantee bacteria characterized by setting the guaranteed bacteria count N (CFU / g) within the guarantee period t ′ (days) when stored at a temperature T ′ (° C.) or less according to the following formula (II): How to set the number.
  • N nt ′ ⁇ a (II)
  • n t ′ survival cell count n of the strain contained in the composition after storage period t (days) estimated by the survival cell count estimation method according to any one of [1] to [9] t (CFU / g), and n t (CFU / g) when the storage temperature T (° C.) is T ′ (° C.) and the storage period t (day) is t ′ (day).
  • a A constant less than 1.
  • survival cell count estimation method of the present invention it is possible to accurately estimate the survival cell count (CFU / g) of a specific strain with respect to the storage period of a probiotic product. It can be shortened.
  • the method for setting the guaranteed bacterial count of the present invention it is possible to easily derive the guaranteed bacterial count of a specific strain in the probiotic product within the quality guarantee period.
  • FIG. 6 is an Arrhenius plot for the death rate k of longum BAA-999.
  • B. It is a figure which shows the relationship between the water activity value w and the death rate k in each storage temperature (degreeC) of longum BAA-999.
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the strain when a composition containing a specific strain is stored is estimated by the following formula (I).
  • Log 10 n t Log 10 n 0 ⁇ t ⁇ EXP ⁇ (A T ⁇ T + B T ) w + (C T ⁇ T + D T ) ⁇ (I) t: Storage period (days) x 1/30.
  • n t Number of surviving bacteria (CFU / g) of the strain contained in the composition after storage period t (days).
  • n 0 the viable cell count (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage.
  • T Storage temperature (° C.).
  • w Water activity value of the composition.
  • a T A coefficient specific to the strain obtained by experiment.
  • B T A constant specific to the strain obtained by experiment.
  • C T A coefficient peculiar to the strain obtained by experiments.
  • D T A constant specific to the strain obtained by experiment.
  • the strain contained as a probiotic in a composition is object.
  • Probiotics are bacteria that function as good bacteria in the intestinal tract for living organisms such as humans and livestock that have eaten them alive, and have a healthy and beneficial effect on the organism. It means the fungus that can do.
  • Bifidobacteria Bacterium longum (Bifidobacterium longum), Bifidobacterium breve (Bifidobacterium breve), Bifidobacterium pseudolongum (Bifidobacterium pseudolongum) ), And strains belonging to Bifidobacterium such as Bifidobacterium infantis.
  • Bifidobacteria genus Bifidobacterium
  • Specific strains belonging to Bifidobacterium include Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 (product name: Bifidobacterium longum BB536, manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), Bifidobacterium breve BCCM (BCCM: Belgian Co-) Ordinated Collections of Micro-organisms) LMG 23729 (Product name: Bifidobacterium breve M16V, Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), Bifidobacterium pseudolongum IFO 15861 (Product name: Bifidobumumitamugi dairy) And other strains. These are all strains that can be stably supplied as probiotics.
  • Lactobacillus gasseri Lactobacillus acidophilus
  • Lactobacillus ramnosus Lactobacillus ramnosus
  • Lactobacillus ramnosus plan Examples include strains belonging to lactic acid bacteria such as Talam (Lactobacillus plantum) and Enterococcus faecium.
  • Lactic acid bacteria (Lactobacillus genus, Enterococcus genus, etc.) are a kind of facultative anaerobic bacteria found in the intestinal tract and fermented milk of the human body, and are variously used as probiotics.
  • strains belonging to lactic acid bacteria include Lactobacillus gasseri LAC343 (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), Lactobacillus acidophilus LAC361 (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), ) LAC-300 (manufactured by Morinaga Milk Company), Lactobacillus ramnosus LCS742 (manufactured by Morinaga Milk Company), Lactobacillus plantarum LP83 (manufactured by Morinaga Milk Company), Enterococcus f terus ) FA5 (Morinaga Milk Industry) Include the lactic acid bacteria. These are all strains that can be stably supplied as probiotics.
  • compositions that are the target of the survival cell count estimation method of the present invention include foods such as health foods, confectionery (creams, cream sands, cookies, chocolate, chocolate flakes, breakfast cereals, gums, etc.) and infant formula. Examples thereof include pharmaceuticals, livestock feed, and pharmaceuticals. Although it does not specifically limit as a form of a composition, It is intended for the composition of a solid state at the time of storage, For example, the tablet etc. which solidified the powder, the capsule which enclosed the powder, the powder was solidified with the excipient
  • the composition used as the object of the survival bacteria estimation method of this invention needs to be sealed in the container which has water vapor
  • the composition used as the object of the survival bacteria count estimation method of this invention needs to be accommodated in the container which has light-shielding property in the storage state.
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the strain may be reduced by ultraviolet rays.
  • the survival cell count estimation method of the present invention There is a possibility that it is difficult to estimate an accurate survival cell count n t (CFU / g) with respect to the storage period.
  • T in the formula (I) is a value obtained by multiplying the storage period (day) by 1/30, and corresponds to the storage period (month) when one month is regarded as 30 days.
  • the storage period t (day) is preferably assumed to be 1 day to 1,500 days. If the storage period t (day) is within this range, the survival cell count estimation method of the present invention allows the above-mentioned storage period t (day) to be exceeded.
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the strain contained in the composition can be estimated more accurately.
  • n t is the survival cell count n t (CFU / g) of a specific strain contained in the composition after the storage period t (days) estimated by the formula (I).
  • n t is the storage period t (days), the viable count n 0 (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage, the storage temperature T (° C.), and the strain-specific coefficient A T obtained by experiments.
  • C T , the constants B T and D T peculiar to the strain obtained by experiment, and the water activity value w of the composition are calculated by substituting into the formula (I).
  • n 0 is the number of viable bacteria (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage.
  • CFU / g viable bacteria
  • T (° C.) is a storage temperature (° C.), that is, a temperature at which the composition is stored.
  • the formula (I) estimates the survival cell count n t (CFU / g) on the assumption that the storage temperature T (° C.) is constant during the storage period of the composition.
  • the set value of the storage temperature T (° C.) is not particularly limited, but is preferably set to 25 to 60 ° C. If the storage temperature T (° C.) is 25 to 60 ° C., there is a strong correlation between the survival cell count n t (CFU / g) of the specific strain contained in the composition and the storage temperature T (° C.). Since the sex is recognized, the survival cell count n t (CFU / g) of a specific strain contained in the composition can be estimated more accurately.
  • the water activity value is the ratio of the water vapor pressure (P) in the sealed container containing the object to be measured to the water vapor pressure (PO) of pure water (P / PO, where P and PO are the same temperature conditions) This is a value defined by the water vapor pressure of the water), and represents a measure of the amount of water other than the bound water contained in the object, that is, the amount of free water, and is mainly used as an indicator of the ease of propagation of microorganisms.
  • the water activity value is expressed in the range of 0.000 to 1.000, the water activity of pure water is 1.000, and the water activity of dried foods is approximately 0.6 or less.
  • the water activity value w of the composition is set at the stage of producing the composition.
  • the setting of the water activity value w is, for example, a method of mixing a composition having various water activity values w at a predetermined blending ratio so as to obtain a desired water activity value w, a salt content, a sugar content, etc. in the composition. It is set by a method of dissolving and reducing the amount of free water, a method of drying the composition or adding water to the composition, and the like.
  • the formula (I) estimates the survival cell count n t (CFU / g) on the assumption that the water activity value w during the storage start period is constant.
  • the set value of the water activity value w is not particularly limited, but is preferably within 0.6, more preferably 0.10 to 0.40.
  • the water activity value w is within 0.6, a strong correlation is observed between the survival cell count n t (CFU / g) of the specific strain contained in the composition and the water activity value w.
  • the survival cell count n t (CFU / g) of a specific strain contained in the composition can be estimated more accurately.
  • a T , B T , C T , and D T are strain-specific coefficients or constants determined by the following experiments 1) to 5).
  • a sample of a composition containing a specific strain is prepared by uniformly mixing a target specific strain into a powdered composition having at least three types of water activity values w. Each is further packaged and sealed in a plurality (water temperature condition number ⁇ storage period condition number) of water vapor barrier containers, and a plurality of sealed samples are obtained for each water activity value w. Each sealed sample is stored at at least three types of storage temperatures (° C.). Then, the survival cell count n t (CFU / g) in the composition in the storage period (days) of at least 3 time points is measured.
  • the 2) the said from the relationship between the obtained storage period and Namazankin number n t (CFU / g) at 1), rapidly from the storage start sample Namazankin number n t (CFU / It is observed that g) decreases and the decrease in the survival cell count n t (CFU / g) gradually decreases with the passage of storage time. Therefore, the relationship with the survival cell count n t (CFU / g) of a specific strain can be expressed by a linear equation (regression line).
  • the slope of the regression line indicates the common logarithm of the number of bacteria that die per storage period of one month. In the present invention, this regression coefficient is defined as the death rate. This killing rate is different for each setting of the storage temperature and the water activity value w, and shows a higher kill rate as the water activity value w is higher and as the storage temperature is higher.
  • examples of the form of the specific strain used for the sample include fungus powder and liquid, preferably fungus powder. This is because a specific strain is often provided as a bacterial powder, and if it is in the state of a bacterial powder, it can be easily mixed uniformly with the powdered composition, and further, a powdered powder with a water activity value w adjusted. This is because even if a small amount of fungal powder is added to the composition, there is little possibility of changing the water activity value w of the powdered composition.
  • the water activity value w of the powdery composition used for the sample is preferably 0.05 to 0.60. This is the range of the water activity value of a normal probiotic product, and if it is within this range, it is strong between the water activity value w and the survival cell count n t (CFU / g) of the strain. This is because a correlation is observed, so that the survival cell count n t (CFU / g) in the powder composition can be estimated more accurately.
  • a powdery composition used for a sample For example, starch powders, such as corn starch, milk powder, etc. are mentioned.
  • the water activity value w of the sample may be adjusted to, for example, a powdery composition having a predetermined water activity value w by appropriately mixing raw starch and dry starch. As described above, the water activity value w of the sample is at least three, but preferably four or more.
  • Samples having a predetermined water activity value w are measured for the number of stored microorganisms n t (CFU / g) at each temperature type (at least 3 types) stored and at a predetermined storage period (at least 3 time points). Because it is necessary to prepare, at least nine samples with each water activity value need to be individually packaged, depending on the type of each temperature stored and the number of measurements in a given storage period, Package as many samples as necessary. In this experiment, since at least three types of samples having different water activity values w are stored, the total number of samples used in the experiment is at least 27.
  • the container used for individual packaging of the sample needs to have a water vapor barrier property as described above. This is to prevent a change in the water activity value w of the sample during the storage period and to estimate the survival cell count n t (CFU / g) more accurately.
  • a form of the container having a water vapor barrier property a bag having a water vapor barrier property and a sealable bag, a container made of glass, metal, or the like and a bottle having a water vapor barrier property in combination is used.
  • the storage temperature T (° C.) of the sample is at least three as described above, but is preferably four or more.
  • the sample storage temperature T (° C.) is preferably set to 5 to 60 ° C. This temperature range corresponds to the temperature at which the probiotic product is stored, and if it is within this temperature range, the storage temperature (° C.) and the survival cell count n t (CFU / g) of a specific strain This is because a strong correlation can be recognized between them and the more accurate estimation of the survival cell count n t (CFU / g).
  • Storing of the sample is preferably performed by leaving it in a storage device that can maintain a constant storage temperature (° C.) such as an incubator or a thermostat.
  • a storage device that can maintain a constant storage temperature (° C.) such as an incubator or a thermostat.
  • the relative humidity in the storage device is not particularly set and may be a result of the temperature, but the relative humidity may be controlled as necessary.
  • the measurement of the survival cell count n t (CFU / g) in the sample is performed in a storage period (days) of at least three time points. Preferably, it is at least 4 time points.
  • the measurement of the survival cell count n t (CFU / g) in the sample is preferably set 1 to 1,500 days after the start of storage. By measuring the number of surviving bacteria n t (CFU / g) in the sample 1 to 1,500 days after the start of storage, the correlation between the storage temperature (° C.) and the water activity value w with respect to the storage period is increased. Accurately grasp.
  • the measurement of the survival cell count n t (CFU / g) in the sample is carried out by appropriate culture and measurement in view of whether the specific strain is anaerobic or aerobic.
  • the specific strain is a strain belonging to an anaerobic bacterium such as bifidobacteria or lactic acid bacterium
  • the survival cell count n t (CFU / g) in the sample is measured, for example, by the following procedure.
  • the sample taken out from the container is diluted with a predetermined buffer, and after a predetermined amount of the diluted solution containing the strain is transferred to the petri dish, an agar medium dissolved in the petri dish is added, and the diluted solution containing the strain and the agar medium Pour evenly.
  • a petri dish is set in an anaerobic box and statically cultured at a predetermined temperature (36 to 38 ° C.) for a predetermined period (about 2 to 4 days). Thereafter, the petri dish is removed from the anaerobic box, the number of colonies in the medium is measured, and the survival cell count n t (CFU / g) is calculated.
  • the survival of the strain contained in the composition at the start of storage is expressed in the formula (I) for each specific strain derived as described above.
  • the number of bacteria n 0 (CFU / g), storage temperature T (° C.), storage period t (day), and water activity value w survival bacteria after storage period t (day) of a specific strain
  • the number n t (CFU / g) can be estimated.
  • the survival cell count estimation method of the present invention can be used without performing a storage test. Since the number of bacteria n t (CFU / g) can be accurately estimated, the development period of the product can be shortened. Moreover, even if the strain in the product is changed, if the formula (I) of the strain is calculated in advance, the formula for each specific strain ( Since the number of surviving bacteria n t (CFU / g) can be accurately estimated using I), the product development period can be shortened.
  • the survival cell count n t (CFU / g) after the storage period t (days), the storage temperature T (° C.), the storage period t (days), and the water activity value w By determining the number of viable bacteria n 0 (CFU / g) of a specific strain required for the composition at the start of storage.
  • the viable cell count n 0 (CFU / g) of the specific strain contained in the composition at the start of storage the viable cell count n after the storage period t (days)
  • the storage temperature T (° C.) necessary for storing the composition can be derived.
  • the viable cell count n 0 (CFU / g) of the specific strain contained in the composition at the start of storage the viable cell count n after the storage period t (days)
  • the storage period t (days) of the composition can also be derived.
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the strain contained in the composition after the storage period t (days) is estimated by the survival cell count estimation method represented by the formula (I).
  • n t ′ is the survival cell count n t (CFU) of the strain contained in the composition after the storage period t (days) estimated by the survival cell count estimation method represented by the formula (I). / G), and n t (CFU / g) when the storage temperature T (° C.) is T ′ (° C.) and the storage period t (day) is t ′ (day).
  • the temperature T ′ (° C.) is a specified temperature when storing the probiotic product.
  • a is a constant less than 1.
  • a is the estimated survival cell count n t (CFU / g) of a specific strain and the actual survival cell count n t (CFU / g) due to fluctuations in storage temperature T (° C.) during the storage period. ) Is determined as appropriate in consideration of the possibility that a difference will occur, and is generally set to 0.5 to 0.9.
  • T ′ ° C.
  • N the guaranteed bacterial count of the specific strain contained in the product within the quality warranty period N (CFU / g) can be derived.
  • raw starch corn starch, water activity value: 0.6, manufactured by Nippon Food Processing Co., Ltd.
  • dried starch refined sterilized dry corn starch, water activity value: 0) .02, manufactured by Matsutani Chemical Co., Ltd.
  • B. B. longum BAA-999 was added in an amount of about 0.1% by mass to 1 ⁇ 10 8 (CFU / g) and mixed uniformly.
  • a sample of a mixed powder of longum BAA-999 bacterial powder and starch powder was prepared.
  • For each sample prepare 40 aluminum bags with water vapor barrier properties (made of PET / AL / PE three-layer laminated film) and wrap 2-3g of each sample in each aluminum bag for heat sealing. And sealed.
  • 2-19 bags per sample are placed in each of the four thermostatic chambers (manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.) set to 25 ° C., 37 ° C., 45 ° C., and 60 ° C. (relative humidity). Storage has started.
  • Table 1 shows the number of measurement of the survival cell count n t (CFU / g) of each sample with respect to the storage period (days) at a storage temperature of 25 ° C.
  • Table 2 shows the number of times the number of surviving bacteria n t (CFU / g) of each sample was measured for the storage period (days) at a storage temperature of 37 ° C.
  • Table 3 shows the number of surviving bacterial counts n t (CFU / g) of each sample with respect to the storage period (days) at a storage temperature of 45 ° C.
  • Table 4 shows the number of surviving bacterial counts n t (CFU / g) of each sample with respect to the storage period (days) at a storage temperature of 60 ° C.
  • the survival cell count n t (CFU / g) was measured according to the following procedures 1) to 6).
  • FIG. 1 shows a case where the storage temperature is 37 ° C.
  • FIG. 3 shows a case where the storage temperature is 45 ° C.
  • FIG. 4 shows a case where the storage temperature is 60 ° C. 1 to 4, the X axis is the storage period (days) ⁇ 1/30, and the Y axis is the common logarithm of the number of surviving bacteria (Log 10 CFU / g).
  • the survival cell count n t (CFU / g) of a specific strain after the storage period t (days) is expressed by the following formula (1 ).
  • Log 10 n t Log 10 n 0 ⁇ t ⁇ k (1)
  • n t survival cell count n t (CFU / g) of the strain contained in the composition after the storage period t (days).
  • n 0 Number of viable bacteria (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage t: Storage period (days) x 1/30.
  • k Death rate (Log 10 CFU / g / month).
  • the death rate k in Table 5 is made a natural logarithm, and the inverse of the absolute temperature (K) of the storage temperature T (° C.) is obtained, and then the natural logarithm of the death rate k and the absolute temperature (K) are calculated.
  • the relationship with the reciprocal is plotted and the regression line is obtained, it is as shown in FIG. A strong negative correlation (R 2 > 0.98) between the death rate k and the reciprocal of the absolute temperature (K) was observed in the regression line for each water activity value w.
  • the killing rate k has a relationship that depends on the storage temperature T (° C.) (if the storage temperature T (° C.) increases, the killing rate k increases), and according to the Arrhenius law 5 shows that the regression line is an Arrhenius plot.
  • the kill rate k depends on the storage temperature (° C.), and the natural logarithm of the kill rate k and the storage temperature (° C.) may be proportional. I understand.
  • the death rate k of longum BAA-999 is proportional to the water activity value w of the composition, and the relationship between the death rate k and the water activity value is expressed by the following equation (3) which is a regression line of FIG. I understand.
  • Lnk k'w + C (3)
  • k ′ slope of the straight line (regression coefficient) obtained from the regression line shown in FIG. w: Water activity value of the composition.
  • C y-intercept of the regression line shown in FIG.
  • N t N 0 ⁇ t ⁇ EXP (k′w + C) (6)
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the above-mentioned strain when storing the composition containing longum BAA-999 is strong against the storage temperature (° C.) of the composition and the water activity value w of the composition. It was shown that it depends. From this, the survival cell count n t (CFU / g) of the strain when the composition is stored can be estimated from the storage temperature (° C.) of the composition and the water activity value w of the composition. It was speculated that Therefore, when the equation of the regression line of each storage temperature (° C.) was calculated from the regression line of FIG. 6, the equation of Table 6 was obtained.
  • T Storage temperature (° C)
  • the composition contained at the beginning of storage contained in viable count (CFU / g) longum BAA-999 shows the survival cell count n t (CFU / g) after the storage period t (days) when stored at the storage temperature T (° C.) under the storage conditions of the water activity value w. It was found that it is represented by (10). Further, from the above formula (10), the survival cell count n t (CFU / g) is calculated based on the viable cell count n 0 (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage and the storage temperature T (° C. ), Storage period t (days), and water activity value w.
  • Bifidobacterium breve BCCM LMG 23729 (Bifidobacterium breve M16V, manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., hereinafter abbreviated as B. breve LMG 23729) was used as a test bacterium and the storage temperature (° C.). ) And 5% was added, and the water activity value w of the starch powder of each sample was changed as shown in Table 7 below by changing the ratio of raw starch to dried starch. The test was conducted in the same manner as in 1. ⁇ Result> In the same manner as in Test Example 1, the number of surviving bacteria n t (CFU / g) in the sample was measured. The kill rate k for each storage condition in Breve LMG 23729 was calculated as shown in Table 7.
  • n t N 0 ⁇ t ⁇ EXP (k′w + C) (11)
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the strain when storing the composition containing breve LMG 23729 is the storage temperature T (° C.) of the composition and the composition It was shown to be strongly dependent on the water activity value w. From this, the survival cell count n t (CFU / g) of the strain when the composition is stored can be estimated from the storage temperature T (° C.) of the composition and the water activity value w of the composition. It was speculated that it was possible. Therefore, when the equation of the regression line of each storage temperature (° C.) was calculated from the regression line of FIG. 10, the equation of Table 8 was obtained.
  • B. pseudolongum IFO 1586 Bifidobacterium pseudolongum M-602, manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., hereinafter referred to as B. pseudolongum IFO 1586.
  • the test was performed in the same manner as in Test Example 1 except that the water activity value w of the starch powder of each sample was changed as shown in Table 9 below by changing the ratio of raw starch to dry starch. .
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the strain when the composition containing pseudolongum IFO 15861 is stored is the same as in Test Example-1 and the storage temperature T (° C.) of the composition and the composition It was shown to be strongly dependent on the water activity value w. From this, the survival cell count n t (CFU / g) of the strain when the composition is stored can be estimated from the storage temperature T (° C.) of the composition and the water activity value w of the composition. It was speculated that it was possible. Therefore, when the equation of the regression line of each storage temperature (° C.) was calculated from the regression line of FIG. 12, the equation of Table 10 was obtained.
  • Lactobacillus acidophilus LAC-300 test ⁇ Method> A bacterial powder of Lactobacillus acidophilus IFO-15862 (Lactobacillus acidophilus LAC-300, manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., hereinafter abbreviated as L. acidophilus LAC-300) is used as a test bacterium, and the storage temperature (storage temperature). C) was changed to 30 ° C. instead of 25 ° C., and the water activity value w of the starch powder of each sample was changed as shown in Table 11 below by changing the ratio of raw starch to dried starch. The test was performed in the same manner as in Test Example-1, except that the number of bacteria n t (CFU / g) was measured under anaerobic conditions instead of anaerobic conditions.
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the above-mentioned strain when the composition containing acidophilus LAC-300 is stored is the same as in Test Example 1, and the storage temperature T (° C.) of the composition and the composition It was shown that it strongly depends on the water activity value w. From this, the survival cell count n t (CFU / g) of the strain when the composition is stored can be estimated from the storage temperature T (° C.) of the composition and the water activity value w of the composition. It was speculated that it was possible. Therefore, when the equation of the regression line of each storage temperature (° C.) was calculated from the regression line of FIG. 13, the equation of Table 12 was obtained.
  • Test Example 1 to Test Example 3 described above all strains belonged to bifidobacteria, but even in lactic acid bacteria, the viability depends on the storage temperature and the water activity value. Since it is shown in Non-Patent Document 8 described above, the survival cell count estimation method of the present invention can be applied, and the details are shown in Test Example-4. Further, even if the strain belongs to another genus, if the survival rate depends on the storage temperature and the water activity value by the same method as in Test Example-1 to Test Example-4, The survival cell count estimation method of the present invention can be applied.
  • the survival cell count estimation method of the present invention it is possible to accurately estimate the survival cell count of a specific strain with respect to the storage period of a probiotic product, and to shorten the product development period It is.
  • the method for setting the guaranteed bacterial count of the present invention it is possible to derive the guaranteed bacterial count of a specific strain in the probiotic product within the quality guarantee period.
  • FIG. 11 is a block diagram showing a configuration of the survival cell count estimation apparatus 1 according to the embodiment.
  • the survival cell count estimation apparatus 1 can be realized by a computer device such as a personal computer, for example, and includes an input reception unit 11, a constant coefficient calculation unit 12, a storage unit 13, a calculation unit 14, and an output instruction unit 15. Prepare.
  • the input receiving unit 11 receives information input by the user through an input unit such as a keyboard, a mouse, a touch panel, buttons, and keys. Alternatively, the input receiving unit 11 may receive information from another computer device connected via a network or read information from a computer-readable recording medium.
  • an input unit such as a keyboard, a mouse, a touch panel, buttons, and keys.
  • the input receiving unit 11 may receive information from another computer device connected via a network or read information from a computer-readable recording medium.
  • the constant coefficient calculation unit 12 calculates the coefficients and constants A T , B T , C T , and D T used in Equation (I) and writes them in the storage unit 13.
  • the calculation unit 14 is based on the formula (I) using A T , B T , C T , D T stored in the storage unit 13, and the number of surviving bacteria contained in the composition after the storage period, The storage period of the composition containing the strain, the number of viable bacteria contained in the composition at the start of storage, the storage temperature of the composition, or the water activity value of the composition are calculated. Further, the calculation unit 14 calculates the guaranteed number of bacteria based on the formula (II).
  • the output instruction unit 15 has a function of displaying a calculation result by the calculation unit 14 on an output unit, for example, a display such as a CRT (Cathode Ray Tube) or an LCD (Liquid Crystal Display), or printing it with a printer or the like.
  • a display such as a CRT (Cathode Ray Tube) or an LCD (Liquid Crystal Display), or printing it with a printer or the like.
  • the calculation result by the calculation unit 14 may be written in a computer-readable recording medium or output to a computer device connected via a network.
  • the input reception unit 11 of the survival cell count estimation apparatus 1 contains the strain, which is information on the strain type, storage conditions when the above-described experiment is performed on the strain, and the results of the experiment. Information on the storage temperature (° C.) and water activity value w of the composition to be stored, the storage period (day) of the composition, and the viable count n t (CFU / g) contained in the composition after the storage period Receive input.
  • the constant coefficient calculation unit 12 calculates the common logarithm of the survival cell count n t (CFU / g) of a specific strain in each sample for each storage condition, that is, storage temperature (° C.) and water activity value. Then, the first regression line (see FIGS. 1 to 4 and Table 5) with the storage period t (days) ⁇ 1/30 as the X axis is calculated. The constant coefficient calculation unit 12 obtains the absolute value of the slope (regression coefficient) of the first regression line obtained for each storage condition as the kill rate k of each storage condition.
  • the constant coefficient calculation unit 12 writes the A T , B T , C T , and D T calculated as described above and information on the type of microorganism in the storage unit 13 in association with each other.
  • the survival cell count estimation apparatus 1 uses the survival cell count estimation apparatus 1, the number of survival cells of the strain included in the composition after the storage period, the storage period of the composition containing the strain, the strain included in the composition at the start of storage A process for calculating the viable cell count, the storage temperature of the composition, the water activity value of the composition, and the guaranteed cell count will be described.
  • the input reception unit 11 of the survival cell count estimation apparatus 1 includes the survival cell count calculation condition information, that is, the type of bacteria, the storage period (days) of the composition containing the strain, and the composition at the start of storage. Information on the viable count n 0 (CFU / g) of the contained strain, the storage temperature (° C.) of the composition, and the water activity value w of the composition is received.
  • Use calculation unit 14 A T corresponding to the type of information entered fungi, B T, C T, reading the D T from the storage unit 13, the read A T, B T, C T , the D T
  • the storage period (days) of the composition containing the strain indicated by the inputted survival cell count calculation condition information, and the viable count n of the strain contained in the composition at the start of storage 0 (CFU / g), the storage temperature (° C.) of the composition, and the water activity value w of the composition are substituted, and the survival number of microorganisms n t contained in the composition after the storage period t (days) Calculate (CFU / g).
  • the calculation unit 14 using a raw Zankin number n t (CFU / g) of the strain contained in the composition after the calculated storage period t (days), and stored at a temperature T '(° C.) or less
  • the guaranteed number of bacteria N (CFU / g) within the guarantee period t ′ (day) is calculated by the formula (II).
  • the temperature T ′ (° C.) and the guarantee period t ′ (day) are the storage temperature (° C.) of the composition and the storage period (day) of the composition containing the strain indicated by the survival cell count calculation condition information. It is.
  • the output instruction unit 15 provides information on the survival cell count n t (CFU / g) and the guaranteed cell count N (CFU / g) of the microorganisms included in the composition after the storage period, calculated by the calculation unit 14. Output.
  • the input reception unit 11 of the survival cell count estimation apparatus 1 stores the storage period calculation condition information, that is, the type of bacteria and the survival cell count n t (CFU / g) of the strain included in the composition after the storage period. And the storage temperature (° C.) of the composition, the viable cell count n 0 (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage, and the water activity value w of the composition are input.
  • Use calculation unit 14 A T corresponding to the type of information entered fungi, B T, C T, reading the D T from the storage unit 13, the read A T, B T, C T , the D T
  • the output instruction unit 15 outputs information on the storage period (days) of the composition containing the strain calculated by the calculation unit 14.
  • the input reception unit 11 of the survival cell count estimation apparatus 1 receives the survival cell count calculation condition information at the start of storage, that is, the type of bacteria and the survival cell count n t of the strain included in the composition after the storage period.
  • CFU / g the storage period (days) of the composition containing the strain, the storage temperature (° C.) of the composition, and the water activity value w of the composition are input.
  • Use calculation unit 14 A T corresponding to the type of information entered fungi, B T, C T, reading the D T from the storage unit 13, the read A T, B T, C T , the D T
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the strain contained in the composition after the storage period indicated by the input storage start count calculation condition information and the strain are contained.
  • the output instruction unit 15 outputs information on the viable cell count n 0 (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage calculated by the calculation unit 14.
  • the input reception unit 11 of the survival cell count estimation apparatus 1 stores storage temperature calculation condition information, that is, the type of bacteria and the survival cell count n t (CFU / g) of the strain included in the composition after the storage period. And the information on the viable count n 0 (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage, the storage period (day) of the composition containing the strain, and the water activity value w of the composition Receive.
  • Use calculation unit 14 A T corresponding to the type of information entered fungi, B T, C T, reading the D T from the storage unit 13, the read A T, B T, C T , the D T
  • the survival cell count n t (CFU / g) of the strain included in the composition after the storage period which is indicated by the input storage temperature calculation condition information, and included in the composition at the start of storage
  • Substituting the viable count n 0 (CFU / g) of the strain to be stored, the storage period (day) of the composition containing the strain, and the water activity value w of the composition, and the storage temperature (° C.) of the composition calculate.
  • the output instruction unit 15 outputs information on the storage temperature (° C.) of the composition calculated by the calculation unit 14.
  • the input reception unit 11 of the survival cell count estimation apparatus 1 includes water activity value calculation condition information, that is, the type of bacteria and the survival cell count n t (CFU / g) of the strain included in the composition after the storage period. ), The viable count n 0 (CFU / g) of the strain contained in the composition at the start of storage, the storage period (days) of the composition containing the strain, and the storage temperature (° C.) of the composition Receive input of information.
  • Use calculation unit 14 A T corresponding to the type of information entered fungi, B T, C T, reading the D T from the storage unit 13, the read A T, B T, C T , the D T
  • the survival number n t (CFU / g) of the strain contained in the composition after the storage period indicated by the input water activity value calculation condition information, and the composition at the start of storage Substituting the viable count n 0 (CFU / g) of the contained strain, the storage period (days) of the composition containing the strain, and the storage temperature (° C.) of the composition, the water activity value w of the composition Is calculated.
  • the output instruction unit 15 outputs information on the water activity value w of the composition calculated by the calculation unit 14.
  • the unit of each condition information input is different from the unit used in the formula (I)
  • the unit of each condition information input is the unit used in the formula (I). Substitute after converting to.
  • FIG. 12 is a screen example output by the survival cell count estimation apparatus 1.
  • tabs T1 to T5 corresponding to the type of bacteria and the calculation target are selected by the input unit of the survival cell count estimation apparatus 1.
  • the case where bifidobacteria are selected as the type of bacteria and the number of surviving bacteria (predicting the number of surviving bacteria) of the strain contained in the composition after the storage period is selected as the calculation target by tab T1.
  • the figure further shows a field A1 for inputting the storage temperature (° C.) of the composition, the number of viable bacteria of the strain contained in the composition at the start of storage (initial number of added bacteria) n 0 (CFU / g)
  • An input field A2 for inputting the water activity value an input field A3 for inputting the water activity value of the composition, and an input field A4 for inputting the storage period (month) of the composition containing the strain.
  • the calculation unit 14 of the survival cell count estimation apparatus 1 selects the type of the selected bacteria, here the bifidos.
  • the output instruction unit 15 is further calculated by the calculation unit 14 according to (the number of surviving microorganisms contained in the composition after the storage period) / (the number of living bacteria contained in the composition at the start of storage).
  • the calculated predicted survival rate is displayed in the display field A6, and the guaranteed number of bacteria N (CFU / g) calculated by the calculation unit 14 using the formula (II) is displayed in the display field A7.
  • FIG. 14 is another screen example output by the survival cell count estimation apparatus 1.
  • the tab T11 is selected by the input unit of the survival cell count estimation apparatus 1, and L.
  • the user uses the input unit of the survival cell count estimation device 1 to input the storage temperature (° C.) of the composition in the field A11, the viable cell count of the strain contained in the composition at the start of storage (the initial added cell count) ) Input field A12 for entering n 0 (CFU / g), input field A13 for entering the water activity value of the composition, input for entering the storage period (month) of the composition containing the strain A numerical value is input in the field A14.
  • the calculation part 14 of the survival bacteria number estimation apparatus 1 is the kind of selected microbe, L. here.
  • Microorganisms contained in the composition after the storage period by substituting the values input in the input fields A11 to A14 into the formula (I) using A T , B T , C T , D T corresponding to acidophilus LAC-300 The survival cell count n t (CFU / g) is calculated, and the output instruction unit 15 displays the calculation result on the display field A15. L.
  • the formula (I) using A T , B T , C T , and D T corresponding to acidophilus LAC-300 for example, the formula (22) of Test Example 4 can be used.
  • the output instruction unit 15 further displays the predicted survival rate in the display field A16, and displays the guaranteed bacterial count N (CFU / g) in the display field A17.
  • the survival cell count estimation apparatus 1 may include only the input reception unit 11, the storage unit 13, the calculation unit 14, and the output instruction unit 15.
  • the storage unit 13 of the survival cell count estimation apparatus 1 is configured to calculate A T , B T , and C calculated by another survival cell count estimation apparatus 1 including at least the input reception unit 11 and the constant coefficient calculation unit 12. T and D T are held.
  • the above-mentioned survival cell count estimation apparatus 1 has a computer system inside.
  • the operation processes of the input reception unit 11, the coefficient constant calculation unit 12, the calculation unit 14, and the output instruction unit 15 of the survival cell count estimation apparatus 1 are stored in a computer-readable recording medium in the form of a program.
  • the computer system reads out and executes this program, the above processing is performed.
  • the computer system here includes a CPU, various memories, an OS, and hardware such as peripheral devices.
  • the “computer system” includes a homepage providing environment (or display environment) if a WWW system is used.
  • the “computer-readable recording medium” refers to a storage device such as a flexible medium, a magneto-optical disk, a portable medium such as a ROM or a CD-ROM, or a hard disk built in a computer system.
  • the “computer-readable recording medium” dynamically holds a program for a short time like a communication line when transmitting a program via a network such as the Internet or a communication line such as a telephone line.
  • a volatile memory in a computer system serving as a server or a client in that case, and a program that holds a program for a certain period of time are also included.
  • the program may be a program for realizing a part of the functions described above, and may be a program capable of realizing the functions described above in combination with a program already recorded in a computer system.
  • Example 1 B from Morinaga Milk Industry Co., Ltd. to skim milk having a water activity value of 0.25 (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) Bacterial powder of longum BAA-999 is added to milk powder so as to be 1 ⁇ 10 8 (CFU / g) / g, and the number of viable bacteria of the strain contained in the composition at the start of storage is n 0 ( A bifidobacteria-containing milk powder having a CFU / g) of 1 ⁇ 10 8 (CFU / g) was prepared, and the bifidobacteria-containing milk powder was heat-sealed in an aluminum bag. B.
  • the guaranteed number of bacteria N (CFU / g) within a guarantee period of 540 days when the bifidobacteria-containing powdered milk of Example 1 was stored at 25 ° C. or less was calculated using the following formula (24).
  • 3.9 ⁇ 10 7 obtained by the equation (23) was substituted for n t ′, and 0.8 was substituted for a.
  • N n t ′ ⁇ a
  • N ⁇ 3.1 ⁇ 10 7 was obtained by the equation (24). Therefore, the guaranteed bacterial count N (CFU / g) within the guaranteed period of 540 days when the Bifidobacterium-containing powdered milk of Example 1 was stored at 25 ° C. or less was set to 3.1 ⁇ 10 7 (CFU / g). .
  • the survival cell count estimation method of the present invention it is possible to accurately estimate the survival cell count (CFU / g) of a specific strain with respect to the storage period of a probiotic product. It is possible to apply to the purpose of shortening. Further, if the method for setting the guaranteed number of bacteria of the present invention is used, it can be applied to easily derive the guaranteed number of bacteria of a specific strain in the probiotic product within the quality guarantee period.

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Abstract

　プロバイオティクス製品中の生残菌数を正確に推定することで、製品の開発期間を短縮可能な生残菌数推定方法、品質の保証期間内におけるプロバイオティクス製品中の特定の菌株の保証菌数を容易に導くことのできる保証菌数の設定方法。特定の菌株を含有する組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を次式（Ｉ）によって推定することを特徴とする生残菌数推定方法。（Ｉ）Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（ＡＴ×Ｔ＋ＢＴ）ｗ＋（ＣＴ×Ｔ＋ＤＴ）｝。ここで、ｔ：保管期間（日）×１／３０、ｎｔ：保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）、ｎ０：保管開始時の前記組成物に含まれる前記菌株の生菌数（ＣＦＵ／ｇ）、Ｔ：保管温度（℃）、ｗ：組成物の水分活性値、ＡＴ及びＣＴ：実験により求めた前記菌株特有の係数、ＢＴ及びＤＴ：実験により求めた前記菌株特有の定数。

Description

生残菌数推定方法及び保証菌数の設定方法
　本発明は、プロバイオティクスなどの菌株を含有する組成物の生残菌数推定方法及び保証菌数の設定方法に関する。
　本願は、２００８年５月２９日に、日本に出願された特願２００８－１４０８１９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ビフィズス菌や乳酸菌は、プロバイオティクスとして様々な食品に使用されている。例えば、ビフィズス菌や乳酸菌は、粉末、カプセル、タブレットなどの形態とされ、健康食品、菓子、育児用粉乳など、幅広い用途の食品に利用されている。また、ビフィズス菌や乳酸菌は、医療分野や家畜用飼料分野においても、プロバイオティクスとして使用されるようになってきた。
　プロバイオティクスは、人や動物に投与した菌が腸内で増殖することで、人や動物の健康に有益な作用を発揮する。そのため、プロバイオティクスは生きていることが重要となる。ビフィズス菌や乳酸菌を製品中に添加し、かつ保証期間（賞味期間）内の生残菌数を維持するのは非常に困難であるものの、過去にいくつかの手法が開発され、現在では多くのプロバイオティクスを含む食品、医薬品、飼料（以下、プロバイオティクス製品という。）が製品化されている。
　プロバイオティクス製品を開発する際には、製品中の生残菌数の変化の予測、製品の賞味期間の設定、製品の有効性の確認など、非常に多くの検討事項がある。また、プロバイオティクス製品には、消費者に対する製品への信頼性を確保する観点から、保証期間内における製品中の保証菌数を明確にする必要がある。
　そのため、プロバイオティクス製品を開発する際には、保管期間内における製品中のプロバイオティクスの生残菌数を、実際に保管試験を行って測定し、プロバイオティクスの生残性を評価する必要があった。しかし、プロバイオティクス製品は、その保証期間が１年から３年と非常に長く設定されることが多く、保証期間終了時点でのプロバイオティクスの生残菌数を測定し、保証菌数を設定するには、保証期間に匹敵する長期間の保管試験が必要であり、製品化に時間が掛かっていた。
　そこで、プロバイオティクス製品の保管試験を短縮するため、高い保管温度による加速試験を行い、加速試験の結果から生残菌数を推定する手法が研究されている（非特許文献１～４参照）。
　ところが、加速試験の期間を短縮するには、保管温度を高く設定することになるため、高温によって菌の死滅速度が高まり、そこから常温の保管温度における生残性を正確に推定することは非常に困難であった。また、加速試験の設定温度が常温よりやや高い程度の場合、保管試験の期間を十分に短縮することができなかった。
　ところで、ビフィズス菌は、製品の水分含量や水分活性値によって、その生残性が変化することが知られている（非特許文献５参照）。更にビフィズス菌は、製品の水分活性値のみならず、製品の保管温度によっても、その生残性が変化することが知られている（非特許文献６参照）。また、ビフィズス菌は、菌株毎に生残性が異なることが知られている（非特許文献７参照）。また、乳酸菌においても、その生残性が保管温度と水分活性値によって変化するという報告がある（非特許文献８参照）。
ダマジャノビック、ルドロビック（Ｄａｍａｊａｎｏｖｉｃ,　Ｖ. ａｎｄ　Ｒｄｕｌｏｖｉｃ，　Ｄ．）、"クライオバイオロジー（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ）"（英国）、１９６８年、第５巻、ｐ．１０１－１０４ アシュールら（Ａｃｈｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ．）、"ジャーナル・オブ・ケミカル・テクノロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊｏｕｎａｒｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．）"、（英国）、２００１年、第７６巻、ｐ．６２４－６２８ ジアディら（Ｚｉａｄｉ　ｅｔ　ａｌ.）、"バイオケミカル・エンジニアリング・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｊｏｕｒｎａｌ）"、（オランダ）、２００５年、第２４巻、ｐ．１４１－１４５ ポートナーら（Ｐｏｒｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、"クライオバイオロジー（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ）"、（英国）、２００７年、第５４巻、ｐ．２６５－２７０ ナガワら（Ｎａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ.）"ジャーナル・オブ・ダイアリー・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）"、（米国）、１９８８年、第７１巻、ｐ．１７７７－１７８２ 立松ら、"凍結及び乾燥研究会会誌"、１９８２年、第２８巻、ｐ．４０－４５ シンプソンら（Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、"ジャーナル・オブ・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）"、（英国）、２００５年、第９９巻、ｐ．４９３－５０１ ハイルら（Ｈｉｇｌ　ｅｔ　ａｌ．）、"バイオテクノロジー・プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ）"、（米国）、２００７年、第２３巻、ｐ．７９４－８００
　しかしながら、これら非特許文献５～８では、保管温度と水分活性値との相関関係を解析し、その相関関係から製品中の生残菌数を推定するという発想には至っていなかった。
　本発明は、前記事情に鑑みてなされたものであって、プロバイオティクス製品の保管期間に対する特定の菌株の生残菌数を正確に推定することで、製品の開発期間を短縮可能な生残菌数推定方法、及び品質の保証期間内におけるプロバイオティクス製品中の特定の菌株の保証菌数を容易に導くことのできる保証菌数の設定方法を提供する。
　本発明者らは、ビフィズス菌、乳酸菌などに属する特定の菌株を含む組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数が、組成物の保管温度と組成物の水分活性値とに依存し、その生残菌数の常用対数値と保管期間との間に相関関係があることを見出した。そして、相関関係から導かれた回帰係数を菌の死滅速度と定義した。そして、死滅速度が水分活性値によって異なること、死滅速度の自然対数値が水分活性値に対して正の相関を示すことを見出した。また、死滅速度がアレニウスの法則に従い、保管温度に対して相関関係を有し、かつ死滅速度と水分活性値との関係から導かれた回帰直線の死滅速度係数や定数が、保管温度と強い相関性があることを見出した。そして、死滅速度と保管温度と水分活性値との相関関係から、菌の死滅速度と特定の菌株の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）に関する関係式を完成させ、この関係式に、保管開始時の生菌数、保管温度（℃）、水分活性値、及び保管期間（日）を代入することで、生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）を正確に推定可能にした。更に、この関係式から導かれる生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）から、指定の温度（℃）以下で保管した場合の保証期間（日）内のプロバイオティクス製品の保証菌数（ＣＦＵ／ｇ）を算出可能にした。
　すなわち、前記の課題を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］特定の菌株を含有する組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を次式（Ｉ）によって推定することを特徴とする生残菌数推定方法。
　Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（ＡＴ×Ｔ＋ＢＴ）ｗ＋（ＣＴ×Ｔ＋ＤＴ）｝・・・（Ｉ）
　　ｔ：保管期間（日）×１／３０。
　　ｎｔ：保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）。
　　ｎ０：保管開始時の前記組成物に含まれる前記菌株の生菌数（ＣＦＵ／ｇ）。
　　Ｔ：保管温度（℃）。
　　ｗ：組成物の水分活性値。
　　ＡＴ：実験により求めた前記菌株特有の係数。
　　ＢＴ：実験により求めた前記菌株特有の定数。
　　ＣＴ：実験により求めた前記菌株特有の係数。
　　ＤＴ：実験により求めた前記菌株特有の定数。
［２］前記菌株が、ビフィズス菌または乳酸菌に属する［１］に記載の生残菌数推定方法。
［３］前記菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）、及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）のいずれか一種のビフィズス菌である［２］に記載の生残菌数推定方法。
［４］前記菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９９９である［２］に記載の生残菌数推定方法。
［５］前記菌株が、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）ＢＣＣＭ　ＬＭＧ　２３７２９である［２］に記載の生残菌数推定方法。
［６］前記菌株が、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）ＩＦＯ　１５８６１である［２］に記載の生残菌数推定方法。
［７］前記菌株が、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔｒｕｍ）、及びエンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）のいずれか一種の乳酸菌である［２］に記載の生残菌数推定方法。
［８］前記菌株が、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）　ＩＦＯ－１５８６２　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００）である［２］に記載の生残菌数推定方法。
［９］前記水分活性値ｗが、０．６以下である［１］～［８］のいずれか一項に記載の生残菌数推定方法。
［１０］前記保管温度Ｔ（℃）が、２５℃～６０℃である［１］～［９］のいずれか一項に記載の生残菌数推定方法。
［１１］温度Ｔ’（℃）以下で保管した場合の保証期間ｔ’（日）内の保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を、次式（ＩＩ）により設定することを特徴とする保証菌数の設定方法。
　Ｎ＝ｎｔ’×ａ・・・（ＩＩ）
　　ｎｔ’：［１］～［９］のいずれか一項に記載の生残菌数推定方法によって推定した保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）であって、保管温度Ｔ（℃）をＴ’（℃）とし、保管期間ｔ（日）をｔ’（日）としたときのｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）。
　　ａ：１未満の定数。
　本発明の生残菌数推定方法を用いれば、プロバイオティクス製品の保管期間に対する特定の菌株の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）を正確に推定することが可能であり、製品の開発期間を短縮可能である。
　本発明の保証菌数の設定方法を用いれば、品質の保証期間内におけるプロバイオティクス製品中の特定の菌株の保証菌数を容易に導くことが可能である。
Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の保管温度２５℃における生残菌数を示す図である。 Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の保管温度３７℃における生残菌数を示す図である。 Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の保管温度４５℃における生残菌数を示す図である。 Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の保管温度６０℃における生残菌数を示す図である。 Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の死滅速度ｋに関するアレニウスプロットを示す図である。 Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の各保管温度（℃）における水分活性値ｗと死滅速度ｋの関係を示す図である。 Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の死滅速度係数ｋ’と保管温度（℃）との関係を示す図である。 Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の死滅速度ｋに関する定数Ｃと保管温度（℃）との関係を示す図である。 Ｂ．ｂｒｅｖｅ　ＬＭＧ　２３７２９の各保管温度（℃）における水分活性値ｗと死滅速度ｋの関係を示す図である。 Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　ＩＦＯ　１５８６１の各保管温度（℃）における水分活性値ｗと死滅速度ｋの関係を示す図である。 生残菌数推定装置の構成を示すブロック図である。 生残菌数推定装置の出力する表示画面の例を示す図である。 Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００の死滅速度ｋ（自然対数値）と水分活性ｗの関係を示す図である。 生残菌数推定装置の出力する表示画面の他の例を示す図である。
　本発明の生残菌数推定方法は、特定の菌株を含有する組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を次式（Ｉ）によって推定する。
　Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（ＡＴ×Ｔ＋ＢＴ）ｗ＋（ＣＴ×Ｔ＋ＤＴ）｝・・・（Ｉ）
　　ｔ：保管期間（日）×１／３０。
　　ｎｔ：保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）。
　　ｎ０：保管開始時の前記組成物に含まれる前記菌株の生菌数（ＣＦＵ／ｇ）。
　　Ｔ：保管温度（℃）。
　　ｗ：組成物の水分活性値。
　　ＡＴ：実験により求めた前記菌株特有の係数。
　　ＢＴ：実験により求めた前記菌株特有の定数。
　　ＣＴ：実験により求めた前記菌株特有の係数。
　　ＤＴ：実験により求めた前記菌株特有の定数。
　特定の菌株としては特に限定されるものではないが、好ましくは組成物中にプロバイオティクスとして含まれる菌株が対象となる。なお、プロバイオティクスとは、それを生きたまま食した人及び家畜などの生体に対して、腸管内で善玉菌として機能する菌のことであり、生体に健康上、有益な働きかけをすることのできる菌のことを意味する。
　本発明の生残菌数推定方法の対象となる菌株としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｆａｎｔｉｓ）などのビフィズス菌に属する菌株が挙げられる。なお、ビフィズス菌（ビフィドバクテリウム属）は、人の乳児の腸管内などに特に多く見受けられる絶対嫌気性細菌の一種であり、プロバイオティクスとして種々利用されている。
　ビフィズス菌に属する菌株として、具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム　ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９９９（製品名：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ＢＢ５３６、森永乳業社製。）、ビフィドバクテリウム・ブレベ　ＢＣＣＭ（ＢＣＣＭ：Ｂｅｌｇｉａｎ　Ｃｏ－Ｏｒｄｉｎａｔｅｄ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）　ＬＭＧ　２３７２９（製品名：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ　Ｍ１６Ｖ、森永乳業社製。）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム　ＩＦＯ　１５８６１（製品名：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　Ｍ－６０２、森永乳業社製。）などの菌株が挙げられる。これらはいずれもプロバイオティクスとして安定供給可能な菌株である。
　また、本発明の生残菌数推定方法の対象となる菌株としては、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔｒｕｍ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）などの乳酸菌に属する菌株が挙げられる。なお、乳酸菌（ラクトバチルス属、エンテロコッカス属など）は、人体の腸管内、発酵乳中などに見受けられる通性嫌気性細菌の一種であり、プロバイオティクスとして種々利用されている。
　乳酸菌に属する菌株として、具体的には、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）ＬＡＣ３４３（森永乳業社製）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＡＣ３６１（森永乳業社製）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＡＣ－３００（森永乳業社製）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒａｍｎｏｓｕｓ）ＬＣＳ７４２（森永乳業社製）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔｒｕｍ）ＬＰ８３（森永乳業社製）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）ＦＡ５（森永乳業社製）などの乳酸菌が挙げられる。これらはいずれもプロバイオティクスとして安定供給可能な菌株である。
　本発明の生残菌数推定方法の対象となる組成物としては、健康食品、菓子（クリーム、クリームサンド、クッキー、チョコレート、チョコフレーク、朝食シリアル、ガム等）及び育児用粉乳などの食品をはじめとして、医薬品、家畜用の飼料、医薬品などが挙げられる。組成物の形態としては特に限定されないが、保管時に固体状態の組成物を対象としており、例えば粉末、粉末を封入したカプセル、粉末を賦形剤などで固めたタブレットなどが挙げられる。
　また、本発明の生残菌数推定方法の対象となる組成物は、水蒸気バリア性を有する容器に密封されることが必要である。前記組成物が水蒸気バリア性を有する容器に密封されない場合、保管期間の経過とともに、水分活性値ｗが保管開始の時点から変化する可能性があり、本発明の生残菌数推定方法によって、保管期間に対する正確な生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定することが難しくなる恐れがある。
　また、本発明の生残菌数推定方法の対象となる組成物は、保管状態において、遮光性を有した容器に収納されていることが必要である。前記組成物が、遮光性の充分でない容器に保管された場合、紫外線によって菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）が減少する恐れがあり、本発明の生残菌数推定方法によって、保管期間に対する正確な生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定することが難しくなる恐れがある。
　前記式（Ｉ）におけるｔは、保管期間（日）に１／３０を乗じた値であり、１ヶ月を３０日とみなした場合の保管期間（月）に相当する。
　保管期間ｔ（日）としては、好ましくは１日～１，５００日を想定しており、この範囲内であれば本発明の生残菌数推定方法によって、保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）をより正確に推定することができる。
　ｎｔは、前記式（Ｉ）によって推定される保管期間ｔ（日）後の組成物に含まれる特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）である。ｎｔは、保管期間ｔ（日）、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、保管温度Ｔ（℃）、実験により求めた菌株特有の係数ＡＴ及びＣＴ、実験により求めた菌株特有の定数ＢＴ及びＤＴ、組成物の水分活性値ｗを前記式（Ｉ）に代入することによって算出される。
　ｎ０は、保管開始時の組成物に含まれる前記菌株の生菌数（ＣＦＵ／ｇ）であり、製造時を保管開始時とする場合は、特定の菌株を含む組成物の製造時に、前記組成物に添加される特定の菌株の生菌数（ＣＦＵ／ｇ）に等しいものとする。
　Ｔ（℃）は、保管温度（℃）、すなわち組成物を保管する際の温度である。なお、前記式（Ｉ）は、組成物の保管期間中、保管温度Ｔ（℃）が一定であるとして生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定する。
　また、保管温度Ｔ（℃）の設定値は特に限定されないが、２５～６０℃に設定されることが好ましい。保管温度Ｔ（℃）が２５～６０℃であれば、組成物に含まれる特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、保管温度Ｔ（℃）との間には強い相関性が認められるため、組成物に含まれる特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）をより正確に推定することができる。
　ｗは、組成物の水分活性値である。水分活性値とは、測定の対象物を入れた密閉容器内の水蒸気圧（Ｐ）と、純水の水蒸気圧（ＰＯ）との比（Ｐ／ＰＯ、ただし、Ｐ、ＰＯとも同じ温度条件での水蒸気圧。）で定義される値であり、対象物に含まれる結合水以外の水分、すなわち自由水の量の尺度を表し、主に微生物の繁殖のしやすさの指標として用いられる。水分活性値は、０．０００～１．０００の範囲で表され、純水の水分活性は１．０００であり、乾燥食品などの水分活性はおおよそ０．６以下を示す。
　組成物の水分活性値ｗは、組成物を製造する段階で設定される。水分活性値ｗの設定は、例えば、種々の水分活性値ｗを有する組成物を、所望の水分活性値ｗとなるように、所定の配合割合で混合する方法、組成物に塩分、糖分などを溶解させ、自由水の量を下げる方法、組成物を乾燥または組成物に水を添加する方法、などによって設定される。なお、前記式（Ｉ）は、保管開始期間中の水分活性値ｗは一定であるとして生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定する。
　水分活性値ｗの設定値は特に限定されないが、好ましくは０．６以内、より好ましくは０．１０～０．４０に設定される。水分活性値ｗが０．６以内であれば、組成物に含まれる特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と水分活性値ｗとの間に、強い相関性が認められるため、組成物に含まれる特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）をより正確に推定することができる。
　ＡＴ、ＢＴ、ＣＴ、ＤＴは、下記１）～５）の実験により求めた菌株特有の係数または定数である。
　１）対象とする特定の菌株を、少なくとも３種類の水分活性値ｗとなる粉末状組成物中にそれぞれ均一に混合することで、特定の菌株を含む組成物のサンプルを作製し、各サンプルを各々、更に複数（保管温度条件数×保管期間条件数）の水蒸気バリア性の容器に個包装して密封し、各水分活性値ｗ毎に、複数の密封サンプルを得る。そして、各密封サンプルを、少なくとも３種類の保管温度（℃）で保管する。そして、少なくとも３時点の保管期間（日）における、組成物中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を測定する。
　２）保管条件（保管温度（℃）、水分活性値）の異なる各サンプル中の特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の常用対数値をＹ軸、保管期間ｔ（日）×１／３０をＸ軸にして、保管期間中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）をプロットする。更に、これらのプロットから各保管条件の回帰直線を算出し、各保管条件における回帰直線の傾き（回帰係数）を死滅速度と定義する。
　３）次に、各保管温度（℃）における死滅速度の自然対数値をＹ軸、水分活性値ｗをＸ軸にして、両者の関係をプロットし、このプロットから各保管温度（℃）における回帰直線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）をそれぞれ算出する。
　４）３）で得られた各保管温度（℃）の直線式の傾き（ａ）をＹ軸にするとともに、保管温度Ｔ（℃）をＸ軸にして、両者の関係をプロットし、このプロットから直線式を求め、得られた回帰直線の傾きＡＴ、Ｙ切片ＢＴを算出する。
　５）また、３）で得られた回帰直線の定数（ｂ）をＹ軸にするとともに、保管温度Ｔ（℃）をＸ軸にして、両者の関係をプロットし、直線式を求め、得られた直線式の傾きＣＴ、Ｙ切片ＤＴを算出する。
　ここで、前記２）では、前記１）で得られた保管期間と生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）との関係から、サンプルの保管開始から急激に生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）が低下し、保管時間の経過とともに、生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の低下が徐々に緩やかになることが認められる。そのため、特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）との関係を直線式（回帰直線）で表すことができる。なお、回帰直線の傾き（回帰係数）は、保管期間１ヶ月あたりに死滅する菌数の常用対数値を示しており、本発明においてこの回帰係数を死滅速度と定義する。この死滅速度は、保管温度及び水分活性値ｗの設定毎に異なり、水分活性値ｗが高い程、及び保管温度が高いほど死滅速度が高い値を示す。
　前記３）で回帰直線式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を保管温度毎に算出した後、前記４）にて、これら複数の回帰直線式の傾き（ａ）（後述の試験例－１に詳述する組成物中に含まれる特定の菌株の死滅速度係数ｋ’に相当。）と、それぞれの式の保管温度との関係をプロットし、直線式（ｋ’＝ＡＴ×Ｔ＋ＢＴ）を求め、直線式の係数である傾きＡＴ、及び直線式の定数であるＹ切片ＢＴを算出する。
　また、前記５）にて、複数の回帰直線式の定数（ｂ）（後述の試験例－１に詳述する組成物中に含まれる特定の菌株の死滅速度に関する定数Ｃに相当。）と、それぞれの式の保管温度との関係をプロットし、直線式（Ｃ＝ＣＴ×Ｔ＋ＤＴ）を求め、直線式の係数である傾きＣＴ、及び直線式の定数であるＹ切片ＤＴを算出する。
　以上のようにして、前記１）～４）の実験により求めた特定の菌株毎のＡＴ、ＢＴ、ＣＴ、ＤＴを、前記式（Ｉ）に代入することで、特定の菌株毎の前記式（Ｉ）が導かれる。
　なお、前記１）において、サンプルに使う特定の菌株の形態としては、菌末、液体が挙げられるが、好ましくは菌末である。これは特定の菌株が菌末として提供される場合が多いこと、菌末の状態であれば、粉末状組成物と均一に混合させやすいこと、更には、水分活性値ｗの調整済みの粉末状組成物に少量の菌末を添加しても、粉末状組成物の水分活性値ｗを変化させる可能性が少ないためである。
　サンプルに使う粉末状組成物の水分活性値ｗは０．０５～０．６０であることが好ましい。これは、通常のプロバイオティクス製品の水分活性値の範囲であり、また、この範囲内であれば、水分活性値ｗと菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）との間に強い相関関係が認められるため、前記粉末状組成物中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）をより正確に推定できるためである。
　サンプルに使う粉末状組成物としては、特に限定されないが、例えばコーンスターチなどの澱粉粉末、粉乳などが挙げられる。
　サンプルの水分活性値ｗは、例えば、生澱粉と乾燥澱粉とを適宜混合して、所定の水分活性値ｗの粉末状組成物に調整すればよい。
　サンプルの水分活性値ｗは、前述の通り、少なくとも３種類とするが、好ましくは４種類以上である。
　所定の水分活性値ｗを有するサンプルは、保管される各温度の種類（少なくとも３種類）、及び所定の保管期間（少なくとも３時点）における生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定分だけ用意しておく必要があるため、各水分活性値を有したサンプルは、少なくとも９個は個包装する必要があり、保管される各温度の種類及び所定の保管期間の測定の数に応じて、適宜必要な数のサンプルを個包装する。なお、この実験では、少なくとも３種類の水分活性値ｗの異なるサンプルを保管することから、実験に用いる総サンプル数は、少なくとも２７個である。
　サンプルの個包装に用いる容器は、前述の通り水蒸気バリア性を有する必要がある。これは、保管期間中におけるサンプルの水分活性値ｗの変化を防止し、より正確な生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の推定を行うためである。水蒸気バリア性を有する容器の形態としては、水蒸気バリア性を有し密封可能な袋、ガラス製、金属製などのビンに、水蒸気バリア性を有する栓を組み合わせた容器などが用いられる。
　サンプルの保管温度Ｔ（℃）は、前述の通り少なくとも３種類とされるが、好ましくは４種類以上である。
　サンプルの保管温度Ｔ（℃）は、好ましくは５～６０℃に設定される。この温度範囲は、プロバイオティクス製品が保管される温度に即した温度であるとともに、この温度範囲であれば、保管温度（℃）と特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）との間に強い相関関係が認められるので、より正確な生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の推定が行えるためである。
　サンプルの保管は、例えばインキュベーター、恒温槽などの保管温度（℃）を一定に維持できる保管装置内に静置することで行われるのが好ましい。保管装置内の相対湿度に関しては特に設定されず、温度に対して成り行きとしても構わないが、必要に応じて相対湿度の制御を行ってもよい。
　サンプル中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定は、少なくとも３時点の保管期間（日）にて行われる。好ましくは４時点以上である。
　サンプル中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定は、保管開始から１～１，５００日後に設定するのが好ましい。サンプル中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定を保管開始から１～１，５００日後にて行うことで、保管期間に対する保管温度（℃）及び水分活性値ｗの相関関係をより正確に把握できる。
　サンプル中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定は、特定の菌株が嫌気性であるか、好気性であるかを鑑みて、適正な培養及び測定を行う。例えば、特定の菌株が、ビフィズス菌や乳酸菌といった嫌気性細菌に属する菌株の場合は、例えば次に示す手順でサンプル中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定を行う。まず、容器から取り出したサンプルを所定の緩衝液で希釈し、菌株を含む希釈液をシャーレに所定量移した後、このシャーレに溶解した寒天培地を加えて、菌株を含む希釈液と寒天培地とを均一に混釈する。そして、寒天培地が固化してから、嫌気ボックスにシャーレをセットし、所定温度（３６～３８℃）にて所定期間（約２～４日。）静置培養する。その後、シャーレを嫌気ボックスから取り出し、培地中のコロニー数を測定し、生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を算出する。
　以上説明した本発明の生残菌数推定方法によれば、前述のようにして導かれた特定の菌株毎の前記式（Ｉ）に、保管開始時の前記組成物に含まれる前記菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、保管温度Ｔ（℃）、保管期間ｔ（日）、及び水分活性値ｗを代入することで、特定の菌株の保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定できる。
　このように、あらかじめ特定の菌株毎の前記式（Ｉ）を導いておけば、特定の菌株を含むプロバイオティクス製品の開発において、保管試験を行わずとも、特定の菌株の保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を、特定の菌株毎の前記式（Ｉ）によって正確に推定できるため、プロバイオティクス製品の開発期間を短縮することが可能となる。
　また、プロバイオティクス製品の配合組成の変更に際し、この製品の配合組成を変更した後の水分活性値が分れば、保管試験を行わずとも、本発明の生残菌数推定方法によって生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を正確に推定できるので、製品の開発期間を短縮できる。
　また、製品中の菌株を変更しても、その菌株の前記式（Ｉ）をあらかじめ算出しておけば、菌株の変更の度に保管試験を行わずとも、その特定の菌株毎の前記式（Ｉ）を用いて生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を正確に推定できるので、製品の開発期間を短縮できる。
　更に、前記式（Ｉ）を用いれば、保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）、保管温度Ｔ（℃）、保管期間ｔ（日）、及び水分活性値ｗを決定することで、保管開始時の前記組成物に必要な特定の菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）を導くこともできる。
　同様に、前記式（Ｉ）を用いれば、保管開始時の前記組成物に含まれる特定の菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）、保管期間ｔ（日）、及び水分活性値ｗを決定することで、組成物の保管に必要な保管温度Ｔ（℃）を導くこともできる。
　同様に、前記式（Ｉ）を用いれば、保管開始時の前記組成物に含まれる特定の菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）、保管温度Ｔ（℃）、及び水分活性値ｗを決定することで、組成物の保管期間ｔ（日）を導くこともできる。
　また、前記式（Ｉ）で示される生残菌数推定方法によって、保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定することで、プロバイオティクス製品中に含まれる保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を、以下のようにして設定することができる。
　すなわち、本発明の保証菌数の設定方法は、温度Ｔ’（℃）以下で保管した場合の保証期間ｔ’（日）内の保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を、次式（ＩＩ）により設定する。
　Ｎ＝ｎｔ’×ａ・・・（ＩＩ）
　ここで、ｎｔ’は、前記式（Ｉ）で示される生残菌数推定方法によって推定した保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）であって、保管温度Ｔ（℃）をＴ’（℃）とし、保管期間ｔ（日）をｔ’（日）としたときのｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）である。
　また、温度Ｔ’（℃）とは、プロバイオティクス製品を保管する際の指定温度である。
　ａは、１未満の定数である。ａは、保管期間中の保管温度Ｔ（℃）の変動などによって、推定される特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、実際の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）との間に差が生じる可能性を鑑みて適宜決定され、概ね０．５～０．９に設定される。
　このように、本発明の保証菌数の設定方法によって、温度Ｔ’（℃）以下でプロバイオティクス製品を保管した際の、品質の保証期間内における製品に含まれる特定の菌株の保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を導くことが可能である。
　以下、本発明の生残菌数推定方法で用いる前記式（Ｉ）を導く方法、及び保証菌数の設定方法について、試験例を用いて、更に詳細に説明する。
〔試験例－１　ビフィドバクテリウム・ロンガム　ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９９９を用いた試験〕
＜方法＞
　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９９９。（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ＢＢ５３６、森永乳業社製。以下、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９と略する。）の菌末を被験菌として試験に使用した。また、水分活性値ｗの異なる粉末を作製するために、生澱粉（コーンスターチ、水分活性値：０．６、日本食品加工社製。）と、乾燥澱粉（精製殺菌乾燥コーンスターチ、水分活性値：０．０２、松谷化学社製。）とを様々な割合で混合することにより、７種類の水分活性値（ｗ＝０．０４、０．１０、０．１６、０．２１、０．３２、０．４０、及び０．５７。）を有する澱粉粉末をそれぞれ作製した。
　次いで、これら７種類の澱粉粉末それぞれに、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の菌末を、１×１０８（ＣＦＵ／ｇ）となるように約０．１質量％添加し、均一に混合し、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の菌末と澱粉粉末との混合粉末のサンプルを作製した。
　そして、１サンプル当たり、水蒸気バリア性を有するアルミ袋（ＰＥＴ／ＡＬ／ＰＥの３層積層のフィルム製）を４０袋用意し、各アルミ袋に前記サンプルを２～３ｇ個包装し、ヒートシールにて密封した。そして、２５℃、３７℃、４５℃、及び６０℃の各温度（相対湿度成り行き。）に設定した４台の恒温槽（三洋電機社製）それぞれに、１サンプル当たり２～１９袋ずつ入れ、保管を開始した。その後、アルミ袋に個包装した各サンプルについて、継時的に恒温槽から取り出し、各々生残菌数を測定した。ここで、保管温度２５℃における保管期間（日）に対する各サンプルの生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定回数を表１に示す。また、保管温度３７℃における保管期間（日）に対する各サンプルの生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定回数を表２に示す。また、保管温度４５℃における保管期間（日）に対する各サンプルの生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定回数を表３に示す。また、保管温度６０℃における保管期間（日）に対する各サンプルの生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定回数を表４に示す。また、生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定は、以下の１）～６）に示す手順で行った。
　１）クリーンベンチ内でサンプルのアルミ袋を開封し、アルミ袋から取り出したサンプル１ｇを、滅菌した９９ｍｌの懸濁用バッファー（ＫＨ２ＰＯ４；４．５ｇ、Ｎａ２ＰＯ４；６．０ｇ、Ｌ－システイン；０．５ｇ、Ｔｗｅｅｎ－８０；０．５ｇ、蒸留水；１，０００ｍｌ）中に添加した。この際、懸濁用バッファーは、あらかじめ３０～４０℃に暖めたものとした。
　２）懸濁用バッファー内でサンプルを完全に溶出させ、懸濁液を作製した。
　３）この懸濁液を、滅菌した９．９ｍｌの生理食塩水で定法に従って希釈し、希釈液を作製した。
　４）この希釈液を、ピペットを用いて０．１～１．０ｍｌずつシャーレに分注した。更に、希釈液を分注したシャーレに、４５～５０℃の溶解されたＢＬ寒天培地（日研化学社製またはニッスイ社製。血液は添加しない。）約２０ｍｌを添加して、希釈液をＢＬ寒天培地で混釈した。
　５）ＢＬ寒天培地が固化した後、クリーンベンチからシャーレを取り出し、できるだけ迅速にミックスガス（Ｎ２；８０％、ＣＯ２；１０％、Ｈ２；１０％）を使用した嫌気ボックスにセットし、嫌気条件下、３７℃で３日間、サンプルに生残する菌を静置培養した。
　６）３日間の培養後、嫌気ボックスからシャーレを取り出し、ＢＬ寒天培地に形成されたコロニー数を測定し、定法に従って粉末１ｇ当たりの生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜結果＞
　以上のようにして測定された、各保管温度（℃）における水分活性値ｗの異なる各サンプルの経時的な生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定結果について、保管温度２５℃の場合を図１に、保管温度３７℃の場合を図２に、保管温度４５℃の場合を図３に、保管温度６０℃の場合を図４に示す。なお、図１～４において、Ｘ軸を保管期間（日）×１／３０、Ｙ軸を生残菌数の常用対数値（Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ）とした。
　次に、図１～４から、各サンプルの回帰直線を作成した。そして、相関性の高い回帰直線（Ｒ２＞０．６）が得られたサンプルについて、その回帰直線の傾きの絶対値を、菌株の死滅速度ｋと定義した。各保管温度Ｔ（℃）と水分活性値ｗにおける死滅速度ｋを下記表５に示す。ここで、下記表５中における死滅速度ｋの単位は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ／月であり、１ヶ月当りに死滅する菌数の常用対数値として表す。また、測定回数が少ないもの、および回帰直線の相関性が低く（Ｒ２＜０．６）、死滅速度ｋとしての信頼性に乏しいものについては、Ｎ．Ｄとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ここで、表５に示された死滅速度をｋとし、保管期間をｔとすると、保管期間ｔ（日）後の特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）は次式（１）で表される。
　Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ｋ・・・・・（１）
　　ｎｔ：保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）。
　　ｎ０：保管開始時の前記組成物に含まれる前記菌株の生菌数（ＣＦＵ／ｇ）
　　ｔ：保管期間（日）×１／３０。
　　ｋ：死滅速度（Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ／月）。
　また、前記式（１）を移動することにより、次式（２）が得られた。
ｋ＝（Ｎ０－Ｎｔ）／ｔ・・・・・（２）
　　Ｎ０：ｎ０の常用対数値、すなわちＬｏｇ１０ｎ０。
　　Ｎｔ：ｎｔの常用対数値、すなわちＬｏｇ１０ｎｔ。
　一方、表５の死滅速度ｋを自然対数値にするとともに、保管温度Ｔ（℃）の絶対温度（Ｋ）の逆数を求めてから、死滅速度ｋの自然対数値と、絶対温度（Ｋ）の逆数との関係をプロットし、回帰直線を求めると、図５のようになった。これら各水分活性値ｗにおける回帰直線には、死滅速度ｋと絶対温度（Ｋ）の逆数とに強い負の相関（Ｒ２＞０．９８）が認められた。したがって、いずれの水分活性値ｗにおいても、死滅速度ｋは保管温度Ｔ（℃）に依存する関係（保管温度Ｔ（℃）が上がれば、死滅速度ｋが上がる。）にあり、アレニウスの法則に従い、図５の回帰直線がアレニウスプロットであることが示された。
　これにより、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９は、いずれの水分活性値ｗにおいても、その死滅速度ｋが保管温度（℃）に依存し、死滅速度ｋの自然対数値と保管温度（℃）とが比例関係にあることが分った。
　また、表５から算出した各温度の死滅速度ｋの自然対数値を求め、各保管温度（℃）における死滅速度ｋの自然対数値とサンプルの水分活性値ｗとの関係についてプロットし、回帰直線を求めると、図６の通りとなった。そして、回帰直線の相関性から、いずれの保管温度（℃）においても、水分活性値ｗと死滅速度ｋの自然対数値との間に、高い正の相関性（Ｒ２＞０．９５２）があることが判明した。このことから、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の死滅速度ｋは組成物の水分活性値ｗに比例し、死滅速度ｋと水分活性値との関係は、図６の回帰直線である次式（３）で表されることが分った。
　Ｌｎｋ＝ｋ’ｗ＋Ｃ・・・・・(３)
　　ｋ’：図６で示される回帰直線から得られる直線の傾き（回帰係数）。
　　ｗ：組成物の水分活性値。
　　Ｃ：図６で示される回帰直線のｙ切片。
　そして、前記式（３）に前記式（２）を代入することで、次式（４）が導き出された。
　Ｌｎ｛（Ｎ０－Ｎｔ）／ｔ｝=ｋ’ｗ＋Ｃ・・・・・（４）
　更に、前記（４）式は、定義によって次式（５）になる。
　（Ｎ０－Ｎｔ）／ｔ＝ＥＸＰ（ｋ‘ｗ＋Ｃ)・・・・・（５）
　更に、前記式（５）を変化させて次式（６）が得られた。
　Ｎｔ＝Ｎ０－ｔ×ＥＸＰ（ｋ’ｗ＋Ｃ）・・・・・（６）
　このようにして、保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の常用対数値（Ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎｔ）が、前記式（６）で表されることが判明した。
　以上のことから、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９を含有する組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）は、組成物の保管温度（℃）と、組成物の水分活性値ｗとに強く依存していることが示された。このことから、組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）は、組成物の保管温度（℃）と組成物の水分活性値ｗとから推定することが可能であることが推測された。そこで、図６の回帰直線から各保管温度（℃）の回帰直線の式を算出したところ、表６の式が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ここで、表６に示された各保管温度（℃）の回帰直線の式は、前記式（３）を表しているので、各保管温度（℃）の係数ｋ’と定数Ｃは、表６から求めることができる。したがって、保管温度２５℃の場合は、ｋ’＝１２．０２、Ｃ＝－６．８１７６となり、保管温度３７℃の場合は、ｋ’＝１３．１２２、Ｃ＝－４．３２１となり、保管温度４５℃の場合は、ｋ’＝１５．１３０、Ｃ＝－３．０５１となり、保管温度６０℃の場合は、ｋ’＝１８．０００、Ｃ＝－０．４５９となる。
　そして、各保管温度の係数ｋ’と保管温度（℃）との関係をプロットすると、図７に示すように、ｙ＝０．１７６２ｘ＋７．２１３７で表される回帰直線が導かれた。また、各保管温度の定数Ｃと保管温度（℃）との関係をプロットすると、図８に示すように、ｙ＝０．１８ｘ－１１．１７８で表される回帰直線が導かれた。また、それぞれの相関係数はＲ２＝０．９７１７及びＲ２＝０．９９６９と非常に高いことが判明した。このことから、係数ｋ’及び定数Ｃは次式（７）及び次式（８）で表せることが判明した。
　ｋ’＝０．１７６２×Ｔ＋７．２１３７・・・・・（７）
　Ｃ＝０．１８×Ｔ－１１．１７８・・・・・（８）
　Ｔ：保管温度（℃）
　なお、前記式（７）は、前記式（Ｉ）に関する（ｋ’＝ＡＴ×Ｔ＋ＢＴ）であり、前記式（８）は、前記式（Ｉ）に関する（Ｃ＝ＣＴ×Ｔ＋ＤＴ）である。つまり、この例では、ＡＴ＝０．１７６２であり、ＢＴ＝７．２１３７であり、ＣＴ＝０．１８であり、ＤＴ＝１１．１７８である。
　そして、前記式（７）及び前記式（８）を前記式（６）に代入すると、次式（９）が導かれた。
　Ｎｔ＝Ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（０．１７６２×Ｔ＋７．２１３７）ｗ＋（０．１８×Ｔ－１１．１７８）｝・・・・・（９）
　更に、Ｎｔ及びＮ０を変換して、最終的に次式（１０）式が導き出された。
　Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（０．１７６２×Ｔ＋７．２１３７）ｗ＋（０．１８×Ｔ－１１．１７８）｝・・・・・（１０）
　以上のことから、保管開始時の前記組成物に生菌数（ＣＦＵ／ｇ）で含まれるＢ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９が、水分活性値ｗの保管条件において保管温度Ｔ（℃）に保管した際の保管期間ｔ（日）後に生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を示すことが、前記式（１０）で表されることが判明した。また前記式（１０）から、生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）が、保管開始時の前記組成物に含まれる前記菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、保管温度Ｔ（℃）、保管期間ｔ（日）、及び水分活性値ｗによって変化することが示された。
　これにより、前記式（１０）を用いれば、保管開始時の前記組成物に含まれる前記菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、保管温度Ｔ（℃）、保管期間ｔ（日）、及び水分活性値ｗを決定することで、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定できる。
〔試験例－２　ビフィドバクテリウム・ブレベ　ＢＣＣＭ　ＬＭＧ　２３７２９を用いた試験〕
＜方法＞
　ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）ＢＣＣＭ　ＬＭＧ　２３７２９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ　Ｍ１６Ｖ、森永乳業社製。以下、Ｂ．ｂｒｅｖｅ　ＬＭＧ　２３７２９と略する。）の菌末を被験菌として使用し、かつ保管温度（℃）として５℃を加えたことと、及び生澱粉と乾燥澱粉の比率を変更することで、各サンプルの澱粉粉末の水分活性値ｗを下記表７に示すように変更した以外は、試験例－１と同様の方法で試験を行った。
＜結果＞
　試験例－１と同様にサンプル中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を測定し、その生残性に関する回帰直線から、Ｂ．ｂｒｅｖｅ　ＬＭＧ　２３７２９における各保管条件の死滅速度ｋを、表７の通り算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　また、表７おける死滅速度ｋの自然対数値と、水分活性値ｗとの関係をプロットしたところ、図９の通り、いずれの保管温度（℃）においても、死滅速度ｋと水分活性値との間に強い正の相関（Ｒ２＞０．９４９９）があることが示された。したがって、Ｂ．ｂｒｅｖｅ　ＬＭＧ　２３７２９の死滅速度ｋは、試験例－１と同様に、組成物の水分活性値ｗに比例していることが示された。
　そして、Ｂ．ｂｒｅｖｅ　ＬＭＧ　２３７２９においても試験例－１と同様に、保管期間ｔ（日）、保管温度Ｔ（℃）、水分活性値ｗから、ｎｔを保管後の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）、ｎ０を保管開始時の菌数（ＣＦＵ／ｇ）とすると、試験例－１の前記式（６）と同様に、次式（１１）が成り立つことが判明した。
　Ｎｔ＝Ｎ０－ｔ×ＥＸＰ（ｋ’ｗ＋Ｃ）・・・・・（１１）
　以上のことから、Ｂ．ｂｒｅｖｅ　ＬＭＧ　２３７２９を含有する組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）は、試験例－１と同様に、組成物の保管温度Ｔ（℃）と組成物の水分活性値ｗとに強く依存していることが示された。このことから、組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）は、組成物の保管温度Ｔ（℃）と組成物の水分活性値ｗとから推定することが可能であることが推測された。そこで、図１０の回帰直線から、各保管温度（℃）の回帰直線の式を算出したところ、表８の式が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ここで、試験例－１と同様に、各保管温度（℃）の係数ｋ’と定数Ｃは、表８から求められることから、保管温度２５℃の場合は、ｋ’＝１１．３４６、Ｃ＝－７．２４７となり、保管温度３７℃の場合は、ｋ’＝１２．３４６、Ｃ＝－４．９５９１となり、保管温度４５℃の場合は、ｋ’＝１５．２４２、Ｃ＝－２．５３１５となり、保管温度６０℃の場合は、ｋ’＝１９．４０５、Ｃ＝－１．５００９となる。
　そして、各温度の係数ｋ’と保管温度（℃）との関係をプロットし、回帰直線を求めると、ｙ＝０．２３９６ｘ＋４．５７９４が導かれた。また、各温度の定数Ｃと保管温度（℃）との関係をプロットし、回帰直線を求めると、ｙ＝０．６９１ｘ－１１．１１８が導かれた。また、それぞれの式の相関係数はＲ２＝０．９４８３及びＲ２＝０．９３１となり、試験例－１と同様に、各温度の定数Ｃと保管温度（℃）との間に強い相関関係が認められた。このことから、Ｂ．ｂｒｅｖｅ　ＬＭＧ　２３７２９における係数ｋ’及び定数Ｃは、次式（１２）及び次式（１３）で表せることが判明した。
　ｋ’＝０．２３９６×Ｔ＋４．５７９４・・・・・（１２）
　Ｃ＝０．６９１×Ｔ－１１．１１８・・・・・（１３）
　なお、前記式（１２）は、前記式（Ｉ）に関する（ｋ’＝ＡＴ×Ｔ＋ＢＴ）であり、前記式（１３）は、前記式（Ｉ）に関する（Ｃ＝ＣＴ×Ｔ＋ＤＴ）である。つまり、この例では、ＡＴ＝０．２３９６であり、ＢＴ＝４．５７９４であり、ＣＴ＝０．６９１であり、ＤＴ＝－１１．１１８である。
　　Ｔ：保管温度（℃）
　そして、前記式（１２）及び前記式（１３）を前記式（１１）に代入し、更にＮ０をＬｏｇ１０ｎ０変換し、ＮｔをＬｏｇ１０ｎｔに変換することで、次式（１４）が導かれた。
　Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（０．２３９６×Ｔ＋４．５７９４）ｗ＋（０．６９１×Ｔ－１１．１１８）｝・・・・・（１４）
　前記式（１４）を用いれば、保管開始時の前記組成物に含まれるＢ．ｂｒｅｖｅ　ＬＭＧ　２３７２９の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、保管温度Ｔ（℃）、保管期間ｔ（日）、及び水分活性値ｗを決定することで、保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定できる。
〔試験例－３　ビフィドバクテリウム・シュードロンガム　ＩＦＯ　１５８６１を用いた試験〕
＜方法＞
　ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）ＩＦＯ　１５８６１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　Ｍ－６０２、森永乳業社製。以下、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　ＩＦＯ　１５８６１と略する。）の菌末を被験菌として使用したこと、また、生澱粉と乾燥澱粉の比率を変更することで、各サンプルの澱粉粉末の水分活性値ｗを下記表９に示すように変更した以外は、試験例－１と同様の方法で試験を行った。
＜結果＞
　試験例－１と同様にサンプル中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を測定し、その生残性に関する回帰直線から、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　ＩＦＯ　１５８６１における各保管条件の死滅速度ｋを表９の通り算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　また、表９おける死滅速度ｋの自然対数値と、水分活性値ｗとの関係をプロットしたところ、図１０の通り、いずれの保管温度（℃）においても、死滅速度ｋと水分活性値ｗとの間に強い正の相関（Ｒ２＞０．９１）があることが示された。したがって、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　ＩＦＯ　１５８６１の死滅速度ｋは、試験例－１と同様に、組成物の水分活性値ｗに比例していることが示された。
　そして、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　ＩＦＯ　１５８６１においても試験例－１と同様に、保管期間ｔ（日）、保管温度Ｔ（℃）、水分活性値ｗから、ｎｔを保管後の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）、ｎ０を保管開始時の菌数（ＣＦＵ／ｇ）とすると、試験例－１の前記式（６）と同様に、次式（１５）が成り立つことが判明した。
　Ｎｔ＝Ｎ０－ｔ×ＥＸＰ（ｋ’ｗ＋Ｃ）・・・・・（１５）
　以上のことから、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　ＩＦＯ　１５８６１を含有する組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）は、試験例－１と同様に、組成物の保管温度Ｔ（℃）と組成物の水分活性値ｗとに強く依存していることが示された。このことから、組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）は、組成物の保管温度Ｔ（℃）と組成物の水分活性値ｗとから推定することが可能であることが推測された。そこで、図１２の回帰直線から、各保管温度（℃）の回帰直線の式を算出したところ、表１０の式が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　各保管温度（℃）の係数ｋ’と定数Ｃは、表１０から求められることから、保管温度２５℃の場合は、ｋ’＝１１．３４６、Ｃ＝－７．２４７となり、保管温度３７℃の場合は、ｋ’＝１２．３４６、Ｃ＝－４．９５９１となり、保管温度４５℃の場合は、ｋ’＝１５．２４２、Ｃ＝－２．５３１５となり、保管温度６０℃の場合は、ｋ’＝１９．４０５、Ｃ＝－１．５００９となる。
　そして、各温度の係数ｋ’と保管温度（℃）との関係をプロットし、回帰直線を求めると、ｙ＝０．１４０９ｘ＋９．２３１７が導かれた。また、各温度の定数Ｃと保管温度（℃）との関係をプロットし、回帰直線を求めると、ｙ＝０．１６１４ｘ－１１．３３が導かれた。また、それぞれの式の相関係数はＲ２＝０．９２６６及びＲ２＝０．９６４６となり、試験例－１と同様に、相関関係が認められた。このことから、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　ＩＦＯ　１５８６１における係数ｋ’及び定数Ｃは、次式（１６）及び次式（１７）で表せることが判明した。
　ｋ’＝０．１４０９×Ｔ＋９．２３１７・・・・・（１６）
　Ｃ＝０．１６１４×Ｔ－１１．３３・・・・・（１７）
　なお、前記式（１６）は、前記式（Ｉ）に関する（ｋ’＝ＡＴ×Ｔ＋ＢＴ）であり、前記式（１７）は、前記式（Ｉ）に関する（Ｃ＝ＣＴ×Ｔ＋ＤＴ）である。つまり、この例では、ＡＴ＝０．１４０９であり、ＢＴ＝９．２３１７であり、ＣＴ＝０．１６１４であり、ＤＴ＝－１１．３３である。
　Ｔ：保管温度（℃）
　そして、前記式（１６）及び前記式（１７）を前記式（１５）に代入し、更にＮ０をＬｏｇ１０ｎ０変換し、ＮｔをＬｏｇ１０ｎｔに変換することで、次式（１８）が導かれた。
　Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（０．１４０９×Ｔ＋９．２３１７）ｗ＋（０．１６１４×Ｔ－１１．３３）｝・・・・・（１８）
　前記式（１８）を用いれば、保管開始時の前記組成物に含まれるＢ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ　ＩＦＯ　１５８６１の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、保管温度Ｔ（℃）、保管期間ｔ（日）、及び水分活性値ｗを決定することで、保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定できる。
　以下、乳酸菌おいても、生残菌数推定方法で用いる前記式（Ｉ）を導く方法及び保証菌数の設定方法について、試験例４を用いて更に説明する。
〔試験例－４　ラクトバチルス・アシドフィラス　ＬＡＣ－３００を用いた試験〕
＜方法＞
　ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＩＦＯ－１５８６２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００、森永乳業社製。以下、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００と略する。）の菌末を被検菌として使用し、かつ保管温度（℃）を２５℃ではなく３０℃にしたこと、生澱粉と乾燥澱粉の比率を変更することで、各サンプルの澱粉粉末の水分活性値ｗを下記表１１に示すように変更したこと、生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の測定時に嫌気条件下ではなく好気条件下で培養したこと以外は、試験例―１と同様の方法で試験を行った。
＜結果＞
　試験例－1と同様にサンプル中の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を測定し、その生残性に関する回帰直線から、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００における各保管条件の死滅速度ｋを、表１１の通りに算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　また、表１１における死滅速度ｋの自然対数値と、水分活性ｗとの関係をプロットしたところ、図１３の通り、いずれの保管温度（℃）においても、死滅速度ｋと水分活性値ｗとの間に強い正の相関（Ｒ２＞０．８８７６）があることが示された。したがって、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００の死滅速度ｋは試験例－1と同様に、組成物の水分活性値ｗに比例していることが示された。
　そして、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００においても試験例－１と同様に、保管期間ｔ（日）、保管温度Ｔ（℃）、水分活性値ｗから、ｎｔを保管後の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）、ｎ０を保管開始時の菌数（ＣＦＵ／ｇ）とすると、試験例－１の前記式（６）と同様に、次式（１９）が成り立つことが判明した。
　Ｎｔ＝Ｎ０－ｔ×ＥＸＰ（ｋ’ｗ＋Ｃ）・・・・・（１９）
　以上のことから、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００を含有する組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）は、試験例－１と同様に、組成物の保管温度Ｔ（℃）と組成物の水分活性値ｗとに強く依存していることが示された。このことから、組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）は、組成物の保管温度Ｔ（℃）と組成物の水分活性値ｗとから推定することが可能であることが推測された。そこで、図１３の回帰直線から、各保管温度（℃）の回帰直線の式を算出したところ、表１２の式が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　ここで、試験例－１と同様に、各保管温度（℃）の係数ｋ’と定数Ｃは、表１２から求められることから、保管温度３０℃の場合は、ｋ’＝１３．１３５、Ｃ＝－５．７１２３となり、保管温度３７℃の場合は、ｋ’＝１４．５２６、Ｃ＝－４．８７０５となり、保管温度４５℃の場合は、ｋ’＝１７．７２、Ｃ＝－３．７４６３となり、保管温度６０℃の場合は、ｋ’＝１３．１３５、Ｃ＝－５．７１２３となる。
　そして、各温度の係数ｋ’と保管温度（℃）との関係をプロットし、回帰直線を求めると、ｙ＝０．１６６９ｘ＋８．６６２１が導かれた。また、各温度の定数Ｃと保管温度（℃）との関係をプロットし、回帰直線を求めると、ｙ＝０．１８３９ｘ－１１．３２７が導かれた。また、それぞれの式の相関係数はＲ２＝０．８６６２１及びＲ２＝０．９８５３となり、試験例－１と同様に、相関関係が認められた。このことから、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００における係数ｋ’及び定数Ｃは次式（２０）及び次式（２１）で表せることが判明した。
　ｋ’＝０．１６６９×Ｔ＋８．６６２１・・・・・（２０）
　Ｃ＝０．１８３９×Ｔ－１１．３２７・・・・・（２１）
　なお、前記式（２０）は前記式（Ｉ）に関する（ｋ’＝ＡＴ×Ｔ＋ＢＴ）であり、前記式（２１）は、前記式（Ｉ）に関する（Ｃ＝ＣＴ×Ｔ＋ＤＴ）である。つまり、この例では、ＡＴ＝０．１６６９であり、ＢＴ＝８．６６２１であり、ＣＴ＝０．１８３９であり、ＤＴ＝－１１．３２７である。
　Ｔ：保管温度（℃）
　そして、前記式（２０）及び前記式（２１）を前記式（１９）に代入し、更にＮ０をＬｏｇ１０ｎ０変換し、ＮｔをＬｏｇ１０ｎｔに変換することで、次式（２２）が導かれた。
　Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（０．１６６９×Ｔ＋８．６６２１）ｗ＋（０．１８３９×Ｔ－１１．３２７）｝・・・・・（２２）
　前記式（２２）を用いれば、保管開始時の前記組成物に含まれるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、保管温度Ｔ（℃）、保管期間ｔ（日）、及び水分活性値ｗを決定することで、保管期間ｔ（日）後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を推定できる。
　なお、前記の試験例－１～試験例－３では、いずれも菌株がビフィズス菌に属するものであったが、乳酸菌においても、その生残性が保管温度と水分活性値に依存することが、前述した非特許文献８に示されていることから、本発明の生残菌数推定方法を適用することが可能であり、その詳細を試験例－４に示した。更に、他の菌属に属する菌株であっても、試験例－１～試験例－４と同様の方法によって、生残性が保管温度と水分活性値に依存することが認められる菌株であれば、本発明の生残菌数推定方法を適用可能である。
　本発明の生残菌数推定方法を用いれば、プロバイオティクス製品の保管期間に対する特定の菌株の生残菌数を正確に推定することが可能であり、製品の開発期間を短縮することが可能である。
　本発明の保証菌数の設定方法を用いれば、品質の保証期間内におけるプロバイオティクス製品中の特定の菌株の保証菌数を導くことが可能である。
　次に、上記の生残菌数推定方法を用いた生残菌数推定装置の構成及び処理について説明する。
　図１１は、一実施の形態による生残菌数推定装置１の構成を示すブロック図である。生残菌数推定装置１は、例えば、パーソナルコンピュータなどのコンピュータ装置により実現することができ、入力受付部１１、定数係数算出部１２、記憶部１３、算出部１４、及び、出力指示部１５を備える。
　入力受付部１１は、キーボード、マウス、タッチパネル、ボタンやキーなどの入力部により、ユーザが入力した情報を受ける。あるいは、入力受付部１１は、ネットワークを介して接続される他のコンピュータ装置から情報を受信したり、コンピュータ読み取り可能な記録媒体から情報を読み出したりすることでもよい。
　定数係数算出部１２は、式（Ｉ）に用いられる係数、定数であるＡＴ、ＢＴ、ＣＴ、ＤＴを算出して記憶部１３に書き込む。算出部１４は、記憶部１３に記憶されているＡＴ、ＢＴ、ＣＴ、ＤＴを用いた式（Ｉ）に基づいて、保管期間後に組成物に含まれる菌株の生残菌数、菌株を含有する組成物の保管期間、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数、組成物の保管温度、あるいは、組成物の水分活性値を算出する。また、算出部１４は、式（ＩＩ）に基づいて、保証菌数を算出する。
　出力指示部１５は、算出部１４による算出結果を出力部、例えば、ＣＲＴ（ｃａｔｈｏｄｅ　ｒａｙ　ｔｕｂｅ）やＬＣＤ（ｌｉｑｕｉｄ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｄｉｓｐｌａｙ）などのディスプレイに表示したり、プリンタなどにより印刷したりする機能を有する。あるいは、算出部１４による算出結果を、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に書き込んだり、ネットワークを介して接続されるコンピュータ装置へ出力したりすることでもよい。
　次に、生残菌数推定装置１を用いた、式（Ｉ）の定数、係数であるＡＴ、ＢＴ、ＣＴ、ＤＴの算出処理について説明する。
　まず、生残菌数推定装置１の入力受付部１１は、菌株の種類の情報と、前記菌株についての上述した実験を行なったときの保管条件、及び、その実験結果である、前記菌株を含有する組成物の保管温度（℃）及び水分活性値ｗと、前記組成物の保管期間（日）と、前記保管期間後の組成物に含まれる生菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）との情報の入力を受ける。
　定数係数算出部１２は、保管条件、すなわち、保管温度（℃）及び水分活性値毎に、各サンプル中の特定の菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）の常用対数値をＹ軸、保管期間ｔ（日）×１／３０をＸ軸としたときの第１の回帰直線（図１～図４、表５参照）をそれぞれ算出する。定数係数算出部１２は、各保管条件について得られた第１の回帰直線の傾き（回帰係数）の絶対値を、前記各保管条件の死滅速度ｋとして得る。
　次に、定数係数算出部１２は、保管温度（℃）毎に、死滅速度ｋの自然対数値をＹ軸、水分活性値ｗをＸ軸としたときの、各保管温度（℃）についての第２の回帰直線ｙ＝ａｘ＋ｂ（図６、表６参照）をそれぞれ算出する。
　さらに、定数係数算出部１２は、第２の回帰直線の傾き（ａ）をＹ軸、保管温度Ｔ（℃）をＸ軸としたときの第３の回帰直線式（図７参照）を算出し、この第３の回帰直線の傾きをＡＴ、Ｙ切片をＢＴとして得る。
　続いて、定数係数算出部１２は、第２の回帰直線の定数（ｂ）をＹ軸、保管温度Ｔ（℃）をＸ軸としたときの第４の回帰直線（図８参照）を算出し、この第４の回帰直線式の傾きをＣＴ、Ｙ切片をＤＴとして得る。
　定数係数算出部１２は、上記により算出したＡＴ、ＢＴ、ＣＴ、ＤＴと、微生物の種類の情報とを対応づけて記憶部１３に書き込む。
　次に、生残菌数推定装置１を用いた、保管期間後に組成物に含まれる菌株の生残菌数、菌株を含有する組成物の保管期間、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数、組成物の保管温度、組成物の水分活性値、保証菌数の算出処理について説明する。
［保管期間後に組成物に含まれる菌株の生残菌数、保証菌数の算出］
　生残菌数推定装置１の入力受付部１１は、生残菌数算出条件情報、すなわち、菌の種類と、菌株を含有する組成物の保管期間（日）と、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）と、組成物の保管温度（℃）と、組成物の水分活性値ｗとの情報の入力を受ける。
　算出部１４は、入力された菌の種類の情報に対応したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを記憶部１３から読み出すと、読み出したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを用いた式（Ｉ）に、入力された生残菌数算出条件情報で示される、菌株を含有する組成物の保管期間（日）と、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）と、組成物の保管温度（℃）と、組成物の水分活性値ｗとを代入し、保存期間ｔ（日）後に組成物に含まれる微生物の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を算出する。
　さらに、算出部１４は、この算出した保管期間ｔ（日）後の組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を用い、温度Ｔ’（℃）以下で保管した場合の保証期間ｔ’（日）内の保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を、式（ＩＩ）により算出する。ただし、温度Ｔ’（℃）、保証期間ｔ’（日）は、生残菌数算出条件情報で示される、組成物の保管温度（℃）、菌株を含有する組成物の保管期間（日）である。
　出力指示部１５は、算出部１４により算出された、保存期間後に組成物に含まれる微生物の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）、及び、保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）の情報を出力する。
［組成物の保管期間の算出］
　生残菌数推定装置１の入力受付部１１は、保管期間算出条件情報、すなわち、菌の種類と、保管期間後に前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、組成物の保管温度（℃）と、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）と、組成物の水分活性値ｗとの情報の入力を受ける。
　算出部１４は、入力された菌の種類の情報に対応したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを記憶部１３から読み出すと、読み出したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを用いた式（Ｉ）に、入力された保保管期間算出条件情報で示される、保管期間後に組成物に含まれる菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、組成物の保管温度（℃）と、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）と、組成物の水分活性値ｗとを代入し、菌株を含有する組成物の保管期間（日）を算出する。
　出力指示部１５は、算出部１４により算出された菌株を含有する組成物の保管期間（日）の情報を出力する。
［保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数の算出］
　生残菌数推定装置１の入力受付部１１は、保管開始時生菌数算出条件情報、すなわち、菌の種類と、保管期間後に前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、菌株を含有する組成物の保管期間（日）と、組成物の保管温度（℃）と、組成物の水分活性値ｗとの情報の入力を受ける。
　算出部１４は、入力された菌の種類の情報に対応したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを記憶部１３から読み出すと、読み出したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを用いた式（Ｉ）に、入力された保管開始時生菌数算出条件情報で示される、保管期間後に組成物に含まれる菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、菌株を含有する組成物の保管期間（日）と、組成物の保管温度（℃）と、組成物の水分活性値ｗとを代入し、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）を算出する。
　出力指示部１５は、算出部１４により算出された保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）の情報を出力する。
［組成物の保管温度の算出］
　生残菌数推定装置１の入力受付部１１は、保管温度算出条件情報、すなわち、菌の種類と、保管期間後に前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）、菌株を含有する組成物の保管期間（日）と、組成物の水分活性値ｗとの情報の入力を受ける。
　算出部１４は、入力された菌の種類の情報に対応したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを記憶部１３から読み出すと、読み出したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを用いた式（Ｉ）に、入力された保管温度算出条件情報で示される、保管期間後に組成物に含まれる菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）と、菌株を含有する組成物の保管期間（日）と、組成物の水分活性値ｗとを代入し、組成物の保管温度（℃）を算出する。
　出力指示部１５は、算出部１４により算出された組成物の保管温度（℃）の情報を出力する。
［組成物の水分活性値の算出］
　生残菌数推定装置１の入力受付部１１は、水分活性値算出条件情報、すなわち、菌の種類と、保管期間後に前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）と、菌株を含有する組成物の保管期間（日）と、組成物の保管温度（℃）との情報の入力を受ける。
　算出部１４は、入力された菌の種類の情報に対応したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを記憶部１３から読み出すと、読み出したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを用いた式（Ｉ）に、入力された水分活性値算出条件情報で示される、保管期間後に組成物に含まれる菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）と、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）と、菌株を含有する組成物の保管期間（日）と、組成物の保管温度（℃）とを代入し、組成物の水分活性値ｗを算出する。
　出力指示部１５は、算出部１４により算出された組成物の水分活性値ｗの情報を出力する。
　なお、上記において、入力された各条件情報の単位と、式（Ｉ）に使用される単位が異なる場合には、入力された各条件情報の単位を、式（Ｉ）において使用されている単位に変換してから代入する。
　図１２は、生残菌数推定装置１が出力する画面例である。
　同図において、まず、生残菌数推定装置１の入力部により、菌の種類及び算出対象に対応したタブＴ１～Ｔ５を選択する。図においては、タブＴ１により、菌の種類としてビフィズス菌を、算出対象として保管期間後に組成物に含まれる菌株の生残菌数（生残菌数予測）を選択した場合を示す。
　同図には、さらに、組成物の保管温度（℃）を入力するためのフィールドＡ１、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数（初期添加菌数）ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）を入力するための入力フィールドＡ２、組成物の水分活性値を入力するための入力フィールドＡ３、菌株を含有する組成物の保管期間（月）を入力するための入力フィールドＡ４が表示されている。ユーザが、生残菌数推定装置１の入力部により、入力フィールドＡ１～Ａ４に数値を入力すると、生残菌数推定装置１の算出部１４は、選択された菌の種類、ここでは、ビフィズス菌に対応したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを用いた式（Ｉ）に、入力フィールドＡ１～Ａ４に入力された値を代入することにより、保存期間後に組成物に含まれる微生物の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を算出し、出力指示部１５は、その算出結果を表示フィールドＡ５に表示させる。ビフィズス菌に対応したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを用いた式（Ｉ）として、例えば、試験例－１の式（１０）を用いることができる。
　同図においては、出力指示部１５はさらに、算出部１４が（保存期間後に組成物に含まれる微生物の生残菌数）／（保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数）により算出した予測生残率を表示フィールドＡ６に表示させ、算出部１４が式（ＩＩ）により算出した保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を表示フィールドＡ７に表示させる。
　図１４は、生残菌数推定装置１が出力する他の画面例である。
　同図においては、生残菌数推定装置１の入力部によりタブＴ１１を選択し、菌の種類としてＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００を、算出対象として保管期間後に組成物に含まれる菌株の生残菌数（生残菌数予測）を選択した場合を示す。
　ユーザは、生残菌数推定装置１の入力部により、組成物の保管温度（℃）を入力するためのフィールドＡ１１、保管開始時の組成物に含まれる菌株の生菌数（初期添加菌数）ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）を入力するための入力フィールドＡ１２、組成物の水分活性値を入力するための入力フィールドＡ１３、菌株を含有する組成物の保管期間（月）を入力するための入力フィールドＡ１４に数値を入力する。これにより、生残菌数推定装置１の算出部１４は、選択された菌の種類、ここでは、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００に対応したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを用いた式（Ｉ）に、入力フィールドＡ１１～Ａ１４に入力された値を代入し、保存期間後に組成物に含まれる微生物の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を算出し、出力指示部１５は、その算出結果を表示フィールドＡ１５に表示させる。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００に対応したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを用いた式（Ｉ）として、例えば、試験例－４の式（２２）を用いることができる。
　出力指示部１５はさらに、予測生残率を表示フィールドＡ１６に表示させ、保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を表示フィールドＡ１７に表示させる。
　なお、生残菌数推定装置１は、入力受付部１１、記憶部１３、算出部１４、及び、出力指示部１５のみを備えるものであってもよい。この場合、生残菌数推定装置１の記憶部１３は、入力受付部１１、及び、定数係数算出部１２を少なくとも備える他の生残菌数推定装置１により算出したＡT、ＢT、ＣT、ＤTを保持する。
　なお、上述の生残菌数推定装置１は、内部にコンピュータシステムを有している。そして、生残菌数推定装置１の入力受付部１１、係数定数算出部１２、算出部１４、及び、出力指示部１５の動作の過程は、プログラムの形式でコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記憶されており、このプログラムをコンピュータシステムが読み出して実行することによって、上記処理が行われる。ここでいうコンピュータシステムとは、ＣＰＵ及び各種メモリやＯＳ、周辺機器等のハードウェアを含むものである。
　また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。
　また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであっても良い。
（実施例１）
　水分活性値０．２５のスキムミルク（森永乳業社製）に森永乳業社製Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の菌末を、粉乳中に１×１０８（ＣＦＵ／ｇ）個／ｇとなる様に添加し、保管開始時の前記組成物に含まれる前記菌株の生菌数ｎ０（ＣＦＵ／ｇ）が１×１０８（ＣＦＵ／ｇ）のビフィズス菌含有粉乳を作製し、このビフィズス菌含有粉乳をアルミ袋にヒートシールした。一方、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＢＡＡ－９９９の生残性を試験例－１に従って求め、以下の関係式を得た。
　Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（０．１７６２×Ｔ＋７．２１３７）ｗ＋（０．１８×Ｔ－１１．１７８）｝・・・・・（２３）
　この製品は２５℃以下で保管するものとされ、かつ賞味期間を５４０日（１８ヶ月）に定める予定であることから、２５℃における保管期間５４０日後の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を前記式（２３）に従って計算した。すなわち、前記式（２３）のｎ０に１×１０８を、ｔに５４０×１／３０＝１８を、Ｔに２５を、ｗに０．２５を代入し、次式とした。
　Ｌｏｇ１０ｎ１８＝Ｌｏｇ１０（１×１０８）－１８×ＥＸＰ｛（０．１７６２×２５＋７．２１３７）×０．２５＋（０．１８×２５－１１．１７８）｝
　そして、この式から、ｎ１８＝３．９×１０７が得られた。したがって、実施例１の水分活性値０．２５のビフィズス菌含有粉乳を、２５℃で保管した場合、保管開始時から１８ヵ月後の生残菌数ｎ１８（ＣＦＵ／ｇ）は、３．９×１０７（ＣＦＵ／ｇ）であることが推定された。
　更に、実施例１のビフィズス菌含有粉乳を、２５℃以下で保管した場合の保証期間５４０日内の保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を、次式（２４）を用いて算出した。ここで、ｎｔ’には前記式（２３）で得られた３．９×１０７を代入し、ａには０．８を代入した。
　Ｎ＝ｎｔ’×ａ・・・（２４）
　前記式（２４）によって、Ｎ≒３．１×１０７が得られた。よって、実施例１のビフィズス菌含有粉乳を、２５℃以下で保管した場合の保証期間５４０日内の保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を、３．１×１０７（ＣＦＵ／ｇ）に設定した。
　本発明の生残菌数推定方法を用いれば、プロバイオティクス製品の保管期間に対する特定の菌株の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）を正確に推定することが可能であり、製品の開発期間を短縮する用途に適用することが可能である。また、本発明の保証菌数の設定方法を用いれば、品質の保証期間内におけるプロバイオティクス製品中の特定の菌株の保証菌数を容易に導くことに適用することが可能である。
１…生残菌数推定装置
１１…入力受付部
１２…定数係数算出部
１３…記憶部
１４…算出部
１５…出力指示部

Claims (11)

  1. 　特定の菌株を含有する組成物を保管した際の前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）を次式（Ｉ）によって推定することを特徴とする生残菌数推定方法。
    　Ｌｏｇ１０ｎｔ＝Ｌｏｇ１０ｎ０－ｔ×ＥＸＰ｛（ＡＴ×Ｔ＋ＢＴ）ｗ＋（ＣＴ×Ｔ＋ＤＴ）｝・・・（Ｉ）
    　　ｔ：保管期間（日）×１／３０。
    　　ｎｔ：保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数（ＣＦＵ／ｇ）。
    　　ｎ０：保管開始時の前記組成物に含まれる前記菌株の生菌数（ＣＦＵ／ｇ）。
    　　Ｔ：保管温度（℃）。
    　　ｗ：組成物の水分活性値。
    　　ＡＴ：実験により求めた前記菌株特有の係数。
    　　ＢＴ：実験により求めた前記菌株特有の定数。
    　　ＣＴ：実験により求めた前記菌株特有の係数。
    　　ＤＴ：実験により求めた前記菌株特有の定数。
  2. 　前記菌株が、ビフィズス菌または乳酸菌に属する請求項１に記載の生残菌数推定方法。
  3. 　前記菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）、及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）のいずれか一種のビフィズス菌である請求項２に記載の生残菌数推定方法。
  4. 　前記菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９９９である請求項２に記載の生残菌数推定方法。
  5. 　前記菌株が、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）ＢＣＣＭ　ＬＭＧ　２３７２９である請求項２に記載の生残菌数推定方法。
  6. 　前記菌株が、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）ＩＦＯ　１５８６１である請求項２に記載の生残菌数推定方法。
  7. 　前記菌株が、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔｒｕｍ）、及びエンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）のいずれか一種の乳酸菌である請求項２に記載の生残菌数推定方法。
  8. 　前記菌株が、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）　ＩＦＯ－１５８６２　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＡＣ－３００）である請求項２に記載の生残菌数推定方法。
  9. 　前記水分活性値ｗが、０．６以下である請求項１～８のいずれか一項に記載の生残菌数推定方法。
  10. 　前記保管温度Ｔ（℃）が、２５℃～６０℃である請求項１～９のいずれか一項に記載の生残菌数推定方法。
  11. 　温度Ｔ’（℃）以下で保管した場合の保証期間ｔ’（日）内の保証菌数Ｎ（ＣＦＵ／ｇ）を、次式（ＩＩ）により設定することを特徴とする保証菌数の設定方法。
    　Ｎ＝ｎｔ’×ａ・・・（ＩＩ）
    　　ｎｔ’：請求項１～９のいずれか一項に記載の生残菌数推定方法によって推定した保管期間ｔ（日）後の前記組成物に含まれる前記菌株の生残菌数ｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）であって、保管温度Ｔ（℃）をＴ’（℃）とし、保管期間ｔ（日）をｔ’（日）としたときのｎｔ（ＣＦＵ／ｇ）。
    　　ａ：１未満の定数。
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