WO2010020935A2 - Aplicação da monooleína como novo lípido adjuvante em lipofecção - Google Patents

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Olga Maria Fernandes Pereira Coutinho
Andreia Ferreira Castro Gomes
Margarida Paula Pedra Amorim Casal
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Definitions

  • Genotypic transformation of a cell implies a phenotypic modification.
  • the present invention relates to a novel formulation using cationic lipids (lipofection) by conjugating the neutral monooleoyl-rac-glycerol lipid (Monoolein) with the cationic surfactants of the Dioctadecyldimethylammonium (DODAX) family.
  • DODAB Dioctadecyldimethylammonium
  • DODAC Dioctadecyldimethylammonium Chloride
  • DODAP Dioctadecyldimethylammonium Phosphate
  • transformation This phenomenon can be artificially obtained by inserting exogenous gene material into the cell (transfection), and is of utmost importance both in the field of molecular biology research (in vitro application). as in health in Gene Therapy (in vivo application).
  • EOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine
  • DODAB Dioctadecyldimethylammonium
  • a Monoolein, 1-monooleoyl rac glycerol (MO) - Fig.2. is an amphiphilic neutral lipid of natural origin which has the particularity of having two inverted bicontinuous cubic phases, even in excess of H20 ( ⁇ 90% w / w), as shown in its phase diagram, shown in Fig. 3 ( Lipowsky et al, 1995). The existence of several non-lamellar phases, plus its low commercial value, indicate that the Monoolein compound presents itself as a potential candidate for adjuvant lipid.
  • transfection using as non-viral vectors cationic lipids derived from styrofoosins, using a first adjuvant lipid DOPE and as a second adjuvant lipid selected from diacyl glycerois in KK-1 cells.
  • Diacylglycerols have two hydrophobic tails, and are therefore similar to the usual adjuvant lipids (DOPE).
  • DOPE adjuvant lipids
  • Fig.1 Chemical representation of the molecule Dioctadecyl dimethylammonium bromide (DODAB).
  • Fig.3 Phase diagram of the 1-monooleoyl rac-glycerol molecule (Monoolein), containing different organizational structures: Lamellar structure (L a ; L p ); Inverted Hexagonal Non-Lamellar Structure (Hn) and Inverted Cubic Non-Lamellar Structure (Q n ) ⁇
  • FIG.4 Graphical representation of transfection efficiency analysis of different DNA / lipid formulations in 293T cell line.
  • FIG.5 Graphical representation of cytotoxicity analysis of different DNA / lipid formulations in 293T cell line.
  • the present invention describes the use of cationic lipid systems composed of dioctadecyldimethylammonium derived cationic surfactants (DODAX) and neutral 1-monooleoyl rac-glycerol surfactant (Monoolein) in DNA complexation and transport, and as a vehicle. of genetic transformation in cells.
  • Monoolein, 1-monooleoyl-rac-glycerol (MO) is a naturally occurring amphiphilic neutral lipid that has the peculiarity of having two inverted bicontinuous cubic phases, even in excess of H20 ( ⁇ 90% w / w) as You can see from its phase diagram, shown in Fig. 3 (Lipowsky et al., 1995). The existence of several non-lamellar phases plus their low commercial value indicate that the Monoolein compound is a potential candidate for adjuvant lipid in lipofection systems.
  • DNA complexation as determined by the electrostatic attraction between the positively charged ammonium groups of the synthetic surfactant Dioctadecyldimethylammonium (DODAX) and the negative phosphate backbone of the plasmid DNA, causes the structure to condense into commonly known DNA / Lipid complexes. lipoplexes, which in this case also contain the neutral lipid
  • one embodiment of the invention is the application of the cationic lipid molar ratio formulation Dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB): adjuvant lipid (Monoolein) 2: 1, in ratios (+/-) loads (2: 1 and 4: 1), from among the possible (from 1: 1 to 4: 1), corresponding to different concentrations of dioctadecyl dimethylammonium bromide (DODAB) positive ammonium groups for the same concentration of phosphate negative groups (DNA).
  • DODAB Dioctadecyldimethylammonium bromide
  • Monoolein adjuvant lipid
  • DODAB dioctadecyl dimethylammonium bromide
  • Transfection efficiency was determined by measuring the activity of the ⁇ -galactosidase reporter enzyme (Absorbance at 420nm) (Fig. 4).
  • the level of cytotoxicity was determined by measuring the activity of the enzyme Lactate Dehydrogenase (Absorbance at 340nm) (Fig. 5).
  • (+/-) 4: 1 had a higher transfection efficiency than the loading ratio (+/-) 2: 1 (due to the higher concentration of lipofection agent), this was not found experimentally (Fig. 4), due to the increased cytotoxicity observed at 48 hours (5% to 7% at the load ratios (+/-) 2: 1 and 4: 1, respectively) (Fig. 5). It should be noted that the commercial system (Lipofectamine) has a cytotoxicity level (7%), higher than the DODAB: MO system (2: 1), for the load ratio (+/-) 2: 1.
  • the genetic material introduced into the cell was plasmid pSV-gal (Invitrogen), which was amplified by the competent strain Escherichia coli DHB4. Isolation and purification of the DNA was performed using the Wizard® Plus Midipreps DNA Purification System extraction kit, marketed by Promega. Final DNA concentration (1.75 ⁇ g / ⁇ L) was measured by absorbance at 260 nm in a
  • 293T cell line cells were cultured in T75cm 3 flasks with L-glutamine supplemented DMEM medium (4 mM), sodium bicarbonate (1.5 g / L), glucose (4.5 g / L), fetal bovine serum (10% v / v) and antibiotic (1 uni / ml). Cells were regularly subcultured between passages 18 and 24 and were always maintained at confluences below 90% (37 ° C and 5% CO 2).
  • the activity of the ⁇ -galactosidase enzyme in the various samples was determined with the Enzyme Assay System with Lysis Buffer Reporter expression kit according to manufacturer's instructions (1 ⁇ cell extract + 49 ⁇ RLB IX solution + 50 ⁇ Assay 2X solution + 150 ⁇ sodium carbonate solution to stop colorimetric reaction), with absorbance reading 420 nm on 96-well plate in a SpectraMax 340PC microplate reader.
  • the intracellular activity of LDH enzyme was determined [10 ⁇ intracellular sample + 250 ⁇ NADH solution (0.31 mM) + 10 ⁇ uv pyruvate solution (8.96 mM) to stop colorimetric reaction] in 96-well plate in a microplate reader SpectraMax 340PC (absorbance at 340 nm).
  • Extracellular activity of LDH enzyme was also measured [40 ⁇ intracellular sample + 250 ⁇ NADH solution (0.31 mM) + 10 ⁇ pyruvate solution (8.96mM) to stop colorimetric reaction] in 96-well plate on a SpectraMax 340PC microplate reader (absorbance at 340 nm).

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Abstract

A presente invenção diz respeito à aplicação de sistemas lipídicos catiónicos à base de Monooleína, na complexação, transporte e transfecção de material genético em células alvo. Os sistemas lipídicos são preparados através da conjugação do lípido neutral monooleoil-rac-glicerol (Monooleína) com os tensioactivos catiónicos da família de Dioctadecildimetilamónio (DODAX) (Brometo de Dioctadecildimetilamónio (DODAB), Cloreto de Dioctadecildimetilamónio (DODAC) e Fosfato de Dioctadecildimetilamónio (DODAP)). Este método de lipofecção é aplicável tanto no domínio da investigação em Biologia Molecular (aplicação in vitro), como na área da saúde em Terapia Génica (aplicação in vivo), apresentando elevados níveis de biocompatibilidade e reduzidos custos de aquisição.

Description

Description
Title of Invention: APLICAÇÃO DA MONOOLEÍNA COMO
NOVO LÍPIDO ADJUVANTE EM LIPOFECÇÃO
Campo da Invenção
[1] A transformação genotípica de uma célula implica uma modificação fenotípica
induzindo uma alteração hereditária permanente do DNA e do seu perfil de expressão. Este fenómeno pode ser obtido artificialmente através da inserção de material génico exógeno na célula (transfecção). A presente invenção diz respeito a uma nova formulação com recurso a lípidos catiónicos (lipofecção), através da conjugação do lípido neutral monooleoil-rac-glicerol (Monooleína) com os tensioactivos catiónicos da família de Dioctadecildimetilamónio (DODAX) (Brometo de
Dioctadecildimetilamónio (DODAB), Cloreto de Dioctadecildimetilamónio (DODAC) e Fosfato de Dioctadecildimetilamónio (DODAP)), com aplicação no domínio da investigação em Biologia Molecular (aplicação m vitro), assim como na área da saúde em Terapia Génica (aplicação in vivo).
Antecedentes da Invenção
[2] A modificação fenotípica de uma célula, induzida por uma alteração hereditária
permanente do DNA e do seu perfil de expressão, dá-se o nome de transformação. Este fenómeno pode ser obtido artificialmente através da inserção de material génico exógeno na célula (transfecção), e revela- se de extrema importância tanto no domínio da investigação em Biologia Molecular (aplicação in vitro). como na área da saúde em Terapia Génica (aplicação in vivo).
[3] Os vários métodos de transfecção actualmente conhecidos têm sido frequentemente agrupados em dois grupos: métodos virais (vírus recombinantes) ou métodos não- virais (complexação de DNA por intermédio de lípidos ou polímeros, co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio, electroporação, bombardeamento de partículas carregadas, ou microinjecção de DNA) (Maslov et al., 2002).
[4] A Tabela I apresenta um resumo comparativo das principais vantagens e
desvantagens associadas a estes dois tipos de sistemas de transfecção.
Tabela I - Comparação entre as propriedades de sistemas de transfecção virais e não- virais (Gregoriadis, 2007)
[5] [Table 1]
[Table ]
Figure imgf000004_0001
[6] Dentro do grande grupo dos métodos não-virais, uma especial relevância tem sido dada nas últimas décadas ao método de lipofecção, que envolve o uso de lipossomas catiónicos para a complexação e libertação de DNA exógeno no interior das células. Foi em 1987 que Felgner e seus colaboradores descreveram pela primeira vez o uso de moléculas lipídicas com grupos químicos positivos para transfecção génica em culturas de células (Felgner et al.,1987). Ao contrário de outras drogas transportadas em sistemas lipídicos, o DNA plasmídico não era encapsulado no interior do lipossoma, mas antes ficava fortemente condensado pela acção de pequenos vesículos catiónicos que cobriam total ou parcialmente o plasmídeo, dando origem a estruturas mais tarde designadas de lipoplexos, cuja formação era fortemente dependente da atracção electrostática entre o esqueleto de fosfatos negativos do DNA e as cabeças positivas dos surfactantes catiónicos (Labat-Moleur et al., 1996; Meager, 1999).
[7] O desenvolvimento de novos lípidos para aplicação em Terapia Génica, dá-se essencialmente através do teste empírico de compostos nunca antes utilizados para esse fim, cada um dos quais sendo analisado para uma aplicação particular. Depois da descoberta inicial de Felgner e seus colaboradores, uma primeira vaga de investigação resultou na descoberta de numerosas moléculas, conforme referido em diversos documentos publicados: US5279833 (Rose, 1994), US6936469 (G. deJong, S.L.
Vanderbyl, 1998). Novos desenvolvimentos continuam a ser propostos na síntese de novos lípidos catiónicos para transfecção, como referido nos documentos US5651981 (Asley et al, 1997), WO2005033289 (R. MacDonald, L. Wang, 2005), onde é descrita a aplicação de misturas de lípidos catiónicos sintéticos
1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (EDOPC),
l,2-dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (EDLPC), e
l,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (EDMPC) em sistemas de transfecção sem indicação de lípidos adjuvantes. Num outro documento US7067697, (Xiang
Gao,2006), são apresentados vários lípidos catiónicos combinados com agentes bioactivos funcionais para aplicações farmacêuticas e onde DOPE
(dioleoil-fosfatidil-etanolamina) e colesterol são identificados como lípidos adjuvantes.
[8] Tem sido demonstrado que a adição de lípidos neutros adjuvantes à formulação dos lipoplexos promovem um aumento na taxa de libertação do DNA e na eficiência de transfecção, quer pela promoção do processo de fusão dos lipoplexos de maiores dimensões com a membrana celular, quer pela intensificação do processo de en- docitose com lipoplexos de dimensões reduzidas (M.R. Almofti et al., 2003).
[9] No entanto, dependendo do tipo e propriedades da linha celular utilizada, o mesmo sistema de lipofecção pode apresentar eficiências de transfecção muito diferentes, o que tem justificado a constante necessidade de procura de novas formulações adaptadas a cada tipo de célula.
[10] De vários documentos publicados até à data, os lípidos adjuvantes mais frequentemente citados são o DOPE, o colesterol e seus derivados (US5888821 - R.
Reszka, 1999; e US7001614 - N. Smyth-Templeton e G.N. Pavlakis, 2006).
[11] Estes adjuvantes, apesar de, num modo geral promoverem o processo de transfecção, mostraram ser apenas um dos vários factores que condicionam a eficiência de transfecção, uma vez que o próprio tipo de célula a transfectar pode ser determinante na eficiência do processo. Além disso, parâmetros como o tamanho e o tipo de estrutura dos complexos parecem ser igualmente importantes no desenvolvimento de um sistema de transfecção, uma vez que acabam por condicionar o grau de biofun- cionalidade, biocompatibilidade e toxicidade dos sistemas. Todos estes factores ajudam a explicar a razão pela qual uma eficiência elevada de complexação de DNA não está necessariamente associada a uma alta taxa de transfecção.
[12] Recentemente, o tensioactivo sintético Brometo de
Dioctadecildimetilamónio(DODAB)(Fig.l) foi utilizado pelos próprios autores da presente invenção em conjugação com um lípido natural de baixo valor comercial (Monooleína), para desenvolver sistemas vesiculares que demonstraram ser capazes de complexar eficientemente DNA comercial (Silva et al., 2008). No entanto, à semelhança do que já foi verificado em muitos outros sistemas vesiculares (C. Esposito et al., 2006)) e do já referido anteriormente, altas eficiências de complexação de DNA não estão necessariamente associadas a taxas elevadas de transfecção.
[13] A Monooleína, 1-monooleoil-rac-glicerol (MO) - Fig.2. é um lípido neutral anfifílico de origem natural que apresenta a particularidade de possuir duas fases cúbicas bicontínuas invertidas, mesmo em excesso de H20 (< 90% w/w), como se pode verificar no seu diagrama de fase, representado na Fig. 3 (Lipowsky et al,1995). A existência de diversas fases não-lamelares, acrescida do seu baixo valor comercial, indicam que o composto Monooleína se apresente como um potencial candidato a lípido adjuvante.
[14] A estrutura dos complexos lípidos/DNA depende fortemente da proporção lípido catiónico:DNA, assim como da proporção lípido catiónico: lípido neutral (May et al., 2004). Além disso, a própria formação dos lipoplexos é dependente do método de preparação dos lipossomas, assim como do procedimento utilizado para complexar o DNA com os vesículos catiónicos (Simões et al., 2005). É também reconhecido que a ordem de adição dos lípidos e DNA tem um efeito crítico nas propriedades físicas e na actividade biológica dos lipoplexos resultantes (Tranchant et al., 2004). Desta forma, do conhecimento da eficiência da monooleína na complexação do DNA (Silva e tal., 2008) não resulta óbvia a sua aplicação em transfecção.
[15] Até ao momento, não foi descrita a utilização de Monooleína como lípido adjuvante em sistemas de lipofecção, isto apesar do seu reduzido valor comercial e da sua baixa citotoxicidade, como é proposto agora nesta nova invenção. A monooleína apenas parece referida como fazendo parte de formulações que utilizam o encapsulamento do DNA em lipossomas, e não por lipofecção via complexação [WO2003/057190 (2003)]. A aplicação da monooleína como adjuvante traz ainda a vantagem adicional de poder ser aplicada em diferentes tipos de células.
[16] O documento US6074667(Paavo Kinnunem et al; 1998) menciona métodos de
transfecção utilizando como vectores não-virais lipidos catiónicos derivados de es- fingosinas, utilizando um primeiro lipido adjuvante DOPE e como segundo lipido adjuvante selecionado dos diacyl glycerois em células KK-1.
[17] Contrariamente à monooleína que pertence à classe dos monoacilgliceróis, os
diacilgliceróis têm duas caudas hidrofóbicos, sendo por isso semelhantes aos lípidos adjuvantes habituais (DOPE).
Breve Descrição das Figuras
[18] Fig.1 - Representação química da molécula Brometo de Dioctadecildimetilamónio (DODAB).
[19] Fig.2 - Representação química da molécula 1-monooleoil-rac-glicerol (Monooleína).
[20] Fig.3 - Diagrama de fase da molécula 1-monooleoil-rac-glicerol (Monooleína), contendo diferentes estruturas de organização: estrutura Lamelar (La; Lp); estrutura Não-Lamelar Hexagonal Invertida (Hn) e estrutura Não-Lamelar Cúbica Invertida (Qn )·
[21] Fig.4 - Representação gráfica da análise da eficiência de transfecção de diferentes formulações DNA/lípido na linha celular 293T.
[22] Fig.5 - Representação gráfica da análise da citotoxicidade de diferentes formulações DNA/lípido na linha celular 293T.
Descrição Geral da Invenção
[23] A presente invenção descreve o uso de sistemas lipídicos catiónicos compostos por surfactantes catiónicos derivados de dioctadecildimetilamónio (DODAX) e pelo ten- sioactivo neutral 1-monooleoil-rac-glicerol (Monooleína), na complexação e transporte de DNA, e como veículo de transformação genética em células. A Monooleína, 1-monooleoil-rac-glicerol (MO), é um lípido neutral anfifílico de origem natural que apresenta a particularidade de possuir duas fases cúbicas bicontínuas invertidas, mesmo em excesso de H20 (< 90% w/w), como se pode verificar no seu diagrama de fase, representado na Fig. 3 (Lipowsky et al., 1995). A existência de diversas fases não-lamelares, acrescida do seu baixo valor comercial, indicam que o composto Monooleína se apresenta como um potencial candidato a lípido adjuvante em sistemas de lipofecção.
[24] A complexação do DNA, determinada pela atracção electrostática entre os grupos amónia carregados positivamente do surfactante sintético Dioctadecildimetilamónio (DODAX) e o esqueleto de fosfatos negativos do DNA plasmídico, provoca a condensação da estrutura, dando origem a complexos DNA/Lípido vulgarmente conhecidos por lipoplexos, e que neste caso contêm também o lípido neutro
Monooleína.
[25] A inclusão de Monooleína na constituição do lipoplexo confere a este propriedades completamente distintas, devido ao facto dos monoacilgliceróis apresentarem um padrão de curvatura distinto do surfactante catiónico utilizado.
[26] A diminuição da rigidez estrutural dos vesículos de Dioctadecildimetilamónio
(DODAX) provocada pela adição de Monooleína, aumenta a mobilidade lateral da cadeia lipídica, o que acaba por promover a interacção membrana- lipoplexo, favorecendo assim o processo de transfecção.
Descrição Detalhada da Invenção
[27] Sendo aplicáveis razões molares monooleína:lípido catiónico entre 0.1 e 0.9, um modelo de realização da invenção consiste na aplicação da formulação com razão molar lípido catiónico Brometo de Dioctadecildimetilamónio (DODAB):lípido adjuvante (Monooleína) 2: 1, em razões de carga (+/-) distintas (2: 1 e 4: 1), de entre as possíveis (de 1: 1 a 4: 1), correspondendo a diferentes concentrações de grupos amónio positivos de Brometo de Dioctadecildimetilamónio (DODAB) para a mesma concentração de grupos fosfato negativos (DNA).
[28] A eficiência relativa dos sistemas (quer ao nível da sua taxa de transfecção e do seu grau de citotoxicidade) foi aferida por comparação directa com um sistema comercial de lipofecção (Lipofectamina®), nas condições indicadas pelo fabricante (Invitrogen).
[29] A eficiência de transfecção foi determinada através da medição da actividade da enzima repórter β-galactosidase (Absorvância a 420nm) (Fig. 4). O nível de citotoxicidade foi determinado através da medição da actividade da enzima Lactato Desidrogenase (Absorvância a 340nm) (Fig. 5).
[30] No exemplo apresentado, a utilização de diferentes razões de carga (+/-) (2: 1 e 4: 1) para o sistema DODAB:MO (2: 1), prendeu-se com a necessidade de determinar a concentração mínima de lípido que permitisse obter uma taxa máxima de transfecção, sem que isso representasse um acréscimo de toxicidade para as próprias células.
[31] Na formulação lipídica testada, muito embora fosse esperado que a razão de carga
(+/-) 4: 1 apresentasse uma eficiência de transfecção mais elevada que a razão de carga (+/-) 2: 1 (devido à maior concentração de agente de lipofecção), o mesmo não se veio a verificar experimentalmente (Fig. 4), devido ao acréscimo de citoxicidade verificado às 48 horas (5% para 7% nas razões de carga (+/-) 2: 1 e 4: 1, respectivamente) (Fig. 5). De referir que o sistema comercial (Lipofectamina) apresenta um nível de citotoxicidade (7%), superior ao do sistema DODAB :MO (2: 1), para a razão de carga (+/-) 2: 1.
[32] Em todo o caso, a demonstração de que a formulação DODAB: Monooleina (2: 1) em razões de carga (+/-) distintas, apresentam eficiências de transfecção comparáveis (r.c. (+/-) 2: 1) e mesmo superiores (r.c. (+/-) 4: 1) ao sistema comercial, mostram que o modelo da invenção é efectivo em concentrações variáveis de lípido e DNA.
[33] Esta versatilidade pode vir a revelar-se útil na aplicação do sistema de lipofecção noutro tipo de linhas celulares em que a razão de carga (+/-) 2:1 seja menos eficiente que as restantes, e em que outras condições de transfecção sejam requeridas para aumentar a eficiência do processo.
Preparação dos lipossomas catiónicos mistos
[34] Para a preparação das soluções lipossomais mis-tas, volumes definidos das soluções stock de Brometo de Dioctadecildimetilamónio (DODAB) e Monooleina em etanol (20 mM) foram injectadas sob forte agitação a uma solução-tampão aquosa a 70°C (30 mM Tris-HCl). Uma concentração final de lípido (DODAB + Monooleina) de 1 mM foi obtida para a razão molar lípido catiónico (DODAB) :lípido adjuvante (Monooleina) 2: 1. Preparação dos lipoplexos catiónicos
[35] Os lipoplexos catiónicos foram preparados através da adição de volumes definidos de soluções lipossomais mistas (concentrações variáveis de grupos amónia positivos) a um volume constante de solução de DNA (concentração fixa de grupos fosfato negativos = número de poços x ^g DNA/poço). Diferentes volumes de meio Opti- mem I foram utilizados para perfazer um volume total constante de solução nas várias formulações e razões de carga (+/-) testadas (100μΙ7ροςο). Os lipoplexos resultantes foram incubados à temperatura ambiente durante 30 min sem agitação.
[36] O material genético introduzido na célula foi o plasmídeo pSV^-gal (Invitrogen), que foi amplificado pela estirpe competente Escherichia coli DHB4. O isolamento e purificação do DNA foi feito utilizando o Kit de extracção 'Wizard® Plus Midipreps DNA Purification System', comercializado pela empresa Promega. A concentração final de DNA (1.75μg/μL) foi medida pela absorvância a 260 nm num
espectrofotómetro Shimadzu UV-3101-PC.
Cultura de células
[37] Para ensaios de transfecção e de análise de citotoxicidade, células da linha celular 293T foram cultivadas em frascos T75cm3 com meio DMEM suplementado com L- glutamina (4 mM), bicarbonato de sódio (1.5 g/L), glucose (4.5 g/L), soro fetal de bovino (10% v/v) e antibiótico (1 uni/ml). As células foram regularmente sub- cultivadas entre as passagens 18 e 24, sendo sempre mantidas a confluências inferiores a 90% (37°C e 5% C02).
Lipofecção
[38] Doze horas antes da transfecção, cada frasco T75cm3 foi lavado uma vez com
solução PBS (IX) e as células foram desaderidas através da adição de solução de tripsina 0.05% (3 min incubação a 37°C e 5% C02). O número de células viáveis foi quantificado num hemocitómetro pelo método de exclusão do azul de tripano. As células foram ressuspendidas em volume apropriado de meio DMEM suplementado para obter a densidade de 2xl05 células/poço, transferidas para placas de
24-Multipoços num volume final de 500 μΐ/poço (cerca de 50-80% confluência no dia da transfecção).
[39] No dia da transfecção, o meio de cultura foi substituído por meio DMEM fresco, e os lipoplexos recém-preparados (ver secção 'Preparação dos Lipoplexos Catiónicos') foram adicionados homogeneamente a cada poço, num volume que não excedeu 20% do volume final (1 μg DNA/poço). As células foram então novamente incubadas a 37°C e 5% C02, durante 24h-48h. A eficiência de transfecção foi determinada através do nível de expressão do gene repórter (β-galactosidase). A citotoxicidade foi medida através da quantificação intra e extracelular da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) nas amostras analisadas.
Análise da eficiência de transfecção (ensaio de actividade da enzima β- galactosidase)
[40] Para determinar a eficiência de transfecção, as células recém-incubadas (24h-48h) foram lavadas duas vezes com PBS (IX) e lisadas durante 15 min com solução-tampão de lise (RLB IX). As células foram então recolhidas e centrifugadas durante 2min a 14000rpm para remover os restos celulares. A actividade da enzima β-galactosidase nas diversas amostras (em unidades arbitrárias de fluorescência, a.u.) foi determinada com o kit de expressão 'β-galactosidase Enzyme Assay System with Repórter Lysis Buffer' de acordo com instruções do fabricante (1 μΐ de extracto celular + 49 μΐ de solução RLB IX + 50 μΐ de solução Assay 2X + 150 μΐ de solução de carbonato de sódio para parar a reacção colorimétrica), com leitura a absorvância 420 nm em placa 96-Multipoços num leitor de microplacas SpectraMax 340PC.
Análise do nível de citotoxicidade (ensaio de actividade da enzima Lactato
Desidrogenase)
[41] Para determinar o nível de citotoxicidade nos sistemas analisados, foram quantificados os níveis intra- e extracelulares da enzima Lactato Desidrogenase. A recolha do meio de cultura em cada poço permitiu a posterior quantificação da LDH ex- tracelular. Para obter o valor da LDH intracelular, procedeu-se à lavagem dos poços com 500 μΐ de solução-tampão Tris-HCl (15mM), seguida de raspagem mecânica e lise da amostra celular por 3 períodos de sonicação de 30seg. Ambas as amostras obtidas (intra- e extracelular) foram centrifugadas durante lmin a 13000rpm para remover os restos celulares. A actividade intracelular da enzima LDH foi determinada [10 μΐ de amostra intracelular + 250 μΐ de solução NADH (0.31 mM) + 10 μΐ de solução de piruvato (8.96 mM) para parar a reacção colorimétrica] em placa 96-Multipoços num leitor de microplacas SpectraMax 340PC (absorvância a 340 nm).
[42] A actividade extracelular da enzima LDH foi também medida [40 μΐ de amostra intracelular + 250 μΐ de solução NADH (0.31 mM) + 10 μΐ de solução de piruvato (8.96mM) para parar a reacção colorimétrica] em placa 96-Multipoços num leitor de microplacas SpectraMax 340PC (absorvância a 340 nm).
[43] O balanço entre a actividade intra- e extracelular da enzima LDH, permite a
determinação da taxa de sobrevivência celular.
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Claims

Claims
Sistema de lipofecção, contendo ácidos nucleicos complexados, caracterizado por ser constituído por:
- lípido catiónico derivado de dioctadecildimetilamónio (DODAX)
- lípido adjuvante monooleína
- lípido adjuvante colesterol ou seus derivados
Sistema de lipofecção, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a monooleína se encontrar em fracção molar compreendida entre 0.1 e 0.9 relativamente ao lípido catiónico. Sistema de lipofecção de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por a razão de carga lípido catiónico/ácido nucleico estar compreendida entre 1: 1 e 4: 1.
Utilização do sistema de lipofecção, descrito nas reivindicações 1 a 3, caracterizada por permitir a transfecção de linhas celulares de mamíferos com DNA e RNA de estrutura linear ou circular, de cadeia simples ou dupla.
Utilização do sistema de lipofecção, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por se proceder do seguinte modo:
- o sistema DODAX+monooleína mistura-se com ácido nucleico, deixa-se complexar à temperatura ambiente durante um intervalo igual ou superior a 30 minutos, em meio de cultura preferencialmente com baixo teor de soro de bovino, sendo posteriormente colocado sobre as células em cultura.
Utilização do sistema de lipofecção, de acordo com as
reivindicações 4 e 5, caracterizada por se destinar à utilização nas áreas de Biologia Molecular e Terapia Génica, ou outras áreas da Saúde ou investigação clínica.
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