WO2010023346A1 - Compuestos híbridos tripirrol-octaarginina y su uso como medicamento, en el tratamiento del cáncer y de enfermedades microbianas. - Google Patents

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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • Tripirrol-octaarginine hybrid compounds and their use as a medicine, in the treatment of cancer and microbial diseases.
  • the present invention relates to a compound formed by a tripyrrole group attached to a polyarginine peptide.
  • it refers to its method of obtaining and its uses, since said compound allows efficient cellular internalization and promotes greater affinity for DNA.
  • MGBLs DNA groove-binding ligands
  • the present invention aims to solve the problem of the difficulty of certain agents that interact with DNA in crossing cell membranes and rapidly reaching the cell nucleus, as well as improving interaction with DNA without loss of selectivity.
  • the present invention relates to the conjugation of a recognition element of the minor groove of the tripirrolic type DNA with polyarginine fragments in order to obtain agents that interact with " ⁇ n vivo" DNA quickly and efficiently (FIG one ).
  • FOG one agents that interact with " ⁇ n vivo" DNA quickly and efficiently
  • a series of peptide-tripyrrole hybrids were prepared, as well as controls without tripyrrole and without the polyarginine peptide, and a fluorophore group was incorporated into the molecules in order to monitor the internalization process cell by analysis with a fluorescence microscope. Internalization assays were performed on live HeLa cells.
  • a first aspect of the present invention refers to a compound comprising a recognition element of the minor groove of the tripirrolic type DNA linked to a polyarginine peptide, more specifically the octaarginine ((Arg) 8 ).
  • This union is produced by means of a spacer group comprising at least one lysine (Lys) by which the tripyrrole is attached. (From now on we will call them compounds of the invention).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) As a recognition element of the minor groove of the DNA or ligands of the minor groove of the DNA (DNA minor groove-binding ligands or MGBLs) there are known a series of compounds that exhibit a series of antitumor, antimicrobial, antiviral and antiprotozoal properties. It is known that the structures containing an imidazole and a pyrrole, of the type of the heterocyclic polyamide Distamycin can bind to the minor groove of the double helix, preferably in areas rich in AT, increasing the twisting of the double helix, inducing a positive supercoiling and interfering in both replication and transcription.
  • the DNA binding is partly due to the fact that the amide hydrogens of the N-methylpyrrolcarboxamides form hydrogen bonds bifurcated with the N 3 atoms of the adenine and O 2 of the thymidine in the minor groove (Koopka et al., 1985. Proc Nati. Acad. Sci. 82: 1376; Koopka et al., 1985. J. Mol. BIoI. 183: 553). Pyrrole rings completely fill the groove, excluding the guanine amino group from the G 1 C base pairs, while establishing van der Waals forces with the groove walls, showing affinity for the A and T rich sequences (Taylor et al., 1985. Tetrahedron 40: 457; Schultz & Dervan. 1984. J. Biomol. Struct. Dyn. 1: 1133).
  • this compound was linked to a fluorophore group, so that in a preferred embodiment of the invention, this compound can be in turn linked to a fluorophore group, preferably fluorescein (FIu).
  • FIu fluorescein
  • tripyrrole has the general formula (I):
  • Ri is a substituent that may be the same or different in each case and is independently selected from the list comprising H. an alkyl group (Ci-C ⁇ ) or an acyl group; R 2 is a substituted alkyl group of the general formula (HA):
  • Ri is defined as above and n takes values between 1 and 6, preferably 3, 4 and 5, and R4 is a substituent that can be the same or different in each case and is independently selected from the list comprising H, or an alkyl group (Ci-C ⁇ ), preferably a methyl.
  • R 3 is a substituted alkyl group of general formula (III):
  • Ki and n are defined as above.
  • Ri is the same or different in each case and is independently selected from the list comprising H, a (C 1 -C 3 ) alkyl group, preferably methyl or an acetyl group. More preferably the tripyrrolic compound is as follows:
  • alkyl cited as a substituent of Ri refers in the present invention to aliphatic, linear or branched chains, having 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkyl group has between 1 and 3 carbon atoms, for example, methyl, ethyl or n-propyl.
  • the spacer of the present invention is a structure composed of at least one amino acid lysine (Lys), to which the tripirrol and 6-aminohexanoic acid groups (Ahx) will be attached, where the peptide and / or the fluorophore in case this is included.
  • Lys amino acid lysine
  • Ahx 6-aminohexanoic acid groups
  • the spacer is of the type (Lys-Ahx) or (Ahx-Lys-Ahx), the latter would present the following formula (IV):
  • the compound is that of formula 6A or any of its salts or isomers:
  • the compound is that of formula 1A or any of its salts or isomers, similar to compound 6A, and incorporating the fluorophore group in its structure:
  • the DNA minor groove binders (MGBLs) compounds constitute an important class of derivatives in antitumor therapy, being of intrinsic interest due to their biological and medical properties.
  • the recognition strategy could be applicable for obtaining new regulatory agents for genetic processes with clinical possibilities.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one compound of the invention, as described above, or any of its
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) combinations, in therapeutically effective amount, or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, solvate or stereoisomer thereof together with a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant or vehicle, for administration to a patient.
  • a pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • the expression “therapeutically effective amount” refers to the amount of the agent or compound capable of developing the therapeutic action determined by its pharmacological properties, calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, due to the characteristics of the compounds, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • the solutions for intravenous injection or infusion may contain as a vehicle, for example, sterile water or, preferably, may be in the form of sterile isotonic aqueous saline solutions.
  • the suspensions or solutions for intramuscular injections may comprise, together with the active compound, a pharmaceutically acceptable carrier, for example sterile water, olive oil, ethyl oleate, glycols, for example propylene glycol, and, if desired, a suitable amount of Lidocaine Hydrochloride
  • the active component can be mixed with conventional oleaginous excipients or emulsifiers.
  • Solid oral forms for example tablets and capsules, may contain, together with the active compound, diluents, for example lactose, dextrose, sucrose, cellulose, corn starch and potato starch; lubricants, for example silica, talc, stearic acid, stearate
  • SUBSTITUTE SHEET magnesium or calcium and / or polyethylene glycols
  • binding agents for example starches, gums, gelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose and polyvinylpyrrolidone
  • disintegrating agents for example starch, alginic acid, alginates and sodium and starch glycolate; effervescent mixtures; dyes; sweeteners; wetting agents, for example lecithin, polysorbates and lauryl sulfates, and, in general, non-toxic and pharmacologically inactive substances used in the pharmaceutical formulation.
  • Said pharmaceutical preparation can be manufactured by known techniques, for example by means of mixing, granulation, tabletting, sugar coating or film coating procedures.
  • said therapeutic composition is prepared in the form of a solid form or aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention can be administered by any appropriate route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of any of the compounds described or the pharmaceutical compositions that include them for the preparation of a medicament.
  • the compounds of the invention are useful as antineoplastic and antimicrobial agents. Specifically, they show cytostatic properties towards tumor cells, so that they can be useful for inhibiting the growth of certain tumors in mammals, including humans, such as, for example, carcinomas, such as breast carcinoma, lung carcinoma, carcinoma of bladder, colon carcinoma and ovarian and endometrial tumors. Other malignancies in which the pharmaceutical compositions of the present may find application
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
  • the invention is, for example, sarcomas, such as soft tissue and bone sarcoma, and hematological malignancies, such as, for example, leukemia.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention is the use of any of the compounds described or of the pharmaceutical compositions that include them for the preparation of a medicament for the treatment of cancer.
  • Part of this preferred embodiment is a combined method for treating cancer or improving the conditions of mammals, including humans, suffering from cancer, the method of which is to administer at least one compound of the invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a additional antitumor agent, sufficiently close in time and in sufficient quantities to produce a therapeutically useful effect.
  • Antineoplastic agents are substances that prevent the development, growth, and / or proliferation of malignant tumor cells
  • antitumor agent is intended to include both a single antitumor drug and “cocktails”, that is, a mixture of said drugs, according to clinical practice.
  • the compounds of the invention also show a remarkable effectiveness in the interference with the reproductive activity of pathogenic viruses and protect the tissue cells against viral infections.
  • they show activity against DNA viruses such as, for example, herpes, for example herpes simplex virus and herpes zoster, vaccinia virus, RNA viruses such as, for example, Rhinovirus and Adenovirus, and against retroviruses such as, for example, sarcoma virus, for example murine sarcoma virus, and leukemia virus, for example Friend leukemia virus.
  • DNA viruses such as, for example, herpes, for example herpes simplex virus and herpes zoster
  • RNA viruses such as, for example, Rhinovirus and Adenovirus
  • retroviruses such as, for example, sarcoma virus, for example murine sarcoma virus, and leukemia virus, for example Friend leukemia virus.
  • another preferred embodiment of this aspect of the invention is the use of any of the compounds described or of the
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) pharmaceutical compositions that include them for the preparation of a medicament for the treatment of viral microbial diseases.
  • the tripirrolic system by allowing a strong interaction with DNA facilitates the anchoring of hybrids in the core chromosomes. That is, the rapid intranuclear accumulation, in particular of the compounds of formula 1A (triprirrol-oligoarginine), is due to the cooperative action of both fragments, the oligoarginine and the minor groove binding molecule of DNA (tripirrol).
  • the interaction is selective for DNA sites that contain at least 4 adenines or thymines in a row.
  • FIG. 1. Shows the operation of the conjugates of triproles with polyarginines to induce cellular intemalization and increase affinity.
  • FIG. 2.- Shows the intracellular distribution of the different hybrids in HeLa cells. The exposure times were different for each sample due to the variations observed in the total emission as
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) result of the different internalization efficiencies.
  • FIG. 3 PAGE of the interaction of peptide 6 with a double stranded oligonucleotide with the ATTTT sequence.
  • Lanes 1 -10: [6] O 1 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25 nM.
  • Ahx 6-aminohexanoic.
  • EXAMPLE 1 Preparation of the tripirrol-peptide compound and internalization tests.
  • a series of peptide-tripyrrole 1A-5A hybrids were prepared, as well as controls without tripyrrole (1B-4B).
  • a fluorophore group was incorporated into the molecules to be able to track the process of cellular internalization by analysis with a fluorescence microscope. The synthesis of the molecules was performed using solid phase methodologies.
  • Nternalization assays were performed on live HeLa cells, recording fluorescence images at 30 min, 90 min and 3 h. As shown in Figure 2 (FIG. 2), the incubation of cells with the conjugate octaarginina tripyrrole-1 A for 90 min at 37 0 C resulting in a homogeneous and intense signal fluorescence in the cell nucleus. Later it was observed that this signal was already observed at 30
  • hybrid 2A that contains as a peptide fragment a nuclear localization signal (NLS) instead of the polyarginine
  • NLS nuclear localization signal
  • the fluorescence signal that is observed after the incubation is also located in the cell nucleus; however, the intensity of the signal is lower than in the case of hybrid 1A, probably due to the lower capacity of cytoplasmic nternalization inherent in this sequence.
  • the 3A conjugate similar to 2A but with a mutation in the NLS, was not efficiently internalized, as evidenced by the low fluorescence observed inside the cells.
  • the product appears uniformly distributed by the cell cytoplasm, which is consistent with the loss of nuclear signaling capacity of the mutated NLS.
  • Control peptides that do not possess the tripyrrolic fragment are not able to reach the nucleus of the cells. Particularly relevant is the case of peptide 1B, which is analogous to 1A, but without tripyrrole. As observed in Figure 2 (FIG. 2), the fluorescence is intense, but is located exclusively in the cytoplasm.
  • hybrid 6 was used, similar to 1A but devoid of the fluoroforo group. This showed an affinity for very high adenine-rich DNA sequences, around 6 nM at room temperature (FIG. 3). In addition, the interaction is selective for DNA sites that contain at least 4 adenines or thymines in a row.
  • the peptides were synthesized manually on a 0.1 mmol scale following the standard peptide synthesis protocols by means of the Fmoc / tBu strategy.
  • a PAL-PEG resin (0.19 mmol / g) was used. Each amino acid was activated for 2 min in DMF prior to its addition on the unprotected resin.
  • the peptide bond formation reaction was allowed to run a minimum of 45 min until the TNBS test was negative.
  • the deprotection of the temporary group Fmoc was carried out by treating the resin with 20% piperidine in DMF for 15 min.
  • the final peptides were obtained after the deprotection / release of the resin by treatment with the standard TFA deprotection cocktail, as specified below.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 5 mL of DMF, 2 x 5 ml_ x 2 min), DMF (3 x 5 mL x 2 min) and CH 2 CI 2 (3 x 5 ml_ x 2 min).
  • Deprotection / release of the resin The synthesized peptide, still bound to the resin is dried under a stream of nitrogen and treated cold with the deprotection cocktail (50 ⁇ L CH 2 CI 2 , 25 ⁇ l_ water, 25 ⁇ l_ TIS and TFA up to 1 mL for 40 mg of resin). Cysteine-containing peptides were deprotected using the specific alternative cocktail: 25 ⁇ L EDT, 25 ⁇ L water, 10 ⁇ L TIS and TFA up to 1 mL, for every 40 mg of resin. The suspension resulting from adding the deprotection mixture to the resin was stirred for 2 h at rt.
  • the resin was washed with DMF (2 x 5 mL) and the Alloc group was deprotected following the previously detailed procedure
  • the resulting peptidyl resin was subjected to the standard deprotection / release and purification procedure to give compounds 1B-5B
  • the peptidyl resin was coupled to the unit of aminotripyrrole to synthesize derivatives 1A-5A
  • the resin was suspended in DMF (1 mL) and stirred for 30 min to expand it conveniently.
  • the DMF was filtered and DIEA (0.5 M was added to the resin) in DMF, 8 equiv), DMAP (2 equiv in DMF) and ⁇ /, ⁇ / '- disuccinimidyl bicarbonate (15 equiv).
  • This compound was obtained by coupling the corresponding peptide that includes a cistern, with the cysteine-ortaarginine peptide previously activated by reaction with DTNB (Ellman reagent).
  • the coupling reaction was carried out in 100 mM Tris-HCI buffer, 1 M NaCl, pH 7.5, stirring the mixture at room temperature for 45 min.
  • the majority product was purified by HPLC following standard conditions and identified by mass spectrometry as the heterodimeric hybrid containing the desired disulfide bridge.

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Abstract

Compuestos híbridos tripirrol-octaarginina. Híbridos formados por un grupo tripirrol unido a un péptido de poliarginina que permiten la internacionalización celular eficiente y promueve una mayor afinidad por el ADN. Su método de obtención y sus usos.

Description

Compuestos híbridos tripirrol-octaarginina y su uso como medicamento, en el tratamiento del cáncer y de enfermedades microbianas.
COMPUESTOS HÍBRIDOS TRIPIRROL-OCTAARGININA
La presente invención se refiere a un compuesto formado por un grupo tripirrol unido a un péptido de poliarginina. Además, se refiere a su 5 método de obtención y sus usos, puesto que dicho compuesto permite Ia internalización celular eficiente y promueve una mayor afinidad por el ADN.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
10
Una de las estrategias moleculares de mayor interés para el desarrollo de agentes antibióticos o antitumorales se basa en Ia interacción de determinadas moléculas con zonas específicas del ADN (L. Strekowski, Mutation Res. 2007, 623, 3-13)
15
Algunas de estas moléculas se encuentran en fase de ensayo clínico, y otras, como las antraciclinas o Ia bleomicina, ya se vienen utilizando en clínica desde hace años.
20 La mayoría de los DNA minor groove-binding ligands (MGBLs) presentan dificultad para atravesar las membranas celulares y alcanzar de forma eficiente el núcleo celular. Así, por ejemplo, poliamidas basadas en el antibiótico Distamicina A, a pesar de que son capaces de interaccionar con secuencias específicas del ADN, experimentan procesos de
25 internalización celular muy lentos, y dependientes de su estructura. (N.G. Nickols, CS. Jacobs. M. E. Farkas, P.B. Dervan, Nucleic Acids Res. 2007. 35, 363-370; Edelson, T.P. Best, B. Olenyuk, N.G. Nickols, R.M. Doss. S. Foister, A. Heckel, P.B. Dervan, Nucleic Acids Res. 2004, 32, 2802-281)).
30 En este sentido algunos documentos del estado de Ia técnica, por ejemplo Ia solicitud de patente WO2008043366, que se refieren a compuestos para el transporte de agentes biológicos a través de membrana. Algunos de estos compuestos son péptidos cationicos.
35
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención pretende solucionar el problema de Ia dificultad de ciertos agentes que interaccionan con ADN en atravesar las membranas celulares y alcanzar de forma rápida el núcleo celular, así como mejorar Ia interacción con el ADN sin pérdida de selectividad. Para ello, Ia presente invención se refiere a Ia conjugación de un elemento de reconocimiento del surco menor del ADN de tipo tripirrólico con fragmentos de poliarginina con el fin de obtener agentes que interaccionan con ADN "¡n vivo" de forma rápida y eficiente (FIG 1 ). Con el fin de estudiar relaciones estructura-función se prepararon una serie de híbridos péptido-tripirrol, así como controles sin el tripirrol y sin el péptido de poliarginina, y se incorporó un grupo fluoróforo en las moléculas para poder realizar el seguimiento del proceso de internalización celular mediante análisis con un microscopio de fluorescencia. Los ensayos de internalización se realizaron en células HeLa vivas.
Los resultados, que se aportan en el apartado de ejemplos, demuestran como Ia conjugación de un tripirrol a octaargininas permiten una intemalización celular eficiente y una localización muy rápida en el núcleo celular. La presencia de Ia región peptídica básica provoca un aumento muy destacable en Ia afinidad del sistema por secuencias de ADN ricas en adeninas (más de 100 veces con respecto al tripirrol solo). El funcionamiento de estos conjugados se fundamenta en Ia sinergia entre el elemento de reconocimiento específico (tripirrol) y el fragmento peptídico, que no solo facilita el transporte celular sino que también promueve una mayor afinidad por el ADN.
Por todo ello, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a un compuesto que comprende un elemento de reconocimiento del surco menor del ADN de tipo tripirrólico unido a un péptido poliarginina, más concretamente Ia octaarginina ((Arg)8). Esta unión se produce por medio de un grupo espaciador que comprende, al menos, una lisina (Lys) por Ia que se une el tripirrol. (A partir de ahora los denominaremos compuestos de Ia invención).
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Como elemento de reconocimiento del surco menor del ADN ó ligandos del surco menor del ADN (DNA minor groove-binding ligands ó MGBLs) se conocen una serie de compuestos que exhiben una serie de propiedades antitumorales, antimicrobianas, antivirales y antiprotozoo. Se conoce que las estructuras que contienen un imidazol y un pirrol, del tipo de Ia poliamida heterocíclica Distamicina pueden unirse al surco menor de Ia doble hélice, preferentemente en zonas ricas en AT, aumentando Ia torsión de Ia doble hélice, induciendo un superenrollamiento positivo e interfiriendo tanto en Ia replicación como en Ia transcripción. La unión al ADN se debe en parte a que los hidrógenos amida de las N- metilpirrolcarboxamidas forman puentes de hidrógeno bifurcados con los átomos N3 de Ia adenina y O2 de Ia timidina en el surco menor (Koopka et al., 1985. Proc. Nati. Acad. Sci. 82:1376; Koopka et al., 1985. J. Mol. BIoI. 183:553). Los anillos de pirrol llenan completamente el surco, excluyendo el grupo amino de Ia guanina de los pares de bases G1C, mientras establecen fuerzas de van der Waals con las paredes del surco, mostrando afinidad por las secuencias ricas en A y T (Taylor et al., 1985. Tetrahedron 40:457; Schultz & Dervan. 1984. J. Biomol. Struct. Dyn. 1 :1133).
Con el fin de estudiar Ia internalización y Ia unión de este complejo con el ADN, se unió a un grupo fluoróforo, por Io que en una realización preferida de Ia invención, este compuesto puede estar unido a su vez a un grupo fluoróforo, preferiblemente fluoresceína (FIu).
En otra realización preferida de Ia presente invención, el tripirrol presenta Ia fórmula general (I):
Figure imgf000004_0001
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Donde, Ri es un sustituyente que puede ser igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente de Ia lista que comprende H. un grupo alquilo (Ci-Cβ) o un grupo acilo; R2 es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (HA):
^(CH2)- N R1 (II) o de fórmula general (MB):
Figure imgf000005_0001
(MB)
Donde Ri se define como anteriormente y n toma valores entre 1 y 6, preferiblemente 3, 4 y 5, y R4 es un sustituyente que puede ser igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente de Ia lista que comprende H, o un grupo alquilo (C-i-Cβ), preferentemente un metilo.
R3 es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (III):
Figure imgf000005_0002
(III)
Donde Ki y n se definen como anteriormente.
En una realización aún más preferida, Ri es igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente de Ia lista que comprende H, un grupo alquilo (C1-C3), preferiblemente metilo o un grupo acetilo. Más preferiblemente el compuesto tripirrolico es el siguiente:
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000006_0001
Donde * representa el sitio de unión con Ia lisina del espaciador.
El término "alquilo" citado como sustituyente de Ri se refiere en Ia presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 6 átomos de carbono. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 3 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo o n-propilo.
En cuanto al espaciador de Ia presente invención, se trata de una estructura compuesta por al menos un aminoácido lisina (Lys), al que se unirá el tripirrol y grupos ácido 6-aminohexanoico (Ahx), donde se unirá el péptido y/o el fluoróforo en caso de que este se incluya.
En una realización preferida, el espaciador es del tipo (Lys-Ahx) o (Ahx- Lys-Ahx), esta última presentaría Ia siguiente fórmula (IV):
Figure imgf000006_0002
(IV)
En una realización más preferida, el compuesto es el de fórmula 6A o cualquiera de sus sales o isómeros:
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000007_0001
En otra realización más preferida, el compuesto es el de fórmula 1A o cualquiera de sus sales o isómeros, similar al compuesto 6A, y que incorpora el grupo fluoróforo en su estructura:
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000008_0001
1A
La síntesis de estas moléculas se realizó usando metodologías en fase sólida, por Io que otro aspecto de Ia invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos descritos, que comprende los siguientes pasos:
a) síntesis de los péptidos mediante métodos Fmoc en fase sólida (fmoc- péptidos)
• desprotección temporal del grupo Fmoc
• acoplamiento de los aminoácidos
• desprotección selectiva del residuo usina • fraccionamiento y desprotección b) síntesis de los compuestos tripirrol-poliarginina
• acoplamiento del amino tripirrol al péptido, mientras este está todavía unido a Ia fase sólida y protegido.
• Eliminación de los grupos protectores y separación de Ia resina sólida
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) yPÉPTI DO— φ O— φ
FmocHN
Figure imgf000009_0001
— PÉPTIDO -NH2
Figure imgf000009_0002
Esquema general síntesis de compuestos sin fluoroforo
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000010_0001
Esquema general síntesis de compuestos con fluoroforo
Los compuestos DNA minor groove binders (MGBLs) constituyen una importante clase de derivados en Ia terapia antitumoral, siendo de interés intrínseco por sus propiedades biológicas y médicas. Además, Ia estrategia de reconocimiento podría ser aplicable para Ia obtención de nuevos agentes reguladores de procesos genéticos con posibilidades clínicas.
Así, otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de Ia invención, tal y como se ha descrito anteriormente, o cualquiera de sus
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) combinaciones, en cantidad terapéuticamente efectiva, o una sal, profármaco, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, para Ia administración a un paciente. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en Ia materia y utilizados habitualmente en Ia elaboración de composiciones terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar Ia acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo Ia edad, estado del paciente, Ia severidad de Ia alteración o trastorno, y de Ia ruta y frecuencia de administración.
Las soluciones para inyección o infusión intravenosa pueden contener como vehículo, por ejemplo, agua estéril o, preferiblemente, pueden estar en forma de soluciones salinas acuosas isotónicas estériles. Las suspensiones o soluciones para inyecciones intramusculares pueden comprender, junto con el compuesto activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo agua estéril, aceite de oliva, oleato de etilo, glicoles, por ejemplo propilenglicol, y, si se desea, una cantidad adecuada de clorhidrato de lidocaína.
En las formas para aplicación tópica, por ejemplo, cremas, lociones o pastas para uso en tratamiento dermatológico, se puede mezclar el componente activo con excipientes oleaginosos o emulsionantes convencionales.
Las formas orales sólidas, por ejemplo tabletas y cápsulas, pueden contener, junto con el compuesto activo, diluyentes, por ejemplo lactosa, dextrosa, sacarosa, celulosa, almidón de maíz y almidón de patata; lubricantes, por ejemplo sílice, talco, ácido esteárico, estearato de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) magnesio o de calcio y/o polietilenglicoles; agentes ligantes, por ejemplo almidones, gomas arábigas, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa y polivinilpirrolidona; agentes desintegrantes, por ejemplo almidón, ácido algínico, alginatos y glicolato de sodio y almidón; mezclas efervescentes; colorantes; edulcorantes; agentes humectantes, por ejemplo lecitina, polisorbatos y laurilsulfatos, y, en general, substancias no tóxicas y farmacológicamente inactivas usadas en Ia formulación farmacéutica. Dicha preparación farmacéutica puede ser fabricada por técnicas conocidas, por ejemplo por medio de procedimientos de mezcla, granulación, formación de tabletas, revestimiento de azúcar o revestimiento de película.
En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para Io cual dicha composición se formulará en Ia forma farmacéutica adecuada a Ia vía de administración elegida.
El uso de los compuestos de Ia invención es compatible con su uso en protocolos en que los compuestos de Ia invención, o sus mezclas se usan por sí mismos o en combinaciones con otros tratamientos o cualquier procedimiento médico.
Por tanto, otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de cualquiera de los compuestos descritos o de las composiciones farmacéuticas que los incluyen para Ia elaboración de un medicamento.
Los compuestos de Ia invención son útiles como agentes antineoplásicos y antimicrobianos. Concretamente, muestran propiedades citostáticas hacia las células tumorales, de tal forma que pueden ser útiles para inhibir el crecimiento de ciertos tumores en mamíferos, incluidos los humanos, tales como, por ejemplo, carcinomas, como el carcinoma mamario, el carcinoma pulmonar, el carcinoma de vejiga, el carcinoma de colon y los tumores de ovario y endometrio. Otras neoplasias en las que pueden hallar aplicación las composiciones farmacéuticas de Ia presente
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) invención son, por ejemplo, los sarcomas, como el sarcoma de tejidos blandos y de hueso, y las malignidades hematológicas, tales como por ejemplo, las leucemias. Así pues, una realización preferida de este aspecto de Ia invención, es el uso de cualquiera de los compuestos descritos o de las composiciones farmacéuticas que los incluyen para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Forma parte de esta realización preferida un método combinado para tratar el cáncer o mejorar las condiciones de mamíferos, incluidos los humanos, que sufren de cáncer, cuyo método consiste en administrar a menos un compuesto de Ia invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable y un agente antitumoral adicional, Io suficientemente próximos en el tiempo y en cantidades suficientes para producir un efecto terapéuticamente útil.
Los antineoplásicos son sustancias que impiden el desarrollo, crecimiento, y/o proliferación de células tumorales malignas
El término "agente antitumoral" pretende incluir tanto un fármaco antitumoral único como "cócteles", es decir, una mezcla de dichos fármacos, según Ia práctica clínica.
Los compuestos de Ia invención muestran también una notable efectividad en Ia interferencia con Ia actividad reproductora de virus patógenos y protegen las células tisulares frente a las infecciones víricas. Por ejemplo, muestran actividad frente a virus ADN tales como, por ejemplo, herpes, por ejemplo virus herpes simplex y herpes zoster, virus de Ia vaccinia, virus ARN tales como, por ejemplo, Rhinovirus y Adenovirus, y frente a retrovirus tales como, por ejemplo, virus del sarcoma, por ejemplo virus del sarcoma murino, y virus de Ia leucemia, por ejemplo virus de Ia leucemia de Friend. Así pues, otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, es el uso de cualquiera de los compuestos descritos o de las composiciones farmacéuticas que los incluyen para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades microbianas. Una realización aún más preferida de Ia invención es el uso de cualquiera de los compuestos descritos o de las
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) composiciones farmacéuticas que los incluyen para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades microbianas virales.
Por todo Io anteriormente citado y avalado por los resultados obtenidos y expuestos en el apartado de ejemplos, se puede afirmar que se produce una entrada eficiente en el núcleo celular de los compuestos, conjugados o híbridos que poseen Ia octaarginina y el tripirrol unidos covalentemente. (Se representa ilustrativamente en Ia FIG.1 )
Además, el sistema tripirrólico al permitir una interacción fuerte con el ADN facilita el anclaje de los híbridos en los cromosomas de núcleo. Es decir, Ia acumulación rápida intranuclear, en particular de los compuestos de fórmula 1A (triprirrol-oligoarginina), se debe a Ia acción cooperativa de ambos fragmentos, Ia oligoarginina y Ia molécula de unión al surco menor del ADN (tripirrol).
Además Ia interacción es selectiva para sitios de ADN que contengan al menos 4 adeninas o timinas seguidas.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1.- Muestra el funcionamiento de los conjugados de tripirroles con poliargininas para inducir Ia intemalización celular y el aumento de afinidad.
FIG. 2.- Muestra Ia distribución intracelular de los diferentes híbridos en células HeLa. Los tiempos de exposición fueron distintos para cada muestra debido a las variaciones observadas en Ia emisión total como
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) resultado de las diferentes eficiencias de internalización. Los tiempos de exposición fueron: 1A, 1 B, 4A = 1/18 s; 2A = 1/2 s; 5A = 1/6 s; 3A = 1 s.
FIG. 3. PAGE de Ia interacción del péptido 6 con un oligonucleótido de doble cadena con Ia secuencia ATTTT. Calles 1 -10: [6]= O1 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25 nM. Ahx = 6-aminohexanoic.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto Ia especificidad y efectividad de los compuestos de Ia invención.
EJEMPLO 1.- Preparación del compuesto tripirrol-péptido y ensayos de internalización. Con el fin de estudiar relaciones estructura-función se prepararon una serie de híbridos péptido-tripirrol 1A-5A, así como controles sin el tripirrol (1B-4B). Se incorporó un grupo fluoróforo en las moléculas para poder realizar el seguimiento del proceso de internalización celular mediante análisis con un microscopio de fluorescencia. La síntesis de las moléculas se realizó usando metodologías en fase sólida.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000016_0001
compound PEPTIDO
1A, 1 B, (Arg)8 2A, 2B, IMKRGRQLD 3A, 3B, IMKRGAQLD 4A, 4B, IAAKRGRQLD-G -(Arg)8 5A
Figure imgf000016_0002
Aba-C -(MTg)8-NH2
Esquema 1. Estructuras de los compuestos estudiados.
Los ensayos de ¡nternalización se realizaron en células HeLa vivas, registrando las imágenes de fluorescencia a 30 min, 90 min y 3 h. Tal y como se muestra en Ia Figura 2 (FIG. 2), Ia incubación de células con el conjugado tripirrol-octaarginina 1 A durante 90 min a 37 0C dio lugar a una señal de fluorescencia homogénea e intensa en el núcleo celular. Posteriormente se observó que dicha señal ya se observaba a los 30
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) minutos. Esto demuestra que Ia ¡nternalización es muy rápida. Un control de ¡nternalización del mismo tripirrol desprovisto de Ia secuencia de octaarginina demostró que no se observaba nada de fluorescencia intracelular incluso después de 3 h. Parece claro pues que Ia octaarginina es clave para un transporte eficiente del conjugado.
En el caso del híbrido 2A que contiene como fragmento peptídico una señal de localización nuclear (NLS) en vez de Ia poliarginina, Ia señal de fluorescencia que se observa después de Ia incubación está también localizada en el núcleo celular; sin embargo Ia intensidad de Ia señal es menor que en el caso del híbrido 1A, probablemente debido a Ia menor capacidad de ¡nternalización citoplasmática inherente a esta secuencia. La introducción de una secuencia de octaargininas además de Ia NLS, bien de manera lineal (4A) o bien a través de un enlace disulfuro lábil (5A), mejoró las propiedades de internalización con respecto al híbrido que contiene exclusivamente Ia NLS (2A); sin embargo las capacidad de transporte fue en ambos casos menor a Ia del híbrido que contenía exclusivamente Ia octaarginina 1A. El conjugado 3A, similar a 2A pero con una mutación en Ia NLS no fue eficientemente internalizado, como queda de manifiesto por Ia baja fluorescencia observada en el interior de las células. El producto aparece distribuido uniformemente por el citoplasma celular, Io cual concuerda con Ia pérdida de capacidad de señalización nuclear de Ia NLS mutada.
Los péptidos control que no poseen el fragmento tripirrólico no son capaces de alcanzar el núcleo de las células. Particularmente relevante es el caso del péptido 1B, que es análogo a 1A, pero sin el tripirrol. Como se observa en Ia Figura 2 (FIG. 2), Ia fluorescencia es intensa, pero se localiza exclusivamente en el citoplasma.
Por otro lado, para comprobar Ia posible implicación del fluoroforo, se utilizó el híbrido 6, similar a 1A pero desprovisto del grupo fluoroforo. Este mostró una afinidad por secuencias de ADN ricas en adenina muy alta, en torno a 6 nM a temperatura ambiente (FIG. 3). Además Ia interacción es selectiva para sitios de ADN que contengan al menos 4 adeninas o timinas seguidas.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) EJEMPLO 2.- Síntesis y purificación de los péptidos
Los péptidos se sintetizaron manualmente en una escala de 0.1 mmol siguiendo los protocolos estándar de síntesis de péptidos mediante Ia estrategia Fmoc/tBu. Para Ia síntesis se utilizó una resina PAL-PEG (0.19 mmol/g). Cada amino ácido se activó durante 2 min en DMF previamente a su adición sobre Ia resina desprotegída. La reacción de formación del enlace peptídico se dejó transcurrir un mínimo de 45 min hasta que el test TNBS dio negativo. La desprotección del grupo temporal Fmoc se llevó a cabo por tratamiento de Ia resina con piperidina al 20% en DMF durante 15 min. Los péptidos finales se obtuvieron después de Ia desprotección/liberación de Ia resina por tratamiento con el coctel estándar de desprotección con TFA tal y como se especifica a continuación.
Desprotección del grupo temporal Fmoc: Se añade piperidina (5 mL, 20% en DMF) a 0.1 mmol de Fmoc-péptido unido al soporte sólido. Se burbujea nitrógeno a través de Ia mezcla durante 15 min. Se filtra Ia resina y se lava con DMF (3 x 5 mL x 3 min). Se comprueba Ia desprotección haciendo un test TNBS a una pequeña fracción de Ia resina.
Acoplamiento de los amino ácidos: Se añade DIEA (3 mL, 0.195M en DMF) sobre el amino ácido correspondiente (0.4 mmol) disuelto en 2 mL de una disolución 0.2 M HOBt y 0.2 M HBTU en DMF. La mezcla resultante se agita durante 2 min y a continuación se añade sobre Ia resina. Se hace pasar nitrógeno sobre Ia mezcla resultante durante 45 min o hasta que se observa que el acoplamiento se completa, mediante el test TNBS en una pequeña alícuota de Ia resina. Se filtra Ia resina y se lava con DMF (3 x 5 mL x 3 min). La síntesis continúa con el siguiente ciclo de desprotección/acoplamiento de forma análoga a Ia descrita.
Desprotección selectiva de Ia cadena lateral del residuo Lys(Alloc): Una vez completada Ia secuencia del péptido, Ia desprotección selectiva de Ia lisina se lleva a cabo utilizando el siguiente procedimiento: Se tratan 0.1 mmol del péptido unido a Ia resina con Pd(PPh^ (1 equiv) y morfolina (190 equiv) en 2% H2OZCH2CI2 (5 mL) durante 5 h. Se filtra Ia resina y se lava con DMF (3 x 5 mL x 3 min), dietilditiocarbamato (DEDTC, 25 mg en
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 5 mL de DMF, 2 x 5 ml_ x 2 min), DMF (3 x 5 mL x 2 min) y CH2CI2 (3 x 5 ml_ x 2 min).
Desprotección/liberación de Ia resina: El péptido sintetizado, todavía unido a Ia resina se seca bajo una corriente de nitrógeno y se trata en frío con el coctel de desprotección (50 μL CH2CI2, 25 μl_ agua, 25 μl_ TIS y TFA hasta 1 mL para 40 mg de resina). Los péptidos que contienen cisteínas se desprotegieron utilizando el coctel alternativo específico: 25 μL EDT, 25 μL agua, 10 μL TIS y TFA hasta 1 mL, por cada 40 mg de resina. La suspensión resultante de añadir Ia mezcla de desprotección a Ia resina se agitó durante 2 h a ta. La resina se separó y los filtrados se añadieron sobre éter etílico en un baño de hielo (10 mL de éter por cada mL de coctel). Después de 10 min, se centrifuga Ia mezcla y el sólido decantado se lava con éter frío y se seca bajo una corriente de argón. El precipitado se disolvió en 2 mL de una mezcla de acetonitrilo/agua 1 :1 y se analizó por HPLC en fase reversa utilizando las condiciones descritas anteriormente. El producto mayoritario en todas las síntesis se identificó como el péptido deseado por espectrometría de masas. Las fracciones aisladas en HPLC preparativo se liofilizaron y guardaron a -20 0C.
EJEMPLO 3.- Síntesis de los híbridos fluorescentes.
Una vez finalizada Ia síntesis se eliminó el grupo protector Fmoc del residuo N-terminal siguiendo el procedimiento estándar. Se lavó Ia resina y se añadieron una disolución de DIEA (0.5 M, 6 equiv) en DMF e isotiocianato de fluoresceina (FITC1 4 equiv. La mezcla resultante se agito durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavó Ia resina con DMF (2 x 5 mL) y el grupo Alloc se desprotegió siguiendo el procedimiento detallado previamente. La peptidil-resina resultante se sometió al procedimiento estándar de desprotección/liberación y purificación para dar los compuestos 1B-5B. Alternativamente, Ia peptidil-resina se acopló a Ia unidad de aminotripirrol para sintetizar los derivados 1A-5A. Para los acoplamientos con los thpirroles se suspendió Ia resina en DMF (1 mL) y se agitó durante 30 min para expandirla convenientemente. Se filtró Ia DMF y sobre Ia resina se añadió DIEA (0.5 M en DMF, 8 equiv), DMAP (2 equiv en DMF) y Λ/,Λ/'-disuccinimidil bicarbonato (15 equiv). La mezcla
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) resultante se agito durante 2 h. La resina se lavó con DMF y se añadieron el aminotripirrol 7 en DMF (4 equiv), DIEA (8 equiv, 0.5M en DMF) y DMAP (2 equiv). La mezcla de reacción se agitó durante 2h y a continuación se lavo con DMF (2 x 5 mL x 2 min) y éter etílico (2 x 5 mL x 2 min). La desprotección/liberación siguiendo condiciones estándar dio lugar a los conjugados esperados que se purificaron por HPLC en fase reversa e identificaron por espectrometría de masas tal y como se detalló previamente.
EJEMPLO 4.- Síntesis del híbrido 5A.
Este compuesto se obtuvo por acoplamiento del péptido correspondiente que incluye una cisterna, con el péptido de cisteina-ortaargininas activado previamente por reacción con DTNB (reactivo de Ellman). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo en tampón 100 mM Tris-HCI, 1 M NaCI, pH 7,5 agitando Ia mezcla a temperatura ambiente por 45 min. El producto mayoritario se purificó por HPLC siguiendo las condiciones estándar y se identificó por espectrometría de masas como el híbrido heterodimérico conteniendo el puente disulfuro deseado.
Estudios preliminares de citotoxicidad.
Se han realizado ensayos preliminares de citotoxicidad usando células HeLa 229, para comprobar el posible efecto de Ia presencia de Ia cadena de octaarginina en Ia actividad biológica. Estos estudios se han realizado realizando una incubación durante 48 horas, y se evaluaron luego mediante una tinción celular por cristal violeta y posterior acetilación. Se ha comprobado que efectivamente Ia presencia de Ia octarginina en los compuestos tripirrólicos aumenta significativamente el porcentaje de inhibición de crecimiento celular. Tal como se desprende de Ia tabla siguiente, el compuesto más activo es el 1A, que en todo es caso significativamente más eficiente que el análogo 10, que no tiene Ia cadena de octaarginina.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Tabla 1
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000021_0001
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto que comprende un grupo tripirrol unido a una octaarginina ((Arg)s) por medio de un espaciador que comprende, al menos, una lisina (Lys).
2. Compuesto según Ia reivindicación 1 que además comprende un grupo fluoróforo.
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde el tripirrol presenta Ia fórmula (I):
Figure imgf000022_0001
R1 es igual o diferente y se selecciona independientemente de Ia lista que comprende H, un grupo alquilo (C-i-Cβ) o un grupo acilo;
R2 es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (MA):
^(CH2)JT \ (MA) ó de fórmula general (NB):
Figure imgf000022_0002
(HB)
R3 es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (III):
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000023_0001
(III)
donde n toma valores entre 1 y 6.
4. Compuesto según Ia reivindicación 3 donde el tripirrol es:
Figure imgf000023_0002
donde * representa el sitio de unión con Ia usina del espaciador.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el espaciador además de Ia lisina comprende ácido 6-aminohexanoico (Ahx).
6. Compuesto según Ia reivindicación 5 donde el espaciador presenta Ia fórmula (Ahx-Lys-Ahx):
Figure imgf000023_0003
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 donde el fluoróforo es fluoresceína.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
8. Método de obtención de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende los siguientes pasos: a. síntesis del péptido en fase sólida, b. acoplamiento al fragmento tripirrólico, c. desprotección de cadenas laterales y separación de Ia resina.
9. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para Ia elaboración de un medicamento.
10. Uso del compuesto según Ia reivindicación 9 para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
11. Uso del compuesto según Ia reivindicación 9 para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades microbianas.
12. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para interferir de forma eficiente con procesos celulares a nivel del ADN.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
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