WO2010063250A1 - Antimikrobielle peptide aus hydra - Google Patents

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WO2010063250A1
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acid molecule
peptide
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Thomas C. G. Bosch
René AUGUSTIN
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Christian Albrechts Universitaet Kiel
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to genes coding for antimicrobial peptides from the freshwater polyp Hydra, the antimicrobial peptides encoded by these genes and their derivatives, and their use for producing antimicrobially active medicaments.
  • MRSA infections were almost exclusively limited to hospitals. The excessive use of antibiotics and the risk of repeated infections in hospitals have favored the development of resistant bacteria. These infections are usually no longer treatable with conventional antibiotics.
  • Beta-lactam antibiotics the main antibiotic used, inhibit enzymes (called transpeptidases) needed for cell wall synthesis.
  • the beta-lactam skeleton was constantly modified to extend the spectrum of action and to counteract resistance.
  • the disadvantage of conventional antibiotics is the rapid development of resistant germs. These resistances are acquired by a) the target is modified, b) the release of antibiotic-inactivating substances takes place and / or c) a faster (er) transport of the antibiotic from the cell takes place. Since many conventional antibiotics are usually substances that have been isolated from bacteria or fungi, there is often already a mechanism of resistance that the donor cell uses to protect itself. Since bacteria and fungi effectively absorb new genetic material from the environment, the transmission of resistance genes is only a matter of time.
  • peptide antibiotics are i. d. R. small ( ⁇ 10 lcDa), amphiphilic and positively charged peptides. These are the effector molecules of the innate immune system, the main defense system of most living things, from prokaryotes to humans. With different sequence and structural properties, such substances are active against many microorganisms such as bacteria, protozoa, fungi and viruses.
  • AMP antimicrobial peptides
  • Some AMPs are currently in the stages of preclinical or clinical trials for the treatment of various infectious diseases [Giuliani, A., Pirri, G., Nicoletto, S.F. (2007) Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics. CEJB 2: 1-33].
  • Figure 1 shows the cDNA and protein sequence of hydraarminin Ia
  • Fig. 2 is a sequence comparison between hydraarminin Ia and ARM-C31-N;
  • the nucleic acid sequence given under SEQ ID: NO 1 represents a cDNA of the freshwater polyp Hydra and encodes a structurally novel peptide, hydraarminin Ia (amino acid sequence see SEQ ID: NO 2).
  • the deduced peptide ARM-C31-N (SEQ ID NO: 3) has unique activity against a broad spectrum of pathogenic bacteria, including multidrug-resistant bacterial strains (see Table 1). Particular attention is paid to the treatment of MRSA infections.
  • ARM-C31-N is clearly superior to the antibiotics currently used in the clinic as well as the currently known broadband AMPs in its bactericidal effect. It is also a very - A -
  • the freshwater polyp Hydra is a developmentally old multicellular organism.
  • Hydra polyps are characterized by a simple morphological structure: They consist essentially of two cell layers, the outer periphery facing the ectoderm and the endoderm, which essentially faces the central gastric space. Since the polyps have no physical barriers (epidermis, cornea, armor, etc.), the thin epithelia of the Hydra are exposed to the surrounding aquatic environment and the potentially pathogenic microorganisms contained therein seemingly defenseless. Nevertheless, iydra polyps colonize even microbially contaminated freshwater and show no signs of infection.
  • the starting point for the substance ARM-C31-N according to the invention was the isolation of the gene for hydraarminin Ia from hydra (Example 1, FIG. Hydraarminin Ia was isolated from a cDNA library generated by a transcriptome comparison of Hydra with and without interstitial cells by means of SSH ("suppression subtractive hybridization") .Synthetic extracts of Hydra without interstitial cells and thus without their cellular derivatives have a Increased antibacterial activity on [Kasahara, S., Bosch, TC (2003) Enhanced antibacterial activity in Hydra polyps varicose nerve cells., Dev.
  • the cDNA library thus constructed contains logically transcripts whose The natural hydraarminine Ia found in Hydra has the following characteristics:
  • the open reading frame comprises 276 nucleotides ( Figure 1, SEQ ID: NO 1) which code for a 88 amino acid residue long peptide ( Figure 1, SEQ ID: NO 2), of which the first 18 amino acid residues form the predicted signal peptide (underlined in Fig. 1) and the calculated mass is included 10567 Da.
  • the isoelectric point is 6.3. In this form or with cleaved signal peptide, this peptide is very likely to have no antibacterial activity. Striking, however, is a separation of negative and positive amino acid residues.
  • the N-terminus of the peptide is strongly negatively charged, whereas the C-terminus is strongly positively charged (FIG. 2). Processing sites of proteases that separate these two parts are undetectable.
  • the substance ARM-C31-N according to the invention ( Figure 2, SEQ ID: NO 3) is an artificial product and is based on the consideration of the inventors to maximize the number of positive charges based on the C-terminal hydraarminin-la sequence.
  • the C-terminus was additionally amidated.
  • the C-terminal end of the gene-encoded peptide Hydraarminm Ia with the amino acid sequence G 86 -K 87 -Ks 8 could be a natural amidation signal, which would lead to a carboxy-amidation of the then C-terminal amino acid residue V 85 by cleavage at the glycine.
  • the Lysgg was deliberately amidated for the peptide ARM-C31-N according to the invention.
  • the peptide of the invention ARM-C31-N in this form can not be purified and prepared from a native hydra extract.
  • amino acid sequence of ARM-C31-N is:
  • ARM-C31-N consists of 31 amino acid residues which have been amidated at the C-terminus.
  • the substance according to the invention has a calculated mass of 3896 Da and an isoelectric point of 12.1. Under physiological conditions, ARM-C31-N is positively charged. Interestingly, ARM-C31-N does not have any cysteines, in contrast to almost all known antimicrobial peptides. The presence of cysts usually increases the stability of the peptide and hinders proteolytic degradation. However, many cysteines make it difficult to prepare such a peptide (ensuring proper linkage of different cysteines, purification and separation of different conformers, etc.).
  • ARM-C31-N can be inexpensively produced in larger quantities either recombinantly or synthetically, since it has no cysteines and corresponding disulfide bridges.
  • ARM-C31-N was chemically synthesized (based on the Merrifield synthesis; Example 2). The results of these tests are summarized in Table 1.
  • peptide antibiotics are based on a different mechanism of action than conventional antibiotics, they are also effective against bacteria that already have resistance to conventional antibiotics.
  • Table 1 clearly show that ARM-C31-N acts against methicillin-resistant S. aureus as well as vancouver-resistant strains of E. faecalis and E. faecium. Infections with multidrug-resistant bacterial strains can no longer be treated with conventional antibiotics, and the existing reserve antibiotics have only limited use.
  • linezolid is currently considered a reserve antibiotic ("last line of defense")
  • treatment is only allowed under strict conditions, such as infection as a mixed infection of gram-positive and gram-negative pathogens Bacteria must be tested for their sensitivity to linezolid prior to treatment, and for mixed infections, linezolid treatment is recommended only if treatment alternatives are lacking and, at the same time, further antibiotic therapy controls the infection by gram-negative bacteria (Important Safety Information, Pfizer Pharma GmbH, March 2007 ; http://www.ifap.de/pdf/Zyvoxid_BfArM.pdf)
  • alternative antibiotics are needed have fewer side effects and have a larger spectrum of activity than line-lid, as it could be demonstrated for the inventive peptide ARM-C31-N.
  • hydraarminine Ib and c SEQ ID NOs 4 and 6
  • the open reading frame of hydraarminin Ib and c comprises, as with hydraarminin Ia, 276 nucleotides encoding 88 amino acid residue long peptides.
  • 3 shows a sequence comparison of the 3 hydraarminin peptides according to the invention.
  • hydraarminin Ib and c each have 7 and 4 amino acid exchanges (shown in gray in FIG. 3). Of these, in both cases there is only one amino acid exchange (K versus R, position 83) in the C-terminal region of the peptides.
  • an identical peptide according to the invention without signal sequence, ARM-C31b-N (SEQ ID: NO 8, shown in black in FIG. 3), which compared to the sequence of ARM-C31-N only has the amino acid exchange K against R.
  • the preferred embodiment of the peptide ARM-C31b-N according to the invention is also C-terminally amidated.
  • the peptide of the invention ARM-C31b-N in this form can not be purified and prepared from a native hydra extract.
  • Biologically active means that the fragments have a maximum of 10 times higher minimum bactericidal concentration (MBK) than the underlying complete peptides according to the measuring method given in the examples.
  • MK minimum bactericidal concentration
  • the invention furthermore relates to peptides in which individual amino acids are exchanged. These are preferably conservative substitutions, ie amino acids with similar properties are replaced, for example alanine against serine, leucine against isoleucine, etc. Again, it is preferred that not more than 10% of the amino acids in the peptides be replaced.
  • individual amino acids may also be replaced by non-natural amino acids, i. by amino acids which carry further functional groups, for example hydroxyproline, methylthreonine, homocysteine, etc. Also in this case preferably not more than 10% of the amino acids are modified accordingly.
  • the peptides may carry derivatizations, for example amidated, glycosylated, acetylated, sulfated or phosphorylated.
  • the present invention further provides a production process for the peptides of the invention.
  • a production process for the peptides of the invention In addition to the genetic engineering of the peptides and the constructive total synthesis of conventional solid phases in the sense of Merrifield synthesis or a liquid phase synthesis is possible.
  • the synthetic strategy and the structure of the peptides and derivatives derived therefrom with the corresponding protected amino acids are known in the art.
  • the present invention also relates to the use of the peptides of the invention as medicaments for various therapeutic indications.
  • the peptides can be used as high-purity substances or - if sufficient for use - within a partially purified peptide mixture or as a mixture of several inventive peptides.
  • the present invention furthermore relates to the following applications of the antimicrobial peptides according to the invention:
  • Disinfection of chronic wounds which are often infected with multiresistant germs (eg, S. aureus), especially in inpatient patients, by rinsing with solutions containing anti-microbial peptides.
  • multiresistant germs eg, S. aureus
  • grafts that continuously release antimicrobial peptides. These grafts can z.
  • biopolymers that are used as artificial skin after severe burns, or include artificial joints.
  • the hydra polyps were incubated with a Pseudomonas aeruginosa brain remnant or (ii) the nerve cells of a special hydrastam were removed.
  • the nerve cells were as previously described [Kasahara, S., Bosch, T.C. (2003) Enhanced antibacterial activity in Hydra polyps varicose nerve cells. Dev. Comp. Immunol. 27: 79-85] by cultivating heat-sensitive Hydra magnipapillata sf-1 animals at 25 ° C for 25 days.
  • RNA from the polyps was recovered with TRIzol (Invitrogen). "Suppression Subtractive Hybridization” was performed as described [Genikhovich, G., Kurn, U., Hemmrich, G., Bosch, TC (2006) Discovery of genes expressed in Hydra embryogenesis. Dev. Biol. 289: 466-81] " ,
  • Example 2 Preparation of ARM-C31-N After the transcript of hydraarminin Ia could be isolated by the suppression subtractive hybridization described above and its sequence analyzed, the inventors found that the sequence of the peptide has at least three distinct regions terminal could be used with the SignalP 3.0 program [Bendtsen, JD, Nielsen, H., von Heijne, G., Brunak, S. (2004) Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol.
  • MBC minimum bactericidal concentration (concentration at which more than 99.9% of bacteria are killed)

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Abstract

Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Nukleinsäuremolekül mit der in der SEQ ID:NO 1, 4 oder 6 dargestellten Nukleotidsequenz, b) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Peptid mit der in der SEQ ID:N0 2, 3, 5, 7 oder 8 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, c) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Komplementärstrang an ein Nukleinsäuremolekül nach a) oder b) hybridisiert und das ein Peptid mit antimikrobieller Aktivität codiert, und d) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Nukleotidsequenz von der Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls nach c) aufgrund des degenerierten genetischen Codes abweicht.

Description

Antimikrobielle Peptide aus Hydra
Die Erfindung betrifft aus dem Süßwasserpolypen Hydra isolierte, für antimikrobielle Peptide codierende Gene, die von diesen Genen codierten antimikrobiellen Peptide und deren Derivate, sowie deren Verwendung zur Herstellung antimikrobiell wirksamer Arzneimittel.
Heutzutage sind Infektionen in Entwicklungsländern die Haupttodesursache und in Industrie- ländern nach Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen immer noch die dritthäufigste Todesursache (WHO, Global Bürden of Diseases). Das Auftreten und die Verbreitung von Antibiotikaresistenzen stellt eine zunehmende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. WHO- Daten zufolge infizierten sich 2005 in Europa bereits rund drei Millionen Menschen mit Keimen, gegen die herkömmliche Antibiotika unwirksam sind, und 50.000 starben daran.
Im Moment sterben mehr Patienten an MRSA-Infektionen, d. h. durch Methicillin-resistente Staphyloccoccus aureus, als an der Immunschwäche AIDS [Taubes, G. (2008) The bacteria fight back. Science. 321: 356-61]. MRSA-Infektionen waren in der Vergangenheit fast ausschließlich auf Krankenhäuser beschränkt. Der exzessive Umgang mit Antibiotika und die Gefahr wiederholter Infektionen in Krankenhäusern haben die Entwicklung von resistenten Keimen begünstigt. Diese Infektionen sind meist nicht mehr mit konventionellen Antibiotika zu behandeln.
Hinzu kommt gerade bei MRSA, dass diese Infektionen nicht mehr nur auf den Krankenhaus- bereich beschränkt sind, sondern auch außerhalb („Community aquired", caMRSA) S.-aureus- Stämme auftreten, die gegen Methicillin resistent sind. Die beschriebenen Zusammenhänge wurden zunächst in den USA entdeckt und endeten mit der Isolierung des besonders infektiösen Stammes US300. Aber auch in Europa sind solche Stämme bereits aufgetreten, hier unter der Bezeichnung ST398. Eine Pandemie ist somit nicht mehr auszuschließen.
Um dieser am Beispiel der MRSA-Infektion beschriebenen Resistenz-Problematik zu begegnen, sind neue Antibiotika notwendig, möglichst solche, die andere Angriffspunkte haben, als die zum gegenwärtigen Zeitpunkt eingesetzten Antibiotika, um pathogene, resistente Keime zu töten. Die Wirkung konventioneller Antibiotika beruht meist auf der Hemmung eines spezifischen Enzyms. Bei den Beta-Lactam-Antibiotika, der hauptsächlich verwendeten Gruppe von Antibiotika, werden Enzyme (sogenannte Transpeptidasen) gehemmt, die zur Zellwandsynthese benötigt werden. Das Beta-Lactam-Grundgerüst wurde ständig modifiziert, um das Wirkungs- spektrum zu erweitern und um Resistenzen zu begegnen.
Nachteil der konventionellen Antibiotika ist die rasche Ausbildung resistenter Keime. Diese Resistenzen werden erworben, indem a) das Angriffsziel modifiziert wird, b) die Ausschüttung von Antibiotika-inaktivierenden Substanzen stattfindet und/oder c) ein schneller(er) Transport des Antibiotikums aus der Zelle erfolgt. Da viele konventionelle Antibiotika meist Substanzen sind, die aus Bakterien oder Pilzen isoliert wurden, existiert oft bereits ein Resistenzmechanismus, den die abgebende Zelle benutzt, um sich zu schützen. Da Bakterien und Pilze effektiv neues genetisches Material aus der Umwelt aufnehmen, ist die Übertragung von Resistenzgenen nur eine Frage der Zeit.
Darüber hinaus gibt es Versuche, Peptidantibiotika zu entwickeln. Hierbei handelt es sich i. d. R. um kleine (< 10 IcDa), amphiphile und positiv geladene Peptide. Diese sind die Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems, des Hauptverteidigungssystems der meisten Lebewesen, von Prokaryoten bis zum Menschen. Mit unterschiedlichen Sequenz- und Struktur- eigenschaften sind solche Substanzen gegen viele Mikroorganismen wie Bakterien, Protozoen, Pilze und Viren aktiv. Die Wirkung der bereits beschriebenen antimikrobiellen Peptide (AMP) beruht im Wesentlichen auf relativ unspezifischen Mechanismen, die zu einer Störung der Integrität der Membranstrukturen fuhren, z. B. durch die Ausbildung von Poren, aber sie können auch die angeborene Immunantwort stimulieren. Einige AMPs befinden sich gerade in den Phasen der präklinischen oder der klinischen Studien für die Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten [Giuliani, A., Pirri, G., Nicoletto, S.F. (2007) Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics. CEJB 2: 1-33].
Gegen die Verbreitung dieser neuen Art der antibakteriellen Therapie sprechen hauptsächlich die hohen Produktionskosten der AMPs. Peptide sind außerdem ziemlich empfindlich gegen proteolytischen Abbau. Die schnelle „clearance" der Peptide und die ungünstige Pharmakokinetik aufgrund der Proteolyse können zudem die Anwendungsmöglichkeiten der AMPs stark eingrenzen. Aus der geschilderten Problematik folgt, dass ein dringender Bedarf an neuen, effektiven Wirkstoffe gegen pathogene resistente Bakterien besteht.
Der vorliegenden Erfindung liegt damit die Aufgabe zugrunde, neue Peptid-Antibiotika bereitzustellen, bei denen eine Resistenzbüdung weniger wahrscheinlich ist, die auch bei bestehenden Resistenzen eingesetzt werden können und als gut zugängliche Arzneimittel mit biologischer und therapeutischer Aktivität verwendet werden können, sowie einen Weg zu deren Produktion aufzuzeigen. Diese Peptid-Antibiotika sollen außerdem eine kostengünstige Al- ternative zu den bereits bekannten AMP darstellen und verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Peptide mit den in den Ansprüchen wiedergegebenen Merkmalen sowie deren Verwendung gelöst.
Die Erfindung wird in den Fig. 1 bis 3 näher veranschaulicht. Es zeigen:
Fig. 1 die cDNA- und die Proteinsequenz von Hydraarminin Ia;
Fig. 2 einen Sequenzvergleich zwischen Hydraarminin Ia und ARM-C31-N; und
Fig. 3 einen Sequenzvergleich zwischen Hydraarminin 1 a, b und c
Die unter der SEQ ID:NO 1 angegebene Nukleinsäuresequenz stellt eine cDNA des Süßwasserpolypen Hydra dar und codiert für ein strukturell neuartiges Peptid, Hydraarminin Ia (A- minosäuresequenz siehe SEQ ID:NO 2). Das daraus abgeleitete Peptid ARM-C31-N (SEQ ID:NO 3) weist eine einzigartige Aktivität gegen ein breites Spektrum pathogener Bakterien einschließlich multiresistenter Bakterienstämme auf (siehe Tabelle 1). Besonderes Augen- merk liegt dabei auf der Behandlung von MRSA-Infektionen. ARM-C31-N ist den derzeit in der Klinik eingesetzten klassischen Antibiotika sowie den derzeit bekannten Breitband- AMPs in seiner bakteriziden Wirkung deutlich überlegen. Es handelt sich außerdem um ein sehr - A -
kleines Molekül, das relativ einfach chemisch synthetisiert werden kann, da es keine Cysteine und damit auch keine Disulfidbrücken aufweist.
Der Süßwasserpolyp Hydra ist ein entwicklungsgeschichtlich alter vielzelliger Organismus. Hydra-Polypen zeichnen sich durch einen einfachen morphologischen Aufbau aus: Sie bestehen im Wesentlichen aus zwei Zellschichten, dem der äußeren Umgebung zugewandten Ek- toderm und dem im Wesentlichen dem zentralen Gastralraum zugewandten Endoderm. Da die Polypen über keinerlei physikalische Barrieren (Epidermis, Hornhaut, Panzer etc.) verfügen, sind die dünnen Epithelien der Hydra dem umgebenden aquatischen Milieu und den darin enthaltenen potentiell pathogenen Mikroorganismen scheinbar schutzlos ausgesetzt. Trotzdem besiedeln /iydra-Polypen selbst mikrobiell stark belastete Süßgewässer und zeigen dabei keine Anzeichen einer Infektion. Dieser Umstand hat die Erfinder dazu veranlasst, in der Hydra nach Substanzen, insbesondere Peptiden zu suchen, die einen wirksamen antimikrobiellen Schutz für die Hydra vermitteln [Bosch, T.C.G., Augustin, R., Anton-Erxleben, F., Fraune, S., Hemmrich, G., ZiIl, H., Rosenstiel, P., Jacobs, G., Schreiber, S., Leippe, M., Stanisak, M., Grötzinger, J., Jung, S., Podschun R., Bartels J., Härder, J., Schröder, J.-M. (2009) Uncove- ring the evolutionary history of innate immunity: The simple metazoan Hydra uses epithelial cells for host defence. Developmental and Comparative Immunology 33:559-569].
Ausgangspunkt für die erfmdungsgemäße Substanz ARM-C31-N (SEQ ID: NO 3) war die Isolation des Gens für Hydraarminin Ia aus Hydra (Beispiel 1; Fig. 1). Hydraarminin Ia wurde aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, die durch einen Transkriptom- Vergleich von Hydra mit und ohne interstitiellen Zellen mittels SSH („Suppression Subtractive Hybridisation") erstellt wurde. Proteinextrakte aus Hydra ohne interstitielle Zellen und damit auch ohne deren zellulären Abkömmlinge weisen eine erhöhte antibakterielle Aktivität auf [Kasahara, S., Bosch, T.C. (2003) Enhanced antibacterial activity in Hydra polyps lacking nerve cells. Dev. Comp. Immunol. 27: 79-85]. Die so erstellte cDNA-Bibliothek enthält folgerichtig Transkripte, deren Produkte eine antimikrobielle Aktivität aufweisen können. Das natürliche in Hydra gefundene Hydraarminin Ia hat folgende Eigenschaften: Der offene Leserahmen umfasst 276 Nukleotide (Fig.l; SEQ ID:NO 1), die für ein 88 Aminosäurereste langes Peptid codieren (Fig. 1; SEQ ID:NO 2); davon bilden die ersten 18 Aminosäurereste das vorhergesagte Sig- nalpeptid (unterstrichen in Fig. 1). Die kalkulierte Masse liegt bei 10567 Da. Der isoelektrische Punkt liegt bei 6,3. In dieser Form bzw. mit abgespaltenem Signalpeptid hat dieses Peptid mit sehr großer Wahrscheinlichkeit keine antibakterielle Aktivität. Auffällig ist allerdings eine Separierung von negativen und positiven Aminosäureresten. So ist der N-Terminus des Peptides stark negativ geladen, der C-terminus hingegen stark positiv geladen (Fig. 2). Prozessierungsstellen von Proteasen, die diese beiden Teile trennen, sind nicht nachweisbar.
Die erfindungsgemäße Substanz ARM-C31-N (Fig. 2; SEQ ID:NO 3) ist ein artifizielles Produkt und basiert auf der Überlegung der Erfinder, die Anzahl der positiven Ladungen auf Grundlage der C-terminalen Hydraarminin-la-Sequenz zu maximieren. Um einen zusätzlichen Schutz gegen proteolytischen Abbau zu erreichen, wurde zusätzlich der C-Terminus amidiert. Das C-terminale Ende des gencodierten Peptids Hydraarminm Ia mit der Aminosäuresequenz G86-K87-Ks8 könnte ein natürliches Amidierungssignal sein, das durch Spaltung am Glycin zu einer Carboxy-Amidierung des dann C-terminalen Aminosäurerestes V85 führen würde. Für das erfindungsgemäße Peptid ARM-C31-N wurde jedoch bewusst das Lysgg amidiert. Somit kann das erfindungsgemäße Peptid ARM-C31-N in dieser Form nicht aus einem nativen Hydraextrakt gereinigt und dargestellt werden.
Die Aminosäuresequenz von ARM-C31-N ist:
KPWRFRRAIRRVRWRKVAPYIPFVVKTVGKK-NH2
ARM-C31-N besteht aus 31 Aminosäureresten, die am C-Terminus amidiert wurden. Die erfindungsgemäße Substanz hat eine kalkulierte Masse von 3896 Da und einen isoelektrischen Punkt von 12,1. Unter physiologischen Bedingungen ist ARM-C31-N positiv geladen. Interessanterweise verfügt ARM-C31-N über keinerlei Cysteine, im Gegensatz zu fast allen bekannten antimikrobiellen Peptiden. Die Anwesenheit von Cy steinen erhöht in der Regel die Stabilität des Peptides und behindert den proteolytischen Abbau. Allerdings erschweren viele Cysteine die Herstellung eines solchen Peptides (Sicherstellen der richtigen Verknüpfung der verschiedenen Cysteine, Reinigung und Separierung verschiedener Konformere, etc.). ARM- C31-N hingegen lässt sich kostengünstig rekombinant oder synthetisch in größeren Mengen herstellen, da es über keine Cysteine und entsprechende Disulfidbrücken verfügt. Für erste antimikrobielle Tests (Beispiel 3) wurde ARM-C31-N chemisch synthetisiert (auf Basis der Merrifield-Synthese; Beispiel 2). Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 1 zusammenge- fasst.
Die Feststellung der hohen bakteriziden Wirkung gegen S. aureus war überraschend, da Hyd- ra nicht mit diesen Bakterien vergesellschaftet ist, und eine solch starke Wirkung keineswegs erwartet werden konnte. Das hat die Erfinder veranlasst, die Minimale Bakterizide Konzentration {minimal bactericidal concentration, MBC) gegen S. aureus detaillierter zu betrachten. Hier zeigte sich, dass ARM-C31-N bereits bei niedrigen Konzentrationen von 0,4 bis 0,8 μM S. aureus und sogar einige MRSA-Stämme eliminiert (Tabelle 1). Aber auch andere gram- positive Bakterien werden von ARM-C31-N effektiv getötet. Darunter sind beispielsweise gram-positive Vancomycin-resistente Stämme von Enterococcus faecalis und Enter ococcus faecium. Besonders hervorzuheben ist darüber hinaus die starke Aktivität gegenüber gramnegativen ESBL-Enterobacteriaceae wie K.-pneumoniae-Stämmen und den E.-co/z-Stämmen E4 and E9 (Tabelle 1). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass ARM-C31-N ein wir- kungsvolles Breitband-Peptidantibiotikum und eine exzellente Ausgangsstruktur für das Design einer neuen Generation von Antibiotika ist.
Da Peptidantibiotika auf einem anderen Wirkmechanismus beruhen als konventionelle Antibiotika, sind sie eben auch wirksam gegen Bakterien, die bereits eine Resistenz gegen kon- ventionelle Antibiotika aufweisen. Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen sehr deutlich, dass ARM-C31-N gegen Methicillin-resistente S. aureus wirkt, genauso wie gegen Van- comycin resistente Stämme von E. faecalis und E. faecium. Infektionen mit multiresistenten Bakterienstämmen können mit herkömmlichen Antibiotika nicht mehr behandelt werden, und die vorhandenen Reserveantibiotika sind nur eingeschränkt einsetzbar. Obwohl z.B. Linezolid im Moment als Reserveantibiotikum gilt („last line of defense"), ist die Behandlung nur unter strengen Auflagen erlaubt. So darf es sich bei der Infektion nicht um eine Mischinfektion aus gram-positiven und gram-negativen Erregern handeln, und die Bakterien müssen vor der Behandlung auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Linezolid geprüft werden. Bei Mischinfektionen wird nur dann eine Behandlung mit Linezolid befürwortet, wenn Behandlungsalternativen fehlen und gleichzeitig mit einer weiteren Antibiotikatherapie die Infektion durch gramnegative Bakterien bekämpft wird (Wichtige Sicherheitsinformation, Pfizer Pharma GmbH, März 2007; http://www.ifap.de/pdf/Zyvoxid_BfArM.pdf). Für Infektionen mit Keimen, die methicillin- und/oder vancomycinresistent sind, werden alternative Antibiotika benötigt, die weniger Nebenwirkungen aufweisen und die ein größeres Wirkspektrum besitzen als Linezo- lid, so wie es für das erfindungsgemäße Peptid ARM-C31-N demonstriert werden konnte. Zudem ist es nur eine Frage der Zeit, bis sich auch gegen die letzten konventionellen Reserveantibiotika Resistenzen bilden werden.
Anhand der Sequenz von Hydraarminin Ia haben die Erfinder EST-Datenbanken durchmustert (http://hydrazome.metazome.net/cgi-bin/gbrowse/hydra/; http://compagen.zoologie.uni- kiel.de/) und konnten dabei zwei zusätzliche Genfamilienmitglieder identifizieren: Hydraarminin Ib und c (SEQ ID:NO 4 und 6). Der offene Leserahmen von Hydraarminin Ib und c (SEQ ID:N0 5 und 7) umfasst, wie bei Hydraarminin Ia, 276 Nukleotide, die für 88 Aminosäurereste lange Peptide codieren. Fig. 3 zeigt einen Sequenzvergleich der 3 erfindungsgemäßen Hydraarminin-Peptide. Gegenüber Hydraarminin Ia weisen Hydraarminin Ib und c jeweils 7 und 4 Aminosäurenaustausche auf (grau dargestellt in Fig. 3). Davon befindet sich in beiden Fällen nur ein Aminosäurenaustausch (K gegen R, Position 83) im C-terminalen Be- reich der Peptide. Somit ergibt sich sowohl aus Hydraarminin Ib als auch aus Hydraarminin Ic ein gleiches erfindungsgemäßes Peptid ohne Signalsequenz, ARM-C31b-N (SEQ ID:N0 8, schwarz dargestellt in Fig. 3), das gegenüber der Sequenz von ARM-C31-N nur den Aminosäurenaustausch K gegen R aufweist. Wie im Fall von ARM-C31-N, ist die bevorzugte Ausführung des erfindungsgemäßen Peptides ARM-C31b-N auch C-terminal amidiert. Wie bei ARM-C31-N kann das erfindungsgemäße Peptid ARM-C31b-N in dieser Form nicht aus einem nativen Hydraextrakt gereinigt und dargestellt werden.
Gegenstand der Erfindung sind neben den beschriebenen Peptiden auch deren biologisch aktive Fragmente. Biologisch aktiv bedeutet, dass die Fragmente gemäß dem in den Beispielen angegebenen Messverfahren eine maximal 10-fach höhere minimale bakterizide Konzentration (MBK) aufweisen als die zugrunde liegenden kompletten Peptide. Bevorzugt handelt es sich um Derivate, bei denen N- oder C-terminal eine oder mehrere Aminosäuren fehlen. Es können jedoch auch Aminosäuren aus der Sequenz deletiert sein. Solche Fragmente weisen bevorzugt nicht mehr als 30 % deletierte Aminosäuren auf.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin solche Peptide, bei denen einzelne Aminosäuren ausgetauscht sind. Bevorzugt handelt es sich dabei um konservative Austausche, d. h. Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften werden ersetzt, beispielweise Alanin gegen Serin, Leucin gegen Isoleucin, etc. Auch hier wird bevorzugt, dass nicht mehr als 10 % der Aminosäuren in den Peptiden ersetzt werden.
Darüber hinaus können auch einzelne Aminosäuren durch nicht-natürliche Aminosäuren er- setzt sein, d.h. durch Aminosäuren, die weitere funktionelle Gruppen tragen, beispielsweise Hydroxyprolin, Methylthreonin, Homocystein, etc. Auch in diesem Fall sind bevorzugt nicht mehr als 10 % der Aminosäuren entsprechend modifiziert. Weiterhin können die Peptide De- rivatisierungen tragen, beispielsweise amidiert, glycosiliert, acetyliert, sulfatiert oder phosphoryliert sein.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Herstellungsverfahren für die erfindungsgemäßen Peptide bereit. Neben der gentechnischen Herstellung der Peptide ist auch die aufbauende Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield- Synthese oder einer Flüssigphasensynthese möglich. Die Synthesestrategie und der Aufbau der Peptide und von ihnen abgeleiteter Derivate mit den entsprechend geschützten Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide als Arzneimittel für verschiedene therapeutische Indikationen. Dazu können die Peptide als hochreine Stoffe oder - wenn für die Verwendung ausreichend - innerhalb eines teilweise aufgereinigten Peptidgemisches oder als Gemisch mehrerer erfindungsgemäßer Peptide verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren folgende Anwendungen der erfindungsgemä- ßen antimikrobiellen Peptide:
- rein äußerliche Anwendungen in Form von Hautcremes.
— Desinfektion chronischer Wunden, die vor allem bei stationären Patienten oft mit multiresistenten Keimen (z. B. S. aureus) infiziert sind, durch Spülen mit anti- mikrobielle Peptide enthaltenden Lösungen. - Beschichtung von Transplantaten, die kontinuierlich antimikrobielle Peptide freigeben. Diese Transplantate können z. B. Biopolymere, die als künstliche Haut nach schwersten Verbrennungen zum Einsatz kommen, oder auch künstliche Gelenke umfassen. - Desinfektion von Kathetern durch eine Beschichtung mit antimikrobiellen Peptiden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
Beispiel 1: Isolation des Peptids Hydraarminin Ia
Zur Stimulation der Immunabwehr wurden (i) die Hydra-Polypen mit einem Pseudomonas- aeruginosa-Kxütmübexstand inkubiert oder (ii) die Nervenzellen eines speziellen Hydrastammes entfernt. Die Nervenzellen wurden wie bereits beschrieben [Kasahara, S., Bosch, T. C. (2003) Enhanced antibacterial activity in Hydra polyps lacking nerve cells. Dev. Comp. Im- munol. 27: 79-85] durch das Kultivieren von wärmesensitiven Hydra magnipapillata sf-1 Tieren bei 25 °C für 25 Tage entfernt.
Die Gesamt-RNA aus den Polypen wurde mit TRIzol (Invitrogen) gewonnen. „Suppression Subtractive Hybridisation" wurde wie beschrieben durchgeführt [Genikhovich, G., Kurn, U., Hemmrich, G., Bosch, T.C. (2006) Discovery of genes expressed in Hydra embryogenesis. Dev. Biol. 289: 466-81]".
Beispiel 2: Herstellung von ARM-C31-N Nachdem das Transkript von Hydraarminin Ia durch die oben beschriebene „Suppression Subtractive Hybridisation" isoliert und seine Sequenz analysiert werden konnte, haben die Erfinder festgestellt, dass die Sequenz des Peptids mindestens drei unterschiedliche Bereiche aufweist. N-terminal konnte mit dem SignalP-3.0-Programm [Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G., Brunak, S. (2004) Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340: 783-95] ein Signalpeptid vorhergesagt werden. Daraus folgt, dass Hydraarminin Ia ins endoplasmatische Reticulum gelangt, dort prozessiert und dann wahrscheinlich sezerniert wird. Das Signalpeptid spielt also keine Rolle für die antibakterielle Aktivität und konnte weggelassen werden. Weiterhin war auffällig, dass das Peptid eine Ladungsverteilung aufweist: N-terminal negativ, C-terminal positiv (Fig. 2). Die Erfinder haben die Sequenz so auf- geteilt, dass möglichst viele positive Ladungen am C-Terminus des Peptides erhalten bleiben. Um das so entstandene Peptid, ARM-C31-N genannt, auf seine antimikrobielle Wirkung hin zu untersuchen, wurde es synthetisch hergestellt (Firma Casio Laboratory). Dies erfolgte durch „Fmoc solid phase synthesis". Das Peptid wurde daraufhin HPLC-gereinigt und die Sequenz wurde durch Massenspektrometrie überprüft.
Um ARM-C31-N vor Proteolyse zu schützen, wurde es zusätzlich C-terminal amidiert. Das natürliche Arminin-la besitzt mit G86-K87-K88 ein mögliches Amidierungssignal, jedoch würde dieses Signal durch Spaltung des Glycins zu einer Amidierung des dann C-terminalen V85 führen. Dies wiederum schließt aus, dass man ARM-C31-N mit der Amidierung am K88 aus der natürlichen Ressource {Hydra) isolieren könnte.
Beispiel 3: Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität
Die antimikrobielle Aktivität von ARM-C31-N wurde wie bereits beschrieben bestimmt [Sah- Iy, H., Schubert, S., Härder, J., Rautenberg, P., Ullmann, U., Schröder, J., Podschun, R. (2003) Burkholderia is highly resistant to human Beta-defensin 3. Antimicrob. Agents Che- mother. 47: 1739—41]. Test-Isolate wuchsen 2 bis 3 h in „brain heart infusion broth" bei 36 +/- 1 °C, wurden dann dreimal in 10 mM Natrium-Phosphat-Puffer (pH 7,4) mit 1 % „tryptic soy broth" (TSB) gewaschen und auf 104 bis 105 Bakterien/ml eingestellt. Je 100 μl Bakteriensuspension wurden mit 10 μl Lösung des antimikrobiellen Peptids versetzt (getestete Endkonzentrationen: 0,0125-100 μg/ml) und bei 36 +/- 1 °C inkubiert. CFUs („colony forming units" = „koloniebildende Einheiten") wurden nach 2 h bestimmt. Als Negativkontrolle dien- ten Bakteriensuspensionen, die mit 10 μl Phosphat-Puffer/ 1 % TSB statt mit Peptid-Lösung versetzt wurden. Die Ergebnisse werden als MBK („minimale bakterizide Konzentration; >=99,9 % Tötung) angegeben.
Tabelle 1: Antimikrobielle Aktivität von ARM-C31-N
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
MBK: minimale bakterizide Konzentration (Konzentration, bei der mehr als 99,9 % der Bakterien getötet werden.)

Claims

ANSPRÜCHE
1. Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) einem Nukleinsäuremolekül mit der in der SEQ ID:NO 1, 4 oder 6 dargestellten Nukleotidsequenz,
b) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Peptid mit der in der SEQ ID:NO 2, 3, 5,
7 oder 8 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
c) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Komplementärstrang an ein Nukleinsäuremolekül nach a) oder b) hybridisiert und das ein Peptid mit antimikrobieller Aktivität codiert, und
d) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Nukleotidsequenz von der Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls nach c) aufgrund des degenerierten genetischen Codes abweicht.
2. Vektor, gekennzeichnet durch ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz nach Anspruch 1.
3. Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül mit regulatorischen Elementen für die Expression in Hydra kombiniert ist.
4. Wirtszelle, gekennzeichnet durch ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz nach Anspruch 1.
5. Wirtszelle, gekennzeichnet durch den Vektor nach Anspruch 2.
6. Peptid mit der unter SEQ ID:NO 2, 3, 5, 7 oder 8 dargestellten Aminosäuresequenz.
7. Peptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es ein zyklisches, amidiertes, acetyliertes, sulfatiertes, phosphoryliertes, glycosiliertes oder oxidiertes Derivat ist.
8. Peptid nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass < 30 % der angegebenen Aminosäuren durch andere Aminosäuren konservativ substituiert sind.
9. Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass < 10 % der angegebenen Aminosäuren mit nicht-natürlich- vorkommenden Aminosäuren substituiert sind.
10. Peptid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-natürlich- vorkommenden Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hydro- xyprolin, Methylthreonin oder Homocystein.
11. Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Lysin-Aminosäurerest durch einen Arginin-Aminosäurerest oder wenigstens wenigstens ein Arginin-Aminosäurerest durch einen Lysin-Aminosäurerest substituiert ist.
12. Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung mikrobieller Infektionen.
13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Behandlung von Infektionen mit gram-negativen oder gram-positiven Bakterien.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur Behandlung von Infektionen mit Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae oder Escherichia coli.
15. Verwendung das Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Beschichten eines medizinischen Instruments, Katheters, medizinischen Implantats oder einer Kontaktlinse.
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