WO2010090318A1 - セレンテラミド類縁体 - Google Patents

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WO2010090318A1
WO2010090318A1 PCT/JP2010/051806 JP2010051806W WO2010090318A1 WO 2010090318 A1 WO2010090318 A1 WO 2010090318A1 JP 2010051806 W JP2010051806 W JP 2010051806W WO 2010090318 A1 WO2010090318 A1 WO 2010090318A1
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WO
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substituted
calcium
coelenterazine
benzyl
ethyl acetate
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PCT/JP2010/051806
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English (en)
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孝充 細谷
光平 岡
敏 井上
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JNC Corp
Tokyo Institute of Technology NUC
Original Assignee
Tokyo Institute of Technology NUC
Chisso Corp
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D241/00—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings
    • C07D241/02—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D241/10—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D241/14—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D241/20—Nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a coelenteramide analog and a fluorescent protein containing the coelenteramide analog.
  • Coelenteramide is an oxidation product of coelenterazine. It is produced during the luminescence process of calcium-binding photoproteins derived from coelenterate and the luminescence process by coelenterazine (CTZ) luciferases such as Renilla and Gaussia.
  • CTZ coelenterazine
  • the calcium-binding photoprotein is a photoprotein that specifically binds to Ca 2+ and emits light instantaneously, and is composed of a complex of coelenterazine peroxide and apoprotein (Non-patent Document 1. Head, JF et. al. (2000) Nature 405: 372-376).
  • a typical photoprotein is aequorin derived from luminescent aquatic jellyfish.
  • aequorin derived from luminescent aquatic jellyfish.
  • mytrocomin, criticin-I, and criticin-II are known.
  • the light emission mechanism is considered to be basically the same.
  • BFP is a fluorescent protein having heat stability and has also been proved to have luciferase activity using CTZ as a substrate.
  • a green-like fluorescent protein (gFP) was produced by adding a chelating agent and removing Ca 2+ from apoaequorin-Ca 2+ .
  • the regeneration method to aequorin with luminous ability by adding CTZ to this gFP was also established.
  • a protein having fluorescence ability and having luciferase activity is only BFP and can be regenerated to aequorin. Therefore, it may be used as a reporter protein in the field of cell biology, and has attracted attention.
  • Non-Patent Documents 4-21 disclose the following fluorescent coelenteramide-related compounds.
  • Non-Patent Documents 4-21 disclose the structures of the above-mentioned coelenteramide-related compounds and their fluorescence characteristics.
  • the present inventors have found that specific thioamide-type coelenteramide analogs and specific sulfonamide-type coelenteramide analogs exhibit fluorescence characteristics different from conventional ones. As a result, the present invention has been completed. That is, the present invention provides the following coelenteramide analogs, fluorescent proteins, and the like.
  • R 1 is substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted arylalkyl, linear or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group, aliphatic cyclic group, or heterocyclic Group
  • R 2 is hydrogen or — (SO 2 ) R 4
  • R 3 is hydrogen, hydroxyl group, methoxy, or acetoxy
  • R 4 is substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted arylalkyl, or linear or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group
  • X 1 is —C ( ⁇ S) — or —SO 2 —.
  • R 1 is phenyl, p-methylphenyl, p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-acetoxyphenyl, p-nitrophenyl, benzyl, ⁇ -hydroxybenzyl, 4-methylbenzyl, 4-hydroxybenzyl, 4- Methoxybenzyl, 4-acetoxybenzyl, 4-nitrobenzyl, phenylethyl, methyl, ethyl, propyl, 2-methylpropyl, 2-methylpropanyl, cyclohexylmethyl, cyclohexylethyl, adamantylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexyl, or thiophene Being 2-yl,
  • R 2 is hydrogen, benzenesulfonyl, p-toluenesulfonyl, 4-hydroxyphenylsulfonyl, 4-hydroxyphenylsulfonyl, 4-
  • Blue fluorescent protein (7)
  • a method for producing a blue fluorescent protein which comprises reacting with.
  • a green fluorescent protein comprising the compound according to any one of (1) to (5a) above and an apoprotein of a calcium-binding photoprotein.
  • Production of a green fluorescent protein comprising treating the blue fluorescent protein according to (6) with a chelating agent for removing calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions Method.
  • a method for producing a calcium-binding photoprotein comprising reacting coelenterazine or an analog thereof with the green fluorescent protein according to (9). (12) The method according to (11) above, wherein the reaction between the fluorescent protein and coelenterazine or an analog thereof is performed in the presence of a reducing agent.
  • the coelenteramide analogs of some aspects of the present invention exhibit fluorescence properties that are different from conventional ones.
  • the coelenteramide analog of a preferred embodiment of the present invention exhibits a relatively high fluorescence ability in an aqueous solvent.
  • FIG. 7 is a graph showing a fluorescence spectrum of c-38 compound (CTSD) having a final concentration of 18 ⁇ M in 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 10 mM CaCl 2 (Example 3).
  • CTSD fluorescence spectrum of c-38 compound
  • Coelenteramide analog The present invention provides a compound represented by the following general formula (1) (coelenteramide analog of the present invention).
  • R 1 is substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted arylalkyl, linear or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group, aliphatic cyclic group, or heterocyclic Group
  • R 2 is hydrogen or — (SO 2 ) R 4
  • R 3 is hydrogen, hydroxyl group, methoxy, or acetoxy
  • R 4 is substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted arylalkyl, or linear or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group
  • X 1 is —C ( ⁇ S) — or —SO 2 —.
  • “Substituted or unsubstituted aryl” for R 1 is, for example, aryl having 1 to 5 substituents, or unsubstituted aryl.
  • the substituent include halogen (fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.), hydroxyl group, alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkoxyl having 1 to 6 carbon atoms, amino, and 1 to 6 carbon atoms. And at least one selected from the group consisting of dialkylamino and the like.
  • the substituent is a hydroxyl group.
  • “Substituted or unsubstituted aryl” specifically includes phenyl, p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-acetoxyphenyl, p-nitrophenyl, p-aminophenyl, p-dimethylaminophenyl, and the like. And preferred are phenyl, p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-acetoxyphenyl, p-nitrophenyl and the like.
  • substituted or unsubstituted aryl is substituted aryl, such as p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-acetoxyphenyl, or p-nitrophenyl.
  • “Substituted or unsubstituted arylalkyl” for R 1 is, for example, arylalkyl having 1 to 5 substituents, or unsubstituted arylalkyl.
  • substituents include halogen (fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.), hydroxyl group, alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkoxyl having 1 to 6 carbon atoms, amino, or 1 to 6 carbon atoms. And dialkylamino.
  • “Substituted or unsubstituted arylalkyl” means, for example, benzyl, ⁇ -hydroxybenzyl, 4-methylbenzyl, 4-hydroxybenzyl, 4-methoxybenzyl, 4-acetoxybenzyl, 4-nitrobenzyl, phenylethyl 4-hydroxy Benzyl, 4-dimethylaminobenzyl, etc., preferably benzyl, ⁇ -hydroxybenzyl, 4-methylbenzyl, 4-hydroxybenzyl, 4-methoxybenzyl, 4-acetoxybenzyl, 4-nitrobenzyl, or phenylethyl Etc.
  • substituted or unsubstituted arylalkyl is arylalkyl substituted with a hydroxyl group, such as ⁇ -hydroxybenzyl or 4-hydroxybenzyl.
  • substituted or unsubstituted arylalkyl is unsubstituted arylalkyl, such as benzyl or phenylethyl.
  • Linear or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group for R 1 is unsubstituted linear or branched alkyl or, for example, 1 to 10 aliphatic cyclic Straight or branched chain alkyl substituted by a group.
  • the aliphatic cyclic group include cyclohexyl, cyclopentyl, adamantyl, cyclobutyl, and cyclopropyl.
  • the aliphatic cyclic group is cyclohexyl, cyclopentyl, adamantyl or the like.
  • “Straight or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group” includes, for example, methyl, ethyl, propyl, 2-methylpropyl, 2-methylpropanyl, cyclohexylmethyl, cyclohexylethyl, adamantyl Methyl, cyclopentylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopropylmethyl, etc., preferably methyl, ethyl, propyl, 2-methylpropyl, 2-methylpropanyl, cyclohexylmethyl, cyclohexylethyl, adamantylmethyl, cyclopentylmethyl, etc. It is.
  • straight chain or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group is a straight chain alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group.
  • Examples of the “aliphatic cyclic group” for R 1 include cyclohexyl, cyclopentyl, adamantyl, cyclobutyl, and cyclopropyl.
  • the aliphatic cyclic group is cyclohexyl or the like.
  • the “heterocyclic group” of R 1 is, for example, a 5- to 7-membered ring containing 1 to 3 atoms selected from the group consisting of N, O, and S in addition to carbon as atoms constituting the ring.
  • “Heterocyclic group” includes, for example, thiophen-2-yl, 2-furanyl, 4-pyridyl and the like.
  • a “heterocyclic group” is a sulfur containing heterocyclic group, such as thiophen-2-yl.
  • R 1 is phenyl, p-methylphenyl, p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-acetoxyphenyl, p-nitrophenyl, benzyl, ⁇ -hydroxybenzyl, 4-methyl.
  • R 1 is p-methylphenyl, p-nitrophenyl, benzyl, methyl or the like.
  • substituents include halogen (fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.), hydroxyl group, alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkoxyl having 1 to 6 carbon atoms, amino, and 1 to 6 carbon atoms. And at least one selected from the group consisting of dialkylamino and the like.
  • the substituent is a hydroxyl group.
  • “Substituted or unsubstituted aryl” specifically includes phenyl, p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-acetoxyphenyl, p-nitrophenyl, p-hydroxybenzyl, p-dimethylaminobenzyl and the like. And preferred are phenyl, p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-acetoxyphenyl, p-nitrophenyl and the like.
  • substituted or unsubstituted aryl is substituted aryl, such as p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-acetoxyphenyl, or p-nitrophenyl.
  • “Substituted or unsubstituted arylalkyl” for R 4 is, for example, arylalkyl having 1 to 6 substituents, or unsubstituted arylalkyl.
  • substituents include halogen (fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.), hydroxyl group, alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkoxyl having 1 to 6 carbon atoms, amino, and 1 to 6 carbon atoms. And dialkylamino.
  • “Substituted or unsubstituted arylalkyl” means, for example, benzyl, ⁇ -hydroxybenzyl, 4-methylbenzyl, 4-hydroxybenzyl, 4-methoxybenzyl, 4-acetoxybenzyl, 4-nitrobenzyl, phenylethyl, 4-ethyl Hydroxybenzyl, 4-dimethylaminobenzyl, etc., preferably benzyl, ⁇ -hydroxybenzyl, 4-methylbenzyl, 4-hydroxybenzyl, 4-methoxybenzyl, 4-acetoxybenzyl, 4-nitrobenzyl, or phenyl Such as ethyl.
  • substituted or unsubstituted arylalkyl is arylalkyl substituted with a hydroxyl group, such as ⁇ -hydroxybenzyl or 4-hydroxybenzyl.
  • substituted or unsubstituted arylalkyl is unsubstituted arylalkyl, such as benzyl or phenylethyl.
  • Linear or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group for R 4 is unsubstituted linear or branched alkyl, or, for example, 1 to 10 aliphatic cyclic Straight or branched chain alkyl substituted by a group.
  • the aliphatic cyclic group include cyclohexyl, cyclopentyl, adamantyl, cyclobutyl, and cyclopropyl.
  • the aliphatic cyclic group is cyclohexyl, cyclopentyl, adamantyl or the like.
  • “Straight or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group” includes, for example, methyl, ethyl, propyl, 2-methylpropyl, 2-methylpropanyl, cyclohexylmethyl, cyclohexylethyl, adamantyl Methyl, cyclopentylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopropylmethyl, etc., preferably methyl, ethyl, propyl, 2-methylpropyl, 2-methylpropanyl, cyclohexylmethyl, cyclohexylethyl, adamantylmethyl, cyclopentylmethyl, etc. It is.
  • straight chain or branched alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group is a straight chain alkyl optionally substituted by an aliphatic cyclic group.
  • R 2 is hydrogen, benzenesulfonyl, p-toluenesulfonyl, 4-hydroxyphenylsulfonyl, 4-methoxyphenylsulfonyl, 4-acetoxyphenylsulfonyl, 4-nitrophenylsulfonyl, benzylsulfonyl, ⁇ -hydroxybenzylsulfonyl, 4-methylbenzylsulfonyl, 4-hydroxybenzylsulfonyl, 4-methoxybenzylsulfonyl, 4-acetoxybenzylsulfonyl, 4-nitrobenzylsulfonyl, phenylethylsulfonyl, methanesulfonyl, ethylsulfonyl, propylsulfonyl, 2 -Methylpropylsulfonyl, 2-methylpropanylsulfon
  • the compound represented by the general formula (1) is a compound represented by the following general formula (2) (the sulfonamide coelenteramide of the present invention).
  • the compound represented by the general formula (2) is a compound selected from the group consisting of the following compounds.
  • the compound represented by the general formula (2) is a compound selected from the group consisting of the following compounds.
  • the compound represented by the general formula (2) is a compound selected from the group consisting of the following compounds.
  • the compound represented by the general formula (1) is a compound represented by the following general formula (3) (the thioamide coelenteramide of the present invention).
  • the compound represented by the general formula (3) is a compound selected from the group consisting of compounds represented by the following formula.
  • the compound represented by the general formula (3) is a compound selected from the group consisting of compounds represented by the following formula.
  • the sulfonamide coelenteramide represented by the general formula (2) is, for example, General formula (4) (Wherein R 3 is as defined above), General formula (5) Can be produced by reacting a compound represented by the formula (wherein R 1 is as defined above).
  • the compound represented by the general formula (4) can be produced by a known production method.
  • the compound represented by the general formula (4) is Kishi, Y. et al., Tetrahedron Lett., 13, 2747-2748 (1972), or Adamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int. ., 33, 477-485 (2001) or a method analogous thereto.
  • the compound represented by the general formula (4) can be produced as follows.
  • a cyclization reaction between a substituted phenylglyoxal aldoxime and a glycinonitrile derivative is performed using a Lewis acid catalyst such as titanium tetrachloride to form pyrazine oxide, and then catalytic hydrogen using Raney Ni or the like as a catalyst. It can be produced by reduction, or by carrying out a Suzuki-Miyaura coupling reaction between a 2-amino-5-bromopyrazine derivative and a substituted phenylboric acid or a substituted phenylboric acid pinacol ester.
  • the compound represented by the general formula (5) can also be produced by a known production method, or a commercially available product can be obtained. Specifically, for example, 1) excess thionyl chloride is allowed to act on the corresponding substituted benzyl sulfonic acid or a salt thereof and heated under reflux and then concentrated under reduced pressure, or 2) the corresponding substituted benzyl sulfonic acid or The salt is subjected to oxalyl dichloride for the corresponding carboxylic acid in the presence of a catalytic amount of N, N-dimethylformamide (DMF) in a solvent such as dichloromethane, and then concentrated under reduced pressure, or 3)
  • the substituted benzyl Grignard reagent can be produced by reacting sulfuryl chloride with any method or a method analogous thereto.
  • Benzylsulfonyl chloride can be purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Kanto Chemical Co., Ltd.
  • the solvent used in the method for producing the compound represented by the general formula (2) is not particularly limited as long as it is other than aqueous or alcohols, and various solvents can be used.
  • pyridine, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, tetrahydrofuran, ethyl acetate, acetone, toluene, dioxane, ether, and the like can be used alone or as a mixture.
  • the reaction temperature and the reaction time are not particularly limited, but are, for example, ⁇ 20 ° C. to 200 ° C., 0.25 hour to 72 hours, preferably ⁇ At 20 ° C. to 100 ° C., 0.5 hour to 36 hours, more preferably at 0 ° C. to 50 ° C., for 1 hour to 24 hours.
  • the thioamide type coelenteramide represented by the general formula (3) is, for example, General formula (6) (Wherein R 1 , R 2 , and R 3 are as defined above) are reacted with Lawesson's reagent or diphosphorus pentasulfide (phosphorus tetrasulfide). be able to.
  • the compound represented by the general formula (6) can be produced by a known production method. Specifically, for example, the compound represented by the general formula (4) and the acid halide represented by the general formula (7) or an analog thereof in an organic solvent, in the presence of a base, or in a basic organic solvent. It can be produced by a reaction method or a method analogous thereto.
  • R 1 is as defined above, and X is halogen (eg, fluorine, chlorine, bromine, or iodine), or R 1 C ( ⁇ O) —).
  • halogen eg, fluorine, chlorine, bromine, or iodine
  • the solvent used in the method for producing the compound represented by the general formula (3) is not particularly limited as long as it is other than water-based or alcohols, ketones, and esters, and various solvents can be used.
  • toluene, benzene, dioxane, tetrahydrofuran, ether, dichloromethane, chloroform, pyridine and the like can be used alone or in combination.
  • the reaction temperature and the reaction time are not particularly limited.
  • the reaction temperature is 0 to 200 ° C., 0.5 to 72 hours, preferably room temperature to At 200 ° C. for 1 hour to 48 hours, more preferably at 60 ° C. to 150 ° C. for 2 hours to 24 hours.
  • BFP blue fluorescent protein
  • gFP green fluorescent protein
  • the blue fluorescent protein (BFP) of the present invention is a complex in which the coelenteramide analog of the present invention is coordinated to the apoprotein of the calcium-binding photoprotein. That is, the BFP of the present invention contains the coelenteramide analog of the present invention, the apoprotein of the calcium-binding photoprotein, and divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions or calcium ions. BFP can generate fluorescence by being excited by light, and can also emit light by contacting BFP with coelenterazine or an analog thereof.
  • BFP is produced from the coelenteramide analog of the present invention as follows. That is, in the presence of calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions, the coelenteramide analog of the present invention (for example, a compound represented by the general formula (1)), an apoprotein of a calcium-binding photoprotein BFP is produced by reacting with.
  • the coelenteramide analog of the present invention for example, a compound represented by the general formula (1)
  • an apoprotein of a calcium-binding photoprotein BFP is produced by reacting with.
  • the coelenteramide analog of the present invention used to produce BFP in the present invention is as described above.
  • Examples of the coelenteramide analog of the present invention include compounds produced by the above production method.
  • the divalent or trivalent ions that can be substituted for the calcium ions used to produce BFP are divalent or trivalent ions that cause a luminescent reaction when reacted with a calcium-binding photoprotein instead of calcium ions. It is a trivalent ion. That is, it acts on calcium-binding photoproteins in the same manner as calcium ions.
  • Examples of calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions include calcium ions (Ca 2+ ), magnesium ions (Mg 2+ ), strontium ions (Sr 2+ ), barium ions (Ba 2+ ), lead Ion (Pb 2+ ), Cobalt ion (Co 2+ ), Nickel ion (Ni 2+ ), Cadmium ion (Cd 2+ ), Yttrium ion (Y 3+ ), Lanthanum ion (La 3+ ), Samarium ion (Sm 3+ ), Europium ion (Eu 3+ ), dysprosium ion (Dy 3+ ), thulium ion (Tm 3+ ), yttrium ion (Yb 3+ ), and the like can be given.
  • divalent metal ions are preferred. More preferred are divalent metal ions other than transition metals, such as Ca 2+ , Sr 2+ , or Pb
  • the apoprotein of the calcium-binding photoprotein used to produce BFP in the present invention is, for example, apoaequorin, apocritin-I, apocritin-II, apooberin, apomytrocomin, apomineopsin, or apovelvoin is there.
  • the apoprotein is apoaequorin, apocrytin-I, apocritin-II, apomytrocomin, etc., for example, apoaequorin.
  • the apoprotein may be collected from nature or may be produced by genetic engineering. Furthermore, as long as the apoprotein can form BFP, its amino acid sequence may be mutated from a natural one by a gene recombination technique.
  • the base sequence and amino acid sequence of an apoprotein (natural apoprotein) of a photoprotein collected from nature are as follows. That is, the base sequence of natural apoaequorin is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of natural apocritin-I is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of natural apocritin-II is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the base sequence of natural apomitrocomine is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the base sequence of natural apooverin is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the base sequence of natural apovelvoin is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the apoprotein mutated by the recombinant technique is, for example, a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c).
  • A a protein comprising an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of a natural apoprotein, and having an apoprotein activity or function of a calcium-binding photoprotein
  • B a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of a natural apoprotein and having an apoprotein activity or function of a calcium-binding photoprotein
  • a natural apoprotein It consists of an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the protein base sequence, and has an apoprotein activity or function of a calcium-binding photoprotein protein.
  • the above-mentioned “natural type apoprotein” is, for example, apoaequorin, apocrytin-I, apocrytin-II, apoovelin, apomytrocomin, apomineopsin, or apovelvoin.
  • the apoprotein is apoaequorin, apocrytin-I, apocritin-II, apomaitrocomin, or the like, and preferably apoaequorin.
  • the amino acid sequences or base sequences of these natural apoproteins are as described above.
  • apoprotein activity or function of calcium-binding photoprotein means, for example, the activity or function of forming a calcium-binding photoprotein by binding a protein with a peroxide of coelenterazine or a peroxide of coelenterazine analog.
  • a protein binds to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of coelenterazine to form a calcium-binding photoprotein” specifically means that (1) the protein binds to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of coelenterazine analog.
  • a photoprotein containing a protein and a peroxide of coelenterazine or a coelenterazine analog by contacting the coelenterazine or its derivative in the presence of oxygen. It also means forming a (complex).
  • contact means that a protein and coelenterazine or an analog thereof are present in the same reaction system, for example, adding a protein to a container containing coelenterazine or an analog thereof, For example, adding coelenterazine or an analog thereof to the container accommodated, or mixing the protein with coelenterazine or an analog thereof.
  • coelenterazine analog refers to a compound that can constitute a calcium-binding photoprotein such as aequorin as an apoprotein, like coelenterazine.
  • Coelenterazine or its analogs include, for example, coelenterazine, h-coelenterazine, f-coelenterazine, cl-coelenterazine, n-coelenterazine, cp-coelenterazine, ch-coelenterazine, hch-coelenterazine, fch-coelenterazine, ef-coelenterazine Ech-coelenterazine or hcp-coelenterazine. Methods for obtaining these coelenterazines or their analogs will be described later.
  • amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6 (1 to several), 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 1 is there.
  • the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added the better.
  • Two or more of the amino acid residue deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously.
  • Such areas include “Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) '',“ Ausbel F. M.
  • the range of “90% or more” in the “amino acid sequence having 90% or more identity” is, for example, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more. 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6 % Or more, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more.
  • identity of amino acid sequences and base sequences can be determined using an analysis program such as BLAST (for example, see Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)). . When using BLAST, the default parameters of each program are used.
  • polynucleotide hybridizing under stringent conditions refers to a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the natural apoprotein or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the natural apoprotein.
  • a polynucleotide obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using all or part of the probe as a probe. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C.
  • the “stringent conditions” referred to here may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 50% (v / v) formamide, 32 ° C.
  • the “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 50% (v / v) formamide, 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5 (w / v)% SDS, 50% (v / v) formamide, 50 ° C.
  • a polynucleotide eg, DNA
  • multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.
  • Alkphos Direct Labeling Reagents manufactured by Amersham Pharmacia
  • Alkphos Direct Labeling Reagents can be used, for example.
  • follow the protocol attached to the kit incubate with the labeled probe overnight, and then wash the membrane with primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. , Hybridized DNA can be detected.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the apoprotein is about 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 92% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.3% or more, 99.5%
  • DNA having 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more of identity can be mentioned.
  • the identity of amino acid sequences and base sequences can be determined using the method described above.
  • recombinant apoprotein that can be used in the present invention, for example, recombinant aequorin described in Shimomura, O. and Inouye, S.Protein Express. Purif. (1999) 16: 91-95, Inouye, S. and Sahara, Y. Protein Express. Purif. (2007) 53: ⁇ ⁇ ⁇ Recombinant Critin I described in 384-389, or Inouye, S. J. Biochem. (2008) 143: 711-717 Tin-II can be mentioned.
  • the apoprotein has all cysteine residues replaced with serine residues.
  • BFP loses chemiluminescence activity when the free SH group of a cysteine residue in an apoprotein is oxidized to produce an SS bond. Therefore, an apoprotein in which a cysteine residue is substituted with a serine residue and cannot generate an SS bond hardly loses chemiluminescence activity and does not generate an SS bond, so that the activity continues.
  • the amount of the coelenteramide analog of the present invention used for the production of BFP is not particularly limited, but for example, 1 mol to 5 mol, preferably 1 mol to 2 mol, more preferably 1 mol to 1.2 mol with respect to 1 mol of apoprotein. It is.
  • the reaction of the coelenteramide analog of the present invention with the apoprotein and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions is preferably carried out in the presence of a reducing agent.
  • a reducing agent examples include dithiothreitol (DTT) and mercaptoethanol.
  • DTT dithiothreitol
  • mercaptoethanol examples include dithiothreitol (DTT) and mercaptoethanol.
  • DTT dithiothreitol
  • mercaptoethanol mercaptoethanol
  • the amount of reducing agent used for the production of BFP is not particularly limited as long as it does not affect the regeneration of BFP, but apoaequorin has an S—S bond formation due to the presence of three cysteine residues.
  • the concentration to prevent is preferred.
  • the final concentration is 1 mM dithiothreitol or 0.1% (v / v) mercaptoethanol.
  • the reaction temperature and reaction time in the production of BFP are not particularly limited.
  • the reaction temperature is 0 ° C. to 42 ° C. for 0.1 hour to 2 hours, 4 ° C. to 37 ° C. for 0.1 hour to 2 hours, or 4 ° C. to 15 ° C. 0.1 to 24 hours.
  • the BFP thus obtained may be further subjected to purification.
  • Purification of BFP can be performed according to a normal separation / purification method. Separation / purification methods include, for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc., alone or in appropriate combination. be able to.
  • BFP blue fluorescent protein
  • the BFP of the present invention acts on a luminescent substrate to cause it to emit light, and thus can be utilized as a luminescent catalyst. Accordingly, the present invention provides a light emitting method including bringing coelenterazine or an analog thereof into contact with the BFP of the present invention.
  • contact means that BFP and coelenterazine or an analogue thereof are present in the same reaction system, for example, adding BFP to a container containing coelenterazine or an analogue thereof, For example, adding coelenterazine or an analog thereof to the container accommodated, or mixing BFP and coelenterazine or an analog thereof.
  • the luminescent substrate used in the luminescent method of the present invention is, for example, coelenterazine or an analog thereof.
  • coelenterazine analog refers to a compound that can constitute a calcium-binding photoprotein such as aequorin as an apoprotein, like coelenterazine.
  • Coelenterazine or its analog used as a luminescent substrate is, for example, coelenterazine, h-coelenterazine, f-coelenterazine, cl-coelenterazine, n-coelenterazine, cp-coelenterazine, ch-coelenterazine, hch-coelenterazine, fch-coelenterazine, e-coelenterazine , Ef-coelenterazine, ech-coelenterazine, or hcp-coelenterazine, and preferably coelenterazine, h-coelenterazine, or e-coelenterazine.
  • Light emission occurs.
  • the normal light emission time is 0.5 to 3 hours, but the light emission time can be made longer or the light emission time can be made shorter depending on the selection of conditions.
  • the BFP of the present invention can also be used as a reporter protein for measuring transcriptional activity of a promoter or the like.
  • a vector is constructed in which a polynucleotide encoding an apoprotein is fused to a target promoter or other expression control sequence (for example, an enhancer).
  • the vector is introduced into a host cell, and the coelenteramide analog of the present invention and calcium ion or divalent or trivalent ion replaceable with calcium ion are brought into contact therewith, and fluorescence derived from the fluorescent protein of the present invention By detecting this, the activity of the target promoter or other expression control sequence can be measured.
  • contact means that a host cell, a coelenteramide analog, and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions are present in the same culture system / reaction system. Adding a coelenteramide analog and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be replaced with calcium ions to a host cell culture vessel; host cell or coelenteramide analog and divalent or replacing calcium ions or calcium ions Alternatively, mixing with trivalent ions, culturing host cells in the presence of coelenteramide analogs and calcium ions or divalent or trivalent ions that can replace calcium ions, and the like are included.
  • the BFP of the present invention can be used as a detection marker by fluorescence.
  • the detection marker of the present invention can be used for detecting a target substance in, for example, an immunoassay or a hybridization assay.
  • the BFP of the present invention can be used by binding to a target substance (protein or nucleic acid) by a commonly used method such as a chemical modification method. A detection method using such a detection marker can be performed by a normal method.
  • the detection marker of the present invention is expressed, for example, as a fusion protein of an apoprotein and a target substance, introduced into a cell by a technique such as a microinjection method, and the coelenteramide analog and calcium ion of the present invention. Alternatively, it can also be used to measure the distribution of the target substance by contacting divalent or trivalent ions that can be replaced with calcium ions.
  • contact means that cells, coelenteramide analogs and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions are present in the same culture system / reaction system, for example, Adding a coelenteramide analog and calcium ions or divalent or trivalent ions replaceable with calcium ions to a cell culture vessel; divalent or trivalent replaceable cells, coelenteramide analog and calcium ions or calcium ions; And culturing host cells in the presence of coelenteramide analogs and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions.
  • Such distribution of the target substance can also be measured using a detection method such as fluorescence imaging.
  • the apoprotein can be expressed in the cell and used in addition to being introduced into the cell by a technique such as a microinjection method.
  • the BFP of the present invention generates fluorescence upon receiving light excitation. Therefore, the BFP of the present invention can be suitably used as a fluorescent base material for amusement goods. Examples of amusement goods include fluorescent soap bubbles, fluorescent ice, fluorescent glaze, fluorescent paints, and the like.
  • the amusement product of the present invention can be manufactured by a usual method.
  • the green fluorescent protein (gFP) of the present invention is a complex in which the coelenteramide analog of the present invention is coordinated to the apoprotein of the calcium-binding photoprotein. That is, the gFP of the present invention includes the coelenteramide analog of the present invention and the apoprotein of the calcium-binding photoprotein. gFP can generate fluorescence upon excitation of light.
  • the gFP of the present invention can be obtained by removing calcium ions or divalent or trivalent ions replaceable with calcium ions from the aforementioned BFP.
  • BFP is treated with a chelating agent for removing calcium ions or divalent or trivalent ions capable of substituting with calcium ions. Can be removed from BFP.
  • the chelating agent used to produce gFP in the present invention is not particularly limited as long as it is strongly bound to calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions.
  • chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol bis ( ⁇ -aminoethyl ether) N, N, N ′, N′-tetraacetic acid (EGTA), trans-1,2-diaminocyclohexane N, N , N ′, N′-tetraacetic acid (CyDTA), N- (2-hydroxyethyl) iminodiacetic acid (HIDA), and the like.
  • the divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions are as described above.
  • the amount of chelating agent used for the production of gFP is not particularly limited as long as it does not affect gFP regeneration. Since it is shown that 3 mol of calcium ions bind to 1 mol of ionic apoaequorin, for example, 3 mol% or more is preferable.
  • the reaction temperature and reaction time in the production of gFP are not particularly limited.
  • the reaction temperature is 0 ° C. to 42 ° C. for 0.1 hour to 2 hours, 4 ° C. to 37 ° C. for 0.1 hour to 2 hours, or 4 ° C. to 15 ° C. 0.1 to 24 hours.
  • the gFP thus obtained may be further subjected to purification.
  • the purification of gFP can be performed according to a normal separation / purification method. Separation / purification methods include, for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc., alone or in appropriate combination. be able to.
  • the gFP of the present invention can also be used as a reporter protein for measurement of transcriptional activity of a promoter or the like.
  • a vector is constructed in which a polynucleotide encoding an apoprotein is fused to a target promoter or other expression control sequence (for example, an enhancer).
  • the vector is introduced into a host cell, and the coelenteramide analog of the present invention is brought into contact therewith to produce BFP, and then calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted with calcium ions are removed.
  • the activity of the target promoter or other expression control sequence can be measured by generating gFP by contacting with a chelating agent for the purpose and detecting the fluorescence derived from the gFP of the present invention.
  • the gFP of the present invention can be used as a detection marker by fluorescence.
  • the detection marker of the present invention can be used for detecting a target substance in, for example, an immunoassay or a hybridization assay.
  • the gFP of the present invention can be used by binding to a target substance (protein or nucleic acid) by a commonly used method such as a chemical modification method. A detection method using such a detection marker can be performed by a normal method.
  • the detection marker of the present invention is expressed, for example, as a fusion protein of an apoprotein and a target substance, introduced into a cell by a technique such as a microinjection method, and further contacted with the coelenteramide analog of the present invention.
  • Distribution of the target substance by, for example, generating BFP by contacting with a chelating agent for removing calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions, etc. Can also be used to measure. Such measurement of the distribution of the target substance can also be performed using a detection method such as fluorescence imaging.
  • the apoprotein can be expressed in the cell and used in addition to being introduced into the cell by a technique such as a microinjection method.
  • amusement article material The gFP of the present invention can be suitably used as a fluorescent material for amusement article materials.
  • Examples of amusement goods include fluorescent soap bubbles, fluorescent ice, fluorescent glaze, fluorescent paints, and the like.
  • the amusement product of the present invention can be manufactured by a usual method.
  • Calcium-binding photoprotein As shown in FIG. 1, calcium-binding photoproteins such as aequorin are present in the presence of a chelating agent for removing calcium ions such as EDTA or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions. Below, it can manufacture by making coelenterazine or its analog react with gFP.
  • the calcium-binding photoprotein of the present invention can be produced from the gFP of the present invention. That is, the calcium-binding photoprotein of the present invention can be obtained by reacting gFP with coelenterazine, which is a luminescent substrate, or an analog thereof.
  • the reaction between gFP and coelenterazine or its analog is performed by bringing gFP into contact with coelenterazine or its analog.
  • Contact means that the gFP of the present invention and coelenterazine or an analog thereof are present in the same reaction system.
  • the gFP of the present invention is added to a container containing coelenterazine or an analog thereof.
  • Coelenterazine or its analogs used in the production of the calcium-binding photoprotein of the present invention include, for example, coelenterazine, h-coelenterazine, f-coelenterazine, cl-coelenterazine, n-coelenterazine, cp-coelenterazine, ch-coelenterazine, hch-coelenterazine , Fch-coelenterazine, e-coelenterazine, ef-coelenterazine, ech-coelenterazine, hcp-coelenterazine, etc., preferably coelenterazine, h-coelenterazine, or e-coelenterazine.
  • the method for obtaining these coelenterazines or their analogs is as described above.
  • the amount of coelenterazine or its analog used for the production of calcium-binding photoprotein is not particularly limited, but may be, for example, 1.2 mol or more with respect to 1 mol of gFP.
  • the reaction temperature and reaction time in the production of the calcium-binding photoprotein are not particularly limited.
  • the reaction temperature is 0 to 42 ° C. for 0.1 to 2 hours, 4 to 37 ° C. for 0.1 to 2 hours, or 4 to 4 ° C. It is 0.1 to 24 hours at 15 ° C.
  • the reaction between the fluorescent protein and coelenterazine or its analog is preferably carried out in the presence of calcium ions or a chelating agent for removing divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions.
  • the chelating agent used for producing gFP in the present invention is the same as described above.
  • the reaction between the fluorescent protein and coelenterazine or an analog thereof is performed in the presence of a reducing agent.
  • a reducing agent used at this time is, for example, dithiothreitol (DTT) or mercaptoethanol.
  • DTT dithiothreitol
  • the amount of the reducing agent used for the production of the calcium-binding photoprotein is not particularly limited as long as it does not affect the regeneration. However, since apoaequorin has three cysteine residues, it has an SS bond. A concentration that prevents formation is preferred. For example, the final concentration is 1 mM dithiothreitol or 0.1% (v / v) mercaptoethanol.
  • the calcium-binding photoprotein of the present invention is a photoprotein (holoprotein) that emits light by the action of calcium ions. Therefore, the photoprotein of the present invention can be used for detection or quantification of calcium ions.
  • a photoprotein composed of apoprotein and a peroxide of coelenterazine analog is used.
  • the photoprotein can be produced according to the method described above. Detection or quantification of calcium ions can be performed by directly adding the sample solution to the photoprotein solution and measuring the generated luminescence. Alternatively, calcium ions can be detected or quantified by adding a photoprotein solution to the sample solution and measuring the generated luminescence.
  • the detection or quantification of calcium ions can be performed by measuring the luminescence of the photoprotein of the present invention by calcium ions using a luminescence measuring device.
  • a luminescence measuring device a commercially available device such as Centro® LB® 960 (manufactured by Bertrand) can be used. Quantification of the calcium ion concentration can be measured by creating a luminescence standard curve for a known calcium ion concentration using a photoprotein.
  • BRET Bioluminescence Resonance Energy Transfer
  • the photoprotein of the present invention when used as a donor protein and an organic compound or a fluorescent protein is used as an acceptor, the interaction between the proteins is detected by causing bioluminescence resonance energy transfer (BRET) between them. be able to.
  • the organic compound used as an acceptor is Hoechist3342, Indo-1 or DAP1.
  • the fluorescent protein used as an acceptor is green fluorescent protein (GFP), blue fluorescent protein (BFP), mutant GFP fluorescent protein, phycobilin, or the like.
  • the physiological function to be analyzed is orphan receptor (especially G protein-coupled receptor), apoptosis, or transcriptional regulation by gene expression.
  • the enzyme to be analyzed is a protease, esterase or phosphorylase.
  • Analysis of physiological functions by the BRET method can be performed by a known method, for example, the method described in Biochem. J. 2005, 385, 625-637, or Expert ⁇ Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541-556 It can be performed according to.
  • the enzyme activity can also be measured by a known method, for example, according to the method described in Nat Methods 2006, 3: 165-174, or Biotechnol J. 2008, 3: 311-324. Can do.
  • CTMD derivatives were synthesized by the following synthesis method based on h-coelenteratiothioamide, h-coelentersulfonamide, and h-coelenteramide.
  • the fluorescence ability of the synthetic compound was evaluated by determining the solubility in an aqueous solvent and the fluorescence quantum yield in an aqueous solvent or an organic solvent.
  • Phenylacetyl chloride (Wako), 4- (dimethylamino) pyridine (Wako), 1.0 M boron tribromide / dichloromethane solution (Aldrich), Lawson's reagent (Aldrich), benzylsulfonyl chloride (Wako), acetic anhydride (Wako) , Triethylamine (Wako), sodium hydroxide (Wako), dehydrated pyridine (Wako), acetyl chloride (Wako), methanesulfonyl chloride (Wako), p-toluenesulfonyl chloride (Kanto), p-nitrobenzenesulfonyl chloride (Aldrich), Phenylboronic acid (Acros organics), sodium carbonate (Wako), and dichlorobis (triphenylphosphine) palladium (II) (Aldrich).
  • IR infrared spectrometer spectrum
  • HRMS high resolution mass spectrometry
  • 3-benzyl-5- (4-methoxyphenyl) -2- (phenylacetylamino) pyrazine (c-16) (539 mg, 1.32 mmol) was suspended in dehydrated toluene (50 mL) at room temperature. Lawesson reagent (320 mg, 790 ⁇ mol) was added to this while stirring, and the mixture was heated to reflux for 17 hours. After refluxing, the mixture was allowed to cool to room temperature and concentrated under reduced pressure using a rotary evaporator.
  • a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and ethyl acetate were added thereto to stop the reaction, and the aqueous layer and the organic layer were separated, followed by extraction with ethyl acetate three times.
  • the organic layer was washed 3 times with water and once with saturated brine, and then dried over anhydrous sodium sulfate. After anhydrous sodium sulfate was removed by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure using a rotary evaporator.
  • IR (KBr, cm -1 ) 513, 596, 640, 654, 710, 746, 851, 910, 1016, 1136, 1167, 1198, 1217, 1373, 1423, 1452, 1466, 1493, 1508, 1535, 1630, 1746, 3148, 3289.
  • triethylamine (145 ⁇ L, 1.04 mmol), dehydrated dichloromethane (1.0 mL), and benzylsulfonyl chloride (131 mg, 687 ⁇ mol) were sequentially added thereto, followed by stirring for 1 hour.
  • triethylamine (145 ⁇ L, 1.04 mmol), dehydrated dichloromethane (1.0 mL), and benzylsulfonyl chloride (131 mg, 687 ⁇ mol) were sequentially added thereto, followed by stirring for 2 hours.
  • a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added thereto to stop the reaction, and the mixture was extracted twice with dichloromethane.
  • the organic layer was washed once with water and once with a saturated aqueous solution of sodium sulfate, and then dried using anhydrous sodium sulfate.
  • Anhydrous sodium sulfate was removed by filtration, and the filtrate was concentrated under reduced pressure using a rotary evaporator.
  • 2-amino-3-benzyl-5-phenylpyrazine (c-41) (852 mg, 3.26 mmol) was dissolved in dehydrated dichloromethane (25 mL), and triethylamine (1.38 mL, 9.87 mmol) was added thereto. In addition, it was cooled to 0 ° C. Benzylsulfonyl chloride (1.87 g, 9.80 mmol) was added thereto, and the mixture was warmed to room temperature and stirred for 23.5 hours.
  • Example 1 The fluorescence quantum yield of each synthesized CTMD analog was determined by the following procedure. The fluorescence spectrum was measured at 25 ° C. using an FP-6500 fluorescence spectrophotometer from Jasco (JASCO Corporation, Tokyo). Specifically, a quartz cell (optical path length 10 mm) is used, and the CTMD analog is dissolved in methanol (MeOH) or 67 mM phosphate buffer solution (PB) (pH 7.4) so that the final concentration is 750 nM.
  • MeOH methanol
  • PB 67 mM phosphate buffer solution
  • Measurement was performed three times at a wavelength of 330 nm, emission / excitation bandwidth: 3 nm, response: 0.5 seconds, scan speed: 100 nm / min, and the average spectrum was defined as a compound fluorescence spectrum.
  • the fluorescence quantum yield was determined after spectral correction.
  • Quinine sulfate was used as a standard control solution for fluorescence quantum yield. After quinine sulfate (Wako Pure Chemical Industries) was dissolved in a 0.1 N aqueous sulfuric acid solution, the excitation light was measured at 366 nm, under the above-described fluorescence measurement conditions. The relative fluorescence quantum yield (fluorescence intensity) of the compound was calculated by setting the quantum yield of quinine sulfate to 0.55.
  • the coelenteramide analogs of the present invention (c-14, c-17, c-31, c-15, c-18, c-32, c-21, c-20, c-39, c- 34, c-35, c-42, c-37, c-40, or c-36) have different fluorescence characteristics from known CTMD (c-4), h-CTMD (c-13), etc. I understood.
  • c-15, c-18, c-32, c-21, c-20, c-39, c-34, c-35, c-42, or c- No. 37 has a fluorescence quantum yield of 0.090 or more in an organic solvent or an aqueous solvent, and was found to have strong fluorescence ability.
  • c-15, c-18, c-32, c-21, c-20, c-35, c-42, or c-37 has a fluorescence quantum yield of 0.100 in an organic or aqueous solvent. This is the above, and it has been found that it has particularly strong fluorescence ability.
  • fluorescent compounds are known to have a significantly reduced fluorescence ability in an aqueous solution even if they have a strong fluorescence ability in an organic solvent.
  • c-18, c-32, or c- As for 37 it was found that the fluorescence quantum yield was 0.100 or more in an organic solvent or an aqueous solvent, and particularly strong fluorescence ability was maintained.
  • Example 2 The fluorescence quantum yield obtained in Example 1 is a numerical value calculated by measuring the fluorescence spectrum with the final concentration of the coelenteramide analog being 750 nM, but when the final concentration is 750 nM as in Example 1, Among the coelenteramide analogs of the present invention, c-14, c-31, and c-36 cannot detect fluorescence spectra in methanol and phosphate buffer, and c-25 is in phosphate buffer. The fluorescence spectrum could not be detected with (nd: not detectable).
  • FIG. 3 also shows the fluorescence spectrum of c-45 (CTTD) in 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 10 mM CaCl 2 .
  • the fluorescence spectrum data of c-4, c-14, c-31, c-25 and c-36 are summarized in Table 2.
  • the coelenteramide analog of the present invention containing c-14, c-31, and c-36 has fluorescence ability in an organic solvent and an aqueous solution. Further, it was confirmed that c-45 has fluorescence ability at least in an aqueous solution.
  • c-44 CTTD
  • c-17 hCTTD is considered to have fluorescence ability similar to c-17 because c-17 (hCTTD) has fluorescence ability.
  • the coelenteramide analog of the preferred embodiment of the present invention has fluorescence ability in both an organic solvent and an aqueous solution, and thus can be applied to a wide range of applications such as bioassay and in vivo molecular imaging. It is.
  • Example 3 For c-38, the fluorescence spectrum was measured at 25 ° C. using an FP-6500 fluorescence spectrophotometer from Jasco (JASCO Corporation, Tokyo). Specifically, using a quartz cell (optical path length 10 mm), c-38 was dissolved in 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 10 mM CaCl 2 so that the final concentration was 18 ⁇ M, and the excitation wavelength was 330 The measurement was carried out three times at nm, emission / excitation bandwidth: 3 nm, response: 0.5 seconds, scan speed: 100 nm / min, and the average spectrum was taken as the fluorescence spectrum.
  • FIG. 4 shows the fluorescence spectrum of c-38 (CTSD) with 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 10 mM CaCl 2 . From FIG. 4, it was found that c-38 has fluorescence ability.
  • [Sequence Listing Free Text] [SEQ ID NO: 1] This is the base sequence of natural apoaequorin.
  • SEQ ID NO: 2] is the amino acid sequence of natural apoaequorin.
  • SEQ ID NO: 3 This is the base sequence of natural apocrytin-I.
  • SEQ ID NO: 4] is an amino acid sequence of natural apocrytin-I.
  • SEQ ID NO: 5 This is the base sequence of natural apocrytin-II.
  • SEQ ID NO: 6] is the amino acid sequence of natural apocrytin-II.
  • SEQ ID NO: 7] is the base sequence of natural apomytrocomin.
  • [SEQ ID NO: 8] is an amino acid sequence of natural apomytrocomin.
  • [SEQ ID NO: 9] This is the base sequence of natural apooverin.
  • [SEQ ID NO: 10] is the amino acid sequence of natural apooverin.
  • [SEQ ID NO: 11] This is the base sequence of natural apovelvoin.
  • [SEQ ID NO: 12] is an amino acid sequence of natural apovelvoin.

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Abstract

　従来のものと異なる蛍光特性を示す蛍光蛋白質を製造するためのセレンテラミド類縁体等が求められていた。一般式（１）で表わされる化合物（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、脂肪族環式基、又は複素環式基であり、Ｒ２は、水素、又は－（ＳＯ２）Ｒ４であり、Ｒ３は、水素、水酸基、メトキシ、又はアセトキシであり、Ｒ４は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキルであり、Ｘ1は、－Ｃ（＝Ｓ）－、又は－ＳＯ２－である。）。

Description

セレンテラミド類縁体
　本発明は、セレンテラミド類縁体、及びそのセレンテラミド類縁体を含む蛍光蛋白質等に関する。
　セレンテラミド（CTMD）は、セレンテラジンの酸化生成物である。腔腸動物由来のカルシウム結合型発光蛋白質の発光過程や、ウミシイタケ（Renilla）やガウシア（Gaussia）などのセレンテラジン（CTZ）系ルシフェラーゼによる発光過程において生成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
　カルシウム結合型発光蛋白質は、Ca2+と特異的に結合し瞬間的に発光する発光蛋白質であり、セレンテラジンのペルオキシドとアポ蛋白質の複合体から構成されている(非特許文献１. Head, J. F. et al. (2000) Nature 405: 372－376)。このようなカルシウム結合型発光蛋白質の中で、代表的な発光蛋白質は発光オワンクラゲ由来のイクオリンである。イクオリンの他に、オベリン、マイトロコミン、クライティン－I、及びクライティン－II等が知られている。その発光機構は、基本的に同じと考えられている。Ca2+添加により発光反応したイクオリン溶液は、青色の蛍光を発することから、CTZの酸化生成物であるCTMDとアポイクオリン－Ca2+との複合体が形成される推定され、その複合体は、BFP（Blue Fluorescent Protein）と呼ばれていた。近年、BFPは、組換えイクオリンより定量的に調製する方法が確立された（非特許文献2及び3：Inouye, S. (2004) FEBS Lett. 577:105－110, Inouye, S. and Sasaki, S (2006) FEBS Lett.  580: 1977－1982）。BFPは、熱安定性を有する蛍光蛋白質であり、しかも、CTZを基質としてルシフェラーゼ活性を有することも証明された。一方、キレート剤を添加し、アポイクオリン－Ca2+からCa2+を取り除くことにより、緑色様蛍光蛋白質(gFP)が生成することも示された。さらに、このgFPにCTZを添加することによる、発光能をもつイクオリンへの再生法も確立された。蛍光能をもち且つルシフェラーゼ活性を有する蛋白質は、BFPのみであり、イクオリンへ再生できることから、細胞生物学の領域でレポーター蛋白質として用いられる可能性があり、注目されている。
　ここで、非特許文献4－21には、下記の蛍光性セレンテラミド関連化合物が開示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
  
　また、非特許文献4－21には、前記したセレンテラミド関連化合物の構造とそれらの蛍光特性が開示されている。
国際公開第WO2005/014633号パンフレット
Head, J.F. et al. Nature 405, 372－376 (2000) Inouye, S. FEBS Lett. 577, 105－110 (2004) Inouye, S. and Sasaki, S. FEBS Lett. 580, 1977－1982 (2006) O. Shimomura, F. H. Johnson, Tetrahedron Lett., 31, 2963 (1973). K. Hori, J. E. Wampler, J. C. Matthews, M. J. Cormier, Biochemistry, 12, 4463 (1973). F. McCapra, M. J. Manning, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 467 (1973). K. Hori, J. E. Wampler, M. J. Cormier, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 492 (1973). K. Teranishi, T. Goto, Bull. Chem. Soc. Jpn., 63, 3132 (1990). T. Hirano, , Y. Gomi, T.　Takahashi, K. Kitahara, C. F. Qi, I. Mizogushi, S. Kyushin, M. Ohashi, Tetrahedron Lett., 33, 5771 (1992). K. Teranishi, K. Ueda, H. Nakao, M. Hisamatsu, T. Yamada, Tetrahedron Lett., 35, 8181 (1994). F. Q. Chen, J. L. Zheng, T. Hirano, H. Niwa, Y. Ohmiya, M. Ohashi, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2129 (1995). R. Saito, T. Hirano, H. Niwa, M. Ohashi, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1711 (1997). K. Teranishi, M. Hisamatsu, T. Yamada, Tetrahedron Lett., 38, 2689 (1997). T. Hirano, Y. Ohmiya, S. Maki, H. Niwa, M. Ohashi, Tetrahedron Lett., 39, 5541 (1998). F. Q. Chen, J. L. Zheng, T. Hirano, Y. Ohmiya, S. Maki, H. Niwa, M. Ohashi, Bull. Chem. Soc. Jpn., 73, 465 (2000). O. Shimomura, K. Teranishi, Luminescence, 15, 51 (2000). K. Teranishi, Luminescence, 16, 367 (2001). Y. Imai, T. Shibata, S. Maki, H. Niwa, M. Ohashi, T. Hirano, J. Photochem. Photobiol., A, 146, 95 (2001). M. Kuse, N. Kondo, Y. Ohyabu, M. Isobe, Tetrahedron, 60, 835 (2004). N. Kondo, M. Kuse, T. Mutarapat, N. Thasana, M. Isobe, Heterocycles, 65, 843 (2005). K. Mori, S. Maki, H. Niwa, H. Ikeda, T. Hirano, Tetrahedron, 62, 6272 (2006).
　上記状況において、従来のものと異なる蛍光特性を示すセレンテラミド類縁体、及びそのようなセレンテラミド類縁体を含有する蛍光蛋白質等が求められていた。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定のチオアミド系セレンテラミド類縁体、及び特定のスルホンアミド系セレンテラミド類縁体が、従来のものと異なる蛍光特性を示すことなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下に示す、セレンテラミド類縁体、及び蛍光蛋白質などを提供する。
（１）下記一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
  
で表わされる化合物
（式中、
　Ｒ１は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、脂肪族環式基、又は複素環式基であり、
　Ｒ２は、水素、又は－（ＳＯ２）Ｒ４であり、
　Ｒ３は、水素、水酸基、メトキシ、又はアセトキシであり、
　Ｒ４は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキルであり、
　Ｘ1は、－Ｃ（＝Ｓ）－、又は－ＳＯ２－である。）。
（２）一般式（１）において、
　Ｒ１は、フェニル、ｐ－メチルフェニル、ｐ－ヒドロキシフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－アセトキシフェニル、ｐ－ニトロフェニル、ベンジル、α－ヒドロキシベンジル、４－メチルベンジル、４－ヒドロキシベンジル、４－メトキシベンジル、４－アセトキシベンジル、４－ニトロベンジル、フェニルエチル、メチル、エチル、プロピル、２－メチルプロピル、２－メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、又はチオフェン－２－イルであること、
　を特徴とする、上記（１）に記載の化合物。
（３）一般式（１）において、
　Ｒ２は、水素、ベンゼンスルホニル、ｐ－トルエンスルホニル、４－ヒドロキシフェニルスルホニル、４－メトキシフェニルスルホニル、４－アセトキシフェニルスルホニル、４－ニトロフェニルスルホニル、ベンジルスルホニル、α－ヒドロキシベンジルスルホニル、４－メチルベンジルスルホニル、４－ヒドロキシベンジルスルホニル、４－メトキシベンジルスルホニル、４－アセトキシベンジルスルホニル、４－ニトロベンジルスルホニル、フェニルエチルスルホニル、メタンスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、２－メチルプロピルスルホニル、２－メチルプロパニルスルホニル、シクロヘキシルメチルスルホニル、シクロヘキシルエチルスルホニル、アダマンチルメチルスルホニル、又はシクロペンチルメチルスルホニルであること、
　を特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の化合物。
（４）下記化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
  
からなる群から選択される、上記（１）～（３）のいずれか１項に記載の化合物。
（５）下記化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
  
からなる群から選択される、上記（１）～（３）のいずれか１項に記載の化合物。
（５ａ）下記化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
  
からなる群から選択される、上記（１）～（３）のいずれか１項に記載の化合物。
（６）上記（１）～（５ａ）のいずれか１項に記載の化合物、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを含む、青色蛍光蛋白質。
（７）カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下、上記（１）～（５ａ）のいずれか１項に記載の化合物と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを反応させることを含む、青色蛍光蛋白質の製造方法。
（８）前記反応を、還元剤の存在下において行う、上記（７）に記載の方法。
（９）上記（１）～（５ａ）のいずれか１項に記載の化合物、及びカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を含む、緑色蛍光蛋白質。
（１０）上記（６）に記載の青色蛍光蛋白質を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することを含む、緑色蛍光蛋白質の製造方法。
（１１）上記（９）に記載の緑色蛍光蛋白質に、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることを含む、カルシウム結合型発光蛋白質の製造方法。
（１２）蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、還元剤の存在下において行う、上記（１１）に記載の方法。
　本発明のいくつかの態様のセレンテラミド類縁体は、従来のものと異なる蛍光特性を示す。本発明の好ましい態様のセレンテラミド類縁体は、水溶媒中で比較的高い蛍光能を示す。
セレンテラミドからBFP、gFP及びイクオリンなどを製造するためのスキームを示す図である。 最終濃度30 μMセレンテラミド類縁体のメタノール中での蛍光スペクトルを示す図である（実施例２）。 最終濃度30 μMセレンテラミド類縁体のリン酸緩衝液中での蛍光スペクトルを示す図である（実施例２）。 最終濃度18 μM のc－38化合物（CTSD）の10 mM CaCl2 を含む50 mM Tris－HCl (pH7.6)中での蛍光スペクトルを示す図である（実施例３）。
　以下、本発明について詳細に説明する。
１．セレンテラミド類縁体
　本発明は、下記一般式（１）で表わされる化合物（本発明のセレンテラミド類縁体）を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
  
（式中、
　Ｒ１は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、脂肪族環式基、又は複素環式基であり、
　Ｒ２は、水素、又は－（ＳＯ２）Ｒ４であり、
　Ｒ３は、水素、水酸基、メトキシ、又はアセトキシであり、
　Ｒ４は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキルであり、
　Ｘ1は、－Ｃ（＝Ｓ）－、又は－ＳＯ２－である。）。
　Ｒ１の「置換若しくは非置換のアリール」は、例えば１～５個の置換基を有するアリール、又は非置換のアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１～６個のアルキル、炭素数１～６個のアルコキシル、アミノ、及び炭素数１～６個のジアルキルアミノなどからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、置換基は水酸基である。「置換若しくは非置換のアリール」は、具体的には、フェニル、ｐ－ヒドロキシフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－アセトキシフェニル、ｐ－ニトロフェニル、ｐ－アミノフェニル、又はｐ－ジメチルアミノフェニルなどであり、好ましくは、フェニル、ｐ－ヒドロキシフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－アセトキシフェニル、又はｐ－ニトロフェニルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは非置換のアリール」は、置換のアリールであり、例えば、ｐ－ヒドロキシフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－アセトキシフェニル、又はｐ－ニトロフェニルなどである。
　Ｒ１の「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、例えば１～５個の置換基を有するアリールアルキル、又は非置換のアリールアルキルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１～６個のアルキル、炭素数１～６個のアルコキシル、アミノ、又は炭素数１～６個のジアルキルアミノなどが挙げられる。「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、例えば、ベンジル、α－ヒドロキシベンジル、４－メチルベンジル、４－ヒドロキシベンジル、４－メトキシベンジル、４－アセトキシベンジル、４－ニトロベンジル、フェニルエチル４－ヒドロキシベンジル、又は４－ジメチルアミノベンジルなどであり、好ましくは、ベンジル、α－ヒドロキシベンジル、４－メチルベンジル、４－ヒドロキシベンジル、４－メトキシベンジル、４－アセトキシベンジル、４－ニトロベンジル、又はフェニルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、水酸基で置換されたアリールアルキルであり、例えば、α－ヒドロキシベンジル、又は４－ヒドロキシベンジルなどである。本発明の別の態様では、「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、非置換のアリールアルキルであり、例えば、ベンジル、又はフェニルエチルなどである。
　Ｒ１の「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、非置換の直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、又は例えば１～１０個の脂肪族環式基によって置換された直鎖若しくは分枝鎖のアルキルである。脂肪族環式基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、又はアダマンチルなどである。「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、２－メチルプロピル、２－メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロブチルメチル、又はシクロプロピルメチルなどであり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、２－メチルプロピル、２－メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、又はシクロペンチルメチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、又はシクロヘキシルエチルなどである。
　Ｒ１の「脂肪族環式基」は、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシルなどである。
　Ｒ１の「複素環式基」は、環を構成する原子として炭素以外にＮ、Ｏ、及びＳからなる群から選択される１～３個の原子を含む例えば５～７員環であって炭素を介して結合する基、又は２つ以上のそのような環が縮環したものであって炭素を介して結合する基、若しくは、そのような環とベンゼン環が縮環したものであって炭素を介して結合する基である。「複素環式基」は、例えば、チオフェン－２－イル、２－フラニル、又は４－ピリジルなどである。本発明のいくつかの態様では、「複素環式基」は、硫黄を含む複素環式基であり、例えば、チオフェン－２－イルである。
　本発明の好ましい態様によれば、Ｒ１は、フェニル、ｐ－メチルフェニル、ｐ－ヒドロキシフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－アセトキシフェニル、ｐ－ニトロフェニル、ベンジル、α－ヒドロキシベンジル、４－メチルベンジル、４－ヒドロキシベンジル、４－メトキシベンジル、４－アセトキシベンジル、４－ニトロベンジル、フェニルエチル、メチル、エチル、プロピル、２－メチルプロピル、２－メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、又はチオフェン－２－イルなどである。本発明のさらに好ましい態様によれば、Ｒ１は、ｐ－メチルフェニル、ｐ－ニトロフェニル、ベンジル、又はメチルなどである。
　Ｒ２の「－（ＳＯ２）Ｒ４」において、Ｒ４の「置換若しくは非置換のアリール」は、例えば１～５個の置換基を有するアリール、又は非置換のアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１～６個のアルキル、炭素数１～６個のアルコキシル、アミノ、及び炭素数１～６個のジアルキルアミノなどからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、置換基は水酸基である。「置換若しくは非置換のアリール」は、具体的には、フェニル、ｐ－ヒドロキシフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－アセトキシフェニル、ｐ－ニトロフェニル、ｐ－ヒドロキシベンジル、又はｐ－ジメチルアミノベンジルなどであり、好ましくは、フェニル、ｐ－ヒドロキシフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－アセトキシフェニル、又はｐ－ニトロフェニルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは非置換のアリール」は、置換のアリールであり、例えば、ｐ－ヒドロキシフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－アセトキシフェニル、又はｐ－ニトロフェニルなどである。
　Ｒ４の「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、例えば１～６個の置換基を有するアリールアルキル、又は非置換のアリールアルキルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１～６個のアルキル、炭素数１～６個のアルコキシル、アミノ、及び炭素数１～６個のジアルキルアミノなどが挙げられる。「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、例えば、ベンジル、α－ヒドロキシベンジル、４－メチルベンジル、４－ヒドロキシベンジル、４－メトキシベンジル、４－アセトキシベンジル、４－ニトロベンジル、フェニルエチル、４－ヒドロキシベンジル、又は４－ジメチルアミノベンジルなどであり、好ましくは、ベンジル、α－ヒドロキシベンジル、４－メチルベンジル、４－ヒドロキシベンジル、４－メトキシベンジル、４－アセトキシベンジル、４－ニトロベンジル、又はフェニルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、水酸基で置換されたアリールアルキルであり、例えば、α－ヒドロキシベンジル、又は４－ヒドロキシベンジルなどである。本発明の別の態様では、「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、非置換のアリールアルキルであり、例えば、ベンジル、又はフェニルエチルなどである。
　Ｒ４の「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、非置換の直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、又は例えば１～１０個の脂肪族環式基によって置換された直鎖若しくは分枝鎖のアルキルである。脂肪族環式基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、又はアダマンチルなどである。「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、２－メチルプロピル、２－メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロブチルメチル、又はシクロプロピルメチルなどであり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、２－メチルプロピル、２－メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、又はシクロペンチルメチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、又はシクロヘキシルエチルなどである。
　本発明の好ましい態様によれば、Ｒ２は、水素、ベンゼンスルホニル、ｐ－トルエンスルホニル、４－ヒドロキシフェニルスルホニル、４－メトキシフェニルスルホニル、４－アセトキシフェニルスルホニル、４－ニトロフェニルスルホニル、ベンジルスルホニル、α－ヒドロキシベンジルスルホニル、４－メチルベンジルスルホニル、４－ヒドロキシベンジルスルホニル、４－メトキシベンジルスルホニル、４－アセトキシベンジルスルホニル、４－ニトロベンジルスルホニル、フェニルエチルスルホニル、メタンスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、２－メチルプロピルスルホニル、２－メチルプロパニルスルホニル、シクロヘキシルメチルスルホニル、シクロヘキシルエチルスルホニル、アダマンチルメチルスルホニル、又はシクロペンチルメチルスルホニルなどである。本発明のさらに好ましい態様によれば、Ｒ２は、水素、ベンジルスルホニル、メタンスルホニル、又はニトロベンゼンスルホニルなどである。
　本発明のいくつかの態様によれば、一般式（１）で表わされる化合物は、下記一般式（２）で表わされる化合物（本発明のスルホンアミド系セレンテラミド）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
  
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記の通りである。）
　好ましくは、一般式（２）で表わされる化合物は、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
  
　より好ましくは、一般式（２）で表わされる化合物は、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
  
　さらに好ましくは、一般式（２）で表わされる化合物は、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
  
　本発明の別の態様によれば、一般式（１）で表わされる化合物は、下記一般式（３）で表わされる化合物（本発明のチオアミド系セレンテラミド）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
  
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記の通りである。）
　好ましくは、一般式（３）で表わされる化合物は、下記式で表わされる化合物からなる群から選択される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
  
　さらに好ましくは、一般式（３）で表わされる化合物は、下記式で表わされる化合物からなる群から選択される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
  
２．セレンテラミド類縁体の製造方法
２．１．スルホンアミド系セレンテラミド類縁体の製造方法
　本発明のセレンテラミド類縁体のうち、下記一般式（２）で表わされるスルホンアミド系セレンテラミドの製造方法について説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
  
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記の通りである。）
　一般式（２）で表わされるスルホンアミド系セレンテラミドは、例えば、
　一般式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
  
で表わされる化合物（式中、Ｒ３は、前記の通りである。）と、
　一般式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
  
で表わされる化合物（式中、Ｒ１は、前記の通りである。）を反応させることにより、製造することができる。
　一般式（４）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができる。例えば、一般式（４）で表わされる化合物は、Kishi, Y. et al., Tetrahedron Lett., 13, 2747－2748 (1972)、又はAdamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477－485 (2001) に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。より具体的には、次のようにして、一般式（４）で表わされる化合物を製造することができる。すなわち、まず、４塩化チタンなどのルイス酸触媒を用いて置換フェニルグリオキサールアルドキシムとグリシノニトリル誘導体との環化反応を行い、ピラジンオキシドを形成した後、Raney Ni等を触媒として用いた接触水素還元により製造するか、又は２－アミノ－５－ブロモピラジン誘導体と置換フェニルホウ酸或は置換フェニルホウ酸ピナコールエステルとの鈴木－宮浦カップリング反応を行うことで製造できる。
　一般式（５）で表わされる化合物も、公知の製造方法で製造することができ、或いは、市販のものを入手することができる。具体的には、例えば、１）対応する置換ベンジルスルホン酸又はその塩に対して過剰の塩化チオニルを作用させて加熱還流した後、減圧濃縮するか、又は、２）対応する置換ベンジルスルホン酸又はその塩に対してジクロロメタンなどの溶媒中、触媒量のＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）存在下、対応するカルボン酸に対して二塩化オキサリルをさせた後、減圧濃縮することにより、或いは３）置換ベンジルGrignard試薬に対し塩化スルフリルを反応させるか、のいずれかの方法又はそれらに準ずる方法で製造することができる。また、ベンジルスルホニルクロリドは東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、関東化学株式会社、などから購入することができる。
　ここで、一般式（２）で表わされる化合物の製造方法において使用される溶媒は、水系、又はアルコール類以外であればであれば特に限定されず、種々のものを使用できる。例えば、ピリジン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン、トルエン、ジオキサン又はエーテル等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
　また、一般式（２）で表わされる化合物の製造方法において、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、－２０℃～２００℃で、０．２５時間～７２時間、好ましくは、－２０℃～１００℃で、０．５時間～３６時間、より好ましくは、０℃～５０℃で、１時間～２４時間である。
　さらに、一般式（２）で表わされる化合物のうちR２＝Hである一部の化合物については、R２＝SO2R1である化合物、すなわちジスルホン酸アミド化合物のアルカリ加水分解を行い、一方のスルホン酸アミド結合のみを選択的に切断するか、又はそれに準ずる方法で製造することができる。
２．２．チオアミド系セレンテラミド類縁体
　本発明のセレンテラミド類縁体のうち、下記一般式（３）で表わされるスルホンアミド系セレンテラミドの製造方法について説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
  
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記の通りである。）
　一般式（３）で表わされるチオアミド系セレンテラミドは、例えば、
　一般式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
  
で表わされる化合物（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記の通りである。）に、ローソン試薬、又は五硫化二リン（十硫化四リン）を反応させることにより、製造することができる。
　一般式（６）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができる。具体的には、例えば、一般式（４）で表わされる化合物、及び一般式（７）で表わされる酸ハライド又はその類縁体とを有機溶媒中、塩基の存在下、又は塩基性有機溶媒中で反応させる方法か、又はそれらに準ずる方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
  
（式中、Ｒ１は前記の通りであり、Ｘはハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素）、又はＲ１Ｃ（＝Ｏ）－である。）
　ここで、一般式（３）で表わされる化合物の製造方法において使用される溶媒は、水系、又はアルコール類、ケトン類、エステル類以外であれば特に限定されず、種々のものを使用できる。例えば、トルエン、ベンゼン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、又はピリジン等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
　また、一般式（３）で表わされる化合物の製造方法において、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、０℃～２００℃で、０．５時間～７２時間、好ましくは、室温～２００℃で、１時間～４８時間、より好ましくは、６０℃～１５０℃で、２時間～２４時間である。
３．蛍光蛋白質
　図１に示すように、青色蛍光蛋白質（BFP）は、セレンテラミド又はその類縁体に、アポイクオリン等のアポ蛋白質を反応させることにより製造することができる。一方、緑色蛍光蛋白質(gFP)は、BFPを、EDTA等のカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することにより製造することができる。
３．１．青色蛍光蛋白質（BFP）
３．１．１．青色蛍光蛋白質（BFP）の製造方法
　本発明の青色蛍光蛋白質（BFP）は、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、本発明のセレンテラミド類縁体が配位した複合体である。すなわち、本発明のBFPは、本発明のセレンテラミド類縁体、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを含む。BFPは、光の励起を受けて蛍光を発生することができるとともに、BFPとセレンテラジン又はその類縁体と接触させることで、発光を生じさせることもできる。
　本発明では、BFPを、本発明のセレンテラミド類縁体から次のように製造する。すなわち、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下、本発明のセレンテラミド類縁体（例えば、一般式（１）で表わされる化合物）、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応させることで、BFPを製造する。
　本発明においてBFPを製造するのに用いる本発明のセレンテラミド類縁体は、前記で説明した通りである。本発明のセレンテラミド類縁体として、例えば、前記製造方法により製造した化合物を挙げることができる。
　本発明においてBFPを製造するのに用いるカルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンとは、カルシウムイオンに代えてカルシウム結合型発光蛋白質と反応させた場合に、発光反応を起こす２価又は３価のイオンのことである。つまり、カルシウム結合型発光蛋白質に対して、カルシウムイオンと同等の作用をするものである。カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンは、例えば、カルシウムイオン（Ｃａ２+）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ２＋）、バリウムイオン（Ｂａ２＋）、鉛イオン（Ｐｂ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、カドミウムイオン（Ｃｄ２＋）、イットリウムイオン（Ｙ３＋）、ランタンイオン（Ｌａ３＋）、サマリウムイオン（Ｓｍ３＋）、ユウロピウムイオン（Ｅｕ３＋）、ジスプロシウムイオン（Ｄｙ３＋）、ツリウムイオン（Ｔｍ３＋）、又はイットリビウムイオン（Ｙｂ３＋）等を挙げることができる。これらのうち、２価の金属イオンが好ましい。より好ましくは遷移金属以外の２価の金属イオン、例えばＣａ２＋、Ｓｒ２＋、又はＰｂ２＋等である。
　本発明においてBFPを製造するのに用いるカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質は、例えば、アポイクオリン、アポクライティン－Ｉ、アポクライティン－ＩＩ、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、又はアポベルボイン等である。本発明のいくつかの態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポクライティン－Ｉ、アポクライティン－ＩＩ、又はアポマイトロコミン等であり、例えば、アポイクオリンである。アポ蛋白質は、天然から採取したものであっても、遺伝子工学的に製造したものであってよい。さらに、アポ蛋白質は、BFPを形成できるものであれば、そのアミノ酸配列を天然のものから遺伝子組換え技術によって変異させたものであってもよい。
　天然から採取した発光蛋白質のアポ蛋白質（天然型アポ蛋白質）の塩基配列及びアミノ酸配列は、次の通りである。すなわち、天然型アポイクオリンの塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。天然型アポクライティン－Ｉの塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。天然型アポクライティン－ＩＩの塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。天然型アポマイトロコミンの塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に示す。天然型アポオベリンの塩基配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。天然型アポベルボインの塩基配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。
　組換え技術によって変異させたアポ蛋白質は、例えば、以下の（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される蛋白質である。
（ａ）天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列において１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質、
（ｂ）天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質、及び
（ｃ）天然型アポ蛋白質の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質。
　上記「天然型アポ蛋白質」は、例えば、アポイクオリン、アポクライティン－Ｉ、アポクライティン－ＩＩ、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、又はアポベルボイン等である。本発明のある態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポクライティン－Ｉ、アポクライティン－ＩＩ、又はアポマイトロコミン等であり、好ましくは、アポイクオリンである。これらの天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列又は塩基配列は、前記の通りである。
　上記「カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性又は機能」とは、例えば、蛋白質がセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する活性又は機能を意味する。「蛋白質がセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する」とは、具体的には、（１）蛋白質が、セレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合して発光蛋白質を形成すること、だけではなく（２）蛋白質が、酸素存在下に、セレンテラジン若しくはその誘導体と接触することにより、蛋白質とセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドとを含有する発光蛋白質（複合体）を形成すること、をも意味する。ここで、「接触」とは、蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器に蛋白質を添加すること、蛋白質を収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添加すること、又は蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれる。また、「セレンテラジン類縁体」は、セレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。セレンテラジン又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、ｈ－セレンテラジン、ｆ－セレンテラジン、ｃｌ－セレンテラジン、ｎ－セレンテラジン、ｃｐ－セレンテラジン、ｃｈ－セレンテラジン、ｈｃｈ－セレンテラジン、ｆｃｈ－セレンテラジン、ｅ－セレンテラジン、ｅｆ－セレンテラジン、ｅｃｈ－セレンテラジン、又はｈｃｐ－セレンテラジン等である。これらのセレンテラジン又はその類縁体の入手方法は、後に記載する。
　上記「１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列」における「１～複数個」の範囲は、例えば、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個（１～数個）、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個である。欠失、置換、挿入若しくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、“Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)”、 “Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1～38, John Wiley and Sons (1987－1997)”、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、又は“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
　また、上記「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、天然型アポ蛋白質の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。具体的には、コロニー或いはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（Saline－sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
　ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1～38, John Wiley and Sons (1987－1997)、又はGlover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
　ここで言う「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
　これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。
　本発明で使用することができる組換えアポ蛋白質として、例えば、Shimomura, O. and Inouye, S.Protein Express. Purif. (1999) 16: 91－95に記載の組換えイクオリン、Inouye, S. and Sahara, Y. Protein Express. Purif. (2007) 53: 384－389に記載の組換えクライティン－I、又はInouye, S. J.Biochem. (2008)143: 711－717に記載の組換えクライティン－IIなどを挙げることができる。
　本発明のいくつかの態様において、アポ蛋白質は、全てのシステイン残基をセリン残基で置換したものである。BFPは、アポ蛋白質中のシステイン残基の遊離ＳＨ基が酸化されてＳ－Ｓ結合を生成すると、化学発光活性を失う。したがって、システイン残基がセリン残基で置換されＳ－Ｓ結合を生じることができなくなったアポ蛋白質は、化学発光活性をほとんど失わず、Ｓ－Ｓ結合を生じないため活性が持続する。
　BFPの製造のために用いる本発明のセレンテラミド類縁体の量は、特に制限されないが、アポ蛋白質1molに対して、例えば、1mol～5mol、好ましくは、1mol～2mol、さらに好ましくは、1mol～1.2molである。
　BFPの製造において、本発明のセレンテラミド類縁体とアポ蛋白質とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとの反応は、還元剤の存在下で行うのが好ましい。ここで用いる還元剤としては、例えば、ジチオトレイトール(DTT)、又はメルカプトエタノール等を挙げることができる。BFPの再生に影響しなければ、BFPの製造のために用いる還元剤の量は、特に制限されないが、アポイクオリンには、３ヵ所のシステイン残基が存在することにより、S－S結合形成を防ぐ濃度であるのが好ましい。例えば、最終濃度が、1mMジチオトレイトールや0.1%（v/v）メルカプトエタノールである。
　BFPの製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃～42℃で0.1時間～2時間、4℃～37℃で0.1時間～2時間、又は、4℃～15℃で0.1時間～24時間である。
　このようにして得たBFPは、さらに精製に供しても良い。BFPの精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
３．１．２．青色蛍光蛋白質(BFP)の利用
（１）発光触媒としての利用
　本発明のBFPは、発光基質に作用しそれを発光させるので、発光触媒として利用できる。そこで、本発明は、本発明のBFPに、セレンテラジン又はその類縁体を接触させることを含む、発光方法を提供する。ここで、「接触」とは、BFPとセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器にBFPを添加すること、BFPを収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添加すること、又はBFPとセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれる。
　本発明の発光方法に用いる発光基質は、例えばセレンテラジン又はその類縁体である。「セレンテラジンの類縁体」とは、セレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。発光基質として用いるセレンテラジン又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、ｈ－セレンテラジン、ｆ－セレンテラジン、ｃｌ－セレンテラジン、ｎ－セレンテラジン、ｃｐ－セレンテラジン、ｃｈ－セレンテラジン、ｈｃｈ－セレンテラジン、ｆｃｈ－セレンテラジン、ｅ－セレンテラジン、ｅｆ－セレンテラジン、ｅｃｈ－セレンテラジン、又はｈｃｐ－セレンテラジン等であり、好ましくは、セレンテラジン、ｈ－セレンテラジン、又はｅ－セレンテラジンである。これらのセレンテラジン又はその類縁体は、例えば、Shimomura et al. (1988) Biochem. J. 251, 405－410、Shimomura et al. (1989) Biochem. J. 261, 913－920、又はShimomura et al. (1990) Biochem. J. 270, 309－312に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。或いは、チッソ株式会社、和光純薬社、又はプロメガ社等から各種市販されているので、これらの市販のものを、本発明の発光方法に用いても良い。
　これらのセレンテラジン及びその類縁体をBFPに接触させ、接触させたBFPの触媒作用によって、セレンテラジン又はその類縁体が対応するセレンテラミド又はその類縁体に酸化される際（この時、二酸化炭素が放出される）、発光が生じる。通常発光時間は、０．５～３時間であるが、条件の選択により、発光時間を更に長時間とすることも、又は発光時間を更に短時間とすることも可能である。
（２）レポーター蛋白質としての利用
　本発明のBFPは、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させ、本発明の蛍光蛋白質に由来する蛍光を検出することにより、目的のプロモーター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、「接触」とは、宿主細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、宿主細胞の培養容器にセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを添加すること、宿主細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下で培養することなどが含まれる。
（３）検出マーカとしての利用
　本発明のBFPは、蛍光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明のBFPを化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（蛋白質或いは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。
　また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに本発明のセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させること等によって、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。ここで、「接触」とは、細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、細胞の培養容器にセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを添加すること、細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下で培養することなどが含まれる。
　このような目的物質などの分布の測定は、蛍光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
（４）アミューズメント用品の材料
　本発明のBFPは、光の励起をうけて蛍光を生じる。よって、本発明のBFPは、アミューズメント用品の材料の蛍光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
３．２．緑色蛍光蛋白質（gFP）
３．２．１．緑色蛍光蛋白質（gFP）の製造
　本発明の緑色蛍光蛋白質（gFP）は、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、本発明のセレンテラミド類縁体が配位した複合体である。すなわち、本発明のgFPは、本発明のセレンテラミド類縁体、及びカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を含む。gFPは、光の励起を受けて蛍光を発生することができる。
　本発明のgFPは、前述のBFPからカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを取り除くことによって、得られる。カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンは、BFPを、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することによって、BFPから取り除くことができる。
　本発明においてgFPを製造するのに用いるキレート剤は、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２若しくは３価のイオンと強く結合するものであれば良く、特に制限されない。キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（β－アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四酢酸（ＥＧＴＡ）、ｔｒａｎｓ－１，２－ジアミノシクロヘキサンＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、又はＮ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）等を挙げることができる。ここで、カルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンは、前記の通りである。
　gFPの製造のために用いるキレート剤の量は、gFP再生に影響しなければ、その濃度は特に制限されない。イオンアポイクオリン1molには、3molのカルシウムイオンが結合することが示されていることより、例えば、3mol 以上が好ましい。
　gFPの製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃～42℃で0.1時間～2時間、4℃～37℃で0.1時間～2時間、又は、4℃～15℃で0.1時間～24時間である。
　このようにして得たgFPは、さらに精製に供しても良い。gFPの精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
３．２．２．緑色蛍光蛋白質（gFP）の利用
（１）レポーター蛋白質としての利用
　本発明のgFPは、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラミド類縁体を接触させてBFPを生成させた後、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤を接触させることでgFPを生成させ、本発明のgFPに由来する蛍光を検出することにより、目的のプロモーター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる。
（２）検出マーカとしての利用
　本発明のgFPは、蛍光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明のgFPを化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（蛋白質或いは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラミド類縁体を接触させてBFPを生成させた後、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤を接触させることでgFPを生成させること等によって、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的物質などの分布の測定は、蛍光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
（３）アミューズメント用品の材料
　本発明のgFPは、アミューズメント用品の材料の蛍光材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
４．カルシウム結合型発光蛋白質
　図１に示すように、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質は、EDTA等のカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下、gFPに、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることで、製造することが出来る。
４．１．カルシウム結合型発光蛋白質の製造
　本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、本発明のgFPから製造することができる。すなわち、本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、gFPに、発光基質であるセレンテラジン又はその類縁体を反応させることによって、得ることができる。
　gFPとセレンテラジン又はその類縁体の反応は、gFPとセレンテラジン又はその類縁体を接触させることにより行う。「接触」とは、本発明のgFPとセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器に本発明のgFPを添加すること、本発明のgFPを収容した容器に本発明のセレンテラジン又はその類縁体を添加すること、又は本発明のgFPとセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれる。
　本発明のカルシウム結合型発光蛋白質の製造に用いるセレンテラジン又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、ｈ－セレンテラジン、ｆ－セレンテラジン、ｃｌ－セレンテラジン、ｎ－セレンテラジン、ｃｐ－セレンテラジン、ｃｈ－セレンテラジン、ｈｃｈ－セレンテラジン、ｆｃｈ－セレンテラジン、ｅ－セレンテラジン、ｅｆ－セレンテラジン、ｅｃｈ－セレンテラジン、又はｈｃｐ－セレンテラジン等であり、好ましくは、セレンテラジン、ｈ－セレンテラジン、又はｅ－セレンテラジンである。これらのセレンテラジン又はその類縁体の入手方法は、前記の通りである。
　カルシウム結合型発光蛋白質の製造のために用いるセレンテラジン又はその類縁体の量は、特に制限されないが、gFP1molに対して、例えば、1.2mol以上であれば良い。
　カルシウム結合型発光蛋白質の製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃～42℃で0.1時間～2時間、4℃～37℃で0.1時間～2時間、又は4℃～15℃で0.1時間～24時間である。
　蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において行うのが好ましい。本発明においてgFPを製造するのに用いるキレート剤は、前記と同様である。
　本発明のさらに好ましい態様では、蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、還元剤の存在下において行う。このとき用いる還元剤は、例えば、ジチオトレイトール（DTT）、又はメルカプトエタノール等である。カルシウム結合型発光蛋白質の製造のために用いる還元剤の量は、再生に影響しなければ、特に制限されないが、アポイクオリンには、３カ所のシステイン残基が存在することより、S－S 結合形成を防ぐ濃度であるのが好ましい。例えば、最終濃度が、1 mMジチオトレイトールや0.1％（v/v）メルカプトエタノールである。
４．２．カルシウム結合型発光蛋白質の利用
（１）カルシウムイオンの検出又は定量
　本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウムイオンの作用によって発光する発光蛋白質（ホロ蛋白質）である。よって、本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出又は定量に使用することができる。
　カルシウムイオンの検出又は定量を行う場合には、アポ蛋白質とセレンテラジン類縁体のペルオキシドとからなる発光蛋白質を使用する。発光蛋白質は、前述した方法に従って製造することができる。カルシウムイオンの検出又は定量は、検体溶液を直接発光蛋白質溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。或いは、検体溶液に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することにより、カルシウムイオンを検出又は定量することもできる。
　カルシウムイオンの検出又は定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０（ベルトールド社製）などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、発光蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。
（２）生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法
　本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。
　例えば、本発明の発光蛋白質をドナー蛋白質として使用し、有機化合物又は蛍光蛋白質をアクセプターとして使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を起こすことにより蛋白質間の相互作用を検出することができる。本発明のある態様では、アクセプターとして使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo－1又はDAP1などである。本発明の別の態様では、アクセプターとして使用する蛍光蛋白質は、緑色蛍光蛋白質（GFP）、青色蛍光蛋白質（BFP）、変異GFP蛍光蛋白質又はフィコビリンなどである。本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体（特にG蛋白質共役受容体）、アポトーシス、又は遺伝子発現による転写調節などである。また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ又はリン酸化酵素などである。
　ＢＲＥＴ法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、Biochem. J. 2005, 385, 625－637、又はExpert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541－556などに記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、Nat Methods 2006, 3:165－174、又はBiotechnol J. 2008, 3:311－324などに記載の方法に準じて行うことができる。
　なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2009－27904号（2009年2月9日出願）の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
　また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
１．概要
　CTMDの基本骨格をベースとして、h－セレンテラチオアミドとh－セレンテラスルホンアミドを、下記合成スキームにより合成した。また、比較として、ｈ－セレンテラミドも合成した。
＜h－セレンテラチオアミドとh－セレンテラスルホンアミド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
  
＜h－セレンテラミド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
  
＜合成ルート＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
  
　さらに、h－セレンテラチオアミド、h－セレンテラスルホンアミド、及びh－セレンテラミドをベースとして、様々なCTMD誘導体を、下記合成法により合成した。
＜CTMD誘導体＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
  
＜CTMD誘導体の合成法＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
  
　さらに、水溶媒における溶解性と、水溶媒又は有機溶媒における蛍光量子収率とを決定することにより、合成化合物の蛍光能の評価を行なった。
２．合成例
［材料及び方法］
（１）化学薬品
　全ての化学薬品は特に記さない限り、市販のものをそのまま使用した。
　反応、抽出、及びクロマトグラフィー用の溶媒には、酢酸エチル、n－ヘキサン、ジクロロメタン、脱水ジクロロメタン、クロロホルム、メタノール、エタノール、ジエチルエーテル、アセトン、トルエン、及び1,2－ジメトキシエタンの市販品（Wako）をそのまま用いた。
　反応試薬は以下に挙げるものを使用した。
　フェニルアセチルクロリド (Wako)、4－(ジメチルアミノ)ピリジン (Wako)、1.0 M 三臭化ホウ素/ジクロロメタン溶液 (Aldrich)、ローソン試薬 (Aldrich)、ベンジルスホニルクロリド (Wako)、無水酢酸 (Wako)、トリエチルアミン (Wako)、水酸化ナトリウム (Wako)、脱水ピリジン (Wako)、アセチルクロリド (Wako)、メタンスルホニルクロリド (Wako)、p－トルエンスルホニルクロリド (Kanto)、p－ニトロベンゼンスルホニルクロリド (Aldrich)、フェニルボロン酸 (Acros organics)、炭酸ナトリウム (Wako)、及びジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II） (Aldrich)。
（２）クロマトグラフィー
　分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）には、MERCK社製、Silicagel 60 F254（Cat. No. 1.05715.）を用いた。スポットの検出は、紫外線ランプ（254 nm又は365 nm）による方法、ヨウ素吸着、及びリンモリブデン酸の酸性水溶液に浸した後にホットプレートで焼くことで行った。分取用フラッシュカラムクロマトグラフィーには、順相シリカゲルとして関東化学社製、Silicagel 60N Cat. No. 37563－85、メッシュ40－50 μm、又は関東化学社製、Silicagel 60N Cat. No. 37565－84、メッシュ63－200 μmを使用した。なお、本実施例においてクロマトグラフィー用の混合溶媒の比率は、特に説明が無い限りv/v である。
（３）物性測定
　融点（Mp.）は、YANACO社製、微量融点測定装置MP－J3を用いて測定した。
　紫外吸収スペクトル（UV）及びOD値（330 nm）の測定には、日本分光社製、V－560を用いて25 ℃で測定した。各サンプルの30 μMメタノール溶液及びpH.7.4リン酸緩衝水溶液（PB）を調製し、石英セル（光路長10 mm）中で測定した。難溶性の化合物は、はじめに少量のDMSOに溶解し、それを各溶媒で希釈することでサンプル調製を行った。DMSOを用いた場合には、その含有割合を記載した。全ての測定は、バンド幅0.5 nm、レスポンスMedium、スキャン速度200 nm/minの条件で測定した。
　1H（400 MHz）核磁気共鳴スペクトル（NMRスペクトル）は、Varian社製、Unity Plus 400を用いてDMSO－d6中で測定した。1H NMRの化学シフトの基準には、測定溶媒であるDMSO－d6中の残存非重水素化ジメチルスルホキシドのピークをδ2.49とした。
　13C（75.5 MHz）核磁気共鳴スペクトル（NMRスペクトル）は、Varian社製、MERCURY 300を用いてDMSO－d6中で測定した。13C NMRの化学シフトの基準には、測定溶媒であるDMSO－d6のピークをδ 39.5とし、ピークが重複した化合物についてはピークを分離するために重メタノールを加え、その旨を記載した。
　赤外分光計スペクトル（IR）は、DRS－8000を装着したSHIMADZU社製、IRPrestige－21 spectrophotometerを用いて、拡散反射法により測定した。
　高分解能質量分析スペクトル（HRMS）は、JEOL社製JMS－700を用いて、電子衝撃イオン化（EI）法、又は高速原子衝突（FAB+）法、又はBrucker社製MicrOTOFを用いてエレクトロスプレーイオン化法（ESI+）により測定した。
　元素分析は、YANACO社製CHN CORDER MT-5を用いて行った。
［合成例１］
3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c－16)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
  
　アルゴン雰囲気下、2－アミノ－3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン (c－11) (Adamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477－485 (2001)に記載の方法によって製造) (400 mg, 1.37 mmol)をピリジン (4 mL)に溶解し、4－（ジメチルアミノ）ピリジン (17.3 mg, 142 μmol)を加えて0 ℃に冷却した。これにフェニルアセチルクロリド (540 μL, 4.08 mmol)を加えて、室温に昇温し3.5時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止し、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (20 g, ジクロロメタン/酢酸エチル= 15/1)で精製し、3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c－16)を淡黄色固体として得た (540 mg, 96.2%)。Rf = 0.25 (ジクロロメタン/酢酸エチル= 15/1)。Mp. 197.5－202 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 330 (4.20), 293 (4.20), 274 (4.18)。UV (pH 7.4 PB, 1% DMSO) λmax(log ε) 333.5 (3.73), 280.5 (3.85)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 3.68 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 4.03 (s, 2H), 7.01－7.08 (m, 4H), 7.11－7.24 (m, 3H), 7.24－7.30 (m, 1H), 7.32－7.38 (m, 4H), 8.01－8.06 (AA’BB’, 2H), 8.88 (s, 1H), 10.52 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6/CD3OD = 2/1) δ 40.2, 42.9, 55.5, 114.8 (2C), 126.7, 127.2, 128.4 (2C), 128.6, 128.7 (2C), 128.8 (2C), 129.4 (2C), 129.7 (2C), 136.0, 137.5, 138.7, 143.9, 149.0, 151.2, 161.3, 170.6。IR (KBr, cm－1) 706, 837, 1034, 1179, 1248, 1296, 1413, 1439, 1449, 1497, 1545, 1574, 1609, 1670, 3281, 3381。HRMS (FAB+) m/z410.1876 (M+H, C26H24N3O2 requires 410.1869)。
［合成例２］
3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－(フェニルアセチルアミノ)ピラジン（h－セレンテラミド） (c－13)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
  
　アルゴン雰囲気下、3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c－16) (250 mg, 611 μmol)を脱水ジクロロメタン (15 mL)に溶解し、室温で撹拌しながらこれに1.0 M 三臭化ホウ素/ジクロロメタン溶液(2.15 mL, 2.15 mmol)を加え、15時間加熱還流した。還流後、室温まで放冷し、これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過し残渣を乾燥することで粗生成物である淡黄色固体270 mgを得た。これをメタノールを用いて再結晶し、3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－(フェニルアセチルアミノ)ピラジン（h－セレンテラミド） (c－13)を無色固体として得た(107 mg, 44.1%)。Rf = 0.20 (ジクロロメタン/酢酸エチル= 4/1)。Mp. 259－261 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 332 (4.38), 294.5 (4.38), 276 (4.35)。UV (pH 7.4 PB, 1% DMSO) λmax (log ε) 345.5 (3.52), 303 (3.57)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 3.67 (s, 2H), 4.01 (s, 2H), 6.84－6.89 (AA’BB’, 2H), 7.02 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.11－7.23 (m, 4H), 7.23－7.30 (m, 1H), 7.32－7.37 (m, 4H), 7.90－7.95 (AA’BB’, 2H), 8.82 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 10.48 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 39.7, 42.4, 115.8 (2C), 126.2, 126.4, 126.7, 128.1 (2C), 128.3 (2C), 128.4 (2C), 128.9 (2C), 129.3 (2C), 135.6, 136.9, 138.3, 143.3, 148.6, 150.5, 159.1, 169.9。IR (KBr, cm－1) 662, 702, 712, 727, 843, 1157, 1173, 1231, 1281, 1321, 1355, 1368, 1452, 1495, 1523, 1541, 1584, 1595, 1611, 1668, 3063, 3169, 3264。HRMS (FAB+) m/z 396.1706 (M+H, C25H22N3O2requires 396.1712)。
［合成例３］
3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル) －2－(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン(c－17)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
  
　アルゴン雰囲気下、3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c－16) (539 mg, 1.32 mmol)を脱水トルエン (50 mL)に懸濁し、室温で撹拌しながらこれにLawesson試薬 (320 mg, 790 μmol)を加え、17時間加熱還流した。還流後、室温まで放冷し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (55 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)で精製し、3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン(c－17)を黄色アモルファスとして得た (430 mg, 76.6%)。Rf = 0.33 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 7/3)。Mp. 45－47 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 334 (4.23), 295 (4.16), 272 (4.25)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 360.5 (4.22), 283.5 (4.16)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 3.81 (s, 3H), 3.92 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 7.01 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.04－7.10 (AA’BB’, 2H), 7.12－7.24 (m, 3H), 7.29 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.37 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 8.05－8.10 (AA’BB’, 2H), 8.99 (s, 1H), 12.20 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 39.3, 51.6, 55.3, 114.5 (2C), 126.3, 127.0, 127.6, 128.2 (2C), 128.3 (2C), 128.4 (2C), 128.9 (2C), 129.0 (2C), 136.9, 137.9, 138.0, 145.0, 149.6, 152.1, 160.9, 204.6。IR (KBr, cm－1) 700, 835, 1028, 1115, 1175, 1252, 1292, 1319, 1369, 1422, 1437, 1493, 1516, 1607, 2961, 3395。HRMS (FAB+) m/z426.1646 (M+H, C26H24N3OS requires 426.1640)。
［合成例４］
3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン（h－セレンテラチオアミド） (c－14)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
  
　アルゴン雰囲気下、3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン(c－17) (114 mg, 267 μmol)を脱水ジクロロメタン (2 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに1.0 M 三臭化ホウ素/ジクロロメタン溶液(1.35 mL, 1.35 mmol)を加えた後、反応溶液を室温に昇温し、3.5時間撹拌した。これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過し残渣を乾燥し、粗生成物である赤色固体105 mgを得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー (8.2 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)で精製し、3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン（h－セレンテラチオアミド） (c－14)を橙色固体として得た(88.9 mg, 80.9%)。Rf = 0.21 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 195－198 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 336.5 (4.24), 297 (4.18), 273.5 (4.26)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 336.5 (4.12), 270 (4.20)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 3.90 (s, 2H), 4.13 (s, 2H), 6.84－6.90 (AA’BB’, 2H), 6.99 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.10－7.24 (m, 3H), 7.26 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.93－7.99 (AA’BB’, 2H), 8.91 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 12.17 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 39.4, 51.6, 115.9 (2C), 126.1, 126.3, 127.0, 128.3 (2C), 128.36 (2C), 126.44 (2C), 128.9 (2C), 129.0 (2C), 136.9, 137.6, 138.1, 144.6, 150.0, 152.0, 159.5, 204.5。IR (KBr, cm－1) 702, 839, 1140, 1169, 1207, 1234, 1283, 1319, 1360, 1435, 1450, 1472, 1491, 1522, 1607, 3069, 3478。HRMS (FAB+) m/z412.1490 (M+H, C25H22N3OS requires 412.1484)。
［合成例５］
3－ベンジル－2－ベンジルスルホニルアミノ－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン (c－18)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
  
　アルゴン雰囲気下、2－アミノ－3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン (c－11) (Adamczyk M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477－485 (2001)に記載の方法によって製造) (99.5 mg, 342 μmol)をピリジン(1 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに、ベンジルスルホニルクロリド (84.7 mg, 444 μmol)を加えて室温に昇温後、1時間撹拌した。これにベンジルスルホニルクロリド (13.8 mg, 72.3 μmol)を加え、2.5時間撹拌した。さらにこれにベンジルスルホニルクロリド (13.9 mg, 72.9 μmol)を加え、15時間撹拌した。さらにこれにベンジルスルホニルクロリド (13.1 mg, 68.7 μmol)を加え、5.5時間撹拌した。これに、2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、有機層をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (7 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 7/3 → 酢酸エチル)で精製した。得られた固体を酢酸エチルで再結晶し、3－ベンジル－2－ベンジルスルホニルアミノ－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン(c－18)を無色固体として得た (56.0 mg, 36.8%)。Rf = 0.32 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 7/3)。Mp. 213－215 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λmax (log ε) 334.5 (4.04), 290 (4.21), 276.5 (4.23)。UV (pH 7.4 PB, 0.3% DMSO) λmax (log ε) 348.5 (3.90), 293 (3.95)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 3.80 (s, 3H), 4.22 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 7.02－7.07 (AA’BB’, 2H), 7.14－7.21 (m, 1H), 7.24－7.27 (m, 4H), 7.36 (s, 5H), 7.99 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 8.88 (s, 1H), 10.46 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 38.0, 55.3, 59.6, 114.4 (2C), 126.3, 127.6 (2C), 128.1, 128.3 (2C), 128.4, 128.5 (2C), 129.0 (2C), 129.9, 130.9 (2C), 136.2, 138.1, 144.6, 145.8, 146.0, 160.3。IR (KBr, cm－1) 459, 538, 586, 698, 748, 785, 831, 893, 912, 926, 1032, 1121, 1132, 1177, 1215, 1256, 1287, 1319, 1395, 1452, 1495, 1516, 1609, 3231。HRMS (FAB+) m/z 446.1548 (M+H, C25H24N3O3S requires 446.1548)。
［合成例６］
5－(4－アセトキシフェニル)－2－アミノ－3－ベンジルピラジン (c－19)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
  
　アルゴン雰囲気下、2－アミノ－3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)ピラジン （セレンテラミン） (c－5) (Adamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477－485 (2001)に記載の方法によって製造) (303 mg, 1.09 mmol)をピリジン (2 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに、無水酢酸 (133 μL, 1.40 mmol)を加え、室温に昇温後1時間撹拌した。これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルを加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を水で3回、飽和食塩水で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (50 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)で精製し、5－(4－アセトキシフェニル)－2－アミノ－3－ベンジルピラジン(c－19)を淡黄色固体として得た (337 mg, 96.7%)。Rf = 0.31 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 183.5－185.5 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ2.27 (s, 3H), 4.07 (s, 2H), 6.42 (s, 2H), 7.12－7.17 (AA’BB’, 2H), 7.19 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.90－7.95 (AA’BB’, 2H), 8.41 (s, 1H)。IR (KBr, cm－1) 513, 596, 640, 654, 710, 746, 851, 910, 1016, 1136, 1167, 1198, 1217, 1373, 1423, 1452, 1466, 1493, 1508, 1535, 1630, 1746, 3148, 3289。
［合成例７］
5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(ベンジルスルホニル)アミノピラジン (c－20)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
  
　アルゴン雰囲気下、5－(4－アセトキシフェニル)－2－アミノ－3－ベンジルピラジン (c－19) (367 mg, 1.15 mmol)を脱水ジクロロメタン (9 mL)に溶解し、これにトリエチルアミン (480 μL, 3.44 mmol)を加え、0 ℃に冷却した。これに、ベンジルスルホニルクロリド (658 mg, 3.45 mmol)を加え、室温に昇温後4.5時間撹拌した。さらにこれにベンジルスルホニルクロリド (658 mg, 3.45 mmol)を加え、1.5時間撹拌した。これに、2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を水で1回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(23 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 4/1 → 7/3)で精製し、5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(ベンジルスルホニル)アミノピラジン (c－20)を黄色アモルファスとして得た (487 mg, 67.4%)。Rf = 0.53 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 84－86.5 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 307 (4.26), 293.5 (4.21), 259.5 (4.19)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 320 (4.30), 298.5 (4.25), 265 (4.29)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.29 (s, 3H), 3.90 (s, 2H), 5.00 (s, 1H), 5.03 (s, 1H),5.18 (s, 1H), 5.22 (s, 1H), 7.13－7.17 (m, 2H), 7.18－7.23 (m, 1H), 7.25－7.33 (m, 4H), 7.39－7.45 (m, 10H), 8.09－8.14 (AA’BB’, 2H), 9.21 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 20.9, 37.4, 61.0 (1C×2), 122.7 (2C), 126.4, 126.8 (1C×2), 128.2 (2C), 128.5 (2C), 128.8 (2C×2), 129.3, 129.6 (2C), 131.6 (2C×2), 132.1, 137.5, 139.2, 141.0, 151.3, 152.5, 155.6, 169.0。IR (KBr, cm－1) 509, 534, 611, 696, 777, 876, 912, 1144, 1163, 1198, 1354, 1375, 1416, 1433, 1757。HRMS (FAB+) m/z 628.1582 (M+H, C33H30N3O6S2requires 628.1576)。
［合成例８］
3－ベンジル－2－ベンジルスルホニルアミノ－5－(4－ヒドロキシフェニル)ピラジン （h－セレンテラスルホンアミド） (c－15)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
  
　5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(ベンジルスルホニル)アミノピラジン(c－20) (435 mg, 694 μmol)をメタノール (8 mL)に溶解し、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.9 mL)を加え、65 ℃で9.5時間撹拌した。室温まで放冷後、これに2 M 塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (35 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/1 → 2/1)で精製し、3－ベンジル－2－ベンジルスルホニルアミノ－5－(4－ヒドロキシフェニル)ピラジン（h－セレンテラスルホンアミド） (c－15)を淡黄色固体として得た(286 mg, 95.6%)。Rf = 0.27 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 144－147 ℃ (dec.)。UV (MeOH) λmax (log ε) 336 (4.06), 290 (4.23), 277.5 (4.25)。UV (pH 7.4 PB) λmax(log ε) 351.5 (4.09), 283 (4.34)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 4.22 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 6.83－6.88 (AA’BB’, 2H), 7.14－7.20 (m, 1H), 7.22－7.29 (m, 4H), 7.36 (s, 5H), 7.86－7.93 (AA’BB’, 2H), 8.83 (s, 1H), 9.81 (s, 1H), 10.40 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 38.0, 59.6, 115.8 (2C), 126.2, 126.5, 127.7, 128.28 (2C), 128.33 (2C), 128.5 (2C), 128.9 (2C), 129.9, 130.9 (2C), 136.0, 138.2, 144.2, 145.8, 146.5, 158.8。IR (KBr, cm－1) 527, 542, 604, 698, 835, 893, 912, 926, 935, 1117, 1130, 1188, 1213, 1244, 1267, 1321, 1402, 1452, 1495, 1516, 1595, 1609, 3055, 3221, 3522。HRMS (FAB+) m/z 432.1385 (M+H, C24H22N3O3S requires 432.1382)。
［合成例９］
3－ベンジル－2－ビス(ベンジルスルホニル)アミノ－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン (c－21)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
  
　2－アミノ－3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン (c－11) (Adamczyk M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477－485 (2001)に記載の方法によって製造) (200 mg, 687 μmol)を脱水ジクロロメタン (2 mL)に溶解し、これにトリエチルアミン (145 μL, 1.04 mmol)を加え、0 ℃に冷却した。これにベンジルスルホニルクロリド (196 mg, 1.03 mmol)を加え、室温に昇温し1時間撹拌した。さらにこれにトリエチルアミン (145 μL, 1.04 mmol)、脱水ジクロロメタン (1.0 mL)、ベンジルスルホニルクロリド (131 mg, 687 μmol)を順次加え、1時間撹拌した。さらにこれにトリエチルアミン (145 μL, 1.04 mmol)、脱水ジクロロメタン (1.0 mL)、ベンジルスルホニルクロリド (131 mg, 687 μmol)を順次加え、2時間撹拌した。これに2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離し飽和食塩水で1回、飽和硫酸ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (23 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 4/1)で精製し、3－ベンジル－2－ビス(ベンジルスルホニル)アミノ－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン (c－21)を黄色アモルファスとして得た (320 mg, 77.6%)。Rf = 0.63 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 78－80 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 332.5 (4.31), 299.5 (4.20), 277.5 (4.06)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 342.5 (4.29), 303 (4.18), 280.5 (4.15)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 3.87 (s, 3H), 3.97 (s, 2H), 4.78 (s, 1H), 4.82 (s, 1H), 4.94 (s, 1H), 4.97 (s, 1H), 6.96－7.02 (AA’BB’, 2H), 7.17 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.19－7.33 (m, 3H), 7.34－7.44 (m, 10H), 7.92－7.98 (AA’BB’, 2H), 8.80 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 37.4, 55.4, 61.0 (1C×2), 114.7 (2C), 126.4, 126.8 (1C×2), 128.1 (2C), 128.78 (2C), 128.84 (2C×2), 129.0, 129.3, 129.6 (2C), 131.6 (2C×2), 137.6, 138.5, 140.1, 151.9, 155.4, 161.5。IR (KBr, cm－1) 501, 611, 696, 773, 876, 922, 1028, 1144, 1163, 1250, 1354, 1373, 1422, 1431, 1454, 1495, 1514, 1607。HRMS (FAB+) m/z 600.1639 (M+H, C32H30N3O5S2requires 600.1627)。
［合成例１０］
5－(4－アセトキシフェニル)－2－(4－アセトキシフェニル)アセチルアミノ－3－ベンジルピラジン (c－29)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
  
　アルゴン雰囲気下、3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－[(4－ヒドロキシフェニル)アセチルアミノ]ピラジン（セレンテラミド）(c－4) (Inouye, S. & Hosoya, T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 386, 617－622 (2009) に記載の方法によって製造) (410 mg, 997 μmol)をピリジン(11 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに、無水酢酸 (475 μL, 5.02 mmol)を加え、室温に昇温後22時間撹拌した。これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルを加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄した。有機層に残った沈殿物をろ過した後、真空乾燥行い、5－(4－アセトキシフェニル)－2－(4－アセトキシフェニル)アセチルアミノ－3－ベンジルピラジン (c－29)を無色固体として得た(300 mg, 60.7%)。Rf = 0.28 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 225－227 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λmax (log ε) 318 (4.14), 290 (4.12), 259 (4.19)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.26 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 3.71 (s, 2H), 4.11 (s, 2H), 7.08 (t, J = 8.6 Hz, 4H), 7.15 (t, J= 7.8 Hz, 1H), 7.21 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.24－7.29 (AA’BB’, 2H), 7.34－7.40 (AA’BB’, 2H), 8.08－8.14 (AA’BB’, 2H), 8.95 (s, 1H), 10.67 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 20.89, 20.92, 41.6, 121.8 (2C), 122.5 (2C), 126.3, 127.8 (2C), 128.3 (2C), 128.9 (2C), 130.3 (2C), 132.9, 133.2, 137.9, 138.1, 144.4, 147.5, 149.3, 150.6, 151.7, 169.1, 169.3, 169.9 (one carbon at benzyl position was unobservable due to overlapping with septet peak of DMSO)。IR (KBr, cm－1) 515, 590, 654, 704, 854, 918, 1016, 1157, 1190, 1211, 1238, 1346, 1371, 1418, 1449, 1493, 1543, 1672, 1751, 3287。HRMS （FAB+） m/z 496.1863 (M+H, C29H26N3O5requires 496.1872)。
［合成例１１］
5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－(フェニルアセチルアミノ)ピラジン (c－30)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
  
　アルゴン雰囲気下、5－(4－アセトキシフェニル)－2－アミノ－3－ベンジルピラジン (c－19) (194 mg, 607 μmol)をピリジン (2 mL)に溶解し、4－(ジメチルアミノ)ピリジン (7.8 mg, 64 μmol)を加えて0 ℃に冷却した。これにフェニルアセチルクロリド (160 μL, 1.21 mmol)を加えて、室温に昇温し2時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止し、桐山ロートを用いて沈殿物をろ過した後、残渣を真空乾燥し5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c－30)を無色固体として得た (53.9 mg, 20.3%)。Rf = 0.24 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 228－231 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λmax (log ε) 318 (4.19), 290 (4.17), 259 (4.24)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.29 (s, 3H), 3.68 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 7.01－7.08 (AA’BB’, 2H), 7.11－7.22 (m, 3H), 7.23－7.29 (m, 3H), 7.31－7.38 (m, 4H), 8.07－8.14 (AA’BB’, 2H), 8.93 (s, 1H), 10.57 (s, 1H)。IR (KBr, cm－1) 706, 851, 918, 1157, 1206, 1223, 1346, 1366, 1410, 1449, 1495, 1543, 1576, 1670, 1755, 3248。HRMS (FAB+) m/z438.1806 (M+H, C27H24N3O3 requires 438.1818)。
［合成例１２］
5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン (c－31)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
  
　アルゴン雰囲気下、3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン（h－セレンテラチオアミド） (c－14) (183 mg, 444 μmol)をピリジン (2 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに、無水酢酸 (55 μL, 0.58 mmol)を加え、室温に昇温後2時間撹拌した。さらにこれに、無水酢酸 (25 μL, 0.26 mmol)を加え、室温で2.5時間撹拌した。これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルを加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を水で3回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (22 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)で精製した後、得られた固体をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー (7 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)で精製し、5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン(c－31)を淡黄色固体として得た (96.3 mg, 47.8%)。Rf = 0.36 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)。Mp. 143－145 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 320 (4.30), 258 (4.41)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 346 (4.36), 274 (4.35)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.29 (s, 3H), 3.95 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 7.00 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.12－7.24 (m, 3H), 7.26－7.32 (AA’BB’, 3H), 7.36 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.12－8.18 (AA’BB’, 2H), 9.04 (s, 1H), 12.23 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 20.9, 39.4, 51.6, 122.6 (2C), 126.4, 127.0, 128.0 (2C), 128.3 (2C), 128.4 (2C), 128.9 (2C), 129.0 (2C), 132.8, 136.8, 137.9, 138.6, 145.9, 149.0, 151.9, 152.4, 169.1, 204.7。IR (KBr, cm－1) 700, 1128, 1165, 1179, 1200, 1238, 1368, 1389, 1416, 1441, 1493, 1508, 1730, 3265。HRMS (FAB+) m/z454.1583 (M+H, C27H24N3O2S requires 454.1589)。
［合成例１３］
5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－(ベンジルスルホニルアミノ)ピラジン (c－32)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
  
　アルゴン雰囲気下、5－(4－アセトキシフェニル)－2－アミノ－3－ベンジルピラジン (c－19) (303 mg, 949 μmol)をピリジン (3 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これにベンジルスルホニルクロリド (362 mg, 1.90 mmol)を加えて、そのまま30分間撹拌した。さらにこれに、ベンジルスルホニルクロリド (89.7 mg, 470 μmol)を加え、そのまま30分間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を水で1回、2 M 塩酸で1回、飽和硫酸ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣を桐山ロートを用いてろ過した後、残渣を酢酸エチル/メタノール (1/1)で再結晶し、5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－(ベンジルスルホニルアミノ)ピラジン (c－32)を無色固体として得た (124 mg, 27.6%)。Rf = 0.56 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 240－241 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λmax (log ε) 324 (4.06), 286.5 (4.13), 264 (4.19)。UV (pH PB, 0.3% DMSO) λmax (log ε) 338.5 (4.01), 290 (4.01), 273.5 (4.02)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.29 (s, 3H), 4.25 (s, 2H), 4.92 (s, 2H), 7.14－7.21 (m, 1H), 7.23－7.28 (m, 6H), 7.35 (s, 5H), 8.03－8.12 (AA’BB’, 2H), 8.93 (s, 1H), 10.55 (s, 1H)。IR (KBr, cm－1) 530, 700, 889, 920, 1157, 1179, 1204, 1223, 1325, 1420, 1454, 1748, 3267。HRMS (FAB+) m/z 474.1486 (M+H, C26H24N3O4S requires 474.1488)。
［合成例１４］
5－(4－アセトキシフェニル)－2－アセチルアミノ－3－ベンジルピラジン (c－33)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
  
　アルゴン雰囲気下、2－アミノ－3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)ピラジン（セレンテラミン）(c－5) (Adamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477－485 (2001)に記載の方法によって製造) (471 mg, 1.70 mmol)をピリジン (3.6 mL)、クロロホルム(9 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これにアセチルクロリド (910 μL, 12.8 mmol)を加えて、室温に昇温後、1時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (45 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1 → 1/3)で精製し、5－(4－アセトキシフェニル)－2－アセチルアミノ－3－ベンジルピラジン (c－33)を淡黄色固体として得た(355 mg, 57.8%)。Rf = 0.17 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 215.5－217 ℃ (dec.)。UV (MeOH) λmax (log ε) 317 (4.09), 290 (4.08), 259 (4.15)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 315 (4.07), 292 (3.98), 253.5 (4.08)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.05 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 4.18 (s, 2H), 7.15－7.22 (m, 3H), 7.23－7.29 (m, 4H), 8.09－8.14 (AA’BB’, 2H), 8.94 (s, 1H), 10.31 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 20.9, 23.0, 39.9, 122.5 (2C), 126.3, 127.7 (2C), 128.3 (2C), 129.0 (2C), 133.2, 137.8, 138.2, 144.7, 147.3, 150.5, 151.6, 169.1, 169.2。IR (KBr, cm－1) 706, 916, 1016, 1159, 1223, 1260, 1369, 1450, 1497, 1545, 1578, 1670, 1751, 3279。HRMS (FAB+) m/z 362.1509 (M+H, C21H20N3O3requires 362.1505)。
［合成例１５］
2－アセチルアミノ－3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)ピラジン（セレンテラアセトアミド） (c－25)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
  
　5－(4－アセトキシフェニル)－2－アセチルアミノ－3－ベンジルピラジン(c－33) (355 mg, 982 μmol)をメタノール (8 mL)に溶解し、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.8 mL)を加え、1時間撹拌した。これに2 M 塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (37 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/2)で精製した後、得られた固体をメタノールを用いて再結晶し、2－アセチルアミノ－3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)ピラジン (セレンテラアセトアミド) (c－25)を無色固体として得た (109 mg, 34.8%)。Rf = 0.23 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/2)。UV (MeOH) λmax (log ε) 332 (4.14), 294 (4.15), 275.5 (4.12)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 328 (4.14), 289.5 (4.03), 270 (4.08)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.03 (s, 3H), 4.13 (s, 2H), 6.84－6.89 (AA’BB’, 2H), 7.14－7.21 (m, 3H), 7.23－7.29 (m, 2H), 7.89－7.94 (AA’BB’, 2H), 8.80 (s, 1H), 9.91 (s, 1H), 10.21 (s, 1H)。IR (KBr, cm－1) 592, 631, 702, 746, 837, 1128, 1157, 1173, 1211, 1231, 1279, 1314, 1368, 1435, 1497, 1518, 1543, 1582, 1591, 1611, 1672, 3026, 3073, 3254。HRMS (FAB+) m/z 320.1399 (M+H, C19H18N3O2requires 320.1399)。
［合成例１６］
2－アセチルアミノ－3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン (c－24)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
  
　アルゴン雰囲気下、2－アミノ－3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン (c－11) (Adamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477－485 (2001)に記載の方法によって製造) (199 mg, 681 μmol)を脱水ピリジン (1.4 mL)、およびクロロホルム(4 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これにアセチルクロリド (365 μL, 5.13 mmol)を加えて、室温に昇温後、1時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をメタノールを用いて再結晶し、2－アセチルアミノ－3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)ピラジン(c－24)を無色固体として得た (74.6 mg, 32.9%)。Rf = 0.14 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。UV (MeOH) λmax (log ε) 329.5 (4.18), 293 (4.18), 274 (4.16)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 328 (4.11), 289.5 (4.01), 270.5 (4.05)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.04 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 4.15 (s, 2H), 7.02－7.08 (AA’BB’, 2H), 7.15－7.22 (m, 3H), 7.23－7.29 (m, 2H), 8.00－8.05 (AA’BB’, 2H), 8.87 (s, 1H), 10.25 (s, 1H)。IR (KBr, cm－1) 698, 744, 833, 1032, 1157, 1175, 1213, 1256, 1285, 1327, 1368, 1416, 1450, 1499, 1543, 1587, 1609, 1670, 3258。HRMS (FAB+) m/z 334.1557 (M+H, C20H20N3O2requires 334.1556)。
［合成例１７］
5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(メタンスルホニル)アミノピラジン (c－39)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
  
　アルゴン雰囲気下、5－(4－アセトキシフェニル)－2－アミノ－3－ベンジルピラジン (c－19) (337 mg, 1.05 mmol)を脱水ジクロロメタン (9 mL)に溶解し、これにトリエチルアミン (220 μL, 1.58 mmol)を加え、室温で撹拌した。これに、メタンスルホニルクロリド (245 μL, 3.16 mmol)を加え、そのまま1.5時間撹拌した。これに、2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(28 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/1 → 3/2)で精製し、5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(メタンスルホニル)アミノピラジン (c－39)を黄色アモルファスとして得た (241 mg, 48.3%)。Rf = 0.32 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 165.5－167 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 306 (4.29),293 (4.25), 259 (4.21)。UV (pH PB) λmax (log ε) 336.5 (4.19), 264 (4.09)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.29 (s, 3H), 3.59 (s, 6H), 4.36 (s, 2H), 7.20－7.26 (m, 1H), 7.26－7.35 (m, 6H), 8.11－8.17 (AA’BB’, 2H), 9.14 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 20.9, 38.5, 43.1 (1C×2), 122.7 (2C), 126.6, 128.3 (2C), 128.6 (2C), 129.5 (2C), 132.1, 137.6, 139.2, 141.5, 151.4, 152.5, 155.6, 169.0。IR (KBr, cm－1) 509, 523, 706, 756, 766, 912, 974, 1015, 1163, 1200, 1321, 1368, 1418, 1435, 1528, 1603, 1755, 3032。HRMS (FAB+) m/z 476.0936 (M+H, C21H22N3O6S2requires 476.0950)。
［合成例１８］
3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)2－(メタンスルホニルアミノ)ピラジン（セレンテラメシルアミド） (c－34)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
  
　5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(メタンスルホニル)アミノピラジン (c－39) (239 mg, 503 μmol)をメタノール (5 mL)に懸濁させ、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.2 mL)を加え、65 ℃で30分間撹拌した。室温まで放冷後、これに2 M 塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (23 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)で精製し、3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)2－(メタンスルホニルアミノ)ピラジン（セレンテラメシルアミド） (c－34)を淡黄色固体として得た(166 mg, 92.6%)。Rf = 0.30 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 208－209 ℃ (dec.)。UV (MeOH) λmax (log ε) 335 (4.12), 290 (4.25), 276 (4.27)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 349 (4.14), 281 (4.38)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 3.36 (s, 3H), 4.25 (s, 2H), 6.82－6.87 (AA’BB’, 2H), 7.15－7.23 (m, 1H), 7.29 (d, J = 5.0 Hz, 4H), 7.83－7.88 (AA’BB’, 2H), 8.73 (s, 1H), 9.80 (s, 1H), 10.41 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 38.2, 42.7, 115.8 (2C), 126.4, 126.6, 127.7 (2C), 128.4 (2C), 129.0 (2C), 135.9, 138.1, 144.3, 146.0, 146.4, 158.8。IR (KBr, cm－1) 521, 538, 588, 606, 700, 750, 827, 841, 889, 916, 939, 970, 1118, 1138, 1153, 1175, 1213, 1273, 1314, 1400, 1456, 1495, 1609, 3206。HRMS (FAB+) m/z356.1060 (M+H, C18H18N3O3S requires 356.1069)。
［合成例１９］
3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－[(4－メチルフェニル)スルホニルアミノ]ピラジン（セレンテラ－p－トシルアミド） (c－35)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
  
　アルゴン雰囲気下、2－アミノ－3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)ピラジン（セレンテラミン） (c－5) (Adamczyk M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477－485 (2001)に記載の方法によって製造) (199 mg, 718 μmol)をピリジン (1.5 mL)に溶解し、これに4－(ジメチルアミノ)ピリジン (9.0 mg, 74 μmol)を加え、0 ℃に冷却した。これに、p－トルエンスルホニルクロリド (410 mg, 2.15 mmol)を加え、室温まで昇温後2時間撹拌した。これに、2 M 塩酸とジクロロメタンを加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、ジクロロメタンで3回抽出した。飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をメタノール (5 mL)に溶解し、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.2 mL)を加え、65 ℃で30分間撹拌した。室温まで放冷後、これに2 M 塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (23 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)で精製し、3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－[(4－メチルフェニル)スルホニルアミノ]ピラジン（セレンテラ－p－トシルアミド） (c－35)を黄色固体として得た (155 mg, 37.1% (2 steps))。Rf = 0.25 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 181－182.5 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 336.5 (4.10), 291.5 (4.26), 277 (4.27)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 351 (4.14), 282.5 (4.37)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.36 (s, 3H), 4.27 (s, 2H), 6.81 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.17－7.24 (m, 1H), 7.25－7.32 (m, 4H), 7.36 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.79 (t, J = 8.7 Hz, 4H), 8.53 (s, 1H), 9.77 (s, 1H), 10.74 (s, 1H)。IR (KBr, cm－1) 474, 525, 546, 567, 610, 667, 698, 743, 816, 839, 876, 941, 1088, 1148, 1165, 1215, 1269, 1321, 1364, 1404, 1447, 1495, 1516, 1593, 1609, 3283。HRMS (FAB+) m/z432.1382 (M+H, C24H22N3O3S requires 432.1382)。
［合成例２０］
5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(4－ニトロフェニルスルホニル)アミノピラジン(c－40)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
  
　アルゴン雰囲気下、5－(4－アセトキシフェニル)－2－アミノ－3－ベンジルピラジン (c－19) (140 mg, 438 μmol)をピリジン (2 mL)に溶解し、これに4－(ジメチルアミノ)ピリジン (6.0 mg, 49 μmol)を加えた。これに室温で撹拌しながら、p－ニトロベンゼンスルホニルクロリド (293 mg, 1.32 mmol)を加えて、そのまま1.5時間撹拌した。さらにこれに、p－ニトロベンゼンスルホニルクロリド (195 mg, 880 μmol)を加え、17時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタンで2回抽出した。有機層を水で1回、飽和硫酸ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (24 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 4/1 → 3/1 → 7/3 → 酢酸エチルのみ)で精製し、5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(4－ニトロフェニルスルホニル)アミノピラジン(c－40)を暗褐色固体として得た (157 mg, 52.1%)。Rf = 0.62 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 227－229.5 ℃ (dec.)。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λmax (log ε) 309 (3.99), 258 (4.21)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.30 (s, 3H), 4.22 (s, 2H), 7.19－7.27 (m, 1H), 7.29－7.35 (m, 6H), 8.05－8.10 (AA’BB’, 4H), 8.14－8.19 (AA’BB’, 2H), 8.39－8.44 (AA’BB’, 4H), 9.13 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6) δ 20.9, 38.0, 122.8 (2C), 124.8 (2C×2), 126.6, 128.3 (2C), 128.7 (2C), 129.6 (2C), 130.7 (2C×2), 131.9, 137.3, 139.8, 140.3, 142.1 (1C×2), 151.1 (1C×2), 151.9, 152.7, 156.2, 169.0。I,R (KBr, cm－1) 548, 598, 617, 687, 737, 775, 810, 854, 880, 897, 916, 935, 1013, 1165, 1180, 1206, 1315, 1348, 1368, 1385, 1404, 1418, 1435, 1530, 1603, 1755, 3107。HRMS (FAB+) m/z690.0975 (M+H, C31H24N5O10S2requires 690.0965)。
［合成例２１］
3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－[(4－ニトロフェニル)スルホニルアミノ]ピラジン（セレンテラ－p－ノシルアミド） (c－36)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
  
　5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(4－ニトロフェニルスルホニル)アミノピラジン(c－40) (151 mg, 219 μmol)をメタノール (3 mL)に懸濁させ、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (600 μL)を加え、65 ℃で30分間撹拌した。これにさらにメタノール (1 mL)、10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (400 μL)を順次加え、1時間撹拌した。室温まで放冷後、2 M 塩酸を加え反応を停止し、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (8 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)で精製し、3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－[(4－ニトロフェニル)スルホニルアミノ]ピラジン（セレンテラ－p－ノシルアミド） (c－36)を橙色固体として得た (88.8 mg, 87.7%)。Rf = 0.13 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 176－177.5 ℃ (dec.)。UV (MeOH) λmax (log ε) 338 (4.11), 276.5 (4.42)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 347 (4.15), 278.5 (4.49)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 4.28 (s, 2H), 6.81 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.17－7.25 (m, 1H), 7.29 (s, 4H), 7.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 8.15 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 8.40 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.52 (s, 1H), 9.81 (s, 1H), 11.25 (s, 1H)。IR (KBr, cm－1) 633, 698, 748, 773, 827, 853, 970, 1084, 1121, 1231, 1263, 1277, 1350, 1395, 1501, 1514, 1528, 1611, 3227。HRMS (FAB+) m/z463.1086 (M+H, C23H19N4O5S requires 463.1076)。
［合成例２２］
2－アミノ－3－ベンジル－5－フェニルピラジン (c－41)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
  
　アルゴン雰囲気下、2－アミノ－3－ベンジル－5－ブロモピラジン (c－10) (1.66 g, 6.27 mmol)を1,2－ジメトキシエタン(17 mL)、エタノール (13 mL)に溶解し、これに室温で撹拌しながら2 M 炭酸ナトリウム水溶液 (31.4 mL, 62.8 mmol)、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II） (221 mg, 315 μmol)、フェニルボロン酸 (996 mg, 8.16 mmol)を順次加え、90 ℃で2.5時間撹拌した。室温まで放冷後、飽和食塩水と酢酸エチルを加え反応を停止し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (50 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2 → 1/1)で精製した後、得られた固体を酢酸エチルを用いて2回再結晶し、2－アミノ－3－ベンジル－5－フェニルピラジン (c－41)を黄色固体として得た(982 mg, 59.9%)。Rf = 0.30 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 4.07 (s, 2H), 6.41 (s, 2H), 7.18 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.24－7.31 (m, 3H), 7.34 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 8.41 (s, 1H)。IR (KBr, cm－1) 596, 664, 694, 716, 733, 754, 773, 908, 937, 1070, 1152, 1217, 1233, 1396, 1427, 1450, 1462, 1493, 1543, 1636, 3024, 3125, 3291, 3487。HRMS (EI+) m/z 261.1269 (M, C17H15N3requires 261.1266)。
［合成例２３］
3－ベンジル－2－ビス(ベンジルスルホニル)アミノ－5－フェニルピラジン (c－42)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
  
　アルゴン雰囲気下、2－アミノ－3－ベンジル－5－フェニルピラジン (c－41) (852 mg, 3.26 mmol)を脱水ジクロロメタン (25 mL)に溶解し、これにトリエチルアミン (1.38 mL, 9.87 mmol)を加え、0 ℃に冷却した。これに、ベンジルスルホニルクロリド (1.87 g, 9.80 mmol)を加え、室温に昇温後23.5時間撹拌した。これに、2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を水で1回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(56 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 4/1)で精製し、3－ベンジル－2－ビス(ベンジルスルホニル)アミノ－5－フェニルピラジン (c－42)を赤橙色アモルファスとして得た (1.27 g, 68.2%)。Rf = 0.70 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 71.5－74.5 ℃。UV (MeOH) λmax (log ε) 304 (4.20), 257 (4.15)。UV (pH 7.4 PB) λmax (log ε) 331 (4.13), 269 (4.12)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 3.89 (s, 2H), 5.00 (s, 1H), 5.04 (s, 1H), 5.19 (s, 1H), 5.22 (s, 1H), 7.15 (d, J= 7.0 Hz, 2H), 7.18－7.24 (m, 1H), 7.25－7.32 (m, 2H), 7.38－7.46 (m, 10H), 7.50－7.55 (m, 3H), 8.04－8.10 (m, 2H), 9.21 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6/CD3OD = 2/1) δ 38.3, 61.7 (1C×2), 127.0, 127.5, 127.8 (1C×2), 128.8 (2C), 129.4 (2C×2), 129.7 (2C), 129.9 (2C), 130.2 (2C), 131.3, 132.2 (2C), 135.3, 138.3, 139.6, 142.0, 153.0, 156.5。IR (KBr, cm－1) 507, 538, 557, 611, 629, 694, 723, 748, 766, 779, 876, 920, 1144, 1163, 1252, 1354, 1375, 1427, 1454, 1495, 1530, 3032。HRMS (FAB+) m/z 570.1526 (M+H, C31H28N3O4S2requires 570.1521)。
［合成例２４］
3－ベンジル－2－ベンジルスルホニルアミノ－5－フェニルピラジン（ジデオキシセレンテラスルホンアミド） (c－37)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
  
　3－ベンジル－2－ビス(ベンジルスルホニル)アミノ－5－フェニルピラジン (c－42) (1.15 g, 2.02 mmol)をメタノール (24 mL)に懸濁させ、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (5.7 mL)を加え、65 ℃で30分間撹拌した。室温まで放冷後、2 M 塩酸を加え反応を停止し、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルを用いて再結晶し、3－ベンジル－2－ベンジルスルホニルアミノ－5－フェニルピラジン（ジデオキシセレンテラスルホンアミド） (c－37)を無色固体として得た(662 mg, 78.9%)。Rf = 0.62 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 207－208.5 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λmax (log ε) 322.5 (4.01), 285.5 (4.08), 261 (4.14)。UV (pH 7.4 PB, 0.3% DMSO) λmax (log ε) 343 (4.01), 280.5 (4.07)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 4.26 (s, 2H), 4.94 (s, 2H), 7.15－7.21 (m, 1H), 7.23－7.30 (m, 4H), 7.36 (s, 5H), 7.40－7.53 (m, 3H), 8.04 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 8.95 (s, 1H), 10.55 (s, 1H)。13C NMR (75.5 MHz, DMSO－d6/CD3OD = 2/1) δ 38.5, 60.1, 126.7 (2C), 126.8, 128.8 (2C), 128.9, 129.0 (2C), 129.4 (2C), 129.5 (2C), 129.7, 130.4, 131.4 (2C), 136.3, 137.3, 138.5, 145.8, 146.3, 146.6。IR (KBr, cm－1) 447, 515, 532, 546, 615, 664, 692, 748, 783, 889, 1117, 1157, 1179, 1323, 1400, 1425, 1450, 1495, 3034, 3267。HRMS (FAB+) m/z 416.1429 (M+H, C24H22N3O2S requires 416.1433)。
［合成例２５］
3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－[(4－メトキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン (c－44)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
  
　アルゴン雰囲気下、3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－[(4－メトキシフェニル)アセチルアミノ]ピラジン (c－43) (Inouye, S. & Hosoya, T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 386, 617－622 (2009) に記載の方法によって製造) (1.00 g, 2.28 mmol) を脱水トルエン (30 mL) に懸濁し、室温で撹拌しながらこれにLawesson試薬 (552 mg, 1.37 mmol) を加え、17時間加熱還流した。還流後、室温まで放冷し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (100 g, ジクロロメタン/酢酸エチル = 49/1) で精製し、3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－[(4－メトキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン (c－44) を黄色油状物質として得た (823 mg, 79.4%)。Rf = 0.43 (ジクロロメタン/酢酸エチル= 19/1)。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ 2.84 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.92 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 6.90－6.96 (AA’BB’, 2H), 6.98－7.04 (AA’BB’, 2H), 7.05－7.11 (AA’BB’, 2H), 7.13－7.26 (m, 3H), 7.38－7.50 (m, 2H), 8.06－8.11 (AA’BB’, 2H), 8.99 (s, 1H), 12.12 (s, 1H)。13C NMR (67.8 MHz, DMSO－d6) δ39.3, 50.8, 55.0, 55.3, 113.8 (2C), 114.5 (2C), 126.3, 127.6, 128.18 (2C), 128.21 (2C), 128.8, 128.9 (2C), 130.0 (2C), 137.8, 138.0, 145.0, 149.6, 152.1, 158.4, 160.8, 205.1。IR (KBr, cm－1) 704, 835, 1030, 1113, 1175, 1250, 1292, 1304, 1319, 1371, 1422, 1439, 1493, 1510, 1607, 2835, 2932, 2957, 3150。HRMS (ESI+) m/z 456.1747 ((M+H)+, C27H26N3O2S+requires 456.1740)。
［合成例２６］
3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－[(4－ヒドロキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン（セレンテラチオアミド） (c－45)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
  
　アルゴン雰囲気下、3－ベンジル－5－(4－メトキシフェニル)－2－[(4－メトキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン (c－44) (823 mg, 1.81 mmol) を脱水ジクロロメタン (30 mL) に溶解し、これに室温にて1.0 M 三臭化ホウ素/ジクロロメタン溶液(6.80 mL, 6.80 mmol) を加えた後、反応溶液を21時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過し残渣を乾燥し、粗生成物である赤色固体591 mgを得た。これを酢酸エチルに溶解し、n－ヘキサンを加え生成物を析出させた。ろ過により析出した固体を回収し、減圧下で乾燥することにより、3－ベンジル－5－(4－ヒドロキシフェニル)－2－[(4－ヒドロキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン（セレンテラチオアミド） (c－45) を橙色固体として得た(514 mg, 66.6%)。Rf = 0.23 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 101－103 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ3.90 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 6.71－6.77 (AABB’, 2H), 6.85－6.91 (AA’BB’, 2H), 6.97－7.03 (AA’BB’, 2H), 7.12－7.25 (m, 3H), 7.27－7.34 (m, 2H), 7.94－8.00 (AA’BB’, 2H), 8.91 (s, 1H), 9.34 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 12.05 (s, 1H)。13C NMR (67.8 MHz, DMSO－d6) δ50.9, 115.1 (2C), 115.8 (2C), 126.0, 126.2, 127.0, 128.18 (2C), 128.24 (2C), 128.9 (2C), 129.9 (2C), 137.4, 138.0, 144.6, 149.9, 152.0, 156.4, 159.3, 205.3 (one carbon at benzyl position was unobservable due to over lapping with septet peak of DMSO)。IR (KBr, cm－1) 515, 561, 706, 731, 837, 908, 935, 1063, 1130, 1171, 1238, 1315, 1371, 1443, 1514, 1609, 2808, 3026, 3159。HRMS (ESI+) m/z 428.1434 ((M+H)+, C25H22N3O2S+requires 428.1427)。
［合成例２７］
5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(4－ヨードベンジルスルホニル)アミノピラジン (c－46)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
  
　アルゴン雰囲気下、5－(4－アセトキシフェニル)－2－アミノ－3－ベンジルピラジン (c－19) (681 mg, 2.13 mmol) を脱水ジクロロメタン (40 mL) に溶解し、これにトリエチルアミン (1.20 mL, 8.53 mmol) を加え、0 ℃に冷却した。これに、4－ヨードベンジルスルホニルクロリド (Liu, S. et al., Org. Lett., 3, 1571－1574 (2001)に記載の方法によって製造) (2.70 g, 8.53 mmol)を加え、室温に昇温後、26時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに、2 M 塩酸およびジクロロメタンを加え、水層と有機層を分離した後、有機層を水で1回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (100 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 4/1) で精製し、得られた生成物にジクロロメタンを加え、ろ過することにより不溶物を除去した。この操作を5回繰り返した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルを用いて再結晶し、5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(4－ヨードベンジルスルホニル)アミノピラジン(c－46) を無色固体として得た (597 mg, 31.8%)。Rf = 0.21 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 4/1)。Mp. 166－167 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ2.30 (s, 3H), 3.89 (s, 2H), 5.00 (d, 2H, J = 13.6 Hz), 5.19 (d, 2H, J = 13.6 Hz), 7.11－7.17 (AA’BB’, 2H), 7.19－7.34 (m, 9H), 7.78－7.83 (AA’BB’, 4H), 8.07－8.15 (AA’BB’, 2H), 9.19 (s, 1H)。13C NMR (67.8 MHz, DMSO－d6) δ20.9, 37.5, 60.5 (2C), 96.3, 126.4, 126.5 (2C), 128.1 (2C), 128.5 (2C), 129.5 (2C), 132.0, 133.6 (4C), 137.4, 137.7 (4C), 139.2, 140.9, 151.2, 152.5, 155.5, 168.9。IR (KBr, cm－1) 519, 575, 627, 704, 775, 835, 912, 1013, 1057, 1159, 1200, 1254, 1356, 1377, 1483, 1601, 1757。Anal. Calcd. For C33H27I2N3O6S2: C, 45.06; H, 3.09; N, 4.78. Found: C, 45.18; H, 3.24; N, 4.78。
［合成例２８］
5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－[(4－ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ]ピラジン (c－48)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
  
　アルゴン雰囲気下、5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－ビス(4－ヨードベンジルスルホニル)アミノピラジン(c－46) (402 mg, 457 μmol) をジメチルスルホキシド（DMSO）(4 mL)に溶解し、これに室温にてbis(pinacolato)diboron (284 mg, 1.12 mmol)、酢酸カリウム (236 mg, 2.41 mmol)、[1,1’－bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II)ジクロロメタン錯体 (1:1)(32.7 mg, 40.1 μmol)を順次加えた後、80 ℃で18時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を水で3回、飽和食塩水で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(50 g, n-ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)にて精製し、5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－[4－{4－(4,4,5,5－テトラメチル－1,3,2－ジオキサボロラン－2－イル)ベンジル}スルホニルアミノ]ピラジン (c－47) と5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－[(4－ヨードベンジル)スルホニルアミノ]ピラジンの混合物を得た。
　上記で得られた混合物をアセトン(10 mL)に溶解し、これに室温にてoxone (247 mg, 401 μmol)を水(3 mL)に溶解したものを加え、そのまま室温で15分間攪拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止し、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を水で1回、飽和食塩水で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(50 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 2/1、および50 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)にて精製し、得られたを無色固体を(68.5 mg)を酢酸エチルに溶解し、n－ヘキサンを加え化合物を析出させた。ろ過により析出した固体を回収し、減圧下で乾燥することにより、5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－[(4－ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ]ピラジン (c－48) を無色固体として得た (44.8 mg, 20.0%, 2 steps)。Rf = 0.45 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ2.30 (s, 3H), 4.26 (s, 2H), 4.81 (s, 2H), 6.68－6.79 (AA’BB’, 2H), 7.08－7.32 (m, 9H), 8.02－8.14 (AA’BB’, 2H), 8.94 (s, 1H), 9.55 (s, 1H), 10.45 (s, 1H)。13C NMR (67.8 MHz, DMSO-d6) δ20.9, 37.9, 59.1, 115.3 (2C), 119.8, 122.4 (2C), 126.3, 127.2 (2C), 128.3 (2C), 128.9 (2C), 132.0 (2C), 133.3, 136.8, 137.9, 145.0, 145.4, 145.5, 151.3, 157.7, 169.1。IR (KBr, cm－1) 536, 598, 702, 841, 891, 920, 1015, 1153, 1204, 1233, 1327, 1373, 1422, 1454, 1514, 1599, 1746, 3269。
［合成例２９］
3－ベンジル－2－(4－ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ－5－(4－ヒドロキシフェニル)ピラジン （セレンテラスルホンアミド） (c－38)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
  
　5－(4－アセトキシフェニル)－3－ベンジル－2－[(4－ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ]ピラジン (c－48) (105 mg, 214 μmol)をメタノール (2 mL) に溶解し、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.0 mL) を加え、60 ℃で2時間撹拌した。室温まで放冷後、これに2 M塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (10 g, n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)およびで精製し、n－ヘキサン/酢酸エチルを用いて再結晶することで、3－ベンジル－2－(4－ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ－5－(4－ヒドロキシフェニル)ピラジン（セレンテラスルホンアミド） (c－38) を黄色固体として得た(43.4 mg, 45.2%)。Rf = 0.29 (n－ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 194.5－196.5 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO－d6) δ4.22 (s, 2H), 4.78 (s, 2H), 6.70－6.77 (AA’BB’, 2H), 6.83－6.90 (AA’BB’, 2H), 7.10－7.21 (m, 3H), 7.23－7.31 (m, 4H), 7.85－7.95 (AA’BB’, 2H), 8.81 (s, 1H), 9.54 (s, 1H), 9.81 (s, 1H), 10.30 (s, 1H)。13C NMR (67.8 MHz, DMSO-d6) δ38.0, 59.1, 115.4 (2C), 115.8 (2C), 119.9, 126.3, 126.6, 127.7 (2C), 128.3 (2C), 129.0 (2C), 132.0 (2C), 135.9, 138.2, 144.4, 145.7, 146.4, 157.7, 158.8。IR (KBr, cm－1) 536, 602, 700, 835, 889, 1119, 1155, 1177, 1258, 1275, 1327, 1402, 1456, 1514, 1611, 3529, 3412, 3487。Anal. Calcd. For C24H21N3O4S: C, 64.41; H, 4.73; N, 9.39. Found: C, 64.28; H, 4.74; N, 9.28。
３．蛍光特性の決定
［実施例１］
　合成した各CTMD類縁体の蛍光量子収率決定を以下の手順で行った。蛍光スペクトルは、Jasco（日本分光株式会社、東京）のFP－6500蛍光分光光度計を用いて25℃で測定した。具体的には、石英セル（光路長10mm）を用い、最終濃度が750 nMになるようにCTMD類縁体をメタノール (MeOH)又は６７mMリン酸緩衝液(PB)（pH 7.4）に溶解し、励起波長：330 nm、 発光／励起帯域幅: 3 nm、レスポンス：0.5 秒、スキャン速度：100 nm/分で３回測定を行い、その平均スペクトルを、化合物蛍光スペクトルとした。蛍光量子収率決定には、スペクトル補正を行った後に使用した。
　蛍光量子収率の標準対照溶液として、硫酸キニーネを用いた。硫酸キニーネ（和光純薬）を0.1 N硫酸水溶液に溶解したのち、励起光を366 nmで、上記の蛍光測定条件で測定を行った。硫酸キニーネの量子収率を、0.55として、化合物の相対的な蛍光量子収率（蛍光強度）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
　上記表１から、本発明のセレンテラミド類縁体（c－14、c－17、c－31、c－15、c－18、c－32、c－21、c－20、c－39、c－34、c－35、c－42、c－37、c－40、又はc－36）が、公知のCTMD（c－4)やh－CTMD（c－13)などと異なる蛍光特性を有することが分かった。
　また、本発明のセレンテラミド類縁体のうち、c－15、c－18、c－32、c－21、c－20、c－39、c－34、c－35、c－42、又はc－37は、有機溶媒又は水溶媒中での蛍光量子収率が0.090以上であり、強い蛍光能を有することが分かった。特に、c－15、c－18、c－32、c－21、c－20、c－35、c－42、又はc－37は、有機溶媒又は水溶媒中での蛍光量子収率が0.100以上であり、特に強い蛍光能を有することが分かった。
　また、多くの蛍光性化合物は、有機溶媒中で強い蛍光能があっても水溶液中では蛍光能が著しく減弱することが知られているが、特に、c－18、c－32、又はc－37については、有機溶媒中でも、水溶媒中でも、蛍光量子収率が0.100以上であり、特に強い蛍光能を保持することが分かった。
［実施例２］
　実施例１で求めた蛍光量子収率は、セレンテラミド類縁体の最終濃度を750 nMとして、蛍光スペクトルを測定し算出した数値であるが、実施例１のように最終濃度を750 nMとした場合、本発明のセレンテラミド類縁体のうち、c－14、c－31、及びc－36については、メタノール中およびリン酸緩衝液中とも蛍光スペクトルを検出できず、c－25は、リン酸緩衝液中で蛍光スペクトルを検出できなかった（n.d.：検出不可）。そこで、蛍光スペクトルを検出できなかったc－14、c－31、c－25 及びc－36について、これらのセレンテラミド類縁体の最終濃度を30 μMとしたことを除いて実施例１と同じ条件で蛍光スペクトルを測定した。また、同様に、c－4についても、最終濃度を30 μMとして蛍光スペクトルを測定した。さらに、c－45についても、最終濃度を 18μMとしたことを除いて実施例１と同じ条件で10 mM CaCl2を含む50 mM Tris－HCl (pH 7.6)中で蛍光スペクトルを測定した。
　c－14 (ｈCTTD)、c－31 (O－Ac－h－CTTD) 及び c－36 (CT－p－NsD) のメタノール中での蛍光スペクトルを図２示し、また、リン酸緩衝液中での、c－14 (ｈCTTD)、c－31 (O－Ac－h－CTTD)、 C－25 (CTAD) 及び c－36  (CT－p－NsD)の蛍光スペクトルを図３に示す。また、10 mM CaCl2を含む50 mM Tris－HCl (pH 7.6)中での、c－45 (CTTD)の蛍光スペクトも図３に示す。
　また、c－4、c－14、c－31、c－25 及び c－36の蛍光スペクトルデータを表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
  
　この結果、c－14、c－31、及びc－36を含む本発明のセレンテラミド類縁体は、有機溶媒および水溶液中で、蛍光能を有することが明らかとなった。また、c－45については、少なくとも水溶液中で蛍光能を有することが確認できた。
　尚、c－44（CTTD）については、c－17（hCTTD）に蛍光能があることから、c－17と同様、蛍光能を有すると考えられる。
　以上の実施例で示したように、本発明の好ましい態様のセレンテラミド類縁体は、有機溶媒中および水溶液中の両方で蛍光能を有することから、バイオアッセイや生体内分子イメージングなど幅広い用途に応用可能である。
　［実施例３］
　c－38について、蛍光スペクトルを、Jasco（日本分光株式会社、東京）のFP－6500蛍光分光光度計を用いて25℃で測定した。具体的には、石英セル（光路長10mm）を用い、最終濃度が18μMになるようにc－38を10 mM CaCl2を含む50 mM Tris－HCl (pH 7.6)に溶解し、励起波長：330 nm、 発光／励起帯域幅: 3 nm、レスポンス：0.5 秒、スキャン速度：100 nm/分で３回測定を行い、その平均スペクトルを、蛍光スペクトルとした。
　c－38(CTSD)の10 mM CaCl2を含む50 mM Tris－HCl (pH 7.6)での蛍光スペクトルを図４に示す。
　図４から、c－38は蛍光能を有することが分かった。
［配列表フリーテキスト］
〔配列番号：１〕天然型アポイクオリンの塩基配列である。
〔配列番号：２〕天然型アポイクオリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：３〕天然型アポクライティン－Ｉの塩基配列である。
〔配列番号：４〕天然型アポクライティン－Ｉのアミノ酸配列である。
〔配列番号：５〕天然型アポクライティン－ＩＩの塩基配列である。
〔配列番号：６〕天然型アポクライティン－ＩＩのアミノ酸配列である。
〔配列番号：７〕天然型アポマイトロコミンの塩基配列である。
〔配列番号：８〕天然型アポマイトロコミンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：９〕天然型アポオベリンの塩基配列である。
〔配列番号：１０〕天然型アポオベリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：１１〕天然型アポベルボインの塩基配列である。
〔配列番号：１２〕天然型アポベルボインのアミノ酸配列である。

Claims (12)

  1. 　下記一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
    で表わされる化合物
    （式中、
    　Ｒ１は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、脂肪族環式基、又は複素環式基であり、
    　Ｒ２は、水素、又は－（ＳＯ２）Ｒ４であり、
    　Ｒ３は、水素、水酸基、メトキシ、又はアセトキシであり、
    　Ｒ４は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキルであり、
    　Ｘ1は、－Ｃ（＝Ｓ）－、又は－ＳＯ２－である。）。
  2. 　一般式（１）において、
    　Ｒ１は、フェニル、ｐ－メチルフェニル、ｐ－ヒドロキシフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－アセトキシフェニル、ｐ－ニトロフェニル、ベンジル、α－ヒドロキシベンジル、４－メチルベンジル、４－ヒドロキシベンジル、４－メトキシベンジル、４－アセトキシベンジル、４－ニトロベンジル、フェニルエチル、メチル、エチル、プロピル、２－メチルプロピル、２－メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、又はチオフェン－２－イルであること、
    　を特徴とする、請求項１に記載の化合物。
  3. 　一般式（１）において、
    　Ｒ２は、水素、ベンゼンスルホニル、ｐ－トルエンスルホニル、４－ヒドロキシフェニルスルホニル、４－メトキシフェニルスルホニル、４－アセトキシフェニルスルホニル、４－ニトロフェニルスルホニル、ベンジルスルホニル、α－ヒドロキシベンジルスルホニル、４－メチルベンジルスルホニル、４－ヒドロキシベンジルスルホニル、４－メトキシベンジルスルホニル、４－アセトキシベンジルスルホニル、４－ニトロベンジルスルホニル、フェニルエチルスルホニル、メタンスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、２－メチルプロピルスルホニル、２－メチルプロパニルスルホニル、シクロヘキシルメチルスルホニル、シクロヘキシルエチルスルホニル、アダマンチルメチルスルホニル、又はシクロペンチルメチルスルホニルであること、
    　を特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物。
  4. 　下記化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      
    からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
  5. 　下記化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
      
    からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを含む、青色蛍光蛋白質。
  7. 　カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを反応させることを含む、青色蛍光蛋白質の製造方法。
  8. 　前記反応を、還元剤の存在下において行う、請求項７に記載の方法。
  9. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物、及びカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を含む、緑色蛍光蛋白質。
  10. 　請求項６に記載の青色蛍光蛋白質を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することを含む、緑色蛍光蛋白質の製造方法。
  11. 　請求項９に記載の緑色蛍光蛋白質に、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることを含む、カルシウム結合型発光蛋白質の製造方法。
  12. 　蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、還元剤の存在下において行う、請求項１１に記載の方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102432614A (zh) * 2011-11-16 2012-05-02 泰州凯美迪生物医药技术有限公司 腔肠素的合成方法
US8883432B2 (en) 2010-04-06 2014-11-11 Jnc Corporation Coelenterazine analogues and coelenteramide analogues
US10854747B2 (en) 2017-07-10 2020-12-01 Micron Technology, Inc. NAND memory arrays, devices comprising semiconductor channel material and nitrogen, and methods of forming NAND memory arrays
EP4206184A4 (en) * 2020-09-07 2024-11-20 Sumitomo Pharma Co., Ltd. PHENOL DERIVATIVE

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3416968B1 (en) 2016-02-15 2022-07-27 Promega Corporation Coelenterazine analogues
JP7212612B2 (ja) 2016-07-28 2023-01-25 プロメガ コーポレイション セレンテラジン類縁体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005014633A1 (ja) * 2003-08-12 2005-02-17 Chisso Corporation 蛍光蛋白質
JP2006271327A (ja) * 2005-03-30 2006-10-12 Chisso Corp 蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005014633A1 (ja) * 2003-08-12 2005-02-17 Chisso Corporation 蛍光蛋白質
JP2006271327A (ja) * 2005-03-30 2006-10-12 Chisso Corp 蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOTARO MORI ET AL.: "Real light emitter in the bioluminescence of the calcium-activated photoproteins aequorin and obelin: light emission from the singlet-excited state of coelenteramide phenolate anion in a contact ion pair", TETRAHEDRON, vol. 62, no. 26, 2006, pages 6272 - 6288 *
MASAKI KUSE ET AL.: "Novel synthetic route of aryl-aminopyrazine", TETRAHEDRON, vol. 60, no. 4, 2004, pages 835 - 840 *
OSAMU SHIMOMURA ET AL.: "Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine", LUMINESCENCE, vol. 15, no. 1, 2000, pages 51 - 58 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8883432B2 (en) 2010-04-06 2014-11-11 Jnc Corporation Coelenterazine analogues and coelenteramide analogues
US9056840B2 (en) 2010-04-06 2015-06-16 Jnc Corporation Coelenterazine analogues and coelenteramide analogues
US9075058B2 (en) 2010-04-06 2015-07-07 Jnc Corporation Coelenterazine analogues and coelenteramide analogues
CN102432614A (zh) * 2011-11-16 2012-05-02 泰州凯美迪生物医药技术有限公司 腔肠素的合成方法
US10854747B2 (en) 2017-07-10 2020-12-01 Micron Technology, Inc. NAND memory arrays, devices comprising semiconductor channel material and nitrogen, and methods of forming NAND memory arrays
EP4206184A4 (en) * 2020-09-07 2024-11-20 Sumitomo Pharma Co., Ltd. PHENOL DERIVATIVE
US12590063B2 (en) 2020-09-07 2026-03-31 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Phenol derivative

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