WO2010140602A1 - Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびｄ－乳酸の製造方法 - Google Patents

Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびｄ－乳酸の製造方法 Download PDF

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WO
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polynucleotide
seq
polypeptide
lactic acid
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健司 澤井
和美 須田
澤井　秀樹
山田　勝成
潤也 山岸
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Toray Industries Inc
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide having D-lactate dehydrogenase activity for producing D-lactic acid, a polynucleotide encoding the polypeptide, and a transformant into which the polynucleotide has been introduced.
  • the present invention relates to a method for producing D-lactic acid, comprising culturing a converter.
  • PLA Polylactic acid
  • PLA that uses biomass, which is a renewable resource, has received a lot of attention from the carbon neutral perspective.
  • PLA is relatively inexpensive and has a heat resistance of about 170 ° C., and is expected as a biodegradable polymer that can be melt-molded.
  • a polylactic acid stereocomplex can be obtained by mixing poly-L-lactic acid and poly-D-lactic acid (Patent Documents 1 to 3).
  • Polylactic acid stereocomplex has a higher melting point and higher crystallinity than a single polymer, and is known to give a molded product useful as a fiber, film, or resin molded product.
  • -A highly pure and highly efficient production method is required for both lactic acid.
  • Lactobacillus delbrueckii is a bacterium that efficiently produces L-lactic acid.
  • a microorganism of Sporolactobacillus laevolacticus is known (Patent Document 4). In either case, the amount of lactic acid accumulated in anaerobic culture has reached a high level, but in the case of L-lactic acid fermentation, D-lactic acid is produced as a by-product, and in the case of D-lactic acid fermentation, L-lactic acid is produced as a by-product. Bring about a decline. And it is very difficult to separate them.
  • a gene encoding L-lactic acid or D-lactic acid dehydrogenase is introduced into a yeast that does not originally have lactic acid-producing ability, and L-lactic acid and D- using the yeast are introduced. Lactic acid fermentation has been studied (Patent Documents 4 to 6, Non-Patent Document 1). Regarding L-lactic acid fermentation using genetically modified yeast, highly efficient and high optical purity lactic acid fermentation is possible by introducing a gene encoding L-lactic acid dehydrogenase derived from highly active Xenopus laevis. (Patent Document 4). On the other hand, regarding D-lactic acid fermentation using genetically modified yeast, although high optical purity D-lactic acid was obtained as in L-lactic acid fermentation, there was a problem in D-lactic acid yield (Patent Documents 5 and 6, Non-patent document 1).
  • An object of the present invention is to realize highly productive D-lactic acid fermentation using a polypeptide having higher D-lactate dehydrogenase activity and a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • the present inventors have found a polypeptide having a D-lactate dehydrogenase activity that increases the amount of D-lactate produced and at the same time produces little by-products, and the same.
  • the encoding polynucleotide was found and the present invention was completed.
  • the present invention comprises the following aspects.
  • polynucleotide of any one of (a) to (e) below (A) A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 4 (b) In the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 4, one or several bases are substituted, deleted, inserted and / or added.
  • a polynucleotide encoding the polypeptide having the D-lactate dehydrogenase activity (c) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 4, or the entire or a part of its complementary strand; A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions, the polynucleotide encoding a polypeptide having D-LDH activity (d) having at least 80% sequence identity with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 4
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having the D-lactate dehydrogenase activity ( ) (1) a polynucleotide encoding a polypeptide according to.
  • the promoter is a pyruvate decarboxylase 1 gene (PDC1 gene), a suppression of exponential defect 1 gene (SED1 gene) or a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3 gene (TDH3 gene)
  • PDC1 gene pyruvate decarboxylase 1 gene
  • SED1 gene suppression of exponential defect 1 gene
  • TDH3 gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3 gene
  • the transformed yeast has its pyruvate decarboxylase 1 gene (PDC1 gene), suppression of exponential defect 1 gene (SED1 gene), and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3 gene. Transformation according to (7), wherein at least one gene of (TDH3 gene) is replaced with the polynucleotide according to (2) or the DNA construct according to any of (3) to (5) yeast.
  • a transformant into which a polynucleotide encoding a D-lactate dehydrogenase derived from a horseshoe crab family or a DNA construct in which the polynucleotide and a promoter capable of expressing the polynucleotide are linked is introduced.
  • a transformed yeast into which a polynucleotide encoding a D-lactate dehydrogenase derived from the horseshoe crab genus or a DNA construct in which the polynucleotide and a promoter capable of expressing the polynucleotide are linked is introduced.
  • the transformed yeast has its pyruvate decarboxylase 1 gene (PDC1 gene), suppression of exponential defect 1 gene (SED1 gene), and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3 gene.
  • PDC1 gene pyruvate decarboxylase 1 gene
  • SED1 gene suppression of exponential defect 1 gene
  • glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3 gene at least one gene is replaced with a polynucleotide encoding the D-lactate dehydrogenase derived from the horseshoe crab family or a DNA construct in which the polynucleotide and a promoter capable of expressing the polynucleotide are linked.
  • TDH3 gene at least one gene is replaced with a polynucleotide encoding the D-lactate dehydrogenase derived from the horseshoe crab family or a DNA construct in which the polynucleotide and a promoter capable of expressing
  • a method for producing D-lactic acid comprising a step of culturing the transformant according to (11) or the transformed yeast according to (12) or (13).
  • a polypeptide having D-lactic acid dehydrogenase activity suitable for D-lactic acid fermentation production and a polynucleotide encoding the same are provided.
  • a transformant capable of producing D-lactic acid at a high yield can be easily obtained by using the polynucleotide of the present invention.
  • D-lactic acid can be efficiently produced with high purity by culturing the transformant. Can do.
  • FIG. 1 shows one production procedure of the yeast SU042 strain of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of continuous culture using the yeast SU042 strain of the present invention.
  • D-Lactate dehydrogenase activity converts reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and pyruvate into D-lactic acid and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +). Active.
  • the present invention includes a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 or a homologue thereof, wherein the polypeptide has D-LDH activity.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 is a polypeptide derived from the American horseshoe crab (Limulus polyphemus) belonging to the genus Lomulidae.
  • Examples of the homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 include, for example, one or several, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 1 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • a polypeptide having an amino acid sequence of substitution, deletion, insertion and / or addition of 5, more preferably 1 or 2 amino acids, and having D-LDH activity is exemplified.
  • the homologue of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 or 4 is an amino acid having at least 80% or more, preferably 90%, more preferably 95% or more sequence identity with the amino sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. It may be a polypeptide having a sequence and having D-LDH activity.
  • sequence identity of amino acid sequences can be easily examined using BLAST which is software widely used in this field. BLAST is available to anyone on the NCBI (National Center for Biotechnology Information) homepage and can be easily checked for identity using default parameters.
  • the homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 is derived from an organism belonging to the family Crabidae, preferably from an organism belonging to the genus Astragalus or the genus Horseshoe crab, more preferably the American horseshoe crab ( It is a polypeptide H derived from Limulus polyphemus or a horseshoe crab (Tachypleus tridentatus), a southern horseshoe crab (Tachypleus gigas) or a marsh horseshoe crab (Tachypleus rotundicauda), which may be an LD-active H.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 can be extracted from American horseshoe crab by a known method, or can be prepared using a known method known as a peptide synthesis method, and SEQ ID NO: 1 or 2 It can also be prepared by a gene recombination technique using a polynucleotide encoding the amino acid sequence described in 1.
  • the polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 can be extracted from an organism belonging to the genus Horseshoe crab by a known method, or can be prepared using a known method known as a peptide synthesis method.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the peptide can also be used to adjust by gene recombination techniques.
  • the homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 may have improved D-LDH activity and improved thermal stability as compared to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2. You may do it.
  • D-LDH activity is improved means that the substrate affinity and molecular activity (Kcat) for pyruvate and NADH as substrates are improved, and that the optimum pH of the enzyme activity of the polypeptide is It means shifting closer to a pH suitable for the growth of cells expressing the polypeptide.
  • Such a polypeptide may be artificially designed based on the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, or may be isolated from nature. Alternatively, mutation may be randomly introduced into the D-lactate dehydrogenase gene by molecular evolution engineering techniques, and a preferred polypeptide may be screened therefrom.
  • the present invention includes a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 4 or a homologue thereof, wherein the polynucleotide encodes a polynucleotide having D-LDH activity.
  • polynucleotide does not ask the origin such as cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, synthetic RNA, and replicon RNA, but is preferably DNA or RNA, and more preferably DNA. Further, it may be a single strand or a double strand having its complementary strand.
  • natural or artificial nucleotide derivatives may be included.
  • the polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 4 is a polynucleotide derived from American horseshoe crab and is characterized in that it encodes the polypeptide having the D-LDH activity.
  • Examples of the homologue of the polynucleotide described in SEQ ID NO: 3 or 4 include, for example, 1 or several, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, in the base sequence described in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • a polynucleotide comprising a base sequence in which 1 to 20, particularly preferably 1 to 10, and most preferably 1 to 5 bases are substituted, deleted, inserted and / or added, Examples include those encoding a polypeptide having D-LDH activity.
  • the homologue of the polynucleotide described in SEQ ID NO: 3 or 4 is hybridized under stringent conditions with the whole or a part of the polynucleotide consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 or 4 or its complementary strand.
  • the polynucleotide include those encoding a polypeptide having D-LDH activity at the same time.
  • the “polynucleotide that hybridizes under stringent conditions” refers to, for example, any one of a continuous sequence of at least 20, preferably 25, more preferably at least 30 of the original base sequence.
  • hybridization is performed using a known hybridization technique (Current-Protocols-I-Molecular-Biology-edit.-Ausubel-et-al., (1987) -Publish-.John-Wily-> SonsSectoin-6.3-6.4).
  • stringent conditions include, for example, a hybridization temperature of 37 ° C. in the presence of 50% formamide, 42 ° C. as a more severe condition, 65 ° C.
  • composition of a 1-fold concentrated SSC solution 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate.
  • the homologue of the polynucleotide described in SEQ ID NO: 3 or 4 is at least 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 or 4. It may be a polynucleotide consisting of a base sequence having identity, and a polynucleotide encoding a polypeptide having D-LDH activity at the same time.
  • the sequence identity of the base sequence of the polynucleotide referred to here can be determined by the aforementioned gene analysis program BLAST or the like.
  • polynucleotide homologue described in SEQ ID NO: 3 or 4 is derived from an organism belonging to the horseshoe crab family, preferably from an organism belonging to the genus Ameridae or the horseshoe crab, more preferably derived from an Astragalus crab, a horseshoe crab, a southern horseshoe crab, or a marsh horseshoe crab And a polynucleotide encoding a polypeptide having D-LDH activity.
  • the polynucleotide can be prepared by cloning from an organism belonging to the family Scorpionidae, preferably the family Scorpionidae (hereinafter collectively referred to as horseshoe crab), but chemically synthesized or long-chain DNA. Synthesis by adopting the method of Fujimoto et al. (Fujimoto Hideya, Synthetic Gene Production Method, Plant Cell Engineering Series 7 Plant PCR Experiment Protocol, 1997, Shujunsha, p95-100) You can also. Cloning from horseshoe crabs can be isolated using commonly known methods, such as D-lactate dehydrogenation from cDNA prepared from polyA (+) RNA isolated from horseshoe crab blood cells.
  • Amplification and sequencing of partial fragments are performed using primers synthesized based on highly conserved sequences in the enzyme, then the entire ORF sequence is determined by the 5′RACE and 3′RACE methods, and then amplified by PCR. Can be obtained. It can also be performed by functional complementation of D-lactate dehydrogenase. Details of the principle are described in (DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, United States (1995) 61 266-272). In this way, the polynucleotide of the present invention having the base sequence once determined can be obtained again from horseshoe crab hemocytes, but can also be chemically synthesized directly with a DNA synthesizer.
  • the polypeptide or polynucleotide has an amino acid sequence or base sequence, site-specific displacement introduction method (Current-Protocols-I-Molecular-Biology-edit.-Ausubel-etal., (1987) -Publish-.John-Wily- & Sons-Sectoin-8.1-8.5), etc. Can be appropriately modified by introducing substitution, deletion, insertion and / or addition mutation as appropriate.
  • the modification of the amino acid sequence of such a polypeptide or the base sequence of a polynucleotide is not limited to artificially introduced or synthesized mutations, but based on or not limited to artificial mutation treatment in nature. Those caused by amino acid mutations are also included.
  • the polynucleotide can be used for producing D-lactic acid-producing cells by genetic recombination.
  • a host cell into which the polynucleotide of the present invention has been introduced by genetic recombination (hereinafter also referred to as a transformant) to produce D-lactic acid
  • the D- encoded by the polynucleotide in the transformant is required. It is necessary to express a polypeptide having LDH activity.
  • a promoter capable of expressing the polynucleotide is linked, that is, It is useful to use a DNA construct in which the polynucleotide is linked to the 3 ′ end of the promoter, and the DNA construct is also included in the present invention.
  • the polynucleotide (DNA) of the present invention and a promoter capable of expressing the polynucleotide are each cleaved with an appropriate restriction enzyme, and inserted into a restriction enzyme site or a multiple cloning site of vector DNA described below.
  • the polynucleotide (DNA) of the present invention and the promoter can be prepared by PCR.
  • the DNA construct is held on a vector such as a plasmid (DNA), bacteriophage (DNA), retrotransposon (DNA), artificial chromosome (YAC, PAC, BAC, MAC, etc.).
  • a prokaryotic vector, eukaryotic vector, animal cell vector or plant cell vector known in the art may be used depending on the form of introduction of the DNA construct (inside or outside the host genome) and the type of host cell. It is selected appropriately.
  • plasmids examples include YCp type E. coli-yeast shuttle vectors such as pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 or pAUR123, YEp type E. coli-yeast shuttle vectors such as pYES32 or YEp13, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, YIp type E. coli-yeast shuttle vector such as pAUR101 or pAUR135, plasmid derived from E.
  • YCp type E. coli-yeast shuttle vectors such as pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 or pAUR123
  • YEp type E. coli-yeast shuttle vectors such as pYES32 or YEp13, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, YIp type
  • coli pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript such as pBluescript, pHSG298, pHSG396, or pTrc99A, pCc17A, AC7 p1A-based plasmid, pMW1 8, pMW119, pMW218 or pSC101-based plasmids such as pMW219 and the like), plasmids derived from Bacillus subtilis (e.g., and the like pUB110, pTP5, etc.).
  • Bacillus subtilis e.g., and the like pUB110, pTP5, etc.
  • Examples of the bacteriophage include ⁇ phage (Charon 4A, Charon 21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt100, gt11, zap), ⁇ X174, M13mp18, and M13mp19.
  • Examples of the retrotransposon include Ty factor.
  • Examples of YAC include pYACC2.
  • the “promoter” in the DNA construct means a base sequence involved in the initiation of transcription of mRNA from a gene, and usually refers to an upstream sequence on the 5-terminal side of a gene present in a chromosome.
  • the length of the base sequence of the promoter is preferably 1 to 3000 bp, more preferably 1 to 1000 bp, but there is no particular limitation as long as it is a base sequence capable of initiating transcription of mRNA of a gene existing downstream.
  • mutations and manipulations that improve the transcriptional activity of the promoter are known, and “promoter” includes those modified by a known technique.
  • the promoter in the DNA construct is not particularly limited as long as it has promoter activity in the transformant into which the DNA construct has been introduced. However, as described later, the DNA construct of the present invention is preferably introduced into yeast. Therefore, a promoter that functions in yeast is preferable.
  • promoters that function in yeast include acid phosphatase gene (PHO5), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (TDH1, 2, 3), alcohol dehydrogenase gene (ADH1, 2, 3, 4, 5, 6,7) gene, galactose metabolic system gene (GAL1,7,10), cytochrome c gene (CYC1), triose phosphate isomerase gene (TPI1), phosphoglycerate kinase gene (PGK1), phosphofructose kinase gene (PFK1), Examples include the promoter of the pyruvine decarboxylase gene (PDC1, 5, 6), and are described and used in the international application PCT / JP2008 / 072129.
  • a promoter is more than five times the average relative expression amount, enolase 1 gene (ENO1), cell wall-associated protein 2 gene (CWP2), include the promoter of suppression-of-exponential-defect 1 gene (SEDl).
  • promoters that function in yeast include the PDC1 promoter or TDH3 promoter that is highly expressed in the yeast ethanol fermentation pathway, or the SED1 promoter that is highly expressed during long-term yeast culture. Include the PDC1 promoter described in SEQ ID NO: 5, the SED1 promoter described in SEQ ID NO: 6, or the TDH3 promoter described in SEQ ID NO: 7.
  • the PDC1 promoter, SED1 promoter or TDH3 promoter has one or several, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 4 base sequences as shown in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7 within the range having the promoter activity. It may be a base sequence in which 1 to 30, more preferably 1 to 20, particularly preferably 1 to 10, and most preferably 1 to 5 base sequences are deleted, substituted and / or added. .
  • the PDC1 promoter, TDH3 promoter or SED1 promoter hybridizes under stringent conditions with the base sequence described in any one of SEQ ID NOS: 5 to 7 or a part thereof, as long as the promoter activity exists. It may be a base sequence.
  • “hybridizes under stringent conditions” means, for example, one or a plurality of continuous sequences of at least 20, preferably 25, more preferably at least 30 of the original base sequence.
  • hybridization using a well-known hybridization technique Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4), etc.
  • stringent conditions include, for example, a hybridization temperature of 37 ° C. in the presence of 50% formamide, 42 ° C. as a more severe condition, 65 ° C. as a more severe condition, and 0.1 to 2 times the concentration of SSC ( This can be achieved by washing with a saline-sodium citrate) solution (composition of a 1-fold concentrated SSC solution: 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate).
  • a transformant obtained by introducing the polynucleotide or DNA construct into a host cell is also included in the present invention.
  • the host cell is not particularly limited as long as it stably holds the polynucleotide or DNA construct, and includes bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and lactic acid bacteria, yeast, insect cells, animal cells, or plant cells.
  • Yeast is preferably used because it is acid-resistant and can grow even when D-lactic acid is highly produced by expressing a polypeptide having D-LDH activity.
  • yeasts examples include Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Hansenoura, and Hansenula.
  • Candida sonorensis or Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus examples include Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Hansenoura, and Hansenula.
  • the yeast is a high-order polyploid yeast, it is possible to stably maintain high productivity of D-lactic acid over a long period of time under simple operating conditions, and stably produce D-lactic acid at low cost. Therefore, it is preferably used in the present invention.
  • the “high order polyploid yeast” is a yeast having two or more pairs of chromosomes in a cell. There is no particular restriction on the number of chromosomes of higher order polyploid yeast, but diploid yeast having two sets of chromosomes is preferred. Examples of the higher polyploid yeast include baker's yeast, sake yeast, wine yeast, beer yeast and the like often used in the fermentation industry. The higher-order multiple versus yeast used may be isolated from the natural environment, or may be partially modified in nature by mutation or genetic recombination.
  • yeast is non-nutrient-requiring, a medium with less nutrients than conventional ones, that is, a low-cost medium can be used, and high production of D-lactic acid can be stably performed over a long period of time under simple operation conditions. Therefore, lactic acid can be stably produced at low cost, and is preferably used in the present invention.
  • auxotrophic means that the nutrient synthesis gene of wild-type yeast is mutated for some reason and, as a result, lacks the ability to synthesize the nutrient. That is, the “nutrient-requiring yeast” is a yeast that does not have a genotype exhibiting auxotrophy or is complemented.
  • auxotrophy of auxotrophic yeast and produce non-nutrient auxotrophic yeast
  • a method for determining whether or not the yeast is non-nutrient-requiring yeast it can be used as a criterion for judgment based on whether or not the yeast can grow on an SD medium that is a minimum yeast culture medium.
  • Yeast is a microorganism that vigorously performs ethanol fermentation, and its metabolic pathway is that pyruvate, a glycolytic product, is converted to acetaldehyde by pyruvate decarboxylase, and the acetaldehyde is converted to ethanol by alcohol dehydrogenase. To do. Therefore, using a yeast strain in which the pyruvate decarboxylase gene, which is the starting point of the ethanol metabolic pathway, is disrupted as a host, the pyruvate that should be metabolized in the ethanol metabolic pathway is used in the D-lactic acid metabolic pathway. Therefore, it is preferable.
  • the genes encoding pyruvate decarboxylase include pyruvate decarboxylase 1 (PDC1) gene, pyruvate decarboxylase 5 (PDC5) gene, and pyruvate decarboxylase 6 (PDC6). Since there are three types of genes, and only PDC1 and PDC5 have pyruvate dehydrogenase activity in yeast cells, it is preferable to use a strain in which the PDC1 gene or the PDC5 gene is disrupted. More preferably, a strain in which the gene is disrupted is used.
  • a strain having a mutant PDC5 gene having a mutation that reduces the activity of PDC5 is preferable, as described in JP-A-2008-048726.
  • a strain having a mutant PDC5 gene is more preferred.
  • “temperature-sensitive mutant PDC5” indicates pyruvate decarboxylase activity at a certain culture temperature compared to wild-type PDC5, but the culture temperature is changed to a specific culture temperature or higher. Then, it is a mutant PDC5 having the property of losing or decreasing the PDC5 activity.
  • the normal culture temperature of Saccharomyces cerevisiae is 28-30 ° C, and the closer the temperature showing temperature sensitivity is to the normal culture temperature, the smaller the amount of heat required to change the culture temperature, and the lower the cost of culture. Since it can reduce, it is preferable.
  • the temperature sensitive mutant PDC5 preferably exhibits temperature sensitivity at 34 ° C. or higher.
  • a method for introducing the polynucleotide or DNA construct into yeast and expressing a polypeptide having D-LDH activity in transformed yeast a method comprising introducing the vector containing the DNA construct outside the yeast chromosome as described above. Examples of the method include introducing the polynucleotide or DNA construct into a yeast chromosome, and any method can be employed.
  • a construct comprising the polynucleotide of the present invention having a DNA segment for homologous recombination that is a sequence homologous to the yeast chromosome (hereinafter also referred to as a DNA construct for homologous recombination). It can be used suitably.
  • the DNA segment for homologous recombination is a DNA sequence that is homologous to the DNA sequence near the target site into which the polynucleotide of the present invention is to be introduced in the yeast chromosome. At least one, preferably two, DNA segments for homologous recombination are provided.
  • the two DNA segments for homologous recombination are made DNA sequences homologous to the upstream and downstream DNA of the target site on the chromosome, and these DNA segments It is preferable to link the polynucleotide of the present invention between the two.
  • the method of homologous recombination with the DNA construct for homologous recombination is not limitation on the method of homologous recombination with the DNA construct for homologous recombination, but the method of amplifying the DNA construct for homologous recombination by PCR, inserting the PCR fragment into a plasmid and introducing it into yeast, A method of introducing into yeast can be employed.
  • the DNA construct for homologous recombination preferably contains a terminator for controlling the expression of the polynucleotide of the present invention.
  • terminatator means a sequence that terminates transcription of mRNA from a gene, and usually refers to a downstream sequence on the 3 ′ end side of a gene present in a chromosome.
  • the DNA construct for homologous recombination preferably contains a selection marker in order to facilitate the selection of transformed yeast.
  • a selection marker include an auxotrophic complementary gene such as URA3 or TRP1, or a drug resistance gene such as a G418 resistance gene or a neomycin resistance gene.
  • a method for preparing a DNA construct for homologous recombination containing the polynucleotide, terminator and selectable marker by PCR can be performed, for example, by the following steps 1 to 3.
  • Step 1 Using a plasmid in which a terminator is connected downstream of a polynucleotide of the present invention as a template, a fragment containing the polynucleotide of the present invention and the terminator is amplified by PCR using primers 1 and 2 as a set.
  • Primer 1 is designed so as to add a homologous sequence of 40 bp or more upstream of the target introduction site, and primer 2 is designed based on a sequence derived from a plasmid downstream from the terminator.
  • Step 2 A fragment containing a selection marker is amplified by PCR using a plasmid having a selection marker, for example, pRS400, pRS424, pRS426, etc. as a template and primers 3 and 4 as a set.
  • Primer 3 is designed so that a sequence homologous to the sequence downstream of the terminator of the PCR fragment of Step 1 adds 30 bp or more, and primer 4 has a sequence of 40 bp or more corresponding to the downstream side of the introduction target site. Design to add.
  • Step 3 Sequence corresponding to the upstream and downstream sides of the introduction target site at both ends by performing PCR using the mixture of PCR fragments obtained in Steps 1 and 2 as a template and Primers 1 and 4 as a set
  • a DNA construct for homologous recombination containing the polynucleotide of the present invention, a terminator, and a yeast selection marker to which is added is obtained.
  • a method such as transfection, cotransfection or electroporation can be used.
  • Specific examples include a method using lithium acetate and a protoplast method.
  • the polynucleotide When the polynucleotide is introduced into the yeast chromosome by homologous recombination, the polynucleotide is introduced so that it can be controlled by a promoter of an endogenous gene on the yeast chromosome.
  • the introduction of the polynucleotide may simultaneously destroy the endogenous gene that should be controlled by the promoter, and the foreign polynucleotide of the present invention may be expressed in place of the endogenous gene.
  • This method is particularly useful when the promoter is a high-expression promoter in yeast as described above, or when an endogenous gene that functions to inhibit the D-lactic acid metabolic pathway of yeast is disrupted.
  • the endogenous genes that are targets when the polynucleotide is introduced into the yeast chromosome include acid phosphatase gene (PHO5), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (TDH1, 2, 3), alcohol dehydrogenase gene (ADH1, 2,3,4,5,6,7), galactose metabolism gene (GAL1,7,10), cytochrome c gene (CYC1), triosephosphate isomerase gene (TPI1), phosphoglycerate kinase gene (PGK1), phospho Preferable examples include a fructose kinase gene (PFK1) and a pyruvate decarboxylase gene (PDC1, 5, 6).
  • PHO5 acid phosphatase gene
  • TDH1 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene
  • ADH1 alcohol dehydrogenase gene
  • GAL1,7,10 galactose metabolism gene
  • Preferred examples include promoters for cell wall-related protein 2 gene (CWP2) and suppression of exponential defect 1 gene (SED1 gene).
  • CWP2 cell wall-related protein 2 gene
  • SED1 gene suppression of exponential defect 1 gene
  • the PDC1 gene or TDH3 gene that is highly expressed in the ethanol fermentation pathway of yeast, or the SED1 gene that is highly expressed during long-term yeast culture is a more preferable example.
  • Pyruvate metabolized in the ethanol fermentation pathway can be used in the D-lactic acid metabolic pathway by introducing the polynucleotide so as to destroy the PDC1 gene or PDC5 gene, preferably the PDC1 gene. Therefore, it is more preferable.
  • a DNA construct for homologous recombination is prepared in the same manner as in the case of introducing the polynucleotide into a yeast chromosome, and the DNA construct is placed at the target chromosome location by homologous recombination. Can be introduced. Since the DNA construct already contains a promoter capable of expressing the polynucleotide, it is not necessary to introduce the polynucleotide so that it can be controlled by the promoter of the endogenous gene on the yeast chromosome.
  • DNA can be prepared from transformed yeast, PCR can be performed with an introduction site-specific primer, and the PCR product can be confirmed by detecting an expected band in electrophoresis. Alternatively, it can be confirmed by performing PCR with a primer labeled with a fluorescent dye or the like.
  • a method for producing D-lactic acid including the step of culturing the transformant is also included in the present invention.
  • the transformant When the transformant is cultured, the expression of a polypeptide having D-LDH activity is newly imparted or enhanced in the transformant, and a D-lactic acid metabolic pathway is newly imparted or enhanced.
  • D-lactic acid can be obtained by carrying out the step of separating D-lactic acid from the mixture.
  • the culture includes a transformant or a disrupted product of the transformant in addition to the culture supernatant.
  • the method for culturing the transformant is not particularly limited, and a known method is employed.
  • a method for culturing the transformed yeast a method described in “M.D. Rose al.,“ Methods In Yeast Genetics ”,“ Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990) ”can be used.
  • a selection marker is included in the plasmid containing the DNA construct or the DNA construct for homologous recombination, a desired transformant is selected by culturing in a nutrient-free medium or a drug-added medium according to the selection marker. Can do.
  • the medium for culturing the transformant is a medium that contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the transformant and that can efficiently culture the transformant.
  • a natural medium or a synthetic medium can be used.
  • carbon sources include glucose, fructose, sucrose, galactose, maltose, raffinose, trehalose, sorbose, cellobiose, lactose, melibiose, melezitose, inulin, xylose, arabinose, ribose, rhamnose, glucosamine, erythritol.
  • carbohydrates such as ribitol, mannitol, glucitol, salicin, starch and starch, organic acids such as acetic acid, propionic acid and citric acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • ammonium salt of inorganic acid or organic acid such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, etc. may be used. it can.
  • inorganic substances include potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • the culture of the transformant should usually be performed under conditions where productivity of lactic acid is good, in a range from aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture to anaerobic conditions in which aeration is not performed. However, conditions of slight aerobic to anaerobic are preferably used.
  • the culture temperature can be 25 to 37 ° C., preferably 28 to 35 ° C. Since the pH of the culture decreases as D-lactic acid accumulates in the medium, it may be neutralized with an alkaline substance such as calcium hydroxide, calcium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, aqueous ammonia, or ammonia gas. it can.
  • the culture method is not particularly limited as long as the target D-lactic acid can be produced by fermentation, and batch culture, fed-batch culture, chemostat culture, continuous culture, and the like can be employed.
  • the fermentation culture is separated into a filtrate and an unfiltered solution by a separation membrane using a batch culture or a membrane described in WO2007 / 097260, which hardly causes clogging, and a desired fermentation product is recovered from the filtrate.
  • it is a membrane-based continuous culture in which the unfiltered liquid is retained or refluxed in the fermentation culture.
  • the method for measuring D-lactic acid obtained in the culture is not particularly limited, and examples include a method using HPLC and a method using F-kit (Roche).
  • Separation / purification of D-lactic acid contained in the fermentation culture can be performed by a combination of conventionally known methods such as concentration, distillation and crystallization.
  • the pH of the filtered / separated fermentation broth is 1 Extraction with diethyl ether or ethyl acetate after the following, elution after adsorption washing on ion exchange resin, reaction with alcohol in the presence of acid catalyst, distillation as ester, calcium salt or lithium salt
  • Examples thereof include a crystallization method, and a separation / purification method combining nanofiltration membrane and distillation disclosed in WO2009 / 004922.
  • Example 1 Determination of nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide having D-LDH activity derived from American horseshoe crab (hereinafter, D-LDH gene derived from American horseshoe crab)
  • D-LDH gene derived from American horseshoe crab
  • polyA (+) RNA was purified.
  • polyA (+) RNA was isolated from blood cells of American horseshoe crab.
  • Total RNA was isolated from blood cells of American horseshoe crab (purchased from Marine Biological Laboratory (USA)) using the AGPC method (see Experimental Medicine Vol. 9 (1991), pages 1937-1940).
  • polyA (+) RNA was isolated using “Oligotex-dT30 Super kit” (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • “SuperScript II Reverse Transcriptase” (manufactured by Invitrogen) was used to synthesize cDNA using Oligod (T) as a primer.
  • PCR was carried out using the oligo DNAs of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 designed by paying attention to the highly conserved DNA sequence in the D-LDH gene. A partial sequence of the D-LDH gene was amplified. PCR was performed under the following conditions. 95 ° C. (3 minutes): ⁇ 95 ° C.
  • 5 'RACE was performed by the following method.
  • cDNA was synthesized using the above phosphorylated oligo DNA as a primer using “SuperScript II II Reverse Transcriptase” (manufactured by Invitrogen Corporation) using polyA (+) RNA of American horseshoe crab as a template.
  • concatemerization of single-stranded cDNA by ligation reaction is performed using “5′-Full®RACE®Core®Set” (manufactured by Takara Bio Inc.), and SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 are described using the generated concatemerized cDNA as a template (For D-LDH1) or the first PCR using oligo DNAs described in SEQ ID NOs: 14 and 15 (for D-LDH2) as primers, and further described in SEQ ID NOs: 16 and 17 using the reaction solution as a template ( A second PCR was carried out using oligo-DNA of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 (for D-LDH2) as primers. Confirmation of the amplified fragment, purification, and determination of the base sequence were performed as described above.
  • 3'RACE was performed by the following method. First, cDNA was synthesized using PolyA (+) RNA of American horseshoe crab as a template and “SuperScript II Reverse Cranscriptase” (manufactured by Invitrogen Corporation) using Oligo® (T) as a primer.
  • PCR was performed for the first time using Oligo (T) and SEQ ID NO: 13 (for D-LDH1) or SEQ ID NO: 15 (for D-LDH2) as primers, using this reaction solution as a template, Furthermore, PCR was performed a second time using Oligo ⁇ ⁇ (T) and SEQ ID NO: 17 (for D-LDH1) or SEQ ID NO: 19 (for D-LDH2) as primers, using the reaction solution as a template. Confirmation of the amplified fragment, purification, and determination of the base sequence were performed as described above.
  • the amino acid sequence of the D-LDH1 gene (SEQ ID NO: 1) and cDNA ORF sequence (SEQ ID NO: 3) derived from American horseshoe crab, or the amino acid sequence of D-LDH2 (SEQ ID NO: 2) and the ORF sequence of cDNA (SEQ ID NO: 4) are: The sequences obtained by the above method were joined together and determined. The sequence identity between the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 by BLAST was 93%, and the sequence identity between the base sequences described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 was 82%. .
  • Example 2 Construction of D-LDH gene expression plasmid derived from American horseshoe crab D-LDH1 and D-LDH2 genes (hereinafter referred to as Lp.D-, respectively) that are considered to be D-LDH genes derived from American horseshoe crab determined in Example 1
  • PCR was performed using cDNA synthesized from polyA (+) RNA of American horseshoe crab as a template, and the gene was cloned.
  • the obtained DNA fragment was cleaved with restriction enzymes XhoI and NotI, and also equipped with a yeast expression vector pTRS11 (TDH3 promoter and selection marker URA3 gene, which was cleaved with restriction enzymes XhoI and NotI, see JP 2006-280368 A. , TDH3 promoter and terminator are expressed as GAPDH promoter and terminator), and the TDH3 promoter and Lp. D-LDH1 gene or Lp. A plasmid vector containing a DNA construct to which the D-LDH2 gene was linked was prepared.
  • pTRS205 holding Lp.D-LDH1
  • pTRS206 holding Lp.D-LDH2
  • the pTRS11 vector was prepared by cleaving the pNV11 vector (see Nature, vol. 357, 25 JUNE 1992, p.700) with the restriction enzyme XhoI, removing the insert, and then self-ligating.
  • Example 3 Introduction of D-LDH gene expression plasmid derived from American horseshoe crab into yeast Saccharomyces cerevisiae SW029-1B strain (genotype: MATa ura TRP) obtained from pTRS205 and pTRS206 obtained as in Example 2 ( ⁇ pdc1 :: TRP1) his a lys leu) (hereinafter referred to as SW029-1B strain).
  • the plasmid was introduced by the lithium acetate method using “YEASTMAKER Yeast Transformation System” (Clontech) (refer to the attached protocol for details).
  • the strain SW029-1B used as a host is a strain lacking the ability to synthesize uracil, and by the action of the selection marker URA3 gene of pTRS205 and 206, selection of transformed yeast introduced with pTRS205 and 206 on a uracil-free medium is possible. Is possible. Confirmation of introduction of the D-LDH gene expression vector into the transformant thus obtained was carried out by using a genomic DNA extraction kit “Gentori-kun” (Takara Bio Inc.) from a transformant cultured in a liquid medium without uracil. Genomic DNA containing plasmid DNA was extracted by the company) and PCR was performed using this as a template. As the primer, the primer used when the D-LDH gene derived from horseshoe crab was cloned was used. As a result, it was confirmed that the D-LDH gene derived from each horseshoe crab was introduced into all transformed yeasts.
  • Example 4 D-lactic acid productivity test 1 Saccharomyces cerevisiae strain SW029-1B (hereinafter referred to as SW029-1B / pTRS205 strain, SW029-1B / pTRS206 strain) introduced with pTRS205 and 206 obtained as in Example 3 was used to produce D-lactic acid. Tested.
  • the optical purity of D-lactic acid was calculated based on the following formula from the measurement results of the D-lactic acid and L-lactic acid concentrations measured by the HPLC method under the following conditions.
  • Mobile phase 1 mM aqueous copper sulfate flow rate: 1.0 ml / min
  • Detection method UV254nm Temperature: 30 ° C.
  • Optical purity (% ee) 100 ⁇ (DL) / (D + L)
  • Optical purity (%) 100 ⁇ D / (D + L)
  • L represents the concentration of L-lactic acid
  • D represents the concentration of D-lactic acid.
  • the accumulated concentration of D-lactic acid was 13 g / L for the SW029-1B / pTRS205 strain and 12 g / L for the SW029-1B / pTRS206 strain. Further, only D-lactic acid was detected in the culture solution, and L-lactic acid was below the detection limit. It was confirmed that the transformed yeast produced D-lactic acid by introducing the D-LDH gene cloned from the horseshoe crab into yeast.
  • Step 1 The Lp. PTRS205 carrying the D-LDH1 gene and Lp. About 1.1 kb containing each D-LDH gene was obtained by PCR using pTRS206 carrying the D-LDH2 gene as a template and the oligo DNAs of SEQ ID NOS: 24 and 25 or the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 26 and 25 as primer sets. The DNA fragment was amplified.
  • the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 24 and 26 were designed so that a sequence having homology was added to the upstream 65 bp of the PDC1 gene.
  • Step 2 a DNA fragment of about 1.4 kb containing the TRP1 gene as a yeast selection marker was amplified by PCR using the plasmid pRS424 (GenBank Accession Number: U03453) as a template and the oligo DNAs described in SEQ ID NOS: 27 and 28 as primer sets.
  • the oligo DNA described in SEQ ID NO: 28 was designed so that a sequence having homology was added to 65 bp downstream of the PDC1 gene.
  • Step 3 The DNA fragments were separated by 1% agarose gel electrophoresis and then purified using “QIA quick Gel extraction kit” (manufactured by Qiagen).
  • a DNA construct for homologous recombination of about 2.5 kb in which each D-LDH gene, TDH3 terminator and TRP1 gene were linked was amplified by PCR using DNA as a primer set.
  • SW092-2D which is a strain in which the lysine auxotrophy of Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain (hereinafter referred to as NBRC10505 strain) is restored from the DNA construct for homologous recombination produced as described above. 2D strain).
  • the method for preparing SW092-2D strain is as follows. A PCR fragment of about 2 kb in the first half of the LYS2 gene was amplified by PCR using the genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain manufactured by Funakoshi Co., Ltd. as a template and oligonucleotides (SEQ ID NOs: 29, 30) as primer sets. The above PCR fragment was separated by 1% agarose gel electrophoresis, purified according to a conventional method, and transformed into NBRC10505 strain to cancel the amber mutation of LYS2 gene.
  • a transformant (NBRC10505 (LYS2) strain in which lysine synthesis ability was restored was selected.
  • Confirmation that the transformed strain was a yeast from which the amber mutation of the LYS2 gene was released was performed as follows. First, the obtained transformant and Saccharomyces cerevisiae L0GY7 strain having a wild-type LYS2 gene were joined to obtain a diploid cell, and the diploid cell was formed as a cyst in a cyst forming medium. The ascites were dissected with a micromanipulator to obtain each haploid cell (Tetrad), and the auxotrophy of each haploid cell was examined.
  • NBRC10505 (LYS2) strain and NBRC10506 strain were joined together to obtain SW092-2D (genotype: MATa ura3 leu2 trp1 his3 ade2 LYS2) strain by ascending dissection using a micromanipulator.
  • Strain SW092-2D was transformed with the above DNA construct for homologous recombination, and transformed yeast was selected by culturing in a medium not containing tryptophan.
  • the transformed yeast thus obtained is designated as strains SW092-2D ( ⁇ pdc1 :: Lp.D-LDH1-TRP1) and SW092-2D ( ⁇ pdc1 :: Lp.D-DLH2-TRP1).
  • Example 6 D-lactic acid productivity test 2 Using the SW092-2D ( ⁇ pdc1 :: Lp.D-LDH1-TRP1) strain and the SW092-2D ( ⁇ pdc1 :: Lp.D-LDH2-TRP1) strain prepared in Example 5, a mini jar fermenter (Maruhishi Bio Fermentation evaluation was performed using 5L) manufactured by Enji Co., Ltd.
  • the amount of the culture solution at the end of the culture, the D-lactic acid concentration and the glucose concentration in the culture solution were measured with “Glucose Test Wako C” (registered trademark) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and calculated from the lactic acid and glucose concentrations.
  • the yield of lactic acid versus sugar calculated from the input glucose was determined.
  • SW092-2D ⁇ pdc1 :: Lp.D-LDH1-TRP1
  • SW092-2D ⁇ pdc1 :: Lp.D-LDH2-TRP1 had a sugar yield of 42%.
  • Cloning of the D-LDH gene was performed using colony PCR (“KOD-Plus” manufactured by Toyobo Co., Ltd.) using a primer set (SEQ ID NOs: 31 and 32) designed with reference to the nucleotide sequence described in WO 2004/104202 and using the ATCC 9135 strain as a template. -polymerase ”was used).
  • the PCR-amplified fragment was purified and phosphorylated with “T4 Polynucleotide Kinase” (manufactured by Takara Bio Inc.), and then ligated to the pUC118 vector (cleaved with the restriction enzyme HincII and the cut surface was dephosphorylated).
  • Ligation was performed using "DNA Ligation Kit Ver.2" (manufactured by Takara Bio Inc.). By transforming E. coli DH5 ⁇ with the ligation plasmid product and recovering the plasmid DNA, Lm. A plasmid in which the D-LDH gene was subcloned was obtained. The obtained Lm. The pUC118 plasmid in which the D-LDH gene was inserted was digested with restriction enzymes XhoI and NotI, and the resulting DNA fragments were inserted into the XhoI / NotI cleavage sites of the yeast expression vector pTRS11. In this way, Lm. A D-LDH gene expression plasmid pTRS207 was obtained.
  • Example 6 using pTRS207 as a template, the same procedure as in Example 5 was used except that the primer set shown in SEQ ID NO: 33 was used instead of the primer shown in SEQ ID NO: 24 or 26.
  • the D-LDH gene was introduced into the PDC1 locus in the chromosome of Saccharomyces cerevisiae SW092-2D strain.
  • the produced transformed yeast is designated SW092-2D ( ⁇ pdc1 :: Lm.D-LDH-TRP1).
  • D-lactic acid productivity by batch culture was evaluated in the same manner as in Example 6.
  • the yield with respect to sugar of SW092-2D ⁇ pdc1 :: Lm.D-LDH-TRP1 was 38%.
  • the results are shown in Table 2 together with the results of Example 6.
  • Xenopus L-LDH gene (X.L-LDH gene) is transformed into PDC1 gene.
  • Yeast introduced into the locus was prepared.
  • a strain (SU013-1D strain) in which the adenine auxotrophy of NBRC10506 strain was restored was used. The method for preparing the SU013-1D strain is shown below.
  • PCR fragment of ADE2 gene was amplified by PCR using plasmid pRS422 as a template and oligonucleotide (SEQ ID NO: 34, 35) as a primer set.
  • the PCR fragment was separated by 1% agarose gel electrophoresis, purified according to a conventional method, and then subjected to a transformation operation to release the mutation in the ADE2 gene. By culturing in a medium not added with adenine, a transformant having adenine synthesis ability restored was selected.
  • the transformant obtained as described above was a yeast in which the mutation of the AED2 gene was released.
  • the obtained transformant was joined to Saccharomyces cerevisiae L0GY77 strain having a wild-type ADE2 gene to obtain diploid cells.
  • the diploid cells were allowed to form ascending with an ascending medium.
  • the ascites were dissected with a micromanipulator to obtain each haploid cell (Tetrad), and the auxotrophy of each haploid cell was examined. It was confirmed that all of the obtained haploid cells had the ability to synthesize adenine.
  • NBRC10506 (ADE2) strain and NBRC10505 strain were joined together, and SU013-1D strain (genotype: MAT ⁇ ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 lys2) was obtained by dissection of ascending with a micromanipulator.
  • the resulting transformed yeast is designated as SU013-1D ( ⁇ pdc1 :: XL-LDH-TRP1) strain.
  • Example 7 (Example 7, Comparative Example 2) D-lactic acid productivity test 3
  • the SU013-1D ( ⁇ pdc1 :: XL-LDH-TRP1) strain prepared as in Reference Example 1 and the SW092-2D ( ⁇ pdc1 :: Lp.D-LDH1-) prepared in Example 5 and Comparative Example 1 were used.
  • TRP1) strain, SW092-2D ( ⁇ pdc1 :: Lp.D-LDH2-TRP1) strain and SW092-2D ( ⁇ pdc1 :: Lm.D-LDH-TRP1) strain were joined to each other, and the L-LDH gene at the PDC1 locus And a diploid yeast having the D-LDH gene heterozygously.
  • the produced diploid yeast is designated as Lp1-X strain, Lp2-X strain, and Lm-X strain, respectively.
  • yeast having D-LDH gene derived from American horseshoe crab produced D-lactic acid with an optical purity of 50% or higher, whereas D- produced by yeast having D-LDH gene derived from Leuconostoc mesenteroides.
  • the optical purity of lactic acid was 44.4%. Since the yield of D-lactic acid with respect to sugar and the optical purity of D-lactic acid produced by each yeast are considered to be proportional to the D-LDH activity in the D-LDH gene-transformed yeast, Table 2 and Table 3 From the results, it was confirmed that the D-LDH gene derived from American horseshoe crab encodes a higher activity polypeptide when introduced into yeast than the D-LDH gene derived from Leuconostoc mesenteroides.
  • Plasmid pTRS208 was prepared by substituting the TDH3 terminator of pTRS205 carrying the D-LDH1 gene with an ADH1 terminator.
  • a DNA construct for homologous recombination for introduction of the TDH3 locus was obtained using pTRS208 as a template using the primer shown in SEQ ID NO: 36 instead of SEQ ID NO: 8 in JP-A-2008-029329.
  • SW087-2C strain a leucine non-requiring strain of SU013-1D strain was used.
  • a method for preparing the SW087-2C strain is shown below.
  • About 2 kb of the PCR fragment of the LEU2 gene was amplified by PCR using the plasmid pRS425 as a template and the oligonucleotide (SEQ ID NO: 37, 38) as a primer set.
  • the above PCR fragment was separated by 1% agarose gel electrophoresis and purified according to a conventional method, and then the transformation of SU013-1D strain was performed to cancel the mutation of LEU2 gene.
  • a transformant in which the ability to synthesize leucine was restored was selected. It was confirmed as follows that the transformant thus obtained was a yeast in which the mutation of the LEU2 gene was released.
  • the obtained transformant was joined to Saccharomyces cerevisiae L0GY77 strain having a wild type LEU2 gene to obtain diploid cells. The diploid cells were allowed to form ascending with an ascending medium. The ascites were dissected with a micromanipulator to obtain each haploid cell (Tetrad), and the auxotrophy of each haploid cell was examined. All of the obtained haploid cells were confirmed to have the ability to synthesize leucine.
  • the obtained SU013-1D (LEU2) strain and NBRC10505 strain were joined together to obtain SW087-2C strain (genotype: MAT ⁇ ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2) by ascending dissection using a micromanipulator.
  • strain SW087-2C was transformed and selected in a medium not containing uracil, so that Lp.
  • a transformed yeast introduced with the D-LDH1 gene was obtained.
  • the obtained transformed yeast is designated as strain SW087-2C ( ⁇ TDH3 :: Lp.D-LDH-URA3).
  • the method for introduction into the SED1 locus was performed by modifying the method described in Example 2 of the international application PCT / JP2008 / 072129. That is, a DNA construct for homologous recombination for SED1 locus introduction was amplified using pTRS205 instead of pTRS102 as a PCR template and using the primer shown in SEQ ID NO: 39 instead of SEQ ID NO: 14 in the above publication.
  • the NBRC10505 (LYS2) strain prepared in Example 5 and the NBRC10506 (ADE2) strain prepared in Reference Example 1 were joined and separated by ascending anatomy using a micromanipulator.
  • the strain SW092-7D (genotype: MATa ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 LYS2) was used.
  • strain SW092-7D was transformed and selected in a medium not containing histidine, so that Lp.
  • a transformed yeast introduced with the D-LDH1 gene was obtained.
  • the resulting transformed yeast is designated as strain SW092-7D ( ⁇ SED1 :: Lp.D-LDH-HIS3).
  • yeast strain SW015 having a temperature-sensitive mutant PDC5 gene (pdc5ts-9) described in JP-A-2008-048726 was used as a yeast into which the temperature-sensitive mutant PDC5 gene was introduced.
  • the SW015 strain and SW087-2C strain were joined and separated by ascending anatomy using a micromanipulator to obtain the SW095-4B strain (genotype: MAT ⁇ ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2 pdc5ts-9 ⁇ pdc1 :: TRP1).
  • SW095-4B strain and the SW092-2D strain were joined and separated by ascending anatomy using a micromanipulator to obtain the SW098-21B strain (genotype: MAT ⁇ ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 LYS2 pdc5ts-9).
  • SW092-2D ⁇ PDC1 :: Lp.D-LDH1-TRP1 strain
  • SW087-2C ⁇ TDH3 :: Lp.D-LDH1-URA3
  • SW092-7D ⁇ TDH3 :: Lp.D-LDH1-HIS3
  • SW098-21B diploid junctions, tetrad repeated at the PDC1, TDH3 and SED1 loci Lp.
  • a SU042 strain having a D-LDH1 gene, having a temperature-sensitive mutant PDC5 (pdc5ts-9), and having no auxotrophy of adenine, leucine and lysine was obtained.
  • the procedure for preparing the SU042 strain is shown in FIG.
  • Example 9 Test 4 for D-lactic acid productivity The SU042 strain prepared as in Example 8 was used to test D-lactic acid productivity by batch culture.
  • the SC3 medium shown in Table 1 or a raw sugar medium 100 g / L “Super Sugar” (manufactured by Muso Co., Ltd.), 1.5 g / L ammonium sulfate) was used.
  • the SU042 strain was cultured in a test tube with shaking overnight in 5 ml of SC3 medium or raw sugar medium (pre-culture). The culture solution was inoculated into 50 ml of fresh SC3 medium or raw sugar medium and cultured with shaking in a 500 ml Sakaguchi flask for 24 hours (preculture).
  • Example 10 D-lactic acid productivity test by continuous culture Using the SU042 strain, continuous culture using a separation membrane described in WO2007 / 097260 was examined.
  • a raw sugar medium 75 g / L “Yoseisei” (manufactured by Muso Co., Ltd.), 1.5 g / L ammonium sulfate was used. The culture conditions are shown below.
  • Fermenter capacity 2 (L) Culture solution volume: 1.5 (L) Separation membrane used: PVDF filtration membrane (described in Reference Example 2 of WO2007 / 097260) Membrane separation element effective filtration area: 120 cm 2 Temperature adjustment: 32 (°C) Aeration volume of fermentation reaction tank: air 0.02 (L / min), nitrogen gas 0.18 (L / min) Fermentation reactor stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: adjusted to pH 5 with 5N calcium hydroxide Sterilization: The culture tank containing the separation membrane element and the medium used are all autoclaved at 121 ° C. for 20 min in an autoclave.
  • the SU042 strain was cultured in a test tube with shaking in a 10 ml raw material sugar medium at 30 ° C. overnight (pre-culture).
  • the obtained culture broth was inoculated in 100 ml of a fresh raw sugar medium and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours in a 500 ml Sakaguchi flask (pre-culture).
  • the culture solution is inoculated into a membrane-integrated continuous culture device (device shown in FIG. 2 of WO2007 / 097260) into which 1.5 L of the raw sugar medium has been added, and the culture solution is extracted with a peristaltic pump from 50 hours after the start of the culture.
  • the lactic acid production rate during continuous culture was calculated using the following formula 1.
  • NBRC0988 a vector was constructed for introducing the D-LDH gene derived from horseshoe crab into the PDC1 locus in the Candida utilis chromosome.
  • Candida utilis NBRC0988 strain (hereinafter referred to as NBRC0988) was inoculated in a YPD medium (1% Bacto Yeast Extract, 2% Bacto peptide, 2% glucose) and cultured at 30 ° C. overnight.
  • Genomic DNA was extracted from the obtained cells in accordance with a conventional method and used as a template for subsequent PCR.
  • a fragment containing the terminator region of the PDC1 gene was amplified using the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 40 and 41 as primer sets.
  • KOD-plus- manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the obtained fragment of about 1 kb was cleaved with the restriction enzyme BssHI, purified, and then ligated to pBluescriptIISK (+) previously cleaved with the restriction enzyme BssHI.
  • the obtained plasmid is designated as pKS01.
  • a fragment containing the PGK promoter was amplified by PCR using the genomic DNA of NBRC0988 as a template and the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 42 and 43 as primer sets. The obtained approximately 1 kb fragment was purified and used in the subsequent experiments.
  • PCR using the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 44 and 45 as primer sets is performed. A fragment containing the gene was amplified and purified to obtain a fragment of about 1.1 kb.
  • a fragment containing a GAP terminator was amplified and purified by PCR using the genomic DNA of NBRC0988 as a template and the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 46 and 47 as a primer set to obtain a fragment of about 500 bp.
  • the PGK promoter, the hph gene, and the fragment containing the PGK promoter obtained as described above, the fragment containing the hph gene, and the fragment containing the GAP terminator were mixed by PCR using the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 48 and 49 as primer sets.
  • the fragment to which the GAP terminator was ligated was amplified. After phosphorylating the end of the obtained about 2.6 kb fragment, it was ligated to pUC118 which had been cleaved with HincII and dephosphorylated.
  • the obtained plasmid is designated as pKS02.
  • a fragment containing a PGK terminator was amplified and purified by PCR using the genomic DNA of NBRC0988 as a template and the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 50 and 51 as a primer set to obtain a fragment of about 500 bp. Further, by using the pKS02 obtained as described above as a template, a fragment in which the PGK promoter, the hph gene and the GAP terminator were ligated was amplified and purified by PCR using the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 52 and 53 as primer sets, A fragment of about 2.6 kb was obtained.
  • the PGK terminator PGK was obtained by PCR using the fragment containing the PGK terminator obtained above and a fragment to which the PGK promoter, hph gene and GAP terminator were linked, and using the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 50 and 53 as primer sets. A fragment to which the promoter, hph gene and GAP terminator were linked was amplified. The obtained fragment of about 3 kb was cleaved with restriction enzymes BamHI and ClaI, purified, and then ligated to pKS02 that had been previously cleaved with restriction enzymes BamHI and ClaI. This is designated as plasmid pKS03.
  • a fragment containing the PDC1 promoter region was amplified and purified by PCR using the genomic DNA of NBRC0988 as a template and the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 54 and 55 as a primer set to obtain a fragment of about 2.1 kb. Further, a fragment containing D-LDH gene derived from horseshoe crab was amplified and purified by PCR using pTRS205 prepared in Example 2 as a template and the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 56 and 57 as a primer set, and a fragment of about 1 kb was obtained. Obtained.
  • the PDC1 promoter region was obtained by PCR using the oligo-DNAs of SEQ ID NOs: 54 and 57 as primer sets by mixing with the fragment containing the PDC1 promoter region and the fragment containing the D-LDH gene derived from the horseshoe crab obtained as described above.
  • a fragment of about 3.1 kb obtained by amplifying a fragment in which the fragment and the fragment containing the D-LDH gene derived from American horseshoe crab were ligated was cleaved with restriction enzymes NotI and BglII, purified, and then the restriction enzymes NotI and Ligation was performed with pKS03 that had been previously cut with BamHI.
  • the obtained plasmid is designated as pKS04.
  • the bacterial cells and pKS04 cleaved with the restriction enzyme BglII were mixed, placed on ice for 5 minutes, then transferred to an electroporation cuvette, Capacitance (25 ⁇ F), voltage (0.75 kV) and resistance (800 ⁇ ) Electroporation was performed under the conditions of Thereafter, the mixture was transferred to a YPD medium containing 1 M sorbitol, cultured at 30 ° C. for about 4 hours, and applied to a YPD medium supplemented with 600 ⁇ g / L hygromycin B.
  • Example 2 Introduction of D-LDH derived from lactic acid bacteria into Candida utilis
  • a D-LDH gene derived from lactic acid bacteria Leuconostoc mesenteroides was introduced in the same manner as in Example 11.
  • the oligo DNA of SEQ ID NO: 58 was used instead of SEQ ID NO: 55
  • pTRS207 of Comparative Example 1 was used as a template instead of pTRS205 of Example 2
  • sequences were used instead of SEQ ID NOs: 56 and 57.
  • the oligo DNAs with numbers 59 and 60 were used.
  • the obtained plasmid is designated as pKS05.
  • the plasmid obtained as described above was introduced into the NBRC0988 strain in the same manner as in Example 11.
  • a strain in which the D-LDH gene derived from the lactic acid bacterium Leuconostoc mesenteroide is introduced into the obtained PDC1 gene locus is referred to as CuLmLDH strain.
  • Example 12 D-lactic acid productivity test of Candida utilis D-lactic acid productivity was evaluated using the CuLpLDH strain and the CuLmLDH strain prepared in Example 11 and Comparative Example 2.
  • 50 ml of YPD medium was added to a 500 ml Sakaguchi flask, and a small amount of CuLpLDH strain and CuLmLDH strain were inoculated there and cultured overnight at 30 ° C. with shaking (preculture).
  • the culture broth was collected and washed with fresh YPD medium, and then introduced into a mini jar fermenter to which 1 L of YPD10 medium (containing 10% glucose) was added for culturing.
  • the culture conditions are shown below.
  • Initial inoculation amount: OD 600 10 inoculation pH: pH 6
  • Aeration 100 mL / min
  • Stirring 120 rpm
  • Neutralizing agent 1N calcium hydroxide culture temperature: 35 ° C.
  • Example 13 Comparative Example 4 D-lactic acid productivity test 2 of Candida utilis
  • D-lactic acid productivity was evaluated using xylose, which is a monosaccharide, as a sugar source.
  • 50 ml of YPD medium was added to a 500 ml Sakaguchi flask, and a small amount of CuLpLDH strain and CuLmLDH strain were inoculated there and cultured overnight at 30 ° C. with shaking (preculture).
  • the culture solution was collected, washed with fresh YPD medium, and then introduced into a mini jar fermenter supplemented with 1 L of YPX10 medium (1% yeast extract, 2% bactopeptone, 4% xylose) and cultured. .
  • the culture conditions are shown below.
  • Initial inoculation amount: OD 600 10 inoculation pH: pH 6
  • Neutralizer 1N calcium hydroxide culture temperature: 30 ° C.
  • the present invention it becomes possible to stably produce D-lactic acid at low cost, and the obtained D-lactic acid has high optical purity and is preferably used as a polymer raw material.

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Abstract

　従来よりも高いＤ－乳酸脱水素酵素活性を有する下記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのポリペプチドを発現するように、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して得られる形質転換体により、生産性の高いＤ－乳酸発酵を実現する。 （Ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド （Ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド （Ｃ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも８０％以上のアミノ酸配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド

Description

Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＤ－乳酸の製造方法
　本発明は、Ｄ－乳酸を製造するための新規なＤ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体に関し、さらに該形質転換体を培養することを含むＤ－乳酸の製造方法に関する。
　再生可能資源であるバイオマスを原料とするポリ乳酸（ＰＬＡ）は、カーボンニュートラルの考え方から強い注目を浴びている。ＰＬＡは、比較的コストが安く、融点もおよそ１７０℃と耐熱性を有し、溶融成形可能な生分解性ポリマーとして期待されている。さらに、ポリ－Ｌ－乳酸とポリ－Ｄ－乳酸を混合することにより、ポリ乳酸ステレオコンプレックスが得られることが知られている（特許文献１～３）。ポリ乳酸ステレオコンプレックスは、単独のポリマーよりも高融点および高結晶性を示し、繊維やフィルム、樹脂成形品として有用な成形品を与えることが知られており、その原料であるＬ－乳酸、Ｄ－乳酸ともに高純度かつ高効率な製造法が求められている。
　自然界には乳酸菌などの乳酸を効率良く生産する細菌が存在し、それらを用いた乳酸製造法の中には既に実用化されているものもある。例えば、Ｌ－乳酸を効率良く生産する細菌としてラクトバシラス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）などがある。また、Ｄ－乳酸を効率良く生産する細菌としてスポロラクトバシラス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）の微生物などが知られている（特許文献４）。いずれの場合も嫌気培養で乳酸の蓄積量は高いレベルに達しているが、Ｌ－乳酸発酵の場合はＤ－乳酸が、Ｄ－乳酸発酵の場合はＬ－乳酸が副産物として生成し光学純度の低下をもたらす。そして、これらを分離することは非常に困難である。
　そこで、高光学純度な乳酸の製造方法として、本来乳酸生産能を有しない酵母にＬ－乳酸またはＤ－乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入し、該酵母を用いたＬ－乳酸およびＤ－乳酸発酵が検討されている（特許文献４～６、非特許文献１）。遺伝子組換え酵母によるＬ－乳酸発酵に関しては、高活性なアフリカツメガエル由来のＬ－乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入することで、高効率かつ高光学純度な乳酸発酵が可能になっている（特許文献４）。一方、遺伝子組換え酵母によるＤ－乳酸発酵に関しては、Ｌ－乳酸発酵と同様に高い光学純度のＤ－乳酸が得られるものの、Ｄ－乳酸収率に課題があった（特許文献５および６、非特許文献１）。
特開昭６１－３６３２１号公報 特開昭６３－２４１０２４号公報 特開平２０００－１７１６３号公報 ＷＯ２００７／０４３２５３ 特開２００７－０７４９３９号公報 ＷＯ２００４／１０４２０２
イシダら、ジャーナル　オブ　バイオサイエンス　バイオエンジニアリング（２００６）、１０１、１７２－７（Ｉｓｈｉｄａ　Ｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｂｉｏｓｃｉ　ｂｉｏｅｎｇ（２００６），１０１，１７２－７）
　本発明は、従来よりも高いＤ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより、生産性の高いＤ－乳酸発酵を実現することを課題とする。
　本発明者らは、種々のＤ－乳酸脱水素酵素について鋭意検討した結果、Ｄ－乳酸の産生量を増大させ、同時に副産物の生成が少ないＤ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の態様からなる。
　（１）下記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのポリペプチド。
（Ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも８０％以上のアミノ酸配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
　（２）下記（ａ）～（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３または４に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、Ｄ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号３または４に記載の塩基配列との配列同一性が少なくとも８０％以上の塩基配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｅ）（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　（３）（２）に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターとを連結させた、ＤＮＡ構築物。
　（４）前記プロモーターが、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）またはグリセルアルデヒド－３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のプロモーターであることを特徴とする、（３）に記載のＤＮＡ構築物。
　（５）前記プロモーターが、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかから選ばれる、（３）または（４）に記載のＤＮＡ構築物。
（Ｉ）配列番号５～７のいずれかに記載の塩基配列からなるプロモーター
（ＩＩ）配列番号５～７のいずれかに記載の塩基配列もしくはその一部を含む塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなるプロモーター
（ＩＩＩ）配列番号５～７いずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなるプロモーター。
　（６）（２）に記載のポリヌクレオチドまたは（３）～（５）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換体。
　（７）（２）に記載のポリヌクレオチドまたは（３）～（５）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換酵母。
　（８）前記形質転換酵母は、そのピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）およびグリセルアルデヒド－３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のうち少なくとも１種類の遺伝子が、（２）に記載のポリヌクレオチドまたは（３）～（５）いずれかに記載のＤＮＡ構築物に置換されている、（７）に記載の形質転換酵母。
　（９）前記遺伝子のうち、少なくとも１種類はＰＤＣ１遺伝子である、（８）に記載の形質転換酵母。
　（１０）（６）に記載の形質転換体または（７）～（９）のいずれかに記載の形質転換酵母を培養する工程を含む、Ｄ－乳酸の製造方法。
　（１１）カブトガニ科由来のＤ－乳酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターが連結されたＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換体。
　（１２）アメリカカブトガニ属由来のＤ－乳酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターが連結されたＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換酵母。
　（１３）前記形質転換酵母は、そのピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）およびグリセルアルデヒド－３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のうち少なくとも１つの遺伝子が、前記カブトガニ科由来のＤ－乳酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターが連結されたＤＮＡ構築物に置換されている、（１２）に記載の形質転換酵母。
　（１４）（１１）に記載の形質転換体あるいは（１２）または（１３）に記載の形質転換酵母を培養する工程を含む、Ｄ－乳酸の製造方法。
　本発明によれば、Ｄ－乳酸発酵生産に適したＤ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドが提供される。また、本発明のポリヌクレオチドによりＤ－乳酸を高生産可能な形質転換体を容易に得ることができ、ひいては、該形質転換体を培養することでＤ－乳酸を効率よく高純度で生産することができる。
図１は、本発明の酵母ＳＵ０４２株の一つの作製手順を表したものである。 図２は、本発明の酵母ＳＵ０４２株の膜利用連続培養結果を示したものである。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　Ｄ－乳酸脱水素酵素（以下、Ｄ－ＬＤＨともいう）活性とは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸をＤ－乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に変換する活性である。
　本発明は配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのホモログを包含しており、該ポリペプチドはＤ－ＬＤＨ活性を有していることを特徴としている。
　配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、カブトガニ科（Ｌｏｍｕｌｉｄａｅ）アメリカカブトガニ属（Ｌｉｍｕｌｕｓ）に属するアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）由来のポリペプチドである。
　配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログとしては、例えば、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１または２個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドでありかつＤ－ＬＤＨ活性を有しているポリペプチドが挙げられる。
　また、配列番号３または４に記載のポリペプチドのホモログは、配列番号１または２に記載のアミノ配列との配列同一性が少なくとも８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有し、かつＤ－ＬＤＨ活性を有しているポリペプチドであってもよい。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、この分野で汎用されているソフトウェアであるＢＬＡＳＴを用いて容易に調べることができる。ＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のホームページで誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に同一性を調べることができる。
　また、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログは、カブトガニ科に属する生物由来、好ましくはアメリカカブトガニ属またはカブトガニ属に属する生物由来、より好ましくはアメリカカブトガニ属のアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）またはカブトガニ属のカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）、ミナミカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｇｉｇａｓ）もしくはマルオカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ）由来のポリペプチドであって、Ｄ－ＬＤＨ活性を有するものであってもよい。
　配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドはアメリカカブトガニから公知の方法により抽出、またはペプチド合成法として知られる公知の方法を用いて調製することができ、また、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて、遺伝子組換え技術により調製することもできる。配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドはカブトガニ属に属する生物から公知の方法により抽出、またはペプチド合成法として知られる公知の方法を用いて調整することができ、また、該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて、遺伝子組換え技術により調整することもできる。
　配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログは、配列番号１または２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドよりＤ－ＬＤＨ活性が向上していても良いし、熱安定性が向上していてもよい。ここで、「Ｄ－ＬＤＨ活性が向上する」とは基質であるピルビン酸やＮＡＤＨに対する基質親和性や分子活性（Ｋｃａｔ）が向上することや、また、該ポリペプチドの酵素活性の最適ｐＨが該ポリペプチドを発現する細胞の生育に適したｐＨにより近くシフトすることを意味する。そのようなポリペプチドは、配列番号１または２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを基に人工的にデザインしても良いし、天然から分離しても良い。また、分子進化工学的手法によりＤ－乳酸脱水素酵素遺伝子に対してランダムに変異を導入し、そこから好ましいポリペプチドをスクリーニングしても良い。
　本発明は配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはそのホモログを包含し、該ポリヌクレオチドはＤ－ＬＤＨ活性を有するポリヌクレオチドをコードしていることを特徴とする。ここで、「ポリヌクレオチド」とはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡ、レプリコンＲＮＡなど、その由来を問うものではないが、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡであり、より好ましくはＤＮＡである。また、１本鎖でも、その相補鎖を有する２本鎖であってもよい。また、天然のあるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。
　配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、アメリカカブトガニ由来のポリヌクレオチドであり、前記Ｄ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴としている。
　配列番号３または４に記載のポリヌクレオチドのホモログとしては、例えば、配列番号３または４に記載の塩基配列において、１もしくは数個、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１～２０個、特に好ましくは１から１０個、最適に好ましくは１から５個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、同時にＤ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードしているものが挙げられる。
　また、配列番号３または４に記載のポリヌクレオチドのホモログとしては、配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、同時にＤ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードしているものが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選択したポリヌクレオチドをプローブとして、公知のハイブリダイセーション技術（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish . John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4）などを用いて、ハイブリダイズするポリヌクレオチドである。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃、より厳しい条件としては４２℃、さらに厳しい条件としては６５℃で、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて洗浄することにより達成することができる。
　また、配列番号３または４に記載のポリヌクレオチドのホモログは、配列番号３または４に記載の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、同時にＤ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。ここで言う、ポリヌクレオチドの塩基配列の配列同一性は、前述の遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。
　また、配列番号３または４に記載のポリヌクレオチドのホモログは、カブトガニ科に属する生物由来、好ましくはアメリカカブトガニ属またはカブトガニ属に属する生物由来、より好ましくはアメリカカブトガニ、カブトガニ、ミナミカブトガニまたはマルオカブトガニ由来のポリヌクレオチドであって、Ｄ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。
　前記ポリヌクレオチドは、カブトガニ科、好ましくはカブトガニ科アメリカカブトガニ属に属する生物（以下、これらを総称してカブトガニともいう）からクローニングすることで調整することができるが、化学的に合成または長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５－１００）を採用して合成することもできる。カブトガニからのクローニングは、通常公知の方法を用いて単離することができ、このような方法としては、例えば、カブトガニ血球より単離した ｐｏｌｙＡ（＋） ＲＮＡより作製したｃＤＮＡからＤ－乳酸脱水素酵素において高く保存されている配列をもとに合成したプライマーを用いて部分断片の増幅・配列決定を行い、その後５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ法により全ＯＲＦ配列を決定し、その後ＰＣＲによって増幅することで得られる。また、Ｄ－乳酸脱水素酵素の機能相補によっても行うことができる。その原理の詳細は（DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, United States (1995) 61 266-272）に記載されている。このようにして、一旦決定された塩基配列を有する本発明のポリヌクレオチドは、これを再度カブトガニ血球から得ることも可能であるが、これを直接ＤＮＡ合成装置で化学合成することも可能である。
　なお、前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、アミノ酸配列または塩基配列に、部位特異的変位導入法（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel etal., (1987) Publish . John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することで適宜改変することができる。また、このようなポリペプチドのアミノ酸配列またはポリヌクレオチドの塩基配列の改変は、人工的に変異を導入しあるいは合成したものに限られず、人工的な変異処理に基づいてあるいはこれに限られず自然界におけるアミノ酸の変異によっても生じたものも包含される。
　前記ポリヌクレオチドは、遺伝子組換えによるＤ－乳酸産生細胞の作製に使用することができる。遺伝子組換えにより本発明のポリヌクレオチドが導入された宿主細胞（以下、形質転換体ともいう）がＤ－乳酸を産生するようになるためには、形質転換体内で該ポリヌクレオチドがコードするＤ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドを発現する必要があるが、その際、Ｄ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドを発現させる方法の一つとして、該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターとを連結させた、すなわち、該プロモーターの３’末端側に該ポリヌクレオチドを連結させたＤＮＡ構築物を利用することが有用であり、該ＤＮＡ構築物についても本発明に含まれる。本発明のＤＮＡ構築物は、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と、該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターをそれぞれ適切な制限酵素で切断し、後述のベクターＤＮＡの制限酵素部位あるいはマルチクローニングサイトに挿入して連結する方法や、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該プロモーターをＰＣＲによって連結することにより作製することができる。
　前記ＤＮＡ構築物の好ましい態様としては、該ＤＮＡ構築物をプラスミド（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）などのベクターに保持させる。該ＤＮＡ構築物の導入形態（宿主ゲノム内または宿主ゲノム外）や宿主細胞の種類に応じて、当該分野において公知の原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクターまたは植物細胞性ベクターが適宜選択される。
　なお、プラスミドとしては、例えば、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌－酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ３２またはＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌－酵母シャトルベクター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌－酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などを挙げることができる。バクテリオファージとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、φＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子などを挙げることができる。ＹＡＣとしては、ｐＹＡＣＣ２などを挙げることができる。
　前記ＤＮＡ構築物における「プロモーター」とは、遺伝子からのｍＲＮＡの転写開始に関与する塩基配列を意味し、通常、染色体中に存在する遺伝子の５末端側の上流配列を指す。プロモーターの塩基配列長としては、好ましくは１～３０００ｂｐ、より好ましくは１～１０００ｂｐであるが、下流に存在する遺伝子のｍＲＮＡの転写を開始し得る塩基配列であれば特に制限はない。また、プロモーターの転写活性を向上させる変異や操作は公知であり、「プロモーター」には公知の手法により改変されたものも含まれる。前記ＤＮＡ構築物におけるプロモーターは、該ＤＮＡ構築物が導入された形質転換体内でプロモーター活性を有するものであれば特に制限はないが、後述の通り、本発明のＤＮＡ構築物は酵母に導入されることが好ましいため、酵母において機能するプロモーターであることが好ましい。
　酵母において機能するプロモーターの好ましい例としては、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ１，２，３）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１，２，３，４，５，６，７）遺伝子、ガラクトース代謝系遺伝子（ＧＡＬ１，７，１０）、シトクロムｃ遺伝子（ＣＹＣ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ１）、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）、ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子（ＰＦＫ１）、ピルビンデカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１，５，６）のプロモーターが挙げられ、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０７２１２９に記載・利用されている、酵母培養開始後５０時間以降における遺伝子発現量が全遺伝子の平均相対発現量の５倍以上であるプロモーターである、エノラーゼ１遺伝子（ＥＮＯ１）、細胞壁関連タンパク質２遺伝子（ＣＷＰ２）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１）のプロモーターが挙げられる。
　酵母において機能するプロモーターのより好ましい例としては、酵母のエタノール発酵経路において高発現されているＰＤＣ１プロモーターまたはＴＤＨ３プロモーター、あるいは長期間の酵母培養時に高発現されているＳＥＤ１プロモーターが挙げられ、より具体的には、配列番号５に記載されるＰＤＣ１プロモーター、配列番号６に記載されるＳＥＤ１プロモーターまたは配列番号７に記載されるＴＤＨ３プロモーターが挙げられる。
　また、ＰＤＣ１プロモーター、ＳＥＤ１プロモーターまたはＴＤＨ３プロモーターは、そのプロモーター活性を有する範囲においては配列番号５～７のいずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～２０個、特に好ましくは１から１０個、最適に好ましくは１から５個の塩基配列が欠失、置換および／または付加された塩基配列であってもよい。
　また、ＰＤＣ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーターまたはＳＥＤ１プロモーターは、そのプロモーター活性を有する範囲においては配列番号５～７のいずれかに記載の塩基配列もしくはその一部を含む塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選択したポリヌクレオチドをプローブとして、当業者の周知のハイブリダイセーション技術（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish . John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4）などを用いて、ハイブリダイズするポリヌクレオチドである。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃、より厳しい条件としては４２℃、さらに厳しい条件としては６５℃で、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium citrate)溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて洗浄することにより達成することができる。
　前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入して得られる形質転換体についても本発明に含まれる。宿主細胞としては、該ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を安定に保持する細胞であれば特に制限はなく、大腸菌、枯草菌、乳酸菌等の細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞または植物細胞が挙げられるが、酵母は耐酸性であり、Ｄ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドを発現することでＤ－乳酸を高産生した場合でも生育できるため、好ましく用いられる。
　酵母としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、イッサチェンキア属（Ｉｓｓａｃｈｅｎｋｉａ）、フェロミセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母が挙げられるが、好ましくは、サッカロミセス属、キャンディダ属またはクリベロミセス属に属する酵母であり、より好ましくはサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはキャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、キャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）またはクリベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）、クリベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）である。
　また、酵母が高次倍数体酵母であれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定してＤ－乳酸の高生産性を維持することが可能となり、Ｄ－乳酸を低コストで安定に生産することができるため、本発明において好ましく用いられる。ここで、「高次倍数体酵母」とは、細胞内に２組以上の染色体をもつ酵母のことである。高次倍数体酵母の染色体の組数に関しては特に制限はないが、２組の染色体を持った２倍体酵母が好ましい。高次倍数体酵母は、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母、清酒酵母、ワイン酵母やビール酵母などの酵母などが挙げられる。使用する高次倍数対酵母は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
　また、酵母が栄養非要求性であれば、従来よりも栄養素の少ない培地、すなわち低コストの培地が使用可能となるとともに、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定してＤ－乳酸の高生産性を維持することが可能となり、乳酸を低コストで安定に生産することも可能となるため、本発明において好ましく用いられる。ここで、「栄養要求性」とは、野生型酵母が有する栄養合成遺伝子に何らかの原因で変異が生じ、結果として、該栄養の合成能を欠損していることを意味する。すなわち、「栄養非要求性酵母」とは、栄養要求性を示す遺伝子型を有しないか、もしくは相補されている酵母である。栄養要求性酵母の栄養要求性を復帰させて栄養非要求性酵母を作出する方法としては、遺伝子組換え手法によって栄養合成遺伝子を導入し、栄養要求性を復帰させる方法や、また異なる栄養要求性を有する酵母同士を接合、子嚢形成させ、目的とする栄養要求性を復帰させる過程を繰り返し、最終的に栄養要求性をすべて復帰させ、栄養非要求性酵母とする方法などが挙げられる。なお、栄養非要求性酵母であるか否かの判定方法としては、酵母の最小培地であるＳＤ培地において、生育可能であるかをもってして判断基準とすることができる。
　また、酵母は旺盛にエタノール発酵を行う微生物であり、その代謝経路は、解糖系産物であるピルビン酸をピルビン酸脱炭酸酵素によりアセトアルデヒドに変換し、そのアセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素によってエタノールに変換する。したがって、エタノール代謝経路の起点となるピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊された酵母株を宿主とすることは、本来エタノール代謝経路で代謝されるべきピルビン酸が、Ｄ－乳酸代謝経路に用いられるようになるため、好ましい。
　特にサッカロミセス・セレビセの場合、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子にはピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子、ピルビン酸脱炭酸酵素５（ＰＤＣ５）遺伝子、およびピルビン酸脱炭酸酵素６（ＰＤＣ６）遺伝子の３種類が存在し、そのうちＰＤＣ１とＰＤＣ５のみが酵母細胞内においてピルビン酸脱水素酵素活性を有するとされているため、ＰＤＣ１遺伝子またはＰＤＣ５遺伝子が破壊された株を使用することが好ましく、ＰＤＣ１遺伝子が破壊された株を使用することがより好ましい。また、ＰＤＣ１遺伝子が破壊された株においては、特開２００８－０４８７２６号公報に記載されるように、ＰＤＣ５の活性が低下するような変異を有する変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する株が好ましく、温度感受性の変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する株がより好ましい。ここで、「温度感受性の変異型ＰＤＣ５」とは、野生型ＰＤＣ５と比較して、ある培養温度では同程度のピルビン酸脱炭酸酵素活性を示すが、培養温度を変化させて特定の培養温度以上になるとＰＤＣ５活性の消失又は低下を示す性質を有する変異型ＰＤＣ５のことである。サッカロミセス・セレビセの通常の培養温度は２８～３０℃であり、温度感受性を示す温度が通常の培養温度に近いほど、培養温度を変化させるために必要な熱量が少なくて済み、培養にかかるコストを低減させることができるため、好ましい。具体的には、温度感受性変異型ＰＤＣ５は３４℃以上で温度感受性を示すことが好ましい。
　前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を酵母に導入して、形質転換酵母内でＤ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドを発現させる方法としては、前述の通り該ＤＮＡ構築物を含むベクターを酵母染色体外に導入する方法や、該ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を酵母染色体に導入する方法が挙げられるが、いずれも採用することができる。
　前記ポリヌクレオチドを酵母染色体に導入する方法としては、本発明のポリヌクレオチドに酵母染色体と相同的な配列である相同組換え用ＤＮＡセグメントを備える構築物（以下、相同組換え用ＤＮＡ構築物とも言う）を好適に用いることができる。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、酵母染色体において本発明のポリヌクレオチドを導入しようとするターゲット部位近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、少なくとも１個備えられ、好ましくは、２個備えられている。相同組換え用ＤＮＡセグメントが２個備えられている場合、２個の相同組換え用ＤＮＡセグメントを、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤＮＡに相同なＤＮＡ配列とし、これらのＤＮＡセグメントの間に本発明のポリヌクレオチドを連結することが好ましい。
　相同組換え用ＤＮＡ構築物により相同組換えする方法に制限はないが、ＰＣＲにより相同組換え用ＤＮＡ構築物を増幅し、該ＰＣＲ断片をプラスミドに挿入して酵母に導入する方法や、該ＰＣＲ断片を酵母に導入する方法が採用できる。また、相同組換え用ＤＮＡ構築物には、本発明のポリヌクレオチドの発現を制御するためのターミネーターが含まれることが好ましい。ここで、「ターミネーター」とは、遺伝子からのｍＲＮＡ転写を終結させる配列を意味し、通常、染色体中に存在する遺伝子の３’末端側の下流配列を指す。
　また、相同組換え用ＤＮＡ構築物には、本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物の他に、形質転換酵母の選択を容易にするために、選択マーカーが含まれることが好ましい。ここで言う選択マーカーとしては、ＵＲＡ３またはＴＲＰ１等の栄養要求性相補的遺伝子もしくはＧ４１８耐性遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
　ＰＣＲにより前記ポリヌクレオチド、ターミネーターおよび選択マーカーを含む相同組換え用ＤＮＡ構築物を調整する方法は、例えば、下記ステップ１～３の工程により行うことができる。
　ステップ１：本発明のポリヌクレオチドの下流にターミネーターがつながったプラスミドを鋳型とし、プライマー１，２をセットとして本発明のポリヌクレオチド及びターミネーターを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー１は、導入目的箇所の上流側に相同的な配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインし、プライマー２は、ターミネーターより下流のプラスミド由来の配列をもとにデザインする。
　ステップ２：選択マーカーを持つプラスミド、例えばｐＲＳ４００、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２６等を鋳型として、プライマー３，４をセットとして選択マーカーを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー３は、ステップ１のＰＣＲ断片のターミネーターより下流の配列と相同性のある配列が３０ｂｐ以上を付加するようにデザインし、プライマー４には、導入目的箇所の下流側に相当する配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインする。
　ステップ３：ステップ１，２で得られたＰＣＲ断片を混合したものを鋳型とし、プライマー１，４をセットとしてＰＣＲを行うことにより、両末端に導入目的箇所の上流側及び下流側に相当する配列が付加された、本発明のポリヌクレオチド、ターミネーター及び酵母選択マーカーを含む相同組換え用ＤＮＡ構築物が得られる。
　前記相同組換え用ＤＮＡ構築物を酵母に導入するには、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法やプロトプラスト法等がある。
　相同組換えにより酵母染色体に前記ポリヌクレオチドを導入する場合、該ポリヌクレオチドが酵母染色体上の内在性遺伝子のプロモーターにより制御可能になるように導入する。この場合、前記ポリヌクレオチドの導入によって、同時に、本来当該プロモーターによって制御されるべき内在性遺伝子を破壊し、この内在性遺伝子に替えて外来の本発明のポリヌクレオチドを発現させてもよい。本方法は、特に、当該プロモーターが上記のように酵母において高発現プロモーターである場合や、酵母のＤ－乳酸代謝経路を阻害するように機能する内在性遺伝子を破壊する場合に有用である。
　前記ポリヌクレオチドを酵母染色体に導入する際のターゲットとなる内在性遺伝子として、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ１，２，３）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１，２，３，４，５，６，７）、ガラクトース代謝系遺伝子（ＧＡＬ１，７，１０）、シトクロムｃ遺伝子（ＣＹＣ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ１）、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）、ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子（ＰＦＫ１）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１，５，６）が好ましい例として挙げられる。また、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０７２１２９に記載・利用されている、酵母培養開始後５０時間以降における遺伝子発現量が全遺伝子の平均相対発現量の５倍以上である、エノラーゼ１遺伝子（ＥＮＯ１）、細胞壁関連タンパク質２遺伝子（ＣＷＰ２）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）のプロモーターも好ましい例として挙げられる。特に、酵母のエタノール発酵経路において高発現されているＰＤＣ１遺伝子またはＴＤＨ３遺伝子、あるいは長期間の酵母培養時に高発現されているＳＥＤ１遺伝子がより好ましい例として挙げられ、また前述の通り、少なくともエタノール発酵経路の起点となるＰＤＣ１遺伝子またはＰＤＣ５遺伝子、好ましくはＰＤＣ１遺伝子を破壊するように前記ポリヌクレオチドを導入することで、エタノール発酵経路で代謝されるピルビン酸をＤ－乳酸代謝経路に利用することができるようになるため、さらに好ましい。
　また、前記ＤＮＡ構築物を酵母染色体に導入する方法としては、前記ポリヌクレオチドを酵母染色体に導入する場合と同様に相同組換え用ＤＮＡ構築物を作成し、相同組換えにより目的とする染色体上の箇所に導入することができる。なお、前記ＤＮＡ構築物には、前記ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターが既に含まれているため、前記ポリヌクレオチドが酵母染色体上の内在性遺伝子のプロモーターにより制御可能になるように導入する必要はない。
　なお、酵母染色体上の所望の位置に前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物が導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換酵母からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において公知である。
　前記形質転換体を培養する工程を含むＤ－乳酸の製造方法についても本発明に含まれる。前記形質転換体を培養すると、該形質転換体内でＤ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドの発現が新たに付与または増強されてＤ－乳酸代謝経路が新たに付与または増強され、その結果、培養物中からＤ－乳酸を分離する工程を実施することによりＤ－乳酸が得られる。培養物とは、培養上清の他、形質転換体または形質転換体の破砕物を包含している。
　前記形質転換体の培養方法については特に限定はなく、公知の方法が採用される。例えば、前記形質転換酵母の培養方法としては「M.D. Rose et al., "Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)」等に記載されている方法を用いることができる。なお、前記ＤＮＡ構築物を含むプラスミドや相同組換え用ＤＮＡ構築物に選択マーカーが含まれる場合、選択マーカーに応じた栄養非添加培地または薬剤添加培地で培養することにより所望の形質転換体を選択することができる。
　前記形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。例えば、形質転換酵母の場合、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトース、ラフィノース、トレハロース、ソルボース、セロビオース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、イヌリン、キシロース、アラビノース、リボース、ラムノース、グルコサミン、エリスリトール、リビトール、マンニトール、グルシトール、サリシン、スターチ、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
　前記形質転換体の培養は、通常、振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下から、通気を実施しないような嫌気条件下までの範囲で、乳酸の生産性が良い条件を設定することができるが、微好気から嫌気の条件下が好適に用いられる。培養温度は２５～３７℃で行うことができるが、２８～３５℃が好適である。Ｄ－乳酸が培地中に蓄積するにしたがって培養物のｐＨが低下するため、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、アンモニアガスなどのアルカリ性物質によって中和することもできる。また後段における乳酸の精製を容易にするために中和を行わずに培養することもできる。また、培養方法としては、目的とするＤ－乳酸を発酵生産しうる形態であれば特に制限はなく、バッチ培養、フェドバッチ培養、ケモスタット培養、連続培養などを採用できる。好ましくは、バッチ培養またはＷＯ２００７／０９７２６０に記載されている、目詰まりを起こしにくい膜を利用して発酵培養物を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養物に保持または還流させる膜利用連続培養である。
　前記培養物中に得られたＤ－乳酸の測定法に特に制限はないが、例えば、ＨＰＬＣを用いる方法や、Ｆ－キット（ロシュ社製）を用いる方法などがある。
　前記発酵培養物中に含まれるＤ－乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができ、例えば、濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、カルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法、ＷＯ２００９／００４９２２に開示されるナノ濾過膜と蒸留を組み合わせた分離・精製方法などが挙げられる。
　以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは本発明の例示であり本発明を制限するものではない。
　（実施例１）アメリカカブトガニ由来のＤ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子）の塩基配列決定
　アメリカカブトガニのｃＤＮＡを作製するために、ｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡの精製を行った。ｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡはアメリカカブトガニの血球より単離した。アメリカカブトガニ（Marine Biological Laboratory (USA)より購入）の血球より、ＡＧＰＣ法（実験医学Ｖｏｌ．９（１９９１）、１９３７－１９４０頁を参照）を用いて、全ＲＮＡを分離した。分離した全ＲＮＡを用いて、“Oligotex-dT30 Superキット”（タカラバイオ社製)を用いてｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを単離した。次に、“SuperScript II Reverse Transcriptase”（インビトロジェン社製）を用いＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）をプライマーとしてｃＤＮＡを合成した。次に、この反応液を鋳型として用い、Ｄ－ＬＤＨ遺伝子において高く保存されているＤＮＡ配列に注目してデザインした配列番号８および配列番号９記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子の部分配列を増幅した。ＰＣＲは以下の条件で行った。９５℃（３分間）：｛９５℃（３０秒間）－４５℃（３０秒間）－７２℃（３０秒間）｝×３５サイクル：７２℃（５分間）。続いて１．０ ％アガロースゲルを用いた電気泳動によって増幅ＤＮＡ断片の確認をおこない、６００ｂｐの増幅断片を“QIA quick Gel extraction kit”（株式会社キアゲン製）を用いて精製した後、プラスミドベクター“pGEMt-easy”（プロメガ株式会社製）にクローニングし、ＤＮＡ配列の決定を行った。塩基配列の決定は、“Taq DyeDeoxyTerminator Cycle Sequencing Kit”（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＳａｎｇｅｒの方法に従って行った。その結果、アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子に相当すると思われる２種類の配列（Ｄ－ＬＤＨ１、Ｄ－ＬＤＨ２）の部分配列が得られた。
　次に、５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ法を用いて、Ｄ－ＬＤＨ１およびＤ－ＬＤＨ２の全ＯＲＦ配列を明らかにした。５’ＲＡＣＥは以下の方法で行った。まず、１００μＭに調整した配列番号１０記載（Ｄ－ＬＤＨ１用）あるいは配列番号１１記載（Ｄ－ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡを５０μＬ、Ｔ４ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＫｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製） ５０ｕｎｉｔ、１０×Ｋｉｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６、１００ｍＭＭｇＣｌ２、５０ ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ） １０μＬ、１００ｍＭＡＴＰ １μＬ、蒸留水３４μＬを混和し、３７℃に１時間静置することで、オリゴＤＮＡの５‘末端のリン酸化を行い、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール処理、エタノール沈殿により精製した。次に、アメリカカブトガニのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを鋳型に、“SuperScript II Reverse Transcriptase”（インビトロジェン株式会社製）を用い上記リン酸化オリゴＤＮＡをプライマーとしてｃＤＮＡの合成を行った。以下、ライゲーション反応による一本鎖ｃＤＮＡのコンカテマー化を“5’-Full RACE Core Set”（タカラバイオ株式会社製）を用いて行い、生成したコンカテマー化ｃＤＮＡを鋳型として配列番号１２および配列番号１３記載（Ｄ－ＬＤＨ１用）、あるいは配列番号１４および配列番号１５記載（Ｄ－ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡをプライマーとして1度目のＰＣＲ、さらに、その反応液を鋳型として配列番号１６および配列番号１７記載（Ｄ－ＬＤＨ１用）、あるいは配列番号１８および配列番号１９記載（Ｄ－ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡをプライマーとして２度目のＰＣＲを行った。増幅断片の確認、精製および塩基配列の決定は前述の通り行った。
　３’ＲＡＣＥは以下の方法で行った。まず、アメリカカブトガニのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを鋳型に、“SuperScript II Reverse Transcriptase”（インビトロジェン株式会社製）を用いＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）をプライマーとしてｃＤＮＡの合成を行った。次に、この反応液を鋳型としてＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）および配列番号１３記載（Ｄ－ＬＤＨ１用）、あるいは配列番号１５記載（Ｄ－ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡをプライマーとして1度目のＰＣＲを行い、さらに、その反応液を鋳型としてＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）および配列番号１７記載（Ｄ－ＬＤＨ１用）、あるいは配列番号１９記載（Ｄ－ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡをプライマーとして２度目のＰＣＲを行った。増幅断片の確認、精製および塩基配列の決定は前述の通り行った。
　アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）およびｃＤＮＡのＯＲＦ配列（配列番号３）、あるいはＤ－ＬＤＨ２のアミノ酸配列（配列番号２）およびｃＤＮＡのＯＲＦ配列（配列番号４）は、上記の方法で得られた配列をつなぎ合わせて決定した。なお、ＢＬＡＳＴによる配列番号１および配列番号２に記載のアミノ酸配列間の配列同一性は９３％であり、配列番号３および配列番号４に記載の塩基配列間の配列同一性は８２％であった。
　（実施例２）アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子発現プラスミドの構築
　実施例１で決定したアメリカカブトガニ由来のＤ－ＬＤＨ遺伝子と思われるＤ－ＬＤＨ１遺伝子およびＤ－ＬＤＨ２遺伝子（以下、それぞれＬｐ．Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子、Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ２遺伝子という）のＯＲＦ５’側とＯＲＦ３’側に相当する配列番号２０および配列番号２１記載のオリゴＤＮＡまたは配列番号２２および配列番号２３記載のオリゴＤＮＡをプライマーセットとして、アメリカカブトガニのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行ない、遺伝子のクローニングを行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断した酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（ＴＤＨ３プロモーターおよび選択マーカーＵＲＡ３遺伝子を搭載、特開２００６－２８０３６８号公報参照。なお、ＴＤＨ３プロモーターおよびターミネーターがＧＡＰＤＨプロモーターおよびターミネーターと表記してある。）の切断部位に導入し、ＴＤＨ３プロモーターと、Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子またはＬｐ．Ｄ－ＬＤＨ２遺伝子が連結されたＤＮＡ構築物を含むプラスミドベクターを作製した。以後、これらのプラスミドベクターをｐＴＲＳ２０５（Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１を保持する）およびｐＴＲＳ２０６（Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ２を保持する）とする。ここでｐＴＲＳ１１ベクターは、ｐＮＶ１１ベクター（Nature, vol. 357, 25 JUNE 1992, p.700参照）を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、インサートを除いた後にセルフライゲーションすることで作成した。
　（実施例３）アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子発現プラスミドの酵母への導入
　実施例２のようにして得られたｐＴＲＳ２０５およびｐＴＲＳ２０６を酵母であるサッカロミセス・セレビセＳＷ０２９－１Ｂ株（遺伝子型：MATa ura TRP(Δpdc1::TRP1) his ade lys leu）（以下、ＳＷ０２９－１Ｂ株という）に導入した。プラスミドの導入は、“YEASTMAKER Yeast Transformation System”（クロンテック社製）を用いた酢酸リチウム法により行った（詳細は、付属のプロトコール参照）。宿主とするＳＷ０２９-１Ｂ株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ２０５および２０６の持つ選択マーカーＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ２０５および２０６の導入された形質転換酵母の選択が可能である。このようにして得られた形質転換体へのＤ－ＬＤＨ遺伝子発現ベクター導入の確認は、ウラシル非添加の液体培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キット“Ｇｅｎとるくん”（タカラバイオ株式会社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として用いたＰＣＲにより行った。プライマーには、アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマーをそれぞれ使用した。その結果、全ての形質転換酵母において、各アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子がそれぞれ導入されていることを確認した。
　（実施例４）Ｄ－乳酸生産性テスト１
　実施例３のようにして得られたｐＴＲＳ２０５および２０６が導入されたサッカロミセス・セレビセＳＷ０２９－１Ｂ株（以下、ＳＷ０２９－１Ｂ／ｐＴＲＳ２０５株、ＳＷ０２９－１Ｂ／ｐＴＲＳ２０６株という）を用いてＤ－乳酸生産性テストを行った。
　表１に示した組成のＳＣ３培地からウラシルを除いた培地（ＳＣ３－Ｕｒａ培地）１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量の各株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前培養）。次に、ＳＣ３－Ｕｒａ培地１０ｍＬを試験管にいれ、各前培養液をそれぞれ１００μＬ植菌し、３０℃で振とう培養した（本培養）。本培養開始後４０時間の培養液を遠心分離し、上清に含まれる乳酸を下記に示す条件でＨＰＬＣにより測定した。
カラム：“Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＳＰＲ－Ｈ”（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ ｐ－トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ－トルエンスルホン酸、２０ｍＭビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
　また、Ｄ－乳酸の光学純度は、以下の条件でＨＰＬＣ法により測定したＤ－乳酸およびＬ－乳酸濃度の測定結果から、次式に基づいて計算した。
カラム：“ＴＳＫ－ｇｅｌ　Ｅｎａｎｔｉｏ　ＬＩ”（登録商標：東ソー株式会社製）
移動相：１ｍＭ　硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：３０℃。
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝１００×（Ｄ－Ｌ）／（Ｄ＋Ｌ）
光学純度（％）＝１００×Ｄ／（Ｄ＋Ｌ）
ここで、ＬはＬ－乳酸の濃度、ＤはＤ－乳酸の濃度を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、Ｄ－乳酸の蓄積濃度はＳＷ０２９－１Ｂ／ｐＴＲＳ２０５株で１３ｇ／Ｌ、ＳＷ０２９－１Ｂ／ｐＴＲＳ２０６株で１２ｇ／Ｌであった。また、培養液中にはＤ－乳酸のみ検出され、Ｌ－乳酸は検出限界以下であった。アメリカカブトガニよりクローニングしたＤ－ＬＤＨ遺伝子を酵母に導入することで、該形質転換酵母はＤ－乳酸を産生することが確認できた。
　（実施例５）アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子の酵母染色体への導入
　以下のステップ１～３により、アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を含む相同組換え用ＤＮＡ構築物を作製した。
　［ステップ１］
　実施例２で得られたＬｐ．Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子を保持するｐＴＲＳ２０５およびＬｐ．Ｄ－ＬＤＨ２遺伝子を保持するｐＴＲＳ２０６を鋳型として配列番号２４および２５記載のオリゴＤＮＡまたは配列番号２６および２５記載のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲにより、各Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を含む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。ここで配列番号２４，２６記載のオリゴＤＮＡはＰＤＣ１遺伝子の上流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようにデザインした。
　［ステップ２］
　次にプラスミドｐＲＳ４２４（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ０３４５３）を鋳型として配列番号２７および２８記載のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。ここで配列番号２８に記載のオリゴＤＮＡはＰＤＣ１遺伝子の下流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようにデザインした。
　［ステップ３］
　ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離した後、“QIA quick Gel extraction kit”（キアゲン株式会社製）を用いて精製した。ここで得られたＤ－ＬＤＨ遺伝子を含む１．１ｋｂ断片、ＴＲＰ１遺伝子を含む１．４ｋｂ断片をそれぞれ混合したものを鋳型として配列番号２４および２８記載のオリゴＤＮＡまたは配列番号２６および２８記載のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲにより各Ｄ－ＬＤＨ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーターおよびＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂの相同組換え用ＤＮＡ構築物を増幅した。
　上記のようにして作製した相同組換え用ＤＮＡ構築物をサッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株（以下、ＮＢＲＣ１０５０５株という）のリジン栄養要求性を復帰させた株であるサッカロミセス・セレビセＳＷ０９２－２Ｄ株（以下、ＳＷ０９２－２Ｄ株という）に形質転換した。
　なお、ＳＷ０９２－２Ｄ株の作製法は次の通りである。フナコシ株式会社製のサッカロミセス・セレビセＢＹ４７４１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号２９，３０）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＹＳ２遺伝子の前半約２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換操作を行い、ＬＹＳ２遺伝子のアンバー変異を解除した。リジン非添加培地で培養することにより、リジン合成能が復帰した形質転換株（ＮＢＲＣ１０５０５（ＬＹＳ２）株）を選択した。形質転換株が、ＬＹＳ２遺伝子のアンバー変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＹＳ２遺伝子を持つサッカロミセス・セレビセＬ０ＧＹ７株とを接合させ２倍体細胞を得て、該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖してそれぞれの一倍体細胞を取得し（テトラッド）、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがリジン合成能を持っていることを確認した。得られたＮＢＲＣ１０５０５（ＬＹＳ２）株とＮＢＲＣ１０５０６株を接合し、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖によりＳＷ０９２－２Ｄ（遺伝子型：MATa ura3 leu2 trp1 his3 ade2 LYS2）株を得た。
　上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を用いてＳＷ０９２－２Ｄ株を形質転換し、トリプトファン非添加の培地で培養することで形質転換酵母を選抜した。このようにして得られた形質転換酵母をＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１－ＴＲＰ１）株およびＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＤＬＨ２－ＴＲＰ１）株とする。
　（実施例６）Ｄ－乳酸生産性テスト２
　実施例５で作製したＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１－ＴＲＰ１）株、ＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ２－ＴＲＰ１）株を用いてミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ株式会社製、５Ｌ）を用いて発酵評価を行った。
　表１に示すＳＣ３培地１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量の各株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、４５ｍＬのＳＣ３培地を投入した三角フラスコに前々培養液を５ｍＬ加え、３０℃でさらに8時間培養した（前培養）。１ＬのＳＣ３培地を投入したミニジャーファメンターに前培養液を全量植菌して、３０時間培養を行った。培養条件を以下に示す。
ｐＨ：ｐＨ５
通気：１００ｍＬ／ｍｉｎ
攪拌：１２０ｒｐｍ
中和剤：１Ｎ　水酸化ナトリウム。
　培養終了時の培養液量および培養液中のＤ－乳酸濃度及びグルコース濃度を“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬株式会社製）で測定し、該乳酸、及びグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された乳酸対糖収率を求めた。その結果、ＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１－ＴＲＰ１）は対糖収率４５％、ＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ２－ＴＲＰ１）は対糖収率４２％でＤ－乳酸を生産していることが確認できた。
　（比較例１）乳酸菌由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子のクローニング、発酵評価
　形質転換酵母においてＤ－乳酸を効率よく発酵生産しうるＤ－ＬＤＨ遺伝子としては、ロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ９１３５株由来のＤ－ＬＤＨ遺伝子が公知であり（ＷＯ２００４／１０４２０２参照）、該Ｄ－ＬＤＨ遺伝子（以下、Ｌｍ．Ｄ－ＬＤＨ遺伝子という）をクローニングして酵母に導入・発酵することでアメリカカブトガニ由来のＬｐ．Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子またはＬｐ．Ｄ－ＬＤＨ２遺伝子とのＤ－ＬＤＨ活性の比較検討を行った。
　Ｌｍ．Ｄ－ＬＤＨ遺伝子のクローニングは、ＷＯ２００４／１０４２０２に記載の塩基配列を参考に設計したプライマーセット（配列番号３１、３２）を用いてＡＴＣＣ９１３５株をテンプレートとしたコロニーＰＣＲ（東洋紡株式会社製“KOD-Plus-polymerase”を使用）により行った。ＰＣＲ増幅断片を精製し末端を“T4 Polynucleotide Kinase”（タカラバイオ株式会社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、“DNA Ligation Kit Ver.2”（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することによりＬｍ．Ｄ－ＬＤＨ遺伝子がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬｍ．Ｄ－ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてＬｍ．Ｄ－ＬＤＨ遺伝子発現プラスミドｐＴＲＳ２０７を得た。
　次に、ｐＴＲＳ２０７を鋳型として、配列番号２４または２６に示すプライマーの代わりに配列番号３３に示すプライマーセットを用いた点を除いて実施例５と同様の方法でＬｍ．Ｄ－ＬＤＨ遺伝子をサッカロミセス・セレビセＳＷ０９２－２Ｄ株の染色体中のＰＤＣ１遺伝子座に導入した。作製した形質転換酵母をＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｍ．Ｄ－ＬＤＨ－ＴＲＰ１）とする。次に、実施例６と同様な方法で、バッチ培養によるＤ－乳酸生産性の評価を行った。その結果、ＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｍ．Ｄ－ＬＤＨ－ＴＲＰ１）の対糖収率は３８％であった。実施例６の結果と合わせて表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（参考例１）アフリカツメガエル由来Ｌ－ＬＤＨ遺伝子導入酵母の作製
　特開２００８－０２９３２９号公報に記載されている方法により、アフリカツメガエル由来のＬ－ＬＤＨ遺伝子（Ｘ．Ｌ－ＬＤＨ遺伝子）をＰＤＣ１遺伝子座に導入した酵母を作製した。なお、染色体に導入する酵母としてＮＢＲＣ１０５０６株のアデニン栄養要求性を復帰させた株（ＳＵ０１３－１Ｄ株）を用いた。ＳＵ０１３－１Ｄ株の作成方法を以下に示す。プラスミドｐＲＳ４２２を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号３４，３５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＡＤＥ２遺伝子のＰＣＲ断片約２ｋｂを増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、形質転換操作を行い、ＡＤＥ２遺伝子の変異を解除した。アデニン非添加培地で培養することにより、アデニン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
　上記のようにして得られた形質転換株が、ＡＥＤ２遺伝子の変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＡＤＥ２遺伝子を持つサッカロミセス・セレビセＬ０ＧＹ７７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖してそれぞれの一倍体細胞を取得し（テトラッド）、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがアデニン合成能を持っていることを確認した。得られたＮＢＲＣ１０５０６（ＡＤＥ２）株とＮＢＲＣ１０５０５株を接合し、マイクロマニピュレーターでの子嚢解剖によりＳＵ０１３－１Ｄ株（遺伝子型：MATα ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 lys2）を得た。得られた形質転換酵母をＳＵ０１３－１Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｘ．Ｌ－ＬＤＨ－ＴＲＰ１）株とする。
　（実施例７、比較例２）Ｄ－乳酸生産性テスト３
　参考例１のようにして作製したＳＵ０１３－１Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｘ．Ｌ－ＬＤＨ－ＴＲＰ１）株と、実施例５および比較例１で作製したＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１－ＴＲＰ１）株、ＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ２－ＴＲＰ１）株およびＳＷ０９２－２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｍ．Ｄ－ＬＤＨ－ＴＲＰ１）株をそれぞれ接合させ、ＰＤＣ１遺伝子座にＬ－ＬＤＨ遺伝子とＤ－ＬＤＨ遺伝子をヘテロに有する２倍体酵母を作製した。作製した２倍体酵母をそれぞれＬｐ１－Ｘ株、Ｌｐ２－Ｘ株、Ｌｍ－Ｘ株とする。
　次に、Ｌｐ１－Ｘ株、Ｌｐ２－Ｘ株、Ｌｍ－Ｘ株を実施例５と同様な条件でバッチ培養を行い、生産した乳酸の光学純度を評価した（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を有する酵母は、光学純度５０％以上でＤ－乳酸を産生したのに対し、ロイコノストック・メセンテロイデス由来のＤ－ＬＤＨ遺伝子を有する酵母が産生したＤ－乳酸の光学純度は４４．４％であった。各酵母が生産するＤ－乳酸の対糖収率およびＤ－乳酸の光学純度は、Ｄ－ＬＤＨ遺伝子形質転換酵母内でのＤ－ＬＤＨ活性に比例すると考えられることから、表２および表３の結果からロイコノストック・メセンテロイデス由来のＤ－ＬＤＨ遺伝子よりもアメリカカブトガニ由来のＤ－ＬＤＨ遺伝子の方が、酵母に導入した場合に高活性のポリペプチドをコードすることが確認できた。
　（実施例８）酵母染色体中へのＤ－ＬＤＨ遺伝子の多コピー導入および温度感受性変異型ＰＤＣ５酵母の作製
　次に、更なるＤ－乳酸収率向上を目的としてＰＤＣ１遺伝子座以外の遺伝子座にもアメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を導入した酵母の作製を検討し、特開２００８－０２９３２９号公報に導入効果が記載されているＴＤＨ３遺伝子および国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０７２１２９に導入効果が記載されているＳＥＤ１遺伝子座に導入した。また、特開２００８－０４８７２６号公報に記載されている温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子も導入した。
　［ＴＤＨ３遺伝子座へのＤ－ＬＤＨ遺伝子導入］
　ＴＤＨ３遺伝子座への導入のために、特開２００８－０２９３２９号公報に記載されているｐＴＲＳ１５０の作製方法と同様に、Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子を保持するｐＴＲＳ２０５のＴＤＨ３ターミネーターをＡＤＨ１ターミネーターに置換したプラスミドｐＴＲＳ２０８を作製した。次に、特開２００８－０２９３２９号公報中の配列番号８の代わりに配列番号３６に示すプライマー用い、ｐＴＲＳ２０８を鋳型としてＴＤＨ３遺伝子座導入用の相同組換え用ＤＮＡ構築物を得た。
　上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を導入する酵母としては、ＳＵ０１３－１Ｄ株のロイシン非要求性株（ＳＷ０８７－２Ｃ株）を用いた。ＳＷ０８７－２Ｃ株の作成方法を以下に示す。プラスミドｐＲＳ４２５を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号３７，３８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＥＵ２遺伝子のＰＣＲ断片約２ｋｂを増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１３－１Ｄ株の形質転換操作を行い、ＬＥＵ２遺伝子の変異を解除した。ロイシン非添加培地で培養することにより、ロイシン合成能が復帰した形質転換株を選択した。このようにして得られた形質転換株が、ＬＥＵ２遺伝子の変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＥＵ２遺伝子を持つサッカロミセス・セレビセＬ０ＧＹ７７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖してそれぞれの一倍体細胞を取得し（テトラッド）、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがロイシン合成能を持っていることを確認した。得られたＳＵ０１３－１Ｄ（ＬＥＵ２）株とＮＢＲＣ１０５０５株を接合し、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖によりＳＷ０８７－２Ｃ株（遺伝子型：MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2）を得た。
　上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を用いてＳＷ０８７－２Ｃ株を形質転換し、ウラシル非添加培地でセレクションすることでＴＤＨ３遺伝子座にＬｐ．Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子が導入された形質転換酵母を得た。得られた形質転換酵母をＳＷ０８７－２Ｃ（ΔＴＤＨ３：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ－ＵＲＡ３）株とする。
　［ＳＥＤ１遺伝子座へのＤ－ＬＤＨ遺伝子導入］
　ＳＥＤ１遺伝子座への導入法は、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０７２１２９の実施例２に記載されている方法を改変して行った。すなわち、ＰＣＲの鋳型としてｐＴＲＳ１０２の代わりにｐＴＲＳ２０５を用い、また上記公報中の配列番号１４の代わりに配列番号３９に示すプライマーを用いてＳＥＤ１遺伝子座導入用の相同組換え用ＤＮＡ構築物を増幅した。
　上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を導入する酵母としては、実施例５で作製したＮＢＲＣ１０５０５（ＬＹＳ２）株と参考例１で作製したＮＢＲＣ１０５０６（ＡＤＥ２）株を接合させ、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖により分離したＳＷ０９２－７Ｄ株（遺伝子型：MATa ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 LYS2）株を用いた。
　上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を用いてＳＷ０９２－７Ｄ株を形質転換し、ヒスチジン非添加培地でセレクションすることでＳＥＤ１遺伝子座にＬｐ．Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子が導入された形質転換酵母を得た。得られた形質転換酵母をＳＷ０９２－７Ｄ（ΔＳＥＤ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ－ＨＩＳ３）株とする。
　［温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子（ｐｄｃ５ｔｓ－９）の導入］
　温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子が導入された酵母として、特開２００８－０４８７２６号公報に記載の、温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子（ｐｄｃ５ｔｓ－９）を有する酵母ＳＷ０１５株を用いた。ＳＷ０１５株とＳＷ０８７－２Ｃ株を接合させ、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖により分離することでＳＷ０９５－４Ｂ株（遺伝子型：MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2 pdc5ts-9 Δpdc1::TRP1）を得た。さらに、ＳＷ０９５－４Ｂ株とＳＷ０９２－２Ｄ株を接合させ、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖により分離することで、ＳＷ０９８－２１Ｂ株（遺伝子型：MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 LYS2 pdc5ts-9）を得た。
　［ＰＤＣ１、ＴＤＨ３およびＳＥＤ１遺伝子座へのＤ－ＬＤＨ遺伝子導入、ならびに温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子（ｐｄｃ５ｔｓ－９）の導入］
　作製したＳＷ０９２－２Ｄ（ΔＰＤＣ１：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１－ＴＲＰ１）株、ＳＷ０８７－２Ｃ（ΔＴＤＨ３：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１－ＵＲＡ３）株、ＳＷ０９２－７Ｄ（ΔＴＤＨ３：：Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１－ＨＩＳ３）およびＳＷ０９８－２１Ｂを用いて、２倍体接合、テトラッドを繰り返しＰＤＣ１、ＴＤＨ３およびＳＥＤ１遺伝子座にＬｐ．Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子を有し、温度感受性変異型ＰＤＣ５（ｐｄｃ５ｔｓ－９）を有し、かつ、２倍体でアデニン・ロイシン・リジンの栄養要求性を有さないＳＵ０４２株を得た。ＳＵ０４２株の作製手順を図１に示す。
　（実施例９）Ｄ－乳酸生産性のテスト４
　実施例８のようにして作製したＳＵ０４２株を用いて、バッチ培養によるＤ－乳酸生産性のテストを行った。培地には表１に示すＳＣ３培地または原料糖培地（１００ｇ／Ｌ “優糖精”（ムソー株式会社製）、１．５ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム）を用いた。まず、ＳＵ０４２株を試験管で５ｍｌのＳＣ３培地または原料糖培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なＳＣ３培地または原料糖培地５０ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。ミニジャーファメンター（Ａｂｌｅ社製、２Ｌ）に１ＬのＳＣ３培地または原料糖培地を投入し、温度調整（３２℃）、ｐＨ制御（ｐＨ５、５Ｎ 水酸化カルシウム）を行い、通気・攪拌（２００ｍＬ／ｍｉｎ，４００ｒｐｍ）させながら培養を行った。その結果ＳＣ３培地では培養は３０時間で終了し、対糖収率は６３％であった。また、原料糖培地では、培養は５０時間で終了し、対糖収率は７０％であった。この結果から、Ｌｐ．Ｄ－ＬＤＨ１遺伝子のＰＤＣ１、ＴＤＨ３、ＳＥＤ１遺伝子座への導入およびＰＤＣ５遺伝子への温度感受性変異の導入によりＤ－乳酸の発酵性能が向上することが確認できた。
　（実施例１０）連続培養によるＤ－乳酸生産性テスト
　ＳＵ０４２株を用いて、ＷＯ２００７／０９７２６０に記載されている分離膜を用いた連続培養の検討を行った。培地には原料糖培地（７５ｇ／Ｌ “優糖精”（ムソー株式会社製）、１．５ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム）を用いた。培養条件を下記に示す。
発酵槽容量：２（Ｌ）
培養液容量：１．５（Ｌ）
使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜（ＷＯ２００７／０９７２６０の参考例２に記載）
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
温度調整：３２（℃）
発酵反応槽通気量：空気０．０２（Ｌ／ｍｉｎ）、窒素ガス０．１８（Ｌ／ｍｉｎ）
発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ 水酸化カルシウムによりｐＨ５に調整
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　まず、ＳＵ０４２株を試験管で１０ｍｌの原料糖培地で３０℃、一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な原料糖培地１００ｍｌに全量植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、１．５Ｌの原料糖培地を投入した膜一体型の連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、培養開始５０時間からペリスタポンプによる培養液抜き出しを開始し（２００ｍＬ／ｈ）、４００時間まで培養を行い、生産物質である乳酸濃度および乳酸生産速度を測定した。結果を図２に示す。なお、連続培養中の乳酸生産速度は以下の式１を用いて算出した。
　乳酸生産速度（ｇ／Ｌ・ｈ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・（式１）。
　分離膜を用いた連続培養を行った結果、Ｄ－乳酸の対糖収率は８５％程度までさらに向上し、また、Ｄ－乳酸生産速度は７．５ｇ／Ｌ・ｈまで向上することが確認できた。
　（実施例１１）キャンディダ・ユーティリスへのアメリカカブトガニＤ－ＬＤＨの導入
　次に、クラブツリー陰性酵母であるキャンディダ・ユーティリスを用いたＤ－乳酸の検討を行った。
　（ａ）アメリカカブトガニＤ－ＬＤＨ遺伝子導入用ベクターの作製
　まず、キャンディダ・ユーティリス染色体中のＰＤＣ１遺伝子座にアメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を導入するためのベクター構築を行った。キャンディダ・ユーティリス　ＮＢＲＣ０９８８株（以下、ＮＢＲＣ０９８８）をＹＰＤ培地（１％ Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ，２％ Ｂａｃｔｏ　ｐｅｐｔｏｎｅ、２％ グルコース）に植菌し、３０℃で一晩培養した。得られた菌体から定法に従い、ゲノムＤＮＡを抽出して続くＰＣＲの鋳型とした。まず、配列番号４０，４１のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしてＰＤＣ１遺伝子のターミネーター領域を含む断片を増幅した。なお、特に断りのない限り、ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（東洋紡株式会社製）を用いて、付属のプロトコールに従って行った。得られた約１ｋｂの断片を制限酵素ＢｓｓＨＩで切断し、それを精製した後に、同じく制限酵素ＢｓｓＨＩで予め切断しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＫＳ０１とする。
　次に、同じくＮＢＲＣ０９８８のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号４２，４３のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＧＫプロモーターを含む断片を増幅した。得られた約１ｋｂの断片を精製して続く実験に用いた。次に、抗生物質の一種であるハイグロマイシンＢに対する耐性を付与しうる遺伝子であるｈｐｈ遺伝子を有するプラスミドｐＬＣ１－ｈｐｈを鋳型として、配列番号４４，４５のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ｈｐｈ遺伝子を含む断片を増幅・精製し、約１．１ｋｂの断片を得た。また、ＮＢＲＣ０９８８のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号４６，４７のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＧＡＰターミネーターを含む断片を増幅・精製し、約５００ｂｐの断片を得た。
　上記のようにして得られたＰＧＫプロモーターを含む断片、ｈｐｈ遺伝子を含む断片およびＧＡＰターミネーターを含む断片を混合して配列番号４８，４９のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによってＰＧＫプロモーター、ｈｐｈ遺伝子およびＧＡＰターミネーターが連結された断片を増幅した。得られた約２．６ｋｂの断片の末端をリン酸化した後に、ｐＵＣ１１８をＨｉｎｃＩＩで切断して脱リン酸化しておいたものにライゲーションした。得られたプラスミドをｐＫＳ０２とする。
　次に、同じくＮＢＲＣ０９８８のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号５０，５１のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＧＫターミネーターを含む断片を増幅・精製し、約５００ｂｐの断片を得た。また、上記のようにして得られたｐＫＳ０２を鋳型として、配列番号５２，５３のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＧＫプロモーター、ｈｐｈ遺伝子およびＧＡＰターミネーターが連結された断片を増幅・精製し、約２．６ｋｂの断片を得た。
　上記のようにして得られたＰＧＫターミネーターを含む断片およびＰＧＫプロモーター、ｈｐｈ遺伝子およびＧＡＰターミネーターが連結された断片を混合し、配列番号５０，５３のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＧＫターミネーターＰＧＫプロモーター、ｈｐｈ遺伝子およびＧＡＰターミネーターが連結された断片を増幅した。得られた約３ｋｂの断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切断し、それを精製した後に、同じく制限酵素ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで予め切断しておいたｐＫＳ０２にライゲーションした。得られたプラスミドｐＫＳ０３とする。
　次に、同じくＮＢＲＣ０９８８のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号５４，５５のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＤＣ１プロモーター領域を含む断片を増幅・精製し、約２．１ｋｂの断片を得た。また、実施例２で作製したｐＴＲＳ２０５を鋳型として、配列番号５６，５７のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、アメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を含む断片を増幅・精製し、約１ｋｂの断片を得た。
　上記のようにして得られたＰＤＣ１プロモーター領域を含む断片およびアメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を含む断片と混合し、配列番号５４，５７のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＤＣ１プロモーター領域を含む断片とアメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を含む断片が連結された断片を増幅して得られた約３．１ｋｂの断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、それを精製した後に、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで予め切断しておいたｐＫＳ０３にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＫＳ０４とする。
　（ｂ）アメリカカブトガニＤ－ＬＤＨ遺伝子のＰＤＣ１遺伝子座への導入
　上記のようにして得られたｐＫＳ０４を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断したものをエレクトロポレーション法によってＮＢＲＣ０９８８に導入した。ＹＰＤ培地に少量の菌体を植菌し、３０℃で一晩培養した。遠心して上清を廃棄した後に、菌体を滅菌水および１Ｍ ソルビトールで洗浄し、最終的に１Ｍ ソルビトールに菌体を懸濁した。次に、菌体と制限酵素ＢｇｌＩＩで切断したｐＫＳ０４を混合し、氷上で５分置いた後に、エレクトロポレーション用のキュベットに移し、Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ（２５μＦ）、電圧（０．７５ｋＶ）と抵抗（８００Ω）の条件でエレクトロポレーションを行った。その後、１Ｍ ソルビトール入りのＹＰＤ培地に移し、３０℃で4時間程度培養し、６００μｇ／ＬのハイグロマイシンＢを添加したＹＰＤ培地に塗布した。得られたハイグロマイシンＢ耐性株からゲノムを抽出し、配列番号５４，５７および配列番号５６，５１のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、それぞれ約３ｋｂおよび２ｋｂの断片の増幅を確認することにより、ＰＤＣ１遺伝子座にアメリカカブトガニ由来のＤ－ＬＤＨ遺伝子が導入された形質転換酵母が得られたことを確認した。得られた形質転換酵母をＣｕＬｐＬＤＨ株とする。
　（比較例２）キャンディダ・ユーティリスへの乳酸菌由来Ｄ－ＬＤＨの導入
　実施例１１と同様の方法で乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデス由来のＤ－ＬＤＨ遺伝子を導入した。なお、実施例１１では配列番号５５の代わりに配列番号５８のオリゴＤＮＡを用い、また実施例２のｐＴＲＳ２０５の代わりに比較例１のｐＴＲＳ２０７を鋳型とするとともに、配列番号５６，５７の代わりに配列番号５９，６０のオリゴＤＮＡを用いた。得られたプラスミドをｐＫＳ０５とする。
　上記のようにして得られたプラスミドを実施例１１と同様の方法でＮＢＲＣ０９８８株に導入した。得られたＰＤＣ１遺伝子座に乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデ由来のＤ－ＬＤＨ遺伝子が導入されている株をＣｕＬｍＬＤＨ株とする。
　（実施例１２、比較例３）キャンディダ・ユーティリスのＤ－乳酸生産性テスト
　実施例１１および比較例２で作製したＣｕＬｐＬＤＨ株、ＣｕＬｍＬＤＨ株を用いて、Ｄ－乳酸生産性を評価した。５００ｍｌの坂口フラスコに５０ｍｌのＹＰＤ培地を加え、そこに少量のＣｕＬｐＬＤＨ株およびＣｕＬｍＬＤＨ株を植菌し、３０℃で一晩振とう培養した（前培養）。培養液を集菌し、新鮮なＹＰＤ培地で洗浄した後、１ＬのＹＰＤ１０培地（１０％ グルコース含有）を添加したミニジャーファメンターに投入し、培養を行った。培養条件を以下に示す。
初期植菌量：ＯＤ６００＝１０になるように植菌
ｐＨ：ｐＨ６
通気：１００ｍＬ／ｍｉｎ
攪拌：１２０ｒｐｍ
中和剤：１Ｎ 水酸化カルシウム
培養温度：３５℃。
　培養は４０時間行い、４０時間時点の培養液の乳酸濃度、グルコース濃度を分析した。グルコースは消費されつくされていた。また、消費グルコース当たりの生産性（対糖収率）およびＤ－乳酸光学純度は表４に示す通り、キャンディダ・ユーティリスにＤ－ＬＤＨ遺伝子を導入した酵母はＤ－乳酸を発酵生産可能なことがわかり、また収率はアメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を導入したＣｕＬｐＬＤＨ株の方が高かった。
　（実施例１３、比較例４）キャンディダ・ユーティリスのＤ－乳酸生産性テスト２
　次に、ＣｕＬｐＬＤＨ株、ＣｕＬｍＬＤＨ株を用いて、５単糖であるキシロースを糖源としたＤ－乳酸生産性の評価を行った。５００ｍｌの坂口フラスコに５０ｍｌのＹＰＤ培地を加え、そこに少量のＣｕＬｐＬＤＨ株およびＣｕＬｍＬＤＨ株を植菌し、３０℃で一晩振とう培養した（前培養）。培養液を集菌し、新鮮なＹＰＤ培地で洗浄した後、１ＬのＹＰＸ１０培地（１％ 酵母エキス、２％ バクトペプトン、４％ キシロース）を添加したミニジャーファメンターに投入し、培養を行った。培養条件を以下に示す。
初期植菌量：ＯＤ６００＝１０になるように植菌
ｐＨ：ｐＨ６
通気：１００ｍＬ／ｍｉｎ
攪拌：１２０ｒｐｍ
中和剤：１Ｎ 水酸化カルシウム
培養温度：３０℃。
　培養は６０時間行い、６０時間時点の培養液の乳酸濃度、キシロース濃度を分析した。キシロースは消費されつくされていた。また、消費キシロース当たりの生産性（対糖収率）およびＤ－乳酸光学純度は表４に示す通り、キャンディダ・ユーティリスにＤ－ＬＤＨ遺伝子を導入した酵母は、キシロースを原料としてＤ－乳酸を発酵生産可能なことがわかり、また収率はアメリカカブトガニ由来Ｄ－ＬＤＨ遺伝子導入したＣｕＬｐＬＤＨ株の方が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明により、Ｄ－乳酸を低コストで安定に生産することが可能になり、また、得られるＤ－乳酸は光学純度が高く、ポリマー原料として好ましく使用される。

Claims (14)

  1. 　下記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのポリペプチド。
    （Ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （Ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド
    （Ｃ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも８０％以上のアミノ酸配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド
  2. 　下記（ａ）～（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチド。
    （ａ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ）配列番号３または４に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    （ｃ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、Ｄ－ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    （ｄ）配列番号３または４に記載の塩基配列との配列同一性が少なくとも８０％以上の塩基配列からなり、Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    （ｅ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
  3. 　請求項２に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターとを連結させた、ＤＮＡ構築物。
  4. 　前記プロモーターが、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）またはグリセルアルデヒド－３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のプロモーターであることを特徴とする、請求項３に記載のＤＮＡ構築物。
  5. 　前記プロモーターが、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかから選ばれる、請求項３または４に記載のＤＮＡ構築物。
    （Ｉ）配列番号５～７のいずれかに記載の塩基配列からなるプロモーター
    （ＩＩ）配列番号５～７のいずれかに記載の塩基配列もしくはその一部を含む塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなるプロモーター
    （ＩＩＩ）配列番号５～７いずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなるプロモーター
  6. 　請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３～５のいずれかに記載のＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換体。
  7. 　請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３～５のいずれかに記載のＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換酵母。
  8. 　前記形質転換酵母は、そのピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）およびグリセルアルデヒド－３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のうち少なくとも１種類の遺伝子が、請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３～５いずれかに記載のＤＮＡ構築物に置換されている、請求項７に記載の形質転換酵母。
  9. 　前記遺伝子のうち、少なくとも１種類はＰＤＣ１遺伝子である、請求項８に記載の形質転換酵母。
  10. 　請求項６に記載の形質転換体または請求項７～９のいずれかに記載の形質転換酵母を培養する工程を含む、Ｄ－乳酸の製造方法。
  11. 　カブトガニ科由来のＤ－乳酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターが連結されたＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換体。
  12. 　アメリカカブトガニ属由来のＤ－乳酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターが連結されたＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換酵母。
  13. 　前記形質転換酵母は、そのピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）およびグリセルアルデヒド－３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のうち少なくとも１つの遺伝子が、前記カブトガニ科由来のＤ－乳酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターが連結されたＤＮＡ構築物に置換されている、請求項１２に記載の形質転換酵母。
  14. 　請求項１１に記載の形質転換体あるいは請求項１２または１３に記載の形質転換酵母を培養する工程を含む、Ｄ－乳酸の製造方法。
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