WO2010143743A1 - 作物植物の栽培方法 - Google Patents

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西城隆憲
長澤秋都
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Sumitomo Chemical Co Ltd
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    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
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    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
    • C12Y103/03004—Protoporphyrinogen oxidase (1.3.3.4)

Definitions

  • the present invention relates to a crop plant cultivation method and the like.
  • weed control using a weed control agent has been carried out for cultivation of agricultural crops.
  • a weed control agent having selectivity it is usually necessary to spray a plurality of types of weed control agents on the crops to be cultivated.
  • a non-selective weed control agent is used, the labor and cost required for applying the weed control agent can be reduced, but it tends to show high crop phytotoxicity.
  • a compound that inhibits protoporphyrinogen IX oxidase (sometimes referred to herein as PPO) involved in chlorophyll biosynthesis is used as an active ingredient of a non-selective weed control agent.
  • PPO protoporphyrinogen IX oxidase
  • various molecular species are known.
  • WO01 / 83459 includes a compound group having a specific uracil-substituted phenylsulfamoylcarboxamide structure. It is disclosed. So far, plants that are resistant to herbicidal active compounds that are active ingredients of weed control agents, for example, plants that are resistant to protoporphyrinogen IX oxidase activity-inhibiting herbicidal active compounds have been artificially created.
  • Plants to which resistance to protoporphyrinogen IX oxidase activity-inhibiting herbicidal active compounds (sometimes referred to herein as PPO inhibitors) has been artificially imparted (herein, PPO inhibitor-tolerant plants and As an example), for example, (1) A plant in which protoporphyrinogen IX oxidase is overexpressed in the plant body, (2) a plant expressing a mutant protoporphyrinogen IX oxidase into which a mutation that reduces the sensitivity to the herbicidally active compound is artificially introduced (see, for example, WO97 / 32011), (3) A plant expressing cytochrome P450 derived from actinomycetes that metabolizes and inactivates the herbicidal active compound in the plant body (see, for example, WO03 / 40370), and (4) (a) DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 showing the activity of metabolizing the herbicidally active compound, and (
  • weed control can be effectively achieved, but depending on the combination of a PPO inhibitor-resistant plant and a PPO inhibitor, For this reason, the amount of the PPO inhibitor used cannot be increased, and therefore a sufficient weed control effect may not be obtained. Therefore, development of a suitable cultivation method for PPO inhibitor-tolerant plants by combining with specific PPO inhibitors is desired.
  • the present invention provides the inventions described in [1] to [10] below. [1] In the region where the crop plant into which one or both of the following (1) and (2) or both are introduced is cultivated, A method for cultivating the crop plant comprising the step of spraying a weed control agent containing saflufenacyl as an active ingredient.
  • DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 showing the activity of metabolizing saflufenacyl (2) DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein exhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activity
  • cytochrome P450 is cytochrome P450 derived from actinomycetes.
  • cytochrome P450 is any one of the following cytochrome P450s.
  • Cytochrome P450 derived from actinomycetes belonging to the genus Streptomyces Cytochrome P450 having an amino acid sequence having 90% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2
  • Cytochrome P450 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Cytochrome P450 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 [4]
  • the cultivation method according to [1] above, wherein the protein exhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activity is derived from a plant.
  • protoporphyrinogen IX oxidase activity is any one of the following proteins: (1) A protein that is derived from a plant and that exhibits protoporphyrinogen IX oxidase activity that is inhibited by saflufenacyl (2) A protein that is derived from a plant and exhibits protoporphyrinogen IX oxidase activity that is not inhibited by saflufenacyl ( 3) a protein having protoporphyrinogen IX oxidase activity having an amino acid sequence of 90% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (4) a proto having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 Protein showing porphyrinogen IX oxidase activity [6] Protoporphyria characterized by comprising the steps of introducing and expressing DNA of either or both of the following (1) and (2) into a plant cell, and contacting the plant cell with sa
  • DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 showing the activity of metabolizing saflufenacyl (2) DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein exhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activity
  • the selection method according to [6], wherein the cytochrome P450 is any one of the following cytochrome P450s.
  • Cytochrome P450 derived from actinomycetes belonging to the genus Streptomyces Cytochrome P450 having an amino acid sequence having 90% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2
  • Cytochrome P450 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Cytochrome P450 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 [9]
  • the selection method according to [6] above, wherein the protein exhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activity is derived from a plant.
  • protoporphyrinogen IX oxidase activity is any of the following proteins: (1) A protein that is derived from a plant and that exhibits protoporphyrinogen IX oxidase activity that is inhibited by saflufenacyl (2) A protein that is derived from a plant and exhibits protoporphyrinogen IX oxidase activity that is not inhibited by saflufenacyl ( 3) A protein having protoporphyrinogen IX oxidase activity having an amino acid sequence having 90% or more sequence homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (4) Protoporphyria having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 Protein showing nogen IX oxidase activity According to the present invention, it is possible to provide a method for cultivating a PPO inhibitor-resistant plant and the like that can increase the amount of a PPO inhibitor used and obtain a sufficient weed control
  • FIG. 1 shows that SR-1 wild type (SR-1WT) and recombinant soybean lines 1609 soy # 25, P023 and P-6-1 leaf discs were left on MS agar medium supplemented with saflufenacil for 8 days. It is a figure which shows the photograph of eyes.
  • SR-1WT SR-1 wild type
  • recombinant soybean lines 1609 soy # 25, P023 and P-6-1 leaf discs were left on MS agar medium supplemented with saflufenacil for 8 days. It is a figure which shows the photograph of eyes.
  • the cultivation method of the present invention is a cultivation method of a crop plant into which DNA of either one or both of the following (1) and (2) is introduced, In the area where the crop plant is cultivated, A step of spraying a weed control agent containing saflufenacil as an active ingredient.
  • (1) DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 showing the activity of metabolizing saflufenacyl
  • (2) DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein exhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activity
  • the “weed control agent” used in the present invention is a composition containing saflufenacil as an active ingredient.
  • Saflufenacyl (IUPAC name: N ′- ⁇ 2-chloro-4-fluoro-5- [1,2,3,6-tetrahydro-3-methyl-2,6-dioxo-4- (trifluoromethyl) pyrimidine-1 -Yl] benzoyl ⁇ -N-isopropyl-N-methylsulfamide) (CAS registration number: 372137-35-4) has protoporphyrinogen IX oxidase activity-inhibiting herbicidal activity and is described in WO01 / 83459, etc. It is a known compound.
  • the content of saflufenacil in the weed control agent is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the weed control agent is widely used in other herbicidal active compounds, insecticidal active compounds, fungicidal active compounds, plant growth regulating active compounds, fertilizer components, and weed control agents as necessary. Additive may be contained.
  • the herbicidally active compound include [(phosphonomethyl) amino] acetic acid (CAS registration number: 1071-83-6).
  • a crop plant to be cultivated by the cultivation method of the present invention is a crop plant into which one or both of the following (1) and (2) are introduced.
  • DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 showing the activity of metabolizing saflufenacyl (2) DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein exhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activity
  • cytochrome P450 is used in a normal sense, and a group having a name derived from a spectroscopic property that binds carbon monoxide in a reduced state and exhibits a Sole absorption band near 450 nm. Protoheme-containing protein.
  • cytochrome P450 has the ability to cause a single atom oxygenation reaction and subsequent functional group elimination reaction to saflufenacyl.
  • the type may be a type in which electrons are transferred to and supplied with both ferredoxin and NADPH-ferredoxin reductase, or (2) Although a type in which electrons are directly supplied from NADPH-cytochrome P450 reductase may be used, the former type is preferable.
  • the cytochrome P450 may be present in any organelle in the host cell and in the cytoplasm in the cells of the crop plant that is the cultivation target of the cultivation method of the present invention, that is, in the transgenic host cell. May be.
  • the ferredoxin may be a ferredoxin that is endogenous to the host cell, or may be a ferredoxin that is heterologous to the host cell by introducing a gene from the outside into the host cell.
  • the location of the gene having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 introduced into the host cell by the method described below may be any intracellular organelle or nucleus chromosome. .
  • Such cytochrome P450 may be present in any intracellular organelle, cytoplasm or extracellular space, but preferably includes an intracellular organelle of a host cell, more preferably a plastid.
  • DNA having a base sequence encoding a signal sequence for transfer to intracellular organelles encodes the amino acid sequence of cytochrome P450. What is necessary is just to introduce
  • linked together with a reading frame means that a reading frame of a base sequence encoding a signal sequence for translocation to an intracellular organelle and a reading frame of a base sequence encoding the amino acid sequence of the cytochrome P450 are included. It means that they are connected to form a continuous reading frame.
  • the translocation signal sequence that causes translocation and localization of proteins to intracellular organelles in host cells include, for example, translocation of proteins localized in chloroplasts of plants described in US Pat. Examples thereof include a signal sequence and a chimeric sequence composed of a plurality of types of transition signal sequences described in USRE36449.
  • soybean riborose-1,5-bisphosphate carboxylate (which may be referred to as RuBPCO in the present specification) that can be obtained by the method described in WO03 / 040370 is a chloroplast derived from a small subunit. Examples include a transition signal peptide.
  • the origin of such cytochrome P450 is not particularly limited, and for example, it may be derived from any organism such as animal tissue, plant tissue, filamentous fungus, yeast, and bacteria. Mention may be made of cytochrome P450.
  • actinomycetes are a group of prokaryotes belonging to the order Actinomycetes, and a group of grams divided into 8 genera such as Streptomyces, Actinomyces, Mycobacurium, Flagia and Norcadea. It is a positive bacterium.
  • cytochrome P450 derived from actinomyces belonging to Streptomyces genus, specifically, for example, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces globechromogenes, Streptomyces olivochromogens, Streptomyces ornatus, Streptomy cegrises, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawaensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces rosseubens, Streptomyces rustens, Streptomyces strusgens.
  • Such a gene (DNA) having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 may be a gene having a naturally occurring base sequence, or a gene converted into a codon optimal for the host. Also good. Alternatively, it may be a gene encoding an amino acid sequence in which substitution, addition, or deletion of one or more amino acid residues is introduced into the amino acid sequence of cytochrome P450 existing in nature. Specific examples of the gene encoding cytochrome P450 include a gene encoding cytochrome P450 described in WO03 / 040370.
  • a gene means a segment of DNA involved in production of the polypeptide chain, a region before and after a coding region (eg, leader sequence), and an intervening sequence (intron). May or may not be included.
  • Examples of techniques for artificially deleting, adding or substituting amino acid residues in the amino acid sequence include, for example, techniques for introducing site-specific mutations into DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence. Can do. Specific examples include a method using amber mutation (gapped duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), a PCR method using a primer for mutagenesis, and the like.
  • a method of randomly introducing mutations into DNA having a base sequence encoding any one of amino acid sequences can be exemplified.
  • a DNA having a base sequence encoding an amino acid sequence as a template using a primer pair capable of amplifying the full length of each DNA, each concentration of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP used as a substrate Mg that promotes the reaction of the polymerase under the reaction conditions changed 2+
  • a method of performing PCR under the reaction conditions in which the concentration of is increased examples include the usual methods described in, for example, Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112.
  • cytochrome P450 particularly preferably, (1) cytochrome P450 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (2) cytochrome P450 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (3) Cytochrome P450 having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 Is mentioned.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are the amino acid sequences of actinomyces cytochrome P450, respectively.
  • the “substantially identical amino acid sequence” is an amino acid sequence having a sequence homology of preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.
  • sequence homology of amino acid sequences is determined by comparing two sequences that are optimally aligned over the entire region of the amino acid sequence to be compared.
  • addition or deletion for example, a gap
  • sequence homology is described, for example, by FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • sequence homology is determined by GENETYX-WIN Ver. 6 (manufactured by GENETYX Corporation) using the Lipman-Pearson method (Lipman, DJ and Pearson, WR, Science, 227, 1435-1441 (1985)) for alignment Can be calculated.
  • the Lipman-Pearson method Lipman, DJ and Pearson, WR, Science, 227, 1435-1441 (1985)
  • a result that 90% sequence homology exists is calculated.
  • the “substantially identical amino acid sequence” (1) an amino acid sequence in which 1 or more and 7 or less, preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less amino acids in the amino acid sequence to be compared are deleted (2) an amino acid sequence having 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 15 amino acids, more preferably 1 to 10 amino acids added (or inserted) in the amino acid sequence to be compared; (3) an amino acid sequence in which one or more and seven or less, preferably one or more and five or less, more preferably one or more and three or less amino acids in the amino acid sequences to be compared are substituted with other amino acids; (4) Amino acid sequence having a combination of these deletions, additions and substitutions Is mentioned.
  • the “protein exhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activity” means a protein having an enzyme activity that oxidizes protoporphyrinogen IX in a cell to produce protoporphyrin IX.
  • the “protein showing protoporphyrinogen IX oxidase activity” is inhibited by saflufenacyl, an inhibitor of protoporphyrinogen IX oxidase activity (sometimes referred to herein as PPO activity). It may be a protein or a protein that is not inhibited.
  • proteins whose PPO activity is inhibited by saflufenacil include proteins possessed by plant species exhibiting growth inhibition such as whitening, injury, and death against normal doses of saflufenacil.
  • examples of proteins whose PPO activity is not inhibited by saflufenacil include, for example, proteins possessed by plant species that are resistant to normal doses of weed control agents, proteins possessed by animals, and proteins possessed by microorganisms.
  • the origin of the “protein exhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activity” is not particularly limited.
  • Escherichia coli Escherichia coli (Genebank accession X68660), Bacillus subtilis Bacillus subtilis (Genebank accession M97208), Haemophilus 420 (Haemophilus 420).
  • Examples include proteins derived from mice (Genebank accession D45185), humans (Genebank accession D38537), Arabidopsis (Genebank accession D83139), tobacco (Genebank accession Y13465, Y13466), etc. But it is, among others, plants (e.g., Arabidopsis (Genebank accession D83139), tobacco (Genebank accession Y13465, Y13466)) derived proteins.
  • Such a gene (DNA) having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein exhibiting PPO activity may be a gene having a naturally occurring base sequence, or a gene converted to a codon optimal for the host It may be. Further, it may be a gene encoding an amino acid sequence in which substitution, addition, or deletion of one or more amino acid residues is introduced into the amino acid sequence of a protein exhibiting PPO activity that exists in nature.
  • a gene encoding an amino acid sequence of a protein exhibiting PPO activity particularly a gene encoding an amino acid sequence of mutant PPO that is not inhibited by saflufenacyl, specifically, for example, WO 1995 / Examples thereof include genes described in 034659, WO1997 / 032011, WO1997 / 004089 and the like.
  • a technique for artificially deleting, adding or substituting an amino acid residue in the amino acid sequence the same technique as that described above for cytochrome P450 can be exemplified.
  • protoporphyrinogen IX oxidase activity in the present invention, particularly preferably, (1) a protein having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or (2) Protoporphyrinogen IX oxidase having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Is mentioned.
  • SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of soybean mutant protoporphyrinogen IX oxidase.
  • An object to be cultivated by the method of the present invention by introducing a DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 and a DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein exhibiting PPO activity into a crop plant;
  • a method for preparing a crop plant a conventional gene transfer method for plants may be used.
  • the chimera downstream of the promoter is linked so that the promoter possessed by the vector plasmid and the chimeric DNA are operably linked. What is necessary is just to insert DNA.
  • the promoter capable of functioning in a host cell such as a plant cell is 5′- upstream of the base sequence of a gene (structural gene) having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein to be introduced into a host cell such as a plant cell. It is a base sequence that functions to transcribe transcribed RNA containing the structural gene.
  • a promoter derived from a plant virus such as a promoter, a phenylalanine ammonia lyase gene promoter, a chalcone synthase gene promoter, a Pathogenesis-related protein gene promoter or an inducible promoter such as a synthetic chimeric promoter described in WO2008 / 111661, described in WO2000 / 020613 And plant promoters.
  • a terminator that can function in a host cell such as a plant cell may be linked downstream.
  • a terminator capable of functioning in a plant cell is joined to the downstream 3′-side of a base sequence of a gene (structural gene) having a base sequence encoding an amino acid sequence of a protein to be introduced into a host cell such as a plant cell, and the structure It is a base sequence having a function of adding a polyadenine sequence for stabilizing transcription of RNA containing a gene.
  • a terminator capable of functioning in a plant cell includes T-DNA derived constitutive terminators such as nopaline synthase gene (NOS) terminators, terminators derived from plant viruses such as garlic virus GV1 and GV2 terminators, and WO2000 / 020613.
  • NOS nopaline synthase gene
  • Plants to be cultivated by the cultivation method of the present invention include, for example, soybean, pea, green beans, alfalfa, clover, peanut, sweet pea, walnut, tea, cotton, pepper, cucumber, watermelon, pumpkin, melon, radish, Rapeseed, canola, sugar beet, lettuce, cabbage, broccoli, cauliflower, Arabidopsis, tobacco, eggplant, potato, sweet potato, taro, chrysanthemum, tomato, spinach, asparagus, carrot, flax, sesame, endive, chrysanthemum, carrot, carnation , Nadesico, periwinkle, Bubaldia, gypsophila, gerbera, turkey, tulip, stock, statice, cyclamen, saxifrage, north pole, violet, rose, cherry, li Carp, pear, grape, strawberry, ume, almond, mandarin, lemon, banana, mango, papaya, kiwi, coffee, bokeh, satsuki
  • plant cells that are host cells various plant cells such as plant tissues, plant individuals, cultured cells, and seeds can be used.
  • Examples of a method for introducing a DNA having the structural gene to which a promoter and terminator capable of functioning in a host cell such as a plant cell are connected into a host cell such as a plant cell include, for example, the Agrobacterium infection method (Japanese Patent Publication No. 2). No. 58917 and JP-A-60-70080), electroporation methods to protoplasts (JP-A-60-251887 and JP-A-5-68575), or particle gun methods (Japanese National Standard Hei 5- 508316 and JP-A 63-258525).
  • a DNA having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 showing the activity of metabolizing the herbicidal active compound saflufenacyl is introduced into a host cell such as a plant cell at the same time, the introduced transformant is introduced into the selection marker gene.
  • a phenotype or the like can be selected as an index.
  • the selectable marker gene is identical to DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein exhibiting PPO activity or DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 exhibiting the activity to metabolize the herbicidal active compound saflufenacyl Or a vector plasmid having the selectable marker gene, DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein exhibiting PPO activity, or the herbicidal active compound saflufenacyl.
  • the target gene was introduced by culturing plant cells introduced with a vector containing the target gene in a medium supplemented with the herbicidally active compound saflufenacil and isolating clones that can grow.
  • a transformant that is, saflufenacil
  • cells resistant to protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicidal active compounds can be selected.
  • concentration of saflufenacil added to the medium is, for example, 0.001 to 1.0 ppm, preferably 0.01 to 0.1 ppm.
  • the cells may be subcultured in a medium supplemented with saflufenacil, for example, 2-3 times every 1 to 2 weeks, cultured under light conditions, and observed for cell proliferation.
  • a method for selecting cells resistant to a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicidal active compound (eg, saflufenacil) using saflufenacil is also an embodiment of the present invention.
  • both DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein showing PPO activity and DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 showing the activity of metabolizing saflufenacyl into a plant Either (1) a method of mixing both the DNAs and introducing them into the same plant cell at the same time, or (2) a method of introducing DNAs formed by connecting both the DNAs in series into the same plant cell may be used.
  • the fact that the transformant possesses both of the DNAs is described in, for example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition” (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc., for DNA prepared from the transformant.
  • either or both of the DNAs are introduced, and by transforming a transformed plant to express the plant of the target variety, either or both of the DNAs are introduced into the chromosome of the plant of the target variety, Plants of the target varieties into which either or both of the DNAs are introduced can also be obtained. Further, a plant cell in which a DNA having a base sequence encoding an amino acid sequence of a protein exhibiting PPO activity and a DNA having a base sequence encoding an amino acid sequence of cytochrome P450 exhibiting an activity of metabolizing the herbicidal active compound saflufenacyl are separately separated.
  • the plant used in the present invention can also be produced by introducing the plant into the plant, selecting and regenerating the individual, and then mating a progeny line of the regenerated transformant.
  • a DNA fragment having a base sequence encoding the amino acid sequence of mutant PPO derived from soybean a DNA fragment having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • each of the DNA fragments is independently According to the method described in JP-A-3-291501, it is introduced into soybean somatic embryos using a particle gun.
  • a crossed line is obtained by crossing the produced recombinant soybean lines.
  • the method described in Example 2 etc. described later withering of individuals caused by chemical spraying, browning / whitening of leaves or stems) (Scoring index based on the degree of phytotoxicity that occurs)
  • scoring evaluation related to sensitivity in the spraying test of the herbicidal active compound saflufenacil may be performed.
  • each of the DNA fragments is independently Fromm, M .; E. , Et al. Bio / Technology, 8; p838 (1990), and then introduced into maize somatic embryos using a particle gun.
  • a crossed line is obtained by crossing the produced recombinant maize line.
  • the method described in Example 2 etc. described later withering of individuals caused by chemical spraying, browning / whitening of leaves or stems) (Scoring index based on the degree of phytotoxicity that occurs)
  • scoring evaluation related to sensitivity in the spraying test of the herbicidal active compound saflufenacil may be performed.
  • a DNA fragment having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a mutant PPO derived from cotton a DNA fragment having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 In order to produce a DNA fragment having a base sequence or a recombinant cotton line into which a DNA fragment having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 has been introduced, Introduce into cotton using the Agrobacterium method. Next, a crossed line is obtained by crossing the produced recombinant cotton lines.
  • scoring evaluation related to sensitivity in the spraying test of the herbicidal active compound saflufenacil may be performed.
  • it encodes a DNA fragment having a base sequence encoding the amino acid sequence of rapeseed-derived mutant PPO, a DNA fragment having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • scoring evaluation related to sensitivity in the spraying test of the herbicidal active compound saflufenacil may be performed.
  • a DNA fragment having a base sequence encoding the amino acid sequence of mutant PPO derived from wheat a DNA fragment having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 In order to produce a DNA fragment having a base sequence or a recombinant wheat line into which a DNA fragment having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 has been introduced, According to the method described in Takumi et al., Breeding Society Journal, 1995, vol. 44, separate volume 1, page 57, it is introduced into a wheat immature scutellum using a particle gun.
  • a crossed line is obtained by crossing the produced recombinant wheat lines.
  • the method described in Example 2 etc. described later individual death caused by chemical spraying, browning / whitening of leaves or stems
  • scoring evaluation related to sensitivity in the spraying test of the herbicidal active compound saflufenacil may be performed.
  • the weed control agent which contains saflufenacil as a main component is applied to the area
  • Application can be carried out, for example, by spraying the weed control agent on the area.
  • the application amount of the weed control agent may be appropriately determined according to the application time, the type of weeds, and the like.
  • 1 g to 1000 g of saflufenacil is applied per hectare, for example. More preferably, 18 g to 125 g is applied as saflufenacil per hectare.
  • the method of spraying is not particularly limited, and a conventional method suitable for the form of the weed control agent may be adopted.
  • the cultivation method of the present invention can be suitably applied to a wide variety of crop plants as long as DNA of either one or both of (1) and (2) below is introduced and shows resistance to saflufenacil.
  • DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of cytochrome P450 showing the activity of metabolizing saflufenacyl (2) DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein exhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activity That is, the plant to be cultivated by the cultivation method of the present invention may express either a protein exhibiting PPO activity or cytochrome P450 exhibiting an activity of metabolizing the herbicidal active compound saflufenacyl, or a plurality of one protein may be expressed. Species may be expressed at the same time, or both proteins may be expressed at the same time, or one protein may be expressed at the same time, and the other protein may be expressed at the same time.
  • both proteins may simultaneously express multiple types.
  • the herbicidally active compound saflufenacil is rapidly metabolized to a lower herbicidal compound in the body, or the herbicidally active compound saflufenacil cannot inhibit the PPO activity of the plant.
  • the plant according to the cultivation method of the present invention can grow well even when the herbicidal active compound saflufenacil is sprayed or added to a region where the plant that is the cultivation target of the cultivation method of the present invention is cultivated or cultured.
  • plants such as weeds other than the crop plant to be cultivated can be efficiently removed, the yield of the crop plant to be cultivated is improved, the quality is improved, and the amount of the weed control agent to be used. Reduction, labor saving, etc. are possible.
  • the leaf of the selected plant one month after sowing was cut to prepare a leaf disk, which was left on MS agar medium supplemented with 0.01, 0.03 or 0.10 ppm of saflufenacil.
  • SR-1 wild-type tobacco seeds were aseptically sown on MS agar medium, and the leaf of a plant was cut similarly in the same month after sowing to produce a leaf disk.
  • Saflufenacyl was 0.01 ppm, 0.03 ppm, or It was left on MS agar medium supplemented with 0.10 ppm. Thereafter, the condition on the eighth day was observed. The resulting photograph is shown in FIG.
  • SR-1 wild-type tobacco partially browned at 0.01 ppm, and was entirely whitened at 0.10 ppm.
  • the recombinant tobacco line 1609 soy # 25 no phytotoxicity was observed at 0.01 ppm, and browning occurred partially at 0.03 ppm and entirely at 0.10 ppm.
  • the recombinant tobacco line P023 no phytotoxicity was observed up to 0.03 ppm, and partial whitening occurred at 0.10 ppm.
  • no phytotoxicity was observed in the progeny plant of the recombinant tobacco line P-6-1 at a concentration of 0.10 ppm.
  • Leaf disks were prepared from 5 individuals in each test section, and scoring evaluation was performed based on the degree of phytotoxicity that caused browning or whitening.
  • Example 2 (Tolerance test with a spreader tobacco) Recombinant tobacco lines 1609 soy # 17, # 25 and 1584 soy # 16, P023, 35S-2 homozygous seeds described in EP 1598423 are aseptically sown on MS agar. Next, the germinated individuals are transplanted to a cultivation pot containing Kureha soil (made by Kureha Chemical), acclimated to the external environment in the artificial weather chamber, and then cultivated in the artificial weather chamber for about two weeks. As a negative control, SR-1 wild-type tobacco seeds are aseptically sown on MS agar medium and similarly cultivated in an artificial climate chamber. The plants thus obtained are subjected to a saflufenacil spray test.
  • Kureha soil made by Kureha Chemical
  • Spraying the sprayed liquid on plants using a traveling automatic medicine sprayer (Namba Design Co., Ltd.) 20 mL of sprayed liquid was applied to recombinant tobacco and wild-type tobacco seedlings placed in a 0.9 square meter spraying range. Spray evenly.
  • the sensitivity to saflufenacil in the tested recombinant tobacco is compared to the sensitivity to saflufenacil in SR-1 wild-type tobacco.
  • the homozygotes of recombinant tobacco lines 1609 soy # 17, # 25 and 1584 soy # 16, P023, 35S-2 are less sensitive to saflufenacil than SR-1 wild-type tobacco, and show saflufenacil resistance .
  • Scoring evaluation is performed based on the degree of phytotoxicity caused by death of individuals caused by spraying chemicals and browning or whitening of leaves or stems. The scoring criteria are as follows.
  • wild-type soybean (cv. Jack) seeds are similarly cultivated in a climate chamber.
  • the plants thus obtained are subjected to a saflufenacil spray test.
  • a spray test on soybean seedlings is performed. After about 2 weeks, the sensitivity to saflufenacil in the tested recombinant soybean is compared to the sensitivity to saflufenacil in wild type soybean (cv. Jack).
  • the recombinant soybean lines J16, J18, J26, and J28 are less sensitive to saflufenacil than the wild type soybean (cv. Jack), and show resistance to saflufenacil.
  • the present invention can be used for cultivation of crop plants that are resistant to a protoporphyrinogen IX oxidase inhibitor.

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Abstract

本発明は、（１）サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ及び（２）プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡのいずれか一方、またはこれら両方のＤＮＡが導入されている作物植物を栽培する領域に、サフルフェナシルを有効成分として含有する雑草防除剤を散布する工程を有する、前記作物植物の栽培方法等を提供可能とする。

Description

作物植物の栽培方法
　本発明は、作物植物の栽培方法等に関する。
　従来、農作物の栽培のため、雑草防除剤を用いた雑草防除が実施されている。選択性を有する雑草防除剤を使用する場合には、通常、栽培する農作物に対し複数の種類の雑草防除剤を散布する必要がある。非選択性の雑草防除剤を使う場合には、雑草防除剤散布に要する労力およびコストを軽減できるものの、高い作物植物毒性を示す傾向がある。
　クロロフィルの生合成に関与するプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ（本明細書中、ＰＰＯと称する場合がある。）を阻害する化合物は、非選択性の雑草防除剤の有効成分として使用される。プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼを阻害する化合物としては、多様な分子種が知られているが、その例として、ＷＯ０１／８３４５９には、特定のウラシル置換型フェニルスルファモイルカルボキサミド構造を有する化合物群が開示されている。
　これまでに、雑草防除剤の有効成分である除草活性化合物に耐性を示す植物、例えば、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性阻害型除草活性化合物に耐性を示す植物が人為的に作成されている。
　プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性阻害型除草活性化合物（本明細書中、ＰＰＯ阻害剤と称する場合がある。）に対する耐性が人為的に付与された植物（本明細書中、ＰＰＯ阻害剤耐性植物と称する場合がある。）としては、例えば、
（１）植物体中でプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼを過剰発現させた植物、
（２）当該除草活性化合物に対する感受性が低下するような変異が人為的に導入された、変異型プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼを発現させた植物（例えば、ＷＯ９７／３２０１１等を参照）、
（３）植物体中で当該除草活性化合物を代謝し不活性化するような、放線菌由来のチトクロムＰ４５０を発現させた植物（例えば、ＷＯ０３／４０３７０等を参照）、及び
（４）（ａ）当該除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、及び
（ｂ）プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
が導入されている植物（例えば、ＥＰ１５９８４２３等を参照）
等が知られている。
　ＰＰＯ阻害剤耐性植物を栽培する領域にＰＰＯ阻害剤を施用することによって、効果的に雑草防除を図ることができるが、ＰＰＯ阻害剤耐性植物とＰＰＯ阻害剤との組み合わせによっては、作物植物毒性のためＰＰＯ阻害剤の使用量を大きくできず、そのため十分な雑草防除効果を得られない場合がある。したがって、特定のＰＰＯ阻害剤との組み合わせによる、ＰＰＯ阻害剤耐性植物の好適な栽培方法の開発が望まれている。
　本発明は、以下の［１］~［１０］に記載の発明等を提供する。
　［１］
下記の（１）及び（２）のいずれか一方、または両方のＤＮＡが導入されている作物植物を栽培する領域に、
サフルフェナシルを有効成分として含有する雑草防除剤を散布する工程を有することを特徴とする、前記作物植物の栽培方法。
（１）サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（２）プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　［２］
前記チトクロムＰ４５０が、放線菌由来のチトクロムＰ４５０であることを特徴とする前記［１］記載の栽培方法。
　［３］
前記チトクロムＰ４５０が、下記のいずれかのチトクロムＰ４５０であることを特徴とする前記［１］記載の栽培方法。
（１）ストレプトミセス属に属する放線菌由来のチトクロムＰ４５０
（２）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
　［４］
前記プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、植物由来であることを特徴とする前記［１］記載の栽培方法。
　［５］
前記プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、下記のいずれかのタンパク質であることを特徴とする前記［１］記載の栽培方法。
（１）植物由来であって、かつサフルフェナシルによって阻害されるプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
（２）植物由来であって、かつサフルフェナシルによって阻害されないプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
　［６］
下記の（１）及び（２）のいずれか一方、または両方のＤＮＡを植物細胞に導入して発現させる工程、および、該植物細胞にサフルフェナシルを接触させる工程を有することを特徴とするプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ阻害型除草活性化合物耐性細胞の選抜方法。
（１）サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（２）プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　［７］
前記チトクロムＰ４５０が、放線菌由来のチトクロムＰ４５０であることを特徴とする前記［６］記載の選抜方法。
　［８］
前記チトクロムＰ４５０が、下記のいずれかのチトクロムＰ４５０であることを特徴とする前記［６］記載の選抜方法。
（１）ストレプトミセス属に属する放線菌由来のチトクロムＰ４５０
（２）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
　［９］
前記プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、植物由来であることを特徴とする前記［６］記載の選抜方法。
　［１０］
前記プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、下記のいずれかのタンパク質であることを特徴とする前記［６］記載の選抜方法。
（１）植物由来であって、かつサフルフェナシルによって阻害されるプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
（２）植物由来であって、かつサフルフェナシルによって阻害されないプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
　本発明により、ＰＰＯ阻害剤の使用量を大きくでき、十分な雑草防除効果が得られる、ＰＰＯ阻害剤耐性植物の栽培方法等を提供することができる。
　図１は、ＳＲ−１野生型（ＳＲ−１ＷＴ）並びに組換えダイズ系統１６０９ｓｏｙ＃２５、Ｐ０２３およびＰ−６−１のリーフディスクをサフルフェナシルが添加されたＭＳ寒天培地上に静置した後８日目の写真を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の栽培方法は、下記の（１）及び（２）のいずれか一方、または両方のＤＮＡが導入されている作物植物の栽培方法であって、
当該作物植物を栽培する領域に、
サフルフェナシルを有効成分として含有する雑草防除剤を散布する工程を有する。
（１）サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（２）プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　本発明において使用される「雑草防除剤」は、サフルフェナシルを有効成分として含有する組成物である。
　サフルフェナシル（ＩＵＰＡＣ名称：Ｎ’−｛２−クロロ−４−フルオロ−５−［１，２，３，６−テトラヒドロ−３−メチル−２，６−ジオキソ−４−（トリフルオロメチル）ピリミジン−１−イル］ベンゾイル｝−Ｎ−イソプロピル−Ｎ−メチルスルファミド）（ＣＡＳ登録番号：３７２１３７−３５−４）は、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性阻害型除草活性を有する、ＷＯ０１／８３４５９等に記載された、公知の化合物である。
　当該雑草防除剤におけるサフルフェナシルの含有量は、本発明の効果が奏される限り、特に限定されない。
　当該雑草防除剤は、有効成分としてのサフルフェナシルに加えて、必要に応じて、他の除草活性化合物、殺虫活性化合物、殺菌活性化合物、植物生長調節活性化合物、肥料成分、及び雑草防除剤に汎用される添加剤等を含有していてもよい。当該除草活性化合物としては、例えば、［（ホスホノメチル）アミノ］酢酸（ＣＡＳ登録番号：１０７１−８３−６）等が挙げられる。
　本発明の栽培方法で栽培する対象となる作物植物は、下記の（１）及び（２）のいずれか一方、または両方のＤＮＡが導入されている作物植物である。
（１）サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（２）プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　以下に、このような作物植物、およびその作成方法について詳細に説明する。
　本明細書中、「チトクロムＰ４５０」なる語は、通常の意味で用いられ、還元状態で一酸化炭素を結合して４５０ｎｍ付近にソーレ吸収帯を示す分光学的な性質に由来する名称を有する一群のプロトヘム含有タンパク質を意味する。
　本明細書中、「サフルフェナシルを代謝する活性を示す」とは、当該チトクロムＰ４５０が、サフルフェナシルに、一原子酸素添加反応や、それに引き続く官能基の脱離反応を引き起こす能力を有することを意味する。
　当該チトクロムＰ４５０としては、
（１）フェレドキシン及びＮＡＤＰＨ−フェレドキシンレダクターゼの両者と電子伝達して電子を供給されるタイプであってもよく、または
（２）直接ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０レダクターゼから電子を供給されるタイプであってもよいが、好ましくは、前者のタイプを挙げることができる。
　本発明の栽培方法の栽培対象である作物植物の細胞中、すなわち遺伝子導入宿主細胞中において、当該チトクロムＰ４５０は、宿主の細胞内のいずれの細胞内小器官に存在してもよく、細胞質に存在してもよい。前記フェレドキシンは、宿主細胞に内在するフェレドキシンであってもよく、宿主細胞に遺伝子を外部から導入することによって宿主細胞とは異種のフェレドキシンであってもよい。
　下記で説明する方法等によって宿主細胞に導入されたチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の存在場所は、細胞内のいずれの細胞内小器官又は核内の染色体であってもよい。かかるチトクロムＰ４５０の存在場所は、いずれの細胞内小器官、細胞質又は細胞外間隙であってもよいが、好ましくは、宿主細胞の細胞内小器官、より好ましくは色素体を挙げることができる。
　チトクロムＰ４５０が細胞内の細胞内小器官に移行されるようにするには、例えば、細胞内小器官への移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが、当該チトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの上流にその読み枠を合わせて連結されて構築されるキメラＤＮＡを宿主細胞に導入すればよい。ここで「読み枠を合わせて連結されて」とは、細胞内小器官への移行シグナル配列をコードする塩基配列の読み枠と、当該チトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列の読み枠とが接続されて一続きの読み枠が形成されるように連結されていることを意味する。宿主細胞においてタンパク質の細胞内小器官への移行及び局在化をもたらす移行シグナル配列としては、例えば、ＵＳＰ５７１７０８４等に記載される植物の葉緑体に局在するタンパク質の細胞質前駆体タンパク質由来の移行シグナル配列や、ＵＳＲＥ３６４４９等に記載される複数種の移行シグナル配列から構成されるキメラ配列等を挙げることができる。具体的には例えば、ＷＯ０３／０４０３７０に記載される方法によって取得可能なダイズのｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（本明細書中、ＲｕＢＰＣＯと記すこともある。）小サブユニット由来の葉緑体移行シグナルペプチド等が挙げられる。
　かかるチトクロムＰ４５０の由来は特に限定されず、例えば、動物組織、植物組織、糸状菌、酵母、及び細菌等のいかなる生物に由来するものであってもよいが、好適な例として、放線菌由来のチトクロムＰ４５０を挙げることができる。ここで「放線菌」とは、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する一群の原核生物のことであり、ストレプトミセス、アクチノマイセス、マイコバクリウム、フランギア、ノルカデア等の８属に分けられる一群のグラム陽性細菌である。より好ましいチトクロムＰ４５０としては、ストレプトミセス属に属する放線菌由来のチトクロムＰ４５０が挙げられ、具体的には例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｔａｂｅｒｉ等由来のチトクロムＰ４５０を挙げることができる。
　かかるチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（ＤＮＡ）としては、天然に存在する塩基配列を有する遺伝子であってもよく、また、宿主に最適なコドンに変換された遺伝子であってもよい。また、天然に存在するチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列に、１個以上のアミノ酸残基の置換、付加、又は欠失等が導入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であってもよい。チトクロムＰ４５０をコードする遺伝子として、具体的には、例えば、ＷＯ０３／０４０３７０に記載のチトクロムＰ４５０をコードする遺伝子が挙げられる。
　本明細書中、遺伝子（ＤＮＡ）は、当該ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、コード領域の前の領域および後の領域（例、リーダー配列）、ならびに介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
　当該アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、付加若しくは置換を人為的に行う手法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡに対して部位特異的変異を導入する手法等を挙げることができる。具体的には例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。また、例えば、アミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡに対してランダムに変異を導入する手法等を挙げることができる。具体的には例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを鋳型とし、それぞれのＤＮＡの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの各々の添加濃度を変化させた反応条件下又はポリメラーゼの反応を促進させるＭｇ２＋の濃度を増加させた反応条件下でＰＣＲを行う方法等が挙げられる。
　このようなＰＣＲの手法としては、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，（３１），１９９４，９７−１１２等に記載される通常の方法を挙げることができる。
　前記チトクロムＰ４５０としては、特に好ましくは、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０、
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０、又は
（３）配列番号１若しくは２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
が挙げられる。
　配列番号１および配列番号２で示されるアミノ酸配列は、それぞれ放線菌チトクロムＰ４５０のアミノ酸配列である。
　本明細書中、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列である。
　本明細書中、アミノ酸配列の「配列相同性」は、比較対象のアミノ酸配列の全領域にわたって最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。このような配列相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４，２４４４−２４４８（１９８８））、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０））、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈｉｇｇｉｎｓ　＆　Ｇｉｂｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０（１９９４ａ））等のプログラムを用いた相同性解析によりアラインメントして算出することができる。上記のプログラムは、例えば、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（国立遺伝学研究所生命情報・ＤＤＢＪ研究センターＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ；ＣＩＢ／ＤＤＢＪ）内で運営される国際ＤＮＡデータバンク）のＷＥＢページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｅ．ｈｔｍｌ）等において、一般的に利用可能である。また、配列相同性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。具体的には、配列相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ　Ｖｅｒ．６（ＧＥＮＥＴＹＸ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いてＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，（１９８５））により相同性解析を行ってアラインメントすることにより算出することができる。例えば、当該方法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列番号２で示されるアミノ酸配列との相同性解析を行いアラインメントした結果、９０％の配列相同性が存在するという結果が算出される。
　本明細書中、「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、
（１）比較対象のアミノ酸配列中の１個以上７個以下、好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（２）比較対象のアミノ酸配列中に１個以上２０個以下、好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加された（または挿入された）アミノ酸配列、
（３）比較対象のアミノ酸配列中の１個以上７個以下、好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（４）これらの欠失、付加、及び置換の組み合わせを有するアミノ酸配列
が挙げられる。
　本明細書中、「プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質」とは、細胞内でプロトポルフィリノーゲンＩＸを酸化してプロトポルフィリンＩＸを産生する酵素活性を有するタンパク質を意味する。
　当該「プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質」は、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性（本明細書中、ＰＰＯ活性と称する場合がある。）阻害剤であるサフルフェナシルによって、その活性を阻害されるタンパク質であってもよく、阻害されないタンパク質であってもよい。
　サフルフェナシルによって、そのＰＰＯ活性を阻害されるタンパク質としては、例えば、通常施用量のサフルフェナシルに対して白化・傷害・枯死等の生育阻害を呈する植物種が有するタンパク質が挙げられる。一方、サフルフェナシルによって、そのＰＰＯ活性を阻害されないタンパク質としては、例えば、通常施用量の雑草防除剤に対して耐性を示す植物種が有するタンパク質、動物が有するタンパク質、及び微生物が有するタンパク質が挙げられる。
　前記「プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質」の由来は特に限定されず、例えば、大腸菌Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｘ６８６６０）、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｍ９７２０８）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｎｚａｅ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｌ４２０２３）、マウス（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｄ４５１８５）、ヒト（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｄ３８５３７）、シロイヌナズナ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｄ８３１３９）、またはタバコ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｙ１３４６５、Ｙ１３４６６）等に由来のタンパク質を挙げることができるが、なかでも、植物（例、シロイヌナズナ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｄ８３１３９）、タバコ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｙ１３４６５、Ｙ１３４６６））由来のタンパク質が挙げられる。
　かかるＰＰＯ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（ＤＮＡ）としては、天然に存在する塩基配列を有する遺伝子であってもよく、また、宿主に最適なコドンに変換された遺伝子であってもよい。また、天然に存在するＰＰＯ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に、１個以上のアミノ酸残基の置換、付加、又は欠失等が導入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であってもよい。
　具体的には、ＰＰＯ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子、特にサフルフェナシルによって、そのＰＰＯ活性を阻害されない、変異型ＰＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子として、具体的には、例えば、ＷＯ１９９５／０３４６５９、ＷＯ１９９７／０３２０１１、及びＷＯ１９９７／００４０８９等に記載されている遺伝子が挙げられる。
　当該アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、付加若しくは置換を人為的に行う手法としては、前記でチトクロムＰ４５０について述べた手法と、同様の手法を挙げることができる。
　本発明におけるプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質としては、特に好ましくは、
（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質、又は
（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ
が挙げられる。
　配列番号３は、ダイズ変異型プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼのアミノ酸配列である。
　前記チトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、及び前記ＰＰＯ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを作物植物に導入して、本発明の方法で栽培する対象となる作物植物を準備する方法としては、植物における慣用の遺伝子導入法を用いればよい。具体的には、例えば、前記でＰ４５０について説明したようなキメラＤＮＡ又は当該キメラＤＮＡと宿主細胞で機能可能なプロモーターとが機能可能な形で連結されて構築されるＤＮＡ等を宿主細胞である植物で利用可能なベクターに組込んで、これを宿主細胞である植物に導入すればよい。尚、宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクタープラスミドを使用する場合には、ベクタープラスミド保有のプロモーターと当該キメラＤＮＡとが機能可能な形で結合するように、当該プロモーターの下流に当該キメラＤＮＡを挿入すればよい。
　ここで、植物細胞等の宿主細胞で機能可能なプロモーターとは、植物細胞等の宿主細胞に導入するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（構造遺伝子）の塩基配列の上流５’−側に接合し、当該構造遺伝子を含む転写ＲＮＡを転写させる機能を持つ塩基配列である。植物細胞等の宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子プロモーター等のＴ−ＤＮＡ由来の構成型プロモーター、カリフラワーモザイクウィルス由来の１９Ｓプロモーター又は３５Ｓプロモーター等の植物ウィルス由来のプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ遺伝子プロモーター、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子プロモーターあるいはＷＯ２００８／１１１６６１に記載される合成キメラプロモーター等の誘導型プロモーター、ＷＯ２０００／０２０６１３に記載される植物プロモーター等を挙げることができる。また、上記のような植物細胞等の宿主細胞で機能可能なプロモーターと、ＰＰＯ活性を示すタンパク質又はチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡの下流に、植物細胞等の宿主細胞で機能可能なターミネーターを連結させてもよい。
　植物細胞で機能可能なターミネーターとは、植物細胞等の宿主細胞に導入するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（構造遺伝子）の塩基配列の下流３’−側に接合し、当該構造遺伝子を含む転写ＲＮＡを転写安定化するためのポリアデニン配列を付加させる機能を持つ塩基配列である。植物細胞で機能可能なターミネーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーター等のＴ−ＤＮＡ由来の構成型ターミネーター、ニンニクウィルスＧＶ１、ＧＶ２のターミネーター等の植物ウィルス由来のターミネーター、ＷＯ２０００／０２０６１３に記載される植物ターミネーター等を挙げることができる。
　本発明の栽培方法の栽培対象となる植物としては、例えば、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ、ミヤコグサ、クローバ、ピーナッツ、スイートピー、クルミ、チャ、ワタ、コショウ、キュウリ、スイカ、カボチャ、メロン、ダイコン、ナタネ、キャノーラ、テンサイ、レタス、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、シロイヌナズナ、タバコ、ナス、ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ、キクイモ、トマト、ホウレンソウ、アスパラガス、ニンジン、アマ、ゴマ、エンダイブ、キク、フウロウソウ、キンギョソウ、カーネーション、ナデシコ、ニチニチソウ、ブバルディア、カスミソウ、ガーベラ、トルコキキョウ、チューリップ、ストック、スターチス、シクラメン、ユキノシタ、ノースポール、スミレ、バラ、サクラ、リンゴ、ナシ、ブドウ、イチゴ、ウメ、アーモンド、ミカン、レモン、バナナ、マンゴー、パパイヤ、キウイ、コーヒー、ボケ、サツキ、ツツジ、ポインセチア、ナンヨウアブラギリ、キャッサバ、アブラヤシ、ココヤシ、オリーブ、リンドウ、コスモス、アサガオ、ヒマワリ、イチョウ、スギ、ヒノキ、ポプラ、マツ、セコイア、オーク、ヤナギ、ユーカリ、ケナフ、スイレン、トチュウ、ブナ、ヒマ、タケ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、ソルガム、シバ、トールフェスキュー、スイッチグラス、ススキ、ネギ、タマネギ、ニンニク、ユリ、オニユリ、ラン、グラジオラス、パイナップルを挙げることができ、宿主細胞としては、これらの植物に由来する植物細胞を挙げることができる。
　宿主細胞である植物細胞としては、植物組織、植物個体、培養細胞、種子等の各種の植物細胞を用いることができる。
　植物細胞等の宿主細胞で機能可能なプロモーター及びターミネーターが接続された前記構造遺伝子を有するＤＮＡを、植物細胞等の宿主細胞に導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウム感染方法（特公平２−５８９１７号公報及び特開昭６０−７００８０号公報）、プロトプラストへのエレクトロポレーション方法（特開昭６０−２５１８８７号公報及び特開平５−６８５７５号公報）、又はパーティクルガン方法（特表平５−５０８３１６号公報及び特開昭６３−２５８５２５号公報）等の方法等を挙げることができる。
　この際、例えば、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等から選ばれる選択マーカー遺伝子と、ＰＰＯ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ又は本除草活性化合物サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとを同時に植物細胞等の宿主細胞に導入すると、導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。当該選択マーカー遺伝子と、ＰＰＯ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ又は本除草活性化合物サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとを同一のベクター上に直列に組み込み、これを導入してもよいし、当該選択マーカー遺伝子を有するベクタープラスミドと、ＰＰＯ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ又は本除草活性化合物サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとを同時に導入してもよい。
　また、本除草活性化合物サフルフェナシルが添加された培地で、目的とする遺伝子を含むベクターが導入された植物細胞を培養し、増殖可能なクローンを単離することによって、目的とする遺伝子が導入された形質転換体、即ち、サフルフェナシルを用いてプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ阻害型除草活性化合物耐性の細胞を選抜することができる。前記培地に添加するサフルフェナシルの濃度は、例えば０．００１~１．０ｐｐｍ、好ましくは０．０１~０．１ｐｐｍを挙げることができる。また、前記耐性に関しては、サフルフェナシルが添加された培地にて、例えば１~２週間毎に２~３回継代し、明条件下にて培養し細胞の増殖を観察すればよい。
　このようにしてサフルフェナシルを用いてプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ阻害型除草活性化合物（例、サフルフェナシル）耐性の細胞を選抜する方法もまた、本発明の一態様である。
　ＰＰＯ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとサフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとの両ＤＮＡを植物に導入する方法としては、（１）当該両ＤＮＡを混合して同時に同一植物細胞に導入する方法、（２）当該両ＤＮＡが直列に接続されてなるＤＮＡを同一植物細胞に導入する方法、のいずれであってもよい。
　形質転換体が当該両ＤＮＡを保有していることは、当該形質転換体から調製されたＤＮＡについて、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等に記載される遺伝子工学的分析方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等）を用いて解析を行うことにより確認すればよい。
　具体的には例えば、モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編（島本功、岡田清孝監修、秀潤社１９９６年）、第４章に記載される方法に準じて、当該ＤＮＡのいずれかあるいは両方が導入されたイネやシロイヌナズナを得ることができる。また、特開平３−２９１５０１に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いてダイズ不定胚に導入して、当該ＤＮＡのいずれかあるいは両方が導入されたダイズを得ることができる。同様に、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８；ｐ８３８（１９９０）に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いてトウモロコシ不定胚に導入し、当該ＤＮＡのいずれかあるいは両方が導入されたトウモロコシを得ることができる。同様に、宅見ら著、育種学会雑誌、１９９５年、第４４巻、別冊１号、５７頁に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培養したコムギ未熟胚盤に導入し、当該ＤＮＡのいずれかあるいは両方が導入されたコムギを得ることができる。同様に、萩尾ら著、育種学会雑誌、１９９５年、第４４巻、別冊１号、６７頁に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培養したオオムギ未熟胚盤に導入し、当該ＤＮＡのいずれかあるいは両方が導入されたオオムギを得ることができる。
　このようにして作製された形質転換体から、例えば、「植物細胞組織培養　　実際・応用・展望」（原田、駒嶺編集、理工学社１９７９年）、６５−１１８頁等に記載される植物細胞培養法に準じて植物体を再生させることによって、当該ＤＮＡのいずれかあるいは両方が導入された形質転換植物を得ることができる。
　さらに、当該ＤＮＡのいずれかあるいは両方が導入され、発現する形質転換植物と目的とする品種の植物とを交配させることにより、目的品種の植物の染色体に当該ＤＮＡのいずれかあるいは両方を導入し、当該ＤＮＡのいずれかあるいは両方が導入された目的品種の植物を取得することもできる。
　またＰＰＯ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、本除草活性化合物サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとを別個に異なる植物細胞に導入して、これを選抜及び個体再生させた後、再生された形質転換体の後代の系統を交配することによって、本発明に用いられる植物を作製することもできる。
　以下に、具体的な作物植物について、詳細に述べる。
　例えば、ダイズ由来の変異型ＰＰＯのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、あるいは、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片が導入された組換えダイズ系統とを作出するために、前記のＤＮＡ断片をそれぞれ独立して、特開平３−２９１５０１号公報に記載される方法に準じて、パーティクルガンを用いてダイズ不定胚に導入する。次いで、作出された組換えダイズ系統を交配することにより交配系統を得る。当該組換えダイズ系統あるいは交配系統における本除草活性化合物サフルフェナシルに対する耐性を調べるために、後述の実施例２等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物サフルフェナシルの散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
　例えば、トウモロコシ由来の変異型ＰＰＯのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、あるいは、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片が導入された組換えトウモロコシ系統とを作出するために、前記のＤＮＡ断片をそれぞれ独立して、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８；ｐ８３８（１９９０）に記載される方法に準じて、パーティクルガンを用いてトウモロコシ不定胚に導入する。次いで、作出された組換えトウモロコシ系統を交配することにより交配系統を得る。当該組換えトウモロコシ系統あるいは交配系統における本除草活性化合物サフルフェナシルに対する耐性を調べるために、後述の実施例２等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物サフルフェナシルの散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
　例えば、ワタ由来の変異型ＰＰＯのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、あるいは、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片が導入された組換えワタ系統とを作出するために、前記のＤＮＡ断片をそれぞれ独立して、アグロバクテリウム法を用いてワタに導入する。次いで、作出された組換えワタ系統を交配することにより交配系統を得る。当該組換えワタ系統あるいは交配系統における本除草活性化合物サフルフェナシルに対する耐性を調べるために、後述の実施例２等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物サフルフェナシルの散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
　例えば、ナタネ由来の変異型ＰＰＯのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、あるいは、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片が導入された組換えナタネ系統とを作出するために、前記のＤＮＡ断片をそれぞれ独立して、エレクトロポレーション法を用いてナタネに導入する。次いで、作出された組換えナタネ系統を交配することにより交配系統を得る。当該組換えナタネ系統あるいは交配系統における本除草活性化合物サフルフェナシルに対する耐性を調べるために、後述の実施例２等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物サフルフェナシルの散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
　例えば、コムギ由来の変異型ＰＰＯのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、あるいは、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片が導入された組換えコムギ系統とを作出するために、前記のＤＮＡ断片をそれぞれ独立して、宅見ら著、育種学会雑誌、１９９５年、第４４巻、別冊１号、５７頁に記載される方法に準じて、パーティクルガンを用いてコムギ未熟胚盤に導入する。次いで、作出された組換えコムギ系統を交配することにより交配系統を得る。当該組換えコムギ系統あるいは交配系統における本除草活性化合物サフルフェナシルに対する耐性を調べるために、後述の実施例２等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物サフルフェナシルの散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
　本発明栽培方法においては、本発明栽培方法にかかる植物を栽培する領域に、サフルフェナシルを主成分として含有する雑草防除剤を施用する。施用は、例えば、前記領域に当該雑草防除剤を散布することによって実施できる。当該雑草防除剤の施用量は、施用時期、雑草の種類等に応じて適宜決定すればよいが、好ましくは、例えば、１ヘクタールあたり、サフルフェナシルとして、１ｇ~１０００ｇを施用する。より好ましくは、１ヘクタールあたり、サフルフェナシルとして、１８ｇ~１２５ｇを施用する。
　散布の方法は、特に限定されず、雑草防除剤の形態に適した慣用の方法を採用すればよい。
　本発明栽培方法は、下記の（１）及び（２）のいずれか一方、または両方のＤＮＡが導入され、かつサフルフェナシル耐性を示す限り、広範な作物植物に好適に適用できる。
（１）サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（２）プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　すなわち、本発明栽培方法の栽培対象である植物は、ＰＰＯ活性を示すタンパク質と本除草活性化合物サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のいずれかが発現していてもよいし、一方のタンパク質が複数種同時に発現していてもよいし、両タンパク質を各々１種類のみを同時に発現していてもよいし、一方のタンパク質については１種類、他方のタンパク質については複数種を同時に発現していてもよいし、両タンパク質とも複数種を同時に発現していてもよい。本発明栽培方法にかかる植物においては、その体内で、本除草活性化合物サフルフェナシルが除草活性のより低い化合物へと速効的に代謝され、あるいは本除草活性化合物サフルフェナシルが当該植物のＰＰＯ活性を阻害できず、その結果として本除草活性化合物サフルフェナシルの施用において薬害をさらに軽減されることが可能となる。従って、本発明栽培方法の栽培対象である植物を栽培する領域又は培養する領域に本除草活性化合物サフルフェナシルを散布又は添加する場合にも本発明栽培方法にかかる植物は良好に生育することができる。
　本発明栽培方法によれば、栽培対象である作物植物以外の雑草等の植物を効率よく取り除くことができ、栽培対象である作物植物の収量の向上、高品質化、使用する雑草防除剤の量の軽減、省力化等が可能となる。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
　以下の実施例で用いられている植物に導入されているＤＮＡを以下に示す。
１６０９ｓｏｙ＃１７：配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
１６０９ｓｏｙ＃２５：配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
Ｐ０２３：配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
３５Ｓ−２：配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
Ｐ−６−１：配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、および配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
１５８４ｓｏｙ＃１６：配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
Ｊ１６：配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
Ｊ１８：配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
Ｊ２６：配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
Ｊ２８：配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
実施例１（リーフディスクを用いた耐性試験）
　ＥＰ１５９８４２３に記載の組換えタバコ系統１６０９ｓｏｙ＃２５およびＰ０２３のホモ接合体の種子、ＥＰ１５９８４２３に記載の組換えタバコ系統Ｐ−６−１の後代種子を１００ｍｇ／Ｌカナマイシンが添加されたＭＳ寒天培地に無菌播種し、カナマイシン耐性を示す植物を選抜した。播種後１ヵ月の選抜された植物の本葉を切断しリーフディスクを作製、サフルフェナシルが０．０１ｐｐｍ、０．０３ｐｐｍ、または０．１０ｐｐｍ添加されたＭＳ寒天培地上に静置した。陰性対照として、ＳＲ−１野生型タバコ種子をＭＳ寒天培地に無菌播種し、同様に播種後１ヵ月の植物の本葉を切断しリーフディスクを作製、サフルフェナシルが０．０１ｐｐｍ、０．０３ｐｐｍ、または０．１０ｐｐｍ添加されたＭＳ寒天培地上に静置した。その後８日目の状態を観察した。その結果の写真を図１に示す。ＳＲ−１野生型タバコでは、０．０１ｐｐｍで部分的に褐変が生じており、０．１０ｐｐｍでは全体的に白化した。一方、組換えタバコ系統１６０９ｓｏｙ＃２５では、０．０１ｐｐｍでは薬害が認められず、０．０３ｐｐｍで部分的に、０．１０ｐｐｍで全体的に褐変が生じた。また、組換えタバコ系統Ｐ０２３では、０．０３ｐｐｍまでは薬害が認められず、０．１０ｐｐｍで部分的に白化した。さらに、組換えタバコ系統Ｐ−６−１の後代植物では、０．１０ｐｐｍの濃度において薬害が認められなかった。
　各試験区について５個体からリーフディスクを作製しており、褐変あるいは白化の生じる薬害の程度に基づいてスコアリング評価を行った。結果を表１に示す。スコアリングの基準は以下の通り。
「０」：リーフディスクが全体的に白化
「１」：リーフディスクが全体的に褐変
「２」：リーフディスクが部分的に褐変あるいは白化
「３」：リーフディスクへの薬害なし
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 図１の写真において、画像解析ソフト「Ｗｉｎ　ＲＯＯＦ　ｖｅｒ．６．１．０」（ＭＩＴＡＮＩ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で緑色部を色抽出してその面積を数値化し、画像全体の面積から培地部分の面積を差し引いた値で割ることにより、リーフディスク面積に対する緑色部面積の割合を算出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 実施例２（散布機による耐性試験　タバコ）
　ＥＰ１５９８４２３に記載の組換えタバコ系統１６０９ｓｏｙ＃１７、＃２５および１５８４ｓｏｙ＃１６、Ｐ０２３、３５Ｓ−２のホモ接合体の種子をＭＳ寒天培地に無菌播種する。次いで、発芽した個体をクレハ培土（クレハ化学製）が入れられた栽培ポットに移植し、人工気象室内で外部環境に馴化した後、人工気象室内で約２週間栽培する。陰性対照として、ＳＲ−１野生型タバコ種子をＭＳ寒天培地に無菌播種し、同様に人工気象室内で栽培する。このようにして得られる植物をサフルフェナシルの散布試験に供試する。サフルフェナシルを適当な溶媒に溶解し、アジバントを加え、水で希釈することにより散布液とする。
　植物への当該散布液の散布は、走行型薬剤自動散布機（難波設計社製）を用いて、散布液２０ｍＬを０．９平方メートルの散布範囲に置かれた組換えタバコおよび野生型タバコ苗に均一に噴霧して行う。約２週間後に、供試された組換えタバコにおけるサフルフェナシルに対する感受性を、ＳＲ−１野生型タバコにおけるサフルフェナシルに対する感受性と比較する。その結果、組換えタバコ系統１６０９ｓｏｙ＃１７、＃２５および１５８４ｓｏｙ＃１６、Ｐ０２３、３５Ｓ−２のホモ接合体はＳＲ−１野生型タバコと比較してサフルフェナシルに対する感受性が低い結果となり、サフルフェナシル耐性を示す。
　薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づいてスコアリング評価を行う。スコアリングの基準は以下の通り。
「０」：個体が枯死した場合
「１」：葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害が発生し、当該薬害が生育に対して大きな障害を与えているが、枯死していない場合
「２」：葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害は発生しているが、当該薬害が生育に対して大きな障害を与えておらず、枯死していない場合
「３」：葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害は軽微であるか、又は、殆ど見られない場合
実施例３（散布機による耐性試験　ダイズ）
　ＵＳ２００６０００９３６１に記載の組換えダイズ系統Ｊ１６、Ｊ１８、Ｊ２６、Ｊ２８のＴ２世代の種子をクレハ培土が入られたポットに播種し人工気象室内で約３週間栽培する。陰性対照として、野生型ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）の種子を、同様に人工気象室内で栽培する。このようにして得られる植物をサフルフェナシルの散布試験に供試する。上記実施例２の方法に従って、ダイズ苗への散布試験を実施する。約２週間後に、供試された組換えダイズにおけるサフルフェナシルに対する感受性を、野生型ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）におけるサフルフェナシルに対する感受性と比較する。その結果、組換えダイズ系統Ｊ１６、Ｊ１８、Ｊ２６、Ｊ２８は野生型ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）と比較してサフルフェナシルに対する感受性が低く、サフルフェナシル耐性を示す。
　本発明は、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ阻害剤に耐性の作物植物の栽培に利用することができる。

Claims (10)

  1. 下記の（１）及び（２）のいずれか一方、または両方のＤＮＡが導入されている作物植物を栽培する領域に、
    サフルフェナシルを有効成分として含有する雑草防除剤を散布する工程を有する、前記作物植物の栽培方法。
    （１）サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
    （２）プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
  2. 前記チトクロムＰ４５０が、放線菌由来のチトクロムＰ４５０である請求項１記載の栽培方法。
  3. 前記チトクロムＰ４５０が、下記のいずれかのチトクロムＰ４５０である請求項１記載の栽培方法。
    （１）ストレプトミセス属に属する放線菌由来のチトクロムＰ４５０
    （２）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
    （３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
    （４）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
  4. 前記プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、植物由来である請求項１記載の栽培方法。
  5. 前記プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、下記のいずれかのタンパク質である請求項１記載の栽培方法。
    （１）植物由来であって、かつサフルフェナシルによって阻害されるプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
    （２）植物由来であって、かつサフルフェナシルによって阻害されないプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
    （３）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
    （４）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
  6. 下記の（１）及び（２）のいずれか一方、または両方のＤＮＡを植物細胞に導入して発現させる工程、および、該植物細胞にサフルフェナシルを接触させる工程を有するプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ阻害型除草活性化合物耐性細胞の選抜方法。
    （１）サフルフェナシルを代謝する活性を示すチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
    （２）プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
  7. 前記チトクロムＰ４５０が、放線菌由来のチトクロムＰ４５０である請求項６記載の選抜方法。
  8. 前記チトクロムＰ４５０が、下記のいずれかのチトクロムＰ４５０である請求項６記載の選抜方法。
    （１）ストレプトミセス属に属する放線菌由来のチトクロムＰ４５０
    （２）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
    （３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
    （４）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムＰ４５０
  9. 前記プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、植物由来である請求項６記載の選抜方法。
  10. 前記プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、下記のいずれかのタンパク質である請求項６記載の選抜方法。
    （１）植物由来であって、かつサフルフェナシルによって阻害されるプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
    （２）植物由来であって、かつサフルフェナシルによって阻害されないプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
    （３）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
    （４）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ活性を示すタンパク質
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