WO2011007802A1 - 微生物培養シート及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

　高価な培養材料の使用を必要部分に限定することができ、製造時の工程が簡便であり、使用者が簡便かつ安定して使用することができる、微生物培養シートを提供する。　本発明の微生物培養シートは、基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、前記培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有する培地液がパターン形成されたものである微生物培養シート。

Description

微生物培養シート及びその製造方法

　本発明は、菌数検査等に用いられる微生物培養シートに関し、詳細には、培養層が基材シートの所定範囲にパターン形成されているため、培養材料の無駄が少なく、かつ操作が簡便な微生物培養シートに関する。

　微生物の存在を確認し、又は微生物数を測定する方法としては、寒天平板混釈法がある。この寒天平板混釈法では、あらかじめ滅菌したシャーレに形成した寒天培地を使用するので、寒天培地を高圧蒸気滅菌するためのオートクレーブや、微生物検査を無菌的に行うための検査室を必要とし、また、微生物のサンプリングから試料液の調製、分注、培地との混釈、培養、計数に至る微生物検査の操作に、熟練を要する。そこで、高度な熟練を必要とせず、簡便に微生物検査を行うことができる乾燥培地を備える微生物培養シートが開発されている。

　例えば、特許文献１には、防水性基体上に、ゲル化剤又は栄養成分を含有する冷水可溶粉末が接着剤により均一に接着された接着剤層を備えるシート状培養装置が開示されている。このシート状培養装置は、ゲル化剤及び微生物の発育培地に浸した濾紙を、接着層によりフィルムに接着させた従来の装置によれば、濾紙に透明性がないため、細菌コロニーの計数が困難であり、また、個々のコロニーの分離が難しいという問題に鑑みてなされたものであり、濾紙を介在させた装置の問題点を、接着剤を介してゲル化剤及び栄養成分を直接固定する方法により解決している。更に、特許文献１には、上記シート状培養装置の使用に際し、重みのある環状の輪のようなテンプレートを、カバーシートの上に一時的に置くことにより、被検液を特定の領域に限定して拡げる旨が記載されている。

　特許文献２には、基材と、該基材面上に形成された非吸収性の培養面を含む台座と、カバーシートとからなり、上記培養面及び／又はカバーシートの底面に培地を付着させたシート状培養装置が開示されている。このシート状培養装置は、基体に接着剤を介して冷水可溶粉末を接着する従来の方法によれば、不規則な形状及び寸法の接着物となるため、ゲル化剤、栄養分、阻害剤、指示薬等の培地構成成分を好適な濃度に維持することができないという問題に鑑みてなされたものである。特許文献２に記載されたシート状培養装置によれば、使用者は、特別な設備や操作を必要とすることなく、均一な形状及び寸法に水性試料を拡散させることができる。なお、特許文献２の実施例では、以下の方法によりシート状培養装置を製造している。まず、台座基部の一方の面上にガムを含むブイヨン溶液である培地液をコーティングした後、温度１００℃で水分を蒸発させる。次いで、上記台座基部の他方の面上に、感熱接着剤、ポリスチレン発泡体、及びポリアクリルアラートＰＳＡを貼り合わせ、得られた積層体を直径５．１ｃｍに打ち抜く。この打ち抜いた積層体を、基材面上に、ＰＳＡ側が下になるように貼り合わせた後、カバーシートを上記基材の縁に付着させることにより、シート状の培養装置を製造している。

　特許文献３には、方形の粘着シート上に、円形の多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層とを積層し、その上に更に方形の透明フィルムが配設された微生物培養器が開示されている。この微生物培養器では、多孔質マトリックス層上に試料液が添加されることによって、試料液が多孔質マトリックス層に保持される。そして、この保持された試料液の水分によって、多孔質マトリックス層に接した水溶性高分子化合物層が溶解し、水溶性高分子化合物水溶液が生じ、この高分子化合物水溶液と、生育栄養成分とによって微生物が生育しうる環境となる。なお、この微生物培養器では、溶解した水溶性高分子化合物層が高粘度溶液であるため、微生物が水溶性高分子化合物層内部までは侵入せず、溶解した水溶性高分子化合物層と、多孔質マトリックス層とが一体化する工程において、微生物が多孔質マトリックス層の表面まで押し上げられる。そのため、コロニーは、多孔質マトリックス層の表面又は表面近傍に形成される。この微生物培養器は、上記多孔質マトリックス層が上になるように粘着シートに接着させ、更に、上記多孔質マトリックス層に接するように透明フィルムを被覆させることにより、軽量で嵩が低く、かつ取り扱いが容易なシート状微生物培養器として使用することができる。なお、上記水溶性高分子として、鹸化度７５～９５％、分子量２５０００～２５００００のポリビニルアルコールが開示されている。

　特許文献４には、防水性の基材シートの全面に、培地混合物や吸水性樹脂を塗布して培養層を形成し、該培養層の上に、接種する被検液の拡がりを一定にするための疎水性インキによる外枠層が形成されている微生物培養シートが開示されている。なお、特許文献４の実施例では、厚さ１００μｍの透明な２軸延伸ポリエステルフィルムを基材シートとし、該基材シート上に、ポリエチレンオキシドのトルエン溶液に栄養成分及びトリフェニルテトラゾリウムクロライドを配合した培養層形成用塗工液を、コンマコーターにより乾燥時の塗工量が３０ｇ／ｍ^２となるように塗工し、形成された培養層の上に、疎水性インキのスクリーン印刷により、外枠層となる内径５０ｍｍ、外径７０ｍｍのドーナッツ状パターンを形成している。

特公平２－４９７０５号公報 特表２００４－５１５２３６号公報 国際公開ＷＯ０１／０４４４３７号公報 特開平８－２８０３７７号公報

　ところで、微生物の培養材料は高価であるため、その使用量は低減できることが好ましい。しかしながら、特許文献４では、基材フィルム上の全域に培養層が積層されており、微生物の培養に必要な部分以外にも培養層が形成されているため、高価な材料に無駄が生じている。また、特許文献２、特許文献３でも、培地液をフィルム上に全面コーティングした後、その一部分を打ち抜き、基材に貼り付けたものを培養層としている点において、やはり材料に無駄が生じている。

　また、微生物培養シートは、製造時の工程が簡便であることが好ましい。この点、上記特許文献１に記載された培養装置は、ゲル化剤や栄養成分である冷水可溶粉末を接着剤により基体に均一に接着させて培養層を形成していることから、簡便な方法であるといえるが、この方法では微生物が容易に接着剤成分に接触する。そのため、接着剤成分が微生物の発育に影響を及ぼす可能性があるため、好ましいとはいえない。これに対して、特許文献２に記載されたシート状培養装置では、接着剤を使用せずに、ポリエステルフィルム等からなる台座基部の上に、ゲル化剤としてグアービーンガムを含むブイヨン溶液をコーティングすることにより培養層を形成している。しかしながら、特許文献２に記載されたシート状培養装置は、上記のように、培地液をフィルムに全面コーティングした後、打ち抜き加工し、得られた打ち抜き加工品を接着剤により基材に貼り付けて培養層を形成しているため、製造工程が煩雑である。特許文献３に記載された微生物培養器も、特許文献２に記載されたシート状培養装置と同様の操作を行うため、やはり製造工程が煩雑である。

　特許文献２に記載されたシート状培養装置では、培地溶液が水を含むことから、加熱乾燥を高温条件下で行う必要があり、栄養成分、ゲル化剤、発色指示薬、基質、及び基材が加熱によって分解されるおそれがある。そのため、使用できる栄養成分やゲル化剤、発色指示薬、基質、及び基材が制限される。これは、ポリビニルアルコール水溶液を使用する特許文献３に記載された微生物培養器についても同様である。特許文献４に記載された微生物培養シートでは、培地混合物としてポリエチレンオキシドのトルエン溶液を使用しているが、トルエンも１００℃を超える高沸点の有機溶媒であることから、やはり使用できる材料が制限される。

　更に、被検液の接種作業は、迅速に行うためにも簡便であることが好ましい。しかしながら、特許文献１に記載された培養装置では、被検液の拡がりを制御するために、重みのある環状の輪のようなテンプレートをカバーシートの上に一時的に置き、被検液を特定の領域に限定する必要があり、作業が簡便とは言い難い。また、特許文献３に記載された微生物培養器では、被検液の拡がりを抑えるために培養層を多孔質マトリックスで構成している。そのため、被検液の吸水時間が長くなり、使用者に作業時間のロスが発生しやすい。また、特許文献３に記載された微生物培養器では、培養時の乾燥を防ぐために、被検液接種後の培養層にカバーシートを被覆させるが、上記培養層は吸水して体積が増加しているため、粘着シートとカバーシートとを慎重に密着させなければ、培養時の乾燥の原因となる隙間が生じる場合がある。また、吸水後に培養層を押さえつけると、被検液が多孔質マトリックスから染み出すことがあり、作業者は慎重に作業を行う必要がある。この点でも作業時間のロスが発生しやすい。

　特許文献４に記載された微生物培養シートでは、接種する被検液の拡がりを一定にするために、疎水性インキによる外枠層が設けられている。この外枠層は培養層の上に形成されているため、被検液の滴下によって外枠層の下部が含水し、外枠層が崩れたり、外枠層の下部及び外周に被検液が浸潤したりする場合があり、安定した使用が困難である。

　そして、微生物検査では、コロニーの計数が正確に行える必要がある。しかしながら、特許文献１、特許文献２では、紙基材の上面だけでなく、カバーシートにも培養層を形成するため、十分な視認性が得られない場合がある。また、特許文献３に記載された微生物培養器は、培養層が多孔質マトリックスで構成されているため、菌体が多孔質マトリックスに入り込む。そのため、菌体の増殖が進行すると、発生したコロニーが視認し難くなり、特に、菌体が接近して増殖した場合には、コロニー計数が難しくなる場合がある。

　本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、高価な培養材料の使用を必要部分に限定することができ、製造時の工程が簡便であり、使用者が簡便かつ安定して使用することができる、微生物培養シートを提供することを目的とする。

　本発明は、微生物培養シートについて詳細に検討した結果、（１）基材シート上に培養層を印刷や塗布によりパターン形成することにより、高価な培地材料の使用を低減し得ること、（２）培地液として、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種を含有するポリビニルピロリドン溶液を使用することにより、所定形状の培養層を安価かつ簡便にパターン形成により形成し得ること、（３）培地液に使用する溶媒としてアルコール溶液を使用することにより、溶媒除去の際に生じ得る配合成分の変質を防止し得ること、及び（４）培養層をパターン形成することにより、環状のテンプレートを用いることなく、被検液の吸水を待たずにカバーをするだけで被検液が一定面積に広がり、そして、更に枠層を形成することにより、被検液の遺漏を防止し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明では、基材シートと、上記基材シートの上に形成された培養層と、上記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、上記培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有する培地液がパターン形成されたものである微生物培養シートを提供する。

　また、本発明では、基材シートと、上記基材シートの上に形成された培養層と、上記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートの製造方法であって、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種を含有させた培地液を、上記基材シートの上にパターン形成した後、上記培地液に含まれる上記アルコールを除去して上記培養層を形成する培養層形成工程を含む微生物培養シートの製造方法を提供する。

　基材シートと、上記基材シートの上に形成された培養層と、上記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートの製造方法であって、上記基材シートは、上記培養層が形成された際に上記培養層の外周を囲む凸形状の疎水性樹脂からなる枠層があらかじめ形成されており、上記枠層の内側に、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液にゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種を含有させた培地液をパターン形成した後、上記培地液に含まれる上記アルコールを除去して上記培養層を形成する微生物培養シートの製造方法を提供する。

　本発明の微生物培養シートによれば、基材シート上に培養層がパターン形成されているので、微生物の培養材料の使用を必要な部分にのみ限定することが可能となり、高価な材料の使用量を低減することができる。また、本発明の微生物培養シートによれば、ポリビニルピロリドンを培地液の必須成分としているので、所定形状の培養層を安価かつ簡便にパターン形成することができる。更に、本発明の微生物培養シートは、培養層がパターン形成されているので、被検液の滴下後に、速やかにカバーシートを被覆することで、被検液が自然に一定範囲に拡がり操作性に優れる。

　本発明の第一の微生物培養シートの製造方法によれば、基材シート上に培養層をパターン形成するので、高価な材料の無駄を回避することができる。また、パターン形成は、印刷や塗布等の安価な方法であるため、製造コストの低減も可能となる。更に、本発明の第一の微生物培養シートの製造方法によれば、培地液によるパターン形成に際し、溶剤としてアルコールを使用するので、溶剤の除去が容易であり、かつ、溶剤の沸点が低いため、配合成分の熱分解を効率的に回避することができる。

　本発明の第二の微生物培養シートの製造方法は、基材シート上に、培養層が形成された際に該培養層の外周を囲む凸形状の疎水性樹脂からなる枠層があらかじめ形成されているので、被検液を接種しても枠層が崩れず安定しており、作業の操作性及び安定性に優れる。また、本発明の第二の微生物培養シートの製造方法によれば、基材シート上に、培養層の外周を囲む枠層が形成されているので、被検液の遺漏をより確実に防げ、接種時の作業効率を向上させることできる。

本発明に係る微生物培養シートの一例を示す平面図（ａ）及び断面図（ｂ）であり、基材シートの略中央に円形の培養層が形成されている態様を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す断面図であり、図２（ａ）は、基材シートが多層構造である態様を示す図であり、図２（ｂ）は、培養層が多層構造である態様を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す展開図（ａ）及び断面図（ｂ）であり、基材シートに培養層、カバーシートに特定成分層が形成されている態様を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す平面図（ａ）及び断面図（ｂ）であり、基材シートの上に培養層と枠層とが形成されている態様を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す断面図であり、基材シートの上に培養層と枠層が形成され、特定成分層が上記枠層の内側に対向するように、カバーシートに形成されている態様を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す断面図であり、基材シートの上に培養層と枠層が形成され、特定成分層が上記枠層の内側に対向するように、また、粘着層が上記枠層と対向するように、カバーシートに形成されている態様を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例であって、基材シートの上に枠層が形成されている断面図であり、図７（ａ）は、基材シートが多層構造である態様を示す図であり、図７（ｂ）は、培養層が多層構造である態様を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図であって、基材シート上に外周を枠層で囲まれた複数の培養層が形成され、カバーシートが基材シートに固設されている態様を示す平面図（ａ）及び断面図（ｂ）である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図であって、カバーシートが連設されている基材シート上に、外周を枠層で囲まれた培養層が形成されている態様を示す展開図（ａ）、断面図（ｂ）、及び上記カバーシートが折り曲げられ、培養層が被覆されている態様を示す断面図（ｃ）である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図であって、カバーシートが両面接着テープによって培養層が形成されている基材シートに固設されている態様を示す断面図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図であって、カバーシートが両面接着テープによって培養層と枠層とが形成されている基材シートに固設されている態様を示す断面図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す外観斜視図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例であって、基材シートの上に枠層が形成されている外観斜視図である。 実施例１の微生物培養シートのコロニー発生状態を示す図である。 実施例６の微生物培養シートのコロニー発生状態を示す図である。

　以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において適宜変更を加えて実施することができる。

［微生物培養シート］
　本発明の微生物培養シートは、基材シートと、上記基材シートの上に形成された培養層と、上記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、上記培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有する培地液がパターン形成されたものである。

　本発明の微生物培養シートは、上記培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されていることが好ましい。また、上記ゲル化剤は、高分子多糖類であることが好ましい。更に、上記培地液における上記ゲル化剤の含有量は、上記ポリビニルピロリドン１００質量部に対して１００～６００質量部であることが好ましい。そして、上記基材シート及び／又は上記カバーシートは、透明プラスチックシートからなることが好ましく、上記カバーシートは、基材シートに固設されているものであってもよい。

　（１）微生物培養シートの構成
　本発明の微生物培養シートの好適な態様の一例を図１（ａ）、（ｂ）に示す。図１（ａ）は平面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ－Ａ’断面図である。

　図１は、方形の基材シート（１０）の略中央に培養層（３０）が形成され、かつ上記培養層（３０）を被覆するように、方形のカバーシート（４０）が設けられている態様を示す。本発明では、基材シート（１０）に培養層（３０）がパターン形成されている点に特徴があり、図２（ａ）の断面図に示すように、基材シート（１０）は、基材シート（１１）と、基材シート（１３）との２層からなる多層シートであってもよく、更に、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。また、図２（ｂ）に示すように、培養層（３０）が２層以上の多層で構成されていてもよい。

　パターン形成により調製された培養層（３０）の形状は、図１に示す円形に限定されるものではなく、正方形、長方形、その他の多角形、不定形であってもよい。

　本発明の微生物培養シートは、図３（ａ）の展開図に示すように、基材シート（１０）とカバーシート（４０）との双方に、培養層（３０）と、バインダー成分及び栄養成分その他の成分を含有する特定成分層（３０’）と、がそれぞれ形成されていてもよい。例えば、培養層（３０）と、上記特定成分層（３０’）との双方にゲル化剤が含まれている場合には、基材シートの上の培養層（３０）と、カバーシート（４０）に設けられた特定成分層（３０’）とが対向して配設されるため、例えば、基材シート（１０）の上の培養層（３０）に被検液を接種した後に、カバーシート（４０）で培養層（３０）を被覆すると、上記被検液が培養層（３０）と特定成分層（３０’）とに吸水され、培養層（３０）と特定成分層（３０’）との双方で微生物を観察することができる。また、指示薬によっては、培養層（３０）に含有させると滅菌処理時に着色が目立つものもあり、その場合には、上記指示薬を特定成分層（３０’）に含有させることで、滅菌処理時の着色を防止することができる。なお、図３（ｂ）は、横断面図である。

　また、本発明の微生物培養シートは、図４（ａ）の平面図及び図４（ｂ）のＡ－Ａ’線断面図に示すように、基材シート（１０）の略中央に培養層（３０）が形成され、上記培養層の外周に円形の枠層（２０）が形成されたものであってもよい。枠層（２０）によれば、培養層（３０）に接種した被検液の吸水範囲をより確実に限定することができる。なお、枠層（２０）の形状は円形に限定されるものではなく、方形、楕円形、多角形、不定形等いずれであってもよいが、培養層（３０）に接種した被検液の吸水範囲が所定の面積を確保しうるように枠層が形成されていることが好ましい。また、この態様において、図５の断面図に示すように、更にカバーシート（４０）に、基材シート（１０）の上の培養層（３０）と対向するように特定成分層（３０’）が形成されていてもよい。

　更に、図６に示すように、上記枠層（２０）と対向するように、カバーシート（４０）に粘着層（５０）が形成されていてもよい。枠層（２０）と粘着層（５０）とが密着することで、培養層（３０）の乾燥や汚染をより効果的に防止することができる。

　本発明の微生物培養シートでは、図７の（ａ）の断面図に示すように、疎水性樹脂からなる枠層（２０）が基材シート（１０）の表面に形成されている場合であっても、基材シート（１０）は、基材シート（１１）と、基材シート（１３）との２層からなる多層シートの態様であってもよいし、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。また、図７（ｂ）の断面図に示すように、疎水性樹脂からなる枠層（２０）が基材シート（１０）の表面に形成されている場合であっても、培養層（３０）は２層以上の多層で構成されていてもよい。

　また、培養層（３０）は、基材シート（１０）の上に複数存在してもよい。複数の培養層（３０）と、それらの外周を囲む凸形状の疎水性樹脂からなる枠層（２０）と、上記培養層（３０）を被覆するカバーシート（４０）とが基材シート（１０）の端部で固設された態様を図８（ａ）、（ｂ）に示す。図８（ａ）は平面図であり、図８（ｂ）は、図８（ａ）のＡ－Ａ’断面図である。図８では、カバーシート（４０）は、培養層（３０）を被覆し、かつ枠層（２０）の上部に密着することができるように、２つの角部（Ｃ１，Ｃ２）が形成される態様となっている。なお、図８とは相違するが、上記基材シート（１０）上に形成された培養層（３０）と対向するように、カバーシート（４０）に特定成分層（３０’）が形成されていてもよい。

　上記培養層（３０）の等価円の直径は、好ましくは２０～８０ｍｍ、より好ましくは３０～７０ｍｍである。微生物培養シートに滴下する被検液は一般に１ｍｌであり、上記範囲であれば、十分に被検液を吸水することができる。

　なお、一般には、枠層（２０）の高さは、培養層の高さより１００～１２００μｍ高く、好ましくは２００～１０００μｍ高く、より好ましくは３００～８００μｍ高くなるように調製される。上記範囲であれば、培養層（３０）に被検液を接種後、カバーシート（４０）を被覆した際に、被検液の遺漏をより確実に防げ、また、培養層（３０）とカバーシート（４０）との間に空隙を作ることなく、被検液が枠層（２０）まで速やかに拡散される。また、被検液が培養層に吸水された後も、培養層（３０）とカバーシート（４０）との密着性を保つことができる。接種後の被検液の培養層による吸水を待たずに直ちにカバーシート（４０）を被覆することができるので、接種時の作業効率を向上させることができる。

　枠層の幅は、均一幅に限定されるものではないが、最細部が幅０．５～５．０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは１．０～３．０ｍｍである。上記範囲であれば、培養層が吸水して膨潤した場合であっても、枠層の形状が崩れるおそれがなく、被検液を所定の領域に拡げることができる。

　なお、枠層は単一のものであってもよく、また、上記枠層の外側に更に枠層が形成された２重枠からなる枠層であってもよい。

　（２）基材シート
　本発明の微生物培養シートでは、基材シートの上に、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有する培地液をパターン形成するため、基材シートは、耐溶媒性、印刷適性を有する必要がある。また、微生物培養シートとして、耐水性も要求され、培養層を形成する際の乾燥処理に耐える耐熱性を有することも要求される。基材シートは、単層でもよく、２層以上の積層シートであってもよい。

　基材シートが単層の場合には、例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等のプラスチックシートを好適に使用することができる。これらのプラスチックシートによれば、透明性に優れるため、基材シートからの透過光によっても微生物コロニーを観察することができ、視認性が向上する。ただし、発泡により白色を呈するもの、いずれかに着色されたものも使用することができる。培養菌によっては、透明に限定されず、着色により生育させたコロニーを計数しやすい場合があり、適宜選択することができる。

　また、積層シートとしては、上記プラスチックシートの２種以上を積層したものを例示することができる。また、上記プラスチックシートに紙基材を積層した積層シートや紙基材に合成樹脂をコーティングした積層シート等も好適に使用することができる。このような積層シートとしては、例えば、ポリエチレンフィルムと紙基材との積層シートを例示することができる。

　更に、合成樹脂を主原料とした合成紙も基材シートとして使用することができる。このような合成紙として、ユポ・コーポレーション製、商品名「ユポ」や東洋紡製、「クリスパー」等を例示することができる。

　本発明で使用する基材シートは、上記培養層との密着性を向上させるため、あらかじめ培養層をパターン形成する側に、表面処理を行ったものであってもよい。このような表面処理としては、コロナ放電処理、オゾン処理、酸素ガス若しくは窒素ガス等を用いた低温プラズマ処理、グロー放電処理、化学薬品等を用いて処理する酸化処理、その他の前処理等がある。

　また、本発明で使用する基材シートは、あらかじめアンカーコート剤を塗布し、表面処理を行ったものであってもよい。このようなアンカーコート剤としては、イソシアネート系（ウレタン系）、ポリエチレンイミン系、ポリブタジエン系、有機チタン系、その他のアンカーコーティング剤が例示できる。より好ましくは、例えば、トリレンジイソシアナート、ジフェニルメタンジイソシアナート、ポリメチレンポリフェニレンポリイソシアナート等の芳香族ポリイソシアナート、又はヘキサメチレンジイソシアナート、キシリレンジイソシアナート等の脂肪族ポリイソシアナート等の多官能イソシアナートと、ポリエーテル系ポリオール、ポリエステル系ポリオール、ポリアクリレートポリオール、その他のヒドロキシル基含有化合物との反応によって得られるポリエーテルポリウレタン系樹脂、ポリエステル系ポリウレタン系樹脂、ポリアクリレートポリウレタン系樹脂を主成分とするものである。

　基材シートは、カール等がなく平坦であることが好ましく、その厚さは、特に限定されないが、通常、２５～１５００μｍ、好ましくは５０～５００μｍである。

　（３）培養層
　本発明の微生物培養シートにおいて、基材シートの上に設ける培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有する培地液がパターン形成されたものであり、ポリビニルピロリドンを培地液の必須の成分とする。

　（ｉ）ポリビニルピロリドン
　本発明の微生物培養シートでは、ポリビニルピロリドンは、培地液の必須の成分であり、培地液の粘度調整としての役割を有する。ポリビニルピロリドンによれば、溶媒中の濃度を調整することで容易に粘度調整することができるので、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種を均一に分散させることができ、また、必要な部分にのみパターン形成することが可能となり、高価な材料の無駄が生じない。しかも、パターン形成後に溶媒を除去すると、ポリビニルピロリドンは皮膜性が高いので、ゲル化剤や栄養成分を取り込んで成膜可能である。また、基材とも良好な密着性を有するので、接着剤を使用せずに培養層を形成することができ、従来の微生物培養シート等のように、接着剤成分によって微生物の発育に影響が現れるおそれがない。

　（ｉｉ）ゲル化剤
　本発明の微生物培養シートでは、培地液にゲル化剤が含有されていてもよい。ゲル化剤を含有する培地液をパターン形成することにより形成された培養層は、被検液を接種すると増粘若しくはゲル化するため、菌の育成に良好な粘度となる。また、増粘後にはカバーシートに密着し得るため、培養時の培養層の乾燥を抑制することができる。

　このようなゲル化剤としては、高分子多糖類を好適に使用することができ、カラギーナン、グアーガム、キタンサンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ローカストビーンガム、アルギン等を例示することができる。これらの高分子多糖類によれば、被検液の滴下によって水で増粘又はゲル化するため、菌の発育が良好となり、また、透明性が高いためコロニーの視認性に優れ、更に、増粘によりカバーシートに密着するため、培養時の乾燥を抑制することが可能となる。本発明の微生物培養シートでは、これらの中でも、特にグアーガムを好適に使用することができる。グアーガムは、低濃度で極めて高い粘度を呈するため、少量で菌の発育に適した環境を作ることができるからである。なお、グアーガムは、一年生の豆科植物、グアーの種子の胚乳部より製造される。

　（ｉｉｉ）栄養成分
　本発明の微生物培養シートでは、培地液に栄養成分が含有されていてもよい。栄養成分としては、例えば、一般生菌検査用であれば、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等や、これらにリン酸二カリウム及び／又は塩化ナトリウムを加えた混合物が用いられる。大腸菌・大腸菌群検査用であれば、デソキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム等が用いられる。ブドウ球菌用であれば、肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・マンニット・卵黄混合物、ペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物等が用いられる。ビブリオ用であれば、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁等が用いられる。腸球菌用であれば、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム等が用いられる。真菌用であれば、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物等が用いられる。本発明の微生物培養シートでは、これらの中から発育させようとする微生物に応じて一種又はそれ以上の栄養成分を選択し、混合して使用することができる。なお、培養層中に栄養成分を含まない場合や不足する栄養成分がある場合には、被検液に栄養成分を加え、微生物を生育してもよい。

　（ｉｖ）発色指示薬、選択剤、基質等他の成分
　本発明の微生物培養シートでは、培地液に発色指示薬、選択剤、基質等他の成分が含有されていてもよい。

　発色指示薬は、培養過程で発育する微生物の代謝により産出される特異物質との反応、ｐＨ変化の認識、酵素との反応等によって発色してコロニーを着色するため、コロニー数の計数を極めて容易にする効果がある。このような発色指示薬としては、具体的には、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（以下ＴＴＣと表示）、ｐ－トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ペテトリルテトラゾリウムブルー等のテトラゾリム塩やニュートラルレッド混合物、フェノールレッド、ブロムチモールブルー、チモールブルー混合物等のｐＨ指示薬がある。

　培地液には、検出目的以外の微生物の生育を抑える選択剤が含有されていてもよい。このような選択剤としては、抗生物質、合成抗菌剤等の抗生剤、色素、界面活性剤、無機塩等が用いられる。抗生物質としては、メチシリン、セフタメタゾール、セフィキシム、セフタジジム、セフスロジン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、リファンピシン、ノボビオシン、コリスチン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等を例示することができ、合成抗菌剤としては、サルファ剤、ナリジクス酸、オラキンドックス等を例示することができる。また、色素としては、静菌又は殺菌作用のあるクリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーン、メチレンブルー等を例示することができる。また、界面活性剤としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ７、ドデシル硫酸塩、ラウリル硫酸塩等を例示することができる。また、無機塩類としては、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム、塩化リチウム、シュウ酸塩、高濃度の塩化ナトリウム等を例示することができる。これら以外にもタウロコール酸塩、グリシン、胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸塩等を用いることができる。

　これらの成分は、粉末で添加してもよいし、また、これらを溶媒に溶解した後、例えば、上記ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に混合し、培地液としてもよい。なお、発色指示薬の種類によっては滅菌処理時に着色が目立つものもあり、培養層に含有させず、被検液に発色指示薬を含んだものを使用して発色させてもよい。

　また、本発明の微生物培養シートでは、培養層を１層で形成する場合に限定されず、２層以上の多層で構成することができる。例えば、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）を含有する培地液で第１培養層を形成し、その上にポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）と栄養成分（ｉｉｉ）を含有する培地液で第２培養層を形成し、本発明で使用する培養層としてもよい。また、第１培養層のみにゲル化剤を配合してもよく、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）を含有する培地液で第１培養層を形成し、その上にポリビニルピロリドン溶液（ｉ）に栄養成分（ｉｉｉ）を含有する培地液で第２培養層を形成し、本発明で使用する培養層としてもよい。

　また、発色指示薬や選択剤の組み合わせによっては混合により反応を起こす場合があり、これらを別の層に含有させることで混合反応を防ぐことができる。また、発色指示薬を最上層に形成することでコロニーの視認性を向上させることができる。したがって、例えば栄養成分に混合反応を形成する成分ＡとＢとが含有される場合には、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋栄養成分（ｉｉｉ）からＡ成分を除去した第１培養層と、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋発色指示薬（ｉｖ）＋栄養成分（ｉｉｉ）からＢ成分を除去した第２培養層との２層を積層して培養層としてもよく、また、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋栄養成分（ｉｉｉ）からＡ成分を除去した第１培養層、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋栄養成分（ｉｉｉ）からＢ成分を除去した第２培養層、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋発色指示薬（ｉｖ）からなる第３培養層との３層を順次積層して培養層としてもよい。また、混合反応は、栄養成分に含有される場合に限定されず、選択剤や発色指示薬との関係で生じる場合もある。いずれの場合でも、成分ＡとＢとを別の層に区分することで、混合反応を回避することができる。

　なお、本発明では、培養層が多層で構成される場合に、多層構造を構成するいずれかの培養層が、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種とを含有する培地液がパターン形成されたものであればよく、他の層の組成は上記に限定されるものではなく、パターン形成の方法も問わない。

　（ｖ）パターン形成
　本発明の微生物培養シートにおける培養層は、上記基材シートの上に上記培地液がパターン形成されたものである。本発明の微生物培養シートでは、培養層がパターン形成されているので、被検液の滴下後に速やかにカバーシートを被覆することで、被検液が自然に一定範囲に拡がり操作性に優れる。本発明において、「パターン形成」とは、上記基材シートの上に、上記培地液を予定した形状に印刷、塗布、塗工、噴霧等することをいい、その方法は、特に限定されるものではない。したがって、パターン形成には、スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷、その他の印刷、ディスペンサーやインクジェット等による塗布、バー等を使用してコーティングするバーコートやナイフコート、ダイコート等の塗工、スプレー方式等の噴霧、その他の方法を使用することができる。

　（４）カバーシート
　本発明の微生物培養シートでは、カバーシートは、基材シートに固設されていることが好ましい。カバーシートは、培養中の落下菌等による汚染を防止すると共に、培養層の水分蒸発を防止する作用を有する。カバーシートは、防水性、水蒸気不透過性を有すると同時に、微生物の培養後、カバーシートを通してコロニーを観察及び計数できるように、透明であることが好ましく、例えば、上記基材シートで挙げたようなポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等のプラスチックシートを使用することができる。本発明の微生物培養シートでは、上記基材シートとカバーフィルムとが透明であれば、微生物培養シートの背面からの投射光で観察することもでき、また、側面からの入射光で観察することもできる。すなわち、カバーシート側からも基材シート側からもコロニーを観察及び計数することができるので、観察方法及び計測方法の選択の幅が広がることとなる。なお、カバーシートの開け閉め等の作業性を考慮すると、ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルムが特に好ましい。

　また、カバーシートには、基材シートの項で記載したコロナ放電処理等の表面処理がなされていてもよい。なお、カバーシートは、培養する微生物の種類により、適した気体透過性、主に酸素透過性、又は酸素非透過性を有することが好ましく、この点も考慮して選定するとよい。

　カバーシートは、被検液を接種するために基材シートから持ち上げる際に、適度の柔軟性が確保されることが好ましい。したがって、カバーシートの厚さは、１０～２００μｍ程度が好ましく、２０～７０μｍ程度が更に好ましい。なお、カバーシートは、どのような形状であってもよいが、雑菌の進入を防ぐために、培養層を被覆可能な培養層よりも大きいサイズとする必要がある。

　本発明の微生物培養シートでは、カバーシートに、基材シートに形成された培養層と対向する位置に、バインダー樹脂を溶解、又は分散した液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される１種以上を配合した特定成分溶液を塗布してなる特定成分層を有していてもよい。上記したように、本発明の微生物培養シートでは、基材シートに形成された培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤等とを含有する培地液がパターン形成されたものであり、発色指示薬を含まない態様とすることができる。このような場合、被検液に発色指示薬を添加して培養することもできるが、カバーシートにバインダー溶液とＴＴＣ試薬等の発色指示薬とからなる特定成分液をパターン形成して特定成分層を形成すれば、被検液に発色試薬を添加する手間を省くことができ、かつバインダーの密着性により、視認性も確保することができる。なお、バインダーとしては、ポリエチレンイミンやポリエチレンオキサイド、アクリル酸系ポリマー等の水溶性、又はアルコールに溶解する樹脂等を使用できる。なお、特定成分層に配合する成分の機能が発揮できれば、疎水性バインダーの溶解液や分散液等も使用することができる。

　なお、カバーシートにおける上記特定成分層は、少なくとも基材シートの培養層と対向する位置に存在すればよく、カバーシートの全面に塗布されたものであってもよい。バインダー溶液は安価であり、発色指示薬は使用量が少ないからである。なお、特定成分層は、ゲル化剤を含むものであってもよい。なお、上記特定成分層は、一層である場合に限定されず、２層以上の多層であってもよい。

　上記特定成分層の形成には、スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷、その他の印刷、ディスペンサーやインクジェット等による塗布、バー等を使用してコーティングするバーコートやナイフコート、ダイコート等の塗工、スプレー方式等の噴霧、その他の方法を使用することができる。なお、パターン形成してもよい。

　なお、本発明の微生物培養シートでは、カバーシートは微生物培養シートに固設されている場合に限定されない。したがって、別個に用意したカバーシートを用いて、被検液を接種した培養層を被覆してもよい。ただし、カバーシートがあらかじめ基材シートに固設させる態様であれば、操作が容易である。

　なお、基材シートに枡目印刷柄が印刷されていない場合、カバーシートに、あらかじめ水に不溶性で微生物の生育に影響を与えないインキで枡目印刷柄が印刷されていてもよい。印刷の版式は、基材シートと同様に、着色剤、樹脂、溶剤等の選択範囲が広い点でグラビア印刷等が好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。

　（５）枠層
　本発明の微生物培養シートでは、上記培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されていることが好ましい。枠層が形成されていると、被検液を培養層に接種し、カバーシートを被覆した場合に、被検液が枠層まで速やかに拡散されるため、培養層による被検液の吸水を待たずにカバーシートを被覆することができ、接種操作を短時間で行うことができる。また、枠層によって被検液の遺漏をより確実に防げ、接種時の作業効率を向上することできる。培養層にゲル化剤が含まれる場合には、被検液が枠層の内側にある培養層に吸水され、ゲル化剤が増粘し、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。また、培養層にゲル化剤が含まれない場合であっても、ポリビニルピロリドンが溶解し増粘するため、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。培養層とカバーシートとの密着性が優れると、カバーシートにコロニー形成のための層等を形成する必要がなく、コロニーの優れた視認性を確保することができる。

　枠層の幅は、均一幅に限定されるものではないが、最細部が幅０．５～５．０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは１．０～３．０ｍｍである。上記範囲であれば、培養層が吸水して膨潤した場合であっても、枠層の形状が崩れるおそれがなく、被検液を所定の領域に拡げることができる。

　本発明の微生物培養シートでは、基材シートの上に形成される枠層の高さは、培養層の高さより１００～１２００μｍ高く、より好ましくは２００～１０００μｍ高く、特に好ましくは３００～８００μｍ高く調製される。１００μｍより低いと、拡散した後に被検液の拡がりを抑制することができず、漏れが生じる場合がある。一方、１２００μｍを超えると、被検液接種時に培養層とカバーシートとの間に過度の空間部が発生するためカバーシートとの密着性を確保することが困難で、培養中に培養層が乾燥しやすくなり、又は、一旦カバーシートと培養層とが密着した場合でも、培養層に被検液が吸水された後、過度の空間によりカバーシートが培養層から剥がれ、培養層の乾燥を招く場合がある。上記範囲であれば、被検液を培養層に吸水させつつ全面に拡げることができ、かつ遺漏をより確実に防げ、カバーシートとの密着性も確保できる。

　また、上記枠層は、基材シートの上に形成される。培養層の上に枠層を形成すると、培養層が被検液の吸水により膨潤してゲル状となった際に、崩れるおそれがあるため、基材シートの上に直接形成されていることが好ましい。枠層が基材シートの上に形成されていれば、作業の操作性及び安定性に優れる。

　本発明の微生物培養シートでは、枠層が疎水性樹脂により形成されているので、枠層が吸水したり、溶解したりすることなく被検液の遺漏を防止することができる。枠層を形成する疎水性樹脂としては、特に限定されるものではなく、ＵＶ硬化樹脂、ホットメルト樹脂、熱発泡インクやＵＶ発泡剤等を好適に使用することができ、これらは着色されていてもよい。

　ＵＶ硬化樹脂としては、ラジカル型では、アクリレート系、不飽和ポリエステル系、カチオン型では、エポキシアクリレート系、オキセタン系、ビニルエーテル系等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。

　また、ホットメルト樹脂としては、軟化点温度が１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下のものを好適に使用することができる。１２０℃を超えると基材シートがカールする場合がある。本発明で好適に使用できるホットメルト樹脂としては、ウレタン系、ポリアミド系、ポリオレフィン系、ポリエステル系、エチレン酢酸ビニル系、スチレンブタジエンゴム系やウレタンゴム系等の合成ゴム系等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

　疎水性樹脂として、熱発泡インクやＵＶ発泡剤等も好適に使用することができる。例えば、バインダーとしてポリウレタン系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリアクリレート系樹脂、ポリエステル系樹脂、そして、塩素化ポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂、また、塩化ゴムや環化ゴム等のゴム類等を用いたインキを使用することができる。これらのインキは、単に疎水性であるというよりも撥水性であれば更に好ましく、この点から上記の樹脂にシリコーン類やワックス類を添加したインキは更に好ましい。特に、枠層に用いる疎水性樹脂は、疎水性、撥水性であると同時に、塗膜の厚さを厚くする必要があり、上記の樹脂に従来公知の発泡剤等を添加して、発泡インキとして使用することが効果的である。このようなＵＶ発泡インキとして、少なくともアクリレート反応性希釈剤又はメタクリレート反応性希釈等の反応性希釈剤と、ウレタンアクリレート光重合性オリゴマー、ポリエステルアクリレート光重合性オリゴマー、エポキシアクリレート光重合性オリゴマー、アクリル系光重合性オリゴマー、特殊光重合性オリゴマー等の光重合性オリゴマーと、光重合開始剤からなる紫外線硬化型インキに、無機発泡剤、有機発泡剤、液体発泡剤等の発泡剤を含有してなる紫外線硬化型発泡インキを例示することができる。

　なお、上記疎水性樹脂には、添加剤として、消泡剤、重合禁止剤、顔料分散剤等を添加してもよい。また、通常使用される着色顔料を、１５質量％未満の範囲で含有してもよい１５質量％を超えると、発泡を阻害するおそれがあるため好ましくない場合がある。

　本発明では、疎水性樹脂として、上記いずれも好適に使用できるが、特にＵＶ硬化樹脂やホットメルト樹脂が好適である。その理由は、枠層の形成は一定の高さを有するパターン形成が必要であり、これら２種の樹脂は非溶媒系の状態でディスペンサー等による塗布によって形状加工が容易であり、その後光照射や冷却によって容易に硬化させるだけでパターン形成できるからである。

　また、本発明の微生物培養シートでは、疎水性材料のくりぬき品を培養層の外周に接着して枠層を形成してもよい。更に、基材シートとしてエンボス加工品を使用する方法もある。例えば、枠層の形状として凸状が基材シートに形成されたエンボス加工品であれば、上記凸状の内側に培養層を形成すればよく、一方、培養層を形成する箇所を凹部で形成し、これより凸状で形成される残部を枠層として使用することができる。

　更に、基材シートとして厚い疎水性基材を使用し、培養層を形成する部分を凹状に削って、残部を枠層とする方法や、又は枠層の形状に凸状を形成し、この凸状の内側に培養層を形成すれば、上記凸状を枠層として使用することができる。ただし、これらに限定されるものではない。

　（６）粘着層
　本発明の微生物培養シートでは、基材シートやカバーシートに粘着層を形成することができる。このような粘着層は、培養層を被覆したカバーシートを固定し、培養層の水分蒸発や汚染を防止する目的で配設され、基材シートを密封できればいかなる種類の粘着剤を用いてもよい。作業性を考えると基材シートとカバーシートとが再接着できる程度に、弱い粘着力を有する粘着剤が好ましい。例えば、ゴム系粘着剤やアクリル系粘着剤が好ましく、特に再剥離タイプ及び微粘着タイプのアクリル系粘着剤が好ましく用いられる。具体的には、ブチルアクリレートや２－エチルヘキシルアクリレート等の炭素数が２～１２のアクリレート１００質量部に対し、カルボキシル基や水酸基、アミノ基等の官能基を含有するモノマーを２～１５質量部共重合させたポリマーに、粘着付与剤としてロジン、キシレン樹脂、フェノール樹脂等を加え、メラミン類、イソシアネート類、エポキシ等で架橋したもの等を使用することができる。また、粘着層はどのような形状でもよいが、基材シートとカバーシートとの接着部分に隙間がなく接着できるように配設されることが好ましい。

　粘着層の厚さは特に制限はなく、カバーシートが基材シートに形成された培養層を被覆し、かつ基材シートと接着しうる粘着性を確保できればよい。
　なお、本発明では、カバーシートで培養層を密封できれば粘着層に限定されず、把持部材を使用したり、重石を配設したりする方法等であってもよい。

　（７）格子印刷層
　本発明の微生物培養シートには、格子印刷層が積層されていてもよい。格子印刷は、着色剤、樹脂、溶剤等の選択範囲が広い点でグラビア印刷等が好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。

　このような格子印刷層は、上記したように、基材シートやカバーシートに形成してもよいが、本発明では、上記基材シートとしてプラスチックシートに紙基材を積層した積層シートを使用する場合には、このような紙基材に格子印刷層を形成してもよい。

　（８）微生物培養キット
　本発明では、上記微生物培養シートと、特定成分を含む被検液とを組み合わせて、微生物培養キットとすることができる。

　上記したように、本発明の微生物培養シートでは、基材シートの上に形成された培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質等の少なくとも１種と、を含有する培地液が印刷や塗布等によりパターン形成された層であり、このような場合、被検液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質の中から、上記培養層に含まれない成分を添加して培養することができる。特に、滅菌処理その他の工程で変質、変色、分解等を受けやすい成分を含む場合に、有効である。

　このような微生物キットに使用できる微生物培養シートとしては、上記カバーシートに特定成分層が形成されているものであってもよい。被検液に、特定成分層や、基材シートの上に形成した培養層に含まれない成分を添加して培養することができる。

　（９）製造方法
　（ｉ）培養層の形成
　本発明の微生物培養シートは、上記基材シートの上に、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有する培地液がパターン形成された培養層を形成することができれば、その製造方法は問わない。また、パターン形成の方法も、上記培地液を基材シートの予定した形状に塗布できるものであれば、特に制限はなく、上記した印刷、塗布、塗工、噴霧等のいずれの方法でもよい。好ましくは、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有させた培地液を調製し、該培地液を基材シートの上にパターン形成した後、上記培地液に含まれる上記アルコール溶液を除去して培養層を形成する。

　本発明の微生物培養シートの製造方法では、基材シートと培養層との密着性、パターン形成の容易さ等の理由から、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液を使用することが好ましい。アルコールとしては、炭素数１～５のアルコールを好適に使用することができる。例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール等の１種又は２種以上の混合液を使用することができる。これらの中でも、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールが好ましい。従来は、栄養成分を溶解するために水やトルエン等の高沸点溶媒が使用されていたが、溶媒除去のために高温で加熱する必要があり、培養層に含まれる成分や基材の熱分解を招くおそれがあった。また、溶媒除去に過剰の熱エネルギーを使用する必要があり、コスト上昇の一因となり、また、溶媒除去時間も長くなるため生産効率低下の一因ともなっていた。本発明では、ポリビニルピロリドンを使用し、その溶媒として、低沸点である上記アルコールを使用することで、培地液に含まれる成分や基材の熱変性を回避し、並びに生産効率を向上することができる。なお、上記趣旨を損なわない範囲で、アルコールにクロロホルム等の副溶媒を混合した溶媒を使用することもできる。

　ポリビニルピロリドンを培地液の必須の成分としたのは、上記したように濃度を調整することでゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種を均一に分散させることができ、しかも、容易に粘度を調整することができるので、得られた培地液によればパターン形成が可能となるからである。なお、ポリビニルピロリドンは、優れた成膜性と基材シートに対する密着性とを有するため、接着剤を使用することなく基材シートに培養層を形成することができ、接着剤による微生物の発育阻害を回避することができる。

　ポリビニルピロリドンに対するアルコールの割合は、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して溶媒１００～１００００質量部、より好ましくは３００～２０００質量部、特に好ましくは９００～１４００質量部である。１００００質量部を超えると、ゲル化剤等の分散性が著しく低下し、一方、１００質量部を下回ると培地液の粘度があがり、パターン形成に対する適性が低下するからである。

　本発明の微生物培養シートでは、培地液を構成するゲル化剤はパターン形成が可能であれば、上記ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に溶解している必要はない。したがって、本発明の微生物培養シートの製造方法では、ゲル化剤を粉末で添加することができる。粉末で添加する場合のゲル化剤の平均粒子径は５～５００μｍ、より好ましくは１０～２００μｍである。平均粒子径が上記範囲にあれば、分散性に優れるからである。５００μｍを超えると分散性が低下し、パターン形成適性が損なわれる場合がある。ただし、これらを溶媒に溶解し、上記ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に混合して培地液としてもよい。

　上記培地液におけるゲル化剤の配合量は、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して１００～６００質量部、より好ましくは２５０～４００質量部である。ゲル化剤の配合量が上記範囲であれば、被検液滴下の際の水分によって、増粘又はゲル化し、菌の育成に良好な粘度とすることができる。１００質量部を下回ると、培養層の粘度が不足する場合があり、一方、６００質量部を超えると培養層が硬くなり、菌の発育が低下する場合がある。

　なお、ポリビニルピロリドンの皮膜は硬くもろい場合があるため、可塑剤を添加してもよい。添加しうる可塑剤としては、エーテルエステル誘導体系可塑剤、グリセリンやグリセリン誘導体系可塑剤、プロピレングリコールやグリコール誘導体系可塑剤、グリコールエーテル誘導体系可塑剤、ポリヒドロキシカルボン酸誘導体系可塑剤、フタル酸誘導体系可塑剤等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。

　本発明の微生物培養シートの製造方法では、上記培地液を使用してパターン形成するが、特に、上記培地液を使用し、ディスペンサーによる塗布等で好適に培養層を形成することができる。

　上記したように培養層は、２層以上の多層であってもよい。例えば、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液にゲル化剤及び栄養成分の粉末を分散した培地液を基材シートにパターン形成し、次いで、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に発色指示薬を分散し、又は溶解した培地液をパターン形成によって積層すれば、コロニーの視認性を更に向上した培養層を形成することができる。なお、本発明では、培養層が第１培養層と第２培養層とからなる２層である場合に、異なる方法でパターン形成を行ってもよい。例えば、第１培養層をディスペンサーで塗布してパターン形成し、第２培養層のパターン形成に関しては、噴霧等その他の方法を用いてもよい。

　本発明では、培地液を基材シート上にパターン形成した後に、上記培地液に含まれるアルコールを除去する。ポリビニルピロリドンにゲル化剤等を配合した培養層を使用することで、寒天培地と同様に微生物コロニーを観察及び計数することができ、かつ極めて視認性に優れることが判明した。なお、ゲル化剤は、水溶性であるため水溶液として調製された後に基材に塗工されることが一般的であるが、水の除去に高温かつ長時間の加熱処理を行う必要があり、水溶液の調製時に粘度が高いために気泡等が混入する場合があった。本発明によれば、ゲル化剤等の粉末をポリビニルピロリドンのアルコール溶液に分散させるため、気泡の混入を回避することができ、水を使用していないため、乾燥を低温かつ短時間で行うことができる。また、ゲル化剤等は、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に分散しているだけで溶解していないため、培地液の粘度の上昇を防止することができ、これによって円滑なパターン形成を行うことができる。しかも、得られた培養層では、上記成分がポリビニルピロリドンで被覆されているので、被検液を接種するとポリビニルピロリドンが直ちに溶解し、上記成分が溶解又は吸水する。そのため、被検液の接種後、すぐにカバーシートで被覆することができる。また、ポリビニルピロリドンが溶解したり、ゲル化剤が含まれたりする場合には、それが増粘してカバーシートに密着するため、乾燥を防止しうると共に、極めて優れた視認性を確保することができる。

　本発明の微生物シートにおいて、カバーシートに特定成分層が形成される場合には、バインダー溶液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される１種以上を含有する特定成分溶液を塗布し、特定成分層を形成してもよい。塗布方法は、全面塗布であっても、パターン形成であってもよい。パターン形成の場合には、培養層の形成と同様に、印刷、塗布、塗工、噴霧等であってもよい。

　培養層の乾燥は、培地液に含まれる上記アルコールを除去できればよく、温度、圧力等、従来公知の方法に準じて乾燥することができる。

　本発明において、基材シートの上に形成する培養層の厚さは、乾燥時５０～１０００μｍ、より好ましくは２００～６００μｍである。また、塗布量は、乾燥時５～４００ｇ／ｍ^２、より好ましくは１００～３００ｇ／ｍ^２である。上記範囲で、菌の発育に最適な粘度の培養層とすることができる。

　（ｉｉ）枠層の形成
　本発明の微生物培養シートは、基材シートの表面、かつ培養層の外周に枠層を形成してもよい。枠層は、疎水性樹脂を用いて形成することができる。なお、枠層の製造方法は特に問わない。あらかじめ枠層が形成された基材シートを使用することもできる。

　枠層が形成された基材シートとしては、少なくとも疎水性樹脂を表面に有する基材シートであって、その疎水性樹脂の部分がエンボス加工されることにより、枠の形状に凸部が形成されたものが挙げられる。そして、上記凸部の内側に培養層を形成すれば、本発明の微生物培養シートを製造することができる。また、培養層を形成する箇所を凹状にエンボス加工し、凹部の外周に形成される凸部を枠層とすることもできる。

　基材シートに培養層を形成する前に枠層を形成する方法としては、例えば、疎水性樹脂板を所定形状にくりぬき、これを基材シートに接着して枠層とすることができる。更に、基材シートとして厚い疎水性樹脂板を使用し、培養層を形成する部分を凹状に削って残部を枠層とする方法や、枠の形状に凸部を形成し、この凸部の内側に培養層を形成すれば、上記凸部を枠層として使用することができる。

　また、疎水性樹脂として、上記したＵＶ硬化インキ、ホットメルト、熱発泡インクやＵＶ発泡剤等を使用し、パターン形成して枠層を形成してもよい。これらは非溶媒系であり、パターン形成をディスペンサー塗布等で容易に加工することができ、硬化も容易であるため特に好ましい。

　疎水性樹脂として上記ＵＶ硬化インキ等を使用して枠層を形成する場合には、上記疎水性樹脂を適当な溶媒に溶解し、印刷や塗布、塗工等によりパターン形成してもよい。印刷方法としては、スクリーン印刷のほか、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷、その他等の印刷方式であってもよい。また、所定形状に、バー等を使用してコーティングするバーコートや、ナイフコート、ダイコート等の塗工、ディスペンサー等による塗布、その他の方法を使用することができる。

　疎水性樹脂がＵＶ硬化インキやＵＶ発泡インキである場合には、パターン形成後に、ＵＶを照射する。紫外線（ＵＶ）照射条件としては、積算光量５０～２０００ｍＪ／ｃｍ^２、より好ましくは１００～１０００ｍＪ／ｃｍ^２であり、紫外線照射ランプの光と熱を併用することができる。発泡可能照射条件の幅は、発泡剤の種類により変化する。一度では所定の高さを確保できない場合には、複数回の印刷によって枠層を形成してもよい。紫外線照射ランプとしては、メタルハライドランプ、水銀ランプ等が使用できる。

　培養層を形成した後に枠層を形成する場合には、上記ＵＶ硬化インキ、ホットメルト、熱発泡インクやＵＶ発泡剤等を使用し、パターン形成によって枠層を形成することができる。この際、培養層に、ＵＶ照射によって変質する成分が含まれている場合には、ＵＶ照射の際に、培養層を金属等で被覆することが好ましい。

　更に、疎水性樹脂板を所定形状にくりぬき、これを培養層が形成された基材シートの上記培養層の外周の基材シートに接着して枠層を形成してもよい。

　本発明では、枠層の形成と上記培養層の形成とは、いずれを先に行ってもよいが、培養層の形成を先に行うと、パターン形成によって調製された培養層は薄層であるため、その後に枠層を容易に形成することができる。一方、枠層を先に形成すれば、ディスペンサー等により容易に枠層内に培地液をパターン形成して培養層を調製することができる。

　基材シートの上に枠層を形成する場合には、培養層の外周に培養層と密着して形成され、枠層と培養層との間に間隙が形成されていないことが好ましい。枠層と培養層との間に間隙を有する場合には、培養層に被検液を接種した場合に、上記間隙に被検液が貯留し、均一な被検液の拡布が困難となる場合がある。間隙を形成することなく枠層と培養層とを形成するには、あらかじめ枠層を形成し、枠層内に上記培地液をパターン形成することが簡便である。パターン形成の方法としては、ディスペンサーによる塗布を好適に行うことができる。従来は、間隙を形成することなく枠層と培養層とを形成することが困難であるため、たとえ枠層を形成する場合でも、培養層の上面に枠層を形成していたと推察される。本発明によれば、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液にゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種を含有する培地液を使用することでパターン形成を可能とし、枠層の内部に、間隙を形成することなく培養層をパターン形成しうるため、被検液の均一拡散が可能となり、性能の高い微生物培養シートを製造することができる。

　（ｉｉｉ）カバーシートの固設
　本発明の微生物培養シートは、培養層に被検液を接種した後にカバーシートで培養層を被覆し、これを培養するため、カバーシートの一部が基材シートに固設されていることが操作上、簡便である。ただし、直接スタンプや拭き取り試験等の場合、カバーシートが無いことで作業効率が向上する場合には、カバーシートを取り除いて使用してもよい。

　カバーシートと基材シートとが同一部材で構成される場合には、別個に作成したカバーシートを基材シートにヒートシールやラミネート接着、その他によって固設してもよいが、カバーシートと基材シートとを同質の材料を使用し、図９（ａ）の展開図、図９（ｂ）の断面図に示すように基材シート（１０）とカバーシート（４０）とを連設したまま基材シート（１０）に枠層（２０）と培養層（３０）とを形成し、カバーシート（４０）を折り曲げて微生物培養シートを形成してもよい。図９（ｃ）にその断面図を示す。この方法によれば、カバーシートに特定成分層（３０’）や粘着層（５０）を形成する場合でも、基材シート（１０）とカバーシート（４０）が連設されているため、基材シート（１０）の上の培養層（３０）と対向する位置に正確かつ簡便に特定成分層（３０’）を形成することができる。

　また、図１０及び図１１の横断面図に示すように、カバーシート（４０）と基材シート（１０）とを異なる部材で構成し、カバーシート（４０）と、培養層（３０）を形成した基材シート（１０）とを、両面接着テープ（６０）等で張り合わせてもよい。

　図１２及び図１３に、カバーシート（４０）に格子印刷が形成され、カバーシート（４０）と培養層（３０）を形成した基材シート（１０）とが端部で接着された本発明の微生物培養シートの外観斜視図を示す。図１３では、培養層（３０）の周囲に枠層（２０）が形成されている。

　本発明の微生物培養シートは、ガンマ線照射やエチレンオキサイドガス滅菌等の滅菌を施し、本発明の微生物培養シートの製品とする。本発明の微生物培養シートは、含まれる微生物栄養成分の種類や、使用する基材シート、カバーシートの通気性その他に応じて各種の微生物の培養を行うことできる。

　次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。

　［製造例１］
　メタノール１３０ｇにポリビニルピロリドン（日本触媒社製、商品名「ポリビニルピロリドン　Ｋ－９０」）２０ｇを溶解し、これにグアーガム粉末（三晶社製、商品名「ネオビスコ　Ｇ」、２００メッシュタイプ）６０ｇを分散し、更に栄養成分としてトリプトン（Ｂｅｃｔｏｎ、　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　社製、商品名「ＢＡＣＴ　ＴＲＹＰＴＯＮＥ」）２０．１６ｇ、酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ、　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　社製、商品名「ＹＥＡＳＴ　ＥＸＴＲＡＣＴ」）２．５８ｇ、ブドウ糖（和光純薬社製、商品名「Ｄ－（＋）－ＧＬＵＣＯＳＥ」）１．０３ｇを混合して培地液を調製し、この培地液をポリエチレンテレフタラートフィルム（帝人デュポン社製、商品名「テイジンテトロンフィルム」）の上に必要な部分パターン形成した後、５０℃で１５分間乾燥し、培養層を形成した。乾燥時の培養層の厚さは、約２５０μｍであった。次いで、ディスペンサーを用いて、ＵＶ硬化インク（十条ケミカル社製、商品名「レイキュアーＧＡ　４１００－２」）を幅１．０ｍｍ、高さ７５０μｍ、直径５２ｍｍの円状に塗布した後、水銀ランプを用いて積算光量２５０ｍＪ／ｃｍ^２の紫外線を照射し、硬化させて培養層の周りに疎水性樹脂で枠層を形成した。

　そして、カバーシート（東セロ社製、ＯＰＰフィルム、型番「ＯＰ　Ｕ－１（片面コロナ放電処理）」、厚み：４０μｍ）を、上記ポリエチレンテレフタラートフィルムの上に積層し、端部を接着した後、γ線で滅菌して、本発明の微生物培養シートを得た。

　（実施例１）
　Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ　２５９２２）を液体培地（ＴＲＹＰＴＩＣ　ＳＯＹ　ＢＲＯＴＨ）にて３７℃で２４時間振盪培養した。そして、得られた被検液を菌数が１０^２／ｍｌとなるように滅菌生理食塩水で希釈し、ＴＴＣを添加して、培養試験用被検液を調製した。この培養試験用被検液を、製造例１の方法により製造した微生物培養シートの培養層の上に滅菌済みのピペットで１ｍｌ接種し、その上にカバーシートを乗せて、被検液を培養層全体に拡げた。その後、約１分間静置してゲルを形成させ、実施例１の培養試験用試料を得た。なお、培養試験用試料は５個作成した。

　（実施例２）
　菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉのかわりにＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ　１３８８３）を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例１と同様の方法にて、実施例２の培養試験用試料を得た。

　（実施例３）
　菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉのかわりにＥ．ｃｌｏａｃａｅ（ＡＴＣＣ　１３５３６）を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例１と同様の方法にて、実施例３の培養試験用試料を得た。

　（実施例４）
　菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉのかわりにＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ（ＪＣＭ　１６５７）を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例１と同様の方法にて、実施例４の培養試験用試料を得た。

　（実施例５）
　菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉのかわりにＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ　２５９２３）を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例１と同様の方法にて、実施例５の培養試験用試料を得た。

　（比較例１）
　実施例１の培養試験用被検液１ｍｌをペトリ皿に加え、従来の混釈法により準備した標準寒天培地２０ｍｌと混釈し、比較例１の培養試験用試料を得た。

　（比較例２）
　実施例２の培養試験用被検液を使用した以外は、比較例１と同様の方法にて、比較例２の培養試験用試料を得た。

　（比較例３）
　実施例３の培養試験用被検液を使用した以外は、比較例１と同様の方法にて、比較例３の培養試験用試料を得た。

　（比較例４）
　実施例４の培養試験用被検液を使用した以外は、比較例１と同様の方法にて、比較例４の培養試験用試料を得た。

　（比較例５）
　実施例５の培養試験用被検液を使用した以外は、比較例１と同様の方法にて、比較例５の培養試験用試料を得た。

　［培養試験］
　実施例１～５及び比較例１～５の培養試験用試料を孵卵器に入れ、３７℃で４８時間培養した。そして、培養後に発生したコロニー数をそれぞれ計測した。また、本発明の微生物培養シートを使用した実施例１の培養試験用試料のコロニー発生状態を図１４に示す。

　実施例１～５の培養試験用試料及び比較例１～５の培養試験用試料のコロニー数を比較したところ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのいずれの菌を培養した場合でも、両者の相関は極めて良好であった。また、本発明の微生物培養シートを使用した実施例１の培養試験用試料のコロニー発生状態を観察したところ、視認性に優れていた（図１４）。本発明の微生物培養シートによれば、増粘したゲル化剤やポリビニルピロリドンにより、カバーシートと培養層とが密着するので、このような結果が得られたものと考えられる。

　［製造例２］
　ポリエチレンテレフタラートフィルム（帝人デュポン社製、商品名「テイジンテトロンフィルム」）の上に、ディスペンサーを用いて、熱可塑性樹脂（コニシ社製、商品名「ＭＰ９７３」）を幅１．０ｍｍ、高さ７５０μｍ、直径５２ｍｍの円状に塗布し、枠層を形成した。

　次いで、メタノール２１０ｍｌにポリビニルピロリドン（日本触媒社製、商品名「ポリビニルピロリドン　Ｋ－９０」）　２０ｇを溶解し、これにグアーガム粉末（三晶社製、商品名「ＮＥＯＶＩＳＣＯ　Ｇ」、４００メッシュタイプ）６０ｇを分散し、更に栄養成分としてトリプトン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　社製、商品名「ＢＡＣＴ　ＴＲＹＰＴＯＮＥ」）２０．１６ｇ、酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製、商品名「ＹＥＡＳＴ　ＥＸＴＲＡＣＴ」）２．５８ｇ、ブドウ糖（和光純薬社製、商品名「Ｄ－（＋）－ＧＬＵＣＯＳＥ」）１．０３ｇを混合して培地液を調製した。

　この栄養成分、ゲル化剤を含んだ培地液を、基材上に形成した枠層の枠内にディスペンサーを用いて塗布した後、５０℃で１５分間乾燥して培養層を形成した。乾燥時の層の厚さは、約２５０μｍであった。

　そして、桝目印刷をしたカバーシート（東セロ社製、ＯＰＰフィルム、型番「ＯＰ　Ｕ－１（片面コロナ放電処理）」、厚み：４０μｍ）を、上記ポリエチレンテレフタラートフィルムの上に積層し、端部を接着した後、γ線で滅菌して、本発明の微生物培養シートを得た。なお、得られた枠層の高さは７５０μｍ（培養層の高さとの差：＋５００μｍ）、幅は１ｍｍであった。

　［製造例３］
　高さ６００μｍの枠層を形成した以外は、製造例２と同様の方法にて、本発明の微生物培養シートを得た。なお、培養層の高さとの差は、＋３５０μｍであった。

　［製造例４］
　高さ９５０μｍの枠層を形成した以外は、製造例２と同様の方法にて、本発明の微生物培養シートを得た。なお、培養層の高さとの差は、＋７００μｍであった。

　（実施例６）
　Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ　２５９２２）を液体培地（ＴＲＹＰＴＩＣ　ＳＯＹ　ＢＲＯＴＨ）にて３７℃で２４時間振盪培養した。そして、得られた被検液を菌数が１０^２／ｍｌとなるように滅菌生理食塩水で希釈し、ＴＴＣを添加して、培養試験用被検液を調製した。この培養試験用被検液を、製造例２の方法により製造した微生物培養シートの培養層の上に滅菌済みのピペットで１ｍｌ接種し、その上にカバーシートを乗せて、被検液を枠層内の培養層全体に拡げた。その後、約１分間静置してゲルを形成させ、実施例６の培養試験用試料を得た。なお、培養試験用試料は５個作成した。

　（実施例７）
　菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉのかわりにＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ　１３８８３）を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例６と同様の方法にて、実施例７の培養試験用試料を得た。

　（実施例８）
　菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉのかわりにＥ．ｃｌｏａｃａｅ（ＡＴＣＣ　１３５３６）を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例６と同様の方法にて、実施例８の培養試験用試料を得た。

　（実施例９）
　菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉのかわりにＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ（ＪＣＭ　１６５７）を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例６と同様の方法にて、実施例９の培養試験用試料を得た。

　（実施例１０）
　菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉのかわりにＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ　２５９２３）を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例６と同様の方法にて、実施例１０の培養試験用試料を得た。

　（比較例６）
　実施例６にて調製した培養試験用被検液１ｍｌをペトリ皿に加え、従来の混釈法により準備した標準寒天培地２０ｍｌと混釈し、比較例６の培養試験用試料を得た。

　（比較例７）
　実施例７にて調製した培養試験用被検液を使用した以外は、比較例６と同様の方法にて、比較例７の培養試験用試料を得た。

　（比較例８）
　実施例８にて調製した培養試験用被検液を使用した以外は、比較例６と同様の方法にて、比較例８の培養試験用試料を得た。

　（比較例９）
　実施例９にて調製した培養試験用被検液を使用した以外は、比較例６と同様の方法にて、比較例９の培養試験用試料を得た。

　（比較例１０）
　実施例１０にて調製した培養試験用被検液を使用した以外は、比較例６と同様の方法にて、比較例１０の培養試験用試料を得た。

　（実施例１１）
　製造例３の方法により製造した微生物培養シートを使用した以外は、実施例６と同様の方法にて、実施例１１の培養試験用試料を得た。

　（実施例１２）
　製造例４の方法により製造した微生物培養シートを使用した以外は、実施例６と同様の方法にて、実施例１２の培養試験用試料を得た。

　［培養試験］
　実施例６～１２及び比較例６～１０の培養試験用試料を孵卵器に入れ、３７℃で４８時間培養した。そして、培養後に発生したコロニー数をそれぞれ計測した。その結果を表１に示す。また、本発明の微生物培養シートを使用した実施例６の培養試験用試料のコロニー発生状態を図１５に示す。

　実施例６～１０の培養試験用試料及び比較例６～１０の培養試験用試料のコロニー数を比較したところ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのいずれの菌を培養した場合でも、両者の相関は極めて良好であった（表１）。枠層の高さを変えた実施例１１では平均コロニー数が９７であり、また、実施例１２では平均コロニー数は９３であり、枠層の高さが規定の範囲内であれば同等の培養性能を発揮することを確認した。また、本発明の微生物培養シートを使用した実施例６の培養試験用試料のコロニー発生状態を観察したところ、視認性に優れていた（図１５）。

　本発明の微生物培養シートは、菌数検査等に用いることができ、操作性及び視認性に優れ、有用である。

　１０　　　基材シート
　２０　　　枠層
　３０　　　培養層
　３０’　　特定成分層
　４０　　　カバーシート
　５０　　　粘着層
　６０　　　両面接着テープ

Claims (11)

1. 　基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、
   　前記培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有する培地液がパターン形成されたものである微生物培養シート。
2. 　前記培地液は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤とを含有する請求項１に記載の微生物培養シート。
3. 　前記ゲル化剤は高分子多糖類である請求項２に記載の微生物培養シート。
4. 　前記培地液における前記ゲル化剤の含有量は、前記ポリビニルピロリドン１００質量部に対して１００～６００質量部である請求項２又は３に記載の微生物培養シート。
5. 　前記培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されている請求項１～４いずれかに記載の微生物培養シート。
6. 　前記基材シート及び／又は前記カバーシートは、透明プラスチックシートからなる請求項１～５のいずれかに記載の微生物培養シート。
7. 　前記カバーシートは、前記基材シートに固設されている請求項１～６のいずれかに記載の微生物培養シート。
8. 　基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートの製造方法であって、
   　ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種を含有させた培地液を、前記基材シートの上にパターン形成した後、前記培地液に含まれる前記アルコールを除去して前記培養層を形成する培養層形成工程を含む微生物培養シートの製造方法。
9. 　前記培養層形成工程後に、疎水性樹脂をパターン形成して前記培養層の外周を囲む凸形状の枠層を形成する枠層形成工程を行う請求項８に記載の微生物培養シートの製造方法。
10. 　前記培養層形成工程前に、前記培養層が形成された際に前記培養層の外周を囲む凸形状の枠層を、疎水性樹脂のパターン形成によりあらかじめ形成する枠層形成工程を行う請求項８に記載の微生物培養シートの製造方法。
11. 　基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートの製造方法であって、
    　前記基材シートは、前記培養層が形成された際に前記培養層の外周を囲む凸形状の疎水性樹脂からなる枠層があらかじめ形成されており、
    　前記枠層の内側に、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液にゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種を含有させた培地液をパターン形成した後、前記培地液に含まれる前記アルコールを除去して前記培養層を形成する微生物培養シートの製造方法。
     

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