WO2011102507A1 - 癌遺伝子の同定方法、癌遺伝子発現細胞の樹立方法、および癌遺伝子標的薬のスクリーニング方法 - Google Patents

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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to an oncogene identification method, an oncogene-expressing cell establishment method, and an oncogene target drug screening method.
  • anticancer drugs are actively conducted. Effective techniques for research and development of anticancer agents include (1) identification of oncogenes, (2) establishment of oncogene-expressing cells, and (3) screening for oncogene-targeted drugs.
  • Non-Patent Document 1 discloses that a novel oncogene EML4-ALK was found by a transformation experiment using mouse-derived 3T3 cells (non-cancerous cells).
  • Another example of an oncogene identification method is to comprehensively analyze gene expression in cancer cells or cancer tissue samples and normal cells or normal tissue samples using DNA chips or two-dimensional electrophoresis, and the difference in expression between the two samples. This is a method for selecting an oncogene from the genes for which the above is recognized (hereinafter, conventional identification method 2).
  • Methods for establishing oncogene-expressing cells include a method of isolating a cell line that naturally expresses an oncogene from a subject, and a drug resistance gene (eg, G418 resistance gene together with the oncogene). ) Is introduced into the cell, and then the cell into which the oncogene has been introduced is selected with a drug (eg, G418).
  • a drug eg, G418
  • Patent Document 1 introduces a ligand receptor gene and a drug resistance gene into a cytokine-dependent cell line (non-cancer cell), It discloses that cell lines that can grow in the presence of ligands or ligand-like substances and drugs against drug resistance genes can be established.
  • Non-Patent Document 1 describes the effect of a molecular targeted drug targeting EML4-ALK gene by introducing EML4-ALK gene into mouse-derived IL-3-dependent cell line (Ba / F3 cell which is a non-cancer cell). Is disclosed.
  • patent document 1 uses the above-mentioned cell line derived from a cytokine dependence cell line (non-cancer cell), and a ligand or a ligand-like substance. Is disclosed.
  • the conventional methods have the following problems when used in the research and development of anticancer agents.
  • (1) Identification of Oncogene Since the conventional identification method 1 is carried out by directly testing the transformation ability as an oncogene, there is a high probability that the gene identified by this method is an oncogene.
  • this method has problems in human application and versatility. As normal cultured cells used in this method, only rodent-derived fibroblasts are generally available, and human-derived cells and cancer cells, or epithelial cells and blood cells that are the origin of many cancers Experimental methods using cells have not been established. In addition, the rodent-derived fibroblasts used in the conventional identification method 1 are difficult to be passaged while maintaining their initial properties for a long period of time.
  • Conventional identification method 2 has a problem that many genes that are induced or suppressed by gene expression of an oncogene other than the oncogene are selected as candidate genes. In addition, the conventional identification method 2 requires more detailed analysis of many candidate genes in order to finally identify an oncogene from among many selected candidate genes.
  • an object of the present invention is to provide a novel methodology capable of solving these problems in the identification of oncogenes, establishment of oncogene-expressing cell lines, and screening for oncogene target drugs.
  • cancer gene addiction or addiction (addition) is a state in which cancer cells are dependent on the growth of specific genes. It is known that when cancer cells that grow depending on a specific gene are treated with an inhibitor of the gene, the growth of the cancer cells can be suppressed.
  • the inventors of the present application have found that dependence on a specific oncogene in cancer cells can be replaced by introduction of another oncogene. Based on this finding, the present inventors also treated cancer cells with an exogenous oncogene expression vector, and then treated the cancer cells treated with the expression vector with the expression or function of an oncogene specific to the cancer cell. It has been found that the method of culturing under conditions that inhibit the growth of artificial cells that can be selectively proliferated, and that the selectively proliferated artificial cells can be used as a cancer cell model.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 disclose that a cancer cell is used as a cell for introducing an oncogene and that the cancer cell into which the oncogene has been introduced is a condition that inhibits the oncogene specific to the cancer cell There is no description or suggestion of selecting by culturing below.
  • the present invention is as follows.
  • Artificial cells having the following characteristics (a) and (b): (A) derived from a cancer cell; and (b) capable of expressing a foreign oncogene and proliferating depending on the foreign oncogene.
  • the artificial cell according to [1], further having the following characteristics (c): (C) retains the ability to express an oncogene unique to the cancer cell and the ability to proliferate depending on the unique oncogene.
  • a method for establishing an artificial cell comprising the following steps (a) to (c): (A) treating cancer cells with a foreign oncogene expression vector; (B) culturing cancer cells treated with the expression vector under conditions that inhibit expression or function of an oncogene specific to the cancer cells; and (c) cancer cells grown in step (b) A step of obtaining an exogenous oncogene as an artificial cell having the ability to express and proliferate depending on the exogenous oncogene.
  • a screening method for a substance having anticancer activity comprising the following steps (a) and (b): (A) a step of evaluating whether or not the test substance inhibits the proliferation of the artificial cell of any one of the above [1] to [10]; and (b) a test substance that inhibits the proliferation of the artificial cell, A step of selecting as a substance having an action.
  • step (a) is performed under conditions that inhibit the expression or function of a specific oncogene.
  • a method for identifying an oncogene comprising the following steps (a) to (c): (A) treating cancer cells with an expression vector for a test gene; (B) a step of culturing cancer cells treated with the expression vector under conditions that inhibit the expression or function of an oncogene unique to the cancer cells; and (c) the cancer cells cultured in step (b). Confirming whether or not is proliferated depending on the test gene. [16] The method of [15] above, wherein the test gene is a single gene.
  • test gene is a plurality of genes and further comprises the following steps: (D) cloning the cancer cells grown in step (c); and (e) identifying the test gene introduced into the cloned cancer cells as an oncogene.
  • test gene is a plurality of genes and further comprises the following steps: (F) A step of obtaining a test gene introduced into the cancer cell from the cancer cell grown in the step (c). (G) A step of cloning the acquired test gene and identifying it as an oncogene.
  • the artificial cell of the present invention enables, for example, the development of an excellent anticancer agent against various cancers.
  • the establishment method of the present invention is excellent in, for example, the establishment efficiency of cells expressing a foreign oncogene.
  • the screening method of the present invention enables, for example, the development of an anticancer agent using any cancer cell that expresses any oncogene.
  • the identification method of the present invention is excellent in sensitivity and accuracy of oncogene identification, for example, since the method of establishing the method and the methodology of the present invention, which are excellent in the efficiency of establishing cells expressing foreign oncogenes, are similar. Further, these methods of the present invention have the advantage that they can be carried out by a simple and conventional technique using commonly used cultured cells (eg, cancer cell lines).
  • FIG. 1 shows the expression of EML4-ALKvariant3a protein in EML4-ALKvariant3a gene-introduced PC-9 cells grown in a G418-containing medium (G418) or a gefitinib-containing medium (Gefitinib).
  • FIG. 2 shows the expression of EML4-ALKvariant3a protein in 10 clones of EML4-ALKvariant3a gene-introduced PC-9 cells selectively proliferated in a gefitinib-containing culture medium.
  • FIG. 1 shows the expression of EML4-ALKvariant3a protein in EML4-ALKvariant3a gene-introduced PC-9 cells grown in a G418-containing medium (G418) or a gefitinib-containing medium (Gefitinib).
  • FIG. 2 shows the expression of EML4-ALKvariant3a protein in 10 clones of EML4-ALKvariant3a gene-introduced PC-9 cells selectively
  • FIG. 3 shows EML4-ALKvariant3a transgenic PC-9 cells (PC-9-EML4-ALKvar3a), EML4-ALKvariant1 transgenic PC-9 cells (PC-9-EML4-ALKvar1) grown in a gefitinib-containing culture medium, and It is a figure which shows the expression of EML4-ALKvariant3a or EML4-ALKvariant1 protein in EML4-ALKvariant3a gene transfer HCC827 cell (HCC827-EML4-ALKvar3a).
  • FIG. 4 is a diagram showing the expression of PDGFR ⁇ V561D protein in PD-9R ⁇ V561D gene-introduced PC-9 cells grown in a gefitinib-containing culture medium.
  • FIG. 4 is a diagram showing the expression of PDGFR ⁇ V561D protein in PD-9R ⁇ V561D gene-introduced PC-9 cells grown in a gefitinib-containing culture medium.
  • FIG. 5 is a graph showing the proliferation percentage (%) of PC-9 cells or PDGFR ⁇ V561D gene-introduced PC-9 cells in the presence of various concentrations of gefitinib.
  • FIG. 6 is a graph showing the percentage proliferation of PDGFR ⁇ V561D gene-introduced PC-9 cells (in the presence or absence of 1 ⁇ M gefitinib) in the presence of various concentrations of the PDGFR ⁇ inhibitor Imatinib. .
  • FIG. 7 is a diagram showing agarose gel electrophoresis of a novel oncogene candidate that can complement mutant EGFR-dependent growth in PC-9 cells.
  • artificial cells The present invention provides specific artificial cells.
  • artificial cell means a cell that is artificially produced.
  • the artificial cell of the present invention may be an isolated or purified cell. Isolation or purification of the cells can be performed by a method known per se such as FACS.
  • the artificial cell of the present invention can be derived from a cancer cell.
  • the artificial cells of the present invention can inherit the cytological properties retained by cancer cells.
  • the cancer cell is a human cell
  • the artificial cell of the present invention can be a human cell.
  • the cancer cell is a lung cell
  • the artificial cell of the present invention can be a lung cell.
  • cancer cell means a tumor cell having the ability to proliferate depending on a specific oncogene expressed by the cancer cell.
  • Cancer cells include primary cultured cells, cell lines or cancer stem cells.
  • the term “dependence” for cell growth refers to an oncogene addiction or addiction state in which the cell relies on growth for a particular oncogene.
  • Whether a cell is dependent on a specific oncogene for growth can be confirmed by treating the cell with an inhibitor of a specific oncogene and then evaluating the proliferative capacity of the treated cell.
  • the proliferative ability can be evaluated by, for example, an MTT assay or an MTS assay.
  • cell death due to apoptosis can be induced by treating an oncogene-addicted cell for a specific oncogene with an inhibitor of the oncogene.
  • cellular oncogene poisoning against a particular oncogene may be confirmed, for example, by evaluating whether apoptosis can be induced by inhibition of the oncogene.
  • Apoptosis induction can be evaluated by, for example, TUNEL assay, detection of active caspase, and detection of ANNEXIN V.
  • Cancer cells can be derived from any tissue.
  • tissues include respiratory tissues (eg, lung, trachea, bronchi, pharynx, nasal cavity, sinus), digestive tissues (eg, stomach, small intestine, large intestine, rectum), pancreas, kidney, Examples include liver, thymus, spleen, heart, thyroid, adrenal gland, prostate, ovary, uterus, brain, skin, and blood tissue (eg, bone marrow, peripheral blood).
  • cancer cells can be adherent cells or non-adherent cells (ie, blood cells), although adherent cells are preferred.
  • the cancer cell can be a cell present in the tissue or a tissue other than the tissue.
  • gland cells eg, lung gland cells, breast cells
  • epithelial cells eg, endothelial cells
  • epidermal cells e.g., stromal cells
  • fibroblasts e.g., fibroblasts
  • adipocytes e.g., mesangial cells
  • pancreatic ⁇ cells e.g., nerve cells
  • nerve cells examples include glial cells and blood cells.
  • the cancer cell is preferably a lung adenocarcinoma cell.
  • cancer refers to any malignant tumor in the tissues and cell types described above.
  • cancer include cancer that may be caused by abnormal adhesion cells and cancer that may be caused by abnormal blood cells (eg, leukemia, lymphoma, multiple myeloma), but may be caused by abnormal adhesion cells. Cancer is preferred.
  • cancers that can be caused by abnormal adhesion cells include lung cancer (eg, non-small cell cancer such as squamous cell carcinoma, adenocarcinoma and large cell cancer, and small cell cancer), digestive system.
  • Cancer eg, stomach cancer, small intestine cancer, colon cancer, rectal cancer
  • pancreatic cancer kidney cancer, liver cancer, thymic cancer, spleen cancer, thyroid cancer, adrenal cancer, prostate cancer, bladder cancer, ovarian cancer, uterine cancer (eg Endometrial cancer, cervical cancer), bone cancer, skin cancer, brain tumor, sarcoma, melanoma, blastoma (eg, neuroblastoma), adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, solid cancer, epithelial cancer, Mesothelioma is mentioned.
  • “Cancer” in cancer-related terms such as the terms “cancer cell” and “oncogene” may also have the same meaning.
  • Cancer cells can be derived from any mammalian species. Examples of such mammalian species include humans, monkeys, cows, pigs, mice, rats, guinea pigs, hamsters, and rabbits. From the viewpoint of clinical application, the mammalian species is preferably human. Thus, the cancer cell may be a cancer cell isolated from a cancer patient or a cancer cell derived therefrom.
  • Cancer cells may be non-virus-infected cells or virus-infected cells.
  • oncogenic viruses that can infect cells include Epstein Barr virus, hepatitis virus, human papilloma virus, human T cell leukemia virus, and Kaposi's sarcoma-associated herpes virus.
  • the cancer cells may also be cancer cells derived from embryonic stem cells, somatic stem cells, or artificial stem cells (eg, iPS cells) made from normal cells.
  • the cancer cell from which the artificial cell of the present invention is derived can express a unique oncogene.
  • unique oncogene means an oncogene responsible for the growth of cancer cells that is expressed by cancer cells that can be used as a material in the establishment of the artificial cells of the present invention.
  • Oncogenes are overexpressed in cancer cells (eg, overexpression with increased gene copy number), genes that transmit excessive growth signals, or mutations that continue to transmit growth signals in cancer cells It can be the gene that occurs. Examples of the mutation include point mutation (eg, substitution), deletion, addition, insertion, and mutation that causes fusion (eg, inversion, translocation).
  • the term “gene” may mean a mutated gene.
  • the term “unique” means a concept that is in conflict with the term “foreign”. Therefore, when a gene is introduced into a cancer cell in the process of establishing the artificial cell of the present invention using the cancer cell as a material, the gene is foreign to the cancer cell. On the other hand, even if a gene possessed by a cancer cell that can be used as a material in the process of establishing the artificial cell of the present invention is a gene introduced or mutated in the process of establishing the cancer cell itself, It shall be unique.
  • oncogenes include oncogenes derived from mammals or viruses.
  • mammalian species include humans, monkeys, cows, pigs, mice, rats, guinea pigs, hamsters, and rabbits. From the viewpoint of clinical application, the mammalian species is preferably human.
  • the virus include Epstein Barr virus, hepatitis virus, human papilloma virus, human T cell leukemia virus, and Kaposi's sarcoma herpes virus.
  • oncogenes include tyrosine kinases (receptor type, non-receptor type), kinases such as serine / threonine kinases, low molecular weight G proteins, and transcription factors, with tyrosine kinases being preferred.
  • tyrosine kinases that can be responsible for the growth of cancer cells include molecules belonging to the epidermal growth factor receptor (EGFR) family (eg, EGFR, HER2, HER3, HER4), platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) gene family. Examples include molecules (eg, PDGFR ⁇ , PDGFR ⁇ ), anaplastic lymphoma kinase (ALK), hepatocyte growth factor receptor (c-MET), and stem cell factor receptor (c-KIT).
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • ALK anaplastic lymphoma kinase
  • c-MET hepatocyte growth factor receptor
  • c-KIT stem cell factor receptor
  • the unique oncogene may be an oncogene capable of transmitting a proliferation signal in a signal transduction pathway of a molecule belonging to the EGFR gene family (eg, EGFR, HER2, HER3, HER4).
  • oncogenes include EGFR, HER2, HER3, HER4, RAS, RAF, MYC, AKT, MAP kinase, PI3 kinase, and PKC.
  • the unique oncogene may be an oncogene capable of transmitting a proliferation signal in a signal transduction pathway of a molecule belonging to the PDGFR gene family (eg, PDGFR ⁇ , PDGFR ⁇ ).
  • oncogenes include PDGFR ⁇ , PDGFR ⁇ , RAS, RAF, MYC, AKT, MAP kinase, PI3 kinase, and PKC.
  • the unique oncogene can be an oncogene capable of transmitting a proliferation signal in the signal transduction pathway of the ALK gene (eg, ALK mutant gene described below).
  • oncogenes include RAS, MAP kinase, AKT, PI3 kinase, and STAT3.
  • the unique oncogene may also be the type of oncogene described in the exogenous oncogene described below.
  • the cancer cell from which the artificial cell of the present invention is derived may have the ability to proliferate depending on the specific oncogene.
  • the term “ability to grow depending on a specific oncogene” for a cancer cell means that the cancer cell that expresses the specific oncogene is proliferating due to the specific oncogene. It means that it can grow by signal. Therefore, a cancer cell that expresses a unique oncogene cannot proliferate depending on the specific oncogene when the expression or function of the unique oncogene is inhibited.
  • Whether a cancer cell grows dependent on a specific oncogene is determined, for example, under conditions that inhibit the expression or function of the specific oncogene (eg, in the presence of a specific oncogene inhibitor). This can be confirmed by evaluating whether the proliferation ability of the cells can be reduced.
  • Inhibition of the function of a specific oncogene in a cancer cell can be achieved, for example, by a specific oncogene inhibitor or gene disruption.
  • the term “inhibitor of a specific oncogene” may inhibit the growth of the aforementioned cancer cells by inhibiting the expression or function of the mRNA or protein of the unique oncogene described above. Means a substance.
  • an inhibitor of a specific oncogene includes, for example, an antisense nucleic acid (eg, an artificial nucleic acid such as DNA, RNA, and PNA) against an mRNA expressed from a specific oncogene, an RNA interference-inducing nucleic acid ( Examples, siRNA: Either double-stranded RNA or single-stranded RNA having a stem-loop structure) and aptamers, and antibodies to proteins expressed from unique oncogenes (eg, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humans) Antibody, human antibody, single chain antibody such as scFv), and expression vectors thereof.
  • Inhibitors of intrinsic oncogenes can also be small molecule compounds.
  • the intrinsic oncogene inhibitor may be a substance that inhibits cell proliferation due to cell death caused by apoptosis. Destruction of a unique oncogene can be performed with a targeting vector for the unique oncogene. A person skilled in the art can easily prepare such an inhibitor and disrupt a gene by obtaining information (eg, sequence information) of a target gene.
  • the unique oncogene inhibitor is a molecular targeted drug that targets the oncogene.
  • the following are known as molecular target drugs.
  • Trastuzumab for HER2 3) Imatinib for BCR-ABL fusion protein, c-KIT and PDGFR ⁇ 4)
  • PHA-666552 and SU-11274 for c-MET see, for example, Science, 2007, vol. 316, p1039-1043, Cancer Research, 2005, vol.
  • NVP-TAE684 and PF-02341066 against ALK see, eg, PNAS, 2007, vol. 104, p270-275, Molecular Cancer Therapy, 2007, Vol. 6, p3314-3322)
  • the cancer cell from which the artificial cell of the present invention is derived can be targeted by the existing molecular target drug from the viewpoint of easily establishing the artificial cell of the present invention using the existing cancer cell and the existing molecular targeted drug.
  • Cancer cells expressing an oncogene as a unique oncogene are preferred. Examples of such cancer cells include EGFR gene expression cells, HER2 gene expression cells, BCR / ABL fusion gene expression cells, EML4-ALK gene expression cells, PDGFR ⁇ gene expression cells, and c-MET gene gene expression cells. .
  • Examples of the EGFR gene-expressing cells include PC-9 cells (derived from human non-small cell lung cancer), HCC827 cells (derived from human non-small cell lung cancer), and HCC4006 (derived from human non-small cell lung cancer).
  • Examples of HER2 gene-expressing cells include NCI-H2170 (derived from human non-small cell lung cancer), BT474 (derived from human breast cancer), HCC1419 (derived from human breast cancer), and MDA-MB-361 (derived from human breast cancer).
  • Examples of BCR / ABL fusion gene-expressing cells include K562 (derived from human leukemia), KCL22 (derived from human leukemia), KU812 (derived from human leukemia), and AR230 (derived from human leukemia).
  • Examples of PDGFR ⁇ gene-expressing cells include NCI-H1703 (derived from human non-small cell lung cancer).
  • EML4-ALK gene-expressing cells include NCI-H2228 (derived from human non-small cell lung cancer), NCI-H3122 (derived from human non-small cell lung cancer), and DFCI032 (derived from human non-small cell lung cancer).
  • Examples of c-MET gene-expressing cells include NCI-H1993 (derived from human non-small cell lung cancer), NCI-H820 (derived from human non-small cell lung cancer), and MKN45 (derived from human gastric cancer).
  • the artificial cell of the present invention can also express a foreign oncogene.
  • the term “foreign oncogene” means an oncogene introduced into a cancer cell in the process of establishing the artificial cell of the present invention using the above-described cancer cell as a material.
  • a foreign oncogene is an oncogene of a different type from a unique oncogene.
  • the foreign oncogene may be a single gene or a plurality of genes.
  • the term “foreign” means a concept that conflicts with the term “native” as described above.
  • exogenous oncogene examples include an oncogene derived from a mammal.
  • examples of mammalian species include humans, monkeys, cows, pigs, mice, rats, guinea pigs, hamsters, and rabbits. From the viewpoint of clinical application, the mammalian species is preferably human.
  • exogenous oncogenes examples include tyrosine kinases (receptor type, non-receptor type), serine / threonine kinases, low molecular weight G proteins, and transcription factors, with tyrosine kinases being preferred.
  • Tyrosine kinases that can be responsible for the growth of cancer cells are similar to those described above for native oncogenes.
  • the exogenous oncogene can be an oncogene capable of transmitting a proliferation signal in a signal transduction pathway of a molecule belonging to the EGFR gene family.
  • oncogenes are similar to those described above for the unique oncogenes.
  • the exogenous oncogene can be an oncogene that can transmit a proliferation signal in the signal transduction pathway of molecules belonging to the PDGFR gene family.
  • Such oncogenes are similar to those described above for the unique oncogenes.
  • the unique oncogene may be an oncogene capable of transmitting a proliferation signal in the signal transduction pathway of an ALK gene (eg, an ALK mutant gene such as EML4-ALK described below).
  • an ALK mutant gene such as EML4-ALK described below.
  • the foreign oncogene can be a PDGFR ⁇ mutant gene or an ALK mutant gene.
  • PDGFR ⁇ mutant genes include genes generated by the mutations described above.
  • PDGFR ⁇ mutant genes that are oncogenes include genes in which point mutations have occurred in PDGFR ⁇ (eg, V561D, D842V).
  • ALK mutant genes that are oncogenes include ALK fusion genes and genes in which point mutations have occurred in ALK.
  • Examples of the ALK fusion gene include EML4-ALK gene, NPM-ALK gene, TPM3-ALK gene, TPM4-ALK gene, ATIC-ALK gene, TFG-ALK gene, CLTC-ALK gene, MSN-ALK gene, MYH9- Examples include ALK gene, ALO17-ALK gene, CARS-ALK gene, RANBD2-ALK gene, and SFC31L1-ALK gene.
  • EML4-ALK gene various variants are known as ALK. Examples of such variants include Variant 1, Variant 2, Variant 3 (eg, 3a, 3b), Variant 4, Variant 5 (eg, 5a, 5b), Variant 6, and Variant 7 (eg, J Clin Oncol. 2009 Sep 10; 27 (26): 4232-5).
  • the expression of a foreign oncogene can be achieved by introducing an artificial expression vector (eg, plasmid, adenovirus, retrovirus) into which a promoter that induces the expression of the gene is incorporated together with the foreign gene.
  • Expression can be transient or constitutive (ie, stable) expression.
  • transient expression of a foreign oncogene can be achieved by a cancer cell immediately after the expression vector of the foreign oncogene is introduced into the cancer cell and expression of the gene is started.
  • the constitutive expression of a foreign oncogene can be achieved by introducing a foreign oncogene into a cancer cell and selecting a cell in which the insert is incorporated into the genome.
  • the artificial cells of the present invention may also have the ability to proliferate depending on foreign oncogenes.
  • the term “ability to proliferate depending on a foreign oncogene” for an artificial cell means that the artificial cell that expresses the foreign oncogene proliferates due to the foreign oncogene. It means that it can grow by signal. Therefore, an artificial cell that expresses an exogenous oncogene depends on the exogenous oncogene, even if it inhibits the expression or function of the intrinsic oncogene when it further expresses the intrinsic oncogene. Can proliferate.
  • Whether or not the artificial cell grows depending on the foreign oncogene is evaluated, for example, whether or not the proliferative ability of the artificial cell can be reduced under conditions that inhibit the expression or function of the foreign oncogene. This can be confirmed. In addition, whether or not artificial cells grow depending on foreign oncogenes can be confirmed by evaluating whether or not the proliferative ability of artificial cells can be maintained under conditions that inhibit specific oncogenes. it can.
  • Inhibition of the function of a foreign oncogene in an artificial cell can be achieved by, for example, a foreign oncogene inhibitor.
  • a foreign oncogene inhibitor As used herein, the term “inhibitor of a foreign oncogene” can inhibit the growth of cancer cells described above by inhibiting the expression or function of the mRNA or protein of the foreign cancer gene described above. Means a substance.
  • the foreign oncogene inhibitor includes, for example, an antisense nucleic acid (eg, an artificial nucleic acid such as DNA, RNA, and PNA) against an mRNA expressed from a foreign oncogene, an RNA interference-inducing nucleic acid ( Examples, siRNA: Either double-stranded RNA or single-stranded RNA having a stem-loop structure) and aptamers, and antibodies to proteins expressed from foreign oncogenes (eg, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humans) Antibody, human antibody, single chain antibody such as scFv), and expression vectors thereof.
  • An inhibitor of a foreign oncogene can also be a small molecule compound.
  • the intrinsic oncogene inhibitor may be a substance that inhibits cell proliferation due to cell death caused by apoptosis. A person skilled in the art can easily prepare such an inhibitor by obtaining information (eg, sequence information) of a target gene.
  • the foreign oncogene inhibitor is a molecularly targeted drug that targets the oncogene.
  • a molecular target drug examples include the molecular target drugs described in the above-mentioned inhibitors of intrinsic oncogenes.
  • the artificial cell of the present invention can also retain the ability to express an oncogene specific to a cancer cell and to proliferate depending on the specific oncogene (the ability of a cancer cell that can be used to establish an artificial cell).
  • the term “ability to proliferate depending on a unique oncogene” for an artificial cell refers to a foreign cancer gene and an artificial cell that expresses the unique oncogene. It means that it can proliferate by a proliferation signal caused by a gene. Therefore, an artificial cell that expresses a foreign oncogene and a specific oncogene can proliferate depending on the specific oncogene even when the expression or function of the foreign oncogene is inhibited.
  • an artificial cell proliferates depending on a specific oncogene is evaluated, for example, whether or not the proliferative ability of the artificial cell can be reduced under conditions that inhibit the expression or function of the specific oncogene. This can be confirmed. In addition, whether or not the artificial cell grows depending on the unique oncogene is confirmed by evaluating whether or not the proliferative ability of the artificial cell can be maintained under conditions that inhibit the foreign oncogene. it can.
  • cancer cells, unique oncogenes and foreign oncogenes may be derived from the same mammalian species. From the viewpoint of clinical application, cancer cells, unique oncogenes and foreign oncogenes are preferably of human origin. However, since oncogenes may be derived from viruses, unique oncogenes and / or foreign oncogenes may be derived from viruses.
  • the artificial cell of the present invention may express one or more other exogenous genes in addition to the exogenous oncogene.
  • foreign genes include foreign oncogene activators (eg, secreted proteins such as EGF, PDGF, HGF, etc.).
  • the artificial cell of the present invention can also be characterized as follows (A) and (B).
  • the present invention provides the artificial cell establishment method (ie, production method) of the present invention.
  • the establishment method of the present invention may include the following steps (a) to (c): (A) treating cancer cells with a foreign oncogene expression vector; (B) culturing cancer cells treated with the expression vector under conditions that inhibit expression or function of an oncogene specific to the cancer cells; and (c) cancer cells grown in step (b) A step of obtaining an exogenous oncogene as an artificial cell having the ability to express and proliferate depending on the exogenous oncogene.
  • a cancer cell is treated with an exogenous oncogene expression vector in a culture medium, whereby the exogenous oncogene expression vector can be introduced into the cancer cell.
  • the treatment for introducing the expression vector into cancer cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a liposome method.
  • the culture medium can be prepared using a medium used for culturing mammalian cells as a basal medium.
  • the basal medium include MEM medium, DMEM medium, ⁇ MEM medium, ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • the culture medium is, for example, serum (eg, FCS), serum substitute (eg, KSR), fatty acid or lipid, amino acid, vitamin, cytokine, antioxidant, 2-mercaptoethanol, pyruvate, buffer, inorganic salts, etc. Can be included. Other conditions such as the number of cells in culture and the concentration of various factors can be appropriately set.
  • Cancer cells can be obtained by a method known per se.
  • cancer cells can be isolated from a mammalian species afflicted with cancer and can be obtained by establishing a cell line after isolation. Existing cell lines can also be used as cancer cells.
  • One skilled in the art can identify oncogenes specific to the obtained cancer cells and easily determine whether the cancer cells have the ability to grow depending on the specific cell growth factor gene. Can do.
  • the promoter used in the expression vector is not particularly limited as long as it can function in the introduced cell.
  • a viral promoter eg, SV40-derived early promoter, cytomegalovirus LTR, Rous sarcoma virus LTR, MoMuLV-derived LTR).
  • Adenovirus-derived early promoter eg, ⁇ -actin gene promoter, PGK gene promoter, transferrin gene promoter.
  • the expression vector preferably contains a transcription termination signal (ie, terminator region) downstream of the oligo (poly) nucleotide encoding the nucleic acid molecule.
  • a transcription termination signal ie, terminator region
  • the expression vector may contain a resistance gene for a drug (eg, G418), such a resistance gene is essentially unnecessary in the establishment method of the present invention. It does not have to be included.
  • the basic vector of an expression vector used for introducing a foreign gene into a cancer cell is, for example, a plasmid or a viral vector (eg, adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus). , Virus-derived vectors such as Sindbis virus, Sendai virus, and lentivirus).
  • a viral vector eg, adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus.
  • Virus-derived vectors such as Sindbis virus, Sendai virus, and lentivirus.
  • the cancer cells treated with the expression vector in the step (a) are cultured under conditions that inhibit the expression or function of the intrinsic oncogene, thereby introducing the introduced foreign oncogene. Cancer cells that have acquired dependence on can selectively proliferate. Conditions that inhibit the expression or function of native oncogenes can be achieved by culturing in the presence of native oncogene inhibitors (and in the absence of foreign oncogene inhibitors). This step can be performed in the absence of the drug even if the expression vector contains a drug resistance gene for the specific drug.
  • the culture temperature is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • an artificial cell having the ability to express a foreign oncogene and proliferate depending on the foreign oncogene is obtained by collecting the cells grown in the step (b). .
  • the establishment method of the present invention may further include a step of cloning the artificial cells obtained in step (c) in order to establish a cell line of artificial cells.
  • Artificial cells can be cloned by a method known per se, such as a limiting dilution method.
  • the establishment method of the present invention may further include a step of confirming the expression of a foreign oncogene for the artificial cell and / or a step of confirming the ability of the artificial cell to proliferate depending on the foreign oncogene. Good. Such a process can be performed in the same manner as described above for evaluating whether or not cancer cells grow depending on a foreign oncogene.
  • the establishment method of the present invention may further include a step of confirming whether or not the artificial cell retains the ability to proliferate depending on a unique oncogene.
  • a step can be performed, for example, in the same manner as described above for evaluating whether or not a cancer cell grows depending on a unique oncogene.
  • the establishment method of the present invention comprises a cancer cell that has acquired dependence on an introduced foreign oncogene for the purpose of establishing an artificial cell such as (B1) and (B3) described above, and a specific oncogene inhibitor.
  • the process of processing by may be further included.
  • the establishment method of the present invention also destroys a unique oncogene in a cancer cell that has acquired dependence on an introduced foreign oncogene for the establishment of an artificial cell as in (B2) and (B4) above.
  • the process of carrying out may be further included.
  • Cancer cells that have acquired dependence on foreign oncogenes can proliferate without requiring unique oncogenes.
  • the destruction of the intrinsic oncogene can be performed, for example, by using a gene knockout technique using a targeting vector for the gene. Artificial cells in which unique oncogenes are destroyed are useful for the development of substances having specific anticancer activity against foreign oncogenes.
  • the establishment method of the present invention may further include a step of providing cancer cells used in step (a).
  • Providing a cancer cell comprises obtaining the cancer cell, then identifying a unique oncogene that the cancer cell expresses, and whether the cancer cell can proliferate depending on the identified unique oncogene. It may include confirming.
  • the step of providing the cancer cell obtains the cancer cell. May contain only to do.
  • Cancer cells can be isolated from a mammalian species afflicted with cancer, and may be obtained by establishing a cell line after isolation. Existing cell lines can also be used as cancer cells.
  • the present invention provides a screening method for a substance having anticancer activity.
  • the screening method of the present invention may comprise the following steps (a) and (b): (A) evaluating whether or not the test substance inhibits the proliferation of artificial cells; and (b) selecting a test substance that inhibits the proliferation of artificial cells as a substance having anticancer activity.
  • the evaluation can be performed by culturing the artificial cell in the presence of the test substance, and then determining whether the test substance inhibits the proliferation of the artificial cell.
  • the culture medium and the culture conditions are the same as those described in the establishment method of the present invention. Whether or not the test substance inhibits the growth of artificial cells is determined by, for example, comparing the number of cells cultured in the presence of the test substance with the number of cells cultured in the absence of the test substance. be able to. The determination can also be performed by measuring an index of cell proliferation (eg, activity of a specific protein, amount of phosphorylated protein). The determination may also be made based on whether the test substance can induce apoptosis.
  • an index of cell proliferation eg, activity of a specific protein, amount of phosphorylated protein
  • the test substance can be any compound, for example, a low molecular weight compound, a compound library prepared using combinatorial chemistry techniques, a nucleic acid (eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide), a carbohydrate (eg, a monosaccharide) , Disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides), lipids (eg, saturated or unsaturated linear, branched and / or cyclic fatty acids), amino acids, proteins (eg, oligopeptides, polypeptides), solid phase synthesis or Examples include random peptide libraries prepared by the phage display method, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
  • a nucleic acid eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide
  • a carbohydrate eg, a monosaccharide
  • the test substance can also be a mutant of a tumor suppressor gene.
  • a tumor suppressor gene mutant expression vector can be introduced into the artificial cell.
  • Step (a) may be performed under conditions that inhibit the expression or function of a specific oncogene.
  • Conditions that inhibit the expression or function of native oncogenes can be achieved, for example, by culturing cells in the presence of inhibitors of native oncogenes.
  • the step (a) is carried out in the presence of an inhibitor of a specific oncogene and a non-inhibitor of a foreign oncogene. It is preferably carried out in the presence.
  • This step can be performed in the absence of the drug even when the expression vector used for establishment of the artificial cell of the present invention contains a drug resistance gene for the specific drug.
  • a test substance that inhibits the proliferation of artificial cells is selected as a substance having an anticancer effect.
  • the test substance can be selected as a substance having an anticancer effect.
  • a test substance that inhibits the proliferation of artificial cells may be selected based on an index of cell proliferation (eg, activity of specific protein, amount of phosphorylated protein) or apoptosis induction.
  • the present invention provides a method for identifying an oncogene.
  • the identification method of the present invention may include the following steps (a) to (c): (A) treating cancer cells with an expression vector for a test gene; (B) a step of culturing cancer cells treated with the expression vector under conditions that inhibit the expression or function of an oncogene unique to the cancer cells; and (c) the cancer cells cultured in step (b). Confirming whether or not is proliferated depending on the test gene.
  • step (a) of the identification method the above-described cancer cell is treated with the test gene expression vector in a culture medium, whereby the test gene expression vector can be introduced into the cancer cell.
  • the treatment for introducing the expression vector into cancer cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a liposome method.
  • the cancer cells, expression vectors, and culture medium used in this step are the same as those described in step (a) in the establishment method of the present invention.
  • the test gene is any gene derived from a mammalian species or a pathogen that can cause cancer (eg, virus), and is not particularly limited, and examples thereof include an overexpressed gene or a mutant gene found in cancer cells. According to the identification method of the present invention, such an overexpressed gene or mutant gene is only generated as a result of canceration of cancer cells, or is a causative factor of canceration (ie, an oncogene). It can be found out.
  • the test gene can also be a single gene or multiple genes.
  • a gene library containing a large number of genes may be used as the plurality of genes.
  • An example of a gene library is a cDNA library prepared from a cancer tissue sample prepared from cultured cancer cells or taken from a cancer patient.
  • Another example of a gene library is a cDNA library prepared from stem or germ cells, or normal cells.
  • step (b) of the identification method the cancer cell treated with the expression vector in step (a) is cultured under conditions that inhibit the expression or function of a specific oncogene, whereby the introduced test gene is cancerous.
  • a specific oncogene cancer cells that have acquired dependence on the test gene can selectively proliferate.
  • Conditions that inhibit the expression or function of native oncogenes can be achieved by culturing in the presence of inhibitors of native oncogenes.
  • the culture conditions are the same as those described in step (b) in the establishment method of the present invention. This step can be performed in the absence of the drug even if the expression vector that can be included in the establishment of the artificial cell of the present invention contains a drug resistance gene for the specific drug.
  • step (c) of the identification method it is confirmed whether the cancer cells cultured in step (b) proliferate depending on the test gene. Specifically, when the test gene is a single gene and the growth of cancer cells is confirmed, the test gene can be identified as an oncogene. In addition, when the test gene is a plurality of genes (eg, gene library) and the growth of cancer cells is confirmed, it can be determined that the cancer gene is included in the plurality of test genes.
  • the test gene is a single gene and the growth of cancer cells is confirmed, the test gene can be identified as an oncogene.
  • the test gene is a plurality of genes (eg, gene library) and the growth of cancer cells is confirmed, it can be determined that the cancer gene is included in the plurality of test genes.
  • the identification method of the present invention further includes the following steps in order to identify the oncogene contained in the plurality of test genes. May be: (D) cloning the proliferated cancer cells; and (e) identifying the test gene introduced into the cloned cancer cells as an oncogene.
  • step (d) of the identification method cancer cells into which a test gene that is an oncogene has been introduced are cloned. Cloning can be performed in the same manner as the above-described cloning of artificial cells.
  • the test gene introduced into the cloned cancer cell is identified as an oncogene.
  • the identification of a test gene introduced into a cancer cell can be accomplished by using the homologous recombination unit of the expression vector used (the test gene and the adjacency derived from the expression vector present 5 ′ and 3 ′ to the test gene
  • the test gene can also be identified by expression analysis of a DNA chip or the like.
  • the identification method of the present invention may further include the following steps: (F) A step of obtaining a test gene introduced into the cancer cell from the cancer cell grown in the step (c). (G) A step of cloning the acquired test gene and identifying it as an oncogene.
  • the test gene introduced into the cancer cell is obtained as a DNA fragment from the proliferated cancer cell.
  • the acquisition of a test gene introduced into a cancer cell can be accomplished by homologous recombination units of the expression vector used (the test gene and the adjacency derived from the expression vector existing 5 ′ and 3 ′ to the test gene). This can be carried out by amplifying (eg, PCR) DNA encoding an oncogene using the nucleotide sequence of the adjacent site in (including the site).
  • step (g) of the identification method the acquired test gene is cloned and an oncogene is identified.
  • the test gene is cloned by incorporating the DNA fragment of the test gene obtained in the step (f) into a plasmid that can be amplified in E. coli, introducing the plasmid into which the test gene is incorporated into E. coli, and then introducing the plasmid. This can be done by cloning E. coli.
  • Identification of the oncogene is performed by, for example, recovering a plasmid from cloned E. coli, amplifying the DNA encoding the oncogene incorporated in the plasmid (eg, PCR), and then determining the nucleotide sequence of the amplified DNA. This can be done.
  • Example 1 PC-9 cells (human non-small cell lung cancer (pulmonary adenocarcinoma)) that expresses a mutant EGFR that is an oncogene and that induces cell death due to apoptosis by EGFR inhibitor gefitinib
  • EGFR inhibitor gefitinib A plasmid pcDNA3.1 ( ⁇ ) in which another oncogene EML4-ALKvariant3a (see J Clin Oncol. 2009 Sep 10; 27 (26): 4232-5) and a G418 resistance gene are incorporated into It was introduced using a transfection reagent.
  • the plasmid-introduced cells were prepared in a G418-containing culture solution (1 mg / mL G418) prepared from RPMI1640 culture solution supplemented with 10% fetal bovine serum and the antibiotic kanamycin, or in a gefitinib-containing culture solution (1 ⁇ M gefitinib).
  • the cells were selectively cultured at 37 ° C. for 3 weeks. Extracts of cells grown in each selective culture medium were developed by SDS-PAGE, and transferred to a PVDF membrane, and subjected to Western blotting using a monoclonal antibody against ALK.
  • Example 2 The cells selectively grown in the culture solution containing gefitinib in Example 1 were limiting diluted to a 96-well plate. Cells grown as clones in a gefitinib-containing medium were selected, and each clonal cell extract was subjected to Western blotting using a monoclonal antibody against ALK. As a result, expression of EML4-ALKvariant3a was confirmed in the cell extracts of all 10 clones obtained (FIG. 2). This shows that this methodology is very excellent in the establishment efficiency of an oncogene expression cell.
  • Example 3 Experiments similar to Example 1 were conducted using gefitinib-sensitive cells HCC827 (human non-small cell lung cancer (lung adenocarcinoma) cell line) other than PC-9 cells, and EML4-ALKvariant3a gene-introduced cells were established. Further, EML4-ALKvariant1 gene (J Clin Oncol. 2009 Sep 10; 27 (26): 4232-5), which is a variant different from EML4-ALKvariant3a, was introduced into PC-9 cells in the same manner to establish expression cells. When the cell extract was subjected to SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane and Western blotted with an anti-ALK antibody, each target gene product was observed (FIG. 3). This result indicates that any ALK mutant gene can complement the growth of any cancer cell.
  • HCC827 human non-small cell lung cancer (lung adenocarcinoma) cell line
  • Example 4 Experiments similar to Example 1 were performed using PC-9 cells, and cells into which an oncogene PDGFR ⁇ V561D (Science 299 (5607), 708-10 (2003)) gene other than the EML4-ALK gene was established. When the cell extract was subjected to SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane and Western blotted with an anti-PDGFR ⁇ antibody, the target gene product was observed (FIG. 4).
  • PC-9 cells or cells obtained by introducing the oncogene PDGFR ⁇ V561D gene into PC-9 cells obtained in Example 4 were seeded in 96-well plates. After culturing the cells for 72 hours in culture solutions containing different concentrations of gefitinib, live cells were quantified by MTS assay. As a result, the proliferation of PC-9 cells was inhibited depending on the concentration of gefitinib, but the proliferation of the cells into which the PDGFR ⁇ V561D gene had been introduced was not inhibited (FIG. 5). This result indicates that PDGFR ⁇ V561D can complement mutant EGFR-dependent proliferation in PC-9 cells. This result also shows that any foreign oncogene can complement the growth of any cancer cell, considering the results of Examples 1-4 as well.
  • Example 6 Cells obtained by introducing the PDGFR ⁇ V561D gene into PC-9 cells obtained in Example 4 were seeded in 96-well plates. After culturing in a culture solution containing the PDGFR ⁇ inhibitor imatinib having a different concentration or a culture solution containing imatinib having a concentration different from that of 1 ⁇ M gefitinib, viable cells were quantified by MTS assay. As a result, it was confirmed that in the presence of 1 ⁇ M gefitinib, the proliferation of the cell into which the PDGFR ⁇ V561D gene was introduced was inhibited depending on the concentration of the PDGFR ⁇ inhibitor imatinib (FIG. 6).
  • Example 7 In place of the known oncogene expression plasmid, a gene library SuperScript Human Stem Cell cDNA Library (manufactured by Invitrogen) consisting of a plasmid group capable of expressing human embryonic stem cell-derived genes was prepared in the same manner as in Example 1 by PC- 9 cells were introduced. Cells into which the plasmid was introduced were selectively cultured at 37 ° C. for 3 weeks in a gefitinib-containing culture solution (1 ⁇ M gefitinib) prepared from RPMI1640 culture solution supplemented with 10% fetal bovine serum and the antibiotic kanamycin.
  • a gefitinib-containing culture solution (1 ⁇ M gefitinib) prepared from RPMI1640 culture solution supplemented with 10% fetal bovine serum and the antibiotic kanamycin.
  • the aTTB1 sequence located in the vicinity of the 5 ′ end upstream of the human embryonic stem cell-derived gene inserted into the plasmid which is a sequence commonly present in the plasmid group constituting the gene library, is a sense primer (aTTB1 primer), human Gene introduced into proliferated PC-9 cells by PCR reaction using the synthesized first strand cDNA as a template with the aTTB2 sequence located near the 3 'end downstream of the embryonic stem cell-derived gene as an antisense primer (aTTB2 primer) was amplified.
  • the amplified gene was inserted into a pGEM-T plasmid (Promega) by TA cloning, and Escherichia coli strain DH5 ⁇ was transformed with the gene insertion plasmid.
  • the transformed DH5 ⁇ was inoculated on ampicillin-containing LB agar medium and incubated at 37 ° C. overnight. Clones that formed colonies on the agar medium were cultured in 1 mL of ampicillin-containing LB liquid medium.
  • the proliferated Escherichia coli was recovered, the plasmid was recovered with a plasmid Miniprep Kit (manufactured by Qiagen), and the recovered plasmid was amplified by PCR using aTTB1 primer and aTTB2 primer as templates.
  • pGEM-T was obtained by using the recovered plasmid as a template and pGEM-T-derived sequence T7 and Sp6 sites as primers.
  • the DNA sequence inserted into the T plasmid was analyzed.
  • genes were found as gene sequence-derived gene sequences that can be amplified by the aTTB1 primer and the aTTB2 primer, and the full-length coding sequence (CDS) deciphered between them. These genes are thought to be novel oncogene candidates that can complement mutant EGFR-dependent growth in PC-9 cells.
  • the present invention is useful, for example, in the development of anticancer agents.

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Abstract

　本発明は、種々の癌に対して従来よりも優れた抗癌剤を開発し得る方法論を提供する。具体的には、本発明は、癌細胞を、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理し、次いで発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養することを含む、人工細胞の樹立方法、および樹立された人工細胞；試験物質が上記人工細胞の増殖を阻害するか否かを評価することを含む、抗癌剤のスクリーニング方法；ならびに、癌細胞を、試験遺伝子の発現ベクターで処理し、次いで、発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養することを含む、癌遺伝子の同定方法を提供する。

Description

癌遺伝子の同定方法、癌遺伝子発現細胞の樹立方法、および癌遺伝子標的薬のスクリーニング方法
　本発明は、癌遺伝子の同定方法、癌遺伝子発現細胞の樹立方法、および癌遺伝子標的薬のスクリーニング方法に関する。
　現在、抗癌剤の研究開発が活発に行なわれている。抗癌剤の研究開発に有効な手法としては、（１）癌遺伝子の同定、（２）癌遺伝子発現細胞の樹立、および（３）癌遺伝子標的薬のスクリーニングが挙げられる。
（１）癌遺伝子の同定
　特定の癌遺伝子をターゲットとした分子標的薬（例、ゲフィチニブ）の抗腫瘍効果が注目されており、抗腫瘍効果を奏する分子標的薬が開発されている。このような分子標的薬の開発において、新規標的分子として有望である癌遺伝子の同定方法が利用されている。このような同定方法の例は、癌遺伝子が含まれると期待される遺伝子ライブラリーを細胞中に導入し、形質転換能を示した細胞中に導入された遺伝子を癌遺伝子として選択する方法（以下、従来の同定方法１）である。例えば、非特許文献１は、マウス由来３Ｔ３細胞（非癌細胞）を利用した形質転換実験により新規癌遺伝子ＥＭＬ４－ＡＬＫが見出されたことを開示している。
　癌遺伝子の同定方法の別の例は、ＤＮＡチップや二次元電気泳動法により癌細胞または癌組織サンプルと正常細胞または正常組織サンプルの遺伝子発現を網羅的に解析し、両サンプル間における発現に差異が認められる遺伝子から癌遺伝子を選択する方法（以下、従来の同定方法２）である。
（２）癌遺伝子発現細胞の樹立
　癌遺伝子発現細胞の樹立方法としては、癌遺伝子を天然に発現する細胞株を被験体から単離する方法、ならびに癌遺伝子と共に薬剤耐性遺伝子（例、Ｇ４１８耐性遺伝子）を細胞に導入し、次いで癌遺伝子が導入された細胞を薬剤（例、Ｇ４１８）で選択する方法が挙げられる。
　また、癌遺伝子発現細胞の樹立に焦点を当てたものではないが、特許文献１は、サイトカイン依存性細胞株（非癌細胞）に対してリガンド受容体遺伝子および薬剤耐性遺伝子を導入することにより、リガンドまたはリガンド様物質、および薬剤耐性遺伝子に対する薬剤の存在下で増殖し得る細胞株を樹立できることを開示している。
（３）癌遺伝子標的薬のスクリーニング
　細胞を用いる癌遺伝子標的薬のスクリーニング方法の例は、癌遺伝子を天然に発現する癌細胞株を用いる方法（以下、従来のスクリーニング方法１）である。
　細胞を用いる癌遺伝子標的薬のスクリーニング方法の別の例は、癌遺伝子を導入した細胞を用いる方法（以下、従来のスクリーニング方法２）である。例えば、非特許文献１は、マウス由来ＩＬ－３依存性細胞株（非癌細胞であるＢａ／Ｆ３細胞）にＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子を導入し、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子をターゲットとした分子標的薬の効果を検証することを開示している。
　また、癌遺伝子標的薬のスクリーニングに焦点を当てたものではないが、特許文献１は、サイトカイン依存性細胞株（非癌細胞）に由来する上述の細胞株を用いることにより、リガンドまたはリガンド様物質をスクリーニングできることを開示している。
国際公開ＷＯ２００３／０１２０８７
Ｎａｔｕｒｅ，２００７，ｖｏｌ．４４８，ｐ５６１－５６６
　しかしながら、従来の手法は、抗癌剤の研究開発において利用する場合、以下のような問題点がある。
（１）癌遺伝子の同定
　従来の同定方法１は、癌遺伝子としての形質転換能を直接的に試験することにより行なわれることから、この方法により同定される遺伝子が癌遺伝子である確率は高い。しかしながら、この方法はヒトへの応用および汎用性に問題がある。この方法に用いられる正常培養細胞としては、げっ歯類由来の繊維芽細胞のみが一般的に利用できるものであり、ヒト由来の細胞や癌細胞、あるいは多くの癌の起源となる上皮細胞、血球細胞を用いた実験方法は確立されていない。また、従来の同定方法１に用いられるげっ歯類由来の繊維芽細胞は、初期の性質を長期間維持したまま継代するのが難しく、継代中に自然発生的に起こる形質転換により目的とする癌遺伝子の同定を困難にするリスクがある。
　従来の同定方法２は、癌遺伝子以外にも癌遺伝子の遺伝子発現によって誘導または抑制される多くの遺伝子を候補遺伝子として選択してしまうという問題がある。また、従来の同定方法２は、選択された多くの候補遺伝子のなかから癌遺伝子を最終的に同定するために、多くの候補遺伝子をさらに詳細に解析することを必要とする。
（２）癌遺伝子発現細胞の樹立
　従来の樹立方法は、多くの場合に癌遺伝子を癌細胞に導入し得ず、また、一度導入された癌遺伝子が細胞の継代により欠落し得るため、非効率的である。
（３）癌遺伝子標的薬のスクリーニング
　従来のスクリーニング方法１は、特定の癌遺伝子を天然に発現する特定の癌細胞株が入手可能である場合に可能であるが、任意の癌遺伝子を天然に発現する種々の癌細胞株を入手することは困難であるため、任意の癌遺伝子に対する標的薬のスクリーニングを行なうことは現実的に可能でない。
　従来のスクリーニング方法２は、汎用される培養細胞を用いて既知の癌遺伝子の阻害剤の効果を検証し得るが、上述したような癌遺伝子の同定および癌遺伝子発現細胞株の樹立に関する問題点のため、種々の培養細胞（例、ヒト細胞、癌細胞）を用いて種々の癌遺伝子の阻害剤の効果を効率的に検証することは依然として困難である。
　したがって、本発明の目的は、癌遺伝子の同定、癌遺伝子発現細胞株の樹立、および癌遺伝子標的薬のスクリーニングにおいて、これらの問題点を解消し得る新規方法論を提供することにある。
　ところで、癌遺伝子中毒（ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）または中毒（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）とは、癌細胞が特定の遺伝子に増殖を依存している状態である。特定の遺伝子に依存して増殖する癌細胞を、その遺伝子の阻害剤で処理すると、癌細胞の増殖が抑制され得ることが知られている。
　本願発明者らは、鋭意検討した結果、癌細胞における特定の癌遺伝子に対する依存が、別の癌遺伝子の導入により置換可能であることを見出した。本願発明者らはまた、本知見に基づき、癌細胞を、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理し、次いで、発現ベクターで処理された癌細胞を、癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養するという方法論により、選択的に増殖した人工細胞が得られること、およびこの選択的に増殖した人工細胞を癌細胞モデルとして使用できることを見出した。本願発明者らはまた、本方法論を利用することにより、癌遺伝子を同定できること、および本方法論で得られる選択的に増殖した癌細胞を利用することにより、抗癌剤を開発できることを見出し、本願発明を完成するに至った。特許文献１および非特許文献１は、癌遺伝子を導入するための細胞として、癌細胞を利用すること、および癌遺伝子が導入された癌細胞を、当該癌細胞に固有の癌遺伝子を阻害する条件下で培養することにより選択することを記載も示唆もしていない。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（ａ）および（ｂ）の特性を有する、人工細胞：
（ａ）癌細胞に由来する；および
（ｂ）外来の癌遺伝子を発現し、かつ該外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する。
〔２〕さらに以下（ｃ）の特性を有する、上記〔１〕の人工細胞：
（ｃ）前記癌細胞に固有の癌遺伝子を発現する能力、および該固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を保持する。
〔３〕人工細胞が細胞株である、上記〔１〕または〔２〕の人工細胞。
〔４〕人工細胞がヒト由来である、上記〔１〕～〔３〕のいずれかの人工細胞。
〔５〕人工細胞が接着細胞である、上記〔１〕～〔４〕のいずれかの人工細胞。
〔６〕人工細胞が肺由来である、上記〔１〕～〔５〕のいずれかの人工細胞。
〔７〕固有の癌遺伝子が固有のチロシンキナーゼ遺伝子である、上記〔２〕～〔６〕のいずれかの人工細胞。
〔８〕固有のチロシンキナーゼ遺伝子がＥＧＦＲ変異遺伝子である、上記〔７〕の人工細胞。
〔９〕外来の癌遺伝子が外来のチロシンキナーゼ遺伝子である、上記〔１〕～〔８〕のいずれかの人工細胞。
〔１０〕外来のチロシンキナーゼ遺伝子がＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子である、上記〔９〕の人工細胞。
〔１１〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、人工細胞の樹立方法：
（ａ）癌細胞を、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において増殖した癌細胞を、外来の癌遺伝子を発現し、かつ外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する人工細胞として得る工程。
〔１２〕さらに以下（ｄ）の工程を含む、上記〔１１〕の方法：
（ｄ）工程（ｃ）で得られた人工細胞をクローニングする工程。
〔１３〕以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、抗癌作用を有する物質のスクリーニング方法：
（ａ）試験物質が上記〔１〕～〔１０〕のいずれかの人工細胞の増殖を阻害するか否かを評価する工程；および
（ｂ）人工細胞の増殖を阻害する試験物質を、抗癌作用を有する物質として選択する工程。
〔１４〕工程（ａ）が固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で行なわれる、上記〔１３〕の方法。
〔１５〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、癌遺伝子の同定方法：
（ａ）癌細胞を、試験遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において培養された癌細胞が試験遺伝子に依存して増殖するか否かを確認する工程。
〔１６〕試験遺伝子が単一の遺伝子である、上記〔１５〕の方法。
〔１７〕試験遺伝子が複数の遺伝子であり、さらに以下の工程を含む、上記〔１５〕の方法：
（ｄ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞をクローニングする工程；および
（ｅ）クローニングされた癌細胞中に導入された試験遺伝子を、癌遺伝子として同定する工程。
〔１８〕試験遺伝子が複数の遺伝子であり、さらに以下の工程を含む、上記〔１５〕の方法：
（ｆ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞から癌細胞中に導入された試験遺伝子を取得する工程。
（ｇ）取得した試験遺伝子をクローニングし、癌遺伝子として同定する工程。
　本発明の人工細胞は、例えば、種々の癌に対して優れた抗癌剤の開発を可能とする。
　本発明の樹立方法は、例えば、外来の癌遺伝子を発現する細胞の樹立効率に優れる。
　本発明のスクリーニング方法は、例えば、任意の癌遺伝子を発現する任意の癌細胞を用いた抗癌剤の開発を可能にする。
　本発明の同定方法は、外来の癌遺伝子を発現する細胞の樹立効率に優れる本発明の樹立方法と方法論が同様であることから、例えば、癌遺伝子同定の感度および精度に優れる。
　また、本発明のこれらの方法は、汎用される培養細胞（例、癌細胞株）を用いて、簡便かつ慣用的な手法により行うことができるという利点を有する。
図１は、Ｇ４１８含有培養液（Ｇ４１８）またはゲフィチニブ含有培養液（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）中で増殖したＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子導入ＰＣ－９細胞における、ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａタンパク質の発現を示す図である。 図２は、ゲフィチニブ含有培養液中で選択的に増殖したＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子導入ＰＣ－９細胞の１０個のクローンにおける、ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａタンパク質の発現を示す図である。 図３は、ゲフィチニブ含有培養液中で増殖したＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子導入ＰＣ－９細胞（ＰＣ－９－ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒ３ａ）、ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ１遺伝子導入ＰＣ－９細胞（ＰＣ－９－ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒ１）およびＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子導入ＨＣＣ８２７細胞（ＨＣＣ８２７－ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒ３ａ）における、ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａまたはＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ１タンパク質の発現を示す図である。 図４は、ゲフィチニブ含有培養液中で増殖したＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ遺伝子導入ＰＣ－９細胞における、ＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄタンパク質の発現を示す図である。 図５は、種々の濃度のゲフィチニブの存在下における、ＰＣ－９細胞またはＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ遺伝子導入ＰＣ－９細胞の増殖百分率（％）を示す図である。 図６は、種々の濃度のＰＤＧＦＲα阻害剤イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）の存在下における、ＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ遺伝子導入ＰＣ－９細胞（１μＭ　ゲフィチニブの存在下または非存在下）の増殖百分率（％）を示す図である。 図７は、ＰＣ－９細胞における変異ＥＧＦＲ依存性増殖を補完し得る新規の癌遺伝子候補のアガロースゲル電気泳動を示す図である。
（１．人工細胞）
　本発明は、特定の人工細胞を提供する。本明細書中で用いられる場合、用語「人工細胞」とは、人為的に作製される細胞を意味する。
　本発明の人工細胞は、単離または精製された細胞であってもよい。細胞の単離または精製は、ＦＡＣＳ等の自体公知の方法により行うことができる。
　本発明の人工細胞は、癌細胞に由来し得る。したがって、本発明の人工細胞は、癌細胞により保持される細胞学的特性を引き継ぎ得る。例えば、癌細胞がヒト細胞である場合、本発明の人工細胞はヒト細胞であり得る。また、癌細胞が肺細胞である場合、本発明の人工細胞は肺細胞であり得る。
　本明細書中で用いられる場合、用語「癌細胞」とは、当該癌細胞により発現される特定の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する腫瘍細胞を意味する。癌細胞としては、初代培養細胞、細胞株または癌幹細胞が挙げられる。
　本明細書中で用いられる場合、細胞の増殖についての用語「依存」とは、細胞が特定の癌遺伝子に増殖を依拠している、癌遺伝子中毒（ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）または中毒（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）の状態をいう。細胞が特定の癌遺伝子に増殖を依拠しているか否かは、特定の癌遺伝子の阻害剤で細胞を処理し、次いで、処理された細胞の増殖能を評価することにより、確認できる。増殖能は、例えば、ＭＴＴアッセイ、ＭＴＳアッセイにより評価できる。また、特定の癌遺伝子に対して癌遺伝子中毒の細胞を、当該癌遺伝子の阻害剤で処理すると、アポトーシスによる細胞死が誘導され得ることが知られている。したがって、特定の癌遺伝子に対する細胞の癌遺伝子中毒は、例えば、当該癌遺伝子の阻害によりアポトーシスが誘導され得るか否かを評価することにより、確認してもよい。アポトーシス誘導は、例えば、ＴＵＮＥＬアッセイ、活性型カスパーゼの検出、ＡＮＮＥＸＩＮ　Ｖの検出により評価できる。
　癌細胞は、任意の組織に由来し得る。このような組織としては、例えば、呼吸器系組織（例、肺、気管、気管支、咽頭、鼻腔、副鼻腔）、消化器系組織（例、胃、小腸、大腸、直腸）、膵臓、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、心臓、甲状腺、副腎、前立腺、卵巣、子宮、脳、皮膚、ならびに血液組織（例、骨髄、末梢血）が挙げられる。別の観点では、癌細胞は、接着細胞または非接着細胞（すなわち、血球細胞）であり得るが、接着細胞が好ましい。さらに別の観点では、癌細胞は、上記組織又は上記組織以外の組織に存在する細胞であり得る。このような細胞としては、例えば、腺細胞（例、肺腺細胞、乳腺細胞）、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、間質細胞、繊維芽細胞、脂肪細胞、メサンギウム細胞、膵β細胞、神経細胞、グリア細胞、血球細胞が挙げられる。癌細胞は、好ましくは肺腺癌細胞である。
　本明細書中で用いられる場合、用語「癌」とは、上述の組織及び細胞種における任意の悪性腫瘍をいう。癌としては、例えば、接着細胞の異常を原因とし得る癌、血球細胞の異常を原因とし得る癌（例、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫）が挙げられるが、接着細胞の異常を原因とし得る癌が好ましい。具体的には、接着細胞の異常を原因とし得る癌としては、肺癌（例、扁平上皮がん、腺がんおよび大細胞がん等の非小細胞癌、ならびに小細胞癌）、消化器系癌（例、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、肉腫、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、固形癌、上皮性癌、中皮腫が挙げられる。用語「癌細胞」、「癌遺伝子」等の癌関連用語における「癌」もまた、同様の意味を示し得る。
　癌細胞は、任意の哺乳動物種に由来し得る。このような哺乳動物種としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギが挙げられる。臨床応用という観点から、哺乳動物種は、好ましくはヒトである。したがって、癌細胞は、癌患者から単離された癌細胞、またはそれに由来する癌細胞であってもよい。
　癌細胞は、ウイルス非感染細胞であっても、ウイルス感染細胞であってもよい。細胞に感染し得る発癌性ウイルスとしては、例えば、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスが挙げられる。癌細胞はまた、胚性幹細胞、体性幹細胞、または正常細胞から作製された人工の幹細胞（例、ｉＰＳ細胞）に由来する癌細胞であってもよい。
　本発明の人工細胞が由来する癌細胞は、固有の癌遺伝子を発現し得る。本明細書中で用いられる場合、用語「固有の癌遺伝子」とは、本発明の人工細胞の樹立において材料として用いられ得る癌細胞により発現される、癌細胞の増殖を担う癌遺伝子を意味する。癌遺伝子は、癌細胞において過剰発現している（例、遺伝子のコピー数の増加に伴う過剰発現）、過剰の増殖シグナルを伝達する遺伝子、または癌細胞において増殖シグナルを伝達し続けるような変異を生じる遺伝子であり得る。変異としては、例えば、点突然変異（例、置換）、欠失、付加、挿入、融合を引き起こす変異（例、逆位、転座）が挙げられる。本明細書中で用いられる場合、用語「遺伝子」は、変異遺伝子を意図していることがある。
　本明細書中で用いられる場合、用語「固有」とは、用語「外来」と対立する概念を意味する。したがって、癌細胞を材料として用いる本発明の人工細胞の樹立過程において、癌細胞に遺伝子が導入される場合、当該遺伝子は、癌細胞に対して外来である。一方、本発明の人工細胞の樹立過程において材料として用いられ得る癌細胞が保有している遺伝子は、たとえ癌細胞自体の樹立過程において導入または変異された遺伝子であっても、癌細胞に対して固有であるものとする。
　固有の癌遺伝子としては、例えば、哺乳動物またはウイルスに由来する癌遺伝子が挙げられる。哺乳動物種としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギが挙げられる。臨床応用という観点から、哺乳動物種は、好ましくはヒトである。ウイルスとしては、例えば、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルスが挙げられる。
　また、固有の癌遺伝子としては、例えば、チロシンキナーゼ（受容体型、非受容体型）、セリン・スレオニンキナーゼ等のキナーゼ、低分子量Ｇタンパク質、転写因子が挙げられるが、チロシンキナーゼが好ましい。癌細胞の増殖を担い得るチロシンキナーゼとしては、例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーに属する分子（例、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）遺伝子ファミリーに属する分子（例、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－ＭＥＴ）、幹細胞因子受容体（ｃ－ＫＩＴ）が挙げられる。
　一実施形態では、固有の癌遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子ファミリーに属する分子（例、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子としては、例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＹＣ、ＡＫＴ、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、ＰＫＣが挙げられる。
　別の実施形態では、固有の癌遺伝子は、ＰＤＧＦＲ遺伝子ファミリーに属する分子（例、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ）のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子としては、例えば、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＹＣ、ＡＫＴ、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、ＰＫＣが挙げられる。
　さらに別の実施形態では、固有の癌遺伝子は、ＡＬＫ遺伝子（例、後述するＡＬＫ変異遺伝子）のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子としては、例えば、ＲＡＳ、ＭＡＰキナーゼ、ＡＫＴ、ＰＩ３キナーゼ、ＳＴＡＴ３が挙げられる。
　固有の癌遺伝子はまた、後述する外来の癌遺伝子において説明した種類の癌遺伝子であってもよい。
　本発明の人工細胞が由来する癌細胞は、固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有し得る。本明細書中で用いられる場合、癌細胞についての用語「固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力」とは、固有の癌遺伝子を発現する癌細胞が、当該固有の癌遺伝子に起因する増殖シグナルにより増殖し得ることを意味する。したがって、固有の癌遺伝子を発現する癌細胞は、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害した場合、当該固有の癌遺伝子に依存して増殖し得ない。癌細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、例えば、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下（例、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下）で、癌細胞の増殖能が低下し得るか否かを評価することにより、確認できる。
　癌細胞における固有の癌遺伝子の機能の阻害は、例えば、固有の癌遺伝子の阻害剤または遺伝子破壊により達成することができる。本明細書中で用いられる場合、用語「固有の癌遺伝子の阻害剤」とは、上述した固有の癌遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現または機能の阻害により、上述した癌細胞の増殖を阻害し得る物質を意味する。
　一実施形態では、固有の癌遺伝子の阻害剤としては、例えば、固有の癌遺伝子から発現するｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ等の人工核酸）、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡまたはステムループ構造を有する一本鎖ＲＮＡのいずれでもよい）およびアプタマー、ならびに固有の癌遺伝子から発現するタンパク質に対する抗体（例、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ｓｃＦｖ等の単鎖抗体）、ならびにこれらの発現ベクターが挙げられる。固有の癌遺伝子の阻害剤はまた、低分子化合物であり得る。固有の癌遺伝子の阻害剤は、アポトーシスに起因する細胞死により、細胞増殖を阻害する物質であってもよい。固有の癌遺伝子の破壊は、固有の癌遺伝子に対するターゲティングベクターにより行うことができる。当業者は、標的遺伝子の情報（例、配列情報）を入手することにより、このような阻害剤の作製および遺伝子破壊を容易に行うことができる。
　別の実施形態では、固有の癌遺伝子の阻害剤は、癌遺伝子を標的とする分子標的薬である。分子標的薬としては、例えば、以下が知られている。
１）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）およびセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）
２）ＨＥＲ２に対するトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｍａｂ）
３）ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質、ｃ－ＫＩＴおよびＰＤＧＦＲαに対する、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）
４）ｃ－ＭＥＴに対する、ＰＨＡ－６６５７５２およびＳＵ－１１２７４（例、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，ｖｏｌ．３１６，ｐ１０３９－１０４３、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，ｖｏｌ．６５，ｐ１４７９－１４８８を参照）
５）ＡＬＫに対する、ＮＶＰ－ＴＡＥ６８４およびＰＦ－０２３４１０６６（例、ＰＮＡＳ，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｐ２７０－２７５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，２００７、Ｖｏｌ．６，ｐ３３１４－３３２２を参照）
　本発明の人工細胞が由来する癌細胞は、既存の癌細胞および既存の分子標的薬を利用して本発明の人工細胞を容易に樹立するという観点からは、既存の分子標的薬が標的とし得る癌遺伝子を固有の癌遺伝子として発現している癌細胞が好ましい。このような癌細胞としては、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子発現細胞、ＨＥＲ２遺伝子発現細胞、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子発現細胞、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子発現細胞、ＰＤＧＦＲα遺伝子発現細胞、ｃ－ＭＥＴ遺伝子遺伝子発現細胞が挙げられる。ＥＧＦＲ遺伝子発現細胞としては、例えば、ＰＣ－９細胞（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＨＣＣ８２７細胞（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＨＣＣ４００６（ヒト非小細胞肺癌由来）が挙げられる。ＨＥＲ２遺伝子発現細胞としては、例えば、ＮＣＩ－Ｈ２１７０（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＢＴ４７４（ヒト乳癌由来）、ＨＣＣ１４１９（ヒト乳癌由来）、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１（ヒト乳癌由来）が挙げられる。ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子発現細胞としては、例えば、Ｋ５６２（ヒト白血病由来）、ＫＣＬ２２（ヒト白血病由来）、ＫＵ８１２（ヒト白血病由来）、ＡＲ２３０（ヒト白血病由来）が挙げられる。ＰＤＧＦＲα遺伝子発現細胞としては、例えば、ＮＣＩ－Ｈ１７０３（ヒト非小細胞肺癌由来）が挙げられる。ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子発現細胞としては、例えば、ＮＣＩ－Ｈ２２２８（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＮＣＩ－Ｈ３１２２（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＤＦＣＩ０３２（ヒト非小細胞肺癌由来）が挙げられる。ｃ－ＭＥＴ遺伝子発現細胞としては、例えば、ＮＣＩ－Ｈ１９９３（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＮＣＩ－Ｈ８２０（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＭＫＮ４５（ヒト胃癌由来）が挙げられる。
　本発明の人工細胞はまた、外来の癌遺伝子を発現し得る。本明細書中で用いられる場合、用語「外来の癌遺伝子」とは、上述した癌細胞を材料として用いる本発明の人工細胞の樹立過程において、癌細胞に対して導入される癌遺伝子を意味する。外来の癌遺伝子は、固有の癌遺伝子と種類が異なる癌遺伝子である。外来の癌遺伝子は、単一の遺伝子であっても、複数の遺伝子であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「外来」とは、上述したように、用語「固有」と対立する概念を意味する。
　外来の癌遺伝子としては、例えば、哺乳動物に由来する癌遺伝子が挙げられる。哺乳動物種としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギが挙げられる。臨床応用という観点から、哺乳動物種は、好ましくはヒトである。
　外来の癌遺伝子としては、例えば、チロシンキナーゼ（受容体型、非受容体型）、セリン・スレオニンキナーゼ等のキナーゼ、低分子量Ｇタンパク質、転写因子が挙げられるが、チロシンキナーゼが好ましい。癌細胞の増殖を担い得るチロシンキナーゼは、固有の癌遺伝子において上述したものと同様である。
　一実施形態では、外来の癌遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子ファミリーに属する分子のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子は、固有の癌遺伝子において上述したものと同様である。
　別の実施形態では、外来の癌遺伝子は、ＰＤＧＦＲ遺伝子ファミリーに属する分子のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子は、固有の癌遺伝子において上述したものと同様である。
　さらに別の実施形態では、固有の癌遺伝子は、ＡＬＫ遺伝子（例、後述するＥＭＬ４－ＡＬＫ等のＡＬＫ変異遺伝子）のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子は、固有の癌遺伝子において上述したものと同様である。
　特定の実施形態では、外来の癌遺伝子は、ＰＤＧＦＲα変異遺伝子またはＡＬＫ変異遺伝子であり得る。このような変異遺伝子としては、例えば、上述したような変異により生じた遺伝子が挙げられる。癌遺伝子であるＰＤＧＦＲα変異遺伝子の代表的な例としては、ＰＤＧＦＲαに点突然変異が生じた遺伝子（例、Ｖ５６１Ｄ、Ｄ８４２Ｖ）が挙げられる。癌遺伝子であるＡＬＫ変異遺伝子の代表的な例としては、ＡＬＫ融合遺伝子、ＡＬＫに点突然変異が生じた遺伝子が挙げられる。ＡＬＫ融合遺伝子としては、例えば、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子、ＮＰＭ－ＡＬＫ遺伝子、ＴＰＭ３－ＡＬＫ遺伝子、ＴＰＭ４－ＡＬＫ遺伝子、ＡＴＩＣ－ＡＬＫ遺伝子、ＴＦＧ－ＡＬＫ遺伝子、ＣＬＴＣ－ＡＬＫ遺伝子、ＭＳＮ－ＡＬＫ遺伝子、ＭＹＨ９－ＡＬＫ遺伝子、ＡＬＯ１７－ＡＬＫ遺伝子、ＣＡＲＳ－ＡＬＫ遺伝子、ＲＡＮＢＤ２－ＡＬＫ遺伝子、ＳＦＣ３１Ｌ１－ＡＬＫ遺伝子が挙げられる。ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子において、ＡＬＫとしては、種々のバリアントが知られている。このようなバリアントとしては、例えば、バリアント１、バリアント２、バリアント３（例、３ａ、３ｂ）、バリアント４、バリアント５（例、５ａ、５ｂ）、バリアント６、バリアント７が挙げられる（例、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．２００９　Ｓｅｐ　１０；２７（２６）：４２３２－５を参照）。
　外来の癌遺伝子の発現は、外来の遺伝子と共にその遺伝子の発現を誘導するプロモーターが組み込まれた人工の発現ベクター（例、プラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス）を細胞に導入することにより達成できる。発現は、一過的発現または恒常的（すなわち、安定的）発現であり得る。例えば、外来の癌遺伝子の一過的発現は、外来の癌遺伝子の発現ベクターを癌細胞に導入し、その遺伝子の発現が開始される直後の癌細胞により達成できる。外来の癌遺伝子の恒常的発現は、外来の癌遺伝子を癌細胞に導入し、ゲノム中にインサートが組み込まれた細胞を選択することにより達成できる。
　本発明の人工細胞はまた、外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有し得る。本明細書中で用いられる場合、人工細胞についての用語「外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力」とは、外来の癌遺伝子を発現する人工細胞が、該外来の癌遺伝子に起因する増殖シグナルにより増殖し得ることを意味する。したがって、外来の癌遺伝子を発現する人工細胞は、固有の癌遺伝子をさらに発現している場合、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害した場合であっても、該外来の癌遺伝子に依存して増殖し得る。人工細胞が外来の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、例えば、外来の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で、人工細胞の増殖能が低下し得るか否かを評価することにより、確認できる。また、人工細胞が外来の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、固有の癌遺伝子を阻害する条件下で、人工細胞の増殖能が保持され得るか否かを評価することにより、確認できる。
　人工細胞における外来の癌遺伝子の機能の阻害は、例えば、外来の癌遺伝子の阻害剤により達成することができる。本明細書中で用いられる場合、用語「外来の癌遺伝子の阻害剤」とは、上述した外来の癌遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現または機能の阻害により、上述した癌細胞の増殖を阻害し得る物質を意味する。
　一実施形態では、外来の癌遺伝子の阻害剤としては、例えば、外来の癌遺伝子から発現するｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ等の人工核酸）、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡまたはステムループ構造を有する一本鎖ＲＮＡのいずれでもよい）およびアプタマー、ならびに外来の癌遺伝子から発現するタンパク質に対する抗体（例、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ｓｃＦｖ等の単鎖抗体）、ならびにこれらの発現ベクターが挙げられる。外来の癌遺伝子の阻害剤はまた、低分子化合物であり得る。固有の癌遺伝子の阻害剤は、アポトーシスに起因する細胞死により、細胞増殖を阻害する物質であってもよい。当業者は、標的遺伝子の情報（例、配列情報）を入手することにより、このような阻害剤の作製を容易に行なうことができる。
　別の実施形態では、外来の癌遺伝子の阻害剤は、癌遺伝子を標的とする分子標的薬である。このような分子標的薬としては、例えば、上述した固有の癌遺伝子の阻害剤において説明した分子標的薬が挙げられる。
　本発明の人工細胞はまた、癌細胞に固有の癌遺伝子を発現する能力、および固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力（人工細胞の樹立に用いられ得る癌細胞の能力）を保持し得る。本明細書中で用いられる場合、人工細胞についての用語「固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力」とは、外来の癌遺伝子および固有の癌遺伝子を発現する人工細胞が、該固有の癌遺伝子に起因する増殖シグナルにより増殖し得ることを意味する。したがって、外来の癌遺伝子および固有の癌遺伝子を発現する人工細胞は、外来の癌遺伝子の発現または機能を阻害した場合であっても、該固有の癌遺伝子に依存して増殖し得る。人工細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、例えば、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で、人工細胞の増殖能が低下し得るか否かを評価することにより、確認できる。また、人工細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、外来の癌遺伝子を阻害する条件下で、人工細胞の増殖能が保持され得るか否かを評価することにより、確認できる。
　本発明の人工細胞は、天然の癌細胞をより模倣することが所望され得る。したがって、癌細胞、固有の癌遺伝子および外来の癌遺伝子は、同一の哺乳動物種に由来していてもよい。臨床応用の観点から、癌細胞、固有の癌遺伝子および外来の癌遺伝子は、好ましくはヒト由来である。しかしながら、癌遺伝子はウイルス由来である場合があるため、固有の癌遺伝子および／または外来の癌遺伝子は、ウイルス由来であってもよい。
　本発明の人工細胞は、外来の癌遺伝子に加えて、１以上の他の外来の遺伝子を発現していてもよい。このような外来の遺伝子としては、外来の癌遺伝子の活性化因子（例、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等の分泌タンパク質）が挙げられる。
　本発明の人工細胞はまた、以下（Ａ）および（Ｂ）のように特徴付けることができる。
（Ａ）外来の癌遺伝子および固有の癌遺伝子を発現する人工細胞：
（Ａ１）外来の癌遺伝子を一過的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を発現する人工細胞（例、外来の癌遺伝子の発現ベクターがトランスフェクトされた癌細胞）；および
（Ａ２）外来の癌遺伝子を恒常的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を発現する人工細胞（例、外来の癌遺伝子をゲノム中に組み込んでいる癌細胞）。
（Ｂ）外来の癌遺伝子を発現し、かつ固有の癌遺伝子を発現し得ない人工細胞：
（Ｂ１）外来の癌遺伝子を一過的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を一過的に発現し得ない人工細胞（例、固有の癌遺伝子の阻害剤で処理された、外来の癌遺伝子の発現ベクターがトランスフェクトされた癌細胞）；
（Ｂ２）外来の癌遺伝子を一過的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を恒常的に発現し得ない人工細胞（例、固有の癌遺伝子が破壊された、外来の癌遺伝子の発現ベクターがトランスフェクトされた癌細胞）；
（Ｂ３）外来の癌遺伝子を恒常的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を一過的に発現し得ない人工細胞（例、固有の癌遺伝子の阻害剤で処理された、外来の癌遺伝子をゲノム中に組み込んでいる癌細胞）；および
（Ｂ４）外来の癌遺伝子を恒常的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を恒常的に発現し得ない人工細胞（例、固有の癌遺伝子が破壊された、外来の癌遺伝子をゲノム中に組み込んでいる癌細胞）。
（２．人工細胞の樹立方法）
　本発明は、本発明の人工細胞の樹立方法（即ち、作製方法）を提供する。本発明の樹立方法は、以下の工程（ａ）～（ｃ）を含み得る：
（ａ）癌細胞を、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において増殖した癌細胞を、外来の癌遺伝子を発現し、かつ外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する人工細胞として得る工程。
　樹立方法の工程（ａ）では、癌細胞を、培養培地において、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理することにより、外来の癌遺伝子の発現ベクターが、癌細胞に導入され得る。発現ベクターを癌細胞に導入するための処理としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポソーム法が挙げられる。
　培養培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。培養培地は、例えば、血清（例、ＦＣＳ）、血清代替物（例、ＫＳＲ）、脂肪酸または脂質、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含むことができる。培養における細胞数、各種因子の濃度等のその他の条件は、適宜設定できる。
　癌細胞は、自体公知の方法により入手することができる。例えば、癌細胞は、癌に罹患した哺乳動物種から単離することができ、また、単離後、細胞株を樹立することにより入手してもよい。また、既存の細胞株を、癌細胞として利用することもできる。当業者は、入手した癌細胞に固有の癌遺伝子を同定することができ、また、癌細胞が固有の細胞増殖因子遺伝子に依存して増殖する能力を有するか否かを、容易に決定することができる。
　発現ベクターで用いられるプロモーターは、導入される細胞で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ウイルスプロモーター（例、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター）、哺乳動物由来の構成遺伝子プロモーター（例、β－アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター）が挙げられる。
　発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル（すなわち、ターミネーター領域）を含む。さらに、発現ベクターは、薬剤（例、Ｇ４１８）に対する耐性遺伝子を含んでいてもよいが、本発明の樹立方法では、このような耐性遺伝子は本質的に不要であるため、このような耐性遺伝子を含んでいなくてもよい。
　外来の遺伝子を癌細胞に導入するために用いられる発現ベクターの基本ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス等のウイルス由来ベクター）であり得る。
　樹立方法の工程（ｂ）では、工程（ａ）において発現ベクターで処理された癌細胞を、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養することにより、導入された外来の癌遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞が、選択的に増殖し得る。固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件は、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下（および外来の癌遺伝子の阻害剤の非存在下）で培養することにより達成され得る。本工程は、発現ベクターが特定の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子を含む場合であっても、当該薬剤の非存在下で行うことができる。培養温度は、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約５％である。
　樹立方法の工程（ｃ）では、工程（ｂ）において増殖した細胞を回収することにより、外来の癌遺伝子を発現し、かつ外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する人工細胞が得られる。
　本発明の樹立方法は、人工細胞の細胞株を樹立するために、工程（ｃ）で得られた人工細胞をクローニングする工程をさらに含んでいてもよい。人工細胞のクローニングは、例えば、限界希釈法等の自体公知の方法により行うことができる。
　本発明の樹立方法は、人工細胞についての外来の癌遺伝子の発現を確認する工程、および／または人工細胞についての外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を確認する工程をさらに含んでいてもよい。このような工程は、例えば、癌細胞が外来の癌遺伝子に依存して増殖するか否かを評価する上述した方法と同様にして行うことができる。
　本発明の樹立方法はまた、人工細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を保持するか否かを確認する工程をさらに含んでいてもよい。このような工程は、例えば、癌細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖するか否かを評価する上述した方法と同様にして行うことができる。
　本発明の樹立方法は、上記（Ｂ１）および（Ｂ３）のような人工細胞の樹立のために、導入された外来の癌遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞を、固有の癌遺伝子の阻害剤により処理する工程をさらに含んでいてもよい。本発明の樹立方法はまた、上記（Ｂ２）および（Ｂ４）のような人工細胞の樹立のために、導入された外来の癌遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞において、固有の癌遺伝子を破壊する工程をさらに含んでいてもよい。外来の癌遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞は、固有の癌遺伝子を要することなく、増殖し得る。固有の癌遺伝子の破壊は、例えば、当該遺伝子に対するターゲティングベクターを用いる遺伝子ノックアウト技術を利用することにより行うことができる。固有の癌遺伝子が破壊された人工細胞は、外来の癌遺伝子に対する特異的な抗癌作用を有する物質の開発に有用である。
　本発明の樹立方法はまた、工程（ａ）において用いられる癌細胞を提供する工程をさらに含んでいてもよい。癌細胞を提供する工程は、癌細胞を入手し、次いで、癌細胞が発現する固有の癌遺伝子を同定すること、および同定された固有の癌遺伝子に依存して癌細胞が増殖し得るか否かを確認することを含んでいてもよい。一方、入手した細胞がこのような特性を有することが明らかである場合（例、入手した細胞が、キャラクタライズされている癌細胞である場合）、癌細胞を提供する工程は、癌細胞を入手することのみを含んでいてもよい。癌細胞は、癌に罹患した哺乳動物種から単離することができ、また、単離後、細胞株を樹立することにより入手してもよい。また、既存の細胞株を、癌細胞として利用することもできる。
（３．抗癌作用を有する物質のスクリーニング方法）
　本発明は、抗癌作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含み得る：
（ａ）試験物質が人工細胞の増殖を阻害するか否かを評価する工程；および
（ｂ）人工細胞の増殖を阻害する試験物質を、抗癌作用を有する物質として選択する工程。
　スクリーニング方法の工程（ａ）では、評価は、試験物質の存在下で人工細胞を培養し、次いで、試験物質が人工細胞の増殖を阻害するか否かを判定することにより行うことができる。培養培地、培養条件は、本発明の樹立方法で説明したものと同様である。試験物質が人工細胞の増殖を阻害するか否かの判定は、例えば、試験物質の非存在下で培養した細胞数に対して、試験物質の存在下で培養した細胞数を比較することにより行うことができる。判定はまた、細胞増殖の指標（例、特定のタンパク質の活性、リン酸化タンパク質の量）を測定することにより行うことができる。判定はまた、試験物質がアポトーシスを誘導し得るか否かに基づいて行われてもよい。
　試験物質は、任意の化合物であり得、例えば、低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖および／または環を含む脂肪酸）、アミノ酸、蛋白質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、固相合成またはファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
　試験物質はまた、癌抑制遺伝子の変異体であり得る。この場合、癌抑制遺伝子の変異体の発現ベクターが人工細胞に導入され得る。癌抑制遺伝子の変異体が本発明の人工細胞の増殖を阻害するか否かを評価することにより、癌抑制遺伝子の機能を喪失させ得るような変異が同定され得る。
　工程（ａ）は、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で行なわれてもよい。固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件は、例えば、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下で細胞を培養することにより達成され得る。外来の癌遺伝子に対して特異的な抗癌作用を有する物質をスクリーニングするという観点からは、工程（ａ）は、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下および外来の癌遺伝子に対する阻害剤の非存在下で行なうことが好ましい。本工程は、本発明の人工細胞の樹立に用いられた発現ベクターが特定の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子を含む場合であっても、当該薬剤の非存在下で行うことができる。
　スクリーニング方法の工程（ｂ）では、人工細胞の増殖を阻害する試験物質が、抗癌作用を有する物質として選択される。例えば、試験物質の存在下で培養された細胞数が、試験物質の非存在下で培養された細胞に比して少ない場合、当該試験物質が、抗癌作用を有する物質として選択され得る。また、細胞増殖の指標（例、特定のタンパク質の活性、リン酸化タンパク質の量）またはアポトーシス誘導に基づいて、人工細胞の増殖を阻害する試験物質を選択してもよい。
（４．癌遺伝子の同定方法）
　本発明は、癌遺伝子の同定方法を提供する。本発明の同定方法は、以下の工程（ａ）～（ｃ）を含み得る：
（ａ）癌細胞を、試験遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において培養された癌細胞が試験遺伝子に依存して増殖するか否かを確認する工程。
　同定方法の工程（ａ）では、上述した癌細胞を、培養培地において、試験遺伝子の発現ベクターで処理することにより、試験遺伝子の発現ベクターが、当該癌細胞に導入され得る。発現ベクターを癌細胞に導入するための処理としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポソーム法が挙げられる。本工程で用いられる癌細胞、発現ベクターおよび培養培地は、本発明の樹立方法における工程（ａ）で説明したものと同様である。
　試験遺伝子は、哺乳動物種または癌を引き起こし得る病原体（例、ウイルス）に由来する任意の遺伝子であり特に限定されないが、例えば、癌細胞において見出される過剰発現遺伝子または変異遺伝子が挙げられる。本発明の同定方法によれば、このような過剰発現遺伝子または変異遺伝子が、癌細胞の癌化の結果として生じているに過ぎないのか、または癌化の原因因子（即ち、癌遺伝子）であるのかが判明し得る。
　試験遺伝子はまた、単一の遺伝子または複数の遺伝子であり得る。複数の遺伝子として、多数の遺伝子を含む遺伝子ライブラリーを使用してもよい。遺伝子ライブラリーの例は、培養癌細胞から調製された、または癌患者から採取された癌組織サンプルから調製されたｃＤＮＡライブラリーである。遺伝子ライブラリーの別の例は、幹細胞または生殖細胞、あるいは正常細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーである。
　同定方法の工程（ｂ）では、工程（ａ）において発現ベクターで処理された癌細胞を、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養することにより、導入された試験遺伝子が癌遺伝子である場合に当該試験遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞が、選択的に増殖し得る。固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件は、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下で培養することにより達成され得る。培養条件は、本発明の樹立方法における工程（ｂ）で説明したものと同様である。本工程は、本発明の人工細胞の樹立に含まれ得る発現ベクターが特定の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子を含む場合であっても、当該薬剤の非存在下で行うことができる。
　同定方法の工程（ｃ）では、工程（ｂ）において培養された癌細胞が、試験遺伝子に依存して増殖するか否かが確認される。具体的には、試験遺伝子が単一の遺伝子であり、かつ癌細胞の増殖が確認された場合、試験遺伝子が癌遺伝子であると同定され得る。また、試験遺伝子が複数の遺伝子（例、遺伝子ライブラリー）であり、かつ癌細胞の増殖が確認された場合、複数の試験遺伝子のなかに癌遺伝子が含まれると判定され得る。
　試験遺伝子が複数の遺伝子であり、かつ癌細胞の増殖が確認された場合、複数の試験遺伝子のなかに含まれる癌遺伝子を同定するために、本発明の同定方法は、さらに以下の工程を含んでいてもよい：
（ｄ）増殖した癌細胞をクローニングする工程；および
（ｅ）クローニングされた癌細胞中に導入された試験遺伝子を、癌遺伝子として同定する工程。
　同定方法の工程（ｄ）では、癌遺伝子である試験遺伝子が導入された癌細胞が、クローニングされる。クローニングは、上述した人工細胞のクローニングと同様に行うことができる。
　同定方法の工程（ｅ）では、クローニングされた癌細胞中に導入された試験遺伝子が、癌遺伝子として同定される。例えば、癌細胞中に導入された試験遺伝子の同定は、使用された発現ベクターの相同組換え単位（試験遺伝子、ならびに試験遺伝子に対して５’側および３’側に存在する発現ベクター由来の隣接部位を含む）中の隣接部位のヌクレオチド配列を利用して、癌遺伝子をコードするＤＮＡを増幅し（例、ＰＣＲ）、次いで、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することにより、行うことができる。試験遺伝子の同定はまた、ＤＮＡチップ等の発現解析により行うことができる。
　また、試験遺伝子が複数の遺伝子である場合、本発明の同定方法は、さらに以下の工程を含んでいてもよい：
（ｆ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞から癌細胞中に導入された試験遺伝子を取得する工程。
（ｇ）取得した試験遺伝子をクローニングし、癌遺伝子として同定する工程。
　同定方法の工程（ｆ）では、増殖した癌細胞から、癌細胞中に導入された試験遺伝子がＤＮＡ断片として取得される。例えば、癌細胞中に導入された試験遺伝子の取得は、使用された発現ベクターの相同組換え単位（試験遺伝子、ならびに試験遺伝子に対して５’側および３’側に存在する発現ベクター由来の隣接部位を含む）中の隣接部位のヌクレオチド配列を利用して、癌遺伝子をコードするＤＮＡを増幅（例、ＰＣＲ）することにより、行うことができる。
　同定方法の工程（ｇ）では、取得した試験遺伝子がクローニングされ、癌遺伝子が同定される。試験遺伝子のクローニングは、例えば、（ｆ）の工程で取得した試験遺伝子のＤＮＡ断片を大腸菌において増幅し得るプラスミドに組み込み、試験遺伝子が組み込まれたプラスミドを大腸菌に導入し、次いで、プラスミドが導入された大腸菌をクローニングすることにより行うことができる。癌遺伝子の同定は、例えば、クローニングされた大腸菌からプラスミドを回収し、プラスミド中に組み込まれた癌遺伝子をコードするＤＮＡを増幅し（例、ＰＣＲ）、次いで、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することにより、行うことができる。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　癌遺伝子である変異ＥＧＦＲを発現し、かつＥＧＦＲ阻害剤であるゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）によってアポトーシスによる細胞死が誘導され、その増殖が阻害されるＰＣ－９細胞（ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）由来細胞株）に、別の癌遺伝子ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ（Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．２００９　Ｓｅｐ　１０；２７（２６）：４２３２－５を参照）及びＧ４１８耐性遺伝子が組み込まれたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（－）を、トランスフェクション試薬を用いて導入した。その後、プラスミドを導入した細胞を、１０％のウシ胎児血清及び抗生物質カナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液から調製したＧ４１８含有培養液（１ｍｇ／ｍＬ　Ｇ４１８）、あるいはゲフィチニブ含有培養液（１μＭ　ゲフィチニブ）において、３週間、３７℃で選択培養した。それぞれの選択培養液で増殖した細胞の抽出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写したものをＡＬＫに対するモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングに供した。その結果、Ｇ４１８含有培養液で選択された細胞の抽出液中にＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａの発現が認められなかったが、ゲフィチニブ含有培養液で選択された細胞の抽出液中にＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａの発現が認められた（図１）。これらの結果は、細胞株ＰＣ－９に癌遺伝子ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａを導入することにより作製された細胞が、当該細胞に固有の癌遺伝子（癌遺伝子である変異ＥＧＦＲ）を阻害する条件下で、増殖し得ることを示す。
（実施例２）
　実施例１においてゲフィチニブ含有培養液で選択的に増殖した細胞を、９６ウェルプレートに限界希釈した。ゲフィチニブ含有培地中でクローンとして増殖した細胞を選択し、それぞれのクローン細胞の抽出液を、ＡＬＫに対するモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングに供した。その結果、得られた１０クローン全ての細胞抽出液中にＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａの発現が確認された（図２）。このことは、本方法論が癌遺伝子発現細胞の樹立効率に非常に優れることを示す。
（実施例３）
　ＰＣ－９細胞以外のゲフィチニブ感受性細胞ＨＣＣ８２７（ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）細胞株）を用いて実施例１と同様の実験をし、ＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子の導入細胞を樹立した。また、ＰＣ－９細胞にＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａと異なるバリアントのＥＭＬ４－ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ１遺伝子（Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．２００９　Ｓｅｐ　１０；２７（２６）：４２３２－５）を同様の方法で導入し発現細胞を樹立した。細胞抽出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写したものを抗ＡＬＫ抗体によりウェスタンブロットしたところ、各目的遺伝子産物が認められた（図３）。この結果は、任意のＡＬＫ変異遺伝子が任意の癌細胞の増殖を補完し得ることを示す。
（実施例４）
　ＰＣ－９細胞を用いて実施例１と同様の実験をし、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子以外の癌遺伝子ＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９９（５６０７），７０８－１０（２００３））遺伝子の導入細胞を樹立した。細胞抽出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写したものを抗ＰＤＧＦＲα抗体によりウェスタンブロットしたところ、目的遺伝子産物が認められた（図４）。
（実施例５）
　ＰＣ－９細胞、あるいは実施例４で得た、ＰＣ－９細胞に癌遺伝子ＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ遺伝子を導入した細胞を、９６ウェルプレートに播種した。濃度の異なるゲフィチニブを含有する培養液で細胞を７２時間培養した後、ＭＴＳアッセイにより生細胞を定量した。その結果、ＰＣ－９細胞の増殖はゲフィチニブ濃度依存的に阻害されたが、ＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ遺伝子の導入細胞の増殖は阻害されなかった（図５）。この結果は、ＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄが、ＰＣ－９細胞における変異ＥＧＦＲ依存性増殖を補完し得ることを示す。また、この結果は、実施例１～４の結果もまた考慮すると、任意の外来の癌遺伝子が任意の癌細胞の増殖を補完し得ることを示す。
（実施例６）
　実施例４で得た、ＰＣ－９細胞にＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ遺伝子を導入した細胞を、９６ウェルプレートに播種した。濃度の異なるＰＤＧＦＲα阻害剤イマチニブを含有する培養液、あるいは１μＭのゲフィチニブと濃度の異なるイマチニブを含有する培養液中で７２時間培養した後、ＭＴＳアッセイにより生細胞を定量した。
　その結果、１μＭのゲフィチニブ存在下において、ＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ遺伝子の導入細胞の増殖は、ＰＤＧＦＲα阻害剤イマチニブの濃度依存的に阻害されることが確認された（図６）。この結果は、外来の癌遺伝子ＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄを発現する細胞株ＰＣ－９の増殖能が、当該癌遺伝子の機能レベルに依存することを示す。
　また、ＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ遺伝子の導入細胞の増殖が１μＭのゲフィチニブ存在下において阻害されることが確認された（図６）。この結果は、癌細胞（ＰＣ－９細胞）が、固有の癌遺伝子（変異ＥＧＦＲ）を発現する能力、および固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を保持することを示す。
　さらに、この結果は、癌細胞の増殖において、変異ＥＧＦＲ遺伝子（固有の癌遺伝子）およびＰＤＧＦＲα　Ｖ５６１Ｄ遺伝子（外来の癌遺伝子）が互いに補完的に作用し得ることを示す。したがって、固有の癌遺伝子として機能する癌遺伝子は、外来の癌遺伝子としても機能し得ること、および外来の癌遺伝子として機能する癌遺伝子は、固有の癌遺伝子としても機能し得ることが示された。
（実施例７）
　既知の癌遺伝子発現プラスミドのかわりにヒト胚性幹細胞由来遺伝子を発現可能なプラスミド群からなる遺伝子ライブラリーＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、実施例１と同様の手順にてＰＣ－９細胞に導入した。プラスミドを導入した細胞を、１０％のウシ胎児血清および抗生物質カナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液から調製したゲフィチニブ含有培養液（１μＭ　ゲフィチニブ）において、３週間、３７℃で選択培養した。ゲフィチニブ含有培養液で選択的に増殖した細胞からＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡを鋳型としてオリゴ（ｄＴ）２０プライマー及び逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩを用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成した。上記遺伝子ライブラリーを構成するプラスミド群に共通して存在する配列でありプラスミドに挿入されているヒト胚性幹細胞由来遺伝子の５’端上流近傍に位置するａＴＴＢ１配列をセンスプライマー（ａＴＴＢ１プライマー）、ヒト胚性幹細胞由来遺伝子の３’端下流近傍に位置するａＴＴＢ２配列をアンチセンスプライマー（ａＴＴＢ２プライマー）として、合成したファーストストランドｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応により、増殖したＰＣ－９細胞に導入された遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子をＴＡクローニングによりｐＧＥＭ－Ｔプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、遺伝子挿入プラスミドで大腸菌株ＤＨ５αを形質転換した。形質転換ＤＨ５αをアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に播種し３７℃で一昼夜インキュベートした。寒天培地上でコロニーを形成したクローンをアンピシリン含有ＬＢ液体培地１ｍＬ中で培養した。増殖した大腸菌を回収し、プラスミドＭｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）によりプラスミドを回収し、回収したプラスミドを、鋳型としてａＴＴＢ１プライマー及びａＴＴＢ２プライマーを用いることによりＰＣＲで増幅した。アガロースゲル電気泳動で増幅遺伝子が確認されたクローン（図７に結果の一部を示す）に関しては、回収したプラスミドを鋳型としてｐＧＥＭ－Ｔ由来配列Ｔ７及びＳｐ６部位をプライマーとして用いることにより、ｐＧＥＭ－Ｔプラスミドに挿入されたＤＮＡ配列を解析した。その結果、ａＴＴＢ１プライマーとａＴＴＢ２プライマーにより増幅され得る遺伝子ライブラリー由来遺伝子配列およびそれらに挟まれた形で完全長コード配列（ＣＤＳ）が解読されたものとして６種の遺伝子が見つかった。これらの遺伝子はＰＣ－９細胞における変異ＥＧＦＲ依存性増殖を補完し得る新規の癌遺伝子候補と考えられる。
　本発明は、例えば、抗癌剤の開発に有用である。

Claims (18)

  1. 　以下（ａ）および（ｂ）の特性を有する、人工細胞：
    （ａ）癌細胞に由来する；および
    （ｂ）外来の癌遺伝子を発現し、かつ該外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する。
  2. 　さらに以下（ｃ）の特性を有する、請求項１記載の人工細胞：
    （ｃ）前記癌細胞に固有の癌遺伝子を発現する能力、および該固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を保持する。
  3. 　人工細胞が細胞株である、請求項１または２記載の人工細胞。
  4. 　人工細胞がヒト由来である、請求項１～３のいずれか一項記載の人工細胞。
  5. 　人工細胞が接着細胞である、請求項１～４のいずれか一項記載の人工細胞。
  6. 　人工細胞が肺由来である、請求項１～５のいずれか一項記載の人工細胞。
  7. 　固有の癌遺伝子が固有のチロシンキナーゼ遺伝子である、請求項２～６のいずれか一項記載の人工細胞。
  8. 　固有のチロシンキナーゼ遺伝子がＥＧＦＲ変異遺伝子である、請求項７記載の人工細胞。
  9. 　外来の癌遺伝子が外来のチロシンキナーゼ遺伝子である、請求項１～８のいずれか一項記載の人工細胞。
  10. 　外来のチロシンキナーゼ遺伝子がＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子である、請求項９記載の人工細胞。
  11. 　以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、人工細胞の樹立方法：
    （ａ）癌細胞を、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
    （ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
    （ｃ）工程（ｂ）において増殖した癌細胞を、外来の癌遺伝子を発現し、かつ外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する人工細胞として得る工程。
  12. 　さらに以下（ｄ）の工程を含む、請求項１１記載の方法：
    （ｄ）工程（ｃ）で得られた人工細胞をクローニングする工程。
  13. 　以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、抗癌作用を有する物質のスクリーニング方法：
    （ａ）試験物質が請求項１～１０のいずれか一項記載の人工細胞の増殖を阻害するか否かを評価する工程；および
    （ｂ）人工細胞の増殖を阻害する試験物質を、抗癌作用を有する物質として選択する工程。
  14. 　工程（ａ）が固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で行なわれる、請求項１３記載の方法。
  15. 　以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、癌遺伝子の同定方法：
    （ａ）癌細胞を、試験遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
    （ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
    （ｃ）工程（ｂ）において培養された癌細胞が試験遺伝子に依存して増殖するか否かを確認する工程。
  16. 　試験遺伝子が単一の遺伝子である、請求項１５記載の方法。
  17. 　試験遺伝子が複数の遺伝子であり、さらに以下の工程を含む、請求項１５記載の方法：
    （ｄ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞をクローニングする工程；および
    （ｅ）クローニングされた癌細胞中に導入された試験遺伝子を、癌遺伝子として同定する工程。
  18. 　試験遺伝子が複数の遺伝子であり、さらに以下の工程を含む、請求項１５記載の方法：
    （ｆ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞から癌細胞中に導入された試験遺伝子を取得する工程。
    （ｇ）取得した試験遺伝子をクローニングし、癌遺伝子として同定する工程。
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