WO2011107643A1 - Bicelas encapsuladas en liposomas y su aplicación en sistemas diluídos - Google Patents

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WO2011107643A1
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liposome
bicelas
liposomes
phospholipids
composition
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PCT/ES2011/070128
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Alfons De La Maza Rivera
Olga LÓPEZ SERRANO
Gelen RODRÍGUEZ DELGADO
Laia Rubio Toledano
Lucyana Barbosa
Guadalupe SORIA RODRÍGUEZ
Ana María PLANAS OBRADORS
Mercedes COCERA NÚÑEZ
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention aims to preserve the morphology of the bicelas in environments with high water content, therefore, the invention relates to a liposome comprising, in its internal aqueous solution, at least one bicela.
  • the concentration of bicelas in said solution is between 5 and 25% by dry weight with respect to the final liposome.
  • the invention also relates to the use of said liposomes for encapsulating active ingredients, as well as their use as a medicine or for the preparation of a cosmetic product.
  • the present invention relates to the method of obtaining said liposomes.
  • a liposome is a spherical and hollow vesicle composed mainly of phospholipids that consist of a water-soluble head and a liposoluble tail, organized in bilayers.
  • the lipophilic tails of the phospholipids come into contact with each other forming a double layer membrane that is hydrophilic in its outer parts and lipophilic in its interior, this membrane encloses an aqueous interior.
  • these structures as transporters has the advantage that they can be programmed so that the medicine can be released for a long time. weather. In addition, they have a natural tendency to bind to cells and tissues, achieving maximum therapeutic efficacy and minimizing unwanted side effects, thus, liposomes conjugated with antibodies bind to target cells more easily than soluble forms of antibodies. From the chemical point of view, they are similar to cells that circulate in the blood with which they are compatible and, on the other hand, they are a useful method of protecting labile products because they do not suffer degradation and act effectively. Other applications that are attributed to these structures are: directing immunomodulators to the cells of the immune system, controlled release of medications against systemic infections, reducing the side effects of some medications, in diagnostic methods or as blood cell substitutes.
  • liposomes as transporters would not be limited only to the health field, in the textile industry microencapsulation is a novel technology that allows the dispersions or emulsions of certain substances to be replaced by similar fluids where said compounds are dispersed inside microcapsules.
  • inert substances which are fixed to the textile by an effective system.
  • the final properties conferred on the textile come from the type of encapsulation performed and the release mechanism achieved.
  • liposomes are being used as microencapsulants in industrial wool dyeing processes (Marti, M. et al. Textile Res. J. 2001, 71 (8), 678-682; Mart ⁇ , M. et al. Inter. Textile Bull. 2003, 2, 60-64; Mart ⁇ , M. et al. Text. Res. J. 2004, 74 (1 1), 961-966).
  • the bicelas are discoidal nano-structures composed of a long chain phospholipid located in the center of a flat bilaminar zone and a short chain phospholipid located at the edges (Sanders, CR; Haré, BJ; Howard, KP; Prestegard, JH Prog. NMR Spectroscopy 1994, 26, 421).
  • the characteristic of these systems consisting only of lipids, of organizing in bilayers and their property of aligning in a magnetic field, has allowed their wide use as membrane models in various structural studies of protein and peptide membranes (Sanders, CR; Prestegard , JH Biophys J. 1990, 58, 447).
  • bicelas in dermatological applications due to its small size, sufficient to pass through the skin.
  • These studies have shown that the action of bicelas on the skin barrier depends on different composition variables acting as skin permeabilizing agents or as reinforcing agents for their lipid structures (Barbosa-Barros, L; Barba, C; Cocer , M .; Coderch, L; López-lglesias, C; de la Maza, A .; López, O. Inter. J. Pharmaceut 2008, 352, 263).
  • the possibility of bicelas incorporating medications and other bioactive compounds is being studied.
  • bicelas acquire different morphologies depending on the molar ratio between the long-chain and the short-chain phospholipid, the total concentration of phospholipids and the temperature.
  • small discoid bevels become large structures, such as vesicles, sheets, rod-shaped micelles, etc. This behavior could make it difficult to apply these systems systemically because the properties of the bicelas would be affected by dilution, and the damage that these structures could cause is not well defined.
  • One method to stabilize the structure of the bicelas under high dilution conditions would be to develop them from mixtures of lipids conjugated with polyethylene glycol (PEG-lipids). The problem with this method is that the bicelas obtained lose some of their properties, such as the ability to enhance permeability.
  • the present invention provides a method for encapsulating them in lipid vesicles or liposomes.
  • bicelar nanostructures lose their morphology becoming spherical vesicles with much larger sizes, behavior that could hinder the use of these compounds through the systemic route where the water content is very high.
  • liposomes are morphologically stable, which makes them good transporters for systemic applications, presenting themselves as a useful method to stabilize the morphology of the bicelas.
  • the present invention relates to new lipid structures that combine the properties of its constituent elements: liposomes and bicelas.
  • liposomes and bicelas are lipid systems formed by an outer phospholipid membrane that forms a vesicle and which also contains discoid structures that are also lipidic.
  • one aspect of the present invention relates to a liposome comprising in its internal aqueous solution at least one bicela.
  • the liposome comprises a concentration of bicelas between 5 and 25% by dry weight with respect to the final liposome.
  • the concentration of bicelas is expressed as a percentage by dry weight with respect to the dry weight of the final liposome, that is, of the liposome comprising said bicela.
  • the liposome would be formed by an external vesicle (structurally very resistant against changes in the environment) whose function is to isolate and protect the bicelas inside (discoidal structures, very versatile and modular), thus allowing it to maintain its shape and size so that they can be used in applications that lead to its administration through different routes where the water content is very high, such as, but not limited to, digestive, parenteral, respiratory and topical.
  • Bicelas are structures that are very sensitive to changes in the environment where they are found, so the isolation of these structures protects them from possible variations. This isolation is carried out by encapsulating said bicelas inside lipid vesicles or liposomes, where the outer lipid membrane of the liposome ensures the isolation and stability of the bicela captured inside. That is, within the lipid vesicle the perfect microenvironment is created so that the bicela can retain its morphology at all times.
  • liposomes offer the advantage of being stable with temperature and dilution as opposed to unencapsulated bicelas.
  • bicelas possess is the ability to enhance permeability to be able to cross the different physiological barriers such as the blood-brain barrier, the barrier of the stratum corneum of the skin, different mucous membranes such as, but not limited to , oral, gastric, intestinal, nasal, conjunctival, pulmonary, and other physiological barriers.
  • This permeabilizing effect they present is due to their small size and their composition (long chain phospholipids and short chain phospholipids with surface activating effect or surfactant) and originates because the lipids of the bicels are mixed with the lipids of the tissue membranes modifying their fluidity and permeability.
  • the ability to enhance the permeability of different biological barriers such as the blood-brain barrier, the skin stratum barrier, different mucous membranes such as, but not limited to, oral, gastric, intestinal, nasal, conjunctival, pulmonary , and other physiological barriers
  • the passage through these barriers provides bicelas a great advantage for their application in the field of medicine and pharmacy.
  • the temperature together with the hydration are key parameters in the structure that a bicela is going to adopt and, therefore, very important for the correct formation of the liposome described in the previous aspect to take place.
  • the bicelas are small discoidal structures (less than 10 nm) while increasing the water in the system the small structures are transformed into aggregates of larger size than at concentrations of 0, 62% in lipid already begin to detect structures with 500 nm sizes mixed with smaller aggregates and at lipid concentrations of 0.15% only very large structures greater than 500nm are detected, so preferably, the bicela is at a concentration of 20% in total lipid content.
  • the average transition temperature of the liposome lipids described in the above aspect is between 4 and 40 ° C.
  • phase transition temperature refers to the temperature at which the system passes from the gel phase to the liquid crystal phase.
  • Tm phase transition temperature
  • the Tm of the lipids that form the liposome Two different Tm will have to be taken into account, the Tm of the lipids that form the liposome and the Tm of the lipids that form the bicela.
  • the bicelas are formed by a mixture of two types of lipids, it will be considered as the phase transition temperature of the bicelas that corresponding to the long chain phospholipid, since this is responsible for forming the bilayer of the structure and the phase transition to which we refer is necessarily linked to the formation of bilayers.
  • mean transition temperature refers to the temperature range in which the Tm of the bicela and the Tm of the liposome coincide, and therefore, the temperature range in which the liposome described in the previous aspect remains stable. . Taking into account that the Tm of the liposome lipids is between -20 and 40 ° C and that the Tm of the bicela lipids is between 4 and 60 ° C, the average transition temperature of the liposome described in the aspect above is in the range between 4 and 40 ° C.
  • the bicela contained in the liposome comprises long chain phospholipids in its flat central region and short chain phospholipids in the regions of the ends.
  • Each phospholipid contained in the bicela is made up of glycerol, to which two fatty acids and a phosphate group are attached.
  • glycerol to which two fatty acids and a phosphate group are attached.
  • the fatty acid chain will be greater or lesser.
  • phospholipids located in the flat central region must have a fatty acid chain of at least 12 carbons, preferably of at least 15 carbons, and more preferably still of - at least 18 carbons; while the chain
  • the fatty acid phospholipids located at the ends will have a length of at most 8 carbon atoms, preferably - at most - 7 carbons, and more preferably even - at most - 5 carbons.
  • Figure 1 shows how phospholipids are placed in the bicela according to the length of their hydrocarbon chain.
  • the ratio of the molar concentrations of the long chain and short chain phospholipids of the bicela is between 1 and 10, preferably between 1, 5 and 9, and more preferably between 2 and 8.
  • the difference between the number of carbons between the long chain and short chain phospholipids of the bicela is between 5 and 25, preferably between 7 and 22, and more preferably between 8 and 20.
  • Long chain phospholipids used in the development and production of bicelas, can be selected, without being limiting, from the list comprising dilauryl phosphatidylcholine (DLPC), dimiristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), distearyl- phosphatidylcholine (DSPC) and diaraquidonyl phosphatidylcholine (DAPC), preferably they are DMPC and DPPC and even more preferably DPPC.
  • DLPC dilauryl phosphatidylcholine
  • DMPC dimiristoyl phosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitoyl phosphatidylcholine
  • DSPC distearyl- phosphatidylcholine
  • DAPC diaraquidonyl phosphatidylcholine
  • the short chain phospholipid used in the development and production of bicelas can be selected, without being limiting, from the list comprising dipentanoyl phosphatidylcholine (DPePC), dihexanoyl phosphatidylcholine (DHPC), diheptanoyl phosphatidylcholine (DHpPC) and dioctanoyl phosphatidylcholine (DOcPC), preferably dihexanoyl phosphatidylcholine (DHPC).
  • DPePC dipentanoyl phosphatidylcholine
  • DHPC dihexanoyl phosphatidylcholine
  • DHpPC diheptanoyl phosphatidylcholine
  • DOcPC dioctanoyl phosphatidylcholine
  • the bevel has a greater axis length between 10 and 80 nm, more preferably even between 15 and 75 nm and, in another preferred embodiment, the liposome has a diameter between 200 and 1000 nm more preferably even between 220 and 900 nm.
  • liposome of the invention may be used.
  • composition of the invention Another aspect of the present invention relates to the composition comprising the liposome of the invention, hereinafter "composition of the invention”.
  • the results of the invention confirm that encapsulation of the bicelas forming the liposome of the invention preserves its structure under dilution, so, if we add to this the properties of these structures, the use of liposomes of the invention would be a good strategy. both to ensure the stability of the bicelas in all biological tissues because in the majority the water content is high, and to introduce bicelas through biological fluids with high water content, for example, but not limited to, cerebrospinal fluid, blood and / or saliva.
  • the liposomes of the invention have the ability to encapsulate different substances in a manner similar to the way liposomes do, but with the advantage that once the drug is transported, the penetration of the drug into a specific tissue will be favored by the effect of the internal discoid structure of the bicela.
  • encapsulation and transport of hydrophobic substances in the liposomes of the invention is more favored by the fact that these structures contain a greater proportion of bilayer than liposomes.
  • substances can be incorporated into the inside of the bezels so that these structures are used as conveyors, markers, or for any application that is considered appropriate by a person skilled in the art.
  • microencapsulation in the textile field is a novel technology that allows replacing dispersions or emulsions of certain substances by similar fluids where said compounds are dispersed inside microcapsules of inert substances, which are fixed to the textile by an effective system.
  • Liposomes have already been tested as microencapsulating agents, but because this process requires effective physical-chemical knowledge of the existing interactions at the fiber-microcapsule level, the liposomes of the invention can significantly improve the current applications of liposomes in industrial processes of dyeing wool or any other textile material increasing the adsorption, penetration and fixation of both dyes, pigments and other substances used in this field of the art, and known by any expert in the field, and allowing Obtain fabrics capable of performing various functions, now known as "polyfunctional fabrics” or "smart textiles".
  • another aspect of the present invention relates to the liposome of the invention which also contains a dye and / or a pigment, as well as its use for the encapsulation of dyes, pigments or other substances used in this field of the art, and known by any expert in the field, and that allow to obtain fabrics capable of performing various functions, now known as "polyfunctional fabrics” or "smart textiles".
  • These liposomes of the invention that may also contain dyes and / or pigments may be used for dyeing textile materials, or may also contain other substances used in the textile industry thereby increasing the efficiency of the dyeing processes of these textile materials.
  • Another aspect of the present invention relates to the liposome of the invention which further comprises an active ingredient, as well as its use for encapsulating at least one active ingredient.
  • active substance refers to any substance capable of causing an effect on the organism or any substance capable of being used for identification or diagnosis.
  • the activity of an active ingredient varies due to their nature, but is always related to the amount ingested or absorbed.
  • the active substance can be selected from the list comprising, but not limited to, marker agents useful for diagnosis such as gadolinium derivatives (gadopenthetic acid, gadodiamine, gadoteric acid and gadoteridol), iron derivatives (iron III ammonium citrate , fermoxide and iron III oxide) or magnesium derivatives; anti-inflammatory agents such as diclofenac, acetaminophen or flufenamic acid; antioxidants such as polyphenols (flavonoids), vitamins (A, E, C), trace elements (selenium, zinc), carotenoids (lutein), amino acids (theanine) or caffeine; sunscreens such as aminobenzoates, salicylates, benzophenones, dibenzoylmethane derivatives,
  • This invention demonstrates that substances such as gadodiamide (useful as a magnetic resonance imaging marker that allows the liposome path of the invention to be tracked inside the body at all times), diclofenac and flufenamic acid (anti-inflammatory agents). high spectrum), iron (usually used for the treatment of anemias), caffeine (used as an antioxidant) and, ceramides and cholesterol sulfate (lipids responsible for the proper barrier function of the skin and involved in various biological mechanisms) they are effectively encapsulated inside the bicelas contained in the liposomes of the invention.
  • liposomes of the invention as vehicles Pharmacologically active would lead to the use of these structures for the preparation of a drug for the treatment of diseases related to the substance being transported, treating among others, pathologies related to inflammatory processes (when anti-inflammatory encapsulates such as diclofenac and flufenamic acid), diseases related to iron and / or vitamin B12 deficiency such as anemia and Crohn's disease among others, injuries (due to regulation of platelet adhesion), cancer (when cytotoxic agents are encapsulated), etc.
  • the liposomes of the invention could also be used in gene therapy by directing the defective or absent gene that is encapsulated to the patient's target cells.
  • bicelas present makes them suitable structures as cosmetics for their already proven dermatological properties because they promote a reinforcement of the lipids present in the stratum corneum, resulting in an increase in elasticity values and an improvement in characteristics of the biological tissue (Barbosa-Barros, L; Barba, C; Corece, M .; Coderch, L; López-lglesias, C; de la Maza, A .; López, O. Inter. J. Pharmaceut.
  • one aspect of the present invention relates to the use of the liposome of the invention, or the composition of the invention, or said composition which further comprises an active ingredient for the preparation of a cosmetic product, where the cosmetic is administered by topical route
  • Cosmetic product means any substance or formulation of local application to be used in the various surface parts of the body human: as, but not limited to, epidermis, hair and hair system, nails, lips and external genital organs or teeth and oral mucous membranes, in order to clean, perfume, modify their appearance and protect them or keep them in good condition and prevent or correct body odors.
  • the topical route uses the skin and mucous membranes for cosmetic administration, which includes the conjunctival, nasal, oral and urogenital mucosa, and also the hair and hair system, nails, lips and teeth.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the liposome of the invention, or the composition of the invention, or said composition which further comprises an active ingredient for use as a medicament.
  • the liposome of the invention as well as the composition of the invention, whether or not it contains an active ingredient, can be used for the preparation of a medicament for the treatment of, but not limited to, skin, liver, kidney, cardiovascular, brain diseases. , bone, muscle, tissues associated with the gastrointestinal, urinary, respiratory, endocrine, nervous or auditory or ocular tissue.
  • a preferred embodiment relates to the use of the liposome of the invention, or the composition of the invention, or said composition which further comprises an active ingredient, for the preparation of a medicament for the treatment of diseases of the skin, nerve tissue or eye tissue.
  • the medicament is presented in a form adapted to administration by the spinal route or topically through the conjunctival mucosa.
  • adapted form refers to how to adapt the medicament of the present invention so that it can be administered spinally or topically through the conjunctival mucosa.
  • the medication is presented in a form adapted to parenteral, cutaneous, oral, epidural, sublingual, nasal, intracatecal, bronchial, lymphatic, rectal, transdermal or inhaled administration.
  • the form adapted to parenteral administration refers to a physical state that can allow its injectable administration, that is, preferably in a liquid state.
  • Parenteral administration can be carried out via intramuscular, intraarterial, intravenous, intradermal, subcutaneous or intraosseous administration, but not limited to these types of parenteral administration routes.
  • the form adapted to oral administration is selected from the list comprising, but not limited to, drops, syrup, herbal tea, elixir, suspension, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, granulate, seal, pill, tablet, tablet, tablet, troccus or lyophilized.
  • the form adapted to rectal administration is selected from the list comprising, but not limited to, suppository, rectal capsule, rectal dispersion or rectal ointment.
  • the form adapted to transdermal administration is selected from the list comprising, but not limited to, transdermal patch or iontophoresis.
  • compositions comprising the liposome of the invention, or comprising the composition of the invention, or comprising said composition which further comprises an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition further comprises at least one pharmacologically acceptable excipient.
  • excipient refers to a substance that aids the absorption of the liposome of the invention or the composition of the invention, stabilizes said compound or aids in the preparation of the pharmaceutical composition in the sense of giving it consistency or providing flavors, aromas. , textures and protection that make it more enjoyable.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, drug protection function such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • pharmaceutically acceptable refers to the compound referred to being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • active substances are, for example, those described above, both in a composition together with the liposomes of the invention or encapsulated within the liposomes of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to the method of obtaining the liposome of the invention, which comprises:
  • step (b) isolate and / or purify the product obtained in step (b).
  • obtaining the dried lipid film from step (a) comprises: i. dissolve lipids in an organic solvent at concentrations between 5 and 30 mg / ml, and
  • obtaining the aqueous bevel solution from step (a) comprises: i. dissolve in an organic solvent long chain phospholipids and short chain phospholipids whose molar concentrations ratio is between 1 and 10,
  • the long chain phospholipid is dimiristoyl phosphatidylcholine or dipalmitoyl phosphatidylcholine and the short chain phospholipid is dihexanoyl phosphatidylcholine.
  • the preparation methodology requires the achievement of a series of steps that have been optimized, which include ultrasound treatments during times ranging from 5 minutes to 5 hours, at temperatures between 5-60 ° C and powers between 100 and 600W and a specific centrifugation process as described in the following paragraph, in order to separate / purify the liposomes of the invention from other lipid aggregates that may have been formed.
  • FIG. 1 Structure of a bicela. It shows the two types of phospholipids that a bicela must have in each of its zones, differentiating the zone from the ends of the flat central zone.
  • FIG. 2. Representative microphotographs of bicelar samples before (A) and after (B) of the dilution.
  • FIG 2A (bicelas) the bicelas are shown in all projections: front (white arrow) and laterally (black arrow).
  • Figure 2B (diluted bicelas) shows spherical unilamellar vesicles showing a wide variety of sizes (from 30 to 250 nm).
  • FIG. 3 Micrographs obtained by cryo-TEM of liposomes of the invention (liposomes and bicelas).
  • Figure 3A shows an overview of the liposome sample of the invention in which a large number of bicelas are seen. It is worth highlighting the great adhesion of most of the bicelas on carbon (area indicated in Fig. 3A with an asterisk). These bicelas mainly showed lateral projection.
  • Figure 3B shows encapsulated bezels, in their two projections (white arrows) and non-encapsulated bevels (black arrows). Some of the encapsulated bicelas showed an increase in size (around 100 nm) with respect to the non-encapsulated ones (20 nm), see Figure. 3A.
  • Figure 3C shows bicelas stacked face to face inside the liposomes.
  • FIG. 4 Micrographs obtained by cryo-TEM of diluted liposomes of the invention (liposomes and bicelas).
  • Figure 4A shows a high variability of vesicles in the diluted sample: empty liposomes (black arrows); liposomes within other liposomes called oligo-lamellar vesicles (white arrowhead); vesicles multilamellar (blank arrows) and liposomes with bicelas inside or liposomes of the invention (black arrowhead).
  • Figure 4B shows multilamellar liposomes.
  • Figure 4C shows accumulations of bicelas within liposomes as in the samples after dilution (Fig. 3C).
  • Figure 4D shows in detail bicelas stacked inside multilamellar liposomes.
  • FIG. MRI visualization of intra-cerebral-ventricular injection of bicelas containing gadodiamide.
  • Figure 5A shows the coronal view of the healthy rat brain.
  • Figure 5B shows the coronal view of the rat brain injected with the sample of bicelas containing gadodiamide.
  • FIG. 6 MRI visualization of intra-cerebral-ventricular injection of bicelas containing gadodiamide encapsulated in liposomes.
  • Figure 6A shows a sagittal view of healthy rat brain (first image) and injected with the liposome sample of the invention (liposomes containing Gadodiamide bicelas inside) at Oh, 4h, 8h and 24 hours after injection (four following images).
  • Figure 6B shows the hyper-intensity induced by gadodiamide that was quantified by drawing an environment of an anatomical zone containing cerebrospinal fluid (CSF) at different times. Detail of the region of interest.
  • Figure 6C shows the signal strength of the CSF (normalized versus muscle intensity) for a control rat (white bar) and the rat injected with liposomes containing bicelas with gadodiamide (black bars) at different times after injection. Representation to observe the evolution of hyper-intensity over time.
  • FIG. 7. M orographies obtained with TEM (transmission electron microscope) of porcine oral mucosa.
  • Figure 7A shows an image of the untreated mucosa and Figure 7B shows the tissue after treatment with the liposomes of the invention containing nystatin. There are no structural changes that may be associated with tissue deterioration.
  • system refers to the bicelas themselves or to the liposomes that comprise bicelas inside.
  • the mixture consisting of DPPC / DHPC was chosen for its preparation.
  • the reason for this choice is due to the fact that in the working temperature ranges (from 25 to 37 ° C) the DPPC / DHPC bicelas do not undergo the observed changes in the DHPC bicels in combination with another long chain phospholipid .
  • This fact finds its explanation that the DPPC has a Tm of 41 ° C, a temperature significantly higher than the working temperature used in the present invention, which confirms that the transition in the structure of a bicela occurs at temperatures above the transition temperature of the lipids that form it.
  • the composition of the liposomes used was 80% Lipoid S-100 and 20% cholesterol. These two components were mixed in chloroform and then a lipid film was formed removing the chloroform with rotary evaporator. The formed film was hydrated with the previously formed bicelar solution. This solution was extruded three times through an 800 nm polycarbonate membrane. The liposome solution was centrifuged for 45 minutes at 20,000 x g in a Heareus centrifuge with a JA-20 rotor. The supernatant was separated and the pellet was resuspended until obtaining the initial volume with 0.9% NaCl in order to maintain the same lipid concentration. This procedure was repeated 3 times. Thus it was possible to separate the encapsulated gadodiamide from the non-encapsulated one in the lipid system.
  • samples were analyzed using DLS and Cryo-TEM spectroscopy techniques before and after dilution.
  • the first technique was used to determine the average size of the systems, while the second was very useful for the characterization of dimensional and morphological aspects of the nanostructures and to provide a direct visualization of the lipid samples.
  • Hydrodynamic diameter (HD) and polydispersity index (Pl) were determined using the Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Systems, Southborough, MA). The DLS measurements consider the Brownian movement of the particles and correlate this reading with the particle sizes. The relationship between particle size and its velocity due to Brownian motion is defined in the Stokes-Einstein equation:
  • HD is the hydrodynamic diameter
  • D is the translational diffusion coefficient (m 2 / s)
  • k is the Boltzmann constant (1 .3806503 x 10 "23 m 2 kg s " 2 k “1 )
  • T is the absolute temperature (K)
  • ⁇ is the viscosity (mPa.s)
  • the HDs for DPPC / DHPC beams were 19.5 nm and 16.3 nm estimated by intensity and volume respectively, with a proportion of scattered light greater than 90% in both analyzes.
  • the sample containing bicelas was diluted from 20% (initial concentration) to 0.07% (final concentration) to determine the effect of dilution on the bicelar structure.
  • both analyzes by intensity and by volume
  • two populations of particles were observed, one of a size around 26 nm and the other around 255 nm.
  • the proportions of scattered light analyzed by intensity and volume were different. This is because large and small particles contribute differently to the intensity of the scattered light. Thus, large particles disperse greater light intensity than small ones. For this reason in heterogeneous size systems intensity analysis resulted in a larger proportion of large particles, as can be seen in Table 1.
  • Simultaneous volume analysis indicated a higher proportion of small particles (96.4%) than large particles (3.6%), indicating the predominant presence of small particles in the system, although the intensity of scattered light for large particles (88 , 4%) was higher than for small (1 1, 6%).
  • the size of the particles approximates that of a hypothetical sphere that diffuses with the same velocity as the particle of the experiment. Since the bicelar structure is disk-shaped, the size of the particles obtained by the DSL provides a relative measurement of the dimensions of the structure. Therefore, this data should be interpreted taking into account also the cryo-TEM images that are analyzed in section 2.2.
  • Liposomes and bicelas were visualized by the Cryo-TEM method.
  • a thin aqueous film was formed by extracting the sample from the suspension placed on a rack. Carbon gratings were used for this. After removing part of the suspension from the grid, it was dried with filter paper, leaving a sample film on the grid.
  • These films were vitrified by immersing the grid in ethane, which remained at its melting point with liquid nitrogen (according to technique described in Honeywell-Nguyen, PL; Frederik, PM; Bomans, PH; Junginger, HE; Bouwstra, JA Pharm Res 2002 , 19, 991) with a Vitrobot (FEI Company, Eindhoven, The Netherlands) and keeping the samples before freezing at 100% humidity.
  • the temperature at which the vitrification of thin films was room temperature.
  • the vitreous samples were transferred to a Tecnai F20 microscope (FEI Company, Eindhoven, Holland) with a Gatan cryotransfert (Barcelona, Spain).
  • the visualization was performed at 200 kV, at a temperature between -170 0 C and -175 0 C using the conditions for low image density
  • the morphology of the particles also changed with dilution (see Figure 2). This fact coincides with the high Pl values (0.714) observed by DLS.
  • the DLS and microscopy show a transition from the bicelar disc system to vesicles, a transition caused by the dilution effect.
  • the diluted liposome samples of the invention and liposomes of the invention were analyzed by cryo-TEM. Also in this case the samples for microscopic observation were only cryo-set at room temperature. Micrographs obtained by cryo-TEM are shown in Figures 3 and 4.
  • the substances that were incorporated into the systems were: iron (as iron chloride at a concentration of 50%), ceramides (10 and 20%), caffeine (10%), gadodiamide (60%), cholesterol sulfate (20% ), diclofenac (1.16%) and 1% flufenamic acid).
  • the incorporation was made in the phase of realization of the bicelas. Depending on the hydrophilic or lipophilic nature of the substance, it was added together with the bicela-forming lipids in the chloroform phase or together with the hydration water. Mixtures consisting of DPPC / DHPC, DMPC / DHPC and DOPC / DHPC were chosen for these preparations.
  • the PDPO is dioleoylphosphatidylcholine. We worked with molar ratios of concentrations of the two lipids from 2 to 3.5.
  • EXAMPLE 4 Use of the systems of the invention for use in products of ocular application.
  • a compound with therapeutic effect in the treatment of conjunctival mucosal sensitization was incorporated into the systems of the invention as described in Example 3. It was proved by optical microscopy that this compound, which had been impossible to disperse using other emulsion systems ( it always crystallized forming very large structures), it remained dispersed without forming any aggregate when it was incorporated into the systems of the invention. This fact turned out to be a success, since the formation of crystals always prevented its use for ocular application.
  • the systems of the invention containing said compound were applied to the eyes of experimental animals and it was verified by optical microscopy that the crystals also did not form upon contact with the aqueous environment of the eye.
  • the animals were previously anesthetized with 4% isofluorane in O2: N 2 O (3: 7, an amount that was reduced to 1% isofluorane during maintenance, and placed in a stereotactic apparatus (Stoelting, USA).
  • sagittal suture, and the Brain surface were used as references for anteroposterior (AP), mid-lateral (ML), and dorso-ventral (DV) coordinates, respectively.
  • AP anteroposterior
  • ML mid-lateral
  • DV dorso-ventral
  • Quantities of 50 ⁇ of an aqueous solution containing two different preparations of bicelas (one formed by free bicelas and another formed by the liposomes of the invention) mixed with gadodiamide were injected with a 100 ⁇ Hamilton syringe equipped with a 32G needle, a an injection rate of 2 ⁇ / min.
  • the needle was left in place for 5 minutes to avoid leaks.
  • the skin was sutured and the animal was transferred to the base of the scanner to obtain MR images.
  • Gadodiamide was injected into both the bicela solution and the liposome solution of the invention.
  • the concentration of bicelas that was used for the injection was 200 mg / ml. The researcher who carried out the stereotactic administration had great experience in this procedure.
  • Magnetic Resonance Imaging (MRI) "in vivo”.
  • MRI scans were performed under isofluorane anesthesia on a 70/30 horizontal BioSpec scanner for animals (Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany), equipped with an internal diameter of 12 cm actively shielded and with a gradient system (400 mT / m) .
  • the configuration ring consisted of a transmission / reception coil.
  • the animals were placed supine on a plexiglass support with a nasal cone for anesthetic gas administration, fixed with a bar to the teeth, earplugs and adhesive tape.
  • Tripilot scans were used for the exact placement of the animal's head inside the magnet. The animal's head was placed so that approximately the center of the brain coincided with the isocenter of the magnet.
  • a sequence of T1-weighted axial sagittal images was performed with a conventional flash (Fast Low Angle Shot images).
  • T1 maps with axial orientation were made with RAREVTR (rapid acquisition with improved relaxation and variable repetition time) sequence.
  • the imaging was done just after the injection and 4.8 and 24 hours later.
  • ROI region of interest
  • FIG. 5 shows the coronal view of the healthy rat brain (A) and that injected with the sample of bicelas (B). It can be seen that the free bicelas had a drastic expansion throughout the rat's cerebral ventricular system, which resulted in death after injection.
  • intracerebroventricular (icv) injections were applied in rats in order to observe the increase in the intensity of the gadodiamide signal in the CSF by administration of liposome samples of the invention.
  • the rat was injected using the same experimental procedure. The animal was scanned immediately and after 4h, 8h and 24h. In contrast to the administration of the bicelar sample, the animal that received the sample of encapsulated bicelas or liposomes of the invention survived. This preparation had no effect apparently toxic, observing a time-dependent effect with a maximum hyperintensity of the signal in the CSF in the analysis performed immediately after the infusion of the liposome preparation of the invention and a progressive decrease of the signal over time. At 24 hours the intensity was similar to that found in healthy animals (control) (see Figure 6).
  • the liposomes of the invention have a larger size than the bicelas in diluted environments and still allowed the survival of the animals, the fact that intracerebroventricular injection of free bicelas is lethal to rats is explained due to the rapid and uncontrolled morphological changes that these structures undergo in contact with dilute environments such as cerebrospinal fluid. These sudden morphological transitions are, therefore, the cause of changing the composition in the cerebrospinal fluid and promoting the expansion of the cerebroventricular system.
  • EXAMPLE 6 Use of the systems of the invention for use in antifungal treatments of the oral mucosa.
  • the nystatin molecule was incorporated into the systems of the invention as described in Example 3. Specifically in systems containing DPPC / DHPC. The composition also included a mixture of Lipoid S-100 phospholipids and 20% cholesterol. Nystatin has antifungal antibiotic activity and is frequently used in cutaneous and mucous infections caused by the species of fungus Candida albicans. The amount of nystatin incorporated into the system of the invention was of the same order as that present in the products containing nystatin in suspension currently marketed, about 15.75 mg / ml. This fact proved to be a success, since the systems of the invention have a high water content and the difficulty of incorporating nystatin into systems of these characteristics (high water content) is known.
  • the systems of the invention containing nystatin were applied in porcine oral mucosa by performing in vitro absorption experiments using Franz cells and after a period of contact with the mucosa for three hours.
  • the amount of nystatin retained in the tissue was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). It was seen that all the applied nystatin (629 micrograms) was incorporated into the tissue, made very convenient when the goal is to treat fungal conditions.
  • MIC minimum inhibitory concentration

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Abstract

La presente invención tiene como finalidad preservar la morfología de las bicelas en ambientes con alto contenido en agua, por ello, la invención se refiere a un liposoma que comprende, en su solución acuosa interna, al menos, una bicela. La concentración de bicelas en dicha solución es de entre el 5 y 25% en peso seco con respecto al liposoma final. La invención también se refiere al uso de dichos liposomas para el encapsulado de principios activos, así como a su uso como medicamento o para la elaboración de un producto cosmético. Además, la presente invención se refiere al método de obtención de dichos liposomas.

Description

Bicelas encapsuladas en liposomas y su aplicación en sistemas
diluidos.
La presente invención tiene como finalidad preservar la morfología de las bicelas en ambientes con alto contenido en agua, por ello, la invención se refiere a un liposoma que comprende, en su solución acuosa interna, al menos, una bicela. La concentración de bicelas en dicha solución es de entre el 5 y 25% en peso seco con respecto al liposoma final. La invención también se refiere al uso de dichos liposomas para el encapsulado de principios activos, así como a su uso como medicamento o para la elaboración de un producto cosmético. Además, la presente invención se refiere al método de obtención de dichos liposomas.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los liposomas han sido objeto de numerosos estudios debido a su potencial uso para micro-encapsular medicamentos y sus aplicaciones en cosmética y clínica (Teschke, O.; de Souza, E. F. Langmuir 2002, 18, 6513). Un liposoma es una vesícula esférica y hueca compuesta principalmente por fosfolípidos que constan de una cabeza hidrosoluble y de una cola liposoluble, organizados en bicapas. Las colas lipofílicas de los fosfolípidos entran en contacto entre ellas formando una membrana de doble capa que es hidrófila en sus partes exteriores y lipófila en su interior, esta membrana encierra un interior acuoso.
Actualmente, se utilizan como transportadores de diversas sustancias entre el exterior y el interior de la célula debido a que son los transportadores más eficaces para introducir sustancias en las células, con un amplio campo de aplicación. Algunas de estas sustancias son medicamentos o cosméticos, e incluso se utilizan en biotecnología, en algunos casos de terapia genética, para introducir genes de un organismo en otro diferente.
El uso de estas estructuras como transportadores tiene la ventaja de que se pueden programar para que el medicamento pueda liberarse durante largo tiempo. Además, poseen una tendencia natural a ligarse a células y tejidos, logrando la máxima eficacia terapéutica y minimizando los efectos secundarios no deseados, así, los liposomas conjugados con anticuerpos se unen a células diana con más facilidad que las formas solubles de los anticuerpos. Desde el punto de vista químico, son similares a células que circulan en la sangre con las que son compatibles y, por otra parte, son un método útil de protección de productos lábiles debido a que no sufren degradación y actúan eficazmente. Otras aplicaciones que se atribuyen a estas estructuras son: dirigir inmunomoduladores a las células del sistema inmunitario, liberación controlada de medicamentos frente a infecciones de tipo sistémico, reducir los efectos secundarios de algunos medicamentos, en métodos de diagnóstico o como sustitutivos de células en sangre.
Pero el uso de liposomas como transportadores no estaría limitado sólo al campo sanitario, en la industria textil la microencapsulación es una tecnología novedosa que permite sustituir las dispersiones o emulsiones de determinadas sustancias por fluidos similares en donde dichos compuestos se encuentran dispersos en el interior de microcápsulas de sustancias inertes, que se fijan al textil por un sistema efectivo. Las propiedades finales conferidas al textil, provienen del tipo de encapsulado realizado y del mecanismo de liberación conseguido. Hasta ahora a nivel industrial, la producción de tejidos biofuncionales (tejidos inteligentes) ha seguido una vía de desarrollo empírica basada en el sistema "ensayo-error". Sin embargo, este proceso requiere de un conocimiento físico-químico eficaz de las interacciones existentes a nivel fibra-microcápsula. En caso contrario, no es posible optimizar ni la tecnología de aplicación ni controlar la liberación del principio activo. En este sentido, los liposomas se están utilizando como microencapsulantes en procesos industriales de tintura de la lana (Marti, M. et al. Textile Res. J. 2001 , 71 (8), 678-682; Martí, M. et al. Inter. Textile Bull. 2003, 2, 60-64; Martí, M. et al. Text. Res. J. 2004, 74(1 1 ), 961 -966).
Estas estructuras con diámetros comprendidos entre 100nm. a 1 μηη. poseen el inconveniente de que son demasiado grandes para pasar a través de la piel en aplicaciones transdérmicas.
Por otro lado, las bicelas son nano-estructuras discoidales compuestas por un fosfolípido de cadena larga situado en el centro de una zona bilaminar plana y un fosfolípido de cadena corta situada en los bordes (Sanders, C. R.; Haré, B. J.; Howard, K. P.; Prestegard, J. H. Prog. NMR Spectroscopy 1994, 26, 421 ). La característica de estos sistemas, constituidos sólo por lípidos, de organizarse en bicapas y su propiedad de alinearse en un campo magnético, ha permitido su amplia utilización como modelos de membranas en diversos estudios estructurales de membranas de proteínas y péptidos (Sanders, C. R.; Prestegard, J. H. Biophys J. 1990, 58, 447).
Recientemente se ha propuesto el uso de bicelas en aplicaciones dermatológicas debido a su pequeño tamaño, suficiente para pasar a través de la piel. Estos estudios han demostrado que la acción de las bicelas sobre la barrera de la piel depende de diferentes variables de composición actuando como agentes permeabilizantes de la piel o como agentes de refuerzo de sus estructuras lipídicas (Barbosa-Barros, L; Barba, C; Cocerá, M.; Coderch, L; López-lglesias, C; de la Maza, A.; López, O. Inter. J. Pharmaceut 2008, 352, 263). Además de la utilización de bicelas para la mejora de la piel se está estudiando la posibilidad de que las bicelas incorporen medicamentos y otros compuestos bioactivos.
El problema que se presenta cuando se trabaja con bicelas es que adquieren diferentes morfologías dependiendo de la razón molar entre el fosfolípido de cadena larga y el de cadena corta, de la concentración total de fosfolípidos y de la temperatura. Así, por ejemplo, en condiciones de alta dilución las pequeñas bicelas discoidales se convierten en estructuras grandes, tales como vesículas, láminas, micelas en forma de varilla, etc. Este comportamiento podría dificultar la aplicación de estos sistemas por vía sistémica debido a que las propiedades de las bicelas se verían afectadas por la dilución, y el daño que estas estructuras podrían comportar no está bien definido. Un método para estabilizar la estructura de las bicelas en condiciones de alta dilución sería desarrollarlas a partir de mezclas de lípidos conjugados con polietilenglicol (PEG-lípidos). El problema de este método es que las bicelas obtenidas pierden algunas de sus propiedades, como por ejemplo, la capacidad de potenciar la permeabilidad.
Por tanto, persiste el problema de estabilizar la estructura de las bicelas en ambientes diluidos. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Con el fin de mantener el tamaño y la forma de las pequeñas bicelas discoidales, la presente invención proporciona un método para encapsularlas en vesículas lipídicas o liposomas.
En condiciones de alta dilución, las nanoestructuras bicelares pierden su morfología convirtiéndose en vesículas esféricas con tamaños muy superiores, comportamiento que podría dificultar el uso de estos compuestos a través de la ruta sistémica donde el contenido de agua es muy alto.
Sin embargo, en ambientes diluidos, los liposomas son morfológicamente estables, lo que les hace buenos transportadores para aplicaciones sistémicas, presentándose como un método útil para estabilizar la morfología de las bicelas.
Por tanto, la presente invención se refiere a unas nuevas estructuras lipídicas que combinan las propiedades de sus elementos constituyentes: los liposomas y las bicelas. Se trata de sistemas lipidíeos formados por una membrana fosfolipídica exterior que forma una vesícula y que contiene en su interior estructuras discoidales también lipídicas.
En este sentido, un aspecto de la presente invención se refiere a un liposoma que comprende en su solución acuosa interna al menos una bicela. En una realización preferida de la presente invención, el liposoma comprende una concentración de bicelas de entre el 5 y el 25% en peso seco respecto al liposoma final . La concentración de bicelas se expresa como tanto por ciento en peso seco con respecto al peso seco del liposoma final, es decir, del liposoma que comprende dicha bicela.
El liposoma estaría formado por una vesícula exterior (estructuralmente muy resistente frente a cambios del medio) que tiene como función aislar y proteger a las bicelas que contiene en su interior (estructuras discoidales, muy versátiles y modulables), permitiendo de esta manera mantener su forma y tamaño para que puedan ser usadas en aplicaciones que conlleven su administración a través de distintas vías donde el contenido en agua es muy alto, como por ejemplo, pero sin limitarse a, vía digestiva, vía parenteral, vía respiratoria y vía tópica.
Las bicelas son estructuras muy sensibles a los cambios del medio donde se encuentran, por lo que el aislamiento de estas estructuras las protege de posibles variaciones. Este aislamiento se lleva a cabo mediante la encapsulación de dichas bicelas en el interior de vesículas lipídicas o liposomas, donde la membrana lipídica exterior del liposoma asegura el aislamiento y estabilidad de la bicela capturada en su interior. Es decir, dentro de la vesícula lipídica se crea el microambiente perfecto para que la bicela pueda conservar su morfología en todo momento. Además, los liposomas ofrecen la ventaja de ser estables con la temperatura y la dilución a diferencia de las bicelas sin encapsular.
Una de las propiedades más interesantes que poseen las bicelas es la capacidad de potenciar la permeabilidad para poder atravesar las distintas barreras fisiológicas como son la barrera hematoencefálica, la barrera del estrato córneo de la piel, diferentes membranas mucosas como por ejemplo, pero sin limitarse a, la oral, gástrica, intestinal, nasal, conjuntival, pulmonar, y otras barreras fisiológicas.
Este efecto permeabilizador que presentan es debido a su pequeño tamaño y a su composición (fosfolípidos de cadena larga y fosfolípidos de cadena corta con efecto activador de superficie o tensioactivo) y se origina porque los lípidos de las bicelas se mezclan con los lípidos de las membranas de los tejidos modificando su fluidez y permeabilidad. La capacidad de potenciar la permeabilidad de diferentes barreras biológicas (como son la barrera hematoencefálica, la barrera del estrato córneo de la piel, diferentes membranas mucosas como por ejemplo, pero sin limitarse a, la oral, gástrica, intestinal, nasal, conjuntival, pulmonar, y otras barreras fisiológicas) y, por tanto, el paso a través de estas barreras proporciona a las bicelas una gran ventaja para su aplicación en el campo de la medicina y la farmacia.
La temperatura junto con la hidratación son parámetros clave en la estructura que va a adoptar una bicela y, por tanto, muy importantes para que tenga lugar la correcta formación del liposoma descrito en el aspecto anterior.
Cuando se modifica la concentración total de lípidos se inducen cambios morfológicos en la estructura de la bicela causados por la variación en el contenido de agua. Cuando la cantidad de agua se incrementa, la concentración de fosfolípido en agua decrece por lo que es eliminado de la estructura de las bicelas (principalmente de los extremos) para liberarse en el agua en forma de monómeros. Este hecho y la alta hidrofobicidad de las moléculas de fosfolípido de cadena larga que componen la bicela inducen un incremento en la razón molar (q) entre el fosfolípido de cadena larga y el de cadena corta y, como consecuencia, un aumento en el diámetro de las bicelas.
A una concentración del 20% en contenido lipídico, las bicelas son estructuras discoidales pequeñas (menores de 10 nm) mientras que al aumentar el agua en el sistema las estructuras pequeñas se van transformando en agregados de mayor tamaño de forma que a concentraciones del 0,62% en lípido ya se empiezan a detectar estructuras con tamaños de 500 nm mezcladas con agregados más pequeños y a concentraciones lipídicas del 0,15% sólo se detectan estructuras muy grandes mayores de 500nm, por lo que preferiblemente, la bicela se encuentra a una concentración del 20% en contenido lipídico total.
Según otra realización preferida, la temperatura de transición media de los lípidos del liposoma descrito en el aspecto anterior es de entre 4 y 40 °C.
En la presente invención el término "temperatura de transición de fase", Tm, hace referencia a la temperatura en la que el sistema pasa de la fase gel a la fase cristal líquido. Se tendrán que tener en cuenta dos Tm distintas, la Tm de los lípidos que forman el liposoma y la Tm de los lípidos que forman la bicela. Aunque las bicelas están formadas por una mezcla de dos tipos de lípidos, se considerará como la temperatura de transición de fase de las bicelas aquella correspondiente con el fosfolípido de cadena larga, ya que éste es el responsable de que se forme la bicapa de la estructura y la transición de fase a la que nos referimos está obligatoriamente ligada a la formación de bicapas. El término "temperatura de transición media" hace referencia al intervalo de temperaturas en el que la Tm de la bicela y la Tm del liposoma coinciden, y por tanto, el intervalo de temperaturas en el que el liposoma descrito en el aspecto anterior se mantiene estable. Teniendo en cuenta que la Tm de los lípidos del liposoma es de entre -20 y 40°C y que la Tm de los lípidos de la bicela es de entre 4 y 60°C, la temperatura de transición media del liposoma descrito en el aspecto anterior está en el intervalo comprendido entre 4 y 40°C. En otra realización preferida, la bicela contenida en el liposoma comprende fosfolípidos de cadena larga en su región central plana y fosfolípidos de cadena corta en las regiones de los extremos.
Cada fosfolípido contenido en la bicela está formado por glicerol, al que se le unen dos ácidos grasos y un grupo fosfato. Como hemos dicho, según donde se sitúe el fosfolípidos en la bicela encontraremos que la cadena de ácidos grasos será mayor o menor. Así, los fosfolípidos situados en la región central plana deben poseer una cadena de ácido graso de como mínimo 12 carbonos, preferiblemente de cómo mínimo 15 carbonos, y más preferiblemente aún de - como mínimo 18 carbonos; mientras que la cadena de ácido graso de los fosfolípidos situados en los extremos tendrá una longitud de, como máximo, 8 átomos de carbono, preferiblemente de - cómo máximo - 7 carbonos, y más preferiblemente aún de - cómo máximo - 5 carbonos.
En la figura 1 puede observarse cómo se van situando los fosfolípidos en la bicela según la longitud de su cadena hidrocarbonada.
En una realización más preferida, la razón de las concentraciones molares de los fosfolípidos de cadena larga y de cadena corta de la bicela es de entre 1 y 10, preferiblemente entre 1 ,5 y 9, y más preferiblemente entre 2 y 8. En otra realización más preferida, la diferencia entre el número de carbonos entre los fosfolípidos de cadena larga y cadena corta de la bicela es de entre 5 y 25, preferiblemente entre 7 y 22, y más preferiblemente entre 8 y 20. Como se ha mencionado anteriormente, una diferencia significativa entre el número de carbonos de los distintos fosfolípidos que componen la bicela proporciona a esta estructura la capacidad de incrementar la permeabilidad para atravesar distintas barreras fisiológicas como podrían ser la barrera del estrato córneo de la piel o la barrera hematoencefálica.
Debido a que la composición de la bicapa fosfolipídica condiciona muchos parámetros a tener en cuenta como la densidad de empaquetamiento, flexibilidad, resistencia osmótica, estabilidad "in vivo" e "in vitro", permeabilidad, carga eléctrica, capacidad antigénica, etc., los fosfolípidos de cadena larga, empleados en el desarrollo y producción de bicelas, se pueden seleccionar, sin ser limitante, de la lista que comprende dilauril-fosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diestearil-fosfatidilcolina (DSPC) y diaraquidonil-fosfatidilcolina (DAPC), preferiblemente son DMPC y DPPC y aún mas preferiblemente DPPC. De igual manera, el fosfolípido de cadena corta empleado en el desarrollo y producción de bicelas se puede seleccionar, sin ser limitante, de la lista que comprende dipentanoil-fosfatidilcolina (DPePC), dihexanoil-fosfatidilcolina (DHPC), diheptanoil-fosfatidilcolina (DHpPC) y dioctanoil-fosfatidilcolina (DOcPC), siendo preferiblemente dihexanoil-fosfatidilcolina (DHPC). En una realización preferida, la bicela tiene una longitud de eje mayor entre 10 y 80 nm, más preferiblemente incluso entre 15 y 75 nm y, en otra realización preferida, el liposoma tiene un diámetro de entre 200 y 1000 nm más preferiblemente incluso entre 220 y 900 nm.
De aquí en adelante, para hacer referencia a cualquier liposoma descrito en párrafos anteriores se puede emplear el término "liposoma de la invención".
Otro aspecto de la presente invención se refiere a la composición que comprende el liposoma de la invención, de aquí en adelante" composición de la invención".
Los resultados de la invención confirman que la encapsulación de las bicelas formando el liposoma de la invención preserva su estructura bajo dilución, por lo que, si a esto añadimos las propiedades que presentan estas estructuras, el uso de liposomas de la invención sería una buena estrategia tanto para asegurar la estabilidad de las bicelas en todos los tejidos biológicos debido a que en la mayoría el contenido en agua es elevado, como para introducir bicelas a través de fluidos biológicos con alto contenido en agua como, por ejemplo, pero sin limitarse a, el fluido cerebroespinal, la sangre y/o la saliva.
Por otro lado, los liposomas de la invención tienen la capacidad de encapsular diferentes sustancias de un modo similar a como lo hacen los liposomas, pero con la ventaja de que una vez transportado el fármaco, la penetración de éste en un tejido concreto estará favorecida por el efecto de la estructura discoidal interna de la bicela. Además, la encapsulación y transporte de sustancias hidrofóbicas en los liposomas de la invención está más favorecida por el hecho de que estas estructuras contienen una proporción mayor de bicapa que los liposomas. Así, pueden ser incorporadas sustancias en el interior de las bicelas de forma que estas estructuras se utilicen como transportadores, marcadores, o para cualquier aplicación que considere apropiada un experto en la materia.
Así, como se ha descrito anteriormente, la microencapsulación en el campo textil es una tecnología novedosa que permite sustituir las dispersiones o emulsiones de determinadas sustancias por fluidos similares en donde dichos compuestos se encuentran dispersos en el interior de microcápsulas de sustancias inertes, que se fijan al textil por un sistema efectivo. Los liposomas ya han sido ensayados como agentes microencapsulantes, pero debido a que este proceso requiere de un conocimiento físico-químico eficaz de las interacciones existentes a nivel fibra-microcápsula, los liposomas de la invención pueden mejorar de forma significativa las actuales aplicaciones de liposomas en los procesos industriales de tintura de la lana o de cualquier otro material textil aumentando la adsorción, penetración y fijación tanto de colorantes, pigmentos como de otras sustancias utilizadas en este campo de la técnica, y conocidas por cualquier experto en la materia, y que permitan obtener tejidos capaces de realizar diversas funciones, conocidos en la actualidad como "tejidos polifuncionales" o "smart textiles". Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al liposoma de la invención que además contiene un colorante y/o un pigmento, así como a su uso para el encapsulado de colorantes, pigmentos u otras sustancias utilizadas en este campo de la técnica, y conocidas por cualquier experto en la materia, y que permitan obtener tejidos capaces de realizar diversas funciones, conocidos en la actualidad como "tejidos polifuncionales" o "smart textiles". Estos liposomas de la invención que pueden contener además colorantes y/o pigmentos se pueden utilizar para el tintado de materiales textiles, o pueden contener también otras sustancias utilizadas en la industria textil aumentando así la eficacia de los procesos de tintado de estos materiales textiles.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al liposoma de la invención que además comprende un principio activo, así como a su uso para el encapsulado de al menos un principio activo.
El término "principio activo" hace referencia a cualquier sustancia capaz de provocar un efecto sobre el organismo o a cualquier sustancia capaz de utilizarse para identificación o diagnóstico. La actividad de un principio activo varía debido a la naturaleza de éstos, pero siempre está relacionada con la cantidad ingerida o absorbida. Así, el principio activo se puede seleccionar de entre la lista que comprende, pero sin limitarse a, agentes marcadores útiles para el diagnóstico como derivados del gadolinio (ácido gadopentético, gadodiamina, ácido gadotérico y gadoteridol), derivados de hierro (hierro III amonio citrato, ferumóxido y hierro III óxido) o derivados de magnesio; agentes antiinflamatorios como diclofenaco, acetaminofeno o ácido flufenámico; antioxidantes como polifenoles (flavonoides), vitaminas (A, E, C), oligoelementos (selenio, zinc), carotenoides (luteína), aminoácidos (teanina) o cafeína; filtros solares como aminobenzoatos, salicilatos, benzofenonas, derivados del dibenzoilmetano, cinamatos o acrilatos; agentes citotóxicos como agentes alquilantes, metotrexato, 6-mercaptopurina, 5-fluoracilo, antibióticos antitumorales o cisplatino y derivados; agentes inmunogénicos; sustancias que signifiquen un aporte exógeno para situaciones patológicas de carencia como vitaminas, hierro, calcio; lípidos epidérmicos de especial importancia para la función barrera de la piel como ceramidas, sulfato de colesterol o ácidos grasos libres; ácidos nucleicos o drogas hidrofóbicas, o mezclas de cualquiera de los anteriores. En una realización preferida el principio activo se puede seleccionar entre diclofenaco, hierro, gadodiamida, ácido flufenámico, cafeína, ceramidas, sulfato de colesterol o mezclas de ellos.
En esta invención se demuestra que sustancias como la gadodiamida (útil como marcador en resonancia magnética de imagen que permite el seguimiento en todo momento del recorrido de los liposomas de la invención en el interior del organismo), el diclofenaco y el ácido flufenámico (antinflamatorios de alto espectro), el hierro (habitualmente utilizado para el tratamiento de anemias), la cafeína (usado como antioxidante) y, las ceramidas y el sulfato de colesterol (lípidos responsables de la correcta función barrera de la piel e implicados en diversos mecanismos biológicos) son encapsuladas de forma eficaz en el interior de las bicelas contenidas en los liposomas de la invención. Esta capacidad de utilizar los liposomas de la invención como vehículos farmacológicamente activos conduciría al uso de estas estructuras para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sustancia que se está transportando, tratando entre otras, patologías relacionadas con procesos inflamatorios (cuando se encapsulan antiinflamatorios como diclofenaco y ácido flufenámico), enfermedades relacionadas con la deficiencia de hierro y/o vitamina B12 como son la anemia y la enfermedad de Crohn entre otras, lesiones (por regulación de la adhesión plaquetaria), cáncer (cuando se encapsulan agentes citotóxicos), etc. Además, los liposomas de la invención también podrían ser utilizadas en terapia génica dirigiendo el gen defectivo o ausente que está encapsulado a las células diana del paciente.
La alta capacidad permeabilizadora que presentan las bicelas las hace estructuras adecuadas como cosméticos por sus ya probadas propiedades dermatológicas debido a que promueven un refuerzo de los lípidos presentes en el estrato córneo, dando como resultado un aumento de los valores de elasticidad y una mejora de las características del tejido biológico (Barbosa- Barros, L; Barba, C; Cocerá, M.; Coderch, L; López-lglesias, C; de la Maza, A.; López, O. Inter. J. Pharmaceut. 2008, 352, 263) siendo útiles para potenciar la reparación de tejidos dañados por envejecimiento cutáneo, eczemas, sequedad, quemaduras, grietas, manchas y todas aquellas patologías relacionadas con la falta de l ípidos en las células del estrato córneo. Además el encapsulamiento, en el interior de los liposomas de la invención, de agentes cutáneos reparadores, vitaminas, filtros solares u otros principios activos potenciaría las acciones cosméticas de los liposomas.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se refiere al uso del liposoma de la invención, o la composición de la invención, o dicha composición que además comprende un principio activo para la elaboración de un producto cosmético, donde el cosmético se administra por vía tópica.
Se entenderá por "producto cosmético" toda sustancia o formulación de aplicación local a ser usada en las diversas partes superficiales del cuerpo humano: como, pero sin limitarse, a epidermis, sistema piloso y capilar, uñas, labios y órganos genitales externos o en los dientes y las mucosas bucales, con el fin de limpiarlos, perfumarlos, modificar su aspecto y protegerlos o mantenerlos en buen estado y prevenir o corregir los olores corporales. La vía tópica utiliza la piel y las mucosas para la administración del cosmético, lo que incluye las mucosa conjuntival, nasal, oral y urogenital, y además el sistema piloso y capilar, uñas, labios y dientes.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del liposoma de la invención, o la composición de la invención, o dicha composición que además comprende un principio activo para su uso como medicamento.
El liposoma de la invención asi como la composición de la invención, conteniendo o no un principio activo, puede usarse para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de, pero sin limitarse a, enfermedades de la piel, hepáticas, renales, cardiovasculares, cerebrales, óseas, musculares, tejidos asociados al tracto gastrointestinal, urinario, sistema respiratorio, endocrino, nervioso o tejido auditivo u ocular. Una realización preferida se refiere al uso del liposoma de la invención, o la composición de la invención, o dicha composición que además comprende un principio activo, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de la piel, tejido nervioso o tejido ocular. En una realización más preferida el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración por vía raquídea o por vía tópica a través de la mucosa conjuntival.
El término "forma adaptada" hace referencia al modo de adecuar el medicamento de la presente invención para que pueda ser administrado por vía raquídea o por vía tópica a través de la mucosa conjuntival.
Otra posibilidad es que el medicamento se presente en una forma adaptada a la administración parenteral, cutánea, oral, epidural, sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada. La forma adaptada a la administración parenteral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración inyectable, es decir, preferiblemente en estado líquido. La administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de administración intramuscular, intraarterial, intravenosa, intradérmica, subcutánea o intraósea, pero sin limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración parenteral. La forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado. La forma adaptada a la administración rectal se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, supositorio, cápsula rectal, dispersión rectal o pomada rectal. La forma adaptada a la administración transdérmica se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, parche transdérmico o iontoforesis.
Así se abren un gran número de aplicaciones en distintos campos para estas nanoestructuras bicelares.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el liposoma de la invención, o que comprende la composición de la invención, o que comprende dicha composición que además comprende un principio activo. En una realización preferida, la composición farmacéutica además comprende al menos un excipiente farmacológicamente aceptable.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del liposoma de la invención o la composición de la invención, estabiliza dicho compuesto o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores, aromas, texturas y protección que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
Dentro de las sustancias activas están, por ejemplo, las descritas anteriormente, tanto en una composición junto con los liposomas de la invención o encapsuladas dentro de los liposomas de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere al método para obtener el liposoma de la invención, que comprende:
a. obtener un film lipídico desecado y una solución acuosa de bicelas, b. hidratar el film lipídico obtenido en el paso (a) con la solución acuosa de bicelas obtenidas en el paso (a),
c. aislar y/o purificar el producto obtenido en el paso (b).
En una realización más preferida, la obtención del film lipídico desecado del paso (a) comprende: i. disolver lípidos en un solvente orgánico a concentraciones entre 5 y 30 mg/ml, y
¡i. eliminar el solvente orgánico del paso anterior.
En una realización más preferida, la obtención de la solución acuosa de bicelas del paso (a) comprende: i. disolver en un solvente orgánico fosfolípidos de cadena larga y fosfolípidos de cadena corta cuya razón de las concentraciones molares es de entre 1 y 10,
¡i. eliminar el solvente orgánico del paso anterior y rehidratar el producto obtenido con solución acuosa hasta conseguir una concentración de lípidos de entre 15 y 25% peso/volumen. En una realización aún más preferida el fosfolípido de cadena larga es dimiristoil-fosfatidilcolina o dipalmitoil- fosfatidilcolina y el fosfolípido de cadena corta es dihexanoil- fosfatidilcolina. La solución final debe ser transparente, para ello, la metodología de preparación requiere la consecución de una serie de pasos que han sido optimizados, los cuales incluyen tratamientos con ultrasonidos durante tiempos que oscilan entre 5 minutos y 5 horas, a temperaturas entre 5-60°C y potencias entre 100 y 600W y un específico proceso de centrifugación tal como se describe en el siguiente párrafo, con el fin de separar/purificar los liposomas de la invención de otros agregados lipidíeos que hayan podido formarse.
Un paso importante una vez se obtienen el film lipídico desecado, la solución acuosa de bicelas y se hidrata el film lipídico con la solución de bicelas, es la purificación, de las estructuras obtenidas, por centrifugación entre 15000xg y 30000xg preferiblemente 20000xg durante periodos entre 120 y 15 min más preferiblemente 45 min. Condiciones más o menos drásticas conducirían a sistemas formados por mezclas de agregados. Otros sistemas de purificación/separación que impliquen diluciones, como son las resinas de exclusión de tamaño podrían provocar la transición de bicelas no encapsuladas, a vesículas.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas tales como morfología, topología, fluidez, viscosidad, heterogeneidad de las estructuras resultantes, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1. Estructura de una bicela. Muestra los dos tipos de fosfolípidos que debe poseer una bicela en cada una de sus zonas diferenciando para ello la zona de los extremos de la zona central plana. FIG. 2. Microfotografías representativas de muestras bicelares antes (A) y después (B) de la dilución.
En la Figura 2A (bicelas) las bicelas se muestran en todas las proyecciones: de frente (flecha blanca) y lateralmente (flecha negro). En la Figura 2B (bicelas diluidas) se observan vesículas esféricas unilamelares que muestran una gran variedad de tamaños (de 30 a 250 nm).
FIG. 3. Micrografías obtenidas por cryo-TEM de liposomas de la invención (liposomas y bicelas).
En la Figura 3 se observaron dos tipos de estructuras: estructuras pequeñas de aproximadamente 20 nm, y otras mayores de tamaño entre 100 y 200 nm.
La Figura 3A muestra una vista general de la muestra de liposomas de la invención en la cual se ven una gran cantidad de bicelas. Es de resaltar la gran adherencia de la mayoría de las bicelas sobre el carbono (zona señalada en la Fig. 3A con un asterisco). Estas bicelas mostraron principalmente la proyección lateral.
La Figura 3B muestra bicelas encapsuladas, en sus dos proyecciones (flechas blancas) y bicelas no encapsuladas (flechas negras). Algunas de las bicelas encapsuladas mostraron un aumento de tamaño (alrededor de 100 nm) con respecto a las no encapsuladas (20 nm), ver Figura. 3A.
La Figura 3C muestra bicelas apiladas cara a cara dentro de los liposomas.
FIG. 4. Micrografías obtenidas por cryo-TEM de liposomas de la invención diluidos (liposomas y bicelas).
La Figura 4A muestra una alta variabilidad de vesículas en la muestra diluida: liposomas vacíos (flechas negras); liposomas dentro de otros liposomas llamados vesículas oligo-lamelares (punta de flecha blanca); vesículas multilamelares (flechas en blanco) y liposomas con bicelas dentro o liposomas de la invención (punta de flecha negra).
La Figura 4B muestra liposomas multilamelares.
La Figura 4C muestra acumulaciones de bicelas dentro de liposomas como en las muestras tras la dilución (Fig. 3C).
La Figura 4D muestra en detalle bicelas apiladas dentro de los liposomas multilamelares.
FIG 5. Visualización por MRI de inyección intra-cerebro-ventricular de bicelas conteniendo gadodiamida.
La Figura 5A muestra la visión coronal del cerebro de rata sano.
La Figura 5B muestra la visión coronal del cerebro de rata inyectado con la muestra de bicelas conteniendo gadodiamida.
FIG. 6. Visualización por MRI de inyección intra-cerebro-ventricular de bicelas conteniendo gadodiamida encapsuladas en liposomas.
La Figura 6A muestra una vista sagital de cerebro de rata sana (primera imagen) e inyectada con la muestra de liposomas de la invención (liposomas que contenían en su interior bicelas de Gadodiamida) a las Oh, 4h, 8h y 24 horas después de la inyección (cuatro imágenes siguientes).
La Figura 6B muestra la hiper-intensidad inducida por gadodiamida que se cuantificó dibujando un entorno de una zona anatómica que contenía fluido cerebroespinal (CSF) a distintos tiempos. Detalle de la región de interés. La Figura 6C muestra la intensidad de señal del LCR (normalizada frente a intensidad muscular) para una rata de control (barra blanca) y la rata inyectada con liposomas que contenían bicelas con gadodiamida (barras negro) en diferentes tiempos después de la inyección. Representación para observar la evolución de la hiper-intensidad en el tiempo. FIG. 7. M ¡orografías obtenidas con TEM (microscopio electrónico de transmisión) de mucosa oral porcina.
La figura 7A muestra una imagen de la mucosa sin tratar y la figura 7B muestra el tejido después del tratamiento con los liposomas de la invención que contienen nistatina. No se observan cambios estructurales que puedan asociarse al deterioro del tejido.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen la preparación de los liposomas de la invención, su caracterización mediante espectroscopia de correlación fotónica (DLS) y crio-microscopía electrónica de transmisión (Cryo-TEM) y el efecto de la introducción de estos sistemas en dos ratas Wistar por inyección intracerebroventricular por visualización MRI. En todos los ensayos se pone a prueba la estabilidad de la bicelas en ambientes diluidos a fin de utilizar estas nano-estructuras a través de vías sistémicas que impliquen un alto contenido en agua.
En estos ejemplos el término "sistema" se refiere a las propias bicelas o a los liposomas que comprenden bicelas en su interior.
EJEMPLO 1. Preparación de sistemas.
1 .1 Bicelas.
Se eligió para su preparación la mezcla compuesta por DPPC/DHPC. La razón de esta elección es debida a que en los intervalos de temperatura de trabajo (de 25 a 37 °C) las bicelas compuestas por DPPC/DHPC no experimentan los cambios observados en las bicelas compuestas por DHPC en combinación con otro fosfolípido de cadena larga. Este hecho encuentra su explicación en que el DPPC posee una Tm de 41 °C, temperatura significativamente superior a la temperatura de trabajo usada en la presente invención, con lo que se confirma que la transición en la estructura de una bicela ocurre a temperaturas superiores a la temperatura de transición de los lípidos que la forman. Las muestras se prepararon mezclando cantidades apropiadas de DPPC en polvo y una solución clorofórmica de DHPC hasta alcanzar una razón molar DPPC/DHPC de q = 3.5. Una vez mezclados los componentes, el cloroformo se eliminó por medio de un rotavapor y los sistemas resultantes se hidrataron con una solución del marcador paramagnético gadodiamida hasta alcanzar el 20% (peso/volumen) de la concentración total de lípido. Las soluciones bicelares se prepararon sometiendo a las muestras a varios ciclos de sonicación y congelación hasta que las muestras llegaron a ser transparentes. 1 .2 Bicelas encapsuladas en liposomas: Liposomas de la invención.
La composición de los liposomas utilizados fue de 80% Lipoid S-100 y del 20% de colesterol. Estos dos componentes se mezclaron en cloroformo y a continuación se formó un film lipídico eliminando el cloroformo con rotavapor. El film formado se hidrató con la solución bicelar previamente formada. Esta solución se extruyó tres veces a través de una membrana de policarbonato de 800 nm. La solución de liposomas se centrifugó durante 45 minutos a 20000 x g en una centrífuga Heareus con un rotor JA-20. El sobrenadante se separó y el pelet, se resuspendió hasta obtener el volumen inicial con NaCI 0.9% a fin de mantener la misma concentración de lípido. Este procedimiento se repitió 3 veces. Así fue posible separar las gadodiamida encapsulada de la no encapsulada en el sistema lipídico.
EJEMPLO 2. Caracterización de los sistemas.
A fin de evaluar el efecto de la dilución en los sistemas, las muestras se analizaron utilizando las técnicas de espectroscopia DLS y Cryo-TEM antes y después de la dilución. La primera técnica se utilizó para determinar el tamaño medio de los sistemas, mientras que la segunda fue muy útil para la caracterización de aspectos dimensionales y morfológicos de las nano- estructuras y para proporcionar una visualización directa de las muestras de los l ípidos.
2.1 Espectroscopia de correlación fotónica (DLS)
El diámetro hidrodinámico (HD) y el índice de polidispersidad (Pl) se determinaron usando el aparato Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Systems, Southborough, MA). Las medidas de DLS consideran el movimiento Browniano de las partículas y correlaciona esta lectura con los tamaños de partícula. La relación entre el tamaño de partícula y su velocidad debida al movimiento Browniano se define en la ecuación de Stokes-Einstein:
HD = kT/3 πη D
donde:
HD es el diámetro hidrodinámico, D es el coeficiente de difusión translacional (m2/s), k es la constante de Boltzmann (1 .3806503 x 10"23 m2 kg s"2 k"1), T es la temperatura absoluta (K) y η es la viscosidad (mPa.s). Los diferentes tamaños de los sistemas se determinaron por detección y análisis de la luz dispersada cuando el rayo láser de He/Ne de 632 nm atraviesa la muestra.
La interpretación de los datos se realizó considerando la distribución de tamaños por intensidad y por volumen de la luz dispersada. El uso de esta metodología, que considera que partículas con diferentes tamaños difunden diferente intensidad de luz, es especialmente útil en muestras que presentan alta heterogeneidad de tamaños. Las medidas por DLS se realizaron a 25 y 37° C a fin de observar las características de los sistemas a temperaturas ambiente y fisiológica.
Los datos obtenidos a temperatura ambiente se indican en la Tabla 1 .
Tabla 1. HD y proporción de las poblaciones de partículas analizadas por intensidad y volumen de luz dispersada
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Datos obtenidos con el software proporcionado por la empresa Malvern Instruments. Los HDs para bicelas DPPC/DHPC (Bice) fueron de 19.5 nm y 16.3 nm estimados por intensidad y por volumen respectivamente, con una proporción de luz dispersada superior al 90% en ambos análisis.
La muestra conteniendo bicelas se diluyó del 20% (concentración inicial) al 0.07 % (concentración final) para saber el efecto de la dilución sobre la estructura bicelar. Al diluir la muestra (Bice Dil) se observaron en ambos análisis (por intensidad y por volumen), dos poblaciones de partículas una de un tamaño alrededor de 26 nm y la otra alrededor de 255 nm. Las proporciones de luz dispersada analizadas por intensidad y por volumen fueron diferentes. Esto es debido a que las partículas grandes y pequeñas contribuyen de forma diferente a la intensidad de la luz dispersada. Así, las partículas grandes dispersan mayor intensidad de luz que las pequeñas. Por esta razón en los sistemas de tamaños heterogéneos el análisis por intensidad dio lugar a una proporción mayor de partículas grandes, como puede apreciarse en la Tabla 1 . El análisis simultáneo por volumen indicó mayor proporción de partículas pequeñas (96,4%) que de partículas grandes (3,6%), indicando la presencia predominante de partículas pequeñas en el sistema, aunque la intensidad de luz dispersada para partículas grandes (88,4%) fuera mayor que para las pequeñas (1 1 ,6%).
Los valores de Pl para los sistemas bicelares fueron respectivamente 0.452 y 0.714, antes y después de la dilución. Así, al diluir la muestra el tamaño de las poblaciones aumentó y las muestras fueron más heterogéneas.
Con todo, es necesario considerar que en esta técnica, el tamaño de las partículas se aproxima al de una hipotética esfera que difunde con la misma velocidad que la partícula del experimento. Como la estructura bicelar tiene forma de disco, el tamaño de las partículas obtenidas por el DSL proporciona una medición relativa de las dimensiones de la estructura. Por lo tanto, estos datos deben interpretarse teniendo en cuenta también las imágenes de cryo-TEM que se analizan en el apartado 2.2.
Los resultados obtenidos por DSL para bicelas encapsuladas en liposomas, (liposomas de la invención, Lipo Inv) se muestran en la Tabla 1 . El análisis por intensidad y por volumen (ambos con una proporción de la luz dispersada de 100%) sólo mostró un pico. El HD analizado por intensidad fue de 92 nm y el de volumen 1 1 ,9 nm. Como ya se ha mencionado, estas diferencias se deben a que las partículas grandes (92 nm) dispersaron mucha más intensidad de luz que las partículas pequeñas (1 1 ,9 nm). Por esta razón en el análisis de intensidad sólo se observó el pico que se corresponde con las partículas grandes. Al analizar las muestras por volumen, se observó una gran contribución de las partículas pequeñas que podía ocultar la pequeña contribución al volumen de las partículas de gran tamaño con lo que se vió sólo un pico, que correspondía con la contribución de las pequeñas partículas. Por lo tanto, dos tipos de estructuras estuvieron presentes, aunque sólo se observó un pico para cada análisis. Se describen a continuación (apartado 2.2) los resultados obtenidos por microscopía a fin de aclarar esta interpretación. Cuando se diluyó la muestra de liposomas de la invención (Lipo Inv Dil.) se observaron claramente dos picos (Tabla 1 ). En general, las estructuras se hicieron más grandes con diámetros de 800 nm (86,3%) y 72,4 nm (13,7%) por intensidad y 850 nm (59,8%) y 68,7 nm (40,2%) por volumen. Los valores de Pl también aumentaron de 0,420 a 0,612 antes y después de la dilución, respectivamente.
Los datos de DLS a 37 0 C no mostraron cambios en comparación con los resultados a temperatura ambiente. 2.2 Crio-microscopía electrónica de transmisión (Crvo-TEM)
Los liposomas y bicelas se visualizaron por el método de Cryo-TEM. Se formó una fina película acuosa por extracción de la muestra de la suspensión colocada sobre una rejilla. Para ello se utilizaron rejillas de carbono Después de retirar parte de la suspensión de la rejilla se secó con papel de filtro, quedando una película de muestra sobre la rejilla. Estas películas fueron vitrificadas sumergiendo la rejilla en etano, que se mantuvo en su punto de fusión con nitrógeno líquido (según técnica descrita en Honeywell-Nguyen, P. L.; Frederik, P. M.; Bomans, P. H.; Junginger, H. E.; Bouwstra, J. A. Pharm Res 2002, 19, 991 ) con un Vitrobot (FEI Company, Eindhoven, Holanda) y manteniendo las muestras antes de la congelación a 100% de humedad. La temperatura a la que se inició la vitrificación de las películas delgadas fue temperatura ambiente. Las muestras vitreas fueron trasladadas a un microscopio Tecnai F20 (FEI Company, Eindhoven, Holanda) con un cryotransfert Gatan (Barcelona, España). La visualización fue realizada a 200 kV, a una temperatura de entre -170 0 C y -175 0 C usando las condiciones para baja densidad de imagen
En las imágenes se obtiene una visualización directa de la estructura bicelar. Todas las mediciones se obtuvieron por DLS a temperaturas ambiente y fisiológica, (25°C y 37°C) y no se detectó ninguna modificación en el tamaño por causa de la temperatura. Dado que la temperatura no tuvo efecto sobre estos sistemas, los experimentos de cryo-TEM sólo se realizaron para muestras crio- fijadas desde la temperatura ambiente. Algunas micrografías representativas de las muestras antes (muestra de bicelas) y después (muestra de bicelas diluidas) de la dilución se muestran en las Figuras 2A y B, respectivamente.
Las imágenes confirmaron los resultados obtenidos por DLS, demostrando que el tamaño de las estructuras en la muestra de bicelas, alrededor en todos los casos de 20 nm., fue menor que el tamaño de las estructuras en la muestra de bicelas diluidas, que mostraron tamaños que iban desde 30 nm. a 250 nm. Además, la morfología de las partículas también cambió con la dilución (ver Figura 2). Este hecho coincide con los valores de Pl altos (0,714) observados por DLS. Así, el DLS y la microscopía muestran una transición del sistema de discos bicelares a vesículas, transición causada por el efecto de la dilución. A fin de investigar la morfología de estos sistemas, las muestras de liposomas de la invención y de liposomas de la invención diluidos se analizaron por cryo-TEM. También en este caso las muestras para observación microscópica solamente se crio-fijaron a temperatura ambiente. Micrografías obtenidas por cryo-TEM se muestran en las Figuras 3 y 4.
La variedad de tamaños, entre 70 nm y 600 nm, presente en estas imágenes confirma la alta Pl (0.612) en la muestra de liposomas de la invención diluidos. Mientras que las estructuras pequeñas corresponden a bicelas discoidales, las mayores corresponden a liposomas unilamelares. Estas micrografías confirman la interpretación de los resultados de DLS para muestras de los liposomas de la invención debido a que, aunque sólo se detectó un pico por análisis de volumen e intensidad (Tabla 1 ), se observaron dos tipos de estructuras. Sin embargo, los resultados también indicaron una alta conservación estructural de las bicelas encapsuladas independientemente del proceso de dilución debido a que las muestras de liposomas de la invención diluidos sólo se observaron dentro de los liposomas, no son visualizadas bicelas libres (ver Figura 4).
EJEMPLO 3: Incorporación de diferentes sustancias en los sistemas
Las sustancias que se incorporaron en los sistemas fueron: hierro (como cloruro de hierro a una concentración del 50%), ceramidas (10 y 20%), cafeína (10%), gadodiamida (60%), sulfato de colesterol (20%), diclofenaco (1 .16%) y ácido flufenámico 1 %). La incorporación se hizo en la fase de realización de las bicelas. Dependiendo del carácter hidrófilo o lipófilo de la sustancia, ésta se añadió junto con los lípidos formadores de la bicela en la fase clorofórmica o junto con el agua de hidratación. Se eligieron para estas preparaciones las mezclas compuestas por DPPC/DHPC, DMPC/DHPC y DOPC/DHPC. El DOPC es dioleoilfosfatidilcolina. Se trabajó con razones molares de concentraciones de los dos lípidos de 2 a 3.5.
Las muestras se sometieron a entre 10 y 50 ciclos de sonicación en baño de ultrasonidos 5 minutos y congelación 5 minutos hasta que llegaron a ser transparentes. Estas bicelas con las sustancias contenidas en su interior, se encapsularon en liposomas de la manera descrita en el ejemplo 1 y se caracterizaron siguiendo los métodos descritos en el ejemplo 2.
EJEMPLO 4: Uso de los sistemas de la invención para su uso en productos de aplicación ocular. Un compuesto con efecto terapéutico en el tratamiento de sensibilizaciones de la mucosa conjuntival, fue incorporado en los sistemas de la invención como describe el ejemplo 3. Se comprobó mediante microscopía óptica que este compuesto, que había sido imposible de dispersar utilizando otros sistemas de emulsión (siempre cristalizaba formando estructuras muy grandes), se mantenía disperso sin formar ningún agregado cuando era incorporado en los sistemas de la invención. Este hecho resultó ser todo un éxito, ya que la formación de cristales siempre impedía su uso para aplicación ocular. Los sistemas de la invención conteniendo dicho compuesto fueron aplicados en ojos de animales de experimentación y se comprobó por microscopía óptica que los cristales tampoco se formaban al entrar en contacto con el entorno acuoso del ojo.
Además se realizaron ensayos de estabilidad y de actividad del citado compuesto, y se verificó que éste se mantenía estable y activo después de su incorporación a los sistemas de la invención.
EJEMPLO 5. Experimentos "in vivo": Agente de visualización de contraste por Resonancia Magnética de Imagen (MRI)
Además, se realizaron experimentos "in vivo" para conocer la estabilidad de estas nuevas estructuras. Se incluyó en estos sistemas el agente de contraste paramagnético gadodiamida. Este agente fue inyectado en el sistema ventricular del cerebro de rata y se visualizó por resonancia magnética (MRI). Indujo una hiper-intensidad que fue cuantificada mediante la definición de una región de interés (ROI) en el compartimento de líquido cefalorraquídeo (LCR).
3.1 Animales
Los experimentos de MRI se realizaron en dos ratas Wistar (machos adultos de peso 250-275 g.) Las ratas se acondicionaron a temperatura (21 ±1 °C) y humedad (55±10%) controladas, con ciclos de 12-h de luz/12-h de oscuridad (luz entre 6:00 AM y 6:00 PM). Se les suministró alimento y agua ad libitum durante el acondicionamiento. Todos los experimentos se realizaron siguiendo las normas de la "National Institute of Health Animal Protection Guidelines" y fueron aprobadas por las autoridades del Comité Local de Bioética.
3.2 Invecciones Stereotaxias.
Los animales fueron previamente anestesiados con 4% isofluorano en O2:N2O (3:7, cantidad que se redujo al 1 % de isofluorano durante el mantenimiento, y se colocaron en un aparato estereotáctico (Stoelting, EE.UU.). La sutura sagital, y la superficie del cerebro fueron utilizadas como referencias para las coordenadas anteroposteriores (AP), medio-laterales (ML), y dorso-ventrales (DV), respectivamente. Se practicó un agujero en el cráneo de la rata para inyectar la solución en el ventrículo lateral en las siguientes coordenadas estereotáxicas: AP: -0,04 mm; ML: -0,12 mm; DV: -0,37 mm de la Bregma. Cantidades de 50 μΙ de una solución acuosa conteniendo dos preparaciones diferentes de bicelas (una formada por bicelas libres y otra formada por los liposomas de la invención) mezcladas con gadodiamida fueron inyectadas con una jeringa de 100 μΙ Hamilton equipada con una aguja de 32G, a un ritmo de inyección de 2 μΙ /min.
Después de la inyección, la aguja se dejó en el lugar durante 5 minutos para evitar fugas. Al final de la cirugía, la piel se suturó y el animal fue trasladado a la base del escáner para la obtención de imágenes de RM. La gadodiamida se inyectó tanto en la solución de bicelas como en la de liposomas de la invención. La concentración de bicelas que se utilizó para la inyección fue de 200 mg/ml. El investigador que llevó a cabo la administración estereotáxica poseía una gran experiencia en este procedimiento.
3.3 Resonancia Magnética de Imagen (MRI) "in vivo".
Se realizaron barridos de RM bajo anestesia con isofluorano en un escáner 70/30 BioSpec horizontal para animales (Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania), equipado con un diámetro interior de 12 cm activamente blindado y con un sistema de gradiente (400 mT/m). El anillo de configuración consistió en una bobina de transmisión/recepción. Los animales fueron colocados en posición supina en un soporte de plexiglás con un cono nasal para la administración de gases anestésicos, fijada con una barra a los dientes, tapones para los oídos y cinta adhesiva. Las exploraciones Tripilot se utilizaron para la colocación exacta de la cabeza del animal en el interior del imán. La cabeza del animal fue colocada de tal forma que aproximadamente el centro del cerebro coincidiera con el isocentro del imán. Se realizó una secuencia de imágenes T1 -ponderadas axiales sagitales con un flash convencional (Fast Low Angle Shot imágenes). Los parámetros de exploración de las imágenes sagitales fueron: tiempo de repetición (TR) = 350 ms, tiempo de eco (TE) = 5,4 ms, 2 medias, el grosor de corte = 1 mm, el número de cortes contiguos = 15, campo de visión (FOV) = 4 x 4 cm2, y la matriz = 256 256 χ 15 píxeles, resultando en una resolución espacial de 0,156 χ 0,156 mm en 1 mm de espesor del corte. Además, los mapas T1 con orientación axial fueron realizados con RAREVTR (adquisición rápida con el mejoramiento de la relajación y el tiempo variable de repetición) de secuencia. Los parámetros de exploración fueron: TR=182,412 ms, 200 ms, 500 ms, 700 ms, 1000 ms, 1400 ms, 2000 ms, 3000 ms, 6000 ms, TE = 10 ms, con un grosor de corte = 1 mm, el número de cortes contiguos = 12, FOV = 3 x 3 cm2, y la matriz = 128 χ 128 χ 12 píxeles, resultando en una resolución espacial de 0,234 χ 0,234 mm en 1 mm de espesor del corte. La toma de imágenes se realizó justo después de la inyección y a 4,8 y 24 horas más tarde.
3.4 Análisis de imágenes.
Se determinó una región de interés (ROI) que se delimitó en el compartimento líquido cefalorraquídeo (LCR) de cada imagen para evaluar el aumento de la señal producida por la gadodiamida. Se normalizó la señal y se realizó el análisis estadístico mediante la prueba t de Student emparejado (un valor de p <0,05 fue considerado significativo).
Cuando lo que se inyectó fueron bicelas libres, cinco minutos después del final de la infusión de las bicelas ambos animales murieron, debido a la drástica expansión a las que se vieron sometidas las bicelas en todo el sistema cerebro-ventricular de la rata, y el análisis de MRI se realizó "post- mortem". La Figura 5 muestra la visión coronal del cerebro de rata sano (A) y el inyectado con la muestra de bicelas (B). Puede observarse que las bicelas libres cursaron con una drástica expansión en todo el sistema cerebro- ventricular de la rata lo que le produjo la muerte después de la inyección.
En el caso de inyectar bicelas encapsuladas, se aplicaron inyecciones intracerebroventriculares (i.c.v) en ratas a fin de observar el aumento de la intensidad de la señal de gadodiamida en el CSF por administración de muestras de liposomas de la invención. La rata se inyectó utilizando el mismo procedimiento experimental. El animal se escaneó inmediatamente y transcurridas 4h, 8h y 24h. En contraste con la administración de la muestra bicelar, el animal que recibió la muestra de bicelas encapsuladas o liposomas de la invención sobrevivió. Dicha preparación no presentó ningún efecto aparentemente tóxico observándose un efecto dependiente del tiempo con una hiperintensidad máxima de la señal en el CSF en el análisis realizado inmediatamente después de la infusión de la preparación de liposomas de la invención y una disminución progresiva de la señal con el tiempo. A las 24 horas la intensidad fue similar a la que se encontró en animales sanos (control) (ver Figura 6).
Teniendo en cuenta que los liposomas de la invención tienen un mayor tamaño que las bicelas en ambientes diluidos y aún así permitieron la supervivencia de los animales, el hecho de que la inyección intracerebroventricular de bicelas libres resultara letal para las ratas se explica debido a los rápidos e incontrolados cambios morfológicos que experimentan estas estructuras en contacto con ambientes diluidos como es el fluido cerebroespinal. Estas repentinas transiciones morfológicas son, por tanto, la causa de que cambie la composición en el fluido cerebroespinal y se promueva la expansión del sistema cerebroventricular.
EJEMPLO 6: Uso de los sistemas de la invención para su uso en tratamientos antimicóticos de la mucosa oral.
La molécula nistatina fue incorporada en los sistemas de la invención como describe el ejemplo 3. Concretamente en los sistemas que contenían DPPC/DHPC. La composición también incluía, una mezcla de fosfolípidos de Lipoid S-100 y colesterol al 20%. La nistatina tiene actividad antibiotica antifúngica y es utilizado frecuentemente en infecciones cutáneas y mucosas originadas por la especie de hongo Candida albicans. La cantidad de nistatina incorporada en el sistema de la invención fue del mismo orden que la presente en los productos que contienen nistatina en suspensión actualmente comercializados, unos 15,75 mg/ml. Este hecho resultó ser todo un éxito, ya que los sistemas de la invención tienen un alto contenido en agua y se conoce la dificultad de incorporar la nistatina en sistemas de estas características (alto contenido en agua).
Los sistemas de la invención conteniendo nistatina fueron aplicados en mucosa oral porcina realizando experimentos in Vitro de absorción utilizando células de Franz y tras un periodo de contacto con la mucosa de tres horas se determinó mediante cromatografía líquida de alto desarrollo (HPLC) la cantidad de nistatina retenida en el tejido. Se vió que toda la nistatina aplicada (629 microgramos) estaba incorporada en el tejido, hecho muy conveniente cuando el objetivo es tratar afecciones provocadas por hongos.
Además, se verificó mediante microscopía electrónica de transmisión que el tejido de la mucosa oral no había sido dañado significativamente por efecto del tratamiento (FIGURA 7).
También se determinó que la actividad microbiológica de la nistatina no quedaba afectada por el hecho de ser incorporada en los liposomas de la invención siendo la concentración mínima inhibitoria (MIC) de 16 g/ml

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Liposoma caracterizado porque comprende, en su solución acuosa interna, al menos una bicela.
2. Liposoma según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende bicelas en una concentración de entre el 5 y 25 % en peso seco con respecto al liposoma final.
3. Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque comprende lípidos que tienen una temperatura de transición media de entre 4 y 40 °C.
4. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las bicelas comprenden fosfolípidos de cadena larga en su región central plana y fosfolípidos de cadena corta en las regiones de los extremos.
5. Liposoma según la reivindicación 4, caracterizado porque las bicelas comprenden fosfolípidos con una razón de concentraciones molares entre los fosfolípidos de cadena larga y los de cadena corta de entre 1 y 10.
6. Liposoma según la reivindicación 4, caracterizado porque los fosfolípidos comprenden cadenas con una diferencia entre el número de carbonos entre cualquier cadena larga y cualquier cadena corta de entre 5 y 25.
7. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque el fosfolípido de cadena larga es dimiristoil- fosfatidilcolina o dipalmitoil- fosfatidilcolina.
8. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque el fosfolípido de cadena corta es dihexanoil- fosfatidilcolina.
9. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la bicela tiene una longitud de eje mayor de entre 10 y 80 nm.
10. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el liposoma tiene un diámetro de entre 200 y 1000 nm.
1 1 . Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque además comprende al menos un principio activo.
12. Liposoma según la reivindicación 1 1 caracterizado porque el principio activo se selecciona entre diclofenaco, hierro, gadodiamida, ácido flufenámico, cafeína, ceramidas, sulfato de colesterol y mezclas de ellos.
13. Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que además contiene un colorante y/o un pigmento.
14. Composición caracterizada porque comprende el liposoma definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Uso del liposoma definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para el encapsulado de al menos un principio activo.
16. Uso del liposoma según la reivindicación 15 caracterizado porque el principio activo se selecciona entre diclofenaco, hierro, gadodiamida, ácido flufenámico, cafeína, ceramidas, sulfato de colesterol y mezclas de ellos.
17. Uso del liposoma definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para el encapsulado de colorantes y/o pigmentos.
18. Uso del liposoma definido en la reivindicación 13 o de la composición según la reivindicación 14 para el tintado de materiales textiles.
19. Uso del liposoma definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o de la composición definida en la reivindicación 14 para la elaboración de un producto cosmético.
20. Uso según la reivindicación 19, caracterizado porque el cosmético se administra por vía tópica.
21 . Liposoma definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o composición definida en la reivindicación 14, para su uso como medicamento.
22. Uso del liposoma definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o composición definida en la reivindicación 14 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de la piel, tejido nervioso o tejido ocular.
23. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración por vía raquídea o por vía tópica a través de la mucosa conjuntival.
24. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende el liposoma definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o composición según la reivindicación 14.
25. Composición farmacéutica según la reivindicación 25, caracterizada porque además comprende, al menos, un excipiente farmacológicamente aceptable.
26. Método para la obtención del liposoma definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende:
a. obtener un film lipídico desecado y una solución acuosa de bicelas, b. hidratar el film lipídico con la solución de bicelas obtenidos ambos en el paso (a),
c. aislar y/o purificar el producto obtenido en el paso (b).
27. Método para la obtención del liposoma definido en la reivindicación 26, caracterizado porque la obtención del film lipídico desecado del paso (a) comprende:
i. disolver lípidos en un solvente orgánico, a concentraciones entre 5- 30mg/ml y
¡i. eliminar el solvente orgánico del paso anterior.
28. Método para la obtención del liposoma según la reivindicación 26 caracterizado porque la obtención de la solución acuosa de bicelas del paso (a) comprende:
i. disolver en un solvente orgánico fosfolípidos de cadena larga y fosfolípidos de cadena corta cuya razón de las concentraciones molares es de entre 1 y 10,
¡i. eliminar el solvente orgánico del paso anterior y rehidratar el producto obtenido con solución acuosa hasta conseguir una concentración de lípidos de entre 15 y 25% peso/volumen.
29. Método según la reivindicación 28, caracterizado porque el fosfolípido de cadena larga es dimiristoil-fosfatidilcolina o dipalmitoil-fosfatidilcolina y el fosfolípido de cadena corta es dihexanoil- fosfatidilcolina.
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