WO2011141613A2 - Nueva fitasa, procedimiento de obtencion y utilizacion de la misma - Google Patents

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Julia Martin Perez
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to a new phytase gene, the phytase enzyme encoded by said gene, a method for obtaining the enzyme in a yeast host cell and the use of the enzyme as an active ingredient in the manufacture of feed additives intended for animal nutrition and / or for the release of phosphate from organic matter from the soil.
  • the invention relates to an isolated odoriferous Serratia gene encoding a protein or polypeptide with phytase activity, a method for obtaining it in a yeast host cell such as, for example, Pichia pastoris, and the use of the enzyme as an active ingredient in the manufacture of feed additives intended for animal nutrition.
  • Elemental or pure phosphorus (P) is rare in nature, and it is common to find it as part of molecules that include the phosphate group (PO4 3 " ) attached to a carbon-based organic group in animal and plant tissues.
  • Phosphorus is an essential nutrient for plants and animals. Due to the lack of inorganic soil phosphorus (the only way it is absorbed by the plants), farmers are forced to make phosphorus contributions, part of which will be fixed by the plants becoming organic phosphorus, however remaining certain proportion on the ground. Animals also need inorganic phosphorus, which they obtain from inorganic phosphorus contributed directly to the diet and from the degradation of organic phosphorus present in the various ingredients that make up the diet. Phytic acid or phytate is the main form of storage of phosphorus in cereals, legumes, oilseeds, with values between 1-5% of the weight.
  • More than two thirds of the phosphorus contained in cereals and legumes is in the form of phytate, in addition to phosphorus, also other cations such as calcium, magnesium, iron, zinc, also proteins and amino acids are sequestered by phytates.
  • monogastric animals pigs and birds
  • phytases enzymes necessary to digest it
  • the phytases are meso-inositol hexaphosphate phosphohydrolases and catalyze the cleavage of the phosphate groups of phytic acid (IP6) or phytate, resulting in a free phosphate group and a lower inositol phosphate ester (IP5-IP1).
  • Phytases can be divided into 2 groups: microbial or fungal phytases (EC 3.1 .3.8) or 3-phytase, which begin to hydrolyze the phosphate group located in C1 or C3 of the inositol ring or plant phytases (EC 3.1 .3.26) or 6- phytase, which begin to preferentially hydrolyze the phosphate group located in the C6 of the inositol ring.
  • microbial or fungal phytases EC 3.1 .3.8
  • 3-phytase which begin to hydrolyze the phosphate group located in C1 or C3 of the inositol ring or plant phytases (EC 3.1 .3.26) or 6- phytase, which begin to preferentially hydrolyze the phosphate group located in the C6 of the inositol ring.
  • Phytases are extremely weak, expressing their maximum activity at pH ranging between 5.0 and 7.5, so the low pH values present in the stomach (pH 2-3) limit their activity, with some activity at a pH of less than 3.0, so there is a considerable breakdown of the phytate molecule in the diet, in the broche of chickens and in the stomach of non-ruminants, before gastric secretion reduces the pH of the intake too low to interrupt enzyme activity (Simons et al., 1992). In addition, the enzyme tends to be strongly inhibited by excess substrate (phytate) and product (inorganic phosphorus), and high temperatures (Power and Khon, 1993).
  • Synthetic phytases which hydrolyze phytic acid, as well as the intrinsic ones of vegetables, are phosphomonoesterases capable of hydrolyzing phytic acid producing inorganic orthophosphates and a small proportion of phosphoric esters, pentaphosphate to monophosphate, as intermediates, and finally free myoinositol (Nayini and Markakis, 1986; Lasztity and Lasztity, 1988; Harland and Morris, 1995).
  • IUPAC-IUB (1976) has recognized 3-Phytase (EC 3.1 .3.8), isolated in animals and microorganisms (Reddy et al., 1982; Lasztity and Lasztity, 1988).
  • Exogenous phytases have been found in microorganisms such as fungi (Saccharomyces cerevisae, Aspergillus sp species), yeasts and bacteria (Bacillus subtilis, Pseudomonas).
  • the phytase obtained from Aspergillus sp follows a certain order for the hydrolysis of the phytate molecule, that is, after the phosphate group is released from position 3, it continues in the following order, 4, 5, 6 and 2 (Venekamp and col., 1995).
  • Enzymes have activity at two different pHs, 2.5 and 5.5, being 40% less effective at the first pH. This is of great importance because the greater phosphorus absorption occurs in the vicinity of the small intestine, where the pH of 5.5 is optimal for phytase to act hydrolyzing phosphates, It is first necessary that the enzyme is activated in the acidic medium of the stomach (pH 2.5) (Power and Khon, 1993).
  • the phytase produced by Aspergillus ficuumm is a purified glycoprotein, with an enzymatic activity that varies with temperature and pH changes.
  • the optimal temperature of the enzyme is 60 to 70 ° C. However, temperatures of 68 ° C, for 10 minutes, cause losses of 60% of activity (Nasi, 1 990).
  • the enzymes obtained from Aspergillus niger are thermostable, resistant to the pelletization process and their activity is a minimum of 5000 FTU / g. (Nasi, 1990).
  • Denbow et al. (1 998) establish that the incorporation of phytases (400, 800, or 1,200 U / kg) to a low-phosphorus basal diet, the weight gain, the content of the finger centers and resistance endlessly increased to the rupture of the tibiae of birds and also improved the digestibility of phosphorus (Nelson et al., 1971; Denbow et al., 1995; Kornegay et al., 1996; Yi et al., 1996). These experiments establish that about 821 U / kg of phytase are required to replace 1 g of inorganic phosphate as defluorinated phosphate, in terms of weight gain and percentage of ashes.
  • ES 2255281 "Overexpression of phytase genes in yeast systems" refers to a method of producing phytase in yeast which comprises providing an appA gene isolated from bacterial cells, said appA gene encoding a protein or polypeptide with activity phytase, expressing said appA gene in a yeast strain and isolating the expressed protein or polypeptide polypeptide, wherein said protein or polypeptide has increased thermostability compared to that of said protein or polypeptide expressed in a non-yeast host cell , as well as a protein or polypeptide obtainable by said method and having phytase activity, with an optimal activity in the temperature range of 57-65 ° C at a pH of 2.5 to 3.5 or 5, 5.
  • Thermo-stability also plays an important role, since compound feeds in the granulation phase (pellet formation) suffer a thermal shock of the order of 70 ° C that denatures the enzyme;
  • Fig. 1 Determination of the molecular weight of the protein with phytase activity.
  • Fig. 2 Determination of the enzymatic activity of the protein with phytase activity as a function of temperature.
  • Fig. 3 Determination of the enzymatic activity of the protein with phytase activity as a function of pH.
  • Fig. 4 Effect of proteases on enzymatic activity.
  • Fig. 5 Maintenance of phytase activity over time.
  • an isolated Serratia odoriferous gene encoding a protein or polypeptide with phytase activity is provided.
  • the protein or polypeptide encoded by said odoriferous Serratia gene with phytase activity expressed in a host yeast strain, preferably Pichia pastoris, is also object of the invention, where the protein or polypeptide has allosteric properties that double its enzymatic activity (measured according to ISO30024: 2009 (E)) four hours after coming into contact with the substrate and remaining active for more than eight hours.
  • the present invention provides a gene that encodes a protein or polypeptide with phytase activity, its nucleotide sequence being that shown in SEQ ID No. 2, or a derivative thereof.
  • a polypeptide with phytase activity that is encoded by a polynucleotide of SEQ ID No. 2 or a polypeptide with phytase activity that has a sequence homology of at least 60% with SEQ ID No. 2, preferably at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% or 95%, with special preference at least 95%.
  • This phytase is obtained from a microorganism of the genus Serratia, preferably from Serratia odor ⁇ fera.
  • the use of the protein encoded by said odoriferous Serratia gene with phytase activity expressed in a yeast strain as a host, as an active ingredient, in the manufacture of feed additives is another object thereof intended for animal nutrition.
  • an isolated odoriferous Serratia gene is provided according to SEQ ID No 2 encoding a protein or polypeptide with phytase activity, the protein having the following characteristics: a) Theoretical molecular weight of 47 kDa ; b) Optimum pH range from 3.5 to 5.8; preferably from 3.7 to 5.8; c) Optimum activity temperature in the range of 45-55 ° C, preferably at 50 ° C; d) High specific activity of 1120 ⁇ 150 U / mg; e) High resistance to pepsin and trypsin; and f) 6.1 isoelectric point.
  • the protein or polypeptide of the invention encoded by said odoriferous Serratia gene with phytase activity is expressed in a host yeast strain, preferably Pichia pastor ⁇ s.
  • a host yeast strain preferably Pichia pastor ⁇ s.
  • this refers to a recombinant vector comprising the odoriferous Serratia gene that encodes the protein or polypeptide with phytase activity, a recombinant host cell, such as Pichia pastoris into which it has been introduced said vector, as well as a method to express the enzyme in a host cell.
  • polypeptide with phytase activity comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 3 or a derivative thereof by substitution, deletion or insertion of one or more amino acid residues
  • substitutions conservative amino acid substitutions well known to those skilled in the art and not modifying phytase activity, being equally applicable to deletions or insertions. It is generally known to those skilled in the art that, during gene cloning, recognition sites are designated that could result in one or more unrelated amino acid residues at the ends of the target protein, without thereby affecting activity.
  • phytase It is also known that in order to build a fusion protein, improve the expression of a recombinant protein, obtain a recombinant protein secreted by the host cell or facilitate purification of the recombinant protein, in the N-terminus or in the C -terminus, or in other suitable regions of the proteins, binding peptides, signal peptides, leader peptides, terminal extensions or the like are usually introduced.
  • the invention also provides a polypeptide with phytase activity that is encoded by a polynucleotide of SEQ ID No. 2 or a polypeptide with phytase activity that has a sequence homology of at least 60% with SEQ ID No. 2, preferably at least 65.
  • the invention also includes nucleic acid molecules that differ in any of the nucleotides shown in SEQ ID No 2 due to the degeneracy of the genetic code, provided they encode the same phytase protein.
  • vector refers to a nucleic acid that is capable of transporting another nucleic acid to which it is attached, which may be, for example, a plasmid or a viral vector.
  • the recombinant vectors of the invention comprise a nucleic acid of the invention in a form suitable for expression in a host cell, which means that the recombinant vectors of the invention include one or more regulatory sequences, selected according to the cell. host to be used for the expression, operatively linked to the sequence to be expressed; that is, the nucleotide sequence of interest binds to the regulatory sequence in a manner that allows the expression of the nucleotide sequence.
  • the regulatory sequence may include promoters, activation sites, terminators, etc. known to the person skilled in the art.
  • the vector can be introduced into the host cell by conventional transformation or transfection techniques.
  • transformation or transfection techniques Such methods for transforming or transfecting host cells can be found, for example, in Sambrook et al, Molecular Cloning. A laboratory Manual, 2 Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989..
  • the host cell is used to produce a protein with phytase activity. Therefore, the invention provides a method for producing a protein with phytase activity as described above using a yeast host cell, preferably from Pichia pastoris, comprising the odoriferous Serratia gene, which encodes a protein with phytase activity, where the method includes culturing the host cell in which the expression vector encoding the protein with phytase activity has been introduced, in a suitable medium for the production of the protein and subsequent separation of the proteins from the medium, if secreted, or from the host cell.
  • a yeast host cell preferably from Pichia pastoris
  • the method includes culturing the host cell in which the expression vector encoding the protein with phytase activity has been introduced, in a suitable medium for the production of the protein and subsequent separation of the proteins from the medium, if secreted, or from the host cell.
  • the additive of the invention can be suitably prepared in solid or liquid form and may optionally include other enzyme preparations correspondingly suitable to the solid liquid preparation, being suitable for use in the preparation of feed or other foods intended for animal nutrition, and It contains an effective amount of phytase that favors the assimilation of phosphorus and increases the absorption of metals and proteins by releasing them from phytate.
  • SerrR GCGCGCAAGCTTGTCTAGACGTGGCCGGTACTGCACCG
  • the coding region of the mature protein was amplified using serrF and SerrR oligonucleotides.
  • the amplification product was visualized on an agarose gel, the band of the expected size was trimmed and the DNA was extracted from the gel by the NucleoSpin Extract II kit (Macherey-Nagel).
  • the purified DNA was inserted into the pPICZa A vector (Invitrogen, San Diego, Calif.) Between the restriction sites delimited by the EcoRI and Xbal sequences.
  • the construct was transformed into DH5a cells that were subsequently plated in LB medium containing 25 g / ml Zeocin. Positive colonies were sequenced. One of the colonies with the sequence Correctly grown in large quantities in order to obtain DNA to transform yeasts.
  • Pichia pastoris strain KH71 H (Invitrogen) was grown in medium
  • the transformed cells were plated in YPDZ medium (containing 100 g / ml Zeocin) that allows selecting the colonies that have integrated the Shble gene (the product of this gene confers resistance to Zeocin) in the host's chromosomal DNA. Transformants that have integrated the Sh ble gene will grow correctly in the YPDZ medium. After 2 days, the transformants were inoculated in minimal medium with glycerol (BMGY) for 24 hours, then the yeasts were recovered by centrifugation (2,500g, 3 min) and resuspended a medium with 0.5% methanol (BMMY) to induce the expression of the phytase gene.
  • BMGY minimal medium with glycerol
  • BMMY 0.5% methanol
  • a unit of Phytase activity is defined as the amount of enzyme that releases 1 ⁇ of phosphorus in a minute. Two days after methanol induction, 6 transformants of 61 produced between 10 and 55 U / ml of culture medium. Obviously, the gene obtained is a new gene that codes for a polypeptide with phytase activity.
  • the polypeptide with phytase activity was named AppAs-r.
  • the transformant with an activity of 55 U / ml was cultivated and induced under optimal conditions.
  • phytase activity was measured by the same method used in the previous example, resulting in an activity of 163 U / ml in the supernatant.
  • the supernatant was obtained by centrifugation at 14,100 g for 5 minutes. The precipitate of cells was discarded.
  • the molecular weight of the AppAs-r phytase was characterized by a denaturing acrylamide gel (SDS-PAGE).
  • line 1 corresponds to the molecular weight marker
  • line 2 refers to the control of culture medium without inducing with methanol
  • line 3 refers to the culture medium induced with methanol
  • line 4 to the dialyzed and purified concentrated phytase.
  • the molecular weight of AppAs-r is approximately 46 kDa, which is the estimated weight from the polypeptide sequence derived from the cloned DNA sequence.
  • the concentration of concentrated and purified AppAs-r phytase was assessed by the Lowry method and the specific activity was studied by the acid molybdate-vanadate method at 37 ° C and pH 4.75.
  • the specific activity of purified AppAs-r was 1,123 ⁇ 1 12 U / mg.
  • Example 4 Phosphate release of organic matter from the soil Due to the long active life of the phytase and with the intention of knowing its ability to release inorganic phosphorus from the organic material from the soil, the purpose of this test is to study its use in the preparation of a fertilizer additive, 5 soil tastings were collected. 2.5 g of cad were weighed and resuspended in an acetate buffer, calculating a final concentration of 0.25 g sample / ml. It was incubated for 20 minutes under stirring at room temperature. Then, a 1/10 dilution of the samples in the acetate buffer was carried out.

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Abstract

La invención se refiere a un gen aislado de Serratia odoriferaque codifica una proteína o polipéptido con actividad fitasa, a un método para su obtención en una célula huésped de levaduratal como, por ejemplo Pichia pastoris, y a la utilización de la enzima como ingrediente activo en la fabricación de aditivos para piensos destinados a la nutrición animaly/o para la liberación de fosfato de materia orgánica procedente del suelo.

Description

NUEVA FITASA, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LA
MISMA
La presente invención se refiere a un nuevo gen de fitasa, a la enzima fitasa codificada por dicho gen, a un método para obtener la enzima en una célula hospedadora de levadura y a la utilización de la enzima como ingrediente activo en la fabricación de aditivos para piensos destinados a la nutrición animal y/o para la liberación de fosfato de materia orgánica procedente del suelo.
Más en particular, la invención se refiere a un gen aislado de Serratia odorífera que codifica una proteína o polipéptido con actividad fitasa, a un método para su obtención en una célula huésped de levadura tal como, por ejemplo Pichia pastoris, y a la utilización de la enzima como ingrediente activo en la fabricación de aditivos para piensos destinados a la nutrición animal.
El fósforo elemental o puro (P) es raro en la naturaleza, siendo habitual encontrarlo formando parte de moléculas que incluyen el grupo fosfato (PO43") unido a grupo orgánico basado en carbono en los tejidos de animales y plantas.
El fósforo es un nutriente esencial para plantas y animales. Debido a la falta de fósforo inorgánico del suelo (la única forma en que es absorbido por las plantas), los agricultores se ven obligados a realizar aportes de fósforo, parte del cual será fijado por las plantas convirtiéndose en fósforo orgánico, permaneciendo no obstante cierta proporción en el suelo. Los animales también necesitan fósforo en forma inorgánica, que lo obtienen del fósforo inorgánico aportado directamente en la dieta y de la degradación del fósforo orgánico presente en los diversos ingredientes que componen dicha dieta. El acido fítico o fitato es la forma principal de almacenamiento de fósforo en cereales, legumbres, semillas oleaginosas, con valores comprendidos entre 1 -5% del peso. Mas de los dos tercios del fósforo contenido en los cereales y leguminosas está en forma de fitato, además del fósforo, también otros cationes como calcio, magnesio, hierro, zinc, también proteínas y aminoácidos están secuestrados por los fitatos. Sin embargo, los animales monogástricos (cerdos y aves) son incapaces de absorber el fósforo en forma de fitato, ya que carecen de las enzimas necesarias para digerirlo, conocidas como fitasas. Esto representa que entre un 20% y 40% del fósforo de origen vegetal ingerido por monogástricos, no es asimilado, siendo excretado a través de las heces con los consiguientes problemas ecológicos. Esta contaminación por fósforo es un problema que va teniendo cada vez mayor importancia, en las zonas donde se practica la ganadería intensiva de monogástricos.
Además, aunque algunos de los microorganismos presentes en la flora intestinal del intestino delgado tienen la capacidad de hidrolizar el acido fítico, debido a su localización en el intestino, el fósforo se absorbe en muy pequeña cantidad. Por otro lado, un exceso de fitato actúa como un factor antinutricional al quelar iones metálicos necesarios para el animal tales como el calcio, el cobre y el zinc, disminuyendo su disponibilidad nutricional. Estos hechos hacen que sea común enriquecer el alimento de estos animales con fósforo inorgánico, lo cual incrementa en gran medida los costes de producción ganadera, además de aportarse un fósforo no asimilado extra al suelo a través del abonado con estiércol, lo que rompe el equilibrio natural de este elemento, produciendo la eutrofización de las aguas superficiales y la contaminación de acuíferos.
Hace unos años y tras numerosas investigaciones se consiguió aportar al estado de la técnica una posible solución a estos problemas, o al menos minimizarlos, proporcionándose la primera fitasa, una enzima que hidroliza el fitato y libera fósforo orgánico, y que, añadida al alimento, hace el fósforo más accesible.
A este respecto, las fitasas son meso-inositol hexafosfato fosfohidrolasas y catalizan la escisión de los grupos fosfato del acido fítico (IP6) o del fitato, dando como resultado un grupo fosfato libre y un éster de inositol fosfato inferior (IP5-IP1 ). Las fitasas se pueden dividir en 2 grupos: fitasas microbianas o fúngicas (E.C. 3.1 .3.8) o 3-fitasa, que empiezan a hidrolizar el grupo fosfato situado en el C1 o C3 del anillo inositol o fitasas de plantas (E.C. 3.1 .3.26) o 6- fitasa, que empiezan a hidrolizar preferentemente el grupo fosfato situado en el C6 del anillo inositol.
Tal como se cita en el artículo de Carmen Frontela y col ., "Empleo de fitasas como ingrediente funcional en alimentos", (Carmen Frontela, Gaspar Ros, Carmen Martínez, Departamento de Tecnología de Alimentos, Nutrición y Bromatología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, Campus de Espinardo, Murcia, España, 2008) a fin de conseguir una completa degradación del contenido en ácido fítico durante el procesado de los alimentos, y de este modo incrementar la disponibilidad mineral, son numerosas las investigaciones que apuntan al empleo de fitasas de origen exógeno como estrategia.
Así, es de gran importancia conocer las condiciones óptimas de actividad de la fitasa empleada, teniendo en cuenta que estas condiciones dependen del tipo de cereal con el que se está trabajando. La mayoría de las fitasas procedentes de cereales presentan un pH óptimo de actividad entre 4,5-5,6, mientras que las procedentes de leguminosas, presentan un pH óptimo en valores de 7 o superiores. No obstante, existen evidencias que ponen de manifiesto que el empleo de fitasas procedentes de microorganismos como es el caso de hongos del género Aspergillus spp. son el método más sencillo y eficaz de conseguir la completa eliminación del ácido fítico produciendo un importante incremento en la absorción de hierro, lo cual podría suponer que el empleo de estas enzimas de origen microbiano durante el procesado de los alimentos, podría ser en un futuro cercano factible de ser empleado en la industria alimentaria a fin de incrementar la disponibilidad mineral de los alimentos producidos. El uso de fitasa de origen microbiano está actualmente autorizado para su em pl eo en al imentación an i mal , y está en cam i nado a i ncrementar la disponibilidad del fósforo del ácido fítico reduciendo la excreción fecal del mismo al ambiente. En el caso del preparado enzimático de 6-fitasa producido por Aspergillus oryzae (DSM 14223), éste fue autorizado para los pollos de engorde, las gallinas ponedoras, los pavos de engorde, los lechones, los cerdos de engorde y las cerdas por el Reglamento (CE) n° 255/2005 de la Comisión Europea, y actualmente se han presentado nuevos datos en apoyo a una solicitud para ampliar la autorización del uso de este preparado enzimático a los salmónidos.
Las fitasas son extremadamente débiles, expresando su máxima actividad a pH que varían entre 5,0 y 7,5, por lo que, los bajos valores de pH presentes en el estomago (pH 2-3) limitan su actividad, con alguna actividad a un pH menor de 3,0, por lo que hay una ruptura considerable de la molécula de fitato de la dieta, en el buche de los pollos y en el estomago de los no rumiantes, antes de que la secreción gástrica reduzca el pH de la ingesta a un nivel demasiado bajo como para interrumpir la actividad enzimática (Simons y col ., 1992). Además, la enzima tiende a ser fuertemente inhibida por exceso de substrato (fitato) y producto (fósforo inorgánico), y por altas temperaturas (Power y Khon, 1993).
Las fitasas sintéticas, que h idrol izan el ácido fítico, al igual que las intrínsecas de los vegetales, son fosfomonoesterasas capaces de hidrolizar el ácido fítico produciendo ortofosfatos inorgánicos y una pequeña proporción de esteres fosfóricos, pentafosfato a monofosfato, como productos intermedios, y finalmente mioinositol libre (Nayini y Markakis, 1986; Lasztity y Lasztity, 1988; Harland y Morris, 1995). La IUPAC-IUB (1976) ha reconocido la 3-Fitasa (EC 3.1 .3.8), aislada en animales y microorganismos (Reddy y col., 1982; Lasztity y Lasztity, 1988).
Se han encontrado fitasas exógenas en microorganismos como hongos (Saccharomyces cerevisae, especies de Aspergillus sp), levaduras y bacterias (Bacillus subtilis, Pseudomonas). La fitasa obtenida de Aspergillus sp sigue un cierto orden para la hidrólisis de la molécula de fitato, es decir, después de ser liberado el grupo fosfato de la posición 3, continúa en el siguiente orden, 4, 5, 6 y 2 (Venekamp y col., 1995).
Las enzimas presentan actividad a dos pH diferentes, 2,5 y 5,5, siendo 40% menos efectiva al primer pH. Esto es de gran importancia debido a que la mayor absorción de fósforo ocurre en las proximidades del intestino delgado, donde el pH de 5,5 es óptimo para que la fitasa actúe hidrolizando los fosfatos, siendo primero necesario que la enzima se active en el medio ácido del estomago (pH 2,5) (Power y Khon, 1993).
La fitasa producida por el Aspergillus ficuumm, es una glicoproteína purificada, con una actividad enzimática que varía con la temperatura y cambios de pH. La temperatura óptima de la enzima es de 60 a 70°C. Sin embargo, temperaturas de 68°C, durante 1 0 minutos, provocan pérdidas del 60% de actividad (Nasi, 1 990). Las enzimas obten idas del Aspergillus niger son termoestables, resistente al proceso de pelletización y su actividad es de un mínimo de 5000 FTU/g. (Nasi, 1990). Existen evidencias de que las fitasas pueden incrementar significativamente, la utilización de fósforo fítico (Qian y col., 1 997; Yi y col ., 1996a,b; Carlos y col., 1998; Maenz y Classen, 1998; Pan y col., 1998; Denbow y col., 1998).
Así, Denbow y col . (1 998) establecen que la incorporación de fitasas (400 , 800 , o 1 .200 U/kg) a una dieta basal baja en fósforo, incrementó l inealmente la ganancia de peso, el conten ido de cen izas del dedo y la resistencia a la ruptura de las tibias de aves y mejoró, además, la digestibilidad del fósforo (Nelson y col., 1971 ; Denbow y col., 1995; Kornegay y col., 1996; Yi y col., 1996). Estos experimentos establecen que cerca de 821 U/kg de fitasa son req u erid as para reem pl aza r 1 g de fosfato inorgánico como fosfato desfluorinado, en términos de ganancia de peso y porcentaje de cenizas.
Simons y col. (1990), adicionando fitasa (750 U/kg) en una dieta maíz- soja para pollos, aumentaron la disponibilidad de fósforo y calcio a 62% y disminuyeron la excreción de fósforo vía fecal y urinaria (2,0 g/kg MS). Por otra parte, Perney (1991 ), utilizando pollos de engorde alimentados con una dieta basal a base de maíz-soya, con 0,38% de fósforo disponible, con la adición de 500 U/kg de fitasa, obtuvieron mejoras en la resistencia a la ruptura de la tibia, sin cambios significativos en el consumo y ganancia de peso de los animales. Estos resultados fueron similares a los obtenidos por Edwards (1993), quien observó poco beneficio debido a los bajos niveles de adición de la fitasa a dietas deficientes de fósforo. La solicitud de patente americana US 2010/0092613, "Cloning and expression of a novel phytase", se refiere a una fitasa obtenida a partir un microorganismo del género Yersinia con un peso molecular de 45,5 kDa, un pH óptimo de 4-5, una temperatura óptima de 50-60°C, un punto isoeléctrico de 7,7 y una actividad específica de 3.000 U/mg.
La ES 2255281 , "Sobreexpresión de genes de fitasa en sistemas de levadura", se refiere a un método de producción de fitasa en levadura que comprende proporcionar un gen appA aislado a partir de células bacterianas, codificando dicho gen appA una proteína o polipéptido con actividad fitasa, expresar dicho gen appA en una cepa de levadura y aislar la proteína o pol ipéptido expresado, en el que d icha proteína o pol ipéptido tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con la de dicha proteína o polipéptido expresado en una célula hospedadora no de levadura, así como a una proteína o pol ipéptido obten ible mediante dicho método y que tiene actividad fitasa, con una actividad óptima en el intervalo de temperatura de 57- 65°C a un pH de 2,5 a 3,5 o de 5,5.
Por todo lo anterior, sería deseable proporcionar una nueva fitasa cuyo uso no conllevara las desventajas de las fitasas conocidas en el estado de la técnica, por ejemplo aquellas relacionadas con: · La diferencia de pH entre el estómago (pH 3,5) y del tracto intestinal (pH 7,0), que hacen que la enzima no pueda tener una buena actividad con un rango de pH tan amplio;
• La termo-estabilidad también juega un papel importante, ya que los piensos compuestos en la fase de granulación (formación del pellet) sufren un choque térmico del orden de 70°C que desnaturaliza la enzima;
• Las proteasas del tracto digestivo catabolizan gran parte de la enzima;
Y que, por ende, perm itiera conseguir resultados más eficientes al mantenerse activa a lo largo de todo el tracto digestivo, en el estómago, donde el pH es demasiado bajo para la actividad de la mayoría de las fitasas, y manteniendo su actividad en el intestino delgado, donde el pH es próximo a 7. En las figuras adjuntas:
Fig. 1 Determinación del peso molecular de la proteína con actividad fitasa.
Fig. 2 Determ inación de la actividad enzimática de la proteína con actividad fitasa en función de la temperatura.
Fig. 3 Determ inación de la actividad enzimática de la proteína con actividad fitasa en función del pH.
Fig. 4 Efecto de las proteasas en la actividad enzimática.
Fig. 5 Mantenimiento de la actividad fitasa en el tiempo.
Por tanto, según un aspecto de la invención, se proporciona un gen aislado de Serratia odorífera que codifica una proteína o un polipéptido con actividad fitasa. Es también objeto de la invención la proteína o el polipéptido codificado por dicho gen de Serratia odorífera con actividad fitasa expresado en una cepa de levadura hospedadora, preferentemente Pichia pastoris, donde la proteína o el polipéptido tiene propiedades alostéricas que doblan su actividad enzimática (medida según ISO30024:2009 (E)) a las cuatro horas de entrar en contacto con el sustrato y permaneciendo activa durante más de ocho horas.
Así, la presente invención proporciona un gen que codifica una proteína o un polipéptido con actividad fitasa, siendo su secuencia de nucleótidos la mostrada en la SEQ ID No 2, o un derivado de la misma.
En otro aspecto, la invención proporciona una proteína o un polipéptido con actividad fitasa con las siguientes características: a) Peso molecular teórico de 46 kDa; b) rango de pH óptimo de 3,5 a 5,8; c) temperatura de actividad óptima en el rango de 45-55°C; d) Alta actividad específica de 1 120 ± 150 U/mg, en particular de 1 .123 ± 1 12 U/mg; e) alta resistencia a la pepsina y la tripsina, y f) punto isoeléctrico Pl=6,1 , donde la proteína con actividad fitasa se selecciona de entre: i) un polipéptido con actividad fitasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No 3 o un derivado de la misma por sustitución, deleción o inserción de uno o más residuos aminoácidos, o. ii) un polipéptido con actividad fitasa que es codificado por un polinucleótido de SEQ ID No 2 o un polipéptido con actividad fitasa que presenta una homología de secuencia de al menos un 60% con la SEQ ID No 2, preferentemente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, con especial preferencia al menos un 95%.
Esta fitasa se obtiene a partir de un microorganismo del género Serratia, preferentemente de Serratia odorífera.
Igualmente, según otro aspecto de la invención, es otro objeto de la misma la utilización de la proteína codificada por dicho gen de Serratia odorífera con actividad fitasa expresado en una cepa de levadura como huésped, como ingrediente activo, en la fabricación de aditivos para piensos destinados a la nutrición animal.
De acuerdo con el primer aspecto de la invención, se proporciona un gen aislado de Serratia odorífera según la SEQ ID No 2 que codifica una proteína o un polipéptido con actividad fitasa, teniendo la proteína las siguientes características: a) Peso molecular teórico de 47 kDa; b) Rango de pH óptimo de 3,5 a 5,8; preferentemente de 3,7 a 5,8; c) Temperatura de actividad óptima en el rango de 45-55°C, preferentemente a 50°C; d) Alta actividad específica de 1120 ± 150 U/mg; e) Alta resistencia a la pepsina y la tripsina; y f) Punto isoeléctrico de 6,1. La proteína o el polipéptido de la invención codificado por dicho gen de Serratia odorífera con actividad fitasa se expresa en una cepa de levadura hospedadora, preferentemente Pichia pastorís. As í, en otro aspecto de la invención, ésta se refiere a un vector recombinante que comprende el gen de Serratia odorífera que codifica la proteína o el polipéptido con actividad fitasa, una célula hospedadora recombinante, tal como Pichia pastorís en la que se ha introducido dicho vector, así como un método para expresar la enzima en una célula huésped.
En el presente contexto, por "pol ipéptido con actividad fitasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No 3 o un derivado de la m isma por sustitución , deleción o inserción de uno o más residuos am inoácidos" se entienden, por ejemplo e n e l c a s o d e l a s sustituciones, sustituciones conservativas de aminoácidos bien conocidas por el experto en la materia y que no modifican la actividad fitasa, siendo igualmente aplicable a las deleciones o inserciones. Es de conocimiento general del experto en la materia que, durante la clonación de genes, se designan sitios de reconocimiento que podrían resultar en uno o más residuos aminoácidos no relacionados en los extremos de la proteína diana, sin que por ello se vea afectada la actividad fitasa. Es igualmente sabido que con el fin de construir una proteína de fusión, mejorar la expresión de una proteína recombinante, obtener una proteína recombinante secretada por la célula huésped o facil itar la purificación de la proteína recombinante, en el N-terminus o en el C-terminus, o en otras regiones adecuadas de las proteínas, se suelen introducir péptidos de unión, péptidos señal, péptidos líder, extensiones terminales o similares. Igualmente la invención proporciona un polipéptido con actividad fitasa que es codificado por un polinucleótido de SEQ ID No 2 o un polipéptido con actividad fitasa que presenta una homología de secuencia de al menos un 60% con la SEQ ID No 2, preferentemente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, con especial preferencia al menos un 95%. A este respecto, se entenderá que la invención además incluye moléculas de ácido nucleico que que difieren en alguno de los nucleótidos mostrados en la SEQ ID No 2 debido a la degeneración del código genético, siempre que codifiquen la misma proteína fitasa.
En la presente invención, el término "vector" se refiere a un ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico al cual está unido, pudiendo ser, por ejemplo, un plásmido o un vector viral.
Así, los vectores recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión en una célula huésped, lo que significa que los vectores recombinantes de la invención incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas de acuerdo con la célula hospedadora a emplear para la expresión, unidas operativamente a la secuencia a expresar; esto es, la secuencia de nucleótidos de interés se une a la secuencia reguladora de forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos. A este respecto, se entiende que la secuencia reguladora puede incluir promotores, sitios de activación, terminadores, etc. conocidos por el experto en la materia.
El vector puede introducirse en la célula huésped mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Métodos de este tipo para transformar o transfectar células hospedadores se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook y col ., Molecular cloning: A laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
En la presente invención, la célula huésped se emplea para producir una proteína con actividad fitasa. Por tanto, la invención proporciona un método para producir una proteína con actividad fitasa tal como se ha descrito anteriormente empleando una célula huésped de levadura, preferentemente de Pichia pastoris, que comprende el gen de Serratia odorífera, el cual codifica una proteína con actividad fitasa, donde el método incluye cultivar la célula huésped en la cual se ha introducido el vector de expresión que codifica la proteína con actividad fitasa, en un medio adecuado para la producción de la proteína y posterior separación de las proteínas del med io, si son secretadas, o de la célula huésped. De acuerdo con otro aspecto de la invención, es otro objeto de la misma la utilización de la proteína codificada por dicho gen de Serratia odorífera con actividad fitasa expresado en una cepa de levadura como huésped, como ingrediente activo, en una cantidad efectiva, en la fabricación de aditivos para piensos destinados a la nutrición animal, y también el aditivo así obtenido.
El aditivo de la invención puede preparase adecuadamente en forma sólida o líquida y opcionalmente puede incluir otras preparaciones enzimáticas correspondientemente adecuadas a la preparación sól ida o l íquida, siendo adecuado para su utilización en la preparación de piensos u otros alimentos destinados a la nutrición animal, ya que contiene una cantidad efectiva de fitasa que favorece la asimilación del fósforo e incrementa la absorción de metales y proteínas al liberarlos del fitato.
Ejemplos
Ejemplo 1 : Expresión en Pichia pastoris Construcción del vector de expresión
Para aislar la región codificante de la proteína madura se sintetizaron los oligonucleótidos:
SerrF: GCGCGCGAATTCGAGCCGCGCTACGTATTGG
SerrR: GCGCGCAAGCTTGTCTAGACGTGGCCGGTACTGCACCG La región codificante de la proteína madura se amplificó usando los oligonucleótidos serrF y SerrR. El producto de amplificación fue visualizado en un gel de agarosa, la banda del tamaño esperado fue recortada y el ADN fue extraído del gel mediante el kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel).
El ADN purificado fue insertado dentro del vector pPICZa A (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre los sitios de restricción delimitados por las secuencias de EcoRI y Xbal. La construcción fue transformada en células DH5a que fueron posteriormente plaqueadas en medio LB que contenía 25 g/ml de Zeocin. Las colonias positivas fueron secuenciadas. Una de las colonias con la secuencia correcta se cultivo en grandes cantidades con el objetivo de obtener ADN para transformar las levaduras.
Transformación de las levaduras y expresión de la proteína Se hizo crecer la cepa de Pichia pastoris KH71 H (Invitrogen) en medio
YPD y se preparó para la transformación. 10 g de plásmido pPICZa A AppAs-r fue linealizado mediante la enzima de restricción Pmel e introducido en las levaduras mediante shock con Litio/Polietilenglicol.
Las células trasformadas fueron plaqueadas en medio YPDZ (contiene 100 g/ml de Zeocin) que permite seleccionar las colonias que han integrado el gen Sh ble (el producto de este gen confiere resistencia al Zeocin) en el ADN cromosómico del huésped. Los transformantes que hayan integrado el gen Sh ble crecerán correctamente en el med ia YPDZ . Después de 2 d ías, los transformantes fueron inoculados en medio mínimo con glicerol (BMGY) durante 24 horas, después las levaduras fueron recuperadas mediante centrifugación (2.500g, 3 min) y resuspendidas un medio con 0,5% de metanol (BMMY) para inducir la expresión del gen de la fitasa.
Cuantificación de la actividad fitasa de los transformantes
Un total de 61 transformantes fueron anal izados para cuantificar la actividad fitasa mediante el método mol ibdato-vanadato en medio ácido (establecido en la ISO 300024:2009 (E)).
Se añadieron 1 .1 60 μΙ de solución sustrato (5mM fitato de sodio en un tampón 250 mM de acetato de sodio, pH 5,5) a 40 μΙ de una solución diluida de la enzima. La reacción se llevó a cabo a 37°C durante 30 minutos. Después se añadieron a la reacción 800 μΙ de solución STOP (14% ácido nítrico; 3,3% heptamolibdato amónico tetrahidratado, 0,078% vanadato) para parar la reacción. Como control, se añadió la solución STOP a la solución diluida de la enzima para inactivarla y después se añadió la solución sustrato. Tras 10 minutos, se cuantificó la intensidad de color amarillo a 415 nm y se calculó la actividad en solución de la enzima y de la solución control. Una unidad de actividad fitasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 μιτιοΙ de fósforo en un m inuto . Dos d ías después de la inducción por metanol, 6 transformantes de 61 produjeron entre 10 y 55 U/ml de medio de cultivo. Obviamente, el gen obtenido es un nuevo gen que codifica para un polipéptido con actividad fitasa. El polipéptido con actividad fitasa se denominó AppAs-r.
Ejemplo 2: Purificación de AppAs-r expresada en Pichia pastoris
Con el objetivo de purificar la fitasa producida por Pichia pastoris, el transformante con un una actividad de 55 U/ml fue cultivado e inducido en condiciones óptimas. Cuatro días después de la inducción con metanol se midió la actividad fitasa mediante el mismo método utilizado en el ejemplo anterior, dando como resultado una actividad de 163 U/ml en el sobrenadante. El sobrenadante se obtuvo mediante centrifugación a 14.100 g durante 5 minutos. El precipitado de células fue descartado.
El sobrenadante fue concentrado mediante centrifugación con VIVASPIN 20 (50.000 MWC O (Sartorius Studium)). Seguidamente la solución concentrada fue dializada en tampón de acetato de sodio (0,25 M, pH 5,5). Finalmente la fitasa fue purificada mediante gel filtración (Sephacryl S-200) con el mismo tampón usado en la diálisis.
Ejemplo 3: Características de AppAs-r expresado en Pichia pastoris Determinación del peso molecular
El peso molecular de la fitasa AppAs-r se caracterizó mediante un gel desnaturalizante de acrilamida (SDS-PAGE). En l a Fig. 1 , l a l ínea 1 se corresponde con el marcador de peso molecular; la línea 2 se refiere al control de medio de cultivo sin inducir con metanol; la l ínea 3 al medio de cultivo inducido con metanol; y la línea 4 a la fitasa concentrada dializada y purificada.
Como se muestra en la Figura 1 , el peso molecular de AppAs-r es de aproximadamente 46 kDa, que es el peso estimado a partir de la secuencia de polipéptidos derivada de la secuencia de ADN clonada.
Determinación de la actividad enzimática de AppAs-r con la temperatura Tal como se observa en la Fig. 2, la actividad cambia con la temperatura. La temperatura óptima se determinó a un pH 5,5, ya que es el pH que exige la ISO 300024:2009 (E). Se testó un rango de temperaturas entre 35°C y 80°C. La máxima actividad se registro a 50°C. Como se muestra en la Fig. 2, después de 10 minutos a 60°C la enzima retiene el 40% de su actividad.
Determinación de la actividad enzimática de AppAs-r dependiente del pH
El efecto del pH sobre la actividad fitasa fue comprobado utilizando los siguiente tampones: Glicina-HCI para pH 1 ,5-3,5; acetato de sodio para pH 3,5- 6,0; Tris-HCI para pH 6,0-8,5; Glicina-NaOH para pH 8,5-1 0,0. Todos los tampones contenían 0,05% IGPAL. Como se observa en la Fig. 3, la actividad enzimática varia con el pH. La máxima actividad se observo a un pH 4,75. Un 70% de la actividad se mantiene a un pH de 3,75, mientras que más del 80% de la actividad se mantiene a pH 5,5.
Efecto de las proteasas en la actividad enzimática Para determinar la resistencia a las proteasas, la AppAs-r purificada (1 ,6 mg/ml) fue incubada con 5 mg/ml de pepsina o con 50 mg/ml de tripsina a 37°C. Después de la incubación a diferentes tiempos (3; 5; 10; 15; 30 y 60 minutos) se cuantificó la actividad fitasa remanente en las muestras. Como se puede observar en la Fig. 4, después de 1 hora de incubación con pepsina la fitasa AppAs-r retiene más del 70% de su actividad inicial, mientras que retiene más del 90% de su actividad inicial después de 1 h de incubación con tripsina. Así, esta fitasa es altamente resistente a la acción de las proteasas, hecho que es muy beneficioso para su utilización en alimentación animal.
Mantenimiento de la actividad fitasa con el tiempo Para determinar la cinética de actividad en el tiempo de la fitasa AppAs-r se midió la actividad específica por minuto a diferentes tiempos después de incorporar el sustrato. Como se observa en la Fig. 5A, a diferencia de la mayoría de fitasas, AppAs-r va aumentando su actividad específica a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Fig. 5B, AppAs-r está activa durante al menos 8 horas desde el momento en que se añade el sustrato, llegando a doblar su actividad específica inicial después de 4 horas y media de actividad. Esta actividad creciente y sostenida en el tiempo no se ha descrito en ninguna otra fitasa y es un punto muy importante puesto que la digestión animal dura más de 30 minutos y es importante que la enzima esté activa durante el máximo de tiempo posible. Esta actividad creciente y sostenida en el tiempo puede ser muy relevante también en la alimentación líquida. Esto permitiría liberar la mayoría del fósforo presente como fitato en los piensos con una cantidad de enzima mucho menor.
Determinación de la actividad específica
Con el fin de determinar la actividad específica, se valoró la concentración de la fitasa AppAs-r concentrada y purificada mediante el método de Lowry y se estudió la actividad específica mediante el método molibdato-vanadato ácido a 37°C y pH 4,75. Como resultado, la actividad específica de AppAs-r purificada fue de 1 .123 ± 1 12 U/mg.
Ejemplo 4: Liberación de fosfato de materia orgánica procedente del suelo Debido a la larga vida activa de la fitasa y con la intención de conocer su capacidad para liberar fósforo inorgánico del material orgánico procedente del suelo, siendo el fin de este ensayo estudiar su utilización en la preparación de un aditivo para fertilizantes, se recogieron 5 catas de suelo. Se pesaron 2,5 g de cad a u n a y se resuspendieron en un tampón acetato, calculando una concentración final de 0,25 g muestra/ml. Se incubó durante 20 minutos bajo agitación a temperatura ambiente. Después, se llevó a cabo una dilución 1/10 de las muestras en el tampón acetato. Se añadieron a 1 ,2 mi de cada muestra diluida el equivalente a 1 U de fitasa AppAs-r/100g suelo y se incubó durante 24 h a 25°C. Como resultado, la liberación de fósforo fue de 53,6 ± 27,8 mg de fósforo/ 100 g de suelo, incrementando el fosfato libre del suelo en un 23,4 ± 18,1 %.

Claims

REIVINDICACIONES
Proteína con actividad fitasa con las siguientes características: a) Peso molecular teórico de 46 kDa; b) Rango de pH óptimo de 3,5 a 5,8; c) Temperatura de actividad óptima en el rango de 45-55°C; d) Alta actividad específica de 1 120 ± 150 U/mg; e) Alta resistencia a la pepsina y la tripsina; y f) Punto isoeléctrico de 6,1 .
Proteína con actividad fitasa según la reivindicación 1 , caracterizada porque el rango de pH óptimo es de 3,7 a 5,8, la temperatura óptima es de 50°C y la actividad específica es de 1 .123 ± 1 12 U/mg.
Proteína con actividad fitasa según las reivindicaciones 1 -2, caracterizada porque se selecciona de entre: i) un polipéptido con actividad fitasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No 3 o un derivado de la misma por sustitución, deleción o inserción de uno o más residuos aminoácidos, o ii) un pol ipéptido con actividad fitasa que es cod ificado por u n polinucleótido de SEQ ID No 2 o un polipéptido con actividad fitasa que presenta una homología de secuencia de al menos un 60% con la SEQ ID No 2, preferentemente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, con especial preferencia al menos un 95%.
4. Proteína según la reivindicación 1 , caracterizada porque es codificada por un gen de Serratia odorífera de SEQ ID No 2 y expresada en una cepa de levadura.
5. Proteína según la reivindicación 4, caracterizada porque la cepa de levadura es Pichia pastoris.
6. Vector recombinante que comprende el gen de Serratia odorífera que codifica la proteína con actividad fitasa según la reivindicación 1 y una célula hospedadora recombinante Pichia pastoris e n l a q u e se h a introducido dicho vector. 7. Procedimiento para la producción de una proteína con actividad fitasa que comprende el cultivo de la célula huésped Pichia pastoris en la que se ha introducido el vector según la reivindicación 6.
8. Utilización de la proteína según la reivindicación 1 codificada por el gen de Serratia odorífera con actividad fitasa expresado en una cepa de levadura como huésped, como ingrediente activo, en una cantidad efectiva, en la fabricación de ad itivos para piensos destinados a la nutrición animal.
9. Aditivo para la alimentación animal que incluye una cantidad efectiva de una proteína según la reivindicación 1 . 10. Aditivo según la reivindicación 9, caracterizado porque se prepara adecuadamente en forma sólida o líquida y porque puede incluir otras preparaciones enzimáticas correspondientemente adecuadas a la forma sólida o líquida.
11. Aditivo para fertilizantes que incluye una cantidad efectiva de una proteína según la reivindicación 1 .
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